CN109456927A

CN109456927A - 一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN109456927A
Application number: CN201811354253.3A
Authority: CN
Inventors: 张汝兵; 咸漠; 孙超; 刘炜; 曹玉锦
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2019-03-12

Abstract

一种高产2,4‑二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在2,4‑二乙酰基间苯三酚生产的工程菌株中整合编码多重抗性因子的基因marA和乙酰辅酶A羧化酶基因ACC，提高了2,4‑二乙酰基间苯三酚的产量。本发明可用于工业化生产2,4‑二乙酰基间苯三酚。

Description

一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)是由多种荧光假单胞菌产生的酚类次生代谢产物，是一种光谱性抗生素，能防治多种植物病害。其分子结构简单，可以通过3分子乙酰辅酶A和1分子丙二酰CoA缩合成前单乙酰基间苯三酚MAPG，然后MAPG通过转乙酰基作用生成DAPG，对于多种植物病原菌有抑制作用，包括甜菜猝倒病、小麦全蚀病自然衰退、烟草黑根腐病等。

Bangear与Tomashow在1999年解析了菌株Pseudomnas fluorescens Q2-87中负责2,4-DAPG合成的基因簇。PhlD能够催化小分子底物碳酰CoA聚酮缩合形成长链及长链环化、苯环乙酰化过程中的一系列反应。而phlACB则催化间苯三酚的乙酰基化形成MAPG(2-乙酰基间苯三酚)和2,4-DAPG。phlE基因与金黄色葡萄球菌的norA基因同源性较高，含有跨膜结构域，可能编码一个膜通透酶，与2,4-DAPG代谢产生的有害物质的跨膜转运相关；PhlF蛋白能够阻遏PhlACB的表达，过量表达PhlF能够降低荧光假单胞菌的2,4-DAPG水平。目前2,4-DAPG的合成法包括化学合成和生物合成，其中生物法主要通过荧光假单胞菌合成。化学合成的条件严苛，耗能大，污染严重，而生物法合成由于污染小、原料可再生等优势越来越受到重视。生物法合成2,4-DAPG的研究具有重要的科学和应用价值。但是现有技术中合成2,4-DAPG的产量很低，难以用于工业生产。需要进一步对工程菌株进行基因改造，以期提高2,4-DAPG的合成能力。

发明内容

针对目前生物合成方法获得的2,4-DAPG产量低的问题，本发明通过整合2,4-DAPG合成相关基因phlD、phlACB、phlE以及编码多重抗性因子的基因marA和编码编码乙酰辅酶A羧化酶的acc基因，获得重组细胞，所述重组细胞能够提高2,4-二乙酰基间苯三酚在大肠杆菌中的合成能力。

本发明提供了一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，所述重组菌过表达聚酮合成酶基因phlD、2,4-二乙酰基间苯三酚合成酶基因phlACB、外排蛋白phlE基因以及编码多重抗性因子的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶的acc基因，出发菌株为大肠杆菌。

优选地，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

进一步地限定，所述基因phlD、phlACB、phlE，均来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens CHA0，DSM 19095^T)，或者为来源于其它生物体，和这些基因具有相同或相似功能的核酸序列；所述marA基因来源于大肠杆菌，Genebank ID：6060688，或者为和marA同源性超过70％的核酸序列；或者所述marA基因来源于其它生物体，和marA基因同源性低于70％，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；所述乙酰CoA羧化酶基因acc来源于大肠杆菌，其中，亚基accA的Genebank ID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083，或者为和acc基因同源性超过70％的核酸序列；或者所述乙酰CoA羧化酶acc基因来源于其它生物体，和acc基因同源性低于70％，但和acc具有相同或相似功能的核苷酸序列。

更进一步地限定，所述phlD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；phlACB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；phlE基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；marA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了上述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌的构建方法，步骤如下：

1)制备含有基因phlD、phlACB、phlE和多重抗性激活因子marA的重组质粒，记为p-phlDACBE/marA；

2)将步骤1)所得的重组质粒和pA-accADBC重组质粒导入到宿主菌中获得重组菌，所述宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，步骤1)中所述重组质粒p-phlDACBE/marA的构建方法如下：

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlD基因，所用正向引物序列phlD-F，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，反向引物phlD-R，核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示；

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlACB基因，所用正向引物序列phlACB-F，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，反向引物phlACB-R，核苷酸序列如SEQID No.8所示；

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlE基因，所用正向引物序列phlE-F，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，反向引物phlE-R，核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示；

以E.coli基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得marA基因，所用正向引物序列marA-F，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，反向引物marA-R，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

以pET28a(+)为载体，通过酶切连接的方式将上述phlD基因、phlACB基因、phlE基因和多重抗性激活因子marA基因，构建到pET28a(+)载体上，获得重组质粒pET28a-phlDACBE/marA。

本发明还提供了所述的重组菌在提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量中的应用。

进一步地限定，将所述重组菌经发酵培养基培养后，再经IPTG诱导表达，获得2,4-二乙酰基间苯三酚。

更进一步地限定，将重组菌接种到M9液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导表达。

更进一步地限定，在所述加入0.25mM IPTG后，将重组菌于30℃、180rpm继续培养12h至发酵结束。

有益效果

间苯三酚是生物合成2,4-DAPG的前体物质。多重抗性激活因子marA基因可以增强大肠杆菌对2,4-DAPG及间苯三酚的耐受性，acc基因可提高间苯三酚产量，本发明将重组质粒pET28a-phlDACBE/marA和pA-accADBC导入大肠杆菌BL21(DE3)，通过在大肠杆菌中过表达marA基因和acc基因来提高2,4-DAPG合成，结果表明，在摇瓶水平，在含有两种重组质粒pET28a-phlDACBE/marA和pA-accADBC的基础上，间苯三酚的产量比含有质粒pET28a-phlDACBE的对照菌株有所提高。

因此，本发明所述的重组菌可用于2,4-DAPG的发酵生产，具有较高的应用价值。

定义和缩写：

在本发明中使用下列的缩写或简称：

2,4-二乙酰基间苯三酚：2,4-DAPG

异丙基硫代半乳糖苷：IPTG

多重抗性激活因子基因：marA

乙酰CoA羧化酶基因：acc

大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli

荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens)：P.Protegens

聚酮合成酶基因：phlD

2,4-二乙酰基间苯三酚合成酶基因：phlACB

外排蛋白基因：phlE

“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

酶切连接：是指通过限制性内切酶对目的基因片段进行酶切，然后再将经同一限制性内切酶酶切后的一个或多个基因片段，通过连接酶进行连接。

附图说明

图1 phlD、phlACB、phlE共表达载体示意图。

图2 phlD、phlACB、phlE、marA共表达载体示意图。

图3 accA、accD、accB、accC共表达载体示意图。

图4为重组大肠杆菌发酵产物2,4-DAPG的高效液相色谱检测，图中，A为标准品2,4-二乙酰基间苯三酚高效液相色谱检测；B为实验组检测发酵产物高效液相色谱检测，横坐标为时间，单位为分钟，纵坐标为响应值，单位是AU。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自Thermo公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国Omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

质粒pACYCDuet-1购买自Novagen，货号71147-3。

质粒pET-28a(+)购买自Novagen，货号69864-3。

重组质粒pA-accADBC为中国科学院青岛生物能源与过程研究所按照现有技术自行构建，如图3所示，具体构建过程见已发表论文(Cao Y,Jiang X,Zhang R,XianM.Improved phloroglucinol production by metabolically engineered Escherichiacoli.Applied Microbiology and Biotechnology,2011,91:1545-1552)材料和方法的质粒构建内容。

培养基配方：

1)摇瓶种子培养基

LB培养基：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，121℃，20min灭菌，各成分浓度均为在培养基中的终浓度。

2)摇瓶发酵培养基

M9培养基(g/L)：NH₄Cl 1.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15.2g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，NaCl0.5g/L，其余为水，121℃，20min灭菌，各成分浓度均为在培养基中的终浓度。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加葡萄糖、硫酸镁及一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如终浓度为50mg/L的卡那霉素和34mg/L的氯霉素。

实施例1.高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌的构建过程。

1)重组质粒构建：

A.重组质粒I：pET28a-phlDACBE的构建

phlD基因的克隆是以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得，正向引物phlD-F序列为：5'-CATGCCATGGGCATGTCTACACTTTGCCTTCCACACGT-3'，反向引物phlD-R序列为：5'-ATCGCATATGTCAGGCGGTCCACTCGCCCACCGCC-3'；phlACB基因的克隆是以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得，正向引物phlACB-F序列为：

5'-ATCGCATATGTGTTTAAGAAGGAGATATACCATGAACGTGAAAAAGATAGGTATTGT

-3'，反向引物phlACB-R序列为：5'-CGGGATCCTTATATATCGAGTACGAACTTATAA-3'；phlE基因克隆是以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得，正向引物phlE-F序列为：

5'-CCCAAGCTTTTTAAGAAGGAGATATACCATGAACACTGGAATGCCGACCACG-3'，反向引物phlE-R序列为：5'-CCGCTCGAGCTAGTCCTTCAGGGGCAAGGGGGC-3'。

克隆所得的phlD基因与载体pET28a(+)分别经NdeI、NcoI双酶切后，利用回收试剂盒分别回收酶切后目的phlD片段和载体pET28a(+)大片段，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-phlD。

克隆所得phlACB基因与重组质粒pET28a-phlD分别经NdeI和EcoRI双酶切后，利用回收试剂盒分别回收酶切后目的phlACB片段和载体pET28a-phlD大片段，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-phlDACB。

克隆所得phlE基因与重组质粒pET28a-phlDACB经HindIII和XhoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后的目的片段phlE和载体pET28a-phlDACB大片段，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-phlDACBE，记为重组质粒I，质粒图谱如图1所示。

B.重组质粒II：pET28a-phlDACBE/marA的构建

制备含有2,4-二乙酰基间苯三酚合成相关基因phlD、phlACB、phlE和多重抗性激活因子marA的重组质粒，记为pET28a-phlDACBE/marA。

5'-ATCGCATATGTGTTTAAGAAGGAGATATACCATGAACGTGAAAAAGATAGGTATTGT

5'-CCCAAGCTTTTTAAGAAGGAGATATACCATGAACACTGGAATGCCGACCACG-3'，反向引物phlE-R序列为：5'-CCGCTCGAGCTAGTCCTTCAGGGGCAAGGGGGC-3'；marA基因克隆是以E.coliDH5α基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得，正向引物marA-F序列为：

5'-CGGAATTCATGTCCAGACGCAATACTGA-3'，反向引物marA-R序列为：

5'-ATCGGTCGACCTAGCTGTTGTAATGATTTA-3'。

克隆所得marA基因与步骤2)所得重组质粒pET28a-phlD分别经EcoRI和SalI酶双酶切后，利用回收试剂盒分别回收酶切后目的marA片段和载体pET28a-phlD大片段。再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-phlD/marA；

克隆所得phlACB基因与重组质粒pET28a-phlD/marA分别经NdeI和EcoRI双酶切后，利用回收试剂盒分别回收酶切后目的phlACB片段和载体pET28a-phlD/marA大片段。再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-phlDACB/marA。

克隆所得phlE基因与重组质粒pET28a-phlDACB/marA经HindIII和XhoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后的目的片段phlE和载体pET28a-phlDACB/marA大片段，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-phlDACBE/marA，即为重组质粒II，质粒图谱如图2所示。

本实施例PCR扩增获得的phlD基因的核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示；phlACB基因的核苷酸序列，如SEQ ID No.2所示，phlE基因的核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示，marA基因的核苷酸序列，如SEQ ID No.4所示。

2)重组菌株的构建

将步骤1)所得的重组质粒和pA-accADBC重组质粒导入到宿主菌中获得重组菌，所述宿主菌为大肠杆菌，方法如下：

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株E.coli BL21(DE3)感受态。

对照组1：将重组质粒I，将质粒pET28a-phlDACBE通过热激法转化至宿主菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到对照菌株，编号为Z0；

对照组2：将重组质粒II，即制备获得的pET28a-phlDACBE/marA通过热激法转化至宿主菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株，编号为Z1；

实验组：将重组质粒II，即pET28a-phlDACBE/marA和重组质粒pA-accADBC通过热激法转化至宿主菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株，编号为Z2。

实施例2.重组菌株的摇瓶发酵试验，考察本发明所述重组菌具有的提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量的作用。

本实施例共进行三组实验，以说明本发明的重要性。

对照组：菌株Z0。

实验组I：重组菌株Z1。

实验组II：重组菌株Z2。

1)将活化后的对照菌株及重组菌株分别接种至5mL LB液体培养基中，并加入50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素，37℃生长8-12h。按1:100的比例接种到含有50mL的M9液体培养基的250mL摇瓶中，摇瓶中根据质粒选择添加50mg/L的卡那霉素和34mg/L的氯霉素，加入20g/L葡萄糖和2mM的MgSO₄·7H₂O。37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入0.25mM的IPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养12h至发酵结束，所述各浓度均为在培养基中的终浓度。

2)取发酵液，4℃，8000rpm离心10min，取20ml上清液，用1mol/L HCl酸化至pH＝2后用乙酸乙酯萃取，1ml无水甲醇溶解，高效液相色谱检测发酵液的萃取物。

根据本实施例操作步骤，摇瓶水平，对照菌株Z0的2,4-DAPG产量为5.7mg/L，含质粒II，即pET28a-phlDACBE/marA的重组菌株Z1的2,4-DAPG产量为14.9mg/L；含有两种重组质粒pET28a-phlDACBE/marA和pA-accADBC的重组菌株Z2的2,4-DAPG的产量为18.6mg/L。即本发明所述的整合了编码多重抗性因子的基因marA和乙酰辅酶A羧化酶基因ACC的重组菌Z2，2,4-DAPG的产量比对照菌株提高了3.3倍。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述表达的10种基因共同克隆到大肠杆菌中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> phlD基因

<400> 1

atgtctacac tttgccttcc acacgtcatg tttccgcaac acaagatcac ccagcaacag 60

atggtcgatc acctggaaaa cctgcacgcc gaccatccac gcatggccct ggccaagcgc 120

atgatcgcca acaccgaagt caacgagcgc cacctggtgt tgccgatcga cgaactggca 180

gtgcacaccg gcttcaccca ccgcagcatc gtctacgagc gtgaagcccg gcagatgtcg 240

tcggccgcgg cgcgccaggc catcgagaat gccgggctgc agatcagcga cattcgcatg 300

gtgatcgtca cttcctgcac cggcttcatg atgccgtcgc tgaccgcgca cctgatcaac 360

gacctggccc tgccaacctc caccgtgcag ttgccgatcg cccagctggg ctgcgtggcc 420

ggtgccgcgg ccatcaaccg cgccaacgac ttcgcccggc tcgatgcccg caaccacgta 480

ctgatcgtgt ccctggagtt ctcctcgctg tgctaccagc cggacgacac caagctgcac 540

gccttcatct ccgcggcgct gttcggcgat gcggtatccg cctgcgtgct gcgcgccgat 600

gaccaggccg gcggcttcaa gatcaagaag accgagtcgt acttcctgcc caagagcgag 660

cactacatca agtacgacgt gaaggacacc ggctttcact tcaccctcga caaggcggtg 720

atgaactcca tcaaggacgt ggcaccggtc atggagcggc tcaactacga gagtttcgaa 780

cagaactgtg cgcacaacga cttcttcatc ttccacaccg gtggtcgcaa gatcctcgac 840

gagctggtga tgcacctgga cctggcatcc aaccgggtct cgcaatcgcg cagcagcctg 900

tcggaagccg gcaacattgc cagcgtggtg gtgttcgacg tactcaagcg gcagttcgat 960

tccaacctca atcgcggcga catcggcctg ctggcggcct tcggcccggg gttcaccgcg 1020

gaaatggcgg tgggcgagtg gaccgcctga 1050

<210> 2

<211> 2768

<212> DNA

<213> phlACB基因

<400> 2

atgaacgtga aaaagatagg tattgtcagc tatggcgcgg gtattccggt atgccgcctg 60

aaagtccagg aagtgatcaa cgtctggaaa aacaccgacc tcaagctggt ggaggaaaac 120

ctcggcgtca cggaaagagc cgtgctgcaa ccggatgaag atgtcatcac cctcggggtg 180

ctggcggcgc aacgggccct ggataaagtc cccggtcatc agatcgaagc cctgtacctg 240

ggcacctgca ccaatcccta tgactcacgg gcctcggctt cgatcatcct ggaaatgctc 300

ggcagcggct acgacgccta ttgcgccgac gtgcagttcg ccggcaagtc cggaacttct 360

gccctgcaga tctgccaggc gctggtggct tccggcatga cgggcagcgc cctggccatc 420

ggcgccgaca ccatcaaccg caacaccgcg ccgggcgacc tgaccgaatc ctatgccggg 480

gccggagccg ctgcgctgct gatcggcagc caggatgtca tcgccgaatt cgacgccagc 540

ttctcctgcg ccgccgatgt cgccgacaac atccgccccc agggcgatcg ctacattcgt 600

tcgggcatgg gcctgggctc ggacaagaac agcatcggcc tggaagacca gacccgccgc 660

gccgccgaag gcctgatggc caagctgcac accagccccg ccgactatga ctatgtggtg 720

ttccagcaaa acctggtgtc cacgccctac tccctggcca agcacctggg cttcaacccc 780

aagcaggtgg aaccgggcat ctatgccggc aacgttggcg atgccggatc ggccagcccg 840

ctgctcggcc tgatcaacgt actggaccag gcacgcccgg ggcagaaaat tcttttggtg 900

tcctacggtt tcggcgccgg cagcgacgcc atcgccctga ccgtcaccga cgccatcgag 960

cagtaccaga agcacaacaa gcctctgcgc gaactgctgg aatccaagat ctacgtcgac 1020

tacggcacgt ccatcaagta cgagttcaag tacctgcggg ctgactacgc cctgaccgcc 1080

tatctctgat tacgcctgtc tacgcaagga gcatgcacat gtgcgcacgt cgtgttgcaa 1140

tcgtttcggc cgcctatacg ccgaaacccg gaagttcacg agttcggcag acgttcaagg 1200

aaatgatcgt cgagtccgcc tacaaggcac tcaaggacgc caagatgcac ccccgggaaa 1260

tccaggccgt ggcctatggt tatcacggtg aaggcatttc cgaatatggc ggcctgggcc 1320

cgaccatttc cgacgccctg ggcatcagcc cggcgccgac cttcatgagc accgccaact 1380

gcaccagcag ctcggtgtcg ttccagatgg gccaccagat ggtggcgtcc ggggagtacg 1440

acatcgtcct gtgcggcggc ttcgagaaga tgaccgatca cttcaactac gccgaataca 1500

tcggctccag cactgaatgt gaatacgatt atttcctcgg catttcccac accgatgcct 1560

tcgccctggc caccgccgag tacttccaga agttcggcta tgccggtcgc gaggccgacg 1620

tactggccac cttcggccgg cagatgcgca tctacgcaca gaacaccccc accgccaccc 1680

gttatggcca gccgattcca tccctggaag tgttgaagaa cagcgaagcc tgcggctcga 1740

tgctggcctg gggcgaagcc agtggctgcg cgatcctggt ggccgaacac ctggcccaca 1800

agtacaccga taaaccggtg ttcgtacgcg gttgcgccta taccggggtc tcccactatt 1860

tcggtacgcg ctttcacaac ccgaccctgc atcatccggg cctgcccaag gatgtgggca 1920

tggcggtttc ggccaactcc atcgcctgtg cggagatcgc ctacaagaaa gccgggatca 1980

ccgccaagga catcgacgtg gcccaggtct acgacctgct cggcgcaggg ctgatccaga 2040

tggaatccat gggcatctgt ggcaagggcc aggccggcga cttcgtgctc gaaggcggca 2100

ttgccctgga tggccagctg ccgctcaata ccgacggcgg caacatcggc cgcggccatg 2160

cctccggctg cgacggcatc ctgcacatca ccgagctgtt ccggcagctg aggggtgaat 2220

ccgacaacca ggtcaagggc gcgcgcatcg gcgtgtcgca gaaccttggc ggttacgcgg 2280

cgcacaactc agtgattgtc ctctcgaacg actaaggagc ccggaccatg tccatgtacc 2340

cagaacagat ccacagaatg accaccgcca gcatgcttcg cgaatggcgc gagcatggcg 2400

gcaagtaccg cctcgaaggc agccagtgcg aagaatgcaa cgaaatcttc ttcccccggc 2460

gcaccgtctg cggcgcttgc aactccctga gtgtgaagcc gtatcgctgc gcgcgcagtg 2520

gcaagatcga ggtcatggcc ccggccgaga acccgatcct ggccgccatg ggctatggcg 2580

aaaccgtgcc gcgcatcatg gccatggtgc gcctggacga cggcctggtg atcgcttcgg 2640

aaatcgtcga tgtgtgcgat cagcaacagc tgaaagtcgg tgcgccggtg cgcatggtga 2700

tccgcaagca tgtgcgcgaa agcaacctgg cctggcaata cgcttataag ttcgtactcg 2760

atatataa 2768

<210> 3

<211> 1266

<212> DNA

<213> phlE基因

<400> 3

atgaacactg gaatgccgac cacggctgcc aacagccgtt acgaaagatc catggtgctg 60

ttgctgtcac tgagtttcgg gctggtgggg ctggatcgct tcatcatcct gccgctgttt 120

ccggtgatca tgcacgacct gcaactggac tatcaggacc tgggctacct gtccgccgcg 180

ctggccttca cctgggggct gtccgccctg ggcatgggca gcgtgatcga gcgcctgggc 240

acccgccgcg tgctggtgac ctcgattgcc gtgctttcgc tactgtccgg tttttccgcg 300

ctggccaccg gcgtgctggg gctggtgatt ctgcgcgggc tgatgggcat ctgcgagggt 360

gccttcaccc ccaccagcat cattgtcacc aatgaagtct cgcgccccga ccggcgcggg 420

ctgaacctgg gtatccagca ggcgctgttc ccgattctcg gcctgtgcct ggggccgctg 480

atcgccgcat acctcctgca aatcactggc tcgtggcgtg cggtgttcgc catcatttcc 540

ctgccgggcc tgctgctggc cggctacctg tggaaaatct accgaccgct gccggcgccc 600

caggccgacc gcaccgcagg cacctggctg gcggccttca agagcggcaa cgtgagcctg 660

aacatcctga tcatgttctg catactcacc tgccagttcg tcctctgcgc catgctgccc 720

agctacctga ccgaccatat gcacctggaa accctgtcca tggccttcgt catctcggcc 780

atcggcgtgg gcggcttcat cggccaattg atcatccccg gcatgtccga ccgtctcggg 840

cgcaagccgg tggtgtcggt gtgcttcatg accagcagca ccctggtggg cctgctgatc 900

gtcagcccgc cccttccctg gctgctgttc ctgctgctgt tcctgctgtc gttcttcaac 960

ttcagcctga tctgcatgac agtcggccct ttgaccagcg aatcggtcac cccggccctg 1020

ctgccggcgg cgaccggaat cgtggtgggg ttcggcgaga tcctgggtgg cgggttgtca 1080

ccggccgtgg ccgggttcgc cgccagccat ttcggcctgc catcgatcct gtacgtggcc 1140

ctgagcggca gcctggccgg cttgctgctg tcattcctgc tcaaggaaca ggccctcgaa 1200

ccgcgccgtt cgcgcgtgcg cgaagcgctg cccatcctcc ccgccccctt gcccctgaag 1260

gactag 1266

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> marA基因

<400> 4

atgtccagac gcaatactga cgctattacc attcatagca ttttggactg gatcgaggac 60

aacctggaat cgccactgtc actggagaaa gtgtcagagc gttcgggtta ctccaaatgg 120

cacctgcaac ggatgtttaa aaaagaaacc ggtcattcat taggccaata catccgcagc 180

cgtaagatga cggaaatcgc gcaaaagctg aaggaaagta acgagccgat actctatctg 240

gcagaacgat atggcttcga gtcgcaacaa actctgaccc gaaccttcaa aaattacttt 300

gatgttccgc cgcataaata ccggatgacc aatatgcagg gcgaatcgcg ctttttacat 360

ccattaaatc attacaacag ctag 384

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> phlD-F

<400> 5

catgccatgg gcatgtctac actttgcctt ccacacgt 38

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> phlD-R

<400> 6

atcgcatatg tcaggcggtc cactcgccca ccgcc 35

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> phlACB-F

<400> 7

atcgcatatg tgtttaagaa ggagatatac catgaacgtg aaaaagatag gtattgt 57

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> phlACB-R

<400> 8

cggaattctt atatatcgag tacgaactta taa 33

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> phlE-F

<400> 9

cccaagcttt ttaagaagga gatataccat gaacactgga atgccgacca cg 52

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> phlE-R

<400> 10

ccgctcgagc tagtccttca ggggcaaggg ggc 33

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> marA-F

<400> 11

cggaattctt taagaaggag atataccatg tccagacgca atactga 47

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> marA-R

<400> 12

atcggtcgac ctagctgttg taatgattta 30

Claims

1.一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达聚酮合成酶基因phlD、2,4-二乙酰基间苯三酚合成酶基因phlACB、外排蛋白phlE基因以及编码多重抗性因子的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶的acc基因，出发菌株为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述基因phlD、phlACB、phlE，均来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens CHA0，DSM 19095^T)，或者为来源于其它生物体，和这些基因具有相同或相似功能的核酸序列；所述marA基因来源于大肠杆菌，Genebank ID：6060688，或者为和marA同源性超过70％的核酸序列；或者所述marA基因来源于其它生物体，和marA基因同源性低于70％，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；所述乙酰CoA羧化酶基因acc来源于大肠杆菌，其中，亚基accA的GenebankID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083，或者为和acc基因同源性超过70％的核酸序列；或者所述乙酰CoA羧化酶acc基因来源于其它生物体，和acc基因同源性低于70％，但和acc具有相同或相似功能的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述phlD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；phlACB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；phlE基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；marA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.权利要求1-4任意一项所述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

6.根据权利要求5所述的高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述重组质粒p-phlDACBE/marA的构建方法如下：

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlD基因，所用正向引物序列phlD-F，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，反向引物phlD-R，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlACB基因，所用正向引物序列phlACB-F，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，反向引物phlACB-R，核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示；

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlE基因，所用正向引物序列phlE-F，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，反向引物phlE-R，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

7.权利要求1-4任意一项所述的重组菌在提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述重组菌经发酵培养基培养后，再经IPTG诱导表达，获得2,4-二乙酰基间苯三酚。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将重组菌接种到M9液体培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述加入0.25mM IPTG后，将重组菌于30℃、180rpm继续培养12h至发酵结束。