CN104174027A - 肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系及其制备方法和应用，该肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系包括介孔二氧化硅纳米颗粒、以及共价链接于所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面的作为肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体的RGD多肽和作为细胞核靶向配体的核定位信号多肽序列。在静脉注射条件下，该载药体系首先实现肿瘤血管靶向作用，富集在肿瘤组织中，降低正常组织的摄取，降低毒副作用；其次再通过对肿瘤细胞膜的识别作用，增加肿瘤细胞的吞噬量；最后再通过细胞核转运性能，将抗癌药物直接输运至细胞核中，提高有效药物浓度，达到最佳的治疗效果。

Description

肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用纳米生物材料技术领域，涉及一种具有良好生物相容性、高比表面积、均一孔径和药物担载与高效的肿瘤特异性靶向治疗功能的医用靶向药物输运体系及其制备方法和应用。

背景技术

传统治疗肿瘤的药物普遍存在对肿瘤选择性差，毒副作用大等缺点，如何设计出良好的药物输运体系成为近年来的研究热点。介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)由于其优异的药物担载输运、控释性能被认为是非常有应用前景的药物输运载体。大量研究表明，基于MSNs的药物输运体系能有效地提高药物利用率，降低对正常细胞的毒副作用，具有显著的细胞水平抗癌性能。然而，其活体水平对实体肿瘤的消灭作用仍然面对巨大的挑战。其主要原因是，体内生理环境复杂，尤其是在通过静脉注射方式给药条件下，载药体系要面对多种阻碍其在肿瘤组织富集的障碍，比如：血管，细胞膜，核膜等。因此，特异性地将药物输运至肿瘤组织已经成为抗癌纳米医药研究中的最关键策略。靶向药物输运可以确保药物在目标病灶部位的有效富集，将周围健康组织的潜在毒副作用降至最低。开发有效的能够主动靶向识别肿瘤组织，识别肿瘤细胞以及高敏感的亚细胞器的药物输运体系是靶向治疗的关键。

要实现在实体肿瘤中的靶向治疗，首先要解决的问题是如何实现载药体系在血液循环过程中从血管中特异性地渗透肿瘤组织中。目前，主要是通过被动靶向机制，即所谓的高渗透和滞留效应(EPR：enhanced permeability and retention)。然而，EPR效应是基于实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性。其受血压、血液循环时间、NO水平多种因素的影响。所以仅靠EPR效应的被动靶向作用个体差异大，效果不稳定。因此，主动靶向肿瘤血管是肿瘤治疗中首要的步骤。随着“肿瘤生长依赖肿瘤血管”学说的提出，肿瘤新生血管靶向治疗成为一种新型的、颇有潜力的提高肿瘤疗效的途径。血管生成对肿瘤生长至关重要，而且血管与血液直接接触，因此实现对肿瘤血管的主动靶向很有可能提高治疗效果。研究表明，整合素α_vβ₃在新生肿瘤血管内皮细胞表面具有高表达，而在正常血管静止的内皮细胞膜表面则欠表达。这一特性使得整合素α_vβ₃成为肿瘤血管靶向的理想靶点。而环状五肽c(RGDyC)含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)可与整合素α_vβ₃特异性结合，从而抑制肿瘤生长和新生血管形成。自1984年Pierschbacher首次报道其为细胞识别位点以来，RGD肽及其衍生物就成为众多领域研究的热点。

除了在血管水平基础的靶向外，应该设计能靶向识别细胞膜表面受体的模块化重组的输运体系，因为载药体系进入肿瘤组织后，细胞膜是其进一步被肿瘤细胞摄取最大的障碍。为了实现这一目标，研究人员作了大量的研究，通过使用特定靶向分子，如配体、抗体等修饰输运载体，开发对肿瘤细胞具有较高亲和性的高效药物输运体系。值得一提的是，细胞膜表面整合素α_vβ₃高表达也是多种恶性肿瘤(如乳腺癌，前列腺癌、卵巢癌、胶质母细胞癌和恶性黑色素瘤等)的特质，因此，RGD多肽嫁接的药物载体，如MSNs-RGD能大大增强药效。

但是，细胞质通常不是药物最终目的地，因为绝大部分抗癌药物，如阿霉素，是通过诱导活化DNA的氧化损伤和抑制拓扑异构酶II以抑制核内DNA复制来达到抑制细胞生长繁殖的抗癌作用，其作用靶点位于细胞核中。纳米载药体系在正确的位置释放药物对维持局部药物浓度，实现增强药效非常重要。因此，发展能直接将药物输运至更脆弱敏感的亚细胞器，尤其是细胞核，对大幅增强实体肿瘤疗效具有非常大的意义。有效的细胞核输运最后的障碍是细胞核核膜，细胞质与细胞核的所有物质交换都通过分布在核膜上的核孔进行，而外来异质结构必须通过核定位信号(NLS)与核孔产生识别作用才有可能进入细胞核中。前期工作表明，HIV激活因子TAT多肽是有效的NLS，可以高效介导粒径合适的纳米颗粒进入细胞核中。

发明内容

由以上论述可知，为了确保有效的静脉给药和肿瘤的靶向特异性治疗，发展多层次的靶向策略是非常必要的。因此，本发明的目的在于提供一种具有良好的生物相容性、高性能抑制肿瘤生长的介孔二氧化硅基药物输运体系及其制备方法和应用，从而在静脉注射条件下实现肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核全程靶向药物输运，克服抗癌药物巨大的毒副作用，为实现临床特异性肿瘤高效治疗提供性能更好更安全的药物输运体系。

一方面，本发明提供一种肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系，包括介孔二氧化硅纳米颗粒、以及共价链接于所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面的作为肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体的RGD多肽(即c(RGDyC)：cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys))和作为细胞核靶向配体的核定位信号多肽序列。

本发明在作为药物载体的介孔二氧化硅纳米颗粒的表面同时嫁接肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体和细胞核靶向配体。首先，利用肿瘤组织的新生脉管系统，通过RGD靶向识别肿瘤血管，增强肿瘤组织的摄取和滞留量。其次，通过RGD对肿瘤细胞膜的靶向结合，促进肿瘤细胞内吞。最后，通过核定位信号多肽序列对细胞核的靶向作用，将药物直接转运至肿瘤高敏的细胞核中，提高细胞核中有效药物浓度。这一连续靶向给药策略有望实现静脉给药下的全程靶向，将最大程度地增强癌细胞死亡。

较佳地，所述核定位信号多肽序列为TAT多肽、SV40T抗原、腺病毒等。

较佳地，在所述RGD多肽与所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面之间还链接有PEG。通过先在介孔二氧化硅纳米颗粒表面链接PEG，再在PEG的链端链接RGD多肽，从而可以提高纳米颗粒的生物相容性，降低毒副作用并且提高其血液循环性能，促进纳米颗粒在肿瘤组织中的分布。

较佳地，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为20～50nm。通过使介孔二氧化硅纳米颗粒具有合适的粒径，从而可以链接足够的肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体和细胞核靶向配体，同时使该药物输运体系能够穿越细胞核核膜上的核孔，进入细胞核。另外，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的孔径可为2～20nm。

另一方面，本发明提供上述肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系的制备方法，包括以下步骤：

(1)将介孔二氧化硅纳米颗粒与末端带氨基的硅烷偶联剂反应以得到表面带氨基的介孔二氧化硅纳米颗粒；

(2)将所得的表面带氨基的介孔二氧化硅纳米颗粒与核定位信号多肽序列和NHS-PEG-MAL反应以得到表面嫁接有核定位信号多肽序列和PEG链的介孔二氧化硅纳米颗粒；

(3)将所得的表面嫁接有核定位信号多肽序列和PEG链的介孔二氧化硅纳米颗粒与RGD多肽反应以在PEG链端嫁接RGD多肽，从而得到双重肽链改性的介孔二氧化硅基载药体系。

本发明通过多步多肽改性技术在介孔二氧化硅纳米材料的表面成功嫁接靶向配体，把肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体RGD多肽和细胞核靶向配体共价链接在高度分散的超小介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)表面，合成工艺简单易行、无任何污染、产量高、效率高、极易工业化生产。所制得的纳米材料具有非常好的分散性与稳定性，在疾病的诊断和治疗中具有广泛的应用前景。

较佳地，步骤(1)中，所述末端带氨基的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-2-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷等氨基硅烷偶联剂。

较佳地，步骤(2)中，所述核定位信号多肽序列与所述NHS-PEG-MAL的摩尔比为(1～100)：1。

再一方面，本发明提供上述肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系在制备靶向抗癌药物中的应用。

较佳地，将负电性抗癌药物通过与所述连续靶向药物输运体系中的介孔二氧化硅颗粒内壁的静电吸附作用担载进介孔孔道中。

较佳地，作用位点位于细胞核中的抗癌药物包括阿霉素、顺铂、喜树碱以及一些光敏剂，如二氢卟吩(Chorin e6)、锌酞菁、卟啉等。

本发明通过一种简单的表面多肽改性技术把肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体RGD多肽和细胞核靶向配体TAT多肽嫁接在MSNs表面，借助于MSNs大的比表面积、高的孔容和均匀孔径实现抗癌药物的高效担载。本发明中，两种多肽(肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体和细胞核靶向配体)的嫁接赋予作为药物载体的介孔二氧化硅颗粒癌细胞识别能力以及细胞核穿越能力，从而极大地提高了靶向效率，增强了化疗效果，降低了毒副作用。体外细胞实验表明该药物输运体系可以有效的实现特异性癌细胞细胞核靶向药物输运，提高细胞核中有效药物浓度，提高药效。重要的是，该连续靶向药物输运体系在活体水平显示出了高效抗肿瘤效果。在静脉注射条件下，该载药体系首先实现肿瘤血管靶向作用，富集在肿瘤组织中，降低正常组织的摄取，降低毒副作用；其次再通过对肿瘤细胞膜的识别作用，增加肿瘤细胞的吞噬量；最后再通过细胞核转运性能，将抗癌药物直接输运至细胞核中，提高有效药物浓度，达到最佳的治疗效果。而且，本发明合成工艺简单易行、无任何污染(无污染物排放)、产量高、效率高、性能优异，得到的连续靶向药物输运体系具有优异的抗癌性能，且对正常组织不具明显的毒副作用，是极具应用前景的药物传输载体，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明的连续靶向药物输运体系的合成示意图；

图2是本发明的连续靶向药物输运体系的制备流程图；

图3是本发明一个示例中连续靶向载体合成过程每步产物的TEM照片，其中，b)～i)分别为：b)MSNs,c)MSNs-NH₂,d)MSNs-PEG,e)MSNs-RGD,f)MSNs-TAT,g)MSNs-RGD/TAT,h)低倍MSNs,i)高倍MSNs；

图4是本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT的紫外可见光谱；

图5(a)是本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT的细胞靶向性的体外定性表征的共聚焦显微图片；

图5(b)是本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT的细胞靶向性的体外定量表征的Si元素在细胞质与细胞核中的分布；

图6(a)是本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT通过尾静脉注射至荷瘤鼠体内24小时后的体分布；

图6(b)是本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT通过尾静脉注射至荷瘤鼠体内48小时后的体分布；

图6(c)是本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT在肿瘤组织细胞核中的分布；

图7(a)是将本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT负载抗癌药物阿霉素(DOX)后在细胞中的共聚焦显微图片，其中的图(i)共聚焦显微图片，图(ii)为与其对应的线扫描图；图中a₁-a₅分别为:a₁)游离DOX，a₂)DOXMSNs，a₃)DOXMSNs-RGD,a₄)DOXMSNs-TAT,a₅)DOXMSNs-RGD/TAT；

图7(b)是将本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT负载抗癌药物阿霉素(DOX)后在细胞质与细胞核中的分布的定量表征；

图8是将本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT负载抗癌药物阿霉素(DOX)后在肿瘤组织中的分布图；

图9(a)是将本发明一个示例的DOXMSNs-RGD/TAT在不同药物浓度下与细胞共培养24小时后细胞存活率；

图9(b)是将本发明一个示例的DOXMSNs-RGD/TAT在不同药物浓度下与细胞共培养48小时后细胞存活率；

图10(a)是荷瘤鼠经过本发明一个示例的DOXMSNs-RGD/TAT治疗后肿瘤体积的变化曲线；

图10(b)为上述肿瘤变化的数码照片，其中1-6分别代表对照组、游离DOX、DOXMSNs、DOXMSNs-RGD、DOXMSNs-TAT、DOXMSNs-RGD/TAT。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明一方面提供一种肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系，该连续靶向药物输运体系以介孔二氧化硅纳米颗粒为载药基体，在其表面嫁接肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体和细胞核靶向配体。两种多肽的嫁接赋予该载体癌细胞识别能力以及细胞核穿越能力，从而极大地提高了靶向效率，增强了化疗效果，降低了毒副作用。其中，肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体可以是能与肿瘤血管内皮细胞表面及癌细胞表面的整合素α_vβ₃特异性结合的多肽，例如RGD多肽。细胞核靶向配体可为核定位信号多肽序列，包括但不限于TAT多肽、SV40T抗原、腺病毒等。

图1示出本发明的连续靶向药物输运体系的合成示意图，如图1中的最终产物所示，在本发明的连续靶向药物输运体系中，细胞核靶向配体可以直接嫁接于介孔二氧化硅纳米颗粒的表面，而肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体可以通过PEG链嫁接于介孔二氧化硅纳米颗粒的表面。通过具有PEG，可以提高纳米颗粒的生物相容性，降低毒副作用并且提高其血液循环性能，促进纳米颗粒在肿瘤组织中的分布。

各配体与介孔二氧化硅纳米颗粒表面及PEG链之间可通过共价键连接。具体地，可以在介孔二氧化硅纳米颗粒表面引入氨基，细胞核靶向配体与该氨基形成酰胺键而链接于介孔二氧化硅纳米颗粒表面。PEG链可以通过连接于其一端的与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与介孔二氧化硅纳米颗粒表面的氨基的反应所形成的共价键而链接于介孔二氧化硅纳米颗粒表面，并通过连接于其另一端的马来酰亚胺(MAL)与RGD多肽上巯基反应所形成的共价键而链接于PEG的末端。

作为药物载体的介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径可为20～50nm。这样，既可以链接足够的肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体和细胞核靶向配体，又可以穿越核膜上的核孔，使该药物输运体系能够进入细胞核。

又，介孔二氧化硅纳米颗粒的孔径可为2～20nm。这样不仅可以担载小分子的抗癌药物，也可以担载大尺寸的基因等于介孔孔道中。

本发明还提供上述肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系的制备方法。图1示出本发明的连续靶向药物输运体系的合成示意图，图2示出本发明的连续靶向药物输运体系的制备流程图。如图1、2所示，本发明的制备方法主要包括：介孔二氧化硅纳米颗的表面氨基化、核靶向配体的嫁接、以及血管/细胞膜靶向配体的嫁接。其中在嫁接核靶向配体时，可以同时进行PEG链的嫁接，以节省步骤，简化流程。但是应理解，也可以是先进行核靶向配体的嫁接，再进行PEG链的嫁接；或者是先进行PEG链的嫁接，再进行核靶向配体的嫁接。另外，也可以先嫁接血管/细胞膜靶向配体，再嫁接核靶向配体。制得连续靶向药物输运体系后，还可以在其中担载抗癌药物，得到双重肽链改性的介孔二氧化硅基载药体系。

具体地，如图2所示，整个材料的制备过程可以细分为四个步骤，例举如下：首先采用表面活性剂导向、碱(或酸)催化和硅源缩聚-聚合过程制备粒径可控(约30nm)、分散性好的介孔SiO₂纳米颗粒(步骤1)。由于介孔SiO₂纳米颗粒表面具有丰富的硅羟基悬键，去除表面活性剂之后，选择一种末端带氨基的硅烷偶联剂(如3-氨丙基三乙氧基硅烷-APTES、3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-2-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷等氨基硅烷偶联剂)，在一定的温度下和介孔SiO₂纳米粒子反应一段时间后，离心出外表面带氨基的介孔SiO₂纳米颗粒(步骤2)。用去离子水充分洗涤后，通过氨基与羧基的酰胺化反应嫁接TAT多肽，通过氨基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的反应嫁接NHS-PEG₁₅₀₀-MAL(步骤3)。进一步充分洗涤后，通过马来酰亚胺与RGD多肽上巯基反应嫁接RGD多肽(步骤4)。再通过介孔孔道与抗癌药物的静电作用实现药物高效担载，从而得到双重肽链改性的介孔二氧化硅基载药体系(步骤5)。本发明中，作用位点位于细胞核中的抗癌药物包括但不限于阿霉素、顺铂、喜树碱以及一些光敏剂，如二氢卟吩(Chorin e6)、锌酞菁、卟啉等。

上述例举了通过表面活性剂和溶胶-凝胶法制备介孔SiO₂纳米颗粒，但应理解，本发明并不限定介孔SiO₂纳米颗粒的制备方法，只要能得到具有合适粒径和孔径的介孔SiO₂纳米颗粒即可。

本发明提供一种操作简单、环境友好的方法合成出具有良好分散性、良好生物相容性、粒径均一可控、外表面具有核定位信号多肽序列(例如TAT)和RGD多肽的介孔SiO₂纳米粒子。纳米粒子的直径为20～50nm可控，壁上的孔径为2～20nm可控。以下，以双重肽链改性的介孔二氧化硅基载药体系(DOXMSNs-RGD/TAT)为例，说明其制备方法的一个示例。

(1)合成小粒径介孔SiO₂纳米粒子：该合成过程以去离子水作为溶剂、三乙醇胺作为碱催化剂，在一定的温度下反应一定的时间，得到粒径可控、单分散的介孔SiO₂纳米粒子。大致过程如下：一定量的三乙醇胺用去离子水配成溶液，加入一定量的表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)溶液，在95℃下剧烈搅拌一段时间后，逐滴加入一定量的正硅酸乙酯(TEOS)。磁性搅拌一段时间后，可以观察到溶液呈乳白色状(MSNs)。将产物收集后充分洗涤去除未反应的物质。

(2)介孔SiO₂纳米粒子表面氨基改性：该过程以乙醇作为溶剂进行化学反应，在一定的温度下反应一定的时间后，可以将带氨基的硅烷偶联剂嫁接到介孔SiO₂纳米粒子表面(得到MSNs-NH₂)。大致过程如下：一定量的介孔SiO₂纳米粒子均匀分散在乙醇中，在一定的温度下搅拌一段时间。然后加入一定量的APTES，回流一定时间后离心收集产物，无水乙醇充分洗涤后得到氨基化的介孔SiO₂纳米粒子。

(3)氨基化介孔SiO₂纳米粒子表面TAT多肽改性：将氨基化的介孔SiO₂纳米粒子均匀分散在去离子水中，加入一定量的EDC/NHS激活的TAT多肽和NHS-PEG₁₅₀₀-MAL，在一定温度下反应一定时间得到表面嫁接TAT多肽和PEG链的介孔SiO₂纳米粒子。其中所加入的TAT多肽和NHS-PEG₁₅₀₀-MAL的摩尔比可为(1～100):1。此处采用EDC/NHS作为缩合剂，但本发明不限于此，其它合适的缩合剂也是可以适用的。另外，此处在PEG的两端分别引入NHS和MAL进行双功能化，但本发明不限于此，也可以引入其它的官能团，只要能使PEG在其一端与氨基反应形成共价键，并在其另一端与巯基反应形成共价键即可。又，PEG也不限于PEG₁₅₀₀，也可以使用PEG₂₀₀₀、PEG₃₅₀₀等。

(4)介孔SiO₂纳米粒子表面RGD多肽改性：将表面具有TAT多肽和PEG链的介孔SiO₂纳米粒子均匀分散在去离子水中，加入一定量的RGD多肽，在一定温度下反应一定时间，在PEG链端嫁接RGD多肽，得到表面同时嫁接TAT多肽和RGD多肽的介孔SiO₂纳米粒子(MSNs-RGD/TAT)。

(5)模型抗癌药物担载：选择带负电的阿霉素(DOX:doxrubicin)为模型药物，将一定量的MSNs-RGD/TAT分散一定量的DOX的PBS溶液中，在一定温度下磁力搅拌一定时间后得到双重肽链改性的介孔二氧化硅基载药体系(DOXMSNs-RGD/TAT)。

在上述制备方法中，首先通过表面活性剂为结构导向剂、碱为催化剂，通过溶胶-凝胶过程制备出粒径在30nm左右，孔径为2.7nm，具有丰富孔道结构的的介孔SiO₂纳米粒子(MSNs)。接着通过纳米颗粒表面丰富的硅羟基悬键与硅烷偶联剂之间的反应，将氨基化的硅烷偶联剂均匀的嫁接到纳米颗粒表面。通过氨基与TAT多肽和双功能团PEG的酰胺化反应将TAT多肽和PEG成功嫁接到纳米颗粒外表面。通过进一步RGD多肽的巯基和PEG链端的马来酰亚胺的反应将RGD多肽嫁接到纳米颗粒外表面，形成双重多肽共嫁接改性的功能纳米载体。最后，通过抗癌药物与介孔孔道的静电吸附作用，实现药物的高效担载，得到具有连续靶向功能的药物输运体系，这种材料是一种新型的纳米治疗剂。

图3示出在本发明的一个示例的连续靶向载体合成过程(即小粒径MCM-41型介孔SiO₂纳米粒子(MSNs)经过硅烷偶联剂APTES进行表面氨基化，然后逐步嫁接细胞核靶向配体TAT多肽和肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体RGD多肽，得到具有连续靶向功能的药物载体MSNs-RGD/TAT)中的每步产物的TEM照片。从中可以看出，每步合成的产物均具有良好的分散性。

图4示出MSNs-RGD/TAT的紫外可见光谱。从图中可以看出，MSNs-RGD/TAT同时具有TAT和RGD多肽分别位于495nm和275nm的特征吸收峰，证明了这两种多肽的成功嫁接。

(生物性能测试)

对本发明的MSNs-RGD/TAT以及担载有盐酸阿霉素的连续靶向载体MSNs-RGD/TAT(DOXMSNs-RGD/TAT)进行生物性能测试，并分析其结果。

1、双重肽链改性的MSNs-RGD/TAT的靶向性能测试：

1)体外定性表征：首先将FITC标记好的MSNs-RGD/TAT分散到细胞培养基中(100μg/mL)。再将细胞接种到共聚焦显微镜专用培养皿中，待细胞密度长到60％-70％时，去掉培养基，加入含有MSNs-RGD/TAT纳米粒子的细胞培养基再共培养24h。去掉培养基，用PBS溶液尽量清洗掉没有被细胞吞噬的纳米粒子。最后用DAPI试剂染细胞核，转移到共聚焦显微镜下观察。

2)体外定量表征：将首先将FITC标记好的MSNs-RGD/TAT分散到细胞培养基中(100μg/mL)。再将细胞接种到10cm的培养皿中，待细胞密度长到60％-70％时，去掉培养基，加入含有MSNs-RGD/TAT纳米粒子的细胞培养基再共培养24h。去掉培养基，用PBS溶液尽量清洗掉没有被细胞吞噬的纳米粒子。然后用0.25％的胰酶消化细胞，离心收集细胞。接着加入3mL细胞裂解液，在超声条件下裂解细胞。最后通过ICP-AES测定细胞中Si的含量。为了测定细胞核中Si含量，与上述相同的培养过程之后，胰酶消化，离心收集细胞。然后以5×10⁶cells/mL的浓度加入细胞核分离液(NaCl(5.845g)、EDTA(0.292g)、Triton X-100(10g)溶解在Tris buffer(1L)中，混合搅匀)。在4℃下静置10min，以800rpm离心15min，即得到细胞核。然后加入细胞裂解液裂解细胞，再通过ICP-AES测定细胞核中Si含量。而细胞中总的Si含量与细胞核中Si含量之差即为细胞质中Si的含量。

3)体内表征：将连续靶向载体MSNs-RGD/TAT分散到PBS中(100μg/mL)，通过尾静脉注射到荷瘤鼠体内(剂量：20mg kg^-1)。24h后将小鼠断颈处死并取出肿瘤组织以及主要脏器(心肝脾肺肾)，微波消融后用IPC-AES定量组织中的Si含量。

图5(a)和图5(b)示出MSNs-RGD/TAT的细胞靶向性的体外表征。其中图5(a)是定性表征的共聚焦显微图片，细胞核被DAPI染色并呈现出蓝色(图5(a)左上角小图中的点)。MSNs-RGD/TAT被FITC标记呈现出绿色(图5(a)左小角小图中的点)。从图片中可以看出绿色的荧光出现在细胞质中，证明MSNs-RGD/TAT纳米粒子可以成功靶向细胞核。图5(b)是定量表征的Si元素在细胞质与细胞核中的分布。从图中，可以进一步证明MSNs-RGD/TAT能在RGD多肽对HeLa细胞膜表面整合素α_vβ₃的特异性识别作用下实现高效的细胞靶向作用，其整个细胞中的Si含量大大提高；进而，在核靶向配体TAT多肽作用下，MSNs-RGD/TAT能穿越细胞核核膜，实现在细胞核的富集，其细胞核中Si含量远大于其他组别，显示了MSNs-RGD/TAT优异的癌细胞靶向功能。

图6(a)～图6(c)示出本发明一个示例的MSNs-RGD/TAT的细胞靶向性的体内表征。其中图6(a)与图6(b)分别为该MSNs-RGD/TAT通过尾静脉注射至荷瘤鼠体内24小时和48小时后的体分布，从图中可以看出，MSNs-RGD/TAT纳米颗粒在连续靶向作用下高效富集在肿瘤组织中，有效提高了特异性，降低了正常器官(心肝脾肺肾)对纳米颗粒的非特异性摄取，从而有望降低对健康组织的毒副作用。图6(c)是MSNs-RGD/TAT在肿瘤组织细胞核中的分布，由此可见，MSNs-RGD/TAT能够在TAT作用下高效穿越细胞核核膜，富集在细胞核中，其Si含量远高于其他组别，在活体水平实现了细胞核靶向作用。

2、DOXMSNs-RGD/TAT的靶向药物输运性能测试：

1)体外定性表征：将包覆了盐酸阿霉素(DOX)的MSNs-RGD/TAT(DOXMSNs-RGD/TAT)分散到细胞培养液中(阿霉素浓度：1μg/mL)。再将细胞接种到共聚焦培养皿中，直至细胞密度长至80-90％，去掉细胞培养液，加入分散了DOXMSNs-RGD/TAT的细胞培养液共培养4h。再用DAPI染细胞核，最后转移到共聚焦显微镜下观察。

2)体外定量表征：将包覆了盐酸阿霉素(DOX)的MSNs-RGD/TAT(DOXMSNs-RGD/TAT)分散到细胞培养液中(阿霉素浓度：5.6μg/mL)。再将细胞接种到10cm的培养皿中，直至细胞密度长至80-90％，去掉细胞培养液，加入分散了DOXMSNs-RGD/TAT的细胞培养液共培养24h。收集细胞，分离细胞核后通过标准曲线法测定细胞核中抗癌药物DOX的量。

3)体内表征：将包覆了盐酸阿霉素(DOX)的MSNs-RGD/TAT(DOXMSNs-RGD/TAT)分散到PBS溶液中，通过尾静脉注射至荷瘤鼠体内。24h后，将小鼠断颈处死并取出肿瘤组织，用FITC-CD31进行肿瘤血管染色后在荧光显微镜下观察药物在肿瘤组织中的分布。

图7(a)和图7(b)示出将MSNs-RGD/TAT负载抗癌药物阿霉素(DOX)后在细胞中的分布。图7(a)中，蓝色为DAPI染色细胞核，红色为抗癌药物DOX。其中a₁-a₅分别为:a₁)游离DOX，a₂)DOXMSNs，a₃)DOXMSNs-RGD,a₄)DOXMSNs-TAT,a₅)DOXMSNs-RGD/TAT。从图中可以显著地看出图7(a)的a₅中，药物的红色荧光与细胞核的蓝色荧光重叠，说明DOXMSNs-RGD/TAT可以有效地进行细胞核靶向药物输运。进一步定量细胞质与细胞核中DOX的量。图7(b)表明，游离DOX与HeLa细胞共培养24h仍只有少量(54.6ng Dox/106cells)分布在细胞核中。由于RGD对HeLa细胞的主动靶向作用，HeLa细胞与DOXMSNs-RGD共培养后细胞质中的药物量(554ng DOX/10⁶)相对于游离DOX有很大程度的提高，但细胞核中药物量(86.5ng DOX/10⁶cells)只有微弱提高。由于TAT多肽介导的主动细胞核靶向作用，能够有效实现DOXMSNs-TAT的细胞核转运，细胞核中DOX药物浓度大大提高(506.7ng DOX/10⁶cells)。而在RGD和TAT多肽共同作用下，细胞核中药物浓度增加到765.5ng DOX/10⁶cells，是游离DOX的14倍，显示了连续靶向药物传输体系优异的细胞核靶向药物输运性能。

图8示出将MSNs-RGD/TAT负载抗癌药物阿霉素(DOX)后在肿瘤组织中的分布。FITC-CD31标记的肿瘤血管呈现绿色(图中较亮的颜色)，抗癌药物DOX呈现红色(图中较暗的颜色)。由图中可以看出，连续靶向载药体系能够在活体中实现高效的连续靶向药物输运，药物分布范围广，从血管中成功渗透到肿瘤组织中，体现了肿瘤血管-肿瘤细胞-肿瘤细胞核连续靶向药物输运体系的独特的药物输运性能。

3、连续靶向载药体系(DOXMSNs-RGD/TAT)的高效抗癌性能

1)体外表征：将包覆了盐酸阿霉素(DOX)的MSNs-RGD/TAT(DOXMSNs-RGD/TAT)分散到细胞培养液中。在不同DOX浓度下分别培养24h和48h后，检测细胞存活率。

2)体内表征：将DOXMSNs-RGD/TAT(剂量：2mg kg^-1)通过静脉注射进荷瘤小鼠体内，每隔一天测量肿瘤体积，称量小鼠体重。

图9(a)和图9(b)示出将DOXMSNs-RGD/TAT在不同药物浓度下与细胞共培养24h和48h后细胞存活率。由图中可以明显看出，DOXMSNs-RGD/TAT具有最强的细胞毒性，其与细胞作用后，细胞存活率远低于对照组。

图10(a)和图10(b)示出DOXMSNs-RGD/TAT在活体水平的化疗效果评价，其中图10(a)为荷瘤鼠经过治疗后肿瘤体积的变化曲线，图10(b)为肿瘤变化的数码照片。可以看出，经过连续靶向药物输运体系作用后，肿瘤生长得到了明显的抑制，其肿瘤体积减小了89％达到了非常好的治疗效果。

本发明采用多步的表面多肽改性技术，把肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体RGD多肽和细胞核靶向配体TAT多肽共价链接在高度分散的超小介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)表面，借助于MSNs大的比表面积、高的孔容和均一的孔径实现抗癌药物的高效担载。将该载药体系尾静脉注射进荷瘤鼠体内后，载药体系能主动实现在肿瘤组织的富集，并且进一步将药物输运至细胞核中。通过重复给药，可有效缩减肿瘤大小，达到高效清除恶性肿瘤的目的。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

合成小粒径MCM-41型介孔SiO₂纳米粒子(MSNs)：2g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)溶于20g去离子水中。待溶液变澄清后，加入0.8g三乙醇胺(TEB)，95℃条件下剧烈搅拌。待溶液变澄清后，逐滴加入1.5mL的正硅酸乙酯(TEOS)，并连续搅拌1h。产物冷却至室温后，加入无水乙醇，使产物絮沉，离心收集产物并用无水乙醇洗涤3次；

利用盐酸的乙醇溶液萃取介孔孔道中的表面活性剂：称取100mg的没有除去表面活性剂的介孔SiO₂纳米颗粒(MSNs)，超声分散在盐酸的乙醇溶液(10％)中，在78℃条件下回流6h。最后，离心收集产物，用无水乙醇充分洗涤。重复此萃取过程数次，直至CTAC被完全去除。

实施例2

MSNs表面氨基改性：称取实施例1中MSNs50mg，超声分散在100mL无水乙醇中，78℃恒温强力搅拌，然后加入50μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，回流4h后离心，无水乙醇洗涤，最后离心收集，得到氨基改性的MSNs。

实施例3

TAT多肽嫁接：取0.2mol(412.4mg)TAT多肽和0.02mol NHS-PEG₁₅₀₀-MAL(30mg)，溶解在20mL去离子水中，然后分别加入0.2mol(38.34mg)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.5mol(57.54mg)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌15min。然后取实施例2中氨基化的MSNs 20mg，超声分散于上述TAT多肽溶液中。室温搅拌反应24h后离心收集产物MSNs-TAT/PEG。

实施例4

RGD多肽嫁接：称取实施例3中产物20mg，超声分散于20mL去离子水中。然后加入RGD多肽0.2mol(118.9mg)，室温搅拌反应24h后离心收集产物，用去离子水充分洗涤得到产物MSNs-RGD/TAT。

上述实施例2-4中每步的产物的TEM照片参见图3中的b)-i)。从中可以看出，每步合成的产物均具有良好的分散性。最终产物MSNs-RGD/TAT的紫外可见光谱参见图4。从图中可以看出，MSNs-RGD/TAT同时具有TAT和RGD多肽分别位于495nm和275nm的特征吸收峰，证明了这两种多肽的成功嫁接。

Claims (10)

1.一种肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系，其特征在于，包括介孔二氧化硅纳米颗粒、以及共价链接于所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面的作为肿瘤血管/肿瘤细胞膜靶向配体的RGD多肽和作为细胞核靶向配体的核定位信号多肽序列。

2.根据权利要求1所述的肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系，其特征在于，所述核定位信号多肽序列为TAT多肽、SV40T抗原、和/或腺病毒。

3.根据权利要求1或2所述的肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系，其特征在于，在所述RGD多肽与所述介孔二氧化硅纳米颗粒表面之间还链接有PEG。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为20～50 nm，孔径为2～20nm。

5.一种权利要求1至4中任一项所述的肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将介孔二氧化硅纳米颗粒与末端带氨基的硅烷偶联剂反应以得到表面带氨基的介孔二氧化硅纳米颗粒；

（2）将所得的表面带氨基的介孔二氧化硅纳米颗粒与核定位信号多肽序列和NHS-PEG-MAL反应以得到表面嫁接有核定位信号多肽序列和PEG链的介孔二氧化硅纳米颗粒；

（3）将所得的表面嫁接有核定位信号多肽序列和PEG链的介孔二氧化硅纳米颗粒与RGD多肽反应以在PEG链端嫁接RGD多肽，从而得到双重肽链改性的介孔二氧化硅基载药体系。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述末端带氨基的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、和/或N-2-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述核定位信号多肽序列与所述NHS-PEG-MAL的摩尔比为（1～100）:1。

8.一种权利要求1至4中任一项所述的肿瘤血管-肿瘤细胞膜-细胞核连续靶向药物输运体系在制备靶向抗癌药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将负电性抗癌药物通过与所述连续靶向药物输运体系中的介孔二氧化硅颗粒内壁的静电吸附作用担载进介孔孔道中。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，作用位点位于细胞核中的抗癌药物包括阿霉素、顺铂、喜树碱以及光敏剂，所述光敏剂包括二氢卟吩（Chorin e6）、锌酞菁、和/或卟啉。