CN104411828A

CN104411828A - 玉米事件dp-004114-3及其检测方法

Info

Publication number: CN104411828A
Application number: CN201380028463.2A
Authority: CN
Inventors: C.M.阿拉孔; M.C.哈蒙; M.A.帕斯夸尔; J.C.雷吉斯特三世; C.J.塞隆格; J.K.杨; C.X.钟
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2015-03-11
Also published as: ES2816640T3; US20170369953A1; EP2831243B1; UA116982C2; BR112014026728A2; EA034330B1; US20200385749A1; BR112014026728B1; AR127650A2; HUE050690T2; MX373192B; US20130283483A1; US10407688B2; US20190338300A1; US9725772B2; EA201491810A1; ZA201407686B; CA2871557C; MX2014012894A; CA2871557A1

Abstract

本发明提供了涉及转基因抗昆虫性玉米植物的DNA组合物。也提供了基于插入玉米基因组中的重组构建体的DNA序列和在插入位点侧翼的DNA序列检测玉米DP-004114-3事件的存在的测定法。提供了在实施所述测定法中有用的试剂盒和条件。

Description

玉米事件DP-004114-3及其检测方法

交叉引用

本发明申请要求2012年3月30日提交的美国临时申请No.61/617990的权益，所述临时申请全文以引用方式并入本文。

对以电子方式提交的序列表的引用

通过EFS-Web以电子方式将序列列表的正式文本作为ASCII格式的序列列表提交，该文件名称为“5251_PCT_sequence_listing.txt”，创建日期为2013年3月8日，文件大小为51千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明的实施例涉及植物分子生物学领域，本发明的实施例具体地涉及用于向植物赋予昆虫抗性的DNA构建体。本发明的实施例更具体地涉及抗昆虫性玉米植物事件DP-004114-3并且涉及用于检测样品及其组合物中玉米事件DP-004114-3的存在的测定法。

背景技术

本发明的实施例涉及抗昆虫性玉米(玉蜀黍(Zea mays))植物DP-004114-3，也称作“玉米系DP-004114-3”、“玉米事件DP-004114-3”和“4114玉米”，并且涉及玉米植物DP-004114-3的DNA植物表达构建体和在玉米植物DP-004114-3及其子代中检测转基因/侧翼插入区域。

玉米是一种重要作物并且是世界许多地区的主要食物来源。尽管采用了诸如化学杀虫剂之类的保护性措施，然而由害虫造成的损害仍是世界范围玉米作物损耗的主要因素。有鉴于此，已经将抗昆虫性基因工程化至作物如玉米中，以控制昆虫损害并降低对传统化学杀虫剂的需要。已经用于产生转基因抗昆虫性作物的一组基因是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)的δ-内毒素类。δ-内毒素已经成功地表达于农作植物如棉属植物、马铃薯、稻、向日葵以及玉米中，并且已经证明提供了优异的病害昆虫控制作用。(Perlak，F.J et al.(1990)Bio/Technology 8：939-943(Perlak，F.J等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第939-943页)；Perlak，F.J.et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：313-321(Perlak，F.J.等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第313-321页)；Fujimoto，H.et al.(1993)Bio/Technology 11：1151-1155(Fujimoto，H.等人，1993年，《生物技术》，第11卷，第1151-1155页)；Tu et al.(2000)Nature Biotechnology18：1101-1104(Tu等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第1101-1104页)；PCT公开WO 01/13731；以及Bing，J.W.et al.(2000)Efficacy ofCry1F Transgenic Maize，14^thBiennial International Plant Resistance to InsectsWorkshop，Fort Collins，CO(Bing，J.W.等人，2000年，《Cry1F转基因玉米的功效》，第14届两年一度的国际植物昆虫抗性研讨会，科罗拉多州科林斯堡))。

已知外来基因在植物中的表达受它们在植物基因组中的位置影响，这可能归因于染色质结构(例如，异染色质)或转录调节元件(例如，增强子)接近整合位点的接近度(Weising et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weising等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页))。与此同时，转基因在基因组中不同位置处的存在将以不同方式影响植物的总体表型。出于这个原因，经常需要筛选大量事件，以鉴定出以导入的目的基因的最佳表达为特征的事件。例如，已经在植物及在其他生物体中观察到，在事件之间可能存在导入基因的表达水平的巨大差异。在表达的空间或时刻模式方面也可以存在差异，例如，转基因在多种植物组织中相对表达方面的差异，这可能不对应于从存在于导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的模式。出于这个原因，常见的是产生数百至数千个不同事件，并从这些事件中筛选出具有合乎需要的转基因表达水平和用于商业目的模式的单一事件。利用常规育种方法，具有合乎需要的转基因表达水平或模式的事件可用于将转基因通过有性远交渐掺至其他遗传背景中。此类杂交的子代维持原始转化体的转基因表达特征。使用这种策略以在充分适应于局部生长条件的众多品种中确保可靠的基因表达。

如能够检测特定事件的存在以确定有性杂交体的子代是否含目的转基因，将是有利的。此外，用于检测特定事件的方法将有助于例如符合要求销售前批准和标注源自重组作物植物的食品的法规，或用于环境监测、在田间监测作物的性状、或监测源自作物收获物的产品、以及用于确保各方主体遵守法规条款或合同条款。

可以通过本领域已知的任何核酸检测方法，包括、但不限于聚合酶链反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交法，来检测转基因的存在。这些检测方法通常集中于频繁使用的遗传元件，如启动子、终止子、标记基因等，因为对于许多DNA构建体而言，编码区是可互换的。因此，此类方法可能无法用于区分不同的事件，尤其是使用相同DNA构建体或十分相似的构建体所产生的那些事件，除非已知与插入的异源DNA相邻的侧翼DNA的DNA序列。例如，美国专利No 6,395,485中描述了一种用于检测原种事件GAT-ZM1的事件特异性PCR测定法。因此，期望拥有一种用于鉴定事件DP-004114-3的简单而又有甄别性的方法。

发明内容

本发明的实施例涉及用于产生和选择抗昆虫性单子叶农作植物的方法。更具体地，提供了一种在植物细胞和植物中表达时赋予抗昆虫性的DNA构建体。根据本发明的一个方面，提供了一种能够导入宿主细胞中并且在其中复制的DNA构建体，所述DNA构建体在植物细胞和植物中表达时赋予所述植物细胞和植物抗昆虫性。玉米事件DP-004114-3由农杆菌介导的质粒PHP27118转化产生。该事件含有cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因盒，它们赋予针对某些鳞翅目(lepidopteran)和鞘翅目(coleopteran)害虫的抵抗性以及对膦丝菌素(phosphinothricin)耐受性。

具体而言，第一盒含有截短形式的来自苏云金芽孢杆菌鲇泽变种(Bacillus thuringiensis var.aizawai)的cry1F基因。cry1F基因的插入赋予针对鳞翅目害虫损害的抗性。Cry1F蛋白(SEQ ID NO：1)由605个氨基酸组成并且具有大约68kDa的分子量。cry1F基因的表达受玉米多聚遍在蛋白启动子控制(Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.118(4)：675-89(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第118卷，第4期，第675-689页))，从而提供Cry1F蛋白在玉米中的组成型表达。该区域还包括与天然多聚遍在蛋白启动子相关联的5′非翻译区(UTR)和内含子。cry1F基因的终止子是来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒pTi15955的开放读框25(ORF 25)的聚(A)添加信号(Barker et al.(1983)Plant Mol.Biol.2：335-350(Barker等人，1983年，《植物分子生物学》，第2卷，第335-350页))。

第二盒含有从苏云金芽孢杆菌菌株PS149B1分离的cry34Ab1基因(美国专利No.6,127,180、No.6,624,145和No.6,340,593)。Cry34Ab1蛋白(SEQ ID NO：2)的长度是123个氨基酸残基并且具有大约14kDa的分子量。cry34Ab1基因的表达受带有5′UTR和内含子的玉米多聚遍在蛋白启动子的第二拷贝控制(Christensen等人，1992年，出处同上)。cry34Ab1基因的终止子是pinII终止子(Keil et al.(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-5650(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)；An et al.(1989)Plant Cell 1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))。

第三基因盒含有也从苏云金芽孢杆菌菌株PS149B1分离的cry35Ab1基因(美国专利No.6,083,499、No.6,548,291和No.6,340,593)。Cry35Ab1蛋白(SEQ ID NO：3)具有383个氨基酸的长度和大约44kDa的分子量。Cry34Ab1和Cry35Ab1蛋白在植物中的同时表达赋予对鞘翅目昆虫的抗性。cry35Ab1基因的表达受普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)过氧化物酶启动子和前导序列控制(Hertig et al.(1991)Plant Mol.Biol.16：171-174(Hertig等人，1991年，《植物分子生物学》，第16卷，第171-174页))。cry35Ab1基因的终止子是pinII终止子的第二拷贝(Keil等人，1986年，出处同上；An等人，1989年，出处同上)。

第四也是最后的基因盒含有来自绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的膦丝菌素乙酰基转移酶基因(pat)的已经针对在玉米中的表达进行了优化的形式。pat基因表达赋予膦丝菌素耐受性的膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)。PAT蛋白(SEQ ID NO：4)的长度是183个氨基酸残基并且具有大约21kDa的分子量。pat基因的表达受来自CaMV 35S转录物的启动子区和终止子区控制(Franck et al.(1980)Cell 21：285-294(Franck等人，1980年，《细胞》，第21卷，第285-294页)；Odell et al.(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)；Pietrzak，et al.(1986)Nucleic Acids Res.14(14)：5857-5868(Pietrzak等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第14期，第5857-5868页))。还提供了含有所述DNA构建体的植物。

根据本发明的另一个实施例，提供了用于鉴定命名为DP-004114-3的新玉米植物的组合物和方法。所述方法基于特异性识别DP-004114-3的5′和/或3′侧翼序列的引物或探针。提供了包含以下引物序列的DNA分子，其中在PCR反应中使用时，所述引物序列将产生对转基因事件DP-004114-3为独特的扩增子。包含这些分子的玉米植物和种子是本发明的一个实施例。另外，提供了使用这些引物序列以鉴定DP-004114-3事件的试剂盒。

本发明的另外一个实施例涉及本文所述的DP-004114-3的特定侧翼序列，所述特定侧翼序列可以用来开发针对生物学样品中DP-004114-3的特异性鉴定方法。更具体地，本发明涉及可以用于开发特异性引物和探针的DP-004114-3的5′和/或3′侧翼区。本发明的又一个实施例涉及用于基于使用此类特异性引物或探针鉴定生物学样品中DP-004114-3的存在的方法。

根据本发明的另一个实施例，提供了检测样品中对应玉米事件DP-004114-3的DNA的存在的方法。此类方法包括：(a)使包含DNA的样品与DNA引物组接触，当用于具有从玉米事件DP-004114-3提取的基因组DNA的核酸扩增反应中时，所述DNA引物组产生判定玉米事件DP-004114-3的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生所述扩增子；以及(c)检测所述扩增子。

根据本发明的另一个实施例，提供了检测样品中对应DP-004114-3事件的DNA分子的存在的方法，此类方法包括：(a)使包含从玉米植物提取的DNA的样品与DNA探针分子接触，所述DNA探针分子在严格杂交条件下与从玉米事件DP-004114-3提取的DNA杂交并且在所述严格杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使样品和探针经历严格杂交条件；和(c)检测所述探针与所述DNA的杂交。更具体地，提供了检测样品中对应DP-004114-3事件的DNA分子的存在的方法，此类方法由以下步骤组成：(a)使包含从玉米植物提取的DNA的样品与DNA探针分子接触，所述DNA探针分子由对于所述事件为独特的序列(例如连接序列)组成，其中所述DNA探针分子在严格杂交条件下与从玉米事件DP-004114-3提取的DNA杂交并且在所述严格杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使样品和探针经历严格杂交条件；和(c)检测所述探针与所述DNA的杂交。

此外，提供了用于鉴定生物学样品中的事件DP-004114-3的试剂盒和方法，其检出DP-004114-3的特异性区域。

提供了包含DP-004114-3的至少一个连接序列的DNA分子；其中连接序列跨越插入基因组中的异源DNA与来自玉米细胞的分布在插入位点侧翼的DNA(即侧翼DNA)之间的接点并且用于判定DP-004114-3事件。

根据本发明的另一个实施例，提供了产生抗昆虫性玉米植物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将包含赋予抗昆虫性的本发明表达盒的第一亲本玉米系和缺少抗昆虫性的第二亲本玉米系有性杂交，从而产生多个子代植物；以及(b)选择抗昆虫的子代植物。此类方法可以任选地包括又一步骤：将所述子代植物与第二亲本玉米系回交以产生抗昆虫的纯种玉米植物。

本发明的又一个实施例提供了产生抵抗昆虫的玉米植物的方法，所述方法包括用DNA构建体PHP27118转化玉米细胞，将转化的玉米细胞培育成玉米植物，选择显示抗昆虫性的玉米植物，以及进一步将所述玉米植物培育成能育玉米植物。所述能育玉米植物可以自我授粉或与相容性玉米品种杂交以产生抗昆虫性子代。

本发明的另一个实施例还涉及用于鉴定生物学样品中玉米事件DP-004114-3的DNA检测试剂盒。所述试剂盒包括用于PCR鉴定方案中的第一引物和第二引物，所述第一引物特异性识别DP-004114-3的5′或3′侧翼区，所述第二引物特异性识别在DP-004114-3的外来DNA内部或在所述侧翼DNA内部的序列。本发明的又一个实施例涉及用于鉴定生物学样品中事件DP-004114-3的试剂盒，所述试剂盒包括具有对应下述序列或与下述序列互补的序列的特异性探针，所述序列与事件DP-004114-3的特定区域具有80％至100％的序列同一性。所述探针的序列对应包含事件DP-004114-3的部分5′或3′侧翼区的特定区域。

由本发明实施例涵盖的方法和试剂盒可以用于不同目的，如，但不限于以下目的：鉴定植物、植物材料中或产品(如但不限于包含或源自植物材料的(新鲜或加工)食品或饲料产品)中的事件DP-004114-3；额外地或备选地，出于分离转基因材料和非转基因材料的目的，所述方法和试剂盒可以用来鉴定转基因植物材料；额外地或备选地，所述方法和试剂盒可以用来确定包含玉米事件DP-004114-3的植物材料的品质。所述试剂盒也可以含有为执行所述检测方法所必需的试剂和材料。

本发明的又一个实施例涉及DP-004114-3玉米植物或其部分，包括、但不限于玉米植物DP-004114-3及源自其的子代的花粉、胚珠、营养细胞、花粉细胞的核和卵细胞的核。DNA引物分子从中提供特定扩增子产物的DP-004114-3玉米植物和种子是本发明的一个实施例。

本发明的前述和其他方面将会因以下详细描述和附图变得更显而易见。

附图说明

图1.带有所示遗传元件和Hind III限制性酶位点的质粒PHP27118的示意图。质粒大小是54910bp(碱基对)。

图2.显示cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因(箭头)连同它们的相应调节元件的T-DNA的示意图。显示了T-DNA内部的Hind III限制性酶位点。T-DNA的大小是11978bp。

图3.DP-004114-3的转化和发育的示意图。

图4.在相同遗传背景(DP-004114-3玉米，等位基因系作为阴性对照)下，在使用玉米杂种籽苗的亚致死性籽苗测定法中，西方玉米根虫(WCRW)幼虫发育作用。结果基于三次重复。各直方图显示在卵孵化17日处于三个龄期中每一龄期的幼虫的百分数。向龄期3偏移表示功效下降。

图5.4114玉米中经测序的插入区和基因组边界区的示意图。该图显示从4114玉米基因组DNA产生的经克隆和测序的PCR片段：片段A至F。垂直的虚线代表基因组边界/插入接点。片段G和H分别代表5′和3′基因组边界区。图未按比例绘制。

发明详述

提供以下定义和方法以更好地限定本发明并引导本领域普通技术人员实施本发明。除非另外说明，否则术语将根据相关领域普通技术人员的常规用法进行理解。分子生物学中常见术语的定义也可以在Rieger et al.，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5^thedition，Springer-Verlag；NewYork，1991(Rieger等人，《经典遗传学和分子遗传学词汇》，第5版，施普林格出版社，纽约，1991年)；和Lewin，GenesV，Oxford UniversityPress：New York，1994(Lewin，《基因V》，牛津大学出版社，纽约，1994年)中找到。使用如在37 CFR§1，822处所述的DNA碱基命名。

下表描述本文件通篇范围内和尤其是实例部分中所用的缩写。

缩写表

本公开的组合物包括以专利保藏号PTA-11506保藏的种子及源自其中的植物、植物细胞和种子。申请人已经在2010年11月24日于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209美国(Manassas，VA 20110-2209 USA)保藏了玉米事件DP-004114-3的至少2500粒种子，并且保藏物获得ATCC保藏号PTA-11506。这些保藏物将在国际承认用于专利程序目的的微生物保存布达佩斯条约的条款下维持。这些保藏物仅为便利于本领域技术人员而保存，并非承认保藏物是在35 U.S.C.§112下所要求的。2010年11月24保藏于ATCC的种子取自先锋良种国际有限公司，7250 NW第62大道，庄士敦，爱荷华50131-1000(Pioneer Hi-BredInternational，Inc.，7250 NW 62^nd Avenue，Johnston，Iowa 50131-1000)所维护的保藏物。在本申请待决期间，专利商标局首长和当请求时由该首长决定授权的人可以取得这种保藏物。一旦本申请中的任何权利要求得到许可，根据37 C.F.R.§1.808，申请人将使公众可获得保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801利伯缇大学，马纳萨斯，弗吉尼亚州，VA 20110-2209(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)的至少2500粒杂交玉米种子的保藏物样品。玉米事件DP-004114-3的种子的这种保藏物将在作为一家公共保藏单位的ATCC保藏单位维持30年时间，或在最近请求后5年，或持续至本专利的有效期限(以较长时间为准)，并且如果在这个时间期间它变得无活力的话将予以更换。另外，申请人已经满足37C.F.R.§§1，801-1，809的全部要求，包括提供所述样品在保藏时有活力的指示。申请人没有权力放弃法律对生物材料转移或其商业运输所规定的任何限制。申请人不豁免对本专利下所授予的其权利或在植物品种保护法(7USC 2321 et seq.)下适用于事件DP-004114-3的其权利的任何侵犯。禁止未授权的种子繁殖。种子可以接受管理。

如本文所用，术语“包含”意指“包括但不限于”。

如本文所用，术语“玉米”意指玉蜀黍(Zea mays)或包谷，包括可与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米物种在内。

如本文所用，术语“DP-004114-3特异性”指适于区别性鉴定植物、植物材料中或产品(如但不限于包含或源自植物材料的(新鲜或加工)食品或饲料产品)中事件DP-004114-3的核苷酸序列。

如本文所用，术语“抗昆虫性”和“影响病害昆虫”指在任何发育阶段引起在昆虫采食、生长、和/或行为方面的变化，包括但不限于：杀死昆虫；迟滞生长；阻碍繁殖能力；抑制采食；等。

如本文所用，术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地用来指某生物体或物质(例如蛋白质)的可以通过众多参数进行测量的活性，所述参数包括、但不限于：害虫死亡率、害虫重量减轻、害虫吸引、害虫排斥性和害虫在采食和/或暴露于所述生物体或物质持续适宜的时间长度后的其他行为和身体变化。例如，“杀虫蛋白”是本身或与其他蛋白质组合表现杀虫活性的蛋白质。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。如本文所用，在指定核酸的语境中使用时，术语“编码”或“编码的”意指所述核酸包含了指导核苷酸序列翻译成所指定蛋白质的必要信息。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。编码蛋白质的核酸可以包含在所述核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。

“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指如自然界中找到那样具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因、且包含在自然界中不在一起的调节序列和编码序列的任何基因。因此，嵌合基因可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”指在生物体基因组中其天然位置内的天然基因。“外来”指通常不存在于目的位置内的材料。因而“外来DNA”可以包括植物的重组DNA以及新导入的重排DNA。“外来”基因指通常不存在于宿主生物体中、但通过基因转移导入所述宿主生物体中的基因。外来基因可以包括插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化方法导入基因组中的基因。植物基因组中已经插入重组DNA的位点可以称作“插入位点”或“靶位点”。

如本文所用，“插入DNA”指在用来转化植物材料的表达盒内部的异源DNA，而“侧翼DNA”可以作为生物体如植物中天然存在的基因组DNA或经转化方法导入的相对原始插入DNA分子为外源的外来(异源)DNA(例如，与转化事件相关的片段)而存在。如本文所用的“侧翼区”或“侧翼序列”指至少20bp、优选地至少50bp和至多到5000bp的序列，其紧邻原始外来插入DNA分子上游存在并与其保持连续或紧邻原始外来插入DNA分子下游存在并与其保持连续。导致外来DNA随机整合的转化方法将产生这样的转化体，它们含有作为每种转化体的特征并且为其独有的不同侧翼区。当重组DNA经传统杂交导入植物时，其侧翼区通常将不改变。转化体还将在一片异源插入DNA和基因组DNA或两(2)片基因组DNA或两(2)片异源DNA之间含有独特接点。“接点”是两个(2)特定DNA片段接合的点。例如，插入DNA接合侧翼DNA之处存在的接点。接点也存在于其中两个(2)DNA片段以改自于天然生物体中存在的方式接合在一起的转化生物体中。“接点DNA”指包含接点的DNA。本公开中所示的两个连接序列是在玉米基因组DNA和如SEQ ID NO：27中所示的插入物的5′末端之间的接点和在所述插入物的3′末端和如SEQ ID NO：28中所示的玉米基因组DNA之间的接点。

如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，与异源核苷酸序列可操作地连接的启动子所来自的物种可以不同于衍生所述核苷酸序列的物种，或，如果来自相同物种，则所述启动子不天然地与所述核苷酸序列可操作地连接。异源蛋白质可以源自外来物种，或如果源自相同物种，则为通过蓄意的人为干预对其原始形式进行了实质性修饰。

“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、和多腺苷化作用识别序列。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的3′。启动子序列由近端上游元件和更远的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以刺激启动子活性并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成性核苷酸片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以引导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或应答于不同的环境条件时表达。引起核酸片段在大部分细胞类型中在大多数时间表达的启动子常称作“组成型启动子”。不断发现可用于植物细胞中的多种类型的新启动子；众多例子可以在Okamuro and Goldberg(1989)Biochemistry of Plants 15：1-82(Okamuro和Goldberg，1989年，《植物生物化学》，第15卷，第1-82页)的汇编中找到。还认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切界限仍未彻底限定，因此不同长度的核酸片段可以具有相同的启动子活性。

“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响众多参数，包括初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的例子(Turner and Foster(1995)Mol.Biotechnol.3：225-236(Turner和Foster，1995年，《分子生物技术》，第3卷，第225-236页))。

“3′非编码序列”指位于编码序列下游并包括多腺苷酸化作用识别序列和编码调节信号的其他序列的核苷酸序列，其中所述调节信号能够影响mRNA加工或基因表达。多腺苷酸化信号通常以影响添加多腺苷酸串至mRNA前体3′末端为特征。不同的3′非编码序列的用途由Ingelbrecht et al.(1989)Plant Cell 1：671-680(Ingelbrecht等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第671-680页)例举。

“蛋白质”或“多肽”是以编码多肽的多核苷酸中编码序列所决定的特定顺序排列的氨基酸链。

DNA构建体是被连接在一起的提供一个或多个表达盒的DNA分子的装配物。DNA构建体可以是能够在细菌细胞中自我复制并且含有可用于导入DNA分子的多个核酸内切酶限制性位点的质粒，所述DNA分子提供功能性遗传元件即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3′终止区及其他；或DNA构建体可以是DNA分子的线性装配物，如表达盒。包含在DNA构建体内的表达盒包括提供信使RNA转录的必需的遗传元件。可以将表达盒设计成在原核细胞或真核细胞中表达。将本发明实施例的表达盒设计成在植物细胞中表达。

在用于在目的生物体中表达的表达盒中提供本发明实施例的DNA分子。所述盒将包括与编码序列可操作地连接的5′和3′调节序列。“可操作地连接”意指连接的核酸序列是连续的，并且在需要接合两个蛋白质编码区的情况下，是连续并且处于相同的读框中。“可操作地连接”意指表示启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并且介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。所述盒可以额外地含有至少一个待共转化入生物体中的额外基因。备选地，可以在多个表达盒或多个DNA构建体上提供额外的基因。

所述表达盒将在5′至3′转录方向上包括：在充当宿主的生物体中有功能的转录及翻译起始区域、编码区和转录及翻译终止区。转录起始区域(即，启动子)可以是天然的或类似的，或相对于宿主生物体是外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。表达盒可以在表达盒构建体中额外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。

应当理解，如本文所用的术语“转基因的”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分、或植物，其基因型已经因异源核酸的存而改变，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些转基因。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

通过以下方式产生转基因“事件”：用异源DNA构建体(包括包含目的转基因的核酸表达盒)转化植物细胞，由于所述转基因插入到所述植物的基因组中而再生出一批植物，以及选择以插入到特定基因组位置中为特征的特定植物。事件通过转基因的表达在表型上(phenotypically)得以表征。在基因层次上看，事件是植物的基因构成(genetic makeup)的一部分。术语“事件”还指通过转化体和包含异源DNA的另一个品种之间有性远交所产生的子代。甚至与轮回亲本反复回交后，插入的DNA和来自转化亲本的侧翼DNA存在于杂交子代中相同的染色体位置处。术语“事件”也指来自原始转化体的包含所插入DNA和与插入DNA紧邻的侧翼序列的DNA，其中预期所述的DNA转移至子代，所述子代因包括所述插入DNA的一个亲本系(例如，原始转化体和因自交产生的子代)与不含所述插入DNA的亲本系的有性杂交而接受包含目的转基因的插入DNA。

可以通过以下方式繁育抗昆虫性DP-004114-3玉米植物：首先将由培育自转基因DP-004114-3玉米植物及其子代的玉米植物组成的第一亲本玉米植物与缺少抗昆虫性的第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生多个第一子代植物，其中所述转基因DP-004114-3玉米植物及其子代源自用赋予抗昆虫性的本发明实施例的表达盒转化；随后选择抵抗昆虫的第一子代植物；将第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物；以及随后从第二子代植物选择抗昆虫性植物。这些步骤可以进一步包括将第一抗昆虫性子代植物或第二抗昆虫性子代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交，从而产生抵抗昆虫的玉米植物。

如本文所用，术语“植物”包括指称完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其子代。应理解为处于本发明范围内的转基因植物的部分包括，例如起源于先前用本发明DNA分子转化的转基因植物或其子代并且因此至少部分地由转基因细胞组成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶子、和根，它们也是本发明的实施例。

如本文所用，术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽苗、配子体、孢子体、花粉、和小孢子。可用于本发明方法的植物的类别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物在内。

“转化”指核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，从而得到遗传上稳定的遗传性。含有转化的核酸片段的宿主生物体称作“转基因”生物体。植物转化方法的例子包括农杆菌介导的转化法(De Blaere et al.(1987)Meth.Enzymol.143：277(De Blaere等人，1987年，《酶学方法》，第143卷，第277页))和粒子加速或“基因枪”转化技术(Klein et al.(1987)Nature(London)327：70-73(Klein等人，1987年，《自然(伦敦)》，第327卷，第70-73页)；美国专利No.4,945,050，所述文献通过引用方式并入本文)。下文公开其它转化方法。

因而，可以将本发明分离出的多核苷酸并入能够导入宿主细胞中并在其中复制的重组构建体，一般是DNA构建体。这种构建体可以是载体，其包括能够在给定宿主细胞中转录和翻译编码多肽的序列的复制系统和序列。适用于稳定转染植物细胞或适用于建立转基因植物的众多载体已经在例如Pouwels et al.，(1985；Supp.1987)Cloning Vectors：ALaboratory Manual(Pouwels等人，(1985年；增刊1987年)，《克隆载体：实验室手册》)；Weissbach and Weissbach(1989)Methods for Plant MolecularBiology，(Academic Press，New York)(Weissbach和Weissbach，1989年，《植物分子生物学方法》，学术出版社，纽约)；和Flevin et al.，(1990)Plant Molecular Biology Manual，(Kluwer Academic Publishers)(Flevin等人，1990年，《植物分子生物学手册》，克吕维尔学术出版社))中描述。一般，植物表达载体包括例如一个或多个在5′和3′调节序列的转录性控制下的克隆的植物基因和显性可选择标记。此类植物表达载体还可以含有启动子调节区(例如，控制诱导型表达或组成型表达、环境或发育调节型表达、或者细胞或组织特异性表达的调节区)、转录引发起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

还应该理解，也可以将两株不同的转基因植物交配以产生含有两个独立分离添加的、外源基因的子代。合适子代的自交可产生针对所述两个所加入的外源基因而言均是纯合的植物。还设想与亲本植物的回交和与非转基因植物的远交，还有无性繁殖。有关常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述，可在几个参考文献之一中找到，例如Fehr著于BreedingMethods for Cultivar Development，Wilcos J.ed.，American Society ofAgronomy，Madison Wis.(1987)(《品种选育的育种方法》，Wilcos J.编辑，美国农学会，威斯康星州麦迪逊，1987年)。

“探针”是与常规的可检测标记或报道分子(如放射性同位素、配体、化学发光试剂、或酶)连接的分离的核酸。这种探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况下，与来自玉米事件DP-004114-3的分离的DNA链互补，无论其是来自玉米植物还是来自包括来自所述事件的DNA的样品。根据本发明的探针包含与靶DNA序列特异性结合并且可以用来检测这种靶DNA序列存在的脱氧核糖核酸或核糖核酸和聚酰胺及其他探针材料。

“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补性靶DNA链退火以形成引物和靶DNA链之间的杂交体，随后由聚合酶(如DNA聚合酶)沿靶DNA链延伸。本发明的引物对指它们用于扩增靶核酸序列的用途，例如，通过PCR或其他常规的核酸扩增方法。“PCR”或“聚合酶链反应”是用于扩增特定DNA片段的技术(见，美国专利No.4,683，195和No.4,800,159；所述专利通过引用方式并入本文)。

探针和引物要有足够的核苷酸长度，以在操作员确定的杂交条件或反应条件下与靶DNA序列特异性地相结合。该长度可以是任何长度，其是在选择的检测方法中有用的足够长度。通常，使用11个或更多个核苷酸的长度、18个或更多个核苷酸的长度、和22个或更多个核苷酸的长度。此类探针和引物在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。根据本发明实施例的探针和引物可以与靶序列具有完全的连续核苷酸DNA序列相似性，不过可以通过常规方法设计与靶DNA序列不同并保持与靶DNA序列杂交的能力的探针。探针可以作为引物使用，不过通常设计成与靶DNA或RNA结合并且不用于扩增过程中。

特异性引物可以用来扩增整合片段以产生可以作为鉴定生物学样品中事件DP-004114-3的“特异性探针”使用的扩增子。当探针与生物学样品的核酸在允许探针与所述样品结合的条件下杂交时，这种结合可以被检测到并因而允许指示事件DP-004114-3在生物学样品中存在。已经在本领域中描述了对结合的探针的这种鉴定。在本发明的一个实施例中，所述特异性探针是这样的序列，所述序列在优化条件下与所述事件的5′或3′侧翼区内部的区域特异性杂交并且还包含与所述区域邻接的外来DNA的部分。特异性探针可以包含与所述事件的特定区域至少80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、和95％至100％相同(或互补)的序列。

用于制备和使用探针和引物的方法例如在Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2^naed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.1989(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第二版，第1-3卷，冷泉港实验室出版，纽约冷泉港，1989年)(下文为“Sambrook等人，1989年”)；Ausubel et al.eds.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork，1995(Ausubel等人编辑，《现代分子生物学实验技术》，格林出版社和威利国际科学出版社，纽约，1995年)(定期更新)(下文为“Ausubel等人，1995年”)；和Innis et al.，PCR Protocols：AGuide toMethods and Applications，Academic Press：San Diego，1990(Innis等人，《PCR方案：方法和应用指南》，学术出版社，圣地亚哥，1990年)中描述。PCR引物对可以从已知的序列衍生，例如，通过使用意图用于此目的的计算机程序如Vector NTI版本6中的PCR引物分析工具(马里兰州贝塞斯达的Informax Inc公司(Informax Inc.，Bethesda MD))；PrimerSelect(威斯康辛州麦迪逊的DNASTAR Inc公司(DNASTAR Inc.，Madison，WI))；和Primer(版本1991，马萨诸塞州坎布里奇的怀特海生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Mass.))。另外，还可以目视地扫描序列，并可使用本领域技术人员已知的指南手工地确定引物。

如本文所用的“试剂盒”指一组试剂，它们意在实施本发明的方法实施例，更具体地是鉴定生物学样品中的事件DP-004114-3。本发明的试剂盒可以用于以下目的，并且其组分可以为以下目的而专门调整：质量控制(例如，种子批的纯度)、检测植物材料或包含或源自植物材料的材料(如但不限于食品或饲料产品)中的事件DP-004114-3。如本文中所用，“植物材料”指从植物获得或衍生的材料。

通过常规方法例如通过将此类序列再克隆和测序，基于本文中公开的侧翼DNA和插入物序列的引物和探针可以用来证实(并且，如果需要，校正)公开的序列。本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可以用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些环境下与其他核酸分子特异性地杂交。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称这两个分子能够彼此特异性杂交。

如果两个核酸分子显示出完全互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本文所用，当所述分子之一的每一个核苷酸均与另一个分子的核苷酸互补时，则称该分子显示出“完全互补性”。如果两个分子可以在至少常规“低严格性”条件下以足够稳定性彼此杂交以允许它们保持彼此退火，则称这两个分子是“最小互补的”。类似地，如果两个分子可以在常规“高严格性”条件下以足够稳定性彼此杂交以允许它们保持彼此退火，则称这两个分子是“互补的”。常规的严格性条件由Sambrook等人，1989年并且由Haymes等人在：Nucleic Acid Hybridization，a Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)(《核酸杂交实用方法》，IRL出版社，华盛顿哥伦比亚特区，1985年)中描述，偏离完全互补性因此是允许的，只要此类偏离没有彻底地排除分子形成双链结构的能力。为了充当引物或探针，核酸分子仅需要在序列上足够互补以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。

在杂交反应中，特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。热解链温度(T_m)是(在限定的离子强度和pH下)50％互补性靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以从Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的等式近似获得：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中乌嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。T_m因每1％错配下降约1℃；因此，可以调节T_m、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有＞90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的T_m低约5℃。然而，极严格条件可以利用比T_m低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比T_m低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比T_m低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。

利用所述公式，杂交和洗涤组成以及所需的T_m，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(含水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)(Tijssen，1993，《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔出版社，纽约)；以及Ausubel等人编辑(1995)和Sambrook等人(1989)。

如本文所用，基本上同源的序列是这样的核酸分子，其将在高严格条件下特异性杂交至与其比较的核酸分子互补物。促进DNA杂交的适宜严格性条件，例如，约45℃下的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后50℃下2XSSC洗涤，是本领域技术人员已知的，或可以在Ausubel等人(1995)，6.3.1-6.3.6中找到。通常，严格条件将为那些其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃于1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交和在55℃至60℃于0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在60℃至65℃于0.1X SSC中洗涤。本发明的核酸可在中等严格性条件下特异性杂交于对于DP-004114-3事件为独特的一个或多个核酸分子或其互补物或任一者的片段。

将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可以使用计算机数学算法完成任意两个序列之间同一性百分比的确定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17(Myers和Miller，1988年，《生物信息学》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部同源算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的同源比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：244402448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的相似性检索方法(search-for-similarity-method)；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第2264页)的算法，如Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。

这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类执行序包括、但不限于：PC/Gene程序(可获自加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Mountain View，California))中的CLUSTAL；ALIGN程序(2.0版本)；ALIGN PLUS程序(版本3.0，版权1997)；和WisconsinGenetics软件包，版本10(从Accelrys公司，9685 Scranton路，圣迭戈，加利福尼亚州92121，美国(Accelrys，9685 Scranton Road，San Diego，CA92121，USA)可获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。

CLUSTAL程序由如下文献充分描述：Higgins and Sharp，Gene 73：237-244(1988)(Higgins和Sharp，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年)；Corpet，et al.，Nucleic Acids Research 16：10881-90(1988)(Corpet等人，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页，1988年)；Huang，et al.，Computer Applications in the Biosciences 8：155-65(1992)(Huang等人，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页，1992年)和Pearson，et al.，Methods in Molecular Biology24：307-331(1994)(Pearson等人，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页，1994年)。ALIGN和ALIGNPLUS程序基于上文的Myers和Miller(1988)算法。Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序基于上文的Karlin和Altschul(1990)算法。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；和TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。见，Ausubel等人(1995)。比对可以通过视检法手工地进行。

为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul et al.(1997)NucleicAcidsRes.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所描述采用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。见上文Altschul等人(1997)。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。

如本文所用，在两个核苷酸序列或多肽序列的场合下，“序列同一性”或“同一性”意指在对指定的比较窗口范围内的最大对应性进行比对时，这两个序列中残基的相同程度。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。将由于此类保守性置换而不同的序列称作具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Mountain View，California))中所执行那样进行计算。

本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算所述百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

就使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列(例如，通过PCR)而言，“严格条件”是允许所述引物对仅与靶核酸序列杂交并且优选地允许在DNA热扩增反应中产生特定扩增产物即扩增子的条件，其中具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物将与所述靶核酸序列结合。

术语“对(靶序列)特异的”表示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。

如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板的一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为确定因有性杂交产生的玉米植物是否含有来自本发明玉米植物的转基因事件基因组DNA，可以使从玉米植物组织样品提取的DNA接受使用DNA引物对的核酸扩增方法处理，以产生判定所述事件DNA存在的扩增子，其中所述DNA引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物源自与插入的异源DNA的插入位点相邻的侧翼序列，所述第二引物源自插入的异源DNA。备选地，第二引物可以源自侧翼序列。所述扩增子具有还可据以判定所述事件的长度和序列。扩增子的长度可以在所述引物对外加一个核苷酸碱基对的联合长度至通过DNA扩增方案可产生的任何扩增子长度的范围内。备选地，引物对可以源自插入的DNA两侧的侧翼序列，从而产生这样的扩增子，所述扩增子包括PHP27118表达构建体的完整插入物核苷酸序列以及在转基因插入物侧翼的序列。源自侧翼序列的引物对的成员可以与插入的DNA序列相隔一段距离存在，这个距离的范围可以是1个核苷酸碱基对直至扩增反应的限值，或是约20，000bp。术语“扩增子”的使用特别地排除了可以在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增可以通过本领域已知的多种核酸扩增方法(包括PCR)中任一种来完成。多种扩增方法是本领域已知的并且尤其是在美国专利No.4,683，195和No.4,683,202和在上文Innis等人(1990)中描述。已经开发了PCR扩增方法以扩增多到22Kb的基因组DNA和多到42Kb的噬菌体DNA(Cheng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699，1994(Cheng等人，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第5695-5699页，1994年))。这些方法以及本领域已知扩增DNA的其他方法可以用于本发明实施例的实施中。应当理解：特定PCR方案中的众多参数可能需要针对具体的实验室条件进行调整并且可以略作修改并仍允许获得相似的结果。这些调整对本领域技术人员是显而易见的。

可以通过多项技术检测出由这些方法产生的扩增子，所述技术包括、但不限于遗传比特分析法(Nikiforov，et al.Nucleic Acid Res.22：4167-4175，1994(Nikiforov等人，《核酸研究》，第22卷，第4167-4175页，1994年))，其中设计了与相邻的侧翼DNA序列和插入的DNA序列均重叠的DNA寡核苷酸。将所述寡核苷酸固定于微量多孔平板的孔中。在对扩增目的区进行了PCR反应(用一个位于插入序列内的引物和一个位于相邻的侧翼序列内的引物)后，单链PCR产物可以与固定的寡核苷酸杂交并且充当单碱基延伸反应的模板，所述单碱基延伸反应使用DNA聚合酶和对下一个预期碱基特异的标记的ddNTP。读出可以是荧光的或基于ELISA的。信号指示出因成功扩增、杂交、和单碱基延伸而存在插入物/侧翼序列。

另一个检测方法是如Winge(2000)Innov.Pharma.Tech.00：18-24(Winge，2000年，《制药技术创新》，第00卷，第18-24页)所述的焦磷酸测序技术。在这个方法中，设计了与相邻DNA和插入DNA接点重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸与来自目的区域(一个位于插入序列内的引物和一个位于侧翼序列内的引物)的单链PCR产物杂交并且在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酶、腺苷5′磷酸硫酸盐和萤光素存在下温育。单独添加dNTP并且所述掺入产生可测量的光信号。光信号指示因成功扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而存在转基因插入物/侧翼序列。

如Chen et al.，(1999)Genome Res.9：492-498(Chen等人，1999年，《基因组研究》，第9卷，第492-498页)描述的荧光偏振法也是可以用来检测本发明扩增子的方法。使用这种方法时，设计与侧翼和插入DNA接点重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸与来自目的区域(一个位于插入的DNA内的引物和一个位于侧翼DNA序列内的引物)的单链PCR产物杂交并且在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下温育。单碱基延伸导致所述ddNTP的掺入。掺入可以使用荧光计度量为偏振的变化。偏振的变化指示因成功扩增、杂交和单碱基延伸而存在转基因插入物/侧翼序列。

(加利福尼亚州福斯特市的PE应用生物系统公司(PE AppliedBiosystems，Foster City，Calif.))被描述为检测和量化DNA序列存在的方法并且在制造商提供的说明书中充分解释。简而言之，设计了与侧翼和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针和PCR引物(一个位于插入DNA序列内的引物和一个位于侧翼基因组内的引物)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针的杂交导致切割荧光部分并且使其释放远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号指示因成功扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入物序列。

已经描述了用于序列检测的分子信标，如Tyangi et al.(1996)NatureBiotech.14：303-308(Tyangi等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第303-308页)。简而言之，设计了与侧翼和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有使得荧光部分和淬灭部分紧密靠近的二级结构。FRET探针和PCR引物(一个位于插入DNA序列内的引物和一个位于侧翼序列内的引物)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。在成功PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致消除探针二级结构以及荧光部分和淬灭部分的空间分隔。荧光信号产生。荧光信号指示因成功扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入物序列。

使用对扩增子内部存在的序列特异的探针的杂交反应是用来检测由PCR反应产生的扩增子的又一个方法。

玉米事件DP-004114-3能有效对抗昆虫害虫，所述昆虫害虫包括选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等的昆虫，尤其包括选自鞘翅目和鳞翅目的昆虫。

鳞翅目昆虫包括、但不限于夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖、和实夜蛾：Agrotis ipsilon Hufnagel(黑地蚕)；A.orthogonia Morrison(西部地蚕)；A.segetum Denis&Schiffermüller)(蔓青蛾)；A.subterranea Fabricius(粒肤地蚕)；Alabama argillacea Hübner(棉叶虫)；Anticarsia gemmatalis Hübner(黎豆毛虫)；Athetis mindara Barnesand McDunnough(粗皮地蚕)；Earias insulana Boisduval(多刺螟蛉)；E.vittella Fabricius(斑点螟蛉)；Egira(Xylomyges)curialis Grote(柑橘地蚕)；Euxoa messoria Harris(黑边地蚕)；Helicoverpa armigera Hübner(美洲螟蛉)；H.zea Boddie(玉米穗虫或玉米螟蛉)；Heliothis virescensFabricius(烟青虫)；Hypena scabra Fabricius(苜蓿绿叶蛾)；Hyponeumataltula Schaus；Mamestra configurata Walker(披肩粘虫)；M brassicaeLinnaeus(甘蓝夜蛾)；Melanchra picta Harris(斑马纹夜蛾)；Mocislatipes Guenée(小毛胫夜蛾)；Pseudaletia unipuncta Haworth(行军虫)；Pseudoplusia includens Walker(大豆尺蠖)；Richia albicosta Smith(西方豆地蚕)；Spodoptera frugiperda JE Smith(秋夜蛾)；S. exigua Hübner(甜菜夜蛾)；S. litura Fabricius(烟草地蚕，簇毛虫)；Trichoplusia niHübner(卷心菜尺蠖)；来自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果蛾和雕叶虫，如Achroia grisella Fabricius(小蜡螟)；Amyelois transitella Walker(脐橙螟蛾)；Anagasta kuehniella Zeller(地中海粉蛾)；Cadra cautella Walker(杏仁蛾)；Chilo partellusSwinhoe(斑点茎秆钻心虫)；C.suppressalis Walker(条纹茎/水稻钻心虫)；C.terrenellus Pagenstecher(甘蔗蛀茎虫)；Corcyra cephalonicaStainton(米蛾)；Crambus caliginosellus Clemens(玉米根网虫)；C.teterrellus Zincken(蓝草网虫)；Cnaphalocrocis medinalis Guenée(稻卷叶虫)；Desmia funeralis Hübner(葡萄卷叶虫)；Diaphania hyalinataLinnaeus(甜瓜虫)；D.nitidalis Stoll(泡菜虫)；Diatraea flavipennellaBox；D.grandiosella Dyar(西南玉米钻心虫)、D.saccharalis Fabricius(甘蔗钻心虫)；Elasmopalpus lignosellus Zeller(小玉米茎钻心虫)；Eoreumaloftini Dyar(墨西哥水稻钻心虫)；Ephestia elutella Hübner(烟草(可可)蛾)；Galleria mellonella Linnaeus(大蜡蛾)；Hedylepta acceptaButler(甘蔗卷叶虫)；Herpetogramma licarsisalis Walker(草地网虫)；Homoeosoma electellum Hulst(向日葵蛾)；Loxostege sticticalis Linnaeus(甜菜网虫)；Maruca testulalis Geyer(豆荚钻心虫)；Orthaga thyrisalisWalker(茶树网蛾)；Ostrinia nubilalis Hübner(欧洲玉米钻心虫)；Plodia interpunctella Hübner(印度谷蛾)；Scirpophaga incertulas Walker(黄茎钻心虫)；Udea rubigalis Guenée(芹菜叶虫)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫Acleris gloveranaWalsingham(西部黑头蚜虫)；A.variana Fernald(东部黑头蚜虫)；Adoxophyes orana Fischer von (夏季果实卷叶蛾)；黄卷蛾属(Archips spp.)包括A.argyrospila Walker(果树卷叶虫)和A.rosanaLinnaeus(欧洲卷叶虫)；条卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；Bonagotasalubricola Meyrick(巴西苹果卷叶虫)；色卷蛾属(Choristoneura spp.)；Cochylis hospes Walsingham(向日葵带蛾)；Cydia latiferreana Walsingham(榛树虫)；C.pomonella Linnaeus(苹果蠹蛾)；Endopiza viteanaClemens(葡萄浆果蛾)；Eupoecilia ambiguella Hübner(葡萄树蛾)；Grapholita molesta Busck(东方果实蛾)；Lobesia botrana Denis&Schiffermüller(欧洲葡萄藤蛾(European grape vine moth))；Platynotaflavedana Clemens(杂色卷叶蛾)；P.stultana Walsingham(杂食卷叶虫)；Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller(苹果芽小卷叶蛾(eyespottedbud moth))；和Suleima helianthana Riley(向日葵蚜蛾)。

鳞翅目中选择的其他农艺学害虫包括但不限于Alsophila pometariaHarris(秋尺蠖)；Anarsia lineatella Zeller(桃树枝钻心虫)；Anisotasenatoria J.E.Smit(橙色条纹橡树虫)；Antheraea pernyi Guérin-Méneville(中国橡树丝蛾)；Bombyx mori Linnaeus(蚕)；Bucculatrix thurberiellaBusck(棉叶潜蛾)；Colias eurytheme Boisduval(苜蓿毛虫)；Datanaintegerrima Grote&Robinson)(胡桃毛虫(walnut caterpillar))；Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov(西伯利亚丝蛾)，Ennomos subsignariaHübner(榆树尺蠖)；Erannistiliaria Harris(椴树尺蠖)；Erechthiasflavistriata Walsingham(甘蔗蚜蛾)；Euproctis chrysorrhoea Linnaeus(褐尾蛾)；Harrisina americana Guérin-Méneville(葡萄叶雕叶虫)；Heliothissubflexa Guenée；Hemileuca oliviae Cockrell(牧场毛虫)；Hyphantriacunea Drury(秋天网虫)；Keiferia lycopersicetla Walsingham(番茄蛲虫)；Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst(东部铁杉尺蠖)；L.fiscellarialugubrosa Hulst(西部铁杉尺蠖)；Leucoma salicis Linnaeus(缎蛾)；Lymantrta dispar Linnaeus(舞毒蛾)；天幕毛虫属(Malacosoma spp.)；Manduca quinquemaculata Haworth(五斑天蛾，番茄天蛾幼虫)；M. sextaHaworth(番茄天蛾幼虫，烟草天蛾幼虫)；Operophtera brumata Linnaeus(冬蛾)；古毒蛾属(Orgyia spp.)；Paleacrita vernata Peck(春尺蠖)；Papilio cresphontes Cramer(巨燕尾蝶，橙狗(orange dog))；Phryganidiacalifornica Packard(加州橡树虫)；Phyllocnistis cttrella Stainton(柑橘潜叶虫)；Phyllonorycter blancardella Fabricius(斑点幕形潜叶虫)；Pierisbrassicae Linnaeus(大白蝴蝶)；P.rapae Linnaeus(小白蝴蝶)；P.napiLinnaeus(绿脉纹白蝴蝶)；Platyptilia carduidactyla Riley(朝鲜蓟羽蛾)；Plutella xylostella Linnaeus(菱纹背蛾)；Pectinophora gossypiellaSaunders(粉色螟蛉)；Pontia protodice Boisduval&Leconte(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；Sabulodes aegrotata Guenée(杂食尺蠖)；Schizura concinna J.E.Smith(红驼背毛虫)；Sitotroga cerealella Olivier(安古木瓦谷蛾)；Telchin licus Drury(大型蔗螟)；Thaumetopoeapityocampa Schiffermüller(松异带蛾)；Tineola bisselliella Hummel(结网衣蛾)；Tuta absoluta Meyrick(番茄潜叶虫)和Yponomeuta padellaLinnaeus(巢蛾)。

值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括、但不限于：Anthonomus grandis Boheman(棉籽象鼻虫)；Cylindrocopturusadspersus LeConte(向日葵茎象鼻虫)；Diaprepes abbreviatus Linnaeus(蔗根象鼻虫)；Hypera punctata Fabricius(三叶草叶象)；Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel(稻水象鼻虫)；Metamasius hemipterus hemipterusLinnaeus(西印度蔗象鼻虫)；M. hemipterus sericeus Olivier(丝蔗象鼻虫)；Sitophilus granarius Linnaeus(谷象鼻虫)；S.oryzae Linnaeus(米象鼻虫)；Smicronyx fulvus LeConte(红向日葵籽象鼻虫)；S.sordidusLeConte(灰色葵花籽象甲)；Sphenophorus maidis Chittenden(玉米象虫)；S.livis Vaurie(甘蔗象虫)；Rhabdoscelus obscurus Boisduval(新几内亚蔗象甲)；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括、但不限于：Chaetocnema ectypa Horn(沙漠玉米跳甲)；C.pulicaria Melsheimer(玉米跳甲)；Colaspis brunneaFabricius(葡萄肖叶甲)；Diabrotica barberi Smith&Lawrence(北方玉米根虫)；D.undecimpunctata howardi Barber(南方玉米根虫)；D.virgiferavirgifera LeConte(西方玉米根虫)；Leptinotarsa decemlineata Say(科罗拉多马铃薯甲虫)；Oulema melanopus Linnaeus(谷物叶甲虫)；Phyllotretacruciferae Goeze(玉米跳甲)；Zygogramma exclamationis Fabricius(向日葵甲虫)；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括、但不限于：Epilachnavarivestis Mulsant(墨西哥豆甲虫)；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括、但不限于：Antitrogus parvulus Britton(Childers蔗蚧螬)；Cyclocephala borealis Arrow(北方隐金龟子，白蚧螬)；C.immaculata Olivier(南方隐金龟子，白蚧螬)；Dermolepida albohirtumWaterhouse(灰背蔗甲虫)；Euetheola humilis rugiceps LeConte(甘蔗甲虫)；Lepidiota frenchi Blackburn(法国蔗蚧螬)；Tomarus gibbosus DeGeer(胡萝卜甲虫)；T.subtropicus Blatchley(甘蔗蚧螬)；Phyllophagacrinita Burmeister(白蛴螬)；P.latifrons LeConte(六月甲虫)；Popilliajaponica Newman(日本甲虫)；Rhizotrogus majalis Razoumowsky(欧洲金龟子)；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自以下各科属的线虫：叩头虫科(Elateridae)、伪金针虫属(Eleodes spp.)，纹叩甲属(Melanotus spp.)，包括M.communis Gyllenhal(线虫)；宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)；丘胸叩甲属(Limonius spp.)；细胸叩甲属(Agriotes spp.)；Ctenicera属；Aeolus属；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle)；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)科的甲虫，例如但不限于Migdolus fryanus Westwood(长角甲虫)；和来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括但不限于Aphanisticus cochinchinae seminulumObenberger(潜叶吉丁虫)。

双翅目(Diptera)的成体和未成熟体是值得关注的，包括潜叶虫Agromyza parvicornis Loew(玉米斑潜叶虫)；摇蚊，包括、但不限于：Contarinia sorghicola Coquillett(高粱摇蚊)；Mayetiola destructor Say(黑森蝇)；Neolasioptera murtfeldtiana Felt(向日葵籽摇蚊)；Sitodiplosismosellana Géhin(小麦摇蚊)；果实蝇(实蝇科(Tephritidae))、Oscinellafrit Linnaeus(麦秆蝇)；蛆，包括、但不限于：地种蝇属(Delia spp.)，包括Delia platura Meigen(玉米种蛆)；D.coarctata Fallen(麦种蝇)；Fannia canicularis Linnaeus，F.femoralis Stein(小家厕蝇)；Meromyzaamericana Fitch(麦秆蛆)；Musca domestica Linnaeus(家蝇类)；Stomoxys calcitrans Linnaeus(厩蝇类)；面蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属(Chrysomya spp.)；伏蝇属(Phormia spp.)；和其他蝇类(muscoid fly)害虫、马蝇类虻属(Tabanus spp.)；肤蝇类胃蝇属(Gastrophilus spp.)；狂蝇属(Oestrusspp.)；牛蝇类皮蝇属(Hypoderma spp.)；鹿蝇类斑虻属(Chrysops spp.)；Melophagus ovinus Linnaeus(虱蝇类)；和其他短角亚目(Brachycera)、蚊类伊蚊属(Aedes spp.)；按蚊属(Anopheles spp.)；库蚊属(Culex spp.)；黑蝇类原蚋属(Prosimulium spp.)；蚋属(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。

作为目的昆虫，包括半翅目的那些昆虫，例如、但不限于以下科：球蚜科(Adelgidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、链蚧科(Asterolecaniidae)、沫蝉科(Cercopidae)、叶蝉科(Cicadellidae)、蝉科(Cicadidae)、菱飞虱科(Cixiidae)、软介壳虫科(Coccidae)、缘蝽科(Coreidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、飞虱科(Delphacidae)、盾蚧科(Diaspididae)、毡蚧科(Eriococcidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、圆飞虱科(Issidae)、长蝽科(Lygaeidae)、硕蚧科(Margarodidae)、角蝉科(Membracidae)、盲蝽科(Miridae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、蝽科(Pentatomidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)和网蝽科(Tingidae)。

来自半翅目的农艺学上重要的成员包括、但不限于：Acrosternumhilare Say(绿蝽象)；Acyrthisiphon pisum Harris(豌豆蚜虫)；球蚜属(Adelges spp.)物种(球蚜类)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(苜蓿褐盲蝽)；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜缘蝽)；Aphis craccivoraKoch(豇豆蚜虫)；A.fabae Scopoli(黑豆蚜虫)；A.gossypii Glover(棉花蚜虫，甜瓜蚜虫)；A.maidiradicis Forbes(玉米根蚜虫)；A.pomi DeGeer(苹果蚜虫)；A.spiraecola Patch(绣线菊蚜虫)；Aulacaspistegalensis Zehntner(甘蔗介壳虫)；Aulacorthum solani Kaltenbach(毛地黄蚜虫)；Bemisia tabaci Gennadius(烟草粉虱，甘薯粉虱)；B.argentifoliiBellows&Perring)(silverleaf whitefly)；Blissus leucopterus leucopterus Say(麦长蝽)；负子蝽属(Blostomatidae)；Brevicoryne brassicae Linnaeus(卷心菜蚜虫)；Cacopsylla pyricola Foerster(梨木虱)；Calocoris norvegicusGmeli(马铃薯盲蝽)；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓蚜虫)；臭虫属(Cimicidae spp.)；缘蝽属(Coreidae)；Corythuca gossypii Fabriciu(棉花网蝽)；Cyrtopeltis modesta Distant(蝽)；C.notatus Distant(吸蝇(suckfly))；Deois flavopicta (吹沫虫)；Dialeurodes citri Ashmead(柑橘粉虱)；Diaphnocoris chlorionis Say(皂荚树蝽)；Diuraphis noxiaKurdjumov/Mordvilko(俄罗斯小麦蚜虫)；Duplachionaspis divergens Green(盾介壳虫)；Dysaphis plantaginea Paaserini(红苹果蚜虫)；Dysdercussuturellus Herrich-(棉蝽)；Dysmicoccus boninsis Kuwana(灰甘蔗粉蚧)；Empoasca fabae Harris(马铃薯叶蝉)；Eriosoma lanigerumHausmann(苹绵蚜)；葡萄斑叶蝉属(Erythroneoura spp.)(葡萄斑叶蝉)；Eumetopina flavipes Muir(岛屿甘蔗飞虱)；扁盾蝽属(Eurygaster)物种；Euschistus servus Say(褐椿象)；E.variolarius Palisot de Beauvois(一斑蝽象)；长蝽属(Graptostethus)物种(长蝽系群(complex of seed bugs))；以及桃大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜)；Icerya purchasi Maskell(吹绵蚧)；Labopidicola allii Knight(洋葱蝽)；Laodelphax striatellusFallen(灰飞虱)；Leptoglossus corculus Say(松叶根蝽)；Leptodictyatabida Herrich-Schaeffer(甘蔗网蝽)；Lipaphis erysimi Kaltenbach(芜箐蚜虫)；Lygocoris pabulinus Linnaeus(通绿盲蝽)；Lygus lineolaris Palisot deBeauvois(牧草盲蝽)；L.Hesperus Knight(西部牧草盲蝽)；L.pratensisLinnaeus(普通牧场蝽)；L.rugulipennis Poppius(欧洲牧草盲蝽)；Macrosiphum euphorbiae Thomas(马铃薯蚜虫)；Macrosteles quadrilineatusForbes(翠菊叶蝉)；Magicicada septendecim Linnaeus(周期蝉)；Mahanarva fimbriolata (甘蔗沫蝉)；M.posticata (甘蔗小蝉)；Melanaphis sacchari Zehntner(甘蔗蚜虫)；Melanaspis glomerata Green(黑白介壳虫)；Metopolophium dirhodum Walker(麦无网长管蚜)；Myzus persicae Sulzer(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；Nasonovia ribisnigriMosley(莴苣蚜虫)；Nephotettix cinticeps Uhler(绿叶蝉)；N.nigropictus(水稻叶蝉)；Nezara viridula Linnaeus(南方绿蝽象)；Nilaparvatalugens (褐飞虱)；Nysius ericae Schilling(假臭虫)；Nysius raphanusHoward(假臭虫)；Oebalus pugnax Fabricius(稻蝽象)；Oncopeltusfasciatus Dallas(大马利筋蝽)；Orthops campestris Linnaeus；瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)(根蚜和瘿蚜)；Peregrinus maidis Ashmead(玉米飞虱)；Perkinsiella saccharicida Kirkaldy(甘蔗飞虱)；Phylloxeradevastatrix Pergande(美洲山核桃葡萄根瘤蚜)；Planococcus citri Risso(柑橘粉蚧)；Plesiocoris rugicollis Fallen(苹果盲蝽)；Poecilocapsuslineatus Fabricius(四线盲蝽)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)；粉蚧属(Pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；Pulvinaria elongataNewstead(羊胡子草介壳虫)；Pyrilla perpusilla Walker(甘蔗叶蝉)；红蝽属(Pyrrhocoridae spp.)；Quadraspidiotus perniciosus Comstock(梨园蚧)；猎蝽属(Reduviidae spp.)；Rhopalosiphum maidis Fitch(玉米叶蚜虫)；R.padi Linnaeus(禾谷缢管蚜)；Saccharicoccus sacchari Cockerell(粉色甘蔗粉蚧)；Scaptocoris castanea Perty(褐根蝽)；Schizaphisgraminum Rondani(麦二叉蚜)；Sipha flava Forbes(黄色甘蔗蚜虫)；Sitobion avenae Fabricius(麦长管蚜)；Sogatella furcifera Horvath(白背飞虱)；Sogatodes oryzicola Muir(水稻飞虱)；Spanagonicus albofasciatusReuter(白斑盲蝽)；Therioaphis maculata Buckton(斑点苜蓿蚜)；谷蛾属(Tinidae)；Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe(黑色柑橘蚜虫)；和T.citricida Kirkaldy(褐色柑橘蚜虫)；Trialeurodes abutiloneus(纹翅粉虱)和T.vaporariorum Westwood(温室粉虱)；Trioza diospyri Ashmead(柿木虱)；以及苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹果白叶蝉)。

另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如Aceria tosichellaKeifer(小麦卷叶螨)Panonychus ulmi Koch(欧洲红螨)；Petrobia latensMüller(褐色小麦螨)；Steneotarsonemus bancrofti Michael(甘蔗茎蟎)；叶螨科(Tetranychidae)的蜘蛛螨和红螨、Oligonychus grypus Baker&Pritchard、O.indicus Hirst(甘蔗叶螨)、O.pratensts Banks(班克斯草螨)、O.stickneyi McGregor(甘蔗蜘蛛螨)；Tetranychus urticae Koch(二斑蜘蛛螨)；T.mcdanieli McGregor(McDaniel螨)；T.cinnabarinusBoisduval(红蜘蛛螨)；T.turkestani Ugarov&Nikolski)(草莓蜘蛛螨)、细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨类、Brevipalpus lewisi McGregor(柑橘扁平螨)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱类。Ixodes scapularis Say(鹿蜱)；I.holocyclus Neumann(澳洲寄生蜱)；Dermacentor variabilis Say(美洲犬蜱)；Amblyomma americanumLinnaeus(美洲钝眼蜱)；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。

缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫是值得关注的，例如Lepisma saccharinaLinnaeus(蠹虫)；Thermobia domestica Packard(小灶衣鱼)。

所涵盖的其他节肢害虫包括：蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如Loxoscelesreclusa Gertsch&Mulaik(棕色隐士蛛(brown recluse spider))；和Latrodectus mactans Fabricius(黑寡妇蜘蛛)；和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类例如Scutigera coleoptrata Linnaeus(蚰蜒)。此外，等翅目(Isoptera)中的病害昆虫是值得关注的，包括白蚁科(termitidae)的那些病害昆虫，例如(但不限于)：白蚁(Cornitermes cumulans Kollar)、Cylindrotermesnordenskioeldi Holmgren和Pseudacanthotermes militaris Hagen(甘蔗白蚁)；以及鼻白蚁科(Rhinotermitidae)的那些病害昆虫，包括但不限于Heterotermes tenuts Hagen。缨翅目(Thysanoptera)的昆虫也是值得关注的，包括(但不限于)：蓟马类，例如微直鬃蓟马(Stenchaetothrips minutus vanDeventer)(甘蔗蓟马)。

本发明的实施例在以下实例中进一步界定。应当理解这些实例仅以示例的方式给出。由以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本发明的核心特征，并在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的实施例作出各种变通和修改以使之适应各种用途和条件。因此，除了本文显示和描述的那些实施例之外，本发明实施例的各种修改将因前面的描述而对本领域技术人员变得显而易见。这类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。

本文给出的每个参考文献的公开内容以引用方式整体并入本文。

实例

实例1.通过农杆菌转化法转化玉米并且再生含有Cry1F、Cry34Ab1、 Cry35Ab1(Cry34/35Ab1)和Pat基因的转基因植物。

4114玉米由农杆菌介导的质粒PHP27118转化产生。该事件含有cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因盒，它们赋予针对某些鳞翅类和鞘翅类害虫的抗性。

具体而言，第一盒含有截短形式的来自苏云金芽孢杆菌鲇泽变种的cry1F基因。cry1F基因的插入赋予针对鳞翅目害虫(包括ECB和FAW)损害的抗性。Cry1F蛋白(SEQ ID NO：1)由605个氨基酸组成并且具有大约68kDa的分子量。cry1F基因的表达受玉米多聚遍在蛋白启动子控制(Christensen等人，1992年，出处同上)，从而提供Cry1F蛋白在玉米中的组成型表达。该区域还包括与天然多聚遍在蛋白启动子相关联的5′UTR和内含子。cry1F基因的终止子是来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)Ti质粒pTi15955的开放读框25(ORF 25)中的聚(A)添加信号(Barker等人，1983年，出处同上)。

第二盒含有从苏云金芽孢杆菌菌株PS149B1分离的cry34Ab1基因(美国专利No.6,127,180、No.6,624,145和No.6,340,593)。Cry34Ab1蛋白(SEQ ID NO：2)的长度是123个氨基酸残基并且具有大约14kDa的分子量。cry34Ab1基因的表达受带有5′UTR和内含子的玉米多聚遍在蛋白启动子的第二拷贝的控制(Christensen等人，1992年，出处同上)。cry34Ab1基因的终止子是pinII终止子(KeiI等人，1986年，出处同上；An等人，1989年，出处同上)。

第三基因盒含有也从苏云金芽孢杆菌菌株PS149B1分离的cry35Ab1基因(美国专利No.6,083,499、No.6,548,291和No.6,340,593)。Cry35Ab1蛋白(SEQ ID NO：3)具有383个氨基酸的长度和大约44kDa的分子量。Cry34Ab1和Cry35Ab1蛋白在植物中的同时表达赋予对鞘翅类昆虫(包括WCRW)的抗性。cry35Ab1基因的表达受普通小麦(小麦)过氧化物酶启动子和前导序列控制(Hertig等人，1991年，出处同上)。cry35Ab1基因的终止子是pinII终止子的第二拷贝(Keil等人，1986年，出处同上；An等人，1989年，出处同上)。

第四也即最后一个基因盒含有来自绿色产色链霉菌的pat的已经针对在玉米中的表达进行了优化的形式。pat基因表达PAT，其赋予膦丝菌素(草铵膦-铵)耐受性。PAT蛋白(SEQ ID NO：4)的长度是183个氨基酸残基并且具有大约21kDa的分子量。pat基因的表达受来自CaMV 35S转录物的启动子区和终止子区控制(Franck等人，1980年，出处同上；Odell等人，1985年，出处同上；Pietrzak等人，1986年，出处同上)。还提供了含有所述DNA构建体的植物。表1中进一步描述了PHP27118 T-DNA(SEQID NO：5中所示)中的遗传元件及其来源的说明。

表1：质粒PHP27118的T-DNA区域中的遗传元件

基本上按照Zhao(美国专利No.5,981,840，其内容据此以引用方式并入)中所述的方法，在授粉后九天至十一天从发育颖果无菌去除玉米(Zeamays L.)的不成熟胚，并用包含质粒PHP27118(图1)的根癌农杆菌菌株LBA4404接种。图2中显示PHP27118的T-DNA区。在胚和农杆菌于没有选择剂的固体培养基上共培育三至六天后，将胚转移至没有除草剂选择但含有羧苄青霉素的培养基。在这种培养基上三至五天后，将胚转移至刺激玉米体细胞性胚发生并含有双丙胺膦以选择表达pat转基因的细胞的选择培养基。所述培养基还含有羧苄青霉素以杀死任何剩余的农杆菌。在这种选择培养基上六至八周后，鉴定展示抗双丙胺膦性的正在生长的健康愈伤组织。随后将推定性转基因愈伤组织再生以产生T0小植物。

从T0小植物取得样品用于PCR分析以验证插入的cry1F、cry35Ab1、cry34Ab1和/或pat基因的存在和拷贝数。证实玉米事件DP-004114-3含有单拷贝的T-DNA(见实例2和3)。除这个分析之外，还通过PCR对T0小植物分析某些农杆菌双元载体骨架序列的存在(数据未显示)。选出确定具有单拷贝插入的基因并且农杆菌骨架序列为阴性的植物用于进一步温室繁殖。通过实施众多生物检验法，对这些选出的T0植物筛选性状功效和蛋白质表达(见实例5)。将符合全部标准的T0植物推进并与近交系杂交以产生种子用于进一步测试。图3中呈现转化和事件发展的示意性概述。

实例2.玉米事件DP-004114-3的表征

从来自4114玉米的试验种子和对照物质(来自非基因修饰玉米的种子，所述玉米具有代表事件背景的遗传背景)的叶组织分离出基因组DNA并且使用构建体特异性引物对，使所述基因组DNA进行定量PCR扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶上分离以证实从试验种子分离的基因组DNA中存在插入的构建体，和从对照种子分离的基因组DNA中不存在插入的构建体。参比标准物(低DNA质量梯；英杰公司(Invitrogen Corporation)目录号10380-012)用来确定PCR产物大小。通过重复实验三次评估构建体特异性PCR方法的可靠性。通过来自4114玉米的基因组DNA的多个稀释物评价PCR扩增的灵敏度。

试验和对照叶样品(V5-V7叶期)从杜邦(DuPont)实验站(特拉华州威明顿(Wilmington，DE))处自先锋良种公司(庄士敦，爱荷华)(Pioneer Hi-Bred(Johnston，IA))获得的种子所培育的植物收获。使用标准脲提取方案从试验和对照叶组织进行基因组DNA提取。

使用NanoDrop 1000分光光度计，使用ND-1000 V3.6软件(特拉华州威明顿的赛默科技公司(ThermoScientific，Wilmington，DE))和Quant-iT试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carslbad，CA))，对基因组DNA定量。DNA样品在琼脂糖凝胶上可视化以确认定量值并且确定DNA质量。

从4114玉米的叶组织分离的基因组DNA样品和对照样品接受使用构建体特异性引物对(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)的PCR扩增(Roche高保真PCR主试剂盒，Roche目录号12140314001)，其中所述构建体特异性引物对涵盖玉米ORF 25终止子和遍在蛋白启动子(见图2)，并且允许唯一鉴定4114玉米中插入的T-DNA。第二引物组(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)用来扩增内源玉米转化酶基因(GenBank登录号AF171874.1)作为PCR扩增的阳性对照。表2给出了每个引物组的PCR靶位点和预期PCR产物的大小。表3给出了PCR试剂和反应条件。在本研究中，全部PCR反应中均使用50ng叶基因组DNA。

表2：PCR基因组DNA靶位点和PCR产物的预期大小

表3：PCR试剂和反应条件

ddH₂O：双蒸水

*Roche高保真主混合物

在使用质粒PHP27118(10ng)作为模板和全部4114玉米DNA样品的PCR反应中观察到由构建体特异性引物组(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)扩增的大小约300bp的PCR产物，但是在全部对照玉米样品和无模板对照中不存在所述PCR产物。该实验重复3次，并且获得相似的结果。对来自五个4114玉米植物和五个对照玉米植物的DNA提取物所观察到的结果与对含有4114玉米基因组DNA样品所预期的PCR产物大小(287bp)非常一致。采用检测内源玉米转化酶基因的引物组(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)的PCR反应后，对4114玉米样品和对照玉米样品均观察到大小约220bp的PCR产物。这些结果与对含有玉米内源转化酶基因的基因组DNA样品所预期的PCR产物大小(225bp)非常一致。在无模板对照中未观察到内源靶条带。

为了评估PCR扩增的灵敏度，将多个浓度的来自4114玉米的单一DNA样品稀释于非基因修饰对照DNA中，从而产生范围为500fg、5pg、10pg、50pg、100pg、500pg、5ng和50ng(基因组DNA在全部PCR样品中的总量是50ng)的4114玉米DNA量。每个稀释物如先前实施那样进行PCR扩增。基于这种分析，确定检测限(LOD)是在50ng总DNA中大约100pg的4114玉米DNA，或0.2％的4114玉米DNA。

总之，使用4114玉米的构建体特异性引物组的定性PCR分析证实，试验植物含有自质粒PHP27118的插入的T-DNA，如由构建体特异性靶条带在分析的全部试验植物样品中存在并且在非基因修饰对照植物中不存在而显而易见。这个结果是可重现的。试验植物和对照植物均含有内源玉米转化酶基因。本分析在所述条件下的灵敏度是在50ng总基因组DNA中大约100pg的4114玉米基因组DNA，或0.2％的4114玉米基因组DNA。

实例3.用于完整性和拷贝数的DP-004114-3玉米的DNA印迹分析

DNA印迹分析用来证实来自PHP27118的插入的T-DNA的完整性和拷贝数并且证实在4114玉米中存在cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因盒。

选择来自4114玉米T1代的五个单独植物用于DNA印迹分析。从4114玉米(试验)和非转基因玉米(对照)植物收获幼叶材料并且立即置于干冰上。将冷冻的样品冻干，并且使用CTAB提取方法从试验组织和对照组织提取基因组DNA。

在如下文详述的限制性酶消化后，DNA片段在琼脂糖凝胶上分离、脱嘌呤化、变性和原位中和，并且使用如对TURBOBLOTTER^TMRapidDownward Transfer System(Schleicher&Schuell)所描述的方法，转移至20xSSC缓冲液中的尼龙膜。转移至所述膜后，通过紫外线交联使DNA与所述膜结合。

完整性

因为存在三个位于T-DNA内部的位点，所以选择限制性酶Hind III用于完整性的DNA印迹分析(图2)。大约1-3μg基因组DNA用Hind III消化并在琼脂糖凝胶上按大小分离。作为阳性对照，将大约15pg含有PHP27118 T-DNA的质粒插入对照植物DNA样品，消化并装载在琼脂糖凝胶上。还包括阴性对照以验证探针与玉米基因组的背景杂交。

与PHP27118 T-DNA(遗传元件参见图2)上的cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因同源的四个探针用于杂交以证实所述基因的存在。为了产生这些探针，将同源于cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因的片段通过PCR从含有PHP27118 T-DNA的质粒中产生，在琼脂糖凝胶上按大小分离，并且使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。随后使用以[³²P]dCTP进行随机引发标记的Rediprime^TMII DNA标记系统(Amersham)，从所述片段产生全部DNA探针。

基本上如制造商(Stratagene)描述，使用杂交溶液，将标记的探针与尼龙膜上的靶DNA杂交以检测特定片段。在高严格性下实施杂交后的洗涤。印迹物在-80℃下对x-射线胶片曝光一个或多个时间点以检测杂交片段。

因为Hind III酶位点已知在T-DNA内部，所以测定每个探针的确切预期条带大小(表4，图2)。对于T-DNA的完整拷贝，cry1F探针预期与3891bp的片段杂交。cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因探针预期与7769bp的片段杂交。来自下述试样的片段将证实插入的T-DNA的完整性和每个基因的存在，所述试样的片段匹配预期的大小以及匹配质粒对照样品中的条带。

采用Hind III和cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因探针的DNA印迹分析的结果证实了预期片段大小，并从而证实所述T-DNA完整插入每个事件中以及所述基因的每一个均存在。

随cry1F探针观察到一条大约4kb的条带，其与预期片段大小一致。在质粒阳性对照泳道中观察到一条大约4kb的相似条带，假定该条带是3891bp的预期条带。基于所述事件中的杂交条带相对于质粒阳性对照中条带的相等迁移率，证实T-DNA的含有cry1F的部分已经完整插入4114玉米中。

在采用cry34Ab1探针的杂交中，在事件中并且还在质粒阳性对照中观察到一条大约8kb的条带。在质粒阳性对照泳道中的杂交条带假定是7769bp的预期条带。因为事件中的杂交条带已经相对于该条带同等地迁移，所以证实T-DNA的含有cry34Ab1的这个部分完整地插入。

类似地，采用cry35Ab1和pat的杂交如预期那样与植物和质粒阳性对照中的相同7769bp片段杂交。这些结果证实，T-DNA的含有cry35Ab1和pat基因的部分已经完整插入。

这个DNA印迹分析证实，4114玉米含有来自PHP27118的T-DNA的完整拷贝，其含有cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因。

表4：对于用Hind III消化4114玉米DNA所预期和在DNA印迹上观察到的杂交片段的总结

¹基于PHP27118 T-DNA图谱的预期片段大小(图2)。

²全部观察到的片段相对于质粒阳性对照同等地迁移，并且因此证实代表PHP27118 T-DNA完整部分。

拷贝数

cry1F和pat探针在DNA印迹杂交中用来评价4114玉米中插入物的拷贝数。

因为存在位于T-DNA内部的单个位点，所以选择限制性酶Bcl I用于拷贝数的DNA印迹分析(图2)。将大约3μg来自事件4114的T1代各个植物的基因组DNA用Bcl I消化并且在琼脂糖凝胶上按大小分离。将含有PHP27118 T-DNA的质粒插入对照植物DNA样品，消化和装载在琼脂糖凝胶上以充当阳性杂交对照。还包括阴性玉米DNA对照以验证探针与玉米基因组的背景杂交。在Bcl I印迹物上包括地高辛(DIG)标记的DNA分子量标记VII(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏公司(Roche，Indianapalis，IN))作为杂交片段的大小标准。

cry1F和pat基因的探针也通过掺入地高辛(DIG)标记的核苷酸[DIG-11]-dUTP至所述片段中的PCR反应进行标记。根据在PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)中提供的方法，实施分离片段的PCR标记。

将DIG-标记的探针与4114事件的T1代的Bcl I DNA印迹物杂交。基本上如制造商所述，使用DIG Easy Hyb溶液(Roche)，将探针与靶DNA杂交以检测特定片段。在高严格性下实施杂交后洗涤。使用CDP-Star化学发光核酸检测系统(Roche)检测与结合的片段杂交的DIG标记探针。印迹物在室温下对X-射线胶片曝光一个或多个时间点以检测杂交片段。按照制造商推荐，从膜剥离杂交的探针，随后用另外的探针杂交。

选择在T-DNA内部具有单一限制性位点(图2)的限制性酶Bcl I来证实4114玉米中单个PHP27118 T-DNA插入物的存在。Bcl I的位点位于T-DNA的bp 2546处(图2)并且将对单一插入的T-DNA产生大于约2500bp和9400bp的片段。采用pat探针的杂交将根据杂交条带的数目(例如，一条杂交条带指示所述元件的一个拷贝)指示在所述事件中存在的该元件的拷贝数。pat探针将与大于9400bp的片段杂交。因为Bcl I限制性酶位点在cry1F基因内部，所以预期cry1F探针与两个片段杂交并且对单一T-DNA插入产生两个条带(图2)。

表5中总结了对4114玉米采用Bcl I以及cry1F和pat基因探针的DNA印迹分析的结果。

表5：对于4114玉米的Bcl I消化物所预期的和在DNA印迹上观察到的杂交片段的总结。

¹基于PHP27118 T-DNA图谱的预期片段大小(图2)。

²全部观察到的片段大小基于DIG VII分子量标记的迁移率近似得到。

³因cry1F基因内部的Bcl I限制性位点的位置，故采用cry1F探针时预期有两个片段。

采用Bcl I消化和cry1F探针的4114玉米DNA印迹分析的结果如预期那样显示两个条带，大于8.6kb的一个条带和

大约3.1kb的第二个条带。因cry1F基因内部Bcl I位点的位置，故对于单个插入物，预期有两个条带，因此这些结果表明在4114玉米中存在cry1F的单拷贝。采用Bcl I消化和pat探针的4114玉米DNA印迹分析的结果

如预期那样显示大于8.6kb的单一条带，其匹配较大cry1F条带的大小。这些结果表明在玉米事件4114中还存在pat基因的单一插入。

由于cry34Ab1和cry35Ab1基因位于与pat基因和部分cry1F基因相同的片段上，且处于T-DNA上cry1F和pat基因之间，按照推论，这也表明该事件很可能含有这些基因中每一者的单拷贝。

实例4.玉米事件DP-004114-3的插入物和基因组边界区的测序表征

测定插入物和基因组边界区的序列以证实插入的DNA的完整性并表征在4114玉米中存在的插入位点侧翼的基因组序列。总计，证实了16,752bp的4114玉米基因组序列，其包含2,422bp的5′基因组边界序列、2,405bp的3′基因组边界序列、和11,925bp来自PHP27118的插入的T-DNA。发现4114玉米中的插入的T-DNA具有在右边界(RB)末端上的29bp缺失和在左边界(LB)末端上的24bp缺失。全部剩余序列是完整的并且与质粒PHP27118的序列相同。通过PCR扩增和将源自4114玉米和对照玉米植物的基因组边界区测序，证实4114玉米的5′和3′基因组边界区是玉米源的。

含有事件DP-004114-3的种子从4114玉米的T1 S2代获得。对照种子从具有与4114玉米相似的遗传背景但不含cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1和pat基因盒的玉米系获得。全部种子均从先锋良种国际有限公司(庄士敦，爱荷华)(Pioneer Hi-Bred International，Inc.(Johnston，IA))获得。低DNA质量梯(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA))和高DNA质量梯(英杰公司)用于凝胶电泳以估计琼脂糖凝胶上的DNA片段大小。

在杜邦(DuPont)实验站(威明顿，特拉华州(Wilmington，DE))的生长室中播种4114玉米种子和对照种子以产生用于本项研究的植物组织。每钵播种一粒种子，并且将该钵唯一地标识。全部植物以调节用于健康植物生长的光、温度和水培育。从对照和4114玉米植物收集叶样品。对于每个单独植物，将叶材料收集于预标记的袋内，置于干冰上并且在收集后转移至超低温冰箱(＜-55℃)。全部样品维持冷冻直至组织处理。

通过事件特异性PCR分析证实基因型

从全部试验植物和对照植物取得叶样品用于事件特异性PCR分析。使用Extract-N-Amp^TMPlant PCR试剂盒，按照对实时PCR分析描述的方法(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))，从每份叶样品提取DNA。

使用7500HT序列检测系统(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA))，对每份样品进行实时PCR。将探针(应用生物系统公司)和引物组(艾奥瓦州凯乐威的整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA))设计组合，以检测来自4114玉米的靶序列。此外，使用针对参比玉米内源基因的第二探针和引物组证实每个反应中存在可扩增的DNA。所述分析由实时PCR确定定性阳性/阴性响应(call)组成。使用Universal PCR Master Mix，NoUNG(应用生物系统公司(Applied Biosystems，Inc.))，分析提取出来的DNA。

4114玉米的阳性或阴性确定基于事件特异性靶PCR的CT(阈值循环)与玉米内源参比靶的CT的比较。如果所述事件和内源PCR靶在CT阈值以上扩增，则将植物评定为对该事件呈阳性。如果内源靶扩增而事件靶不扩增，则将植物评定为阴性。如果对于特定样品，两种靶均不扩增，则确定该样品是质量低劣的DNA样品或测试失败，并且重复分析。

全部4114玉米植物均对事件特异性PCR和PAT、Cry1F和Cry34Ab1蛋白呈阳性，而全部对照玉米植物均为阴性。表6中汇总结果。

表6.4114玉米植物和对照玉米植物中事件特异性PCR分析及Cry1F、 Cry34Ab1和PAT蛋白表达的总结

4114玉米植物ID	事件特异性PCR¹	Cry1F²	Cry34Ab1²	PAT²
					T-F-08-233C-1	+	+	+	+
T-F-08-233C-2	+	+	+	+
					T-F-08-233C-3	+	+	+	+
T-F-08-233C-4	+	+	+	+
					对照玉米植物ID
C-F-08-246C-1	-	-	-	-
					C-F-08-246C-2	-	-	-	-

^1.4114玉米的事件特异性实时PCR测定的总结。阳性(+)指示存在4114玉米事件。阴性(-)指示不存在4114玉米事件。

^2.使用横向流装置时，4114玉米植物和对照玉米植物中Cry1F、Cry34Ab1和PAT蛋白表达的总结。阳性(+)指示存在所述蛋白质。阴性(-)指示不存在所述蛋白质。

DNA测序

将DNA片段克隆并且提交在先锋作物遗传研究(Pioneer CropGenetics Research)测序设施(威明顿，特拉华州)测序。使用来自基因密码公司(Gene Codes Corporation)的Sequencher^TM软件(安娜堡，密西根州(Ann Arbor，Michigan))装配序列。使用Vector NTI 9.1.0(英杰公司(Invitrogen Corp))，通过比较从4114玉米产生的T-DNA插入物序列与来自(用于转化以产生4114玉米的)质粒PHP27118的T-DNA区的序列，进行序列注释。

对用来产生4114玉米的质粒PHP27118的T-DNA区测序并且与4114玉米中的插入的T-DNA序列比较。

使用了质粒PHP27118的T-DNA区的序列来设计引物对以表征4114玉米中的插入的T-DNA。使用来自四株不同的4114玉米植物的基因组DNA作为模板，产生六个重叠的PCR产物。将这些PCR产物克隆并测序。

5′和3′侧翼基因组边界区的测序。

使用几轮反向PCR(Silver and Keerikatte(1989)J.Virol.63：1924(Silver和Keerikatte，《病毒学杂志》，第63卷，第1924页)；Ochmanet al.(1988)Genetics 120：621-623(Ochman等人，1988年，《遗传学》，第120卷，第621-623页)；Triglia et al.，(1988)Nucl.Acids Res.16：8186(Triglia等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第8186页))以锚定于插入的T-DNA的多个区域内部的引物，实施5′和3′侧翼基因组边界区的初步序列表征。从反向PCR获得的序列信息经过BLASTn分析并且显示与来自NCBI(国家生物技术信息中心)GenBank核苷酸数据库的玉米BAC克隆AC211214匹配。该序列随后用来设计跨越4114玉米中5′和3′插入物/基因组接点的引物。从四株4114玉米植物产生的PCR产物经克隆和测序以验证5′和3′插入物/基因组接点和基因组边界区。

此外，为了显示鉴定的5′和3′基因组边界区是玉米源的，对4114玉米植物和对照玉米植物在所述基因组区内部进行PCR。将每个PCR片段直接测序以验证其玉米源身份。

使用了质粒PHP27118的T-DNA序列信息来设计引物以验证4114玉米中的插入序列(表7和8)。

表7.用来表征4114玉米中基因组边界区和插入的T-DNA的PCR引物

表8：用于PCR反应的引物的序列和位置

¹在4114玉米序列中的位置。

碱基1-2,422＝5′基因组边界区

碱基2,423-14,347＝插入物

碱基14,348-16,752＝3′基因组边界区。

为表征4114玉米中的插入的T-DNA，将PCR引物设计成在如表7中概述的六个独立、重叠的PCR产物中扩增T-DNA插入物：片段A至F(位置在图5中显示)。如预期那样，预测的PCR产物仅从4114玉米基因组DNA样品产生，并且不存在于对照玉米样品中。将这六个PCR产物克隆并测序。当比较4114玉米中的插入的T-DNA的序列与用来产生4114玉米的质粒PHP27118的T-DNA区时，确定RB末端上存在29bp缺失并且LB末端上存在24bp缺失。RB和LB末端缺失经常在农杆菌介导的转化中发生(Kim et al.(2007)PlantJ.51：779-791(Kim等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第779-791页))。全部剩余序列是完整的并且与质粒PHP27118的序列相同。插入物的序列显示于SEQ ID NO：27。

为验证额外的5′基因组边界序列，采用在5′基因组边界区中的正向引物(SEQ ID NO：11)和在插入的T-DNA内部的反向引物(SEQ ID NO：12)进行PCR。将所得到的来自4114玉米基因组DNA样品的2,511bp PCR片段A克隆并且测序(图3)。2,422bp的5′基因组边界区序列在SEQ ID NO：27的核苷酸1-2,422中示出。

为验证额外的3′基因组边界序列，采用在插入的T-DNA内部的正向引物(SEQ ID NO：21)和在3′基因组边界区中的反向引物(SEQ ID NO：22)进行PCR。将所得到的来自4114玉米基因组DNA样品的2,612bp PCR片段F克隆并且测序(图3)。2,405bp的3′基因组边界区序列在SEQ ID NO：27的核苷酸14,348至16,752中示出。

总计，证实了来自4114玉米基因组DNA的16,752bp序列：2,422bp的5′基因组边界序列、2,405bp的3′基因组边界序列和包含插入的T-DNA的11,925bp。

为了显示所鉴定的5′和3′侧翼基因组边界区是玉米源的，对4114玉米基因组DNA样品和对照玉米样品在所述5′和3′基因组边界区内部进行PCR(分别在SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中示出的引物对以及在SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26中示出的引物对)。从4114玉米和对照玉米中均产生预期的PCR片段G(对于5′基因组区域的257bp)和PCR片段H(对于3′基因组区域的283bp)。将这些PCR产物克隆并测序，发现来自4114玉米和对照玉米的相应产物是相同的，因而证实所述序列是玉米基因组源的。

实例5.玉米事件DP-004114-3的昆虫功效

在4114玉米上产生的功效数据。田间试验比较了具有两种遗传背景的4114玉米与具有相同背景的阴性对照(等位基因系)。功效检验包括：在四个地点的第一代ECB(ECB1)叶损伤和第二代ECB(ECB2)茎秆损伤、在三个地点的WCRW根损伤和在一个地点的FAW叶损伤。在每个地点，单行样区以随机完全区组播种，三次重复，(20粒/样区×12个条目(entry)×3次重复＝1实验/地点)。在出苗后对全部植物进行组织取样以通过事件特异性PCR证实事件的存在。剔除任何阴性者，并且将每一样区疏苗至目标株丛(stand)：每样区10-15株均匀间隔的植物。

对于表征ECB1损伤的试验，将每株植物在大约1周内用大约100条ECB初生幼虫手工侵染3次(总计300条幼虫)，在大约V5生长期开始。在最后成功侵染后大约三周，对每样区8株相邻植物(每种遗传背景、每个条目总计24株植物)进行叶损伤评级(基于9-1目视评级量表，其中9表示无损伤而1表示最大损伤)，并且对每个处理计算平均值。表9中显示在4114玉米上的第一代ECB叶采食结果。

表9.DP-004114-3玉米抵抗第一代ECB幼虫的功效

^a使用以下目视评级表对各个植物确定损伤评级：

9.无可见叶损伤或少数叶上的少量针状或细微穿孔型损伤。

8.少数叶上少量穿孔型病灶。

7.在若干叶上常见穿孔损伤。

6.若干叶具有穿孔和加长病灶(病灶长度＜0.5”)。

5.若干叶具有加长病灶(病灶长度0.5”至1.0”)。

4.若干叶具有加长病灶(病灶长度＞1.0”)。

3.在约一半叶上常见长病灶(＞1.0”)。

2.在约三分之二叶上常见长病灶(＞1.0”)。

1.大多数叶具有长病灶。

^b在一个地点内，有相同字母的各平均值不具有显著性差异(Fisher受保护的LSD检验，P＞0.05)。

对于表征ECB2损伤的试验，将上文用于ECB1侵染的相同植物稍后在生长季节在大约1周内再次用每株植物大约100条ECB初生幼虫手工侵染3次(总计300条幼虫)，在R1生长期开始，此时大约50％的植物正扬播花粉。在最后一次侵染后大约50-60日，将每样区8株相邻植物(每种遗传背景、每个条目总计24株植物)的茎秆从原发穗(primary ear)上方的第四节间顶部至植物基部劈开。随后以厘米计测量ECB茎秆蛀道(ECBXCM)的总长度并且对每种植物记录。1cm或更短的蛀道视为入口孔(幼虫不能够在茎秆中建立)并且不包括在蛀道的总厘米数中。计算每个处理的平均值(蛀道的总厘米数)。表10中显示4114玉米的ECB2茎秆采食结果。

表10.DP-004114-3玉米抵抗第二代ECB幼虫的功效

还研究了WCRW造成的根损伤。对大约在V2生长期的植物用大约500粒WCRW卵手工侵染(总计～1,000粒卵/植物)，办法是将所述WCRW卵施加在植物的每一侧的土壤中。另外，在具有WCRW天然侵染的高度可能性的田间样区播种。在大约R2生长期时评价植物的根部。将每样区五株相邻植物(每种遗传背景、每个条目总计45株植物)从样区移出并且用加压水冲洗。使用0-3的结节损伤评级表(node injury scale)对根部损伤评级(CRWNIS)(Oleson，et al.(2005)J.Econ.Entomol.98(1)：1-8(Oleson等人，2005年，《经济昆虫学杂志》，第98卷，第1期，第1-8页))，并计算每个处理的平均值。表11给出了因WCRW采食所致的平均根部损伤评级。

表11.DP-004114-3玉米抵抗WCR幼虫的功效

^b使用0-3结节损伤评级表对各个植物根群确定损伤评级(Oleson等人，2005年，出处同上)。

^c在某一地点内，带有相同字母的各平均值不具有显著性差异(Fisher受保护的LSD检验，P＞0.05)。

对于FAW功效检验，将各株植物在大约V5生长期时用大约75条新生幼虫手工地侵染。在最后成功侵染后大约两周，对每样区8株连续植物(每种遗传背景、每个条目总计24株植物)评定叶的损伤(FAWLF基于9-1目视评级表，其中9表示无损伤，1表示最大损伤)，并且对每个处理计算平均值。表12给出了表征FAW叶采食DP-004114-3上的平均损伤评级。

表12.DP-004114-3玉米抵抗FAW幼虫的功效

^a使用以下目视评级表对各个植物确定损伤评级：

9.无损伤至轮叶上存在针孔病灶。

8.轮叶上存在针孔和圆形小病灶

7.轮叶和缩卷叶上存在圆形小病灶和一些加长(矩形形状)小病灶，长度至多到0.5”。

6.一些轮叶和缩卷叶存在若干小的加长病灶，长度0.5”至1”。

5.一些叶和缩卷叶上存在若干大的加长病灶，长度大于1”′，和/或轮叶和缩卷叶中存在一些小尺寸至中等尺寸的均匀至不规则形状的孔(基底叶膜蚀透)。

4.若干轮叶和缩卷叶上存在若干大的加长病灶，和/或轮叶和缩卷叶中存在若干均匀至不规则形状的大孔。

3.若干轮叶上存在全部尺寸的许多加长病灶，外加轮叶和缩卷叶中存在若干均匀至不规则形状的大孔。

2.大部分轮叶和缩卷叶上存在全部尺寸的许多加长病灶，外加轮叶和缩卷叶中存在许多中等尺寸至大尺寸的均匀至不规则形状的孔。

1.轮叶和缩卷叶几乎完全被摧毁。

除了田间功效研究之外，4114玉米还在基于实验室的亚致死籽苗测定法(SSA)中进行评价(美国专利公开No.2006/0104904，其内容据此以引用方式并入)。SSA法允许在没有田间环境混淆影响下比较4114玉米与未保护的对照(近等位基因系)的功效。SSA技术包括使WCRW初生幼虫群体暴露于含有所述4114玉米事件之一的玉米籽苗或非转基因(阴性对照)玉米籽苗。从卵初始孵育起，使幼虫暴露17天时间。SSA的实验装置是尺寸为23×30×10cm的单个塑料容器(伊利诺伊州福瑞斯特湖的Pactiv公司(Pactiv Corp.，Lake Forest，IL))。条目以随机完全区组设置，每个条目3次重复。对于每个条目，SSA的做法包括将115颗籽粒置于每个容器中，所述容器具有225mL的1％甲基硫菌灵杀菌剂溶液和1000mL的Metro-Mix200植物生长培养基(俄亥俄州玛丽斯维尔的Scotts-Sierra园艺产品公司(Scotts-Sierra Horticultural Products Company，Marysville，OH))。在添加Metro-Mix后，立即将WCRW卵以每个容器1,000粒卵的比率侵染到每个容器的表面。WCRW卵在25℃下预孵育，以使得初始卵孵化正好在容器装好试样后5-7天发生。侵染的容器保存在具有如下设定的步入式环境室中：25℃，65％相对湿度和14∶10的光照∶黑暗循环。卵孵化后17天时，用布氏漏斗装置从所述容器中提取幼虫。从每个容器选择30条幼虫的随机子样本，并且在解剖显微镜下测量它们的头壳以将每条幼虫划归入3个龄期之一。收集的数据包括从处于三个潜在龄期中每一龄期的幼虫的数目所确定的幼虫群体的年龄结构。绘制了以图形方式显示每个条目的幼虫年龄分布的直方图并且如图4中所示那样目视比较。

表13提供了4114玉米的害虫谱。

表13.由表达Cry1F、Cry34Ab1和Cry35Ab1的DP-004114-3玉米控制或抑制的昆虫害虫

学名	俗名	昆虫目
			玉米螟(Ostrinia nubilalis)	欧洲玉米钻心虫(ECB)	鳞翅目
棉铃虫(Helicoverpa zea)	玉米穗虫(CEW)	鳞翅目
			草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)	秋夜蛾(FAW)	鳞翅目
西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)	西南玉米螟(SWCB)	鳞翅目
			Richia albicosta	西部豆类夜盗虫(WBCW)	鳞翅目
小地老虎	黑地老虎(BCW)	鳞翅目

南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)	小玉米茎蛀虫(LCSB)	鳞翅目
			南部玉米螟(Diatrea crambidoides)	南部玉米茎蛀虫(SCSB)	鳞翅目
玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)	西方玉米根虫(WCRW)	鞘翅目
			玉米根叶甲(Diabrotica virgifera zeae)	墨西哥玉米根虫(MCR)	鞘翅目
巴氏根萤叶甲(Diabrotica berberi)	北方玉米根虫(NCR)	鞘翅目
			小蔗螟(Diatrea saccharalis)	甘蔗钻心虫(SCB)	鞘翅目

实例6.蛋白质表达和浓缩

植物材料的产生

来自PHNAR×BC3F3代的4114玉米在美国和加拿大的五个地点培育。每个地点采用含有四个区块的随机完全区组设计，其中每个区块由至少36英寸(0.9m)的缓冲距离隔开。每个条目在2行样区中播种，所述样区在每一侧邻接1行边界种子(border seed)。

叶组织收集和加工

在V9期在每个区块中收集一个叶组织样品。对于每个事件，从无偏选择、健康、代表性植物收集全部样品。通过选择已经从轮叶中出现至少8英寸(20cm，可见组织)的最年幼的叶，获得每个叶样品。如果该叶是受损或不健康的，则将其下方的下一片叶子采样。从植物中距离叶尖端大约8英寸(20cm)剪下(切下)叶。将叶样品(包括中脉)切成1英寸(2.5cm)片段并且置于50ml的样品小瓶中。样品随后置于干冰上直至转移到冰箱(≤-10℃)。将样品在≤-10℃冷冻运输和贮存直至抵达。将全部组织样品在真空下冻干直至干燥。制备时，将冻干的叶样品精细均化用于分析。样品在处理步骤之间冷冻贮存。

蛋白质浓度测定

使用特异性定量ELISA方法测定Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1和PAT蛋白的浓度。

蛋白质提取

处理的叶组织样品的等分试样以10mg的目标重量称量至1.2mL管中。将用于Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1和PAT蛋白浓度分析的每个样品在0.6mL冰冷的PBST(磷酸盐缓冲盐水外加Tween-20)中萃取。离心后，将上清液取出、稀释并分析。

Cry1F、Cry34Ab1和PAT蛋白浓度的测定

所用的Cry1F、Cry34Ab1和PAT ELISA试剂盒从缅因州波特兰的恩沃劳格公司(EnviroLogix，Inc.(Portland，ME))获得，并且所用的Cry35Ab1ELISA试剂盒从缅因州波特兰的阿卡迪亚生物科技公司(Acadia BioScience，LLC(Portland，ME))获得。用于这四种蛋白质中每一种的ELISA方法利用顺序“夹心”模式以确定样品提取物中蛋白质的浓度。标准物(以三重孔分析)和稀释的样品提取物(以双孔分析)在用抗体预包被的平板上温育，所述抗体是对选自Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1或PAT的单一蛋白质特异。温育后，将未结合的物质从平板上洗去。将针对各选择的蛋白质的不同特异性抗体(其与辣根过氧化物酶(HRP)缀合)添加至平板并温育。随后，将未结合的物质从平板洗去，从而留下“夹”在平板上包被的抗体与抗体-HRP缀合物之间的结合着的蛋白质。通过添加在HRP存在下产生有色产物的底物完成对结合的抗体-蛋白质复合物的检测。所述反应用酸溶液终止并且使用平板读数仪测定每个孔的光密度(OD)。用测自双孔的结果的平均值来确定以ng/mg样品干重计的Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1或PAT蛋白的浓度。

确定蛋白质浓度的计算

用Pro软件来执行将通过平板读数仪获得的OD值换算成蛋白质浓度所需要的计算。

1.标准曲线

在每块ELISA平板上包括一标准曲线。用于该标准曲线的方程由该软件产生，所述软件使用二次拟合以使针对标准物所获得的平均OD值与相应的标准物浓度(ng/mL)相关。如下应用二次回归方程：

v＝Cx²+Bx+A

其中x＝已知的标准物浓度，而y＝相应的平均吸光度值(OD)。

2.样品浓度

通过使用由标准曲线所确定的A、B和C的值，解算上述方程中的x，完成样品浓度(ng/ml)的内推。

例如，曲线参数：A＝0.0476，B＝0.4556，C＝-0.01910并且样品OD＝1.438

样品浓度值针对表述为1∶N的稀释系数作调整。

调整的浓度＝样品浓度×稀释系数

例如，样品浓度＝3.6ng/mL并且稀释系数＝1∶10

调整的浓度＝3.6ng/mL×10＝36ng/mL

将调整的样品浓度值从ng/mL如下换算成ng/mg样品重量：

ng/mg样品重量＝ng/mL×提取体积(mL)/样品重量(mg)

例如，浓度＝36ng/mL，提取体积＝0.60ml，并且

样品重量＝10.0mg

ng/mg样品重量＝36ng/mg×0.60mL/10.0mg＝2.2ng/mg

3.定量下限(LLOQ)

以ng/mg样品重量计的LLOQ计算如下：

例如，对于叶中的PAT：可报告的分析LLOQ＝2.3ng/mL，提取体积＝0.6mL，并且样品靶重量＝10mg

结果

在4114玉米的V9叶组织中检测到处于以下表14中所示浓度的蛋白质Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1和PAT。

表14：4114玉米中的蛋白质浓度

*Cry1F和PAT的LLOQ是0.14ng/mg干重；Cry34Ab1和Cry35Ab1的LLOQ是0.16ng/mg干重

实例7.DP-004114-3玉米的事件特异性鉴定系统

在DP-004114-3插入物和玉米基因组区域之间的5′接点处设计DP-004114-3玉米的事件特异性系统。正向引物(08-O-2677，SEQ ID NO：29)位于玉米基因组DNA内部，反向引物(08-O-2678，SEQ ID NO：30)位于所插入的DNA内部，并且探针的结合位点(08-QP74，SEQ ID NO：31)跨越DP-004114-3插入物与玉米基因组DNA之间的过渡区(表15)。基于PCR效率以及在动态范围低端(0.08％GM)和高端(5％GM)定量的能力，来选择最适引物和探针浓度(表15)。

表15：DP-004114-3事件特异性PCR系统的引物和探针

DP-004114-3扩增子序列(加下划线的是引物和结合位点)：

长度：90bp

CGTTTGTAGCACTTGCACGTAGTTACCCGGACCG

TGATAGTTTAAACGCTCTTCAACTGGAAGAGC

GGTTACC(SEQ ID NO：32)

表16：DP-004114-3事件特异性PCR系统的主混合物

PCR反应总体积为20μl(15μl主混合物和5μl基因组DNA模板)。

表17：反应和循环参数

表18：循环参数

所述测定法格式使用具有四个标准点(每者重复三次)的标准曲线。通过如下方式产生标准品：制备含10％DP-004114-3玉米DNA的40ng/μl总基因组玉米DNA的溶液，然后在含有10ng/μl鲑鱼精DNA的0.1×TE缓冲液中连续稀释。对每个系统的阴性对照(NTC)重复测量三次，以验证试剂的纯度。在200ng基因组玉米DNA/反应下重复分析每种样品(未知)三次(对于两种PCR系统而言，每种样品总计6次反应)。随后通过如下方式计算DP-004114-3玉米对于总玉米DNA的相对含量：基于标准曲线确定拷贝数的均值(阈值循环(C_T)值相对于log[拷贝数]的线性回归)并计算DP-004114-3玉米拷贝数/单倍体玉米基因组总拷贝数的比率。

在Applied Biosystem ViiA 7^TM实时PCR系统上开发、优化并验证了用于检测DP-004114-3玉米DNA的该事件特异性定量PCR系统。然而，所述方法也可在极少优化和修改的情况下应用于不同平台。

可应用此处所述的事件特异性实时PCR方法确定DP-004114-3玉米DNA在总基因组玉米DNA中的相对含量。所述方法以线性方式执行，且在0.08％至5.0％DP-004114-3含量的整个范围内具有可接受的准确度和精确度。所述方法用提取自玉米种子的基因组DNA开发和验证。然而，所述测定法可应用于可从中纯化具有足够数量和质量的基因组DNA的任何基质。

实例8.玉米事件DP-004114-3的基于凝胶的PCR检测方法

该方案描述了定性的基于凝胶的PCR测定法以检测DP-004114-3玉米DNA的存在。PCR检测方法连同产生足够质量和数量的DNA的DNA提取方法一起使用。

使用引物扩增玉米基因组DNA与DP-004114-3插入物之间的5′边界接点，从而开发DP-004114-3玉米的PCR系统。正向引物位于玉米基因组区域中，并且反向引物位于转基因插入物中。

正向引物(11-O-4127)(SEQ ID NO：33)：5’-GGA CCC TGT TCA CAACAC AGG GCT C-3’

反向引物(11-O-4128)(SEQ ID NO：34)：5’-GGC CGA AGC TTC GGTCCG G-3’

扩增子序列(加下划线的是引物结合位点)(SEQ ID NO：35)：

ggaccctgttcacaacacagggctctggctttggagcctctcgtttgtagcacttgcacgtagttacccggaccgaagcttcaacacagatctgatagtttaaacgctcttcaactggaagagcggttacccggaccgaagcttcggcc

所用设备和材料：

试剂、缓冲液和溶液：

步骤

在使用前彻底混合试剂。以执行所有反应的足够量制备由PCR反应的所有成分组成的反应混合物(除模板DNA外)。将试剂和主混合物保持在冰上。

PCR系统的主混合物的制备：

成分	浓度	终浓度	ul/rxn
				Promega 2×PCR缓冲液	2×	1×	12.50
正向引物(11-O-4127)	10μM	200nM	0.50
				反向引物(11-O-4128)	10μM	200nM	0.50
无菌水			6.50
				总体积			20.00

将各成分混合，并将20μl彻底混合的主混合物分配到反应管中。加入5μl的20ng/μl模板基因组DNA。

无模板的对照：作为基因组DNA的替代，将用于稀释测试DNA样品的5μl稀释液加入到其适当浓度；例如，水、0.1×TE等。

阳性对照：加入5μl的例如1％DP-004114-3(20ng/μl)玉米DNA。

在将模板加入主混合物中后，盖上反应管，立即放置在预热PCR仪器中，并开始运行。

循环参数

使用升降温速度设定为“GeneAmp 9600”的Applied Biosystems的96孔GeneAmp PCR系统9700进行PCR测定。循环参数如下：

DP-004114-3检测方法的PCR配置

凝胶电泳

将PCR产物与所添加的足以达到1×上样缓冲液终浓度的6×上样缓冲液混合(例子：25μl PCR产物加5μl 6×上样缓冲液)。将15μl PCR产物/上样染料混合物上样于2.5％琼脂糖/1×TBE凝胶。以7V/cm(电极到电极的测量值)的最大电压运行凝胶，直到片段适当分离。凝胶运行足够长的时间以得到50至200bp范围内的标记条带的清晰分离。将琼脂糖凝胶在溴化乙锭浴(每ml蒸馏水或缓冲液1.5μg)中染色大约15分钟，用蒸馏水或1x TBE漂洗，并用适当凝胶成像系统在紫外光下拍照。DP-004114-3玉米的PCR产物的长度为149bp。

在解释并描述了本发明的原理之后，本领域技术人员应当清楚，本发明可以在安排和细节上进行修改而不脱离这些原理。我们要求保护处于所附权利要求书的精神和范围内的全部修改。

本说明书中引用的全部出版物及公开的专利文件均以引用方式以相同程度并入本文，一如专门且单独地说明通过引用方式并入每份单独的出版物或专利申请那样。

Claims

1.一种扩增子，其包含选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35及其全长互补序列的核酸序列。

2.一种源自玉米事件DP-004114-3植物、组织或种子的生物学样品，其中所述样品包含核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35的序列或与选自SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35的序列互补，其中所述核苷酸序列是使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述样品中可检测的，其中所述玉米事件DP-004114-3种子的代表性样品已经以登录号PTA-11506存放于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

3.根据权利要求2所述的生物学样品，其中所述生物学样品包含转基因玉米事件DP-004114-3的植物、组织或种子。

4.根据权利要求3所述的生物学样品，其中所述生物学样品是从所述转基因玉米植物事件DP-004114-3提取的DNA样品，并且其中所述DNA样品包含选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35及其互补序列的核苷酸序列中的一个或多个。

5.根据权利要求4所述的生物学样品，其中所述生物学样品选自玉米粉、玉米粕、玉米浆、玉米油、玉米淀粉及经完全或部分地加工以含有玉米副产物的谷类物。

6.一种提取物，其源自玉米事件DP-004114-3植物、组织或种子并且包含核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：35的序列或与选自SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35的序列互补，其中所述玉米事件DP-004114-3种子的代表性样品已经以登录号PTA-11506存放于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

7.根据权利要求6所述的提取物，其中所述核苷酸序列是使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述提取物中可检测的。

8.根据权利要求7所述的提取物，其中所述提取物包含转基因玉米植物事件DP-004114-3的植物、组织或种子。

9.根据权利要求8所述的提取物，还包含选自玉米粉、玉米粕、玉米浆、玉米油、玉米淀粉和经完全或部分地加工以含有玉米副产物的谷类物的组合物，其中所述组合物包含可检测量的所述核苷酸序列。

10.一种确定生物学样品中包含玉米事件DP-004114-3的玉米植物的DNA接合性的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与选自SEQ ID NO：29和30的引物对、或选自SEQID NO：33和34的引物对接触，使得

(1)当在包含玉米事件DP-004114-3 DNA的核酸扩增反应中使用时，产生判定玉米事件DP-004114-3的第一扩增子，并且

(2)当在包含除DP-004114-3 DNA之外的玉米基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，产生判定除DP-004114-3 DNA之外的玉米基因组DNA的第二扩增子；

(b)进行核酸扩增反应；以及

(c)检测如此产生的所述扩增子，其中检测到两种扩增子的存在指示所述样品是对玉米事件DP-004114-3 DNA杂合的，其中仅检测到所述第一扩增子指示所述样品是对玉米事件DP-004114-3DNA纯合的。

11.一对多核苷酸引物，其包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物，其中所述第一多核苷酸引物包含SEQ ID NO：29的所述核苷酸序列及其互补序列；并且所述第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO：30的所述核苷酸序列及其互补序列，所述多核苷酸引物在样品中存在DP-004114-3 DNA模板的情况下一起发挥作用以产生判定事件DP-004114-3的扩增子。

12.一种试剂盒，其用于检测对于事件DP-004114-3为独特的核酸，所述试剂盒包含由SEQ ID NO：29和30、或SEQ ID NO：33和34、及其互补序列组成的引物对，所述序列在核酸检测方法中充当引物对，并且在扩增或杂交于样品中的靶核酸序列接着检测所述靶序列的扩增子或与所述靶序列的杂交时，判定所述样品中对于事件DP-004114-3为独特的核酸序列的存在。