CN104274406B - 一种注射用他克莫司脂肪乳剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用他克莫司脂肪乳剂，含有他克莫司，注射用油性溶剂，表面活性剂，两亲性嵌段共聚物，注射用渗透压调节剂，抗氧剂，稳定剂。另外，本发明还公开了该脂肪乳剂的制备方法。本发明可有效增加药物的化学稳定性，他克莫司脂肪乳剂中，大部分药物分布在油相或油水界面，避免药物与水直接接触；药物增溶于油相中，隔离药物，水相的药物量少，大大降低了药物水解的量，对药物的稳定性有很大提高。本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂系将药物部分包裹于油相或界面膜中，避免了与体液的直接接触，因此降低了药物自身可能产生的局部及血管刺激性。

Description

一种注射用他克莫司脂肪乳剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种注射用他克莫司脂肪乳剂及其制备方法。

背景技术

器官移植被称为20世纪人类医学三大进步之一。器官移植作为器官衰竭治疗的最后有效手段，在中国的需求很大，如今全国有100多家医院和200多位专家已经可以进行包括肾脏、肝脏、心脏、胰腺、肺、骨髓及角膜等25种同种异体器官移植，器官移植患者需要在移植后终身服用免疫抑制剂，免疫抑制剂对器官移植患者存活时间、保持移植器官良好功能等方面都起着重要作用。故免疫抑制剂作为器官移植用药的开发具有临床应用价值。

他克莫司(Tacrolimus，FK506，商品名Prograf)是日本藤泽(Fujisawa)制药公司1984年首次从Tsukubaensis链霉菌第9993株发酵产物中提纯的一种23元大环内酯类新型免疫抑制剂。其分子式为C₄₄H₆₉NO₁₂，分子量804.02。室温下呈白色结晶或晶状粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿及乙醚中，略溶于己烷、石油醚，不溶于水，其熔点为127～129℃，旋光度为-84.4°。

他克莫司除具有抗真菌作用外，还具有很强的免疫抑制作用，他克莫司作用机理为：他克莫司与内源性细胞内受体(胞浆结合蛋白FKBP12)结合，形成亲免素复合物，该复合物竞争性地与钙调素特异性地结合并抑制钙调素，有效地抑制T细胞激活，抑制白细胞介素-2(IL-2)的产生。他克莫司的效力比应用较广的环孢素A(cyclosporine A，CsA)高近100倍。在低于1/100环孢素浓度的情况下，也具抑制混合淋巴细胞培养物的反应，他克莫司能够有效防止器官移植后的排斥反应，并能逆转对环孢素无效的排斥反应。

目前市场上已有的以他克莫司为有效活性成份的药物制剂有注射液、胶囊和软膏三种。他克莫司软膏用于非特异性皮炎，他克莫司注射剂和他克莫司胶囊剂用于预防肝脏或肾脏移植术后的移植物排斥反应及治疗肝脏或肾脏移植术后应用其他免疫抑制药物无法控制的移植物排斥反应。

在临床上，由于他克莫司体内吸收过程中所受的干扰因素很多，所以即便增加了他克莫司的溶出速度，他克莫司口服制剂仍然存在着相当大的个体差异，导致血药浓度的波动很大；他克莫司注射剂适用于不能接受口服给药或需要在短期内达到较高血药浓度、迅速起效的患者。因此，他克莫司注射剂在临床治疗上仍然是口服制剂无法代替的。

目前临床上他克莫司注射剂常采用非水溶媒系统，即：将他克莫司溶解于聚氧乙烯氢化蓖麻油和无水乙醇的混合溶剂中。聚氧乙烯氢化蓖麻油存在着药理活性和不良反应，临床应用上往往会带来毒副作用。且注射剂在稀释时存在药物析出的风险。他克莫司在碱性条件下不稳定。

鉴于上述特性，为使他克莫司更好的发挥免疫抑制作用，开发一种不含具有药理活性的表面活性剂及有机试剂的注射液，并保持其稳定性具有十分重要的意义。

静脉注射脂肪乳剂作为水难溶性药物的载体，近来得到广泛的应用。其特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为脂溶性药物的良好载体。与传统注射液相比较，脂肪乳剂可以降低血管刺激性。载药脂肪乳是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成，是一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒分散体系，作为药物载体具有提高药物溶解度和稳定性等优点。

日本藤泽制药公司研制生产并在中国、日本、美国等国上市的他克莫司注射液，其采用的表面活性剂是聚氧乙烯60氢化蓖麻油(Polyoxyl60Hydrogenated Castor Oil，以下简称HCO-60)，每毫升他克莫司注射液中含200mg HCO-60。韩国专利No.0177158公开了一种溶液制剂，该溶液制剂含有他克莫司或其药学上可接受的盐、包括氢化蓖麻油聚氧乙烯醚的药学上可接受的表面活性剂和药学上可接受的非水溶剂。韩国专利No.0206722公开了一种溶液组合物，该组合物含有他克莫司或其药学上可接受的盐；选自由蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂和氢化蓖麻油聚氧乙烯醚所组成的药学上可接受的乳化剂；和选自由大豆油和芝麻油所组成的液体炭氢化合物的药学上可接受的油。韩国特开No.2001-0006070公开了一种药用组合物，该药用组合物含有水不溶性药物和两种以上的表面活性剂，至少一种表面活性剂能够溶解其它水不溶性表面活性剂和水不溶性药物。

美国公开了一种他克莫司注射液制剂，该制剂包含他克莫司、蓖麻油聚烃氧酯(35)及非水溶剂。药剂学上，主张制剂配方中尽量减少与治疗作用无关的组分或其含量，而达到相似或更好的药物质量和临床疗效。任何与治疗作用无关的组分的增加或其加入量的增大都会给临床使用带来安全性问题。从药剂学角度分析，以上公开资料中采用多种表面活性剂组合的发明均不是最佳的发明，其临床应用的疗效和安全性尚未有相关研究数据，其安全性值得商榷。

此外，现有溶液组合物存在一些问题，药物在产期储存的过程中会产生沉淀，并且随着药物含量的降低，其药学稳定性将会下降。因此，传统的溶液组合物不适于用作人体注射用制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了一种注射用他克莫司脂肪乳剂。该脂肪乳剂可有效增加药物的化学稳定性，他克莫司脂肪乳剂中，大部分药物分布在油相或油水界面，避免药物与水直接接触；药物增溶于油相中，隔离药物，水相的药物量少，大大降低了药物水解的量，对药物的稳定性有很大的提高；注射用他克莫司脂肪乳剂系将药物部分包裹于油相或界面膜中，避免了与体液的直接接触，因此降低了药物自身可能产生的局部及血管刺激性。另外，药物在体内是由油相中缓慢释放，可避免药物在注射时由于初期浓度过高引起的不良反应。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.01g～10g，注射用油性溶剂2g～20g，表面活性剂0.5g～7g，两亲性嵌段共聚物0.1g～2g，注射用渗透压调节剂0.5g～7g，抗氧剂0～3g，稳定剂0.1g～5g；所述抗氧剂为水溶性抗氧剂和/或油溶性抗氧剂。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.01g～5g，注射用油性溶剂10g～20g，表面活性剂1g～3g，两亲性嵌段共聚物1g～2g，注射用渗透压调节剂1g～4g，抗氧剂1g～2g，稳定剂0.5g～2g。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.2g，注射用油性溶剂20g，表面活性剂2.05g，两亲性嵌段共聚物1.4g，注射用渗透压调节剂2.5g，抗氧剂1.5g，稳定剂0.8g。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中还含有金属螯合剂0.001g～3g，所述金属螯合剂为依地酸二钠和/或依地酸钠钙。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，所述注射用他克莫司脂肪乳剂中还含有pH调节剂，pH调节剂的用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为4.0～9.0，所述pH调节剂为氢氧化钠或盐酸。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的一种或几种；所述表面活性剂为卵磷脂、司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的一种或几种。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物中的亲水链段为聚乙二醇，疏水链段为左旋聚乳酸、右旋聚乳酸或消旋聚乳酸。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，所述亲水链段的粘均分子量为2000～10000，疏水链段的粘均分子量为8000～100000。

上述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，所述稳定剂为胆固醇和/或胆固醇硫酸酯钠；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的一种或几种；所述水溶性抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸中的一种或几种，所述油溶性抗氧剂为维生素E。

另外，本发明还提供了一种制备上述的注射用他克莫司脂肪乳剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、将他克莫司、油溶性抗氧剂和稳定剂加入注射用油性溶剂中，在温度为50℃～80℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将注射用渗透压调节剂、表面活性剂、两亲性嵌段共聚物、金属螯合剂和水溶性抗氧剂加入注射用水中，在温度为50℃～80℃的条件下搅拌至所述原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，将步骤一中所述油相加入步骤二中所述水相中或者将步骤二中所述水相加入步骤一中所述油相中，然后以6000rpm～20000rpm搅拌2min～8min，得到初乳；

步骤四、用pH调节剂将步骤三中所述初乳的pH值调节至4.0～9.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为20℃～60℃，以300bar～1200bar压力均质4～12次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至4.0～9.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂可有效增加药物的化学稳定性，他克莫司脂肪乳剂中，大部分药物分布在油相或油水界面，避免药物与水直接接触；药物增溶于油相中，隔离药物，水相的药物量少，大大降低了药物水解的量，对药物的稳定性有很大的提高。

3、本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂系将药物部分包裹于油相或界面膜中，避免了与体液的直接接触，因此降低了药物自身可能产生的局部及血管刺激性。另外，药物在体内是由油相中缓慢释放，可避免药物在注射时由于初期浓度过高引起的不良反应。

4、本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂采用表面活性剂与两亲性嵌段共聚物复配来提高制剂的物理稳定性。两亲性嵌段共聚物中的疏水部分可以全部或部分地插入到油相中，亲水部分在水相中自由舒展，有效地阻止了乳滴间的聚集，提高了制剂的稳定性。

5、本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂中的稳定剂为胆固醇和/或胆固醇硫酸酯钠，稳定剂可以调节脂肪乳界面膜的流动性，有很好的膜稳定作用，加入稳定剂的乳剂不仅能经受高温热压灭菌，而且常温或低温放置稳定，药物不易析出。

6、本发明将他克莫司90％以上的药物包裹于脂肪乳的脂质核心内部，其余药物分布于油水界面膜中，减慢药物降解，提高了药物制剂的物理化学稳定性，延长了药物在体内的作用时间。

7、将本发明的他克莫司脂肪乳剂经注射给药后表现为注射时对血管的刺激性显著降低，制剂在贮存过程中表现为较好的化学物理稳定性，无药物的渗漏现象。

8、本发明制备的注射用他克莫司脂肪乳剂具有包封率高，稳定性良好等优点，是一种有效的静脉注射用药，具有广阔的开发前景。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细描述。

附图说明

图1为市售他克莫司注射液和本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂给药后的药时曲线。

图2为本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂零时粒径分布。

具体实施方式

实施例1

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.2g，大豆油10g，中链脂肪酸甘油三酯10g，卵磷脂(蛋黄卵磷脂)2g，油酸0.05g，左旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物(中科院长春应用化学研究所提供，其中聚乙二醇的粘均分子量为2000，左旋聚乳酸的粘均分子量为14000)1.4g，甘油2.5g，维生素E 1.5g，胆固醇0.8g，依地酸二钠0.02g，盐酸(用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为6.0)，余量为注射用水。

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂的制备方法为：

步骤一、将他克莫司、维生素E和胆固醇加入大豆油和中链脂肪酸甘油三酯的混合溶剂中，在温度为70℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将甘油、卵磷脂、油酸、左旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物和依地酸二钠加入注射用水中，在温度为70℃的条件下搅拌至所述原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，将步骤一中所述油相加入步骤二中所述水相中，然后以10000rpm搅拌5min，得到初乳；

步骤四、用氢氧化钠将步骤三中所述初乳的pH值调节至6.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为40℃，以800bar压力均质8次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至6.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，灭菌条件为103.4kPa，121℃灭菌10min，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。

实施例2

本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于：所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的一种或三种以上，或者为蓖麻油、玉米油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的两种，或者为蓖麻油、玉米油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的一种与大豆油的混合物；所述表面活性剂为卵磷脂、司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的一种或三种以上，或者为司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的两种，或者为司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠和去氧胆酸中的一种与卵磷脂的混合物；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇或山梨醇，或者为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的至少两种；所述抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸或L-半胱氨酸，或者为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸和维生素E中的至少两种；所述稳定剂为胆固醇硫酸酯钠，或胆固醇和胆固醇硫酸酯钠；所述金属螯合剂为依地酸钠钙，或依地酸二钠和依地酸钠钙。

实施例3

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.01g，鸦胆子油10g，卵磷脂(蛋黄卵磷脂)0.5g，油酸钠0.1g，吐温800.4g，右旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物(中科院长春应用化学研究所提供，其中聚乙二醇的粘均分子量为5000，左旋聚乳酸的粘均分子量为8000)1g，甘油1g，抗坏血酸1g，胆固醇硫酸酯钠0.5g，依地酸钠钙0.01g，氢氧化钠(用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为9.0)，余量为注射用水。

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂的制备方法为：

步骤一、将他克莫司和胆固醇硫酸酯钠加入鸦胆子油中，在温度为50℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将甘油、卵磷脂、油酸钠、吐温80、右旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物、依地酸钠钙和抗坏血酸加入注射用水中，在温度为50℃的条件下搅拌至所述原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，将步骤二中所述水相加入步骤一中所述油相中，然后以6000rpm搅拌8min，得到初乳；

步骤四、用氢氧化钠将步骤三中所述初乳的pH值调节至9.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为20℃，以1200bar压力均质12次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至9.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，灭菌条件为103.4kPa，121℃灭菌10min，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。

实施例4

本实施例与实施例3相同，其中不同之处在于：所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油或川穹油，或者为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的至少两种；所述表面活性剂为卵磷脂、司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的一种、两种或四种以上，或者为司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的三种，或者为司盘、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的两种与卵磷脂的混合物，或者为司盘、普朗尼克、油酸和去氧胆酸中的一种与卵磷脂和吐温的混合物；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇或山梨醇，或者为氯化钠、葡萄糖、甘油、甘露醇和山梨醇中的两种以上；所述抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或维生素E，或者为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸和维生素E中的至少两种；所述稳定剂为胆固醇，或胆固醇和胆固醇硫酸酯钠；所述金属螯合剂为依地酸二钠，或依地酸二钠和依地酸钠钙。

实施例5

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司5g，大豆油20g，卵磷脂(蛋黄卵磷脂)3g，消旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物(中科院长春应用化学研究所提供，其中聚乙二醇的粘均分子量为5000，消旋聚乳酸的粘均分子量为100000)2g，氯化钠1g，山梨醇1g，甘油2g，L-半胱氨酸1g，维生素E 1g，胆固醇1g，胆固醇硫酸酯钠1g，依地酸二钠0.5g，依地酸钠钙0.5g，盐酸(用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为4.0)，余量为注射用水。

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂的制备方法为：

步骤一、将他克莫司、维生素E、胆固醇和胆固醇硫酸酯钠加入大豆油中，在温度为80℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将山梨醇、甘油、卵磷脂、消旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物、依地酸二钠、依地酸钠钙和L-半胱氨酸加入注射用水中，在温度为80℃的条件下搅拌至所述原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，将步骤一中所述油相加入步骤二中所述水相中，然后以20000rpm搅拌2min，得到初乳；

步骤四、用盐酸将步骤三中所述初乳的pH值调节至4.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为60℃，以300bar压力均质4次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至4.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，灭菌条件为103.4kPa，121℃灭菌10min，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。

实施例6

本实施例与实施例5相同，其中不同之处在于：所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的一种或几种，或者为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的至少两种；所述表面活性剂为司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸或去氧胆酸，或者为卵磷脂、司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的至少两种；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的一种、两种、四种或五种，或者为葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的三种，或者为葡萄糖、甘露醇和山梨醇中的两种与氯化钠的混合物，或者为氯化钠、葡萄糖和甘露醇；所述抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、维生素E和L-半胱氨酸中的一种或三种以上，或者为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸中的两种，或者为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和抗坏血酸中的一种与维生素E的混合物；所述稳定剂为胆固醇或胆固醇硫酸酯钠；所述金属螯合剂为依地酸二钠或依地酸钠钙。

实施例7

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.5g，蓖麻油0.5g，中链脂肪酸甘油三酯0.5g，棕榈油0.8g，莪术油0.2g，普朗尼克0.2g，去氧胆酸0.3g，消旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物(中科院长春应用化学研究所提供，其中聚乙二醇的粘均分子量为10000，消旋聚乳酸的粘均分子量为50000)0.1g，葡萄糖0.5g，胆固醇硫酸酯钠0.1g，依地酸二钠0.001g，氢氧化钠(用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为8.0)，余量为注射用水。

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂的制备方法为：

步骤一、将他克莫司和胆固醇硫酸酯钠加入蓖麻油、中链脂肪酸甘油三酯、棕榈油和莪术油的混合溶剂中，在温度为60℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将葡萄糖、普朗尼克、去氧胆酸、消旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物和依地酸二钠加入注射用水中，在温度为60℃的条件下搅拌至所述原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，步骤二中所述水相加入步骤一中所述油相中，然后以12000rpm搅拌4min，得到初乳；

步骤四、用pH调节剂将步骤三中所述初乳的pH值调节至8.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为30℃，以1000bar压力均质6次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至8.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，灭菌条件为103.4kPa，121℃灭菌10min，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。

实施例8

本实施例与实施例7相同，其中不同之处在于：所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的一种、两种、三种或五种以上，或者为玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的四种，或者为玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的三种与蓖麻油的混合物，或者为玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、鸦胆子油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的两种与蓖麻油和中链脂肪酸甘油三酯的混合物，或者为玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、鸦胆子油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油和川穹油中的两种与蓖麻油、中链脂肪酸甘油三酯和莪术油的混合物；所述表面活性剂为卵磷脂、司盘、吐温、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的一种或三种以上，或者为卵磷脂、司盘、吐温、油酸钠和油酸中的一种与普郎尼克的混合物；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、甘露醇、甘油和山梨醇，或者为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的至少两种；所述稳定剂为胆固醇，或胆固醇和胆固醇硫酸酯钠；所述金属螯合剂为依地酸钠钙，或者为依地酸二钠和依地酸钠钙。

实施例9

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司10g，中链脂肪酸甘油三酯20g，卵磷脂(蛋黄卵磷脂)5g，油酸钠2g，左旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物(中科院长春应用化学研究所提供，其中聚乙二醇的粘均分子量为5000，左旋聚乳酸的粘均分子量为20000)2g，甘露醇2g，甘油3g，山梨醇2g，焦亚硫酸钠2g，维生素E 1g，胆固醇5g，依地酸钠钙3g，氢氧化钠(用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为9.0)，余量为注射用水。

本实施例的注射用他克莫司脂肪乳剂的制备方法为：

步骤一、将他克莫司、维生素E和胆固醇加入注射用油性溶剂中，在温度为50℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将甘露醇、甘油、山梨醇、卵磷脂、油酸钠、左旋聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物、依地酸钠钙和焦亚硫酸钠加入注射用水中，在温度为50℃的条件下搅拌至所述原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，将步骤一中所述油相加入步骤二中所述水相中或者将步骤二中所述水相加入步骤一中所述油相中，然后以6000rpm搅拌8min，得到初乳；

步骤四、用pH调节剂将步骤三中所述初乳的pH值调节至9.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为60℃，以500bar压力均质8次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至9.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，灭菌条件为103.4kPa，121℃灭菌10min，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。

实施例10

本实施例与实施例9相同，其中不同之处在于：所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油或川穹油，或者为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的至少两种；所述表面活性剂为卵磷脂、司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的一种或三种以上，或者为司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的两种，或者为司盘、吐温、普朗尼克、油酸和去氧胆酸中的一种和卵磷脂的混合物；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的一种、两种、四种或五种，或者为氯化钠、葡萄糖、甘露醇和甘油中的三种，或者为氯化钠、葡萄糖和甘露醇中的两种和山梨醇的混合物，或者为氯化钠、甘油和山梨醇，或者为葡萄糖、甘油和山梨醇；所述抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸和维生素E中的一种或三种以上，或者为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸和维生素E中的两种，或者为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸和维生素E中的一种与焦亚硫酸钠的混合物；所述稳定剂为胆固醇或胆固醇和胆固醇硫酸酯钠；所述金属螯合剂为依地酸二钠或依地酸二钠和依地酸钠钙。

对本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂的各项性能进行考察：

一、血管刺激性实验

取健康家兔15只，随机分成5组，每组3只。5组家兔左耳均注射氯化钠注射液，右耳分别注射本发明实施例1、3、5、7和9的注射用他克莫司脂肪乳剂，每天给药1次，连续3天。给药期间每天肉眼观察给药局部血管有无血栓形成，周围组织有无红肿淤血等炎症反应。给药结束后处死，自给药处向心方向3cm处取下耳组织，以10％福尔马林固定、石蜡包埋、制片、染色，光镜下观察血管机周围组织形态学改变。

表1 血管刺激试验结果

组织学观察结果表明：给药组兔耳缘静脉血管壁完整，光滑。未见内皮损伤，无血栓形成及周围组织水肿、炎细胞浸润、炎症及坏死等病理变化。给药组与阴性对照组比较无明显差别，表明所制备的注射用他克莫司脂肪乳对家兔耳血管未见明显刺激。

二、动物过敏性试验

取体重250g～350g健康豚鼠42只，随机分为7组，一组作为阴性对照组注射0.9％氯化钠注射液，每次注射剂量为0.5mL/只，一组作为阳性对照组注射10％卵白蛋白溶液，每次注射剂量为0.1mL/只，其余五组作为供试品组分别注射本发明实施例1、3、5、7和9的注射用他克莫司脂肪乳剂，每次注射剂量为0.5mL/只。注射方式与次数：隔日腹腔注射一次，共注射三次。然后在末次注射后第14日阴性对照组、阳性对照组和各供试组分别静脉注射0.9％氯化钠注射液、10％卵白蛋白溶液和各供试品溶液，给药体积均为1mL/只，进行激发。在注射后15分钟内，观察注射药液的豚鼠是否出现过敏反应。如有竖毛、呼吸困难或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者，或有抽搐、虚脱或死亡等现象之一者，则判为阳性(有过敏反应)。结果见表2。

表2 过敏试验结果(n＝6)

从表2中可以看出，阴性对照组及本发明制备得到的注射用他克莫司脂肪乳剂两次静脉给药后15分钟内每组各6只豚鼠均未出现过敏反应，阳性对照液两次静脉给药后1分钟内6只豚鼠全部出现咳嗽、呼吸抑制、抽搐直至死亡。结果表明：在本试验条件下本发明实施例1、3、5、7和9制备得到的注射用他克莫司脂肪乳剂过敏试验未出现全身过敏反应。

三、动物溶血性试验

2％红细胞悬液的制备：取新鲜兔血10mL，置于烧杯中，用玻璃棒轻微搅动，数分钟后除去纤维蛋白，取出血液，加入5倍量生理盐水，摇匀，2500rpm/min离心5min，弃去上清液；沉淀的红细胞再用同量的生理盐水清洗，离心，如此反复洗涤3～4次，至上清液成无色透明为止。将洗涤好的红细胞用生理盐水配制成2％红细胞悬液，备用。

实验设计：取干净试管7个，分别编号，依次加入下表内各液，第6管不加供试液为空白对照管，第7管用蒸馏水代替生理水，摇匀，置于37℃水浴中，分别于0.5h、1h、2h、3h、4h观察是否有溶血现象发生。

结果判定标准：全溶血：溶液澄明红色，管底无红细胞残留；部分溶血：溶液澄明或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集：不溶血，红细胞在试管底部凝集，振摇后细胞不能分散。

表3 本发明实施例1的注射用他克莫司脂肪乳剂的溶血试验结果

注：+++完全溶血；++部分溶血；+凝集；-不溶血，也不发生凝集

试验结果表明：本发明实施例1制备得到的注射用他克莫司脂肪乳剂在4小时内未引起溶血或凝集反应。

采用上述方法对本发明实施例3、5、7和9制备的注射用他克莫司脂肪乳剂进行动物溶血性试验，在4小时内均未引起溶血或凝集反应。

四、大鼠体内药动学实验

将12只Wistar种雄性大鼠，体重(200±20)g，随机分成两组：R组和A组，每组6只，实验前禁食一夜。R组为对照组，尾静脉注射市售他克莫司注射液(Prograf)；A组为受试组，于尾静脉注射本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂(TLE)，分别于给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h眼眶取血0.5mL，置预先肝素化的1.5mL尖底离心试管中，处理后以LC-MS/MS测定药物浓度。

表4 采用统计矩方法计算的各项药动学参数(n＝6)

注：a表示p<0.05；

采用统计软件(SPSS，version11.5)对两种制剂主要的各项药动学参数进行单侧t-检验分析。比较两组数据，若得到p<0.05时，说明两组数据具有统计学差异。由表4可知，TLE与Prograf相比较，除了AUC外，其他药动学参数均无显著性差异。

由图1中TLE(本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂)与Prograf(市售他克莫司注射液)相比较，二者体内药动学行为很相似。表明所制备制剂与市售注射液相似，在不改变药物动力学行为的前提下，起到了提高药物溶解度、增加药物稳定性的效果。

五、加速稳定性试验

由于注射用他克莫司脂肪乳剂是热力学不稳定体系，属于对热敏感的剂型。按照中国药典2010年版原料药与药物制剂稳定性试验指导原则的说明，将本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂在25±2℃的条件下放置6个月，考察物理化学稳定性的变化。

表5 加速稳定性试验结果

时间(月)	pH值	粒径(nm)	ζ-电位(mv)	包封率(％)	含量(％)
						0	6.18	204.1±62.4	-36.67	92.36	104
1	6.19	206.9±75.8	-37.44	91.15	102
						2	6.15	203.3±61.5	-36.33	90.07	103
3	6.12	210.7±59.3	-36.39	89.33	101
						6	6.07	209.6±60.6	-36.98	89.30	99

从表5中可以看出，本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂在25±2℃的条件下加速6个月后外观、物理稳定性及化学稳定性良好。

采用上述方法对本发明实施例3、5、7和9制备的注射用他克莫司脂肪乳剂进行加速稳定性试验，在25±2℃的条件下加速6个月后外观、物理稳定性及化学稳定性良好。

六、长期稳定性试验

将本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂在6±2℃的条件下放置12个月，考察物理化学稳定性的变化。本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂零时粒径分布如图2所示，平均粒径在200nm左右。

表6 长期稳定性试验结果

时间(月)	pH值	粒径(nm)	ζ-电位(mv)	包封率(％)	含量(％)
						0	6.18	204.1±63.3	-39.67	92.36	104
3	6.14	206.7±74.7	-38.37	90.98	102
						6	6.11	203.3±62.2	-38.54	91.32	103
9	6.17	203.0±59.5	-39.63	90.17	100
						12	6.15	203.3±60.4	-38.28	90.12	98

从表6中可以看出，本发明实施例1制备的注射用他克莫司脂肪乳剂在6±2℃长期试验12个月各项考察指标的检验结果仍符合质量标准规定。

采用上述方法对本发明实施例3、5、7和9制备的注射用他克莫司脂肪乳剂进行长期稳定性试验，在6±2℃长期试验12个月后外观、物理稳定性及化学稳定性良好。

综上，本发明的注射用他克莫司脂肪乳剂在经25±2℃加速试验6个月和6±2℃长期试验12个月各项考察指标的检验结果仍符合质量标准规定，可以保证制剂在贮藏期间的质量稳定。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.01g～10g，注射用油性溶剂2g～20g，表面活性剂0.5g～7g，两亲性嵌段共聚物0.1g～2g，注射用渗透压调节剂0.5g～7g，抗氧剂0～3g，稳定剂0.1g～5g；所述抗氧剂为水溶性抗氧剂和/或油溶性抗氧剂；每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中还含有金属螯合剂0.001g～3g，所述金属螯合剂为依地酸二钠和/或依地酸钠钙；所述两亲性嵌段共聚物中的亲水链段为聚乙二醇，疏水链段为左旋聚乳酸、右旋聚乳酸或消旋聚乳酸；所述稳定剂为胆固醇和/或胆固醇硫酸酯钠；所述注射用渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、甘油和山梨醇中的一种或几种；所述水溶性抗氧剂为亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸中的一种或几种，所述油溶性抗氧剂为维生素E；所述注射用油性溶剂为蓖麻油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、红花油、中链脂肪酸甘油三酯、鸦胆子油、棕榈油、葵花籽油、沙棘籽油、当归油、花椒油、大蒜油、莪术油和川穹油中的一种或几种；所述表面活性剂为卵磷脂、司盘、吐温、普朗尼克、油酸钠、油酸和去氧胆酸中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.01g～5g，注射用油性溶剂10g～20g，表面活性剂1g～3g，两亲性嵌段共聚物1g～2g，注射用渗透压调节剂1g～4g，抗氧剂1g～2g，稳定剂0.5g～2g。

3.根据权利要求2所述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，每100mL注射用他克莫司脂肪乳剂中含有他克莫司0.2g，注射用油性溶剂20g，表面活性剂2.05g，两亲性嵌段共聚物1.4g，注射用渗透压调节剂2.5g，抗氧剂1.5g，稳定剂0.8g。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，其特征在于，所述注射用他克莫司脂肪乳剂中还含有pH调节剂，pH调节剂的用量为使注射用他克莫司脂肪乳剂的pH值为4.0～9.0，所述pH调节剂为氢氧化钠或盐酸。

5.根据权利要求1、2或3所述的一种注射用他克莫司脂肪乳剂，其特征在于，所述亲水链段的粘均分子量为2000～10000，疏水链段的粘均分子量为8000～100000。

6.一种制备如权利要求4所述的注射用他克莫司脂肪乳剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、将他克莫司、油溶性抗氧剂和稳定剂加入注射用油性溶剂中，在温度为50℃～80℃的条件下搅拌均匀，得到油相；

步骤二、将注射用渗透压调节剂、表面活性剂、两亲性嵌段共聚物、金属螯合剂和水溶性抗氧剂加入注射用水中，在温度为50℃～80℃的条件下搅拌至原料全部溶解，得到水相；

步骤三、利用高速组织捣碎机，将步骤一中所述油相加入步骤二中所述水相中或者将步骤二中所述水相加入步骤一中所述油相中，然后以6000rpm～20000rpm搅拌2min～8min，得到初乳；

步骤四、用pH调节剂将步骤三中所述初乳的pH值调节至4.0～9.0，然后用注射用水定容，将定容后的初乳转移至高压均质机中，控制均质温度为20℃～60℃，以300bar～1200bar压力均质4～12次，得到终乳，再用pH调节剂将所述终乳的pH值调节至4.0～9.0；

步骤五、用高压蒸汽灭菌锅对步骤四中调节pH值后的终乳进行灭菌，得到注射用他克莫司脂肪乳剂。