CN104203274B

CN104203274B - 轮状病毒亚单位疫苗及其制备和使用的方法

Info

Publication number: CN104203274B
Application number: CN201380015512.9A
Authority: CN
Inventors: R·F·柏; R·R·西蒙逊; K·R·斯里吉雷迪; B·M·豪瑟
Original assignee: Cimmeria Limited-Liability Co
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2017-09-08
Anticipated expiration: 2033-02-14
Also published as: US9446117B2; AU2013221479A1; JP6149240B2; EP2814508B1; DK2814508T3; PL2814508T3; WO2013123219A1; AR126891A2; HUE033858T2; BR112014020025A8; MX353786B; CA2864106A1; EA201400914A1; US20130209507A1; PT2814508T; PH12014501795B1; LT2814508T; KR20140123592A; DK2814508T5; CN104203274A

Abstract

本发明提供了在动物或人中引发抗轮状病毒的免疫反应的轮状病毒抗原性多肽或抗原、包含所述轮状病毒多肽的组合物、接种以抗轮状病毒的方法，以及用于这样的方法和组合物的试剂盒。本发明还提供了用于产生疫苗抗原性多肽的新型表达载体。

Description

轮状病毒亚单位疫苗及其制备和使用的方法

发明领域

本申请要求2012年2月14日提交的美国临时专利申请系列No.USSN 61/598,624的优先权，将所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明总地来说涉及亚单位疫苗，具体地包含已被工程化以在遗传和抗原性上与由感染目标动物群体的病毒表达的肽几乎相同的轮状病毒肽的那些疫苗。通过毒素/解毒剂选择系统在细菌细胞群体中维持表达抗原性肽或亚单位蛋白的质粒。细菌细胞产生毒性蛋白，该毒性蛋白被由质粒编码的具有肽的解毒蛋白中和，从而使得非转化细胞不能存活。

背景

轮状病毒是婴儿和幼儿中严重腹泻的最常见原因(Dennehy PH,2000)，并且是引起通常称为肠胃感冒(stomach flu)(尽管与流感无关)的的感染的几种病毒之一。其属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)的双链RNA病毒属。该病毒有五个种，称为A、B、C、D和E(ICTV病毒分类学：2009发布)。表1提供了已知轮状病毒蛋白的概述。轮状病毒A(最常见的)引起超过90％的人的感染。该病毒通过粪口途径传播，感染和破坏沿着小肠排列的细胞，引起胃肠炎。除了其对人死亡的影响外，轮状病毒还感染动物，为家畜的病原体(Dubovi EJ,2010)。

例如，根据最近的研究，轮状病毒主要(65％)发现于来自具有腹泻的猪的粪便或肠内容物中。大部分动物被单个组(A,B,C)感染，超过一个轮状病毒组的合并感染确实也有发生(Yoon,KJ,Epidemiology of rotaviruses,ISUVDL submissions,2010-2011,IowaState)。将近1/3的动物被至少组C轮状病毒感染。直至现在，猪的轮状病毒的预防牵涉相当神秘的实践，例如给健康猪喂饲感染的仔猪组织。该实践是必需的，因为组C轮状病毒不能体外生长，从而妨碍了常规灭活/减毒的全病毒疫苗的产生。因此，存在对更安全、更有效的预防性措施的明确、紧迫的需要。

表1.轮状病毒蛋白概述

可选择的方法可以是产生包含免疫原性轮状病毒亚单位蛋白或抗原的疫苗。在提交本申请时，本发明人了解到无描述产生轮状病毒亚单位疫苗(自体的或别的方式的)来免疫猪以抗轮状病毒(特别地组C种类)的方法的参考资料。下列专利和申请概述了相关轮状病毒现有技术，强调了基于亚单位的疫苗。

US7790178(属于Intervet)描述了包含灭活的犬轮状病毒的三价疫苗。

US7311918和US6589529(属于Children’s Hospital Ohio)描述了包含VP6蛋白片段、旨在用于接种人的重组轮状病毒融合蛋白。小鼠数据表明该疫苗产生针对VP6融合蛋白的免疫反应。

US6867353(属于Exploregen)总体上描述了使用转化的番茄进行的编码人轮状病毒结构蛋白的cDNA片段的表达。

US6716431(属于Wyeth,现Pfizer)描述了仍然保持抗原性但显示减小的细胞毒性的NSP4可选择形式(即导致氨基酸变化的SNP)。

US6673355和US6210682(属于Baylor College of Medicine)涉及NSP4及其片段(NSP4114-135、NSP4120-147、NSP4112-174或NSP4112-150)用于轮状病毒疾病预防和/或治疗的用途。还描述了包含肠毒素佐剂的组合物。US5891676和US5827696(也属于Baylor)分别描述了轮状病毒VP2和VP7的杆状病毒表达。

US6187319(属于University of Mass.)总地来说描述了通过施用第二轮状病毒的分离的VP6多肽产生动物的抗第一轮状病毒的免疫反应的方法，所述第二轮状病毒感染与待接种的动物不同的物种。

US5298244(属于University of Saskatchewan)描述了具有VP4、VP6和VP7的装配的病毒颗粒。

US20110171316(属于US Health and Human Service)描述了重组人轮状病毒组C病毒样颗粒。

US20100047763(属于Goes等人)描述了编码用于诊断试剂盒的轮状病毒蛋白的质粒DNA。

US5186933(属于Baylor College of Medicine)公开了使用杆状病毒系统的轮状病毒基因(特别地VP3和VP7)的表达。

直至它们的现有公开内容，本发明人了解到不存在通过在大肠杆菌(E.coli.)中表达轮状病毒C型抗原制备的有效猪轮状病毒亚单位疫苗。此外，未曾公开用于产生用于猪的安全有效的疫苗的方法，从而本公开内容的目的是提供这样的疫苗。

参考资料

Dennehy PH(2000)。"Transmission of rotavirus and other entericpathogens in the home".Pediatr.Infect.Dis.J.19(10Suppl):S103–5.doi:10.1097/00006454-200010001-00003.PMID 11052397.

Bernstein DI(March 2009)。"Rotavirus overview".The PediatricInfectious Disease Journal 28(3Suppl):S50–3.

Grimwood K,Lambert SB(February 2009)。"Rotavirus vaccines:opportunities and challenges".Human Vaccines 5(2):57–69.PMID 18838873.

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Simpson E,Wittet S,Bonilla J,Gamazina K,Cooley L,Winkler JL(2007)。"Use of formative research in developing a knowledge translation approach torotavirus vaccine introduction in developing countries".BMC Public Health 7:281.

Edward J Dubovi；Nigel James MacLachlan(2010)。Fenner's VeterinaryVirology,Fourth Edition.Boston:Academic Press.p.288.ISBN 0-12-375158-6.

发明概述

本发明的目的是提供亚单位疫苗以及用于治疗和预防轮状病毒感染的方法。

本发明还涉及新型载体以及其用于产生可用于例如免疫的背景的异源蛋白或目标基因的用途。在具体实施方案中，所述异源蛋白为轮状病毒蛋白。在一些具体实施方案中，所述蛋白为选自NSP4、VP4或VP6的猪轮状病毒蛋白。在另一个实施方案中，轮状病毒蛋白为NSP4-VP4-VP6三重融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供新型载体，所述载体可以以工业规模使用，具有产生高表达产率的有利方面(在不使用任何抗生素的情况下事实如此)，从而可用于小或大规模体积(例如，1-10,000升的培养物)。

本发明从而提供了不存在任何抗生素抗性基因的自主复制载体，其包含：(a)功能性连接于第一启动子的编码ccdA蛋白的序列；和(b)功能性连接于第二启动子的异源序列。根据一个具体实施方案，第一启动子是组成型启动子。根据另一个实施方案，第二启动子为诱导型启动子，具体地第二启动子为T7启动子。在另一个实施方案中，启动子为T5启动子。

根据一个具体实施方案，异源序列编码疫苗抗原。

根据另一个方面，本发明涉及表达ccdB蛋白的原核生物细胞，其中包含上文中定义的载体。

根据一个具体方面，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。

根据另一个方面，本发明涉及用于产生异源蛋白的方法，其包括步骤：

(a)用表达ccdB蛋白并且包含上文中定义的载体的原核细胞接种适当的培养基；

(b)在抗生素不存在的情况下发酵罐培养所转化的细胞；和

(c)从上清液或从细胞沉淀回收在步骤(b)中产生的异源蛋白质。

根据一个具体实施方案，本发明涉及用于产生重组轮状病毒肽的方法。

根据另一个方面，本发明涉及用于产生上文中定义的自主复制载体的方法，所述方法包括步骤：

(b)在抗生素不存在的情况下发酵罐培养所转化的细胞；和

(c)回收在步骤(b)中产生的载体。

根据另一个方面，本发明涉及用于构建上文中定义的自主复制载体的方法，所述方法包括步骤：

(a)始于包含功能性抗生素抗性基因和ccdA基因的自主复制载体；

(b)进行反转PCR以扩增非抗生素抗性基因质粒序列；

(c)磷酸化PCR产物并将其连接以产生(a)中所述的载体的无抗生素抗性基因形式；

(d)转化表达ccdB蛋白的原核细胞；和

(e)回收包含所述自主复制载体的原核细胞。

根据另一个方面，从生产性动物包括猪的群体获取生物样品。从其收获RNA，使用轮状病毒基因特异性引物进行反转录。随后将PCR产物克隆进入上文中定义的自主复制质粒，将包含畜群和/或地区特异性轮状病毒基因的新型质粒转化进入表达ccdB的原核细胞。从细胞收获轮状病毒肽，将其配制成本发明的自体和/或商业疫苗。

在一个具体实施方案中，所述自体轮状病毒亚单位疫苗包含佐剂。佐剂可以是油、乳剂、金属盐(例如Al(OH)₃)或其组合。在一个实施方案中，佐剂为或或(TRIGEN+Quil A)、TS6(属于Merial的US 7,371,395中描述的)、LR4(属于Merial的US 7,691,368中描述的)或US 2011-0129494A1(属于Merial)中描述的任何制剂。

在一个实施方案中，疫苗可包含轮状病毒VP4、VP6和NSP4以及保存量的甲醛和/或抗微生物剂的混合物。

本发明还提供了用于诱导抗轮状病毒的免疫性(或免疫原性)或保护性反应的方法，以及用于预防或治疗轮状病毒或由轮状病毒引起的疾病状态的方法，包括施用所述亚单位或包含所述亚单位的组合物。

本发明还涉及来自质粒的表达产物以及从所述表达产物产生的抗体，或这样的产物和抗体例如在诊断应用中的用途。

还提供了包括至少一种轮状病毒多肽或其片段或变体和使用说明书的试剂盒。

这些和其它实施方案公开于下列详细描述中，或根据所述描述是明显的以及包括在所述描述中。

附图概述

在说明书的其余部分(包括对附图的参考)更具体地对本领域技术人员显示了本发明的完全和充分的公开内容，包括其最佳实施方式，其中：

图1提供了pStaby1.2的限制性内切核酸酶图谱(如由提供者提供的)；

图2概述了从pStaby1.2去除氨苄青霉素抗性基因；

图3概述了将GST基因插入pNPL1以形成pNPL2；

图4是pNPL2的侧翼区和轮状病毒基因插入位点的图谱；

图5是供体DNA回收技术的示意图；

图6概述了从临床样品分离自体疫苗候选轮状病毒基因的过程；

图7是用于插入供体DNA pNPL2以产生pNPL2-Rota的方法的示意图；

图8是确认轮状病毒VP4、VP6和NSP4蛋白的表达和尺寸的PAGE凝胶；

图9A显示NSP4分离株的核苷酸和肽序列比对(利用百分比同一性表)；

图9B显示VP4分离株的核苷酸和肽序列比对(利用百分比同一性表)；

图9C显示VP6分离株的核苷酸和肽序列比对(利用百分比同一性表)；

图10是显示疫苗功效研究的总体血清学结果的图表；

图11是显示通过ELISA测量的VP4、VP6和NSP4-特异性血清学的图；

图12是确认Rota C NSP4-VP4-VP6三重融合蛋白的表达的PAGE凝胶。L，梯形条带；1，诱导前(OD＝0.6)；2，未诱导的培养物(OD＝1.5)；3，诱导的培养物(OD＝1.5)；

图13是确认融合蛋白表达的Western印迹(左)和PAGE凝胶(右)。L-梯形条带，1-BSA 1.5μg，2-融合蛋白(1:20稀释的)，3-融合蛋白(1:40稀释的)，4-GST 0.5μg。

发明详述

本发明包括在动物中引发免疫原性反应的轮状病毒亚单位(本文中定义为例如轮状病毒多肽、蛋白质、抗原、表位或免疫原)，特别地引发、诱导或刺激猪中反应的轮状病毒亚单位。

具体的目标轮状病毒亚单位为VP4、VP6和NSP4，特别地由来自组C轮状病毒感染的猪的核酸序列编码的那些病毒亚单位。已承认这些抗原中任何抗原的前体均可用于本发明的实施。

在一个实施方案中，本发明提供了用于扩增来自感染的猪的轮状病毒序列和使用公知的分子技术将所述扩增的序列置于表达载体中的方法。在一个具体实施方案中，使用与轮状病毒基因的高度保守区域互补的引物，通过PCR实现扩增，以便可使用相同引物扩增来自众多种轮状病毒株的基因。在一个实施方案中，引物与编码VP4、VP6和/或NSP4的轮状病毒核酸序列互补，并且具有SEQ ID NO:8-13中所示的序列。

在另一个方面，本发明提供了用于产生表达载体的方法，所述表达载体包含解毒剂基因，并且在原核细胞宿主中表达所述基因，其赋予表达蛋白毒素的细菌细胞以存活能力。在一个实施方案中，解毒剂为ccdA并且毒素为ccdB。

在另一个方面，将新型轮状病毒序列置于表达载体中以产生待用于形成亚单位疫苗的轮状病毒亚单位。

在一个实施方案中，亚单位疫苗还包含佐剂。在一个具体实施方案中，佐剂为水包油佐剂。在一些实施方案中，佐剂为TRIGEN、ULTRAGEN、PrimaVant、TS6、LR4或其组合。在一个实施方案中，疫苗还包含佐剂量的铝盐。还可将其它佐剂化合物添加至亚单位疫苗，包括但不限于皂苷和氢氧化铝。这些另外的佐剂化合物可改善疫苗贮存稳定性、效率或两者。

在另一个方面，本发明提供了用于给猪崽提供抗轮状病毒的保护性免疫力的方法，包括给母猪和小母猪、产前施用本发明的亚单位疫苗。

表1.用于构建载体和克隆基因的引物的列表

SEQ ID#	#	说明
			2	650	GST正向引物，具有NdeI位点
3	651	GST反向引物，具有BamHI位点
			4	644	AMP^R基因缺失正向引物
5	645	AMP^R基因缺失反向引物
			6	660	PCR验证正向引物.
7	661	PCR验证反向引物.
			8	652	NSP4正向引物，具有BamHI位点
9	653	NSP4反向引物，具有HindIII位点
			10	654	VP4正向引物，具有BamHI位点
11	655	VP4反向引物，具有HindIII位点
			12	656	VP6正向引物，具有BamHI位点
13	657	VP6反向引物，具有HindIII位点
			73	760	KSN760–反向引物VP4
74	761	KSN761–正向引物VP4
			75	762	KSN762-反向引物VP4
76	763	KSN763-正向引物VP4

77	772	将His标记插入pNPL1的引物1
			78	773	将His标记插入pNPL1的引物2
79	774	用于pNPL3的Rota C NSP4正向引物
			80	775	用于pNPL3或pNPL1的Rota C NSP4反向引物
81	776	用于pNPL3的Rota C VP4正向引物
			82	777	用于pNPL3或pNPL1的Rota C VP4反向引物
83	778	用于pNPL3的Rota C VP6正向引物
			84	779	用于pNPL3或pNPL1的Rota C VP6反向引物
85	780	用于pNPL1的Rota C NSP4正向引物
			86	781	用于pNPL1的Rota C VP4正向引物
87	782	用于pNPL1的Rota C VP6正向吲物
			88	783	用于pNPL3的Rota C VP7反向引物
89	784	用于pNPL3或pNPL1的Rota C VP7反向引物

本发明的抗原性多肽或蛋白能够保护免受轮状病毒侵害。即，它们能够刺激动物的免疫反应。“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱发特异性免疫反应的物质。所述抗原可包括整个生物体(杀死的、减毒的或活的)；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性质的插入物的重组载体；能够在呈递给宿主动物时诱发免疫反应的一段DNA或DNA片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，指具有任意长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且其可被除氨基酸外的化学部分间断。所述术语还包括已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记或生物活性组分的缀合。

如本文中所用，术语“免疫原性或抗原性多肽”包括在给宿主施用后能够诱发抗所述蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上具有免疫活性的多肽。优选地，蛋白质片段是这样的片段，其具有与总蛋白大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。"免疫原性"蛋白或多肽，如本文中所用，包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。"免疫原性片段"意指包括一个或多个表位、从而引发上述免疫反应的蛋白质的片段。这样的片段可使用许多本领域公知的表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可通过例如在固体载体上同时合成许多肽(所述肽对应于该蛋白质分子的部分)和将所述肽与抗体反应(同时肽仍然连接于载体)来测定。这样的技术在本领域是已知的，并且描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen et al.,1984；Geysen等人,1986中。类似地，构象表位可通过例如通过例如X射线晶体分析法和2-维核磁共振测定氨基酸的空间构象来容易地鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols,同上。特别适用于小泰勒虫(T.parva)的蛋白质的方法详尽地描述于PCT/US2004/022605(通过引用整体并入本文)中。

如本文中论述的，本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性或抗原性多肽”还包括对序列的缺失、添加和置换，只要多肽能够发挥产生本文中定义的免疫反应的作用即可。术语"保守性变化"意指氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替代，或核酸序列中使得编码的氨基酸残基不改变或为另一种生物学上相似的残基的核苷酸置换。在这一点上，特别优选置换通常是性质上保守的，即在氨基酸的家族内发生的那些置换。例如，氨基酸总体上被分成4个家族：(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守性变化的实例包括一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被另一个疏水残基置换，或一个极性残基被另一个极性残基置换，例如精氨酸被赖氨酸置换，谷氨酸被天冬氨酸置换，或谷氨酰胺被天冬酰胺置换等；或利用结构上相关的对生物活性没有重大影响的氨基酸对氨基酸的相似保守置换。因此具有与参照分子大体上相同的氨基酸序列但具有少量氨基酸置换(所述置换不显著影响蛋白质的免疫原性)的蛋白质在参照多肽的定义内。由这些修饰产生的所有多肽包括在本文中。术语"保守性变化"还包括被取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸的用途，只要针对被取代多肽产生的抗体也与未取代的多肽免疫反应即可。

术语"表位"是指特定B细胞和/或T细胞对其反应的抗原或半抗原上的位点。该术语还可与“抗原性决定簇”或“抗原性决定位点”互换使用。可在显示一个抗体阻断另一个抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定识别相同表位的抗体。

对组合物或疫苗的"免疫反应"是宿主中针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应的发展。通常地，"免疫反应"包括但不限于下列效应的一个或多个：特异性针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选，宿主显示治疗性或保护性免疫反应，以便针对新的感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重度减轻。这样的保护将通过通常由感染的宿主显示的症状和/或临床疾病体征的减少或不存在、感染的宿主的更快恢复时间和/或更低的病毒滴度来证明。

“动物”包括哺乳动物、鸟类等。本文中使用的动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、丛林狼(coyote)、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫以及其它猫科动物，包括猎豹和山猫)、羊(例如，绵羊)、牛族动物(例如，牛)、猪类(例如，猪)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(例如，狐猴、跗猴、猴、长臂猿、人猿)、白鼬、海豹和鱼。术语“动物”还包括所有发育阶段(包括新生儿、胚胎期和胎儿期)中的个体动物。

除非另外解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域内的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文明确另有所指，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数所指物。类似地，除非上下文明确地另有所指，否则单词“或”意欲包括“和”。

应当指出，在本公开内容中，特别地在权利要求和/或段落中，术语例如“包括”、“包含”、“含有”等可具有其在美国专利法中所赋予的含义；例如，它们可意指“包括”、“包含”、“含有”等；并且术语例如“基本上由…….组成”和“大体上由……组成”具有它们在美国专利法中所赋予的含义，例如，它们允许未被明确引用的要素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新特征的要素。

组合物

本发明涉及可包含轮状病毒多肽、抗原、表位或免疫原和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的轮状病毒疫苗或组合物。所述轮状病毒多肽、蛋白质、抗原、表位或免疫原可以是引发、诱导或刺激动物中反应的任何轮状病毒多肽、蛋白质、抗原、表位或免疫原，例如但不限于其蛋白质、肽或片段。

本发明涉及可包含轮状病毒VP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4、NSP5或NSP6多肽和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物的轮状病毒疫苗或组合物。在一个实施方案中，表达载体还可包含编码VP4、VP6或NSP4多肽或其组合的多核苷酸。在一个具体实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72中所示的序列或其组合。

在另一个实施方案中，所述药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物可以是油包水乳剂。在另一个实施方案中，所述油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三重乳剂。

在一个实施方案中，轮状病毒多肽、抗原或其片段或变体包括轮状病毒多肽或其片段或变体。在该实施方案的一个方面，轮状病毒多肽或其片段或变体是由轮状病毒基因产生的重组多肽。在该实施方案的另一个方面，轮状病毒基因与SEQ ID NO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72中所示的序列或其组合具有至少70％的同一性。在该实施方案的另一个方面，轮状病毒多肽或其片段或变体与SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71中所示的序列具有至少80％的同一性，其中所述多肽或其片段或变体具有相同的功能作用(即所述多肽是属于组C轮状病毒的不同株的轮状病毒VP4、VP6或NSP4多肽)。

合成抗原包括在该定义内，例如多表位、侧翼表位和其它重组或合成来源的抗原。参见，例如，Bergmann等人,1993；Bergmann等人,1996；Suhrbier,1997；Gardner等人,1998。为了本发明的目的，免疫原性片段通常包括分子的至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10-15个氨基酸或约15-25个氨基酸或更多个氨基酸。对于片段的长度不存在至关重要的上限，所述片段可包括蛋白质序列的几乎全长，或甚至包含蛋白质的至少一个表位的融合蛋白。

因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码轮状病毒多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由所述核苷酸组成或由所述核苷酸组成。编码轮状病毒多肽的片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最少15个核苷酸、约30-45个核苷酸、约45-75或至少57、87或150个连续或邻接核苷酸或基本上由所述核苷酸组成或由所述核苷酸组成。表位测定法，例如产生重叠肽文库的方法(Hemmer等人,1998),Pepscan(Geysen等人,1984；Geysen等人,1985；Van der Zee R.等人,1989；Geysen,1990；Multipin.RTM.PeptideSynthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人,1999；PCT/US2004/022605)可用于本发明的实践。

术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性的或分枝的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂合体。该术语还包括RNA/DNA杂合体。下列是多核苷酸的非限定性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA,重组多核苷酸、分枝的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其它糖类和连接基团例如氟代核糖和硫代酯，以及核苷酸分枝。可在聚合后通过标记组分缀合来进一步修饰核苷酸的序列。该定义中包括的其它类型的修饰是帽、利用类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的置换，以及用于将多核苷酸连接于蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体载体的方式的引入。多核苷酸可通过化学合成获得或从微生物产生。

术语“基因”被广泛用于指与生物学功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包括内含子和外显子(如基因组序列中一样)，或仅包括编码序列(如在cDNA中)和/或它们的表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质并且包括调控序列的核酸片段。

本发明还包括编码轮状病毒抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可以是多聚体，并且可具有任意长度，可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和以任意组合存在的类似物。

“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指大体上与所述组分天然存在于其中的生物体细胞中的其它生物组分(例如，其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)分离或从其纯化出来的组分。已被“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。

如本文中所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，其意欲为相对术语。因此，例如，部分纯化的多肽制剂是其中所述多肽比该多肽在其天然环境中更富集的制剂。即多肽与细胞组分分离。“大体上纯化的”意指使至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％或更多的细胞组分或材料被除去的纯化。同样地，多肽也可以是部分纯化的。“部分纯化”意指少于60％的细胞组分或材料被除去。所述术语也适用于多核苷酸。本文中公开的多肽可通过本领域已知的任何方法进行纯化。

此外，轮状病毒多肽的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能，但已在不相关的生物中单独进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种，但通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常地，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。例如，野生型轮状病毒多肽的类似物、直系同源物或旁系同源物可与野生型轮状病毒多肽在翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者方面不同。具体地，本发明的同源物通常显示与野生型轮状病毒多肽或多核苷酸序列的全部或部分具有至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且显示相似的功能。

在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71中所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。在另一个方面，本发明提供了上文中鉴定的轮状病毒多肽(SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71)的片段和变体，其可由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。

变体是具有与SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71中所示的氨基酸序列具有少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的同源多肽。

变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"是指包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的变化，其存在于天然群体(例如，病毒物类或品种)中。这样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5％的变化。等位基因变体可通过对许多不同物种中的目标核酸序列测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定这些物种中相同基因的基因座来容易地进行。任何和所有这样的核酸变化和所得的氨基酸多态性或变化(作为天然等位基因变化的结果产生的并且不改变目标基因的功能活性)意欲在本发明的范围内。

如本文中所用，术语"衍生物"或“变体”是指这样的多肽或编码多肽的核酸，所述多肽具有一个或多个保守氨基酸变化或其它微小修饰，以便(1)当与野生型多肽相比较时对应多肽具有大体上等同的功能，或(2)针对所述多肽产生的抗体与该野生型多肽有免疫反应性。这些变体或衍生物包括对所述轮状病毒多肽一级氨基酸序列有微小修饰的多肽，所述修饰导致相较于未修饰的对应多肽而言具有大体上等同的活性的肽。这样的修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是自发的。术语“变体”还涉及对序列的缺失、添加和置换，只要多肽有能力产生本文中定义的免疫反应即可。

术语"保守变异"意指另一个生物相似残基对氨基酸残基的替代，或使编码的氨基酸残基不改变或为另一种生物学上相似的残基的核酸序列中的核苷酸替代。在这一点上，特别优选的置换通常在性质上是保守的，如上文中描述的。

轮状病毒多肽的免疫原性片段包含具有SEQ ID NO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72中显示的序列的轮状病毒多肽或其变体或功能性片段的至少8、10、13、14、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。

在另一个方面，本发明提供编码轮状病毒多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ IDNO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72中所示的序列的多肽或其变体或功能性片段的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72中所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽，或保守变体、等位基因变体、同源物或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段、或这些多肽的组合。

在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71中所示的核苷酸序列的多核苷酸，或其变体或功能片段。在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71中所示序列的多核苷酸之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸，或其变体。

本公开内容的多核苷酸包括作为遗传密码，例如针对特定宿主的最优化密码子选择的结果而为简并的序列。如本文中所用，“最优化的”是指经遗传工程化以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码轮状病毒多肽的最优化多核苷酸，轮状病毒基因的DNA序列可被修饰来1)包含由在特定宿主细胞表达系统(例如细菌宿主细胞)中高度表达的基因偏爱的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含A+T或G+C含量至大体上在所述宿主细胞中发现的所述含量；3)形成所述宿主细胞的起始序列；或4)消除引起RNA的去稳定、降解和终止的序列，或形成二级结构发夹的序列。轮状病毒蛋白在所述宿主细胞表达系统中的表达增加可通过使用原核生物中密码子用法的分步频率来实现。

两个氨基酸序列之间的序列同一性可使用标准参数(参见，例如，可在"NationalCenter for Biotechnology Information"(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器上以及在Altschul等人中获取的BLAST或BLASTX算法；该文献通过术语“blasts”论及使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)，通过NCBI(美国国家生物技术信息中心)成对blast和blosum62矩阵来确定。

关于序列的“同一性”可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两个序列中更短序列的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)，例如使用20个核苷酸的窗口尺寸、4个核苷酸的字长和为4的缺口罚分来测定，序列数据(包括比对)的计算机辅助分析和解释可使用商购可得的程序(例如，Intelligenetics^TM Suite,Intelligenetics Inc.CA)来方便地进行。当RNA序列被认为与DNA序列相似，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可来源于DNA序列(DNA序列中的胸苷(T)被视为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U))。

两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来测定。

下列文献提供了用于比较序列的相对同一性或同源性的算法，另外地或可选择地，关于上述序列，这些参考资料中的教导可用于测定百分比同源性或同一性：NeedlemanSB和Wunsch CD；Smith TF和Waterman MS；Smith TF,Waterman MS和Sadler JR；Feng DF和Dolittle RF；Higgins DG和Sharp PM；Thompson JD,Higgins DG和Gibson TJ；以及Devereux J,Haeberlie P和Smithies O。并且，无需过度实验，本领域技术人员可咨询关于测定百分比同源性的许多其它程序或参考资料。

可在具有不同“严格度”的条件下进行杂交反应。增加杂交反应的严格度的条件是公知的。参见例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第2版(Sambrook等人,1989)。

本发明还包括载体分子或表达载体中包含的并且有效地连接于启动子元件和任选地增强子的轮状病毒多核苷酸。

“载体”是指包含将被体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包含用于预防或治疗的目标序列，并且可任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体不需要能够在最终的靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“重组体”意指具有半合成或合成来源的多核苷酸，其不是天然存在的，或以非天然发现的排列连接于另一个多核苷酸。

“异源的”意指来源于在遗传上与将与其比较的其余实体不同的实体。例如，多核苷酸可通过基因工程技术被置于源自不同来源的质粒或载体中，并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并且有效地连接于除所述天然序列外的编码序列的启动子是异源启动子。

本发明的多核苷酸可包含另外的序列，例如在相同转录单位内的另外编码序列、控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的另外的转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞的转化的序列，以及任何这样的构建体，只要被期望来提供本发明的实施方案。

用于轮状病毒多肽、抗原、表位或免疫原的表达的元件有利地存在于本发明的载体中。所述元件以最小的方式包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地对于某些载体例如质粒和某些病毒载体(例如除痘病毒外的病毒载体)还有多聚腺苷酸化序列。当多核苷酸编码多肽片段例如轮状病毒多肽时，有利地，在载体中，将ATG置于阅读框架的5'，将终止密码子置于3'。可存在用于控制表达的其它元件，例如增强子序列、稳定化序列，例如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。

本发明还涉及包含载体例如表达载体的制剂，例如治疗性组合物。制剂可包含一种或多种载体，例如表达载体，例如体内表达载体，所述载体包含一种或多种轮状病毒多肽、抗原、表位或免疫原并表达其。在一个实施方案中，所述载体包含多核苷酸并在药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物中表达其，所述多核苷酸包含编码轮状病毒抗原、表位或免疫原的多核苷酸。因此，根据本发明的一个实施方案，制剂中的其它载体包含这样的多核苷酸，基本上由所述多核苷酸组成或由所述多核苷酸组成，所述多核苷酸编码轮状病毒多肽的一个或多个其它蛋白、抗原、表位或免疫原(例如，血凝素、衣壳、神经氨酸酶、核蛋白、非结构蛋白、肠毒素)或其片段，并且在适当的情况下载体表达所述蛋白、抗原、表位或免疫原或其片段。

根据另一个实施方案，制剂中的载体包含编码轮状病毒多肽、抗原、表位或免疫原中的一种或多种蛋白质或片段的多核苷酸，或基本上由所述多核苷酸组成，或由所述多核苷酸组成。在另一个实施方案中，制剂包含1、2或更多个载体，所述载体包含编码轮状病毒多肽、抗原、融合蛋白或其表位并表达(有利地体内)其的多核苷酸。本发明还涉及载体的混合物，所述载体包含编码不同轮状病毒多肽、抗原、表位、融合蛋白或免疫原，例如来自不同物种(例如但不限于人、猪、母牛或牛、狗、猫和禽类)的轮状病毒多肽、抗原、表位或免疫原并表达其的多核苷酸。

根据本发明的又一实施方案，表达载体是质粒载体，特别地体内表达载体。在一个特定的非限定性实例中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke等人,1997；Hartikka等人,1996,参见，例如，美国专利No.5,846,946和6,451,769)可用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒来源于pVR1012，并且包含人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号序列包含Genbank中登录号HUMTPA14下的氨基酸M(1)至氨基酸S(23)。在另一个特定的非限定性实例中，用作用于插入多核苷酸序列的载体的质粒可包含Genbank中登录号U28070下的猪IGF1的从氨基酸M(24)至氨基酸A(48)的信号肽序列。可被查询或用于实践的关于DNA质粒的其它信息可见于例如美国专利No.6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中。

术语质粒涵盖包含根据本发明的多核苷酸和其在期望的宿主或靶的细胞中体内表达所必需的元件的任何DNA转录单位；并且，在这一点上，应指出，超螺旋或非超螺旋的环状质粒以及线性形式意欲在本发明的范围内。

每一个质粒包含或含有编码轮状病毒多肽、抗原、表位或免疫原(任选地与异源肽序列、变体、类似物或片段融合的)的多核苷酸，或基本上由所述多核苷酸组成，所述多核苷酸有效地连接于启动子或在启动子的控制之下或依赖于启动子。一般地，有利地使用在真核细胞中具有功能的强启动子。强启动子可以是但不限于人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选地具有另外的起源例如大鼠或豚鼠的所述启动子。

在更一般的术语中，启动子具有病毒或细胞起源。可有用地用于本发明实践中的除CMV-IE外的强病毒启动子为SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于本发明实践的强细胞启动子为细胞骨架的基因的启支男孩子，例如结蛋白(desmin)启动子(Kwissa等人,2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人,1989)。

关于质粒和除痘病毒外的病毒载体的多腺苷酸化信号(polyA)，可使用牛生长激素(bGH)基因(参见U.S.5,122,458)的poly(A)信号，或兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。

“宿主细胞”是指已通过施用外源多核苷酸例如重组质粒或载体在遗传上进行了改变，或能够通过所述方式在遗传上进行改变的原核或真核细胞。当提及遗传上改变的细胞时，该术语是指原始改变的细胞和其后代。

使用方法和制品

本发明包括下列方法实施方案。在一个实施方案中，公开了接种动物的方法，其包括给动物施用包含载体和药学上或兽医学上可接受的载物、赋形剂或媒介物的组合物，所述载体包含轮状病毒多肽或其片段或变体。在该实施方案的一个方面，所述动物是猪。

在本发明的一个实施方案中，可使用初免-加强方案，其由至少一次初免施用和至少一次使用至少一种共同多肽、抗原、表位或免疫原的加强施用组成。通常地，用于初免施用的免疫组合物或疫苗在性质上与用作加强免疫的那些免疫组合物或疫苗不同。然而，应指出，同一组合物可用作初免施用和加强施用。该施用方案称为“初免-加强”

初免-加强方案包括至少一次初免-施用和使用至少一种共同多肽和/或其变体或片段的至少一次加强施用。用于初免-施用的疫苗可在性质上与用作后来的加强疫苗的那些疫苗不同。初免-施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。

基于病毒载体，例如基于非痘病毒载体的组合物，用于哺乳动物靶物种的组合物的剂量体积(例如猪或猪类组合物的剂量体积)通常为约0.1至约2.0ml，约0.1至约1.0ml，和约0.5ml至约1.0ml。

可在最后一次免疫后约2至4周，通过用轮状病毒的强毒株攻击动物例如猪来测试疫苗的效力。将同源和异源株用于攻击以测试疫苗的效力。可通过IM或SC注射、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或口服施用来攻击动物。取决于施用途径，攻击病毒可以为在一定体积中的约10^5-8EID₅₀、TCID₅₀或10^3-8个基因组等同物，如通过PCR测定的。例如，如果施用是通过喷雾进行的，则将病毒悬浮液喷雾以产生约1至100μm的微滴，如果施用是鼻内、气管内或口服施用，则攻击病毒的体积分别为约0.5ml、1-2ml和5-10ml。可在攻击后每日观察动物的临床体征，例如，脱水、腹泻、糊状至水样粪便、死亡和/或体重减轻、发育停滞、病毒脱落，进行14天。此外，可无痛致死成组的动物，评价其病理检查所见肠病、绒毛萎缩。可在攻击后从所有动物收集直肠或粪便拭子以进行病毒分离或定量或检测。病毒抗原在肠组织或粪便中的存在或不存在可通过定量实时逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)来评价。可在攻击前和攻击后收集血液样品，可分析所述样品的轮状病毒特异性抗体的存在。

包含用于初免-加强方案的本发明的重组抗原性多肽的组合物包含于药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂中。本发明的方案保护动物免受轮状病毒侵害和/或阻止被感染的动物中疾病进展。

优选每隔1至6周进行不同的施用。优选时间间隔为3至5周，任选地4周。根据一个实施方案，还预想了每年加强。动物例如猪在第一次施用时可以为至少8周龄。

本领域技术人员应当理解，本文中的公开内容只是举例说明，本发明不限于此。根据本文中的公开内容和本领域内的知识，本领域技术人员可确定施用次数、施用途径以及待用于每一个注射方案的剂量，而无需任何过度的实验。

本发明涉及给动物至少一次施用有效量的根据本发明制备的治疗性组合物。例如，有效量可以为约10μg至约300μg的蛋白质。在一个实施方案中，各自约100μg的3种不同的组C轮状病毒蛋白存在于有效量的治疗性组合物中。动物可以是雄性、雌性、怀孕的雌性和新生儿。该施用可通过各种途径进行，包括但不限于肌内(IM)、真皮内(ID)、腹膜内(IP)或皮下(SC)注射或通过鼻内或口服施用。根据本发明的治疗性组合物还可通过无针装置(例如，例如利用Pulse Needle Free,Pulse Needlefree,Lenexa,KS,USA、Pigjet、皮肤无针喷注器(Dermojet)、生物喷射器(Biojector)、Avijet(Merial,GA,USA)、Vetjet或Vitajet装置(Bioject,Oregon,USA))来施用。施用质粒组合物的另一个方法是使用电穿孔(参见，例如Tollefsen等人,2002；Tollefsen等人,2003；Babiuk等人,2002；PCT申请No.WO99/01158)。在一个实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗性组合物递送至动物。有利的实施方案中，动物为猪、狗、白鼬或海豹。

本发明的另一个实施方案是用于进行引发或诱导动物的抗轮状病毒的免疫反应或保护性反应的方法的试剂盒，其包括轮状病毒亚单位免疫组合物或疫苗，以及用于进行在动物中引发免疫反应的有效量递送的方法的说明书。

本发明的另一个实施方案是用于进行诱导动物的抗轮状病毒的免疫反应或保护性反应的方法的试剂盒，其包括含有本发明的轮状病毒多肽或抗原的组合物或疫苗，以及用于进行在动物中引发免疫反应的有效量递送的方法的说明书。

本发明的另一个方面涉及用于上述根据本发明的初免-加强接种的试剂盒。所述试剂盒可包括至少两个小瓶：包含用于根据本发明的初免-接种的疫苗或组合物的第一小瓶，和包含用于根据本发明的加强-接种的疫苗或组合物的第二小瓶。该试剂盒可有利地包含用于另外的初免-接种或另外的加强-接种的另外的第一或第二小瓶。

药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员来说是公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其它药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是有利于载体(或从本发明载体体外表达的蛋白质)施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，载体、媒介物或赋形剂可促进转染和/或改善载体(或蛋白质)的保留。剂量和剂量体积在本文的一般描述中进行了论述，其还可由本领域技术人员结合本领域的知识阅读本公开内容来测定，而无需任何过度的实验。

有利地但不是唯一地适合于质粒的包含季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下式的阳离子脂质：

其中R1为具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂肪族基，R2为包含2或3个碳原子的另一种脂肪族基，X为胺或羟基，例如DMRIE。在另一个实施方案中，阳离子脂质可与中性脂质(例如DOPE)结合。

在这些阳离子脂质中，优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)其有利地与中性脂质，有利地DOPE(二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺；Behr,1994)结合以形成DMRIE-DOPE。

当DOPE存在时，DMRIE:DOPE摩尔比有利地为约95:约5至约5:约95，更有利地约1:约1，例如1:1。

在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物可以是油包水乳剂。适当的油包水乳剂的实例包括基于油的油包水疫苗乳剂，其在4℃是稳定的并且为流体，包含：6至50v/v％的含抗原水相(优选12至25v/v％)，50至94v/v％的全部或部分包含不可代谢的油(例如，矿物油例如石蜡油)和/或可代谢油(例如，植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的油相，0.2至20p/v％的表面活性剂(优选3至8p/v％)，后者完全或部分为任一聚甘油酯或为其混合物，所述聚甘油酯优选为聚甘油(聚)蓖麻酸盐或聚氧乙烯蓖麻油，或另外地氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂的表面活性剂的实例包括乙氧基化山梨坦酯(例如，可获自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT的聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN))和山梨坦酯(例如，可获自Sigma Aldrich,St.Louis,MO的去水山梨糖醇单油酸酯(SPAN))。此外，关于油包水乳剂，也参见US 6,919,084。在一些实施方案中，含抗原水相包含含有一种或多种缓冲剂的盐溶液。适当的缓冲液的实例为磷酸缓冲盐溶液。在一个有利的实施方案中，油包水乳剂可以为水/油/水(W/O/W)三重乳剂(U.S.6,358,500)。其它适当的乳剂的实例描述于U.S.7,371,395中。

根据本发明的免疫组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由所述佐剂组成。用于本发明的实践的适当佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人,1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and AdjuvantApproach”的第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作的第183页上描述的乳剂MF59，(4)包含季铵盐的阳离子脂质，例如，DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)引用的和通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂，或(9)其任意组合或混合物。

特别适合用于病毒载体的水包油乳剂(3)可基于：液态石蜡(欧洲药典类型)、类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯、因烯烃例如异丁烯或癸烯的寡聚化而产生的油、具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸/癸酸酯)、甘油三(辛酸/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯或分枝的脂肪族醇或酸的酯，特别地异硬脂酸酯。

将油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如一方面脱水山梨醇、二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇与另一方面油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选地被乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic，例如L121。

在(1)型佐剂聚合物当中，优选的是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其地通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联的。这些化合物称为卡波姆(Pharmeuropa,第8卷,no.2,1996年6月)。本领域技术人员还可参考U.S.2,909,462，其提供了通过具有至少3个羟基、优选不超过8个这样的基团的多羟基化合物交联的这样的丙烯酸类聚合物，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪烃基取代。优选的基团是包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团。不饱和基团还可包含其它取代基，例如甲基。在名称卡波姆下销售的产物(BF Goodrich,Ohio,USA)是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。在它们当中，参考卡波姆974P、934P和971P。

关于马来酸酐-烯基衍生物共聚物，优选的是EMA(Monsanto)，其为直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物，它们例如通过乙烯醚交联。也参考J.Fields等人,1960。

关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选通过具有下式的基本单元形成：

其中：

-R1和R2可以相同或不同，代表H或CH3

-x＝0或1，优选x＝1

-y＝1或2，x+y＝2。

对于EMA，x＝0并且y＝2；对于卡波姆，x＝y＝1。

这些聚合物溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)，并且可以例如利用苏打(NaOH)将pH调整至7.3至7.4，以提供其中可掺入表达载体的佐剂溶液。最终免疫或疫苗组合物中的聚合物浓度可为约0.01至约1.5％w/v，约0.05至约1％w/v，约0.1至约0.4％w/v。

细胞因子(5)可以以蛋白质形式存在于免疫或疫苗组合物中，或可与免疫原或其表位在宿主中共表达。优选的是细胞因子通过与表达免疫原或其表位的载体相同的载体，或通过其分开的载体的共表达。

本发明包括例如通过将活性组分与佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂有利地混合在一起来制备这样的组合组合物。

可用于本发明的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNγ)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)和转化生长因子β(TGFβ)。应理解可将细胞因子与本发明的免疫或疫苗组合物共施用和/或依次地施用。因此，例如，本发明的疫苗还可包含在体内表达适当的细胞因子，例如与待接种的或将在其中引发免疫反应的宿主匹配的细胞因子(例如，对于待给犬施用的制剂为犬细胞因子)的外源核酸分子。

本发明现将通过下列非限定性实例进行进一步描述。

实施例

概述。通常使用从感染的动物的临床样品分离的完整病毒，通过在鸡胚蛋或体外培养物中进行病毒适应和繁殖来制备病毒疫苗。众所周知组C猪轮状病毒难以通过这些常规病毒学技术来进行回收，轮状病毒通常被认为在对鸡胚蛋的适应或细胞培养生长过程中易于发生抗原性失真(antigenic distortion)，从分离的完整病毒得到的是亚最佳疫苗产生。因此，表达载体(pNPL2,SEQ ID NO:15)被构建来使得能够产生包含猪轮状病毒组CVP4、VP6和/或NSP4重组蛋白的疫苗。轮状病毒的遗传物质通过从由牧兽医提交的临床材料进行PCR来得到。向pNPL2添加(通过本文中描述和图7中描绘的方法)编码VP4(18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40)、VP6(42、44、46、48或50)或NSP4(52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72)多肽/亚单位的基因，以产生pNPL2-RotaC载体，所述载体的每一个编码NSP4、VP4或VP6的部分并且能够在细菌宿主细胞中表达其。随后将这些载体在SE1大肠杆菌细胞中生长，所述细胞组成型地表达ccdB蛋白毒素，该毒素在载体不存在的情况下杀死细菌。生长细胞，使细胞失活，随后收获重组表达的轮状病毒蛋白，用佐剂配制其以用作无活力型亚单位蛋白自体疫苗。本发明的疫苗组合物在猪中引发抗轮状病毒的保护性免疫。

实施例1-用于轮状病毒亚单位疫苗的自体或商业化生产的载体的构建

pNPL1&2表达载体的构建。通过缺失氨苄青霉素抗性基因和插入GST(谷胱甘肽S-转移酶)基因(以促进生产过程中的下游蛋白质加工)，从Delphi Genetics的pStaby1.2载体(SEQ ID NO:1)(pStaby1.2用户手册，如2011年出版的)构建表达载体pNPL2(SEQ ID NO:15)。该载体既不包含也不表达已知的哺乳动物毒力特征，此外，在其构建中从所述载体除去所有抗生素抗性基因。将pNPL2在SE1大肠杆菌中生长，它们一起为B株大肠杆菌宿主/载体生产系统(pStaby用户手册)。

pStaby1.2的限制性图谱示于图1中，并且如所指示的，包含T7启动子以驱动编码重组蛋白的基因表达。该质粒还包含编码不稳定的解毒剂蛋白的ccdA基因，所述解毒剂蛋白抑制稳定的对肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细胞有毒的抗促旋酶蛋白(ccdB)的表达。ccdB蛋白由存在于宿主SE1大肠杆菌宿主细胞的染色体中(ccdB基因不存在于pStaby1.2质粒中)的ccdB基因编码。转化后，ccdA基因在质粒中的存在确保了成功转化的细胞能够存活，同时无质粒的SE1细胞产生毒素而无解毒剂，从而不能存活。

pStaby1.2载体的氨苄青霉素抗性基因被认为用于亚单位轮状病毒疫苗生产并不理想，从而使用反转PCR技术去除(图2)。用于所有公开方法的一列引物示于表1中。磷酸化最终的PCR产物，将其自身连接以产生pNPL1(SEQ ID NO:14)。随后将GST添加至pNPL1以增加任何表达的蛋白质的尺寸，和改善下游加工/在线分析。使用引物#650(SEQ ID NO:2)和#651(SEQ ID NO:3)从pGEX4T.1(GE Life Sciences)扩增GST，随后消化扩增子(SEQ ID NO:16)，将其克隆进入NdeI-BamHI-线性化的pNPL1以产生pNPL2(图2-4)。利用BamHI和HindIII消化的pNPL2产生在琼脂糖凝胶上可见的两个条带(5682bp和25bp)。

pNPL3的构建。使用引物KSN772(SEQ ID NO:77)和KSN773(SEQ ID NO:78)，以pNPL1作为模板进行PCR。磷酸化PCR产物，对其自身连接以形成pNPL3，该载体现包含6×HIS标签。使用通过使用SEQ ID NO:79-89中所示的引物产生的PCR引物，通过融合反应将NSP4、VP4、VP6或VP7基因克隆进入BamHI和HindIII消化的pNPL3载体。pNPL3与pNPL2相似，只是pNPL3不存在编码GST基因的序列。相反地，pNPL3具有编码His标记的序列，从而能够产生N-末端His标记的融合肽。

实施例2-自体轮状病毒亚单位疫苗的生产

直接从由被感染的猪收集的临床样品分离、纯化轮状病毒RNA，使用特异于编码VP4(由SEQ ID NO:10、11所示的引物)、VP6(由SEQ ID NO:12、13所示的引物)和NSP4(由SEQID NO:8、9所示的引物)的基因的引物将其经历反转录-PCR(RTPCR)。每一个引物对被设计来结合在靶基因的每一个末端上的高度保守区域(图5)，从而使得能够从许多不同的病毒分离株扩增组C轮状病毒基因。如果不能使用SEQ ID NO:8,9,10,11,12和13中所示的轮状病毒C基因特异性引物扩增基因，则可由本领域技术人员使用本领域公知的技术设计和使用替代引物。例如，可使用简并引物，以便可改变至关重要的引物位置(例如3’末端核苷酸)来容纳与保守序列的模板偏差。可将具有SEQ ID NO:73、74、75和76中所示序列的引物用于扩增VP序列，并将其克隆进入pNPL1和/或pNPL2。SEQ ID NO:73和74可用于扩增VP4序列，将其克隆进入TOPO载体。此后，SEQ ID NO:75和76可用于将VP4序列插入pNPL2载体，以进行随后的亚单位疫苗产生。

每一个引物的5’末端包含15个核苷酸的序列以允许在随后的融合反应中插入pNPL2。用于生产待用于表达系统的供体DNA的产生域起源轮状病毒基因的分离和扩增示于图4、5和6中。ccdA(载体编码的)和ccdB(细胞基因组编码的)基因在转化的SE1细胞中的存在导致表达轮状病毒基因的可存活的稳定培养物。任何非转化的或质粒消除细胞是不可存活的。表征基因插入，通过测序验证基因插入，通过SDS PAGE(图8)验证蛋白质表达，所述SDS PAGE显示约36kDa(NSP4)、52kDa(VP4)和68kDa(VP6)的分子量。该方法预期适用于任何在保守区与克隆引物具有充分同源性的任何轮状病毒野生株。

对于大规模生产，将单个菌落或多个均一的菌落转移至10mL-200,000mL LB培养基。当在600nm测量的光密度达到0.4-1.0时，以1mM的终浓度添加IPTG([异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷]Sigma Aldrich Catalog No.I5502或等同物)。将培养物再温育另外2-6小时。可如下在发酵罐中生长培养物：

a.将培养温度维持在36°±3℃。

b.将过滤压缩气流维持在0.1-300L/分钟。

c.将培养物的pH维持在7.4±0.3。

d.当在600nm测量的光密度达到0.4-1.0时，以1mM的终浓度添加IPTG。将培养物再温育另外2-6小时。

收获技术。通过过滤或离心将消耗培养基与大肠杆菌细胞分离，使用0.1-0.45微米过滤器通过过滤浓缩细胞。随后使用B-PER试剂(Thermo Scientific,Catalog No.78248或等同物)，随后搅拌或搅动溶液0.5-2小时来裂解浓缩的细胞。通过以5000-10000g离心15-30分钟，或通过使用0.1-0.45微米过滤器过滤来浓缩裂解的细胞，弃去上清液/渗透物。通过搅拌或搅动0.1-0.5小时将沉淀/浓缩物重悬浮于洗涤缓冲液A(20mM Tris-HCL,2mMEDTA和0.1％TritonX-100,调整pH至7.5-8.5)，通过以5000-10000g离心15-30分钟或通过使用0.1-0.45微米过滤器浓缩所得的悬浮液。通过搅拌或搅动0.1-0.5小时将沉淀/浓缩物重悬浮于洗涤缓冲液B(20mM Tris-HCL和2mM EDTA,将pH调整至7.5-8.5)，随后通过以5000-10000g离心15-30分钟，或通过使用0.1-0.4微米过滤器过滤来浓缩悬浮液。在于8M尿素(Sigma-Aldrich,Catalog No.U6504或等同物)中悬浮以及搅拌或搅动0.5-2小时后，用无菌PBS稀释终悬浮物。

疫苗制剂。收获后，用TRIGEN(水包油)和防腐剂(<30.0μg/mL浓度的庆大霉素和<2.50μg/mL浓度的两性霉素B或<30μg/mL浓度的多粘菌素B)配制轮状病毒亚单位。向混合物中添加a)氢氧化铝凝胶(“85”，由Brenntag Biosector制造的,Cat.No.EMS2485-2或REHYDRAGEL HPA,Reheis Cat.No.203130070600,REHYDRAGEL LV,Reheis Cat.No.203120070602或等同物)(在终产物中提供约0.1至约0.5％Al₂O₃)。或者，Quil A佐剂以0.5至2.5％灭活流体与水包油佐剂的比率存在于制剂中。佐剂占终产物的约10至约50％。

实施例3-使用自体轮状病毒亚单位疫苗进行的母猪的免疫

概述。48只研究母猪(被轮状病毒C和相似对应物(parity)慢性感染的)入选疫苗效力研究。二十六(26)只动物为安慰剂接种的对照，而22只动物接受包含VP4、VP6、NSP4和乳剂/另外的佐剂的混合物的轮状病毒亚单位疫苗。疫苗被配制成每一个剂量的疫苗存在约100微克的每一种蛋白质(总共300微克蛋白质)和10％Trigen。在分娩前6和3周肌内施用疫苗。在接种和分娩前收集母猪血清，随后在分娩后7天收集猪崽的血清。

结果。从未接种的母猪出生的猪崽具有21％的死亡率，从接种的母猪出生的猪崽具有14％的死亡率(即33％的降低)。在从接种的母猪出生的猪中发病率也显著降低。来自接种母猪的猪崽相较于对照猪崽也具有显著(p<0.05)更高的抗体滴度(图9)。

实施例4-新型轮状病毒C疫苗降低乳猪腹泻发病率和提高性能中的效力

概述。选择3600只养育至断奶畜群的母猪来评价新型轮状病毒C疫苗的效力。畜群由与02品系公猪杂交的PIC L03母猪组成。所有在农场中喂食的膳食被配制来满足或超过营养需求(NRC,1998)。基于养育的天数和在平等性内将母猪和小母猪随机分配至两个处理组(对照(CON)或Rota C RS疫苗(VACC))之一内。指定的VACC组中的动物在分娩前3周、3和5周，或3、5和8周肌内接受2ml疫苗。通过处理将来自这些动物的所有同窝幼仔在出生后24小时内交叉哺育。从出生当天至第5天每日进行腹泻评分。评分被给作0(无腹泻)、1(少数腹泻)、2(50％的同窝幼仔腹泻)或3(超过50％的同窝幼仔腹泻)。记录因与腹泻相关的死亡而从原始同窝幼仔除去的猪。当使用3周或3、5和8周接种程序时，腹泻评分或与腹泻相关的死亡率无差异。然而，CON与VACC(3和5周)处理(0.56对0.41,P<0.05)之间的腹泻评分减小。此外，对于VACC处理(第3和5周)相对于CON，腹泻同窝幼仔的百分比从第1天至第5天减少。总之，当接种母猪1或3次时，新型轮状病毒C疫苗不改变乳猪腹泻率或死亡率的发生率。然而，当在分娩前3和5周提供时，新型疫苗的使用似乎减少腹泻发生率。

处理。基于养育的天数和在平等性内将母猪和小母猪随机分配至4个处理(对照(CON)或Newport疫苗处理1-3(VACC)之一内。制剂为各自100微克的多肽：VP4(SEQ ID NO:42)、VP6(SEQ ID NO:52)和NSP4(SEQ ID NO:18)，所述多肽源自轮状病毒分离株1。将这些蛋白质亚单位与10％TRIGEN(由约1.6％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、10％氢氧化铝凝胶、38％水性/盐水、45％纯化的矿物油和5％的脱水山梨醇单油酸酯组成)组合，配制用于2cc的剂量。指定的VACC处理组1中的动物在分娩前3周肌内接受2ml的疫苗，指定的VACC处理组2中的动物在分娩前5周肌内接受2ml的疫苗，随后再次在分娩前3周肌内接受2ml的疫苗，指定的VACC处理组3中的动物在分娩前7周、分娩前5周以及随后再次在分娩前3周肌内接受2ml的疫苗。通过处理在出生后24小时内将来自这些动物的所有同窝幼仔交叉哺育。

数据收集。从出生当天至第5天每日进行腹泻评分。收集所有数据的个体不清楚原始处理分配。在除去当天记录因与腹泻相关的死亡率而从原始同窝幼仔除去的猪，将其在数据组编辑为死亡率/发病率。

数据分析。使用GLM法分析死亡率/发病率和腹泻评分。房间和平等性也包括在模型中。

结果。猪崽死亡率和发病率在于分娩之前接受两剂量的疫苗的组中相较于它们各自的对照对应组有所降低，尽管不显著。然而，在接受1或3剂量的疫苗的组中，不存在差异。腹泻评分对于两剂量接种处理仅在分娩后第1天显著不同。在任何其它时间点上或对于1或3剂量程序在腹泻评分上未注意到其它差异。有趣地，在本研究中，疫苗显示使用两剂量接种程序有降低，使用单或三剂量程序不降低。

表2.利用2剂量接种测量的性能数据

	CON	VACC	P值
				因腹泻引起的死亡率，n	37	23
因腹泻引起的死亡率，％	1.72	1.02	.19
				Fallouts,％	.69	.92	.53

表3.利用2剂量接种的分娩后日子的平均腹泻评分

	CON	VACC	SEM	P值
					第1天	.56	.41	.06	.05
第2天	.87	.84	.07	.77
					第3天	1.01	1.00	.08	.98
第4天	.51	.40	.10	.41
					第5天	.29	.24	.04	.37

表4.利用3剂量接种的分娩后日子的平均腹泻评分

	CON	VACC	SEM	P值
					第1天	.30	.32	.10	.84
第2天	.61	.40	.12	.15
					第3天	.80	.76	.13	.79
第4天	.25	.15	.09	.32
					第5天	.02	.00	.02	.31

实施例5-三重融合轮状病毒C疫苗的产生

概述。如上所述，通过将3个不同的基因(NSP4、VP4和VP6)克隆入3个不同的载体和生长3个不同的大肠杆菌培养物来实现Rota C亚单位疫苗的生产。为了简化该方法，将所有3个基因串联并按读框置于单个质粒载体中，从而使得能够使用单批大肠杆菌培养物进行疫苗生产。该构建体通过将Rota C(分离物12-1260-5)基因克隆进入pNPL2(在N末端上具有按读框连接的GST标记)来进行构建。该三基因融合物(不包括GST标记)具有SEQ ID NO:94中所示的序列。所编码的多蛋白具有SEQ ID NO:95中所示的序列。

材料和方法。按照制造商的方案，使用Qiagen Viral RNA提取试剂盒从临床样品提取RNA。通过使用Nanodrop测量260和280nm处的吸光度来确认RNA的浓度和纯度。如果260/280比率为至少1.7并且RNA的浓度为至少50ng/μl，则RNA合格。扩增(表5中所示的引物)轮状病毒基因，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，通过在DNA凝胶上电泳来确认产物的尺寸(NSP4-300bp、VP4-750bp、VP6-1200bp)，使用nanodrop评估其浓度。

表5.Rota C三重融合引物

将PCR产物克隆至pNPL2内。将所有3种产物同时克隆进入表达载体。如下设置反应，并且在50℃温育15分钟，随后在4℃保持。按照制造商的推荐(Delphi Genetics)，将约5ul的反应产物用于转化CYS21大肠杆菌感受态细胞(Cat#GE-STCB-22)。将包含该质粒的重组大肠杆菌生长在LB培养基中，使用表5中所列的引物连同T7启动子和T7终止子引物(标准自由引物)对质粒DNA进行测序。将序列对齐以产生大的开放阅读框架并验证其准确度；ORF符合读框地包含所有3个基因和GST标记(GST-NSP4-VP4-VP6；约2.9kb)。

表6.三重融合连接反应混合物

标记	体积
		BamH I和Hind III切割的pNPL2(～50ng/ul)	3μl
NSP4PCR产物(～50ng/ul)	0.5μl
		VP4PCR产物(～50ng/ul)	1μl
VP6PCR产物(～50ng/ul)	1.5μl
		5X融合HD克隆混合物(Cat#639646,Clontech)	2μl
不含核酸酶的水	2μl

NSP4-VP4-VP6多蛋白表达分析。通过按照标准方案添加IPTG在大肠杆菌的SE1株中诱导蛋白质表达。将培养液在PAGE凝胶上进行分离以验证融合蛋白的表达(图12)。融合蛋白存在于液体的脲溶性级分内，但不存在于B-per溶液级分内(PAGE，数据未显示)。以1:20和1:40用水稀释脲溶性融合蛋白，在PAGE上进行电泳以进行随后的Western印迹。使用标准方案，以0.1μg/mL的终浓度使用抗GST单克隆抗体(Genscript Cat A00866)探测印迹(图13)。

* * * * * * * *

在已详细地描述了本发明的优选实施方案后，应理解通过上述段落定义的本发明不限于上述描述中所示的特定内容，因为在不背离本发明的精神或范围的情况下，许多明显变化是可能的。

Claims

1.一种免疫组合物，其包含：

a)由C型轮状病毒NSP4、VP4和VP6多肽组成的多肽组合；

b)表面活性剂；

c)油；和

d)药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

2.权利要求1的组合物，其被配制为水包油型乳剂，并且其中所述多肽组合基本上由C型轮状病毒NSP4-VP4-VP6三重融合多肽组成。

3.权利要求2的组合物，其中所述多肽具有SEQ ID NO:95中所示的序列。

4.权利要求3的组合物，其中所述油包含矿物油，所述表面活性剂包含脱水山梨醇单油酸酯。

5.权利要求3的组合物，其中所述多肽与由下述一个或多个序列所编码的多肽相同：SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69或71。

6.权利要求3的组合物，其还包含与除轮状病毒外的病原体相关的至少一种另外的抗原。

7.权利要求6的组合物，其中所述至少一种另外的抗原能够在猪中引发抗猪肺炎支原体、猪环状病毒2型、猪呼吸与生殖综合征病毒、猪流感病毒或其它病原体的免疫反应，所述其它病原体能够感染猪并引起疾病或对疾病的易感性。

8.一种用于产生权利要求1的组合物的方法，包括步骤：

(a)从已知感染有或怀疑感染有一种或多种类型的轮状病毒的动物获得生物样品；

(b)如果感染状态未知，则确定所述动物是否被轮状病毒感染；

(c)从被所述一种或多种类型的轮状病毒感染的动物收获RNA；

(d)使用与NSP4、VP4和VP6基因互补的引物进行逆转录酶PCR；

(e)将来自步骤(d)的PCR产物插入适当的表达载体；

(f)将步骤(e)中产生的载体置于适当的宿主表达系统中；

(g)收获轮状病毒多肽；和

(h)向所述轮状病毒多肽添加任何另外的疫苗组分，从而产生疫苗组合物。

9.权利要求8的方法，其中所述另外的组分选自佐剂、载体、稀释剂和与除轮状病毒外的病原体相关的抗原。

10.权利要求9的方法，其中所述另外的组分为除轮状病毒外的抗原。

11.权利要求9的方法，其中所述另外的组分为能够在猪中引发抗猪肺炎支原体、猪环状病毒2型、猪呼吸与生殖综合征病毒、猪流感病毒或其它病原体的免疫反应的抗原，所述其它病原体能够感染猪并引起疾病和/或对疾病的易感性。

12.权利要求1至7中任一项的组合物在制备用于接种猪的药物中的用途。

13.权利要求12的用途，其中所述猪是分娩前3周至6周的母猪。

14.权利要求13的用途，其中来自所述猪的猪崽相较于来自未接种的母猪的猪崽具有降低的发病率和/或死亡率。