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CN104244978A - 通过施用丝氨酸蛋白酶抑制剂治疗或预防流感病毒感染的方法 - Google Patents

通过施用丝氨酸蛋白酶抑制剂治疗或预防流感病毒感染的方法 Download PDF

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CN104244978A
CN104244978A CN201380020133.9A CN201380020133A CN104244978A CN 104244978 A CN104244978 A CN 104244978A CN 201380020133 A CN201380020133 A CN 201380020133A CN 104244978 A CN104244978 A CN 104244978A
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influenza
ttsp
inhibitor
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CN201380020133.9A
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L·A·珀塞尔恩嘉波
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本发明提供了用于治疗和预防流感病毒感染的方法。本发明方法包括给需要其的受试者施用包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)的药物组合物。TTSP抑制剂优选地通过抑制流感血凝素(HA0)蛋白水解切割成有功能的亚基HA1和HA2来发挥作用。在某些实施方案中，TTSP抑制剂是跨膜蛋白酶丝氨酸S1成员2(TMPRSS2)的抑制剂，例如抗TMPRSS2抗体或其抗原结合片段。

Description

通过施用丝氨酸蛋白酶抑制剂治疗或预防流感病毒感染的方法
发明领域
本发明涉及流感病毒感染的治疗和预防。更特别地，本发明涉及使用II型跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂(TTSP)，如抗-TMPRSS2抗体在受试者中治疗或预防流感病毒感染。
发明背景
流感病毒感染过程从病毒颗粒(病毒体)附着到靶细胞开始，然后是病毒包膜与靶细胞膜融合。病毒附着和细胞融合通过病毒包膜蛋白血凝素(HA)介导。HA由两个亚基组成：HA1介导附着步骤，而HA2介导融合步骤。HA最初合成为没有活性的前体(HA0)，其中HA1和HA2通过蛋白酶敏感的连接体序列连接。通过宿主细胞蛋白酶切割连接体产生了有功能的HA1和HA2亚基。因为HA的切割是必要的，所以认为流感病毒感染过程中的宿主介导步骤(介导HA活化的宿主细胞蛋白酶)是针对流感感染的治疗靶点(参见例如，Bottcher等,(2006)J.Virol.80:9896-9898)。
涉及流感HA切割的宿主细胞蛋白酶包括TTSP如跨膜蛋白酶丝氨酸S1成员2(TMPRSS2)、TMPRSS4和人呼吸道胰岛素样蛋白酶(HAT)。(参见例如，Bahgat等,(2011)Virol.J.8:27，以及其中引用的参考文献)。这些蛋白酶在人呼吸道上皮细胞中表达。(参见Bertram等,(2010)Rev.Med.Virol.20:298-310)。已经报道，使用在空间上阻断TMPRSS2cRNA的单链DNA样反义试剂(PPMO)在体外处理人呼吸道上皮细胞系(Calu-3)造成了H1N1病毒滴度的降低。(参见Bottcher-Friebertshauser等人,(2011)J.Virol.85:1554-1562)。然而，并没有直接显示动物模型中TTSP作用减弱(例如TMPRSS2敲除)的保护性作用。此外，并没有显示流感病毒感染的治疗和/或预防中靶向TTSP的蛋白水解活性的治疗剂(例如，抗TMPRSS2抗体)的用途。因此，在本领域存在针对流感的新的、高效的治疗方法的需求，所述方法利用了感染过程中宿主细胞蛋白酶的作用。
发明概要
本发明通过提供用于治疗或预防流感病毒感染的方法处理了本领域的前述需求。本发明方法包括给需要其的受试者施用包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物。在某些实施方案中，TTSP是TMPRSS2的抑制剂。可以在本发明的背景中使用的示例性TMPRSS2抑制剂包括例如，小分子蛋白酶抑制剂、肽抑制剂、基于核酸的抑制剂，以及特异地结合TMPRSS2的抗体或抗体的抗原结合片段。
根据本发明的某些方面，将TMPRSS2抑制剂施用给需要其的受试者，其中TMPRSS2抑制剂特异性针对TMPRSS2和/或仅将TTSP抑制剂施用给受试者。例如，在某些实施方案中，将抗TMPRSS2抗体施用给受试者，其中抗TMPRSS2抗体仅抑制TMPRSS2的活性，并且不将其他TTSP抑制剂(例如，TMPRSS4抑制剂、HAT抑制剂等)施用给受试者。
本发明还包括这样的实施方案，其中将第二治疗剂与TTSP抑制剂组合施用给受试者。例如，本发明包括这样的方法，其中将抗TMPRSS2抗体与一种或多种抗病毒剂组合和/或与抗流感抗体组合施用给受试者。
在阅读随后的详细说明后，本发明的其他实施方案是显而易见的。
附图简述
图1-4描述了4个不同试验(分别为试验1-4)的结果，其中用750PFU的H1N1流感病毒攻击野生型小鼠(“WT”，闭合的正方形)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”闭合的圆形)，并在感染后的几个时间点评估了体重改变百分数(A图)和存活百分数(B图)。
图5显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，在野生型小鼠(“WT”，空白条形)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”，阴影条形)中观察到的体重改变百分数(A图)和肺病毒负荷(B图)。
图6显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，用野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)观察到的体重改变百分数，以及用相应的未感染WT和未感染KO小鼠观察到的体重改变百分数。每一标记表示第5天各个小鼠的体重改变百分数。
图7显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中CD45+CD19+(图A)和CD45+CD3+(图B)细胞的频率，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中CD45+CD19+和CD45+CD3+细胞的频率。每一标记表示第5天来自各个小鼠的指定细胞类型的频率。
图8显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中CD45+CD4+(图A)和CD45+CD8+(图B)细胞的频率，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中CD45+CD4+和CD45+CD8+细胞的频率。每一标记表示第5天来自各个小鼠的指定细胞类型的频率。
图9显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中树突细胞(DC)的频率，以及在相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中观察到的DC频率。每一标记表示第5天在来自各个小鼠的肺组织中的DC频率。
图10显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中嗜中性粒细胞(图A)、肺泡巨噬细胞(图B)和嗜酸性粒细胞(图C)的频率，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中嗜中性粒细胞、肺泡巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的频率。每一标记表示第5天来自各个小鼠的指定细胞类型的频率。
图11显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中肺泡巨噬细胞(图A)和流感感染的肺泡巨噬细胞(图B)的频率，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中肺泡巨噬细胞和流感感染的肺泡巨噬细胞的频率。每一标记表示第5天来自各个小鼠的指定细胞类型的频率。
图12显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中嗜中性粒细胞(图A)和流感感染的嗜中性粒细胞(图B)的频率，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中嗜中性粒细胞和流感感染的嗜中性粒细胞的频率。每一标记表示第5天来自各个小鼠的指定细胞类型的频率。
图13显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中上皮细胞(图A)和流感感染的上皮细胞(图B)的频率，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中上皮细胞和流感感染的上皮细胞的频率。每一标记表示第5天来自各个小鼠的指定细胞类型的频率。
图14显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的肺中的累积病变得分，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的肺中的累积病变得分。每一标记表示第5天来自各个小鼠的肺中的累积病变得分。累积病变得分是5个参数的0至4的数值排序(0＝无，1＝极小的，2＝轻微的，3＝中度的，4＝显著的)，5个参数为：(1)炎症(支气管的和细支气管的)＝出现炎性细胞(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞)；上皮层丧失(坏死)以及管腔内细胞碎片累积；(2)炎症(肺泡的)＝肺泡层(alveolar lining)丧失、II型肺细胞增生、嗜中性粒细胞和组织炎性细胞、纤维蛋白、出血和/或细胞碎片沉积；(3)浸润(血管周围的)＝混合的细胞浸润(淋巴细胞和嗜中性粒细胞)，伴有内皮反应、多处炎性细胞着边和偶尔极少的细胞碎片；(4)Exema/渗出物＝血管周围和肺泡内，伴有纤维蛋白沉积和/或混合的细胞浸润；和(5)IHC＝在支气管上皮、肺泡被覆上皮和/或肺泡巨噬细胞中观察的。
图15显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的血清中多种趋化性细胞因子(KC/GRO–图A；MIP-1α–图B和MCP-1/CCL-2–图C)的水平，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的血清中细胞因子的水平。每一标记表示第5天来自各个小鼠的血清中的细胞因子水平(pg/mL)。
图16显示用H1N1流感病毒攻击后第5天，野生型小鼠(“WT”)和TMPRSS2敲除小鼠(“KO”)的血清中干扰素γ(IFNγ)的水平，以及相应的未感染WT和未感染KO小鼠的血清中干扰素γ的水平。每一标记表示第5天来自各个小鼠的血清中的干扰素γ水平(pg/mL)。
发明详述
在描述本发明之前，应当理解本发明并不限于所述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件是可以改变的。还应当理解，本文中所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另外指明，本文中所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义一样的含义。如本文中所用，术语“约”当用于指代具体列举的数值时，意为该值可以具有与所列举值的1％以下的不同。例如，如本文中所用，表述“约100”包括99和101，以及之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管可以将与本文中所述的那些方法和材料类似的或者等同的任意方法和物质用于本发明的实践，但当前描述了优选的方法和材料。
用于治疗或预防流感病毒感染的方法
本发明提供了用于治疗或预防流感病毒感染的方法。如本文中所用，表述“治疗流感病毒感染”意为改善、降低或缓解哺乳动物中流感病毒感染的至少一种症状或生物学结果，和/或在暴露于流感病毒后降低或减少哺乳动物中流感病毒的滴度、载量、复制或增殖。表述“治疗流感病毒感染”还包括缩短流感病毒感染后受试者显示出流感病毒感染的至少一种症状或生物学结果的时间期限。根据本发明，用于治疗流感病毒感染的方法包括在受试者感染流感病毒感染后和/或在受试者显示出或者诊断为具有流感病毒感染的一种或多种症状或生物学结果后，将本发明药物组合物施用给受试者。
如本文中所用，表述“预防流感病毒感染”意为在哺乳动物中预防流感病毒感染的至少一种症状或生物学结果，和/或抑制或减弱流感病毒能在动物身体的细胞内/之间进入、扩散和/或繁殖的程度。表述“预防流感病毒感染”还包括降低受试者对流感病毒感染的至少一种症状或生物学后果的易感性。用于预防流感病毒感染(即，预防)的方法包括在受试者感染流感病毒之前和/或受试者显示出流感病毒感染的一种或多种症状或生物学结果之前，将本发明的药物组合物施用给受试者。用于预防流感病毒感染的方法还可以包括在特定的时期或季节(例如，在通常发现的经历流感病毒感染的个体数达到峰值之前1-2个月期间)或者在受试者进入或者暴露于流感病毒感染高发的环境之前，和/或在受试者暴露于感染流感病毒的其他受试者之前，将本发明药物组合物施用给受试者。
如本文中所用，表述“流感病毒感染的症状或生物学结果”包括以下的一种或多种：鼻充血、鼻窦充血、流鼻涕、打喷嚏、身体(肌肉)疼痛、头疼、寒冷、发烧、咳嗽、咽喉痛、疲乏、耳痛或者流感病毒感染的诊断指标。流感病毒感染的诊断指标包括，例如通过病毒培养检测流感、血凝素凝集抑制(HAI)测定、免疫荧光或者使用合适样本(例如，鼻拭子、鼻咽拭子、咽喉拭子、气管内吸出物、痰、支气管冲洗液等)进行的基于核酸的检测(例如RT-PCR)。因此，认为通过诊断测定测试出的流感病毒感染阳性受试者是显示出“流感病毒感染症状或生物学结果”的受试者。
本文中所述的实验显示，动物并不表达有功能的II型跨膜丝氨酸蛋白酶(例如，TMPRSS2)，所述II型跨膜丝氨酸蛋白酶在流感病毒攻击后的肺中的某些流感感染的细胞类型中并不表现出显著的增加。特别地，用流感病毒攻击的TMPRSS2敲除小鼠的肺中并不显示出流感阳性肺泡巨噬细胞、嗜中性粒细胞或上皮细胞的增加，而这些流感感染细胞类型频率在流感病毒攻击后的野生型小鼠的肺中显著增加。TMPRSS2敲除小鼠在流感病毒攻击后还显示出完全存活以及体重增加/维持特征。因此，本发明还提供了这样的方法，其用于预防或减少已经暴露于流感病毒或者受流感病毒攻击的受试者的肺中流感感染的肺泡巨噬细胞、流感感染的嗜中性粒细胞和/或流感感染的上皮细胞的积累，其中该方法包括给受试者施用包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物。
患者群体
可将本发明方法用于任意受试者中来治疗或预防流感病毒感染，其中所述受试者将受益于该治疗或预防。受试者可以是人类或非人动物(例如，马、犬、牛、猫科动物、绵羊、猪、禽鸟等)。关于治疗方法，待治疗的受试者包括显示出至少一种流感病毒感染的症状或生物学结果(已在本文中定义了该短语)的任意个体。关于预防方法，受试者可以是处于暴露于流感病毒的风险或者可能与感染流感病毒的另一个体接触的任意个体。
在“治疗”或者“预防”的情况下，本发明方法可以特别地用于患者群体中来治疗或者预防流感病毒感染，所述患者群体选自老年受试者、癌症患者(例如，进行化疗、放射或其他抗癌症治疗方案的个体)和无免疫能力的或者免疫受损的个体。例如，不能充分地应答流感疫苗接种或者其他抗病毒治疗或者不耐受常规治疗的受试者(例如，具有蛋类过敏不能进行流感疫苗接种的个体)是可以在治疗上或预防上受益于本发明方法的受试者。
TTSP抑制剂
本发明方法包括将包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物施用给受试者。示例性TTSP包括跨膜蛋白酶丝氨酸S1成员2(TMPRSS2)、跨膜蛋白酶丝氨酸S1成员4(TMPRSS4)和人呼吸道胰岛素样蛋白酶(HAT)。TTSP抑制剂可以是小分子蛋白酶抑制剂、基于核酸的抑制剂(例如，siRNA、核酶、反义构建体等)、抗原结合蛋白质(例如，抗体或其抗原结合片段)或者阻断肽/肽抑制剂。TTSP抑制剂可以通过抑制或降低TTSP将血凝素前体蛋白(HA0)蛋白水解切割成HA1和HA2亚基的能力来发挥作用。
在某些示例性实施方案中，TTSP抑制剂是TMPRSS2抑制剂例如特异地结合TMPRSS2并抑制TMPRSS2的蛋白水解活性的抗体或其抗原结合片段。例如，抗体或其抗原结合片段可以抑制或降低TMPRSS2蛋白水解切割血凝素前体蛋白(HA0)成HA1和HA2亚基的能力。当与TTSP混合时，相对于在相同或基本上相同的实验条件下测试的非抑制性对照分子，如果抗体使TTSP的蛋白水解活性降低至少25％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，那么认为抗体抑制TTSP(例如TMPRSS2)的蛋白酶活性。
在本发明的某些实施方案中，TTSP抑制剂是抗TMPRSS2抗体或其抗原结合片段，其抑制TMPRSS2的蛋白酶活性，但基本上不抑制任何其他TTSP的蛋白酶活性。对于本发明公开的目的，如果抗TMPRSS2抗体与TMPRSS4或HAT混合，相对于在相同或基本上相同的实验条件下测试的非抑制性对照分子，所述抗体对TMPRSS4或HAT的蛋白水解活性没有影响，或者导致TMPRSS4或HAT的蛋白水解活性不超过25％(例如，20％、15％、10％、5％或更低)的下降，那么所述抗体“基本上不抑制任何其他TTSP的蛋白酶活性”。
在其中TTSP抑制剂是TMPRSS2抑制剂的某些实施方案中，TMPRSS2抑制剂是施用给受试者的唯一TTSP抑制剂。因此，在本发明此类实施方案的情况下，特别地排除了抗TMPRSS2抑制剂之外的任何其他TTSP抑制剂(例如，TMPRSS4抑制剂或HAT抑制剂)的施用。
抗体和抗体的抗原结合片段
如上所示，用于本发明方法中的TTSP抑制剂(例如，TMPRSS2抑制剂)可以是抗体或其抗原结合片段(例如，特异地结合TMPRSS2的抗体或其抗原结合片段)。如本文中所用，术语“抗体”意为包含至少一个互补决定区(CDR)的任一抗原结合分子或分子复合体，所述互补决定区与特定抗原(例如TMPRSS2)特异地结合或者相互作用。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链、通过二硫键互相连接的两个重链(H)和两个轻链(L)，及其多聚体(例如IgM)。每一重链包含重链可变区(在本文中简称为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(在本文中简称为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步划分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其与更保守的区域(称为构架区(FR))交替。每一VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施方案中，抗TMPRSS2抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可以基于两个或两个以上CDR的并行分析来定义氨基酸共有序列。
如本文中所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异地结合抗原形成复合体的任一天然存在的、酶促获得的、合成的或者基因工程多肽或糖蛋白。使用任意合适的标准技术如蛋白水解消化或涉及操作和表达编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA的重组基因工程技术，抗体的抗原结合片段可以来源于例如完整抗体分子。该DNA是已知的和/或从例如商业来源、DNA文库(包括例如，噬菌体抗体库)容易得到的，或者可以是合成的。可以对DNA测序并使用化学方法或者通过使用例如分子生物学技术操作DNA，以使一个或多个可变域和/或恒定域排列成合适的构型，或者引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单位或者受限的FR3-CDR3-FR4肽。其他基因工程分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、缺失结构域的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、小型抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也包含于如本文中所用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变域。可变域可以是任意大小或任意的氨基酸组成，并且通常包含至少一个CDR，其与一个或多个构架序列邻近或者与一个或多个构架序列处在一个框架中。在具有VH结构域及VL结构域的抗原结合片段中，相对于彼此，VH和VL结构域可以位于任意合适的排列中。例如，可变区可以是二聚的，并含有VH-VH,VH-VL或VL-VL二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以在本发明抗体的抗原结合片段中发现的可变域和恒定域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任意构型，包括上述任意示例性构型中，可变域和恒定域可以是相互直接连接或者可以是通过完整的或部分的铰链区或连接体区连接。铰链区由至少两个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变域和/或恒定域之间的弹性或半弹性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含上述任意可变域和恒定域构型的同型二聚体或异型二聚体(或者其他多聚体)，其通过上述任意可变域和恒定域构型彼此非共价结合和/或与一个或多个单体VH和VL结构域非共价结合(例如，通过二硫键)形成。
如同完整抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变域，其中每一可变域能特异地结合单独的抗原或者同一抗原上的不同表位。使用本领域可得到的常规技术，可将任意多特异性抗体形式，包括本文中所公开的示例性双特异性抗体形式适用于本发明抗体的抗原结合片段的背景中。
如本文中所用，术语“人抗体”意在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以例如在CDR且特别地CDR3中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体细胞突变引入突变)。然而，如本文中所用的术语“人抗体”并不意图包含这样的抗体，其中已经将来源于另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列移植在人构架序列上。
如本文中所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的全部人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(进一步描述于下文)、分离自重组的、组合的人抗体文库的抗体(进一步描述于下文)、分离自针对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)的抗体(参见例如，Taylor等,Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))或者通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，将此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此该重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然来源于并且与人种系VH和VL序列相关，但并非天然存在于体内的人抗体种系库中。
人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键结合。在第二种形式中，二聚体并不通过链间二硫键连接，而是形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成。这些形式非常难分离，甚至是在亲和纯化后也难分离。
在多种完整IgG同种型中第二种形式出现的频率归因于但不局限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现(Angal等(1993)Molecular Immunology30:105)显著地降低至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。本发明包括在铰链区，期望地在CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，以例如在生产中改善期望的抗体形式的产率。
如本文中所用，“分离的抗体”意为从其天然环境的至少一个组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，从抗体天然存在或者天然产生的器官或组织或者细胞的至少一个组分中分离或回收的抗体是用于本发明目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经进行了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上是没有细胞物质和/或化学物质的抗体。
药物组合物和施用方法
本发明包括将TTSP抑制剂(例如抗TMPRSS2抗体)施用于受试者的方法，其中TTSP抑制剂包含于药物组合物中。本发明药物组合物与合适的载体、赋形剂以及提供合适的转移、递送、耐受等的其他试剂一起配制。许多合适的制剂可见于全部药剂师的已知的处方集：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括，例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油剂、脂质、含小囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水的吸附性糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)JPharm Sci Technol 52:238-311。
已知多种递送系统，并可以将其用于施用本发明药物组合物，例如脂质体中的包囊、微粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如，Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。施用的方法包括但不限于，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可以通过任何方便的途径，例如通过输注或弹丸注射、通过上皮层或皮肤粘膜层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用组合物，并且可以与其他生物学活性试剂一起施用。
使用标准的针头和注射器，可以皮下或静脉内递送本发明药物组合物。此外，关于皮下递送，已经将笔式递送装置(pen delivery device)应用于递送本发明药物组合物。该笔式递送装置是可重复使用或者一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常使用含药物组合物的可替换药筒。一旦施用了药筒内的全部药物组合物并且药筒已空，那么可以立即丢弃空药筒，并用含药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用笔式递送装置。在一次性的笔式递送装置中，没有可替换的药筒。相反，在一次性的笔式递送装置中，已经用药物组合物预装满了装置内的储存器。一旦储存器中没有了药物组合物，那么可以丢弃整个装置。
在某些情况下，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物质；参见，MedicalApplications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRCPres.,Boca Raton,Florida。又在另一个实施方案中，可将控释系统放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论了其他控释系统。
可注射的制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、点滴注射等的剂量形式。可以通过已知的方法制备这些可注射的制剂。例如，可以例如通过在常规地用于注射的无菌的水介质或者油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐，来制备可注射的制剂。对于用于注射的水介质，可以是例如生理盐水、含葡萄糖和其他辅助剂(auxiliary agent)的等渗溶液等，可以将其与合适的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等组合使用。对于油性介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，可以将其与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。因此，将制备的注射剂优选地装入合适的安瓿瓶中。
有利地，将上述经口或肠胃外使用的药物组合物制备成单位剂量的剂量形式，所述单位剂量与一次剂量的活性成分相匹配。此类单位剂量的剂量形式包括例如，药片、药丸、胶囊、注射剂(针剂)、栓剂等。
剂量
根据本发明方法，施用给受试者的TTSP抑制剂(例如，抗TMPRSS2抗体)的量通常是治疗有效量。如本文中所用，短语“治疗有效量”意为TTSP抑制剂的剂量，其导致流感病毒感染的一个或多个症状或生物学结果可检测的改善，这正如该表述在本文中定义的那样。本领域普通技术人员应当理解，可以将多种动物模型用于证实特定量的候选TTSP抑制剂是否是治疗有效量。TTSP抑制剂的“治疗有效量”还包括这样的TTSP抑制剂(例如，抗TMPRSS2抗体)的量，相对于在相同的或基本上相同的实验条件下测试的非抑制性对照分子，所述量能使TTSP的蛋白水解活性(例如，将HA0切割成HA1和HA2亚基的能力)降低至少25％。
在抗TMPRSS2抗体的情况下，治疗有效量可以是以下量的抗TMPRSS2抗体：约0.05mg至约600mg，例如，约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg或约600mg。
各个剂量中含有的抗TMPRSS2抗体的量可以以每千克患者体重的抗体的毫克数(即mg/kg)的形式表示。例如，可以以每千克患者体重0.0001至约10mg的剂量，将抗TMPRSS2抗体施用给患者。
组合治疗
根据某些实施方案，本发明方法可以包括将包含TTSP抑制剂(例如，抗TMPRSS2抗体)的药物组合物与第二治疗剂组合施用给受试者。术语“与第二治疗剂组合”意为在将包含TTSP抑制剂的药物组合物施用于受试者之前(例如，之前约1至72小时)、之后(例如，之后约1至72小时)或同时(例如，约1小时内)，将第二治疗剂施用于受试者。
第二治疗剂本身可以是用于治疗或预防流感病毒感染的任意治疗剂。可以与包含TTSP抑制剂的药物组合物组合施用的第二治疗剂的非限制性实例包括，例如金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、扎那米韦、抑肽酶、亮肽素、阳离子类固醇抗菌剂(参见例如，US 2007/0191322)、流感疫苗(例如，灭活的、活的、减毒的全病毒或亚单位疫苗)或者针对流感病毒的抗体(例如，抗血凝素抗体)。
施用方案
根据本发明的某些实施方案，可以在确定的时程中将多个剂量的包含TTSP抑制剂(例如，抗TMPRSS2抗体)的药物组合物施用于受试者。根据本发明该方面的方法包括对受试者顺次施用多个剂量的TTSP抑制剂。如本文中所用，“顺次施用”意为在不同的时间点，例如在由预定间隔(例如，小时、天、周或月)分开的不同日期，将每一剂量的TTSP抑制剂施用给受试者。本发明包括这样的方法，其包括给患者顺次施用单一初始剂量的TTSP抑制剂，然后施用一个或多个第二剂量的TTSP抑制剂，任选地然后施用一个或多个第三剂量的TTSP抑制剂。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用TTSP抑制剂的暂时顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是初始剂量后施用的剂量；而“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量可以含有相同量的TTSP抑制剂，但通常在施用的频率方面相互区别。然而，在某些实施方案中，在治疗期间，在初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中含有的TTSP抑制剂的量可以相互不同(例如，根据需要上调或下调)。
在本发明的一个示例性实施方案中，在立即的在前剂量之后1至30(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多)天施用第二和/或第三剂量。如本文中所用，术语“立即的在前剂量”意为在多个施用的顺序中，施用于患者的TTSP抑制剂的剂量恰好在顺序中的下一计量的施用之前，并且没有间隔剂量。
根据本发明该方面的方法可以包括给患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的TTSP抑制剂。例如，在某些实施方案中，仅将单个第二剂量施用于患者。在其他实施方案中，将两个或两个以上(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量施用于患者。同样地，在某些实施方案中，仅将单个第三剂量施用于患者。在其他实施方案中，将两个或两个以上(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量施用于患者。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，可以以与其他第二剂量相同的频率施用每一个第二剂量。例如，可以在立即的在前剂量之后1至29天给患者施用每一个第二剂量。相似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，可以以与其他第三剂量相同的频率施用每一个第三剂量。例如，可以在立即的在前剂量之后1至60天给患者施用每一个第三剂量。备选地，可以根据治疗方案的进程来改变施用于患者的第二和/或第三剂量的频率。取决于临床检查后各个患者的需求，在疗程中医师或医疗服务人员还可以调整施用的频率。
如本文中其他地方所定义，前述实施方案中的任一个可以包括将一种或多种其他治疗剂与TTSP抑制剂组合施用。
实施例
提出了以下实施例，从而为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明组合物，使用本发明方法的完整公开和描述，并且所述实施例并不旨在限制发明人认为的本发明的范围。已经进行了努力，以确保所使用的数值(例如，量、温度等)的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或者接近大气压。
实施例1.A型流感病毒感染后，与野生型小鼠比较，TMPRSS2敲除小鼠显示出改善的存活和重量维持
使用经改造的不能表达有功能的TMPRSS2蛋白的敲除小鼠(“TMPRSS2-KO”)进行最初的实验。将野生型littermate小鼠(“WT”)用作为对照。实施了4次单独的试验(试验1-试验4)，其中用10x MLD50(750PFU)的A/Puerto Rico/8/1934H1N1病毒鼻内感染TMPRSS2-KO小鼠和WT对照。感染后每天大致地称重小鼠，并监测存活。当动物丧失25％或更多在感染时(例如，第0天)测定的最初体重时，进行感染小鼠的安乐死。还监测小鼠其他的明显的发病体征，包括身体蜷缩(hunchedposture)、竖毛和/或神经学症状如后肢瘫痪。图1-4分别显示了试验1-4的结果。表1总结了各个试验的存活数据。
表1.流感感染试验的总结
如图1-4中所示，感染后，大多数受感染的TMPRSS2-KO小鼠在至少21天中显示出正常的体重增加/维持。相反，早在感染后第3天，大多数感染的WT小鼠显示出剧烈的和快速的体重减轻，这是小鼠对实验性流感感染的指示性应答
此外，与WT小鼠的20-50％存活比较，在整个实验期间，在全部四组试验中，TMPRSS2-KO小鼠显示出100％的存活。
该实施例表明，在有功能的TMPRSS2不存在的情况下，动物中流感感染的症状和结果是剧烈减弱的。因此，该实施例中显示的结果提示，在人类和非人动物受试者中，抑制TMPRSS2活性是用于治疗和/或预防流感病毒感染的有效治疗策略。
实施例2.A型流感病毒感染后，与野生型小鼠比较，TMPRSS2敲除小鼠显示出降低的肺中病毒负荷
在第二组实验中，用750PFU的A/Puerto Rico/8/1934H1N1病毒鼻内感染10只TMPRSS2-KO小鼠和10只WT对照。在感染后第5天测定感染小鼠的体重改变的百分比和病毒负荷(表示为肺中的PFU)。结果显示于图5A(体重改变百分数)和5B(病毒负荷)中。
该组实验再次显示，流感感染后，TMPRSS2-KO小鼠显示出整体的体重增加(增加～3％)，在感染后，野生型小鼠显示出显著的体重减轻(减轻～12％)(图5A)。此外，流感病毒感染后TMPRSS2-KO小鼠的肺中病毒负荷比在感染的野生型小鼠中观察到的病毒负荷显著更低(低～10,000倍)(图5B)。该实施例的结果还提供了在感染流感病毒的动物中拮抗或抑制TMPRSS2的潜在治疗益处的其他证明。
实施例3.A型流感病毒感染后，TMPRSS2敲除小鼠的全肺组织分析和血清分析
在第三组实验中，用750PFU的A/Puerto Rico/8/1934H1N1病毒鼻内感染5只TMPRSS2-KO小鼠和5只WT对照。分析中还包括了5只未感染的野生型和5只未感染的TMPRSS2-KO小鼠。分析了小鼠的(1)体重改变，(2)借助于流式细胞术分析了细胞改变，(3)整个肺的免疫组织化学、PAS和H&E染色，以及(4)血清中的细胞因子水平。
图6中描述了感染后第5天在小鼠中观察到的体重改变百分数。用A型流感病毒感染的(“KO感染的”)TMPRSS2-KO小鼠在起始重量基础上显示出2.2-3.4％的增加，这仅稍低于在未感染的TMPRSS2-KO小鼠(增加5.9-6.4％)和未感染的WT小鼠(增加4.0-4.8％)中观察到的重量增加。另一方面，在感染后第5天，感染的WT小鼠显示出显著的体重减轻(减轻11.0-11.4％)。
对于肺分析，按照以下方法：首先，从每一只小鼠中获取整个肺。将左肺分离并固定在多聚甲醛中，并且进行用于细胞损伤/浸润的PAS/H&E染色。将免疫组织化学染色用于鉴定感染的细胞。将右肺分离并用于产生单细胞悬浮液(使用LiberaseTMenzyme[Roche Applied Science,Indianapolis,IN],DNAse和机械力)；裂解RBC，计数细胞并染色，以用于流式细胞分析。通过该方法分析的细胞类型为嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞和感染的细胞。
肺组织和细胞分析的结果总结如下：
(1)在不同的样品之间没有观察到B细胞或T细胞的显著差异(图7A-7B和图8A-8B)；
(2)与未感染的TMPRSS2-KO细胞比较，在感染的TMPRSS2-KO小鼠中观察到了树突细胞频率的显著增加；然而，该增加没有与相比于未感染的WT小鼠，感染的WT小鼠中观察到的增加那样显著(图9)；
(3)与未感染的TMPRSS2-KO小鼠比较，在感染的TMPRSS2-KO小鼠中嗜中性粒细胞浸润或肺泡巨噬细胞水平是显著增加的，然而，与未感染的WT小鼠比较，感染的WT小鼠显示出显著更高水平的嗜中性粒细胞和显著更低水平的肺泡巨噬细胞(图10A和10B)；感染的KO小鼠的肺中嗜酸性粒细胞水平倾向于比未感染的KO小鼠的肺中更高，该增加并没有统计学显著性(图10C)；
(4)与未感染的TMPRSS2-KO小鼠比较，在感染的TMPRSS2-KO小鼠中没有观察到流感感染的肺泡巨噬细胞(图11B)或流感感染的嗜中性粒细胞(图12B)比例的显著增加；相反，与未感染的WT小鼠比较，感染的WT小鼠中流感感染的肺泡巨噬细胞和流感感染的嗜中性粒细胞的频率显著更高。
(5)与未感染的TMPRSS2-KO小鼠比较，TMPRSS2-KO小鼠没有显示出上皮细胞水平的减少，并且也不存在流感阳性上皮细胞比例的显著改变；相反，与未感染的WT小鼠比较，感染的WT小鼠的肺中流感感染的上皮细胞的频率显著更高(图13A-13B)。
(6)与未感染小鼠比较，感染野生型小鼠显示出显著增加的累积病变得分(归因于炎症、细胞浸润、水肿和皮层丧失(lining loss))；另一方面，感染的KO小鼠的肺中的积累病变得分倾向于仅适度地高于未感染的KO小鼠的肺中的积累病变得分，但这种差异并不是统计学显著的(图14)；
(7)就早期细胞因子水平而言，在不同样品之间没有观察到显著的差异；
(8)关于涉及发烧和嗜中性粒细胞以及巨噬细胞迁移的细胞因子(例如，KC/GRO、MIP-1α和MCP-1/CCL-2)，在测试的任意实验组中没有观察到KC或MIP-1α水平的改变；然而，在感染的WT小鼠中观察到了MCP-1的显著增加；然而，与未感染的KO小鼠比较，在感染的KO小鼠中没有观察到MCP-1水平的统计学显著增加(图15)；和
(9)与来自测试的其他组，包括感染的TMPRSS2-KO小鼠的样品比较，在来自感染的WT小鼠的样品中观察到了显著更高水平的IFNγ(图16)。
总之，来自该组实验的结果证实，TMPRSS2-KO基本上抵抗了流感病毒感染的影响和结果。
实施例4.抗TMPRSS抗体抑制体外流感病毒感染
使用已知的方法获得了完整的人抗TMPRSS2抗体。测试了抗体结合细胞表面表达的TMPRSS2的能力。还测试了抗体结合TMPRSS2的可溶性形式的能力。还使用标准的测定形式测试了抗体抑制TMPRSS2的蛋白水解活性的能力。例如，测试了抗TMPRSS2抗体抑制TMPRSS2介导的血凝素蛋白的切割的能力。然后使用表达TMPRSS2(但不表达人呼吸道胰岛素样蛋白酶[HAT])的人支气管上皮细胞(Calu-3)，在体外流感抑制测定中测试了抗TMPRSS2抗体与TMPRSS2结合的高亲和力以及有效抑制TMPRSS2的蛋白水解活性的能力。期望干扰TMPRSS2的催化功能的抗体可以在该测定中抑制病毒增殖。
实施例5.在动物模型中通过抗TMPRSS抗体预防和治疗流感病毒感染
使用合适的动物模型，测试了抗TMPRSS2抗体预防流感病毒感染的影响的能力。在实验性流感病毒感染之前，将阻断TMPRSS2的蛋白水解活性的抗体施用于动物。在感染之前，用同种型匹配的对照抗体处理对照动物。与用抗体处理的对照比较，期望用抗TMPRSS2封闭型抗体处理的动物显示出较少的和/或较不严重的流感病毒感染症状和/或改善的成活力。
还测试了抗TMPRSS2抗体治疗已经感染流感病毒的动物的能力。在实验性流感病毒感染之后，将阻断TMPRSS2的蛋白水解活性的抗体施用于动物。感染后，用同种型匹配的对照抗体处理对照抗体。与用对照抗体处理的动物比较，期望用抗TMPRSS2封闭型抗体处理的动物显示出较少的和/或较不严重的流感病毒感染症状和/或改善的成活力。
本发明范围并不受本文中所述特定实施方案的限制。事实上，对于本领域技术人员而言，除本文中所述的那些改变之外，本发明的多种改变从前述说明和附图是显而易见的。此类改变意在落入所附权利要求的范围。

Claims (18)

1.用于治疗或预防流感病毒感染的方法，所述方法包括将包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物施用于需要其的受试者。
2.用于预防或减少受试者的肺中流感感染的肺泡巨噬细胞、流感感染的嗜中性粒细胞和/或流感感染的上皮细胞的积累的方法，所述受试者已经暴露于流感病毒或受流感病毒攻击，所述方法包括将包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物施用于受试者。
3.包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物，用于在受试者中治疗或预防流感病毒感染。
4.包含II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)抑制剂的药物组合物，用于预防或减少受试者的肺中流感的肺泡巨噬细胞、流感感染的嗜中性粒细胞和/或流感感染的上皮细胞的积累，所述受试者已经暴露于流感病毒或受流感病毒攻击。
5.权利要求3或4的药物组合物，其中所述TTSP抑制剂是跨膜蛋白酶丝氨酸S1成员2(TMPRSS2)抑制剂。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述TMPRSS2抑制剂选自小分子蛋白酶抑制剂、肽抑制剂和基于核酸的抑制剂。
7.权利要求5的药物组合物，其中所述TMPRSS2抑制剂抑制TMPRSS2的蛋白酶活性，但基本上不抑制任何其他TTSP的蛋白酶活性。
8.权利要求3或4的药物组合物，其中所述TTSP抑制剂是特异地结合TMPRSS2并抑制其蛋白水解活性的抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制TMPRSS2的蛋白酶活性，但基本上不抑制任何其他TTSP的蛋白酶活性。
10.权利要求3至9中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于全身施用。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于皮下施用。
12.权利要求10的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于静脉内施用。
13.权利要求3至12中任一项的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述第二治疗剂是抗病毒剂。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述抗病毒剂选自金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦和扎那米韦。
16.权利要求13的药物组合物，其中所述第二治疗剂是流感病毒疫苗。
17.权利要求13的药物组合物，其中所述第二治疗剂是抗流感抗体。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述抗流感抗体是特异地结合血凝素(HA)的抗体。
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