CN104039974B - 乙酰辅酶a衍生的类异戊二烯的生产 - Google Patents

Abstract

本文中提供用于在宿主细胞中异源生产乙酰‑CoA衍生的类异戊二烯的组合物和方法。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰以包含编码乙醛脱氢酶，酰化(ADA，E.C.1.2.1.10)的异源核苷酸序列，和包含利用NADP的HMG‑CoA还原酶的MEV途径。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰以包含编码ADA的异源核苷酸序列和包含乙酰乙酰‑CoA合酶的MEV途径。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞还包含一种或多种编码磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞还包含天然PDH旁路的功能性破坏。本文中所描述的组合物和方法为乙酰‑CoA衍生的类异戊二烯的异源生产提供节能且氧化还原平衡的路径。

Description

乙酰辅酶A衍生的类异戊二烯的生产

本申请要求2011年11月9日提交的美国临时申请No.61/557,893的优先权，据此通过提述完整并入其内容。

1.发明领域

本公开文本涉及用于在工程化宿主细胞中生产乙酰-CoA衍生的类异戊二烯的组合物和方法。

2.发明背景

乙酰辅酶A(乙酰-CoA)是包括聚酮化合物，脂肪酸，类异戊二烯，酚类(phenolics)，生物碱，维生素和氨基酸在内的必需生物学化合物的合成中的关键中间体。在自乙酰-CoA衍生的代谢物中有初级和次级代谢物，包括有工业效用的化合物。例如，类异戊二烯用于医药产品及用作生物燃料，食品添加剂和其它专业化学药品。类异戊二烯产品通常由重复的五碳异戊烯二磷酸(IPP)单元构成，尽管不规则的类异戊二烯和多萜也有报道。在自然界中，类异戊二烯通过它们的前体IPP和它的异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的连续缩合来合成。已知这些前体的两条途径。除一些例外以外，原核生物通常采用脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径将丙酮酸和甘油醛3-磷酸(G3P)转化成IPP和DMAPP。除植物以外，真核生物一般利用甲羟戊酸依赖性(MEV)途径将乙酰-CoA转化成IPP，IPP随后异构化成DMAPP。

单细胞真菌酿酒酵母及其近缘生物利用两种内源途径生成乙酰-CoA。一条途径发生在线粒体基质中，其中PDH复合物催化经糖酵解自葡萄糖生成的丙酮酸氧化脱羧成乙酰CoA。PDH复合物由60条多肽链组成，24条硫辛酰胺还原酶-转乙酰酶(lipoamide reductase-transacetylase)链，12条二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase)链，和24条丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase)链。这种大型复合物将丙酮酸转化成乙酰-CoA，生成NADH作为副产物。所得乙酰-CoA然后可以经柠檬酸循环完全氧化成CO₂和H₂O以产生能量，或者用于在线粒体中实施的生物合成反应。

在线粒体中生成的乙酰-CoA无法穿越线粒体膜进入胞质溶胶。因此，为了生成重要的初级和次级代谢物的生物合成需要的胞质溶胶乙酰-CoA，酿酒酵母利用位于胞质溶胶中称作“PDH旁路”的一种独立机制。这种多步骤途径催化：(1)由丙酮酸脱羧酶(PDC，EC4.1.1.1)将丙酮酸脱羧成乙醛；(2)由乙醛脱氢酶(ACDH，EC1.2.1.5和EC1.2.1.4)将乙醛转化成乙酸，这将一个NADP⁺还原成一个NADPH；和(3)由乙酰-CoA合成酶(ACS，EC6.2.1.1)自乙酸和CoA合成乙酰-CoA，这将1个ATP水解成1个AMP，即将2个ATP水解成2个ADP的能量当量。

由于自然界对于很多乙酰-CoA衍生的生物分子的提取仅提供低产率来源，因此利用经遗传修饰的微生物进行的发酵生产已经因它们的产量而成为有前景的替代方式。然而，利用天然乙酰-CoA途径生产乙酰-CoA中间体具有某些限制。例如，如图1所示，经天然MEV途径生产类异戊二烯对于生成的每个甲羟戊酸分子需要3个乙酰-CoA分子和氧化两个NADPH。虽然PDH旁路每产生一个乙酰-CoA就生成一个NADPH，但是在该过程中消耗两个ATP当量。如此，尽管NADPH的产生对于天然MEV途径的辅因子要求是有益的，但是每生成一个甲羟戊酸消耗6个ATP当量导致低能效反应，因为必须将更多的碳源引向ATP合成，例如经TCA循环和氧化磷酸化，即以产物产率为代价。

因此，设计高效生成乙酰-CoA衍生的化合物的生产宿主的挑战之一是优化乙酰-CoA生成，使得ATP需求最小化，同时还满足生物合成途径的要求和辅因子。本文中提供的组合物和方法解决了这种需要并提供相关的优点。

3.发明概述

本文中提供的组合物和方法提供乙酰-CoA衍生的类异戊二烯的高能效且辅因子平衡的生产。通过利用异源酰化乙醛脱氢酶(也称作“乙酰醛脱氢酶，乙酰化”，“乙酰醛脱氢酶，酰化”，或“ADA”(EC1.2.1.10))作为对于乙酰-CoA的胞质溶胶生成而言PDH旁路的替代，每生成一分子乙酰-CoA节省两个ATP当量。ADA将乙醛直接转化成乙酰-CoA，不消耗ATP，并在该过程中将一个NAD⁺还原成一个NADH。

虽然可利用用ADA替换PDH旁路获得的节省的ATP来获取更高的产物产率，但是也存在与组合使用ADA与天然甲羟戊酸途径有关的缺点。首先，天然PDH旁路的灭活去除了一种NADPH来源，而由ADA催化的反应产生NADH。因此，用ADA替换PDH旁路在没有进一步途径修饰的情况下会在消耗NADPH的类异戊二烯合成中引入氧化还原失衡。

第二，ADA催化下述可逆反应：

形成乙酰-CoA的天然PDH旁路反应是热力学上有利的，因为该反应与ATP水解成AMP偶联。相反，ADA反应不与ATP偶联，而且比形成乙酰-CoA的天然PDH旁路反应更加接近平衡得多。因而，由ADA催化的反应具有更低的热力学驱动力将乙醛转化成乙酰-CoA，而且在没有进一步途径修饰的情况下ADA的理论能量增益可能无法实现。

本文中描述的组合物和方法解决了这些缺点。在一些实施方案中，为了解决用ADA替换PDH旁路引入的氧化还原失衡，经遗传修饰的宿主细胞还在类异戊二烯途径中利用利用NADH的酶来消耗ADA产生的NADH。因此，可直接利用由ADA介导的乙醛转化成乙酰-CoA所生成的NADH集合进行类异戊二烯合成。在一些实施方案中，利用NADH的酶是对于类异戊二烯途径而言非天然的酶。例如，利用NADH的酶可替换对于类异戊二烯途径而言天然的利用NADPH的酶。在具体的实施方案中，利用NADH的酶是利用NADH将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)。

在一些实施方案中，为了解决ADA反应更低的热力学驱动力，经遗传修饰的宿主细胞还在紧邻乙酰-CoA的下游利用热力学上有利的反应作为甲羟戊酸途径的第一步，以拉动ADA反应。在一些实施方案中，由乙酰乙酰-CoA合酶(AACS；也称作乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶)催化自乙酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA。由于乙酰-CoA羧化酶生成丙二酰-CoA导致1个ATP的水解，因此由AACS催化的反应比由天然甲羟戊酸途径的乙酰-CoA硫解酶催化的反应在热力学上更加有利(图5)。因此，AACS对乙酰-CoA提供更强的拉动来驱动ADA反应前行。

利用异源ADA与这些修饰相组合的优点的例证在于包含MEV途径的宿主细胞中倍半萜法呢烯升高的理论产率。图1和图2中图示了经天然甲羟戊酸途径的类异戊二烯生成。如图3中指出的，如在酵母天然代谢网络中发生的，当仅利用化学反应自葡萄糖合成胞质溶胶乙酰-CoA时，葡萄糖经甲羟戊酸途径转化成法呢烯的最大可能化学计量产率是23.6wt％，合成每分子法呢烯需要4.77分子葡萄糖。每分子法呢烯需要27个ATP，其中18个在经PDH旁路自乙醛合成胞质溶胶乙酰-CoA中消耗掉。然而，如图4中图示的，通过将由ADA催化的反应和利用NADH的HMG-CoA还原酶纳入用于生成甲羟戊酸的代谢网络，最大理论化学计量产率提高至25.2wt％。具体而言，在无需任何ATP输入的情况下ADA将乙醛转化成乙酰-CoA；这将法呢烯合成需要的ATP当量降至9，导致每生成一分子法呢烯节省18个ATP当量(2个ATP当量/乙酰-CoAx9个乙酰-CoA/法呢烯)。乙酰-CoA生成期间ATP用量的节省消除了细胞为生成法呢烯而运行TCA循环对氧的需求。葡萄糖转化成法呢烯的氧需求从每个葡萄糖7.8分子O₂降至6，由此降低大规模向发酵罐提供氧气的主要生产成本。此外，通过共引入利用NADH的HMG-CoA还原酶(其消耗由ADA生成的NADH)减轻氧化还原失衡。

如图4中指出的，在包含ADA和利用NADH的HMG-CoA还原酶二者的菌株中仍有化学计量上过量的ATP，其可被细胞用于维持和生长。或者，通过引入乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)，可将这些过量ATP中的一些用于改善乙酰乙酰-CoA生成的动力学。如图5中图示的，AACS是自丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的酶。丙二酰-CoA合成每转化1分子乙酰-CoA(由乙酰-CoA羧化酶催化)需要1个ATP的能量输入，由此改善自乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA的热力学驱动力。重要的是，如图6中图示的，由于这种菌株设计中仍有可利用的过量ATP，因此这不影响自糖生成法呢烯的最大化学计量产率或该途径的氧需求。

如图7中显示的，通过引入磷酸转酮酶(PK)和磷酸转乙酰酶(PTA)可获得额外的效率。PK和PTA催化果糖-6-磷酸(F6P)或木酮糖-5-磷酸(X5P)转化成乙酰-CoA的反应。凭借这些可利用的代谢途径，最佳时，反应网络能够达到29.8wt％的质量产率或更高，即最大理论产率的明显提高。这种方案涉及将碳从导致较少ATP和NADH生成(二者在包含ADA和利用NADH的HMG-CoA还原酶修饰的网络中早就过量了)的下游糖酵解(lower glycolysis)(G3P→丙酮酸)移开。减少通过下游糖酵解的流的一个好处是丙酮酸转化成乙醛时产生较少的CO₂，且因此在终产物中捕获更多的碳，由此提高网络的最大理论产率。第二个好处是产生更少的NADH，并因此再氧化它需要显著更少的氧。具体而言，最佳时，氧需求是每消耗1个葡萄糖仅1.84分子的氧。如图13中图示的，即使是在微规模的低产率中，也可见对ADA背景增加PK和PTA的氧化还原影响，其中甘油生成回到野生型水平。

因此，本文中提供经遗传修饰的宿主细胞及使用它们生产乙酰-CoA衍生的类异戊二烯的方法。一方面，本文中提供能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中一种或多种用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸；和(b)编码酰化乙酰醛脱氢酶的异源核酸。

在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括及乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶(即乙酰乙酰-CoA合酶(AACS))。

在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的利用NADH的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括利用NADH的HMG-CoA还原酶。

在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含编码磷酸转酮酶(phosphoketolase)的异源核酸。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含编码磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase)的异源核酸。

在一些实施方案中，所述ADA的氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少80％同一。在一些实施方案中，所述乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:16至少80％同一。在一些实施方案中，所述利用NADH的HMG-CoA还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:20至少80％同一。在一些实施方案中，所述磷酸转酮酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:12至少80％同一。在一些实施方案中，所述磷酸转乙酰酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:14至少80％同一。

在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含天然丙酮酸脱氢酶(PDH)旁路中一种或多种酶的功能性破坏。在一些实施方案中，所述PDH旁路中的一种或多种酶选自乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)。在一些实施方案中，ACS1是功能性破坏的。在一些实施方案中，ACS2是功能性破坏的。在一些实施方案中，ALD6是功能性破坏的。在一些实施方案中，ACS1和ACS2是功能性破坏的。在一些实施方案中，ACS1，ACS2和ALD6是功能性破坏的。

在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含一种或多种具有醇脱氢酶(ADH)活性的酶的功能性破坏。在一些实施方案中，所述一种或多种具有ADH活性的酶选自醇脱氢酶1(ADH1)，醇脱氢酶3(ADH3)，醇脱氢酶4(ADH4)，和醇脱氢酶5(ADH5)。

在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将两分子乙酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合以形成HMG-CoA的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。在一些实施方案中，所述MEV途径中的一种或多种酶选自HMG-CoA合酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。

在一些实施方案中，所述宿主细胞包含编码MEV途径中所有酶的众多异源核酸。在一些实施方案中，所述编码MEV途径中一种或多种酶的一种或多种异源核酸在一种转录调节物的控制下。在一些实施方案中，所述编码MEV途径中一种或多种酶的一种或多种异源核酸在多种异源转录调节物的控制下。

在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核酸。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含编码能缩合IPP和/或DMAPP分子以形成聚异戊二烯(polyprenyl)化合物的酶的异源核酸。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核酸。在一些实施方案中，所述能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶选自下组：蒈烯(carene)合酶，牦牛儿醇(geraniol)合酶，芳樟醇(linalool)合酶，柠檬烯(limonene)合酶，香叶烯(myrcene)合酶，罗勒烯(ocimene)合酶，α-蒎烯(pinene)合酶，β-蒎烯合酶，γ-萜品烯(terpinene)合酶，萜品油烯(terpinolene)合酶，紫穗槐双烯(amorphadiene)合酶，α-法呢烯(farnesene)合酶，β-法呢烯合酶，法尼醇(farnesol)合酶，橙花叔醇(nerolidol)合酶，广藿香醇(patchouliol)合酶，诺卡酮(nootkatone)合酶和松香双烯(abietadiene)合酶。在一些实施方案中，所述类异戊二烯选自下组：半萜，单萜，双萜，三萜，四萜，倍半萜，和多萜。在一些实施方案中，所述类异戊二烯是C₅-C₂₀类异戊二烯。在一些实施方案中，所述类异戊二烯选自下组：松香双烯，紫穗槐双烯，蒈烯，α-法呢烯，β-法呢烯，法尼醇，牦牛儿醇，牦牛儿基牦牛儿醇(geranylgeranitol)，异戊二烯(isoprene)，芳樟醇，柠檬烯，香叶烯，橙花叔醇，罗勒烯，广藿香醇，β-蒎烯，香桧烯(sabinene)，γ-萜品烯，萜品油烯和瓦伦烯(valencene)。

在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。

另一方面，本文中提供能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中一种或多种用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸；(b)编码乙酰醛脱氢酶，酰化(ADA)的异源核酸；(c)天然PDH旁路中至少一种选自乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)的酶的功能性破坏；(d)编码磷酸转酮酶(PK)的异源核酸；和(e)编码磷酸转酮酶(PTA)的异源核酸。

另一方面，本文中提供能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中一种或多种用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸，其中该一种或多种酶包括利用NADH的HMG-CoA还原酶；(b)编码乙酰醛脱氢酶，酰化(ADA)的异源核酸；和(c)天然PDH旁路中至少一种选自乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)的酶的功能性破坏。

另一方面，本文中提供能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中一种或多种用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸，其中该一种或多种酶包括利用NADH的HMG-CoA还原酶；(b)编码乙酰醛脱氢酶，酰化(ADA)的异源核酸；(c)天然PDH旁路中至少一种选自乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)的酶的功能性破坏；(d)编码磷酸转酮酶(PK)的异源核酸；和(e)编码磷酸转酮酶(PTA)的异源核酸。

另一方面，本文中提供能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中一种或多种用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸，其中该一种或多种酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶；(b)编码乙酰醛脱氢酶，酰化(ADA)的异源核酸；和(c)天然PDH旁路中至少一种选自乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)的酶的功能性破坏。

另一方面，本文中提供能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中众多用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸，其中该众多酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶和利用NADH的HMG-CoA还原酶；(b)编码乙酰醛脱氢酶，酰化(ADA)的异源核酸；(c)天然PDH旁路中至少一种选自乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)的酶的功能性破坏；(d)编码磷酸转酮酶(PK)的异源核酸；和(e)编码磷酸转酮酶(PTA)的异源核酸。

另一方面，本文中提供生产类异戊二烯的方法，该方法包括：(a)在适于生成所述类异戊二烯化合物的条件下在含碳源的培养基中培养本文中描述的经遗传修饰的酵母细胞的群体；并(b)自培养基回收所述类异戊二烯化合物。

4.附图简述

图1提供用于生成异戊烯二磷酸(“IPP”)的甲羟戊酸(“MEV”)途径的示意图。

图2提供将IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)转化成牦牛儿基焦磷酸(“GPP”)，法呢基焦磷酸(“FPP”)和牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(“GGPP”)的示意图。

图3提供经甲羟戊酸途径葡萄糖转化成法呢烯中的最佳碳流，代谢需求和产率的示意图，其中经“野生型”PDH旁路生成胞质溶胶乙酰-CoA。

图4提供经甲羟戊酸途径葡萄糖转化成法呢烯中的最佳碳流，代谢需求和产率的示意图，其中经ADA生成胞质溶胶乙酰-CoA，且甲羟戊酸途径包含利用NADH的HMGr，代替利用NADPH的HMGr。

图5提供自乙酰-CoA生成法呢烯的示意图，其中由乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)自丙二酰-CoA和乙酰-CoA(AcCoA)合成乙酰乙酰-CoA(AcAcCoA)。丙二酰-CoA合成每转化1分子乙酰-CoA(由乙酰-CoA羧化酶(ACC1)催化)需要1ATP的能量输入。

图6提供经甲羟戊酸途径葡萄糖转化成法呢烯中的最佳碳流，代谢需求和产率的示意图，其中经ADA生成胞质溶胶乙酰-CoA，甲羟戊酸途径包含利用NADH的HMGr，代替理由NADPH的HMGr，且由乙酰乙酰-CoA合酶自丙二酰-CoA和乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。

图7提供在经甲羟戊酸途径葡萄糖转化成法呢烯中的最佳碳流，代谢需求和产率的示意图，其中经ADA生成胞质溶胶乙酰-CoA，甲羟戊酸途径包含利用NADH的HMGr，代替利用NADPH的HMGr，且磷酸转酮酶(PK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化果糖-6-磷酸(F6P)转化成乙酰-CoA的反应

图8提供来自酿酒酵母(Sc.tHMG-CoA还原酶)，Pseudomonas mevalonii(Pm.)，食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)(Da.)和Silicibacter pomeroyi(Sp.)的羟基甲基戊二酰-CoA还原酶的NADPH特异性或NADH特异性活性(以nmol/mg/min测量)。

图9提供分别在野生型ADH1和ADH1敲除(adh1Δ)背景中包含异源MevT途径的酿酒酵母(Sc.)菌株在24和48小时后的细胞密度(以OD₆₀₀测量)，该MevT途径包含利用NADPH的HMG-CoA还原酶(Sc.tHMG-CoA还原酶)或利用NADH的HMG-CoA还原酶(Pm.--Pseudomonas mevalonii；Da.--食酸戴尔福特菌；Sp.--Silicibacter pomeroyi)。

图10提供在野生型ADH1和ADH1敲除二者背景中包含异源MevT途径的酿酒酵母(Sc.)菌株在24和48小时后的甘油产量(以g/L测量)，该MevT途径包含利用NADPH的HMG-CoA还原酶(Sc.tHMG-CoA还原酶)或利用NADH的HMG-CoA还原酶(Pm.--Pseudomonas mevalonii；Da.--食酸戴尔福特菌；Sp.--Silicibacter pomeroyi)。

图11提供在野生型ADH1和ADH1敲除(adh1Δ)二者背景中包含利用NADPH的HMG-CoA还原酶(Sc.tHMG-CoA还原酶)或利用NADH的HMG-CoA还原酶(Pm.--Pseudomonas mevalonii；Da.--食酸戴尔福特菌；Sp.--Silicibacter pomeroyi)的酿酒酵母(Sc.)菌株在24和48小时后的甲羟戊酸产量(以g/L测量)。

图12提供酿酒酵母菌株的法呢烯产量和细胞密度，该酿酒酵母菌株包含：(A)与acs1Δacs2Δald6Δ偶联的异源表达的ADA(Dz.eutE)和包含利用NADPH的HMG-CoA还原酶或利用NADH的HMG-CoA还原酶任一的MEV途径；(B)完整(野生型)PDH旁路和包含利用NADPH的HMG-CoA还原酶或利用NADH的HMG-CoA还原酶任一的MEV途径。标示为“空白”的柱代表只有培养基(没有细胞)的孔。

图13提供(A)野生型菌株(Y968)；异源表达ADA(Dz.eutE)的菌株(Y12869)；和(B)异源表达ADA(Dz.eutE)，磷酸转酮酶(PK)和磷酸转乙酰酶(PTA)的菌株(Y12745)的甘油产量(顶部小图)和葡萄糖消耗(下部小图)。

图14提供包含完整(野生型)PDH旁路或与acs1Δacs2Δald6Δ偶联的异源表达的ADA(Dz.eutE)；和包含ERG10(乙酰-CoA硫解酶)或nphT7(乙酰乙酰-CoA合酶)的MEV途径任一的酿酒酵母菌株的甲羟戊酸产量。

5.发明详述

5.1术语

如本文中使用的，术语“异源”指正常情况下在自然界中找不到的。术语“异源核苷酸序列”指正常情况下在自然界中在给定细胞中找不到的核苷酸序列。因而，异源核苷酸序列可以是：(a)对其宿主细胞而言是外来的(即对细胞而言是“外源”的)；(b)在宿主细胞中天然发现的(即“内源”的)但在细胞中以非天然数量存在的(即高于或低于在宿主细胞中天然发现的数量)；或(c)在宿主细胞中天然发现的但定位于其天然基因座以外的。术语“异源酶”指正常情况下在自然界中在给定细胞中找不到的酶。该术语涵盖如下的酶：(a)对给定细胞而言是外源的(即由非天然存在于宿主细胞中或非天然存在于宿主细胞中的给定背景(context)中的核苷酸序列编码)；和(b)在宿主细胞中天然发现的(例如该酶由对细胞而言内源的核苷酸序列编码)但在宿主细胞中以非天然量生成(例如高于或低于天然发现的量)。

另一方面，如本文中关于分子(特别是酶和核酸)使用的术语“天然”或“内源”指在它们的起源生物或在自然界中发现它们的生物中表达的分子，与表达水平无关，表达水平可以低于，等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。应当理解，在重组微生物中天然酶或多核苷酸的表达可被修饰。

如本文中使用的，例如靶基因(例如PDH旁路的一种或多种基因)的“功能性破坏”表示改变靶基因从而降低由该靶基因编码的蛋白质在宿主细胞中的活性。类似地，例如靶蛋白质(例如PDH旁路的一种或多种酶)的“功能性破坏”表示改变靶蛋白质从而降低该蛋白质在宿主细胞中的活性。在一些实施方案中，在宿主细胞中消除由靶基因编码的靶蛋白质的活性。在其它实施方案中，在宿主细胞中降低由靶基因编码的靶蛋白质的活性。靶基因的功能性破坏可通过删除整个或部分基因，从而消除或降低基因表达或者消除或降低基因产物的活性来实现。靶基因的功能性破坏也可以通过突变该基因的调节元件(例如该基因的启动子)，由此消除或降低表达或者通过突变该基因的编码序列，由此消除或降低基因产物的活性来实现。在一些实施方案中，靶基因的功能性破坏导致靶基因的可读框整个去除。

如本文中使用的，术语“亲本细胞”指如下的细胞，它与本文中公开的经遗传修饰的宿主细胞具有同样的遗传背景，只是不包含工程化改造入经修饰宿主细胞中的一种或多种特定遗传修饰，例如一种或多种选自下组的修饰：ADA的异源表达，利用NADH的HMG-CoA还原酶的异源表达，AACS的异源表达，磷酸转酮酶的异源表达，磷酸转乙酰酶的异源表达，和甲羟戊酸途径的一种或多种酶的异源表达。

如本文中使用的，术语“产量”一般指由本文中提供的经遗传修饰的宿主细胞生成的类异戊二烯的量。在一些实施方案中，产量表述为宿主细胞的类异戊二烯产率。在其它实施方案中，产量表述为宿主细胞生成类异戊二烯的生产力。

如本文中使用的，术语“生产力”指宿主细胞的类异戊二烯产量，表述为随时间的推移(每小时)每份量的培养宿主细胞的发酵液(以体积计)中所生成的类异戊二烯的量(以重量计)。

如本文中使用的，术语“产率”指宿主细胞的类异戊二烯产量，表述为宿主细胞消耗每份量的碳源生成的类异戊二烯的量，以重量计。

5.2 生成乙酰-CoA衍生的类异戊二烯的经遗传修饰的微生物

5.2.1 宿主细胞

在本文中提供的组合物和方法中有用的宿主细胞包括古细菌(archae)，原核或真核细胞。

合适的原核宿主包括但不限于多种革兰氏阳性，革兰氏阴性或是革兰氏可变性细菌任一。例子包括但不限于属于下述属的细胞：土壤杆菌属(Agrobacterium)，脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)，鱼腥蓝细菌属(Anabaena)，组囊蓝细菌属(Anacystis)，节杆菌属(Arthrobacter)，固氮菌属(Azobacter，Azotobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)，短杆菌属(Brevibacterium)，着色菌属(Chromatium)，梭菌属(Clostridium)，棒杆菌属(Corynebacterium)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，埃希氏菌属(Escherichia)，乳杆菌属(Lactobacillus)，乳球菌属(Lactococcus)，Mesorhizobium，甲基杆菌属(Methylobacterium)，微杆菌属(Microbacterium)，席蓝细菌属(Phormidium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，红细菌属(Rhodobacter)，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，红螺菌属(Rhodospirillum)，红球菌属(Rhodococcus)，沙门氏菌属(Salmonella)，Scenedesmun，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属(Shigella)，葡萄球菌属(Staphlococcus)，链霉菌属(Strepromyces，Streptomyces)，Synnecoccus，和发酵单胞菌属(Zymomonas)。原核菌株的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)，产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)，嗜氨短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum，Brevibacterium immariophilum)，拜氏梭菌(Clostridiumbeigerinckii)，Enterobacter sakazakii，大肠杆菌(即大肠埃希氏菌)(Escherichiacoli)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，Mesorhizobium loti，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，Pseudomonas mevalonii，恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudica，Pseudomonas putida)，荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)，类球红球菌(Rhodobacter sphaeroides)，深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)，肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)，和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在一个具体的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。

合适的古细菌宿主包括但不限于属于下述属的细胞：Aeropyrum，古生球菌属(Archaeglobus)，盐杆菌属(Halobacterium)，甲烷球菌属(Methanococcus)，甲烷杆菌属(Methanobacterium)，火球菌属(Pyrococcus)，硫化叶菌属(Sulfolobus)，和热原体属(Thermoplasma)。古细菌菌株的例子包括但不限于：闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)，盐杆菌(Halobacterium sp.)，詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)，热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)，嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)，火山热原体(Thermoplasma volcanium)，Pyrococcus horikoshii，Pyrococcus abyssi，和Aeropyrum pernix。

合适的真核宿主包括但不限于真菌细胞，藻类细胞，昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，在本方法中有用的酵母包括已保藏于微生物保藏机构(例如IFO，ATCC等)且属于下述属的酵母：针芽孢酵母(Aciculoconidium)，神食酵母(Ambrosiozyma)，节囊酵母(Arthroascus)，Arxiozyma，Ashbya，Babjevia，Bensingtonia，Botryoascus，Botryozyma，酒香酵母(Brettanomyces)，布勒弹孢酵母(Bullera)，Bulleromyces，假丝酵母(Candida)，固囊酵母(Citeromyces)，棒孢酵母(Clavispora)，隐球酵母(Cryptococcus)，Cystofilobasidium，德巴利酵母(Debaryomyces)，德克酵母(Dekkara)，Dipodascopsis，Dipodascus，爱尼拉酵母(Eeniella)，拟内孢霉(Endomycopsella)，Eremascus，Eremothecium，Erythrobasidium，Fellomyces，线黑粉菌(Filobasidium)，Galactomyces，地霉(Geotrichum)，小季酵母(Guilliermondella)，有孢汉逊酵母(Hanseniaspora)，Hansenula，Hasegawaea，Holtermannia，连锁酵母(Hormoascus)，Hyphopichia，伊萨酵母(Issatchenkia)，克勒克酵母(Kloeckera)，Kloeckeraspora，克鲁维酵母(Kluyveromyces)，Kondoa，Kuraishia，Kurtzmanomyces，白色冬孢酵母(Leucosporidium)，油脂酵母(Lipomyces)，类德酵母(Lodderomyces)，Malassezia，酶奇酵母(Metschnikowia)，Mrakia，Myxozyma，纳逊酵母(Nadsonia)，Nakazawaea，针孢酵母(Nematospora)，Ogataea，卵孢酵母(Oosporidium)，管囊酵母(Pachysolen)，厚壁孢酵母(Phachytichospora)，范菲亚酵母(Phaffia)，毕赤酵母(Pichia)，红色冬孢酵母(Rhodosporidium)，红酵母(Rhodotorula)，糖酵母(Saccharomyces)，类酵母(Saccharomycodes)，复膜孢子酵母(Saccharomycopsis)，Saitoella，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母(Schizoblastosporion)，裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)，许旺氏酵母(Schwanniomyces)，锁合掷孢酵母(Sporidiobolus)，掷孢酵母(Sporobolomyces)，孢皮肥厚酵母(Sporopachydermia)，冠囊酵母(Stephanoascus)，梗孢酵母(Sterigmatomyces)，拟梗孢酵母(Sterigmatosporidium)，Symbiotaphrina，合轴酵母(Sympodiomyces)，Sympodiomycopsis，有孢圆酵母(Torulaspora)，Trichosporiella，丝孢酵母(Trichosporon)，三角酵母(Trigonopsis)，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母(Wickerhamia)，拟威克酵母(Wickerhamiella)，拟威尔酵母(Williopsis)，Yamadazyma，耶罗酵母(Yarrowia)，接合酵母(Zygoascus)，接合糖酵母(Zygosaccharomyces)，Zygowilliopsis和Zygozyma等。

在一些实施方案中，所述宿主微生物是酿酒酵母(即啤酒糖酵母)(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，布鲁塞尔德克酵母(Dekkerabruxellensis)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(以前称为乳酸酵母(Saccharomyces lactis))，马克斯克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)，Arxula adeninivorans，或多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)(现称为Pichiaangusta)。在一些实施方案中，所述宿主微生物是假丝酵母属诸如解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，季也蒙氏假丝酵母(Candida guilliermondii)，克鲁斯氏假丝酵母(Candida krusei)，假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)，或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

在一个具体的实施方案中，所述宿主微生物是酿酒酵母。在一些实施方案中，所述宿主是选自下组的酿酒酵母菌株：面包酵母(Baker’s yeast)，CBS7959，CBS7960，CBS7961，CBS7962，CBS7963，CBS7964，IZ-1904，TA，BG-1，CR-1，SA-1，M-26，Y-904，PE-2，PE-5，VR-1，BR-1，BR-2，ME-2，VR-2，MA-3，MA-4，CAT-1，CB-1，NR-1，BT-1，和AL-1。在一些实施方案中，所述宿主是选自下组的酿酒酵母菌株：PE-2，CAT-1，VR-1，BG-1，CR-1，和SA-1。在一个具体的实施方案中，所述酿酒酵母菌株是PE-2。在另一个具体的实施方案中，所述酿酒酵母菌株是CAT-1。在另一个具体的实施方案中，所述酿酒酵母菌株是BG-1。

在一些实施方案中，所述宿主微生物是适合于工业发酵的微生物。在具体的实施方案中，所述微生物进行条件化以在高溶剂浓度，高温，扩展的底物利用，营养物限制，糖和盐所致渗透应激，酸度，亚硫酸盐和细菌污染，或其组合下存活，它们是公认的工业发酵环境的应激条件

5.2.2 用于乙酰-CoA生产的异源ADA

一方面，本文中提供能够生成乙酰-CoA衍生的类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含一种或多种编码酰化乙醛脱氢酶(也称作“乙酰醛脱氢酶，乙酰化”，“乙酰醛脱氢酶，酰化”，或ADA(EC1.2.1.10))的异源核苷酸序列。

对本文中提供的组合物和方法有用的能够催化这种反应的蛋白质包括下述四种类型的蛋白质：

(1)催化乙酰-CoA可逆转化成乙醛，及随后乙醛可逆转化成乙醇的双功能蛋白质。这种类型的蛋白质的一个例子是大肠杆菌中的AdhE蛋白(GenBank No：NP_415757)。AdhE看来是基因融合的进化产物。AdhE蛋白的NH₂末端区域与醛:NAD⁺氧化还原酶高度同源，而COOH末端区域与Fe²⁺依赖性乙醇:NAD⁺氧化还原酶同源(Membrillo-Hernandez et al.,(2000)J.Biol.Chem.275:33869-33875)。大肠杆菌AdhE经受金属催化的氧化，因此对氧敏感(Tamarit et al.(1998)J.Biol.Chem.273:3027-32)。

(2)在严格或兼性厌氧微生物中催化乙酰-CoA可逆转化成但不拥有醇脱氢酶活性的蛋白质。已经报告了克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中这种类型蛋白质的一个例子(Smith et al.(1980)Arch.Biochem.Biophys.203:663-675)。已经在克氏梭菌DSM555的基因组中注释了ADA(登录号：EDK33116)。在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的基因组中鉴定出同源蛋白AcdH(登录号：NP_784141)。这种类型蛋白质的另一个例子是拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NRRL B593中的ald基因产物(Toth et al.(1999)Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980，登录号：AAD31841)。

(3)参与乙醇胺分解代谢的蛋白质。乙醇胺可作为碳源和氮源二者被许多肠细菌利用(Stojiljkovic et al.(1995)J.Bacteriol.177:1357-1366)。首先乙醇胺氨裂合酶将乙醇胺转化成氨和乙醛，随后ADA将乙醛转化成乙酰-CoA。这种类型的ADA的一个例子是鼠伤寒沙门氏菌中的EutE蛋白(Stojiljkovic etal.(1995)J.Bacteriol.177:1357-1366，登录号：AAL21357；还可参见U18560.1)。大肠杆菌也能够利用乙醇胺(Scarlett et al.(1976)J.Gen.Microbiol.95:173-176)且具有与鼠伤寒沙门氏菌中的EutE蛋白同源的EutE蛋白(登录号：AAG57564；还可参见EU897722.1)。

(4)作为参与4-羟基-2-酮基戊酸盐分解代谢的双功能醛缩酶-脱氢酶复合物的一部分的蛋白质。此类双功能酶催化儿茶酚间位切割途径的最后两步，儿茶酚是多种细菌物种中降解酚，甲苯酸酯(toluates)，萘，联苯和其它芳香族化合物的中间产物(Powlowski and Shingler(1994)Biodegradation5,219-236)。首先4-羟基-2-酮基戊酸盐醛缩酶将4-羟基-2-酮基戊酸盐转化成丙酮酸和乙醛，随后ADA将乙醛转化成乙酰-CoA。这种类型的ADA的一个例子是假单胞菌(Pseudomonas sp.)CF600中的DmpF蛋白(登录号：CAA43226)(Shingler et al.(1992)J.Bacteriol.174:711-24)。大肠杆菌具有与假单胞菌CF600中的DmpF蛋白同源的MphF蛋白(Ferrandez et al.(1997)J.Bacteriol.179:2573-2581，登录号：NP_414885)。

在一些实施方案中，对本文中描述的组合物和方法有用的ADA(或编码此类活性的核酸序列)选自下组：大肠杆菌adhE，Entamoeba histolytica adh2，金黄色葡萄球菌adhE，Piromyces sp.E2adhE，克氏梭菌(EDK33116)，植物乳杆菌acdH，和恶臭假单胞菌(YP001268189)，如记载于国际公开文本号WO2009/013159，通过提述完整收录其内容。在一些实施方案中，ADA选自下组：肉毒梭菌(Clostridium botulinum)eutE(FR745875.1)，Desulfotaleapsychrophila eutE(CR522870.1)，不动杆菌(Acinetobacter sp.)HBS-2eutE(ABQ44511.2)，Caldithrix abyssi eutE(ZP_09549576)，和Halorubrumlacusprofundi ATCC49239(YP_002565337.1)。

在具体的实施方案中，对本文中提供的组合物和方法有用的ADA是来自Dickeya zeae的eutE。Dickeya zeae的一种代表性eutE核苷酸序列包括登录号NC_012912.1:1110476..1111855和如本文中提供的SEQ ID NO:1。Dickeya zeae的一种代表性eutE蛋白质序列包括登录号YP_003003316和如本文中提供的SEQ ID NO:2。

在本文中提供的组合物和方法中有用的ADA还包括那些据说是本文中描述的任何ADA的“衍生物”的分子。此类“衍生物”具有下述特征：(1)与本文中描述的任何ADA分享实质同源性；和(2)能够催化乙醛转化成乙酰-CoA。如果ADA衍生物的氨基酸序列与本文中描述的任何ADA的氨基酸序列至少80％，至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，那么就说该衍生物与ADA分享“实质同源性”。

5.2.2.1 用于鉴定功能性ADA的方法

另一方面，本文中提供具有升高的体内性能的ADA的筛选方法。在这种筛选方法中，通过其挽救工程化宿主细胞避免细胞死亡的能力来鉴定具有升高的体内性能的ADA。工程化宿主细胞包含用于生成胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物(例如类异戊二烯)的异源途径。在一些实施方案中，工程化宿主细胞还包含功能性破坏的PDH旁路途径和具有微弱活性的ADA，其中功能性破坏的PDH旁路途径和具有微弱活性的ADA的组合活性不生成足够的胞质溶胶乙酰-CoA来满足生成细胞存活，健康和/或生长需要的(1)胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物；和(2)胞质溶胶乙酰-CoA衍生的初级代谢物二者的需要。对于存活，健康和/或生长，因此宿主细胞需要活性ADA，其能够生成升高的胞质溶胶乙酰-CoA集合。

在一些实施方案中，具有升高的体内性能的ADA的筛选方法包括：(a)在具有功能性破坏的PDH旁路途径的宿主细胞中表达对照ADA以生成升高水平的胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物，其中与不生成升高水平的胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的亲本细胞相比，生成升高水平的胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物降低宿主细胞的存活力；及(b)在宿主细胞中表达测试ADA，代替对照ADA；由此，与表达对照ADA的宿主细胞相比，表达测试ADA的宿主细胞的存活力提高将测试ADA鉴定为与对照ADA相比，具有改善的体内性能。

在一些实施方案中，宿主细胞中升高水平的胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的生成是可诱导的。诱导可响应诱导剂(例如半乳糖)或特定生长条件(例如生长温度)而发生。当在诱导剂缺失下培养时，宿主细胞的ADA活性足以能够生成宿主细胞存活需要的胞质溶胶乙酰-CoA。然而，当在诱导剂存在下培养时，宿主细胞的ADA活性不足以能够生成宿主细胞存活需要的胞质溶胶乙酰-CoA和升高水平的胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物二者。因此，在后一种情况中，宿主细胞存活需要能够生成升高集合的胞质溶胶乙酰-CoA的、活性更高的ADA。宿主细胞中胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的产量的范围可以是比亲本细胞中胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的产量高约10％到至少约1,000倍或更多。

与亲本细胞相比，表达对照ADA的宿主细胞的降低的存活力的范围可以是降低的细胞生长至致死。因此，在一些实施方案中，与亲本细胞相比，表达对照ADA的宿主细胞在液体培养物中或琼脂板上产生减少数目的后代细胞。在其它实施方案中，与亲本细胞相比，表达对照ADA的宿主细胞在液体培养物中或在琼脂板上不产生后代细胞。因而，与表达对照ADA的宿主细胞产生的后代细胞数目或集落尺寸相比，表达测试ADA代替对照ADA的宿主细胞的存活力的升高可表现为在液体培养物中更高数目的后代细胞或在琼脂板上更大的集落尺寸。

可通过修饰在宿主细胞中参与胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物或其前体生成的酶的表达和/或活性来实现宿主细胞中升高水平的胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的生成。在一些此类实施方案中，修饰MEV或DXP途径中的酶的表达和/或活性。在一些此类实施方案中，修饰HMG-CoA还原酶和/或甲羟戊酸激酶的表达和/或活性。

对照ADA和测试ADA可以是天然存在的ADA或非天然存在的ADA。在一些实施方案中，测试ADA是对照ADA的变体，其因一处或多处氨基酸替代，删除，和/或添加而不同于对照ADA。在一些实施方案中，测试ADA包含与对照ADA同一的氨基酸，但是编码这些氨基酸的密码子在测试ADA和对照ADA之间不同。在一些此类实施方案中，密码子针对宿主细胞中的使用率经过优化。在一些实施方案中，对照ADA和/或测试ADA与丙酮酸脱羧酶融合。在一些实施方案中，测试ADA的表达在强启动子的调节性控制下。在一些实施方案中，测试ADA的表达在中等强度的启动子的调节性控制下。在一些实施方案中，测试ADA的表达在弱启动子的调节性控制下。

可通过比对照ADA更具活性的测试ADA或通过具有与对照ADA相似或更弱活性但以更高水平表达的测试ADA来实现在测试ADA存在下宿主细胞存活力的升高。可通过在宿主细胞中以相似水平表达对照ADA和测试ADA来完成对具有升高活性的测试ADA的鉴定。例如，这可通过在宿主细胞中将编码对照ADA和测试ADA的核苷酸序列置于相同调节元件的控制下来完成。在使用该方法的其它实施方案中，例如，为了鉴定提供期望表达水平的调节元件(例如启动子)，测试ADA不在核苷酸或氨基酸序列上而是在表达水平上不同于对照ADA。在此类实施方案中，可将不同调节元件用于对照ADA和测试ADA的表达，宿主细胞存活力的比较提供并非有关测试ADA的活性而是关于驱动测试ADA表达的调节元件的强度的信息。

为了防止快速生长的假阳性宿主细胞(其包含促进生长的突变而非改善的ADA变体)超越宿主细胞培养物的竞争性生长情况，筛选方法的一个实施方案涉及基于琼脂板的选择系统。在这个实施方案中，将宿主细胞涂布于琼脂板上，并通过集落生长来鉴定包含具有改善的体内性能的测试ADA变体的宿主细胞。

当前公开的筛选方法的实质性优点在于其简单性和高通量执行的能力。仅仅根据细胞存活力就鉴定ADA变体，使得其它昂贵且费时的筛选方法实际上不必要。因此，在一个实施方案中，该方法用于对ADA变体的集合(例如突变体ADA的文库)筛选具有改善的体内性能的ADA变体。在一个此类实施方案中，不是在宿主细胞中表达单一的测试ADA，而是在宿主细胞的集合中表达测试ADA的集合。然后，可以在琼脂板上培养宿主细胞，并且可以根据集落生长鉴定表达具有改善的体内性能的ADA变体的宿主细胞。在一些实施方案中，ADA变体的集合包含2到5，5到10，10到50，50到100，100到500，500到1,000，1,000到10,000，10,000到100,000，100,000到1,000,000，和更多种ADA变体。

当前公开的筛选方法的另一项主要优点在于其以迭代方式选择越来越好的ADA变体的持续能力，其中将在某一迭代中鉴定得到的测试ADA在下一迭代中用作对照ADA。然而，一个此类实施方案要求在每一迭代检查宿主细胞中胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的产量，并潜在地提高(例如通过提高或降低酶的表达水平，添加或去除酶，增加或减少基因的拷贝数，替换控制酶表达的启动子，或通过遗传突变改变酶)到当宿主细胞表达新对照ADA(即前一迭代中的测试ADA)时引起存活力降低的水平。或者/另外，在每一迭代，可降低对照ADA的表达(例如通过降低表达或通过使用更弱的启动子或通过降低对照ADA转录物或多肽的稳定性)以提供降低的对照ADA活性。然后，在下一迭代中可鉴定仍具有与先前迭代的测试ADA相比升高的体内性能的测试ADA。

当前公开的筛选方法的另一项主要优点在于对改善的ADA的选择发生在体内而不是体外。结果是，可获得增强ADA变体体内性能的多种酶特性的改善。

使用当前公开的筛选方法开发的酶可进行另外的任选筛选手段，包括但不限于荧光筛选和/或通过气相层析对胞质溶胶乙酰-CoA衍生的次级代谢物的直接定量。更具体而言，这包括用于测量倍半萜(诸如法呢烯)的产量的基于尼罗红的高通量荧光测定法，和用于测量倍半萜(诸如法呢烯)的滴度的基于气相层析(GC)的直接定量方法。改善的酶也可通过遗传工程方法(诸如诱导突变等等)进一步改善。结果是，相继实现增强最终酶性能的多种酶特性的改进，并鉴定出最有效的酶变体。

5.2.3 PDH旁路的功能性破坏

在线粒体中，可通过丙酮酸由PDH复合物催化的氧化脱羧而形成乙酰-CoA。然而，由于酿酒酵母没有将乙酰-CoA转运到线粒体外的能力，因此PDH旁路对于提供胞质溶胶区室中的乙酰-CoA具有至关重要的作用，并且为丙酮酸转化成乙酰-CoA的PDH反应提供一种备选途径。PDH旁路涉及丙酮酸脱羧酶(PDC；EC4.1.1.1)，乙醛脱氢酶(ACDH；EC1.2.1.5和EC1.2.1.4)，和乙酰-CoA合成酶(ACS；EC6.2.1.1)。丙酮酸脱羧酶催化丙酮酸脱羧成乙醛和二氧化碳。乙醛脱氢酶将乙醛氧化成乙酸。在酿酒酵母中，醛脱氢酶家族包含5个成员。ALD2(YMR170c)，ALD3(YMR169c)和ALD6(YPL061w)对应于胞质溶胶同种型，而ALD4(YOR374w)和ALD5(YER073w)编码线粒体酶。主要的胞质溶胶乙醛脱氢酶同种型由ALD6编码。自乙酸形成乙酰-CoA由ACS催化，且涉及ATP的水解。两种结构基因(ACS1和ACS2)编码ACS。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含PDH旁路途径中一种或多种基因的功能性破坏。在一些实施方案中，宿主细胞的PDH旁路中一种或多种基因的破坏导致经遗传修饰的微生物细胞在其催化一种或多种下述反应的能力上受损：(1)由丙酮酸脱羧酶将丙酮酸脱羧成乙醛；(2)由乙醛脱氢酶将乙醛转化成乙酸；和(3)由乙酰-CoA合成酶自乙酸和CoA合成乙酰-CoA。

在一些实施方案中，与亲本细胞相比，宿主细胞包含PDH旁路途径的一种或多种基因的功能性破坏，其中单独的或与弱ADA组合的功能减弱的或无功能的PDH旁路途径的活性不足以支持宿主细胞生长，存活和/或健康。

在一些实施方案中，PDH旁路的一种或多种内源蛋白质的活性或表达降低至少约50％。在另一个实施方案中，与不包含PDH旁路的一种或多种内源蛋白质的表达或活性降低或缺失的重组微生物相比，PDH旁路的一种或多种内源蛋白质的活性或表达降低至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％。

本领域技术人员应当理解，有数种机制可用于降低或破坏蛋白质(诸如PDH旁路中的蛋白质)的活性，包括但不限于使用受调节的启动子，使用组成性弱启动子，在二倍体酵母中破坏编码蛋白质的基因的两个拷贝之一，在二倍体酵母中破坏基因的所有两个拷贝，表达反义核酸，表达siRNA，过表达内源启动子的负调节物，改变内源或异源基因的活性，使用具有较低比活性的异源基因，等等，或其组合。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含至少一种编码PDH旁路蛋白质的基因中的突变，导致由所述基因编码的多肽的活性降低。在另一个实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含编码PDH旁路蛋白质的基因的部分删除，导致由该基因编码的多肽的活性降低。在另一个实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含编码PDH旁路蛋白质的基因的完全删除，导致由该基因编码的多肽的活性降低。在还有另一个实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含与编码PDH旁路蛋白质的基因相关的调节区的修饰，导致由所述基因编码的多肽的表达降低。在还有另一个实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含转录调节物的修饰，导致编码PDH旁路蛋白质的基因的转录降低。在还有另一个实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含所有编码PDH旁路蛋白质的基因中的突变，导致由该基因编码的多肽的活性降低。在一个实施方案中，PDH旁路蛋白质的活性或表达降低至少约50％。在另一个实施方案中，与不包含PDH旁路蛋白质的表达或活性降低的重组微生物相比，PDH旁路蛋白质的活性或表达降低至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％。

在一些实施方案中，通过使用“破坏构建体”来实现PDH旁路中的一种或多种基因的破坏，在将“破坏构建体”引入微生物细胞后，构建体能够特异性破坏PDH旁路的基因，由此使得受到破坏的基因无功能。在一些实施方案中，靶基因的破坏阻止功能性蛋白质的表达。在一些实施方案中，靶基因的破坏导致自受到破坏的基因表达非功能性蛋白质。在一些实施方案中，通过同源重组将“破坏序列”整合到靶基因基因座中，由此实现PDH旁路基因的破坏。在此类实施方案中，破坏构建体包含破坏序列，其侧翼是与靶基因基因座的一对核苷酸序列同源的一对核苷酸序列(同源序列)。一旦破坏构建体替换了靶基因的靶定部分，破坏序列阻止功能性蛋白质的表达，或引起自靶基因表达非功能性蛋白质。

能够破坏PDH旁路基因的破坏构建体可使用本领域共知的标准分子生物学技术来构建。参见例如Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning--ALaboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY和Ausubel et al.,eds.,Current Edition,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY。在本方法的实践中可变化的破坏构建体参数包括但不限于同源序列的长度，同源序列的核苷酸序列，破坏序列的长度，破坏序列的核苷酸序列，和靶基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，每种同源序列的长度的有效范围是50到5,000个碱基对。在具体的实施方案中，每种同源序列的长度是约500个碱基对。关于基因打靶需要的同源性长度的讨论参见Hasty et al.,Mol Cell Biol11:5586-91(1991)。在一些实施方案中，同源序列包含靶基因的编码序列。在其它实施方案中，同源序列包含靶基因的上游或下游序列。在一些实施方案中，一种同源序列包含与位于靶基因编码序列5’端的核苷酸序列同源的核苷酸序列，而另一种同源序列包含与位于靶基因编码序列3’端的核苷酸序列同源的核苷酸序列。在一些实施方案中，破坏序列包含编码选择标记的核苷酸序列，其能够选择包含破坏序列的微生物细胞。因而，在此类实施方案中，破坏构建体具有双重功能，即功能性破坏靶基因和提供选择标记(用于鉴定其中的靶基因受到功能性破坏的细胞)。在一些实施方案中，终止密码子以符合读码框的方式位于编码选择标记的核苷酸序列下游以阻止翻译通读，翻译通读可能产生具有一定程度的、由靶基因编码的野生型蛋白质的活性的融合蛋白。在一些实施方案中，破坏序列长度是一个碱基对。单个碱基对的插入会足以破坏靶基因，因为编码序列中单个碱基对的插入可构成移码突变，移码突变能阻止功能性蛋白质的表达。在一些实施方案中，破坏序列的序列与位于同源序列之间的靶基因的核苷酸序列相差单个碱基对。一旦用破坏序列替换靶基因内的核苷酸序列，引入的单个碱基对替代会导致蛋白质中关键位点处的单个氨基酸替代和非功能性蛋白质的表达。然而，应当领会，使用非常短的破坏序列造成的破坏易于通过自发突变回复成野生型序列，由此导致宿主菌株恢复PDH旁路功能。因而，在具体的实施方案中，破坏序列要更长一个至一些碱基对。在另一个极端，过长的破坏序列不大可能比长度适中的破坏序列赋予任何优点，而且可能降低转染或打靶的效率。这种背景中的过长指比靶基因中的选定同源序列之间的距离长许多倍。因而，在某些实施方案中，破坏序列的长度可以是2到2,000个碱基对。在其它实施方案中，破坏序列的长度大约等同于靶基因基因座中与破坏构建体中的同源序列匹配的区域之间的距离。

在一些实施方案中，破坏构建体是线性DNA分子。在其它实施方案中，破坏构建体是环状DNA分子。在一些实施方案中，如上所述，环状破坏构建体包含由破坏序列分开的一对同源序列。在一些实施方案中，环状破坏构建体包含单一同源序列。一旦整合到靶基因基因座，此类环状破坏构建体会变成线性化的，具有位于每个末端的同源序列一部分，而且破坏构建体的剩余区段插入并破坏靶基因，不替换靶基因的任何核苷酸序列。在具体的实施方案中，环状破坏构建体的单一同源序列与位于靶基因编码序列内的序列同源。

可通过本领域技术人员已知的任何方法将破坏构建体引入微生物细胞，没有限制。此类方法包括但不限于细胞自溶液直接摄取分子，或经由脂转转(使用例如脂质体或免疫脂质体)的促进摄取，颗粒介导的转染，等。参见例如美国专利No.5,272,065；Goeddel et al.,eds,1990,Methods in Enzymology,vol.185,Academic Press,Inc.,CA；Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；Sambrook et al.,1989,MolecularCloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY；Ausubel etal.,eds.,Current Edition,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,NY。用于转化酵母细胞的具体方法是本领域公知的。参见Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1292-3(1978)；Cregg et al.,Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(1985)。例示性技术包括但不限于原生质球法，电穿孔，PEG1000介导的转化，和乙酸锂或氯化锂介导的转化。

5.2.3.1 ALD4和ALD6

在一些实施方案中，宿主细胞中编码醛脱氢酶(ACDH)活性的一种或多种基因是功能性破坏的。在一些实施方案中，醛脱氢酶是由选自ALD2，ALD3，ALD4，ALD5，ALD6，及其同系物或变体的基因编码的。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含ALD4的功能性破坏。代表性的酿酒酵母ALD4核苷酸序列包括登录号NM_001183794和本文中提供的SEQ ID NO:7。代表性的酿酒酵母的Ald4蛋白质序列包括登录号NP_015019.1和本文中提供的SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含胞质溶胶醛脱氢酶(ALD6)的功能性破坏。Ald6p在天然PDH旁路中发挥将乙醛转化成乙酸的功能。代表性的酿酒酵母ALD6核苷酸序列包括登录号SCU56604和本文中提供的SEQ ID NO:9。代表性的酿酒酵母Ald6蛋白质序列包括登录号AAB01219和本文中提供的SEQ ID NO:10。

如本领域会理解的，可使用本文中描述的方法类似地灭活醛脱氢酶在除酿酒酵母以外的酵母中的天然存在同系物。

如本领域技术人员会理解的，可降低或消除超过一种醛脱氢酶的活性或表达。在一个具体的实施方案中，可降低或消除ALD4和ALD6或其同系物或变体的活性或表达。在另一个具体的实施方案中，可降低或消除ALD5和ALD6或其同系物或变体的活性或表达。在还有另一个具体的实施方案中，可降低或消除ALD4，ALD5，和ALD6或其同系物或变体的活性或表达。在还有另一个具体的实施方案中，可降低或消除定位于胞质溶胶的醛脱氢酶ALD2，ALD3，和ALD6或其同系物或变体的活性或表达。在还有另一个具体的实施方案中，可降低或消除定位于线粒体的醛脱氢酶ALD4和ALD5或其同系物或变体的活性或表达。

5.2.3.2 ACS1和ACS2

在一些实施方案中，宿主细胞中编码乙酰-CoA合酶(ACS)活性的一种或多种基因是功能性破坏的。在一些实施方案中，乙酰-CoA合酶是由选自ACS1，ACS2，及其同系物和变体的基因编码的。

在一些实施方案中，宿主细胞中编码乙酰-CoA合酶(ACS)活性的一种或多种基因是功能性破坏的。ACS1和ACS2均是能将乙酸转化成乙酰-CoA的乙酰-CoA合酶。ACS1仅在呼吸条件下表达，而ACS2是组成性表达的。当ACS2被敲除时，菌株能在呼吸条件(例如乙醇，甘油或乙酸培养基)上生长，但是在可发酵碳源(例如蔗糖，葡萄糖)上死亡。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含ACS1的功能性破坏。酿酒酵母ACS1基因的序列先前已有记载。参见例如Nagasu et al.,Gene37(1-3):247-253(1985)。代表性的酿酒酵母ACS1核苷酸序列包括登录号X66425和本文中提供的SEQ ID NO:3。代表性的酿酒酵母Acs1蛋白质序列包括登录号AAC04979和本文中提供的SEQ ID NO:4。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含ACS2的功能性破坏。酿酒酵母的ACS2基因的序列先前已有记载。参见例如Van den Berg et al.,Eur.J.Biochem.231(3):704-713(1995)。代表性的酿酒酵母ACS2核苷酸序列包括登录号S79456和本文中提供的SEQ ID NO:5。代表性的酿酒酵母Acs2蛋白质序列包括登录号CAA97725和本文中提供的SEQ ID NO:6。

如本领域会理解的，也可使用本文中描述的方法类似地灭活乙酰-CoA合酶在除酿酒酵母以外的酵母中的天然存在同系物。

在一些实施方案中，宿主细胞包含能在呼吸条件下(即当宿主细胞在例如乙醇，甘油，或乙酸存在下生长时)将乙酸转化成乙酰-CoA的胞质溶胶乙酰-CoA合酶活性。在一些此类实施方案中，宿主细胞是包含ACS1活性的酵母细胞。在其它实施方案中，与亲本细胞相比，宿主细胞不包含或包含减弱的、呼吸条件下的内源乙酰-CoA合酶活性。在一些此类实施方案中，与亲本细胞相比，宿主细胞是不包含或包含减弱的ACS1活性的酵母细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞包含能在非呼吸条件下(即当宿主细胞在可发酵碳源(例如蔗糖，葡萄糖)存在下生长时)将乙酸转化成乙酰-CoA的胞质溶胶乙酰-CoA合酶活性。在一些此类实施方案中，宿主细胞是包含ACS2活性的酵母细胞。在其它实施方案中，与亲本细胞相比，宿主细胞不包含或包含减弱的、非呼吸条件下的内源乙酰-CoA合酶活性。在一些此类实施方案中，与亲本细胞相比，宿主细胞是不包含或包含减弱的ACS2活性的酵母细胞。

5.2.4 磷酸转酮酶(PK)和磷酸转乙酰酶(PTA)

在酵母中，经由糖酵解，三羧酸(TCA)循环，氧化磷酸化和丙酮酸代谢自葡萄糖生物合成乙酰-CoA。然而，在这种生物合成途径中，在由丙酮酸羧化酶进行的丙酮酸代谢期间以及在由丙酮酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶进行的TCA循环中失去CO₂。在工业发酵设置中，减少经由下游糖酵解的流量(flux)的一个好处是丙酮酸转化成乙醛时产生较少的CO₂，并且因此在终产物中捕获更多的碳，由此提高最大理论产率。第二个好处是产生较少的NADH，并且因此将其再氧化需要显著更少的氧。理论上可通过绕开TCA循环来避免碳原子的丢失。这可使用磷酸转酮酶(PK)(酶类EC4.1.2.9，EC4.1.2.22)结合磷酸乙酰转移酶(PTA)(EC2.3.1.8)来实现。

PK和PTA催化果糖-6-磷酸(F6P)或木酮糖-5-磷酸(X5P)转化成乙酰-CoA的反应(图7)。PK自戊糖磷酸中间物提取木酮糖5-磷酸，或自上游糖酵解中间物提取D-果糖6-磷酸(F6P)；PK将X5P分裂成甘油醛3-磷酸(G3P)和乙酰磷酸，或将F6P分裂成赤藓糖4-磷酸(E4P)。然后PTA将乙酰磷酸转化成乙酰-CoA。G3P能重新进入下游糖酵解，而E4P能通过经由转醛醇酶(transaldolase)和转酮醇酶(transketolase)的非氧化性戊糖磷酸途径网络循环而重新进入戊糖磷酸途径或糖酵解。

在一些实施方案中，本文中提供的经遗传修饰的宿主细胞包含编码磷酸转酮酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，磷酸转酮酶来自肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(Lee et al.,Biotechnol Lett.27(12)；853-858(2005))。代表性的肠系膜明串珠菌磷酸转酮酶核苷酸序列包括登录号AY804190和本文中提供的SEQ ID NO:11。代表性的肠系膜明串珠菌磷酸转酮酶蛋白质序列包括登录号YP_819405，AAV66077.1和本文中提供的SEQ IDNO:12。其它有用的磷酸转酮酶包括但不限于来自齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)ATCC27678(ABIX02000002.1:2350400..2352877；EDT46356.1)；动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)(NC_017834.1:1127580..1130057；YP_006280131.1)；和伪长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)(AY518216.1:988..3465；AAR98788.1)的磷酸转酮酶。

在本文中提供的组合物和方法中有用的磷酸转酮酶还包括那些据说是本文中描述的任何磷酸转酮酶的“衍生物”的分子。此类“衍生物”具有下述特征：(1)与本文中描述的任何磷酸转酮酶分享实质同源性；和(2)能够催化X5P转化成甘油醛3-磷酸(G3P)和乙酰磷酸；或F6P转化成赤藓糖4-磷酸(E4P)。如果磷酸转酮酶衍生物的氨基酸序列与磷酸转酮酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，那么就说该衍生物与磷酸转酮酶分享“实质同源性”。

在一些实施方案中，本文中提供的经遗传修饰的宿主细胞包含编码磷酸转乙酰酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，磷酸转乙酰酶来自克氏梭菌。代表性的克氏梭菌磷酸转乙酰酶核苷酸序列包括登录号NC_009706.1:1428554..1429555和本文中提供的SEQ ID NO:13。代表性的克氏梭菌磷酸转乙酰酶蛋白质序列包括登录号YP_001394780和本文中提供的SEQ ID NO:14。其它有用的磷酸转乙酰酶包括但不限于来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(NC_010609.1:460303..461277；YP_001841389.10)；枯草芽孢杆菌(NC_014479.1:3671865..3672836；YP_003868063.1)；和嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophile)(L23147.1:207..1208；AAA72041.1)的磷酸转乙酰酶。

在本文中提供的组合物和方法中有用的磷酸转乙酰酶还包括那些据说是本文中描述的任何磷酸转乙酰酶的“衍生物”的分子。此类“衍生物”具有下述特征：(1)与本文中描述的任何磷酸转乙酰酶分享实质同源性；和(2)能够催化乙酰磷酸转化成乙酰-CoA。如果磷酸转乙酰酶衍生物的氨基酸序列与磷酸转乙酰酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，那么就说该衍生物与磷酸转乙酰酶分享“实质同源性”。

5.2.5 MEV途径

在一些实施方案中，宿主细胞包含MEV途径的一种或多种异源酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将两分子乙酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合以形成HMG-CoA的酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶。在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。

在一些实施方案中，MEV途径中的一种或多种酶选自下组：乙酰-CoA硫解酶，乙酰乙酰-CoA合酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。在一些实施方案中，关于MEV途径中能够催化乙酰乙酰-CoA形成的酶，经遗传修饰的宿主细胞包含将两分子乙酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰-CoA硫解酶)或将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰乙酰-CoA合酶)任一。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含将两分子乙酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰-CoA硫解酶)和将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰乙酰-CoA合酶)二者。

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的超过一种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的两种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶和能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的三种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的四种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的五种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的六种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的七种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码MEV途径的所有酶的众多异源核酸。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞还包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核酸。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞还包含编码能缩合IPP和/或DMAPP分子以形成聚异戊二烯化合物的酶的异源核酸。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞还包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核酸。

5.2.5.1 乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含编码能缩合两分子乙酰-CoA以形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如乙酰-CoA硫解酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(NC_000913区：2324131.2325315；大肠杆菌)，(D49362；脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans))，和(L20428；酿酒酵母)。

乙酰-CoA硫解酶催化可逆的两分子乙酰-CoA缩合以产生乙酰乙酰-CoA，但是这个反应是热力学上不利的；乙酰乙酰-CoA硫解反应相对于乙酰乙酰-CoA合成反应是有利的。乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)(也称作乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶；EC2.3.1.194)将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA。与乙酰-CoA硫解酶相反，由于相关的丙二酰-CoA脱羧反应，AACS催化的乙酰乙酰-CoA合成反应本质上是能量有利的反应。此外，AACS针对乙酰乙酰-CoA不表现硫解活性，因此该反应是不可逆的。

在包含异源ADA和乙酰-CoA硫解酶的宿主细胞中，由乙酰-CoA硫解酶(其偏好乙酰乙酰-CoA硫解反应)催化的可逆反应可产生大量乙酰-CoA集合。鉴于ADA的可逆活性，这个乙酰-CoA集合继而可驱动ADA朝着将乙酰-CoA转化成乙醛的逆反应，由减弱由ADA朝向乙酰-CoA生成提供的好处。因此，在一些实施方案中，为了提供对乙酰-CoA的强拉动以驱动朝向ADA的正反应，本文中提供的经遗传修饰的宿主细胞中的MEV途径利用乙酰乙酰-CoA合酶自乙酰-CoA和丙二酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA。

在一些实施方案中，AACS来自链霉菌(Streptomyces sp.)菌株CL190(Okamura et al.,Proc Natl Acad Sci USA107(25):11265-70(2010))。代表性的链霉菌菌株CL190AACS核苷酸序列包括登录号AB540131.1和本文中提供的SEQ ID NO:15。代表性的链霉菌菌株CL190AACS蛋白质序列包括登录号D7URV0，BAJ10048和本文中提供的SEQ ID NO:16。对本文中提供的组合物和方法有用的其它乙酰乙酰-CoA合酶包括但不限于链霉菌(AB183750；KO-3988BAD86806)；S.anulatus菌株9663(FN178498；CAX48662)；链霉菌KO-3988(AB212624；BAE78983)；游动放线菌(Actinoplanes sp.)A40644(AB113568；BAD07381)；链霉菌C(NZ_ACEW010000640；ZP_05511702)；Nocardiopsis dassonvillei DSM43111(NZ_ABUI01000023；ZP_04335288)；溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)Agy99(NC_008611；YP_907152)；海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)M(NC_010612；YP_001851502)；链霉菌Mg1(NZ_DS570501；ZP_05002626)；链霉菌AA4(NZ_ACEV01000037；ZP_05478992)；玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)NRRL15998(NZ_ABYB01000295；ZP_04696763)；链霉菌ACTE(NZ_ADFD01000030；ZP_06275834)；产绿色链霉菌(S.viridochromogenes)DSM40736(NZ_ACEZ01000031；ZP_05529691)；弗兰克氏菌(Frankia sp.)CcI3(NC_007777；YP_480101)；巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)(NC_018681；YP_006812440.1)；和Austwickia chelonae(NZ_BAGZ01000005；ZP_10950493.1)。另外的合适的乙酰乙酰-CoA合酶包括美国专利申请公开文本No.2010/0285549和No.2011/0281315中记载的那些，通过提述完整收录其内容。

在本文中提供的组合物和方法中有用的乙酰乙酰-CoA合酶还包括那些据说是本文中描述的任何乙酰乙酰-CoA合酶的“衍生物”的分子。此类“衍生物”具有下述特征：(1)与本文中描述的任何乙酰乙酰-CoA合酶分享实质同源性；和(2)能够催化乙酰-CoA与丙二酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA的不可逆缩合。如果乙酰乙酰-CoA合酶衍生物的氨基酸序列与乙酰乙酰-CoA合酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，那么就说该衍生物与乙酰乙酰-CoA合酶分享“实质同源性”。

5.2.5.2 乙酰乙酰-CoA转化成HMG-CoA

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将乙酰乙酰-CoA与另一分子乙酰-CoA缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)的酶(例如HMG-CoA合酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(NC_001145.互补物19061.20536；酿酒酵母)，(X96617；酿酒酵母)，(X83882；拟南芥(Arabidopsis thaliana))，(AB037907；Kitasatospora griseola)，(BT007302；人(Homo sapiens))，和(NC_002758，基因座标签SAV2546，GeneID1122571；金黄色葡萄球菌)。

5.2.5.3 HMG-CoA转化成甲羟戊酸

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将HMG转化成甲羟戊酸的酶(例如HMG-CoA还原酶)的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，HMG-CoA还原酶是利用NADH的羟基甲基戊二酰-CoA还原酶。HMG-CoA还原酶(EC1.1.1.34；EC1.1.1.88)催化(S)-HMG-CoA还原性脱酰基成(R)-甲羟戊酸，而且可分成两类，即I类和II类HMGr。I类包括来自真核生物和大多数古细菌的酶，而II类包括某些原核生物和古细菌的HMG-CoA还原酶。除了序列上的差异之外，两类酶在它们的辅因子特异性方面也不同。与专一利用NADPH的I类酶不同，II类HMG-CoA还原酶在辨别NADPH和NADH的能力方面不同。参见例如Hedl et al.,Journal of Bacteriology186(7):1927-1932(2004)。下文提供选定的II类HMG-CoA还原酶的辅因子特异性。

表1：选定的II类HMG-CoA还原酶的辅因子特异性

来源	辅酶特异性	Km NADPH(μM)	Km NADH(μM)
				P.mevalonii	NADH		80
A.fulgidus	NAD(P)H	500	160
				金黄色葡萄球菌	NAD(P)H	70	100
粪肠球菌(E.faecalis)	NADPH	30

对本文中提供的组合物和方法有用的HMG-CoA还原酶包括能够利用NADH作为辅因子的HMG-CoA还原酶，例如来自P.mevalonii，A.fulgidus或金黄色葡萄球菌的HMG-CoA还原酶。在具体的实施方案中，HMG-CoA还原酶能够仅利用NADH作为辅因子，例如来自P.mevalonii，S.pomeroyi或食酸戴尔福特菌的HMG-CoA还原酶。

在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶来自Pseudomonasmevalonii。编码HMG-CoA还原酶(E.C.1.1.1.88)的Pseudomonas mevalonii野生型mvaA基因的序列先前已有记载。参见Beach and Rodwell,J.Bacteriol.171:2994-3001(1989)。代表性的Pseudomonas mevalonii mvaA核苷酸序列包括登录号M24015和本文中提供的SEQ ID NO:17。代表性的Pseudomonasmevalonii HMG-CoA还原酶蛋白质序列包括登录号AAA25837，P13702，MVAA_PSEMV和本文中提供的SEQ ID NO:18。

在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶来自Silicibacterpomeroyi。代表性的Silicibacter pomeroyi HMG-CoA还原酶核苷酸序列包括登录号NC_006569.1和本文中提供的SEQ ID NO:19。代表性的Silicibacterpomeroyi HMG-CoA还原酶蛋白质序列包括登录号YP_164994和本文中提供的SEQ ID NO:20。

在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶来自食酸戴尔福特菌。代表性的食酸戴尔福特菌HMG-CoA还原酶核苷酸序列包括登录号NC_010002区域：互补物(319980..321269)和本文中提供的SEQ ID NO:21。代表性的食酸戴尔福特菌HMG-CoA还原酶蛋白质序列包括登录号YP_001561318和本文中提供的SEQ ID NO:22。

在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶来自Solanumtuberosum(Crane et al.,J.Plant Physiol.159:1301-1307(2002))。

在本文中提供的组合物和方法中有用的利用NADH的HMG-CoA还原酶还包括那些据说是本文中描述的任何利用NADH的HMG-CoA还原酶(例如来自P.mevalonii，S.pomeroyi和食酸戴尔福特菌的)的“衍生物”的分子。此类“衍生物”具有下述特征：(1)与本文中描述的任何任何利用NADH的HMG-CoA还原酶分享实质同源性；和(2)能够催化(S)-HMG-CoA还原性脱酰基成(R)-甲羟戊酸，同时优先利用NADH作为辅因子。如果利用NADH的HMG-CoA还原酶衍生物的氨基酸序列与利用NADH的HMG-CoA还原酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，那么就说该衍生物与利用NADH的HMG-CoA还原酶分享“实质同源性”。

如本文中使用的，短语“利用NADH”表示相比于NADPH，利用NADH的HMG-CoA还原酶对于NADH作为辅因子是选择性的，胜过NADPH，例如表现为对NADH的比活性比NADPH更高。在一些实施方案中，将对NADH作为辅因子的选择性表示为比率k_cat ^(NADH)/k_cat ^(NADPH)。在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶具有至少5，10，15，20，25或大于25的比率k_cat ^(NADH)/k_cat ^(NADPH)。在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶专一利用NADH。例如，专一利用NADH的利用NADH的HMG-CoA还原酶对在体外作为唯一辅因子供应的NADH展现一些活性(见例如下文实施例1和6.1.1.3部分)，而且当作为唯一辅因子供应NADPH时，没有展现可检测到的活性。可利用本领域已知的用于确定辅因子特异性的任何方法来鉴定具有NADH作为辅因子的偏好的HMG-CoA还原酶，包括Kim et al.,Protein Science9:1226-1234(2000)；Wilding et al.,J.Bacteriol.182(18):5147-52(2000)记载的方法，据此完整收录其内容。

在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶被工程化改造成对NADH是选择性的，胜过NADPH，例如通过辅因子结合口袋的定点诱变。用于工程化改造NADH选择性的方法记载于Watanabe et al.,Microbiology153:3044-3054(2007)，而用于确定HMG-CoA还原酶的辅因子特异性的方法记载于Kim et al.,Protein Sci.9:1226-1234(2000)，据此通过提述完整收录其内容。

在一些实施方案中，利用NADH的HMG-CoA还原酶衍生自天然包含甲羟戊酸降解途径的宿主物种，例如以甲羟戊酸作为其唯一碳源进行分解代谢的宿主物种。在这些实施方案里，在包含甲羟戊酸生物合成途径的经遗传修饰的宿主细胞中利用在其天然宿主细胞中正常情况下催化内化的(R)-甲羟戊酸氧化性酰化成(S)-HMG-CoA的利用NADH的HMG-CoA还原酶来催化逆反应，即将(S)-HMG-CoA还原性脱酰基成(R)-甲羟戊酸。能够以甲羟戊酸作为其唯一碳源生长的原核生物记载于Anderson et al.,J.Bacteriol,171(12):6468-6472(1989)；Beach et al.,J.Bacteriol.171:2994-3001(1989)；Bensch et al.,J.Biol.Chem.245:3755-3762；Fimongnari et al.,Biochemistry4:2086-2090(1965)；Siddiqi et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.8:110-113(1962)；Siddiqi et al.,J.Bacteriol.93:207-214(1967)；Takatsuji et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.110:187-193(1983)，据此通过提述完整收录其内容。

在本文中提供的组合物和方法的一些实施方案中，宿主细胞包含利用NADH的HMGr和利用NADPH的HMG-CoA还原酶二者。编码利用NADPH的HMG-CoA还原酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))，(NC_002758，基因座标签SAV2545，GeneID1122570；金黄色葡萄球菌)，(AB015627；链霉菌KO3988)，(AX128213，提供编码截短型HMG-CoA还原酶的序列；酿酒酵母)，和(NC_001145：互补物(115734.118898；酿酒酵母)。

5.2.5.4 甲羟戊酸转化成甲羟戊酸-5-磷酸

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶(例如甲羟戊酸激酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(L77688；拟南芥)，和(X55875；酿酒酵母)。

5.2.5.5 甲羟戊酸-5-磷酸转化成甲羟戊酸-5-焦磷酸

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶(例如磷酸甲羟戊酸激酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AF429385；巴西橡胶树(Hevea brasiliensis))，(NM_006556；人)，和(NC_001145.互补物712315.713670；酿酒酵母)。

5.2.5.6 甲羟戊酸-5-焦磷酸转化成IPP

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯二磷酸(IPP)的酶(例如甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(X97557；酿酒酵母)，(AF290095；屎肠球菌(Enterococcus faecium))，和(U49260；人)。

5.2.5.7 IPP转化成DMAPP

在一些实施方案中，宿主细胞还包含编码能将经由MEV途径生成的IPP转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶(例如IPP异构酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(NC_000913，3031087.3031635；大肠杆菌)，和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。

5.2.5.8 聚异戊二烯合酶

在一些实施方案中，宿主细胞还包含编码能缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有超过5个碳的聚异戊二烯化合物的聚异戊二烯合酶的异源核苷酸序列。

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将1分子IPP与1分子DMAPP缩合以形成1分子牦牛儿基焦磷酸(“GPP”)的酶(例如GPP合酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AF513111；Abies grandis)，(AF513112；Abies grandis)，(AF513113；Abies grandis)，(AY534686；金鱼草(Antirrhinum majus))，(AY534687；金鱼草)，(Y17376；拟南芥)，(AE016877，基因座AP11092；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；ATCC14579)，(AJ243739；Citrus sinensis)，(AY534745；Clarkia breweri)，(AY953508；Ips pini)，(DQ286930；Lycopersicon esculentum)，(AF182828；胡椒薄荷(Mentha x piperita))，(AF182827；胡椒薄荷)，(MPI249453；胡椒薄荷)，(PZE431697，基因座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens)，(AY866498；Picrorhiza kurrooa)，(AY351862；Vitis vinifera)，和(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码能将2分子IPP与1分子DMAPP缩合或将1分子IPP添加至1分子GPP以形成1分子法呢基焦磷酸(“FPP”)的酶(例如FPP合酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(ATU80605；拟南芥)，(ATHFPS2R；拟南芥)，(AAU36376；Artemisia annua)，(AF461050；Bos taurus)，(D00694；大肠杆菌K-12)，(AE009951，基因座AAL95523；核粒梭杆菌核粒亚种(Fusobacteriumnucleatum subsp.nucleatum)ATCC25586)，(GFFPPSGEN；稻恶苗赤霉(Gibberella fujikuroi))，(CP000009，基因座AAW60034；氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)621H)，(AF019892；Helianthus annuus)，(HUMFAPS；人)，(KLPFPSQCR；乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，(LAU15777；Lupinus albus)，(LAU20771；Lupinus albus)，(AF309508；小家鼠(Mus musculus))，(NCFPPSGEN；粗糙链孢霉(Neurospora crassa))，(PAFPS1；Parthenium argentatum)，(PAFPS2；Parthenium argentatum)，(RATFAPS；褐家鼠(Rattus norvegicus))，(YSCFPP；酿酒酵母)，(D89104；粟酒裂殖糖酵母)，(CP000003，基因座AAT87386；化脓链球菌(Streptococcuspyogenes))，(CP000017，基因座AAZ51849；化脓链球菌)，(NC_008022，基因座YP_598856；化脓链球菌MGAS10270)，(NC_008023，基因座YP_600845；化脓链球菌MGAS2096)，(NC_008024，基因座YP_602832；化脓链球菌MGAS10750)，(MZEFPS；玉蜀黍(Zea mays))，(AE000657，基因座AAC06913；Aquifex aeolicus VF5)，(NM_202836；拟南芥)，(D84432，基因座BAA12575；枯草芽孢杆菌)，(U12678，基因座AAC28894；Bradyrhizobium japonicum USDA110)，(BACFDPS；Geobacillusstearothermophilus)，(NC_002940，基因座NP_873754；杜克氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)35000HP)，(L42023，基因座AAC23087；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Rd KW20)，(J05262；人)，(YP_395294；清酒乳芽孢杆菌清酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)23K)，(NC_005823，基因座YP_000273；Leptospira interrogans serovar Copenhagenistr.Fiocruz L1-130)，(AB003187；藤黄微球菌(Micrococcus luteus))，(NC_002946，基因座YP_208768；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)FA1090)，(U00090，基因座AAB91752；根瘤菌(Rhizobium sp.)NGR234)，(J05091；酿酒酵母)，(CP000031，基因座AAV93568；Silicibacter pomeroyiDSS-3)，(AE008481，基因座AAK99890；肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)R6)，和(NC_004556，基因座NP779706；Xylella fastidiosaTemecula1)。

在一些实施方案中，宿主细胞还包含编码能组合IPP和DMAPP或IPP和FPP以形成牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(“GGPP”)的酶的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(ATHGERPYRS；拟南芥)，(BT005328；拟南芥)，(NM_119845；拟南芥)，(NZ_AAJM01000380，基因座ZP_00743052；苏云金芽孢杆菌以色列血清变型(Bacillus thuringiensisserovar israelensis)，ATCC35646sq1563)，(CRGGPPS；Catharanthus roseus)，(NZ_AABF02000074，基因座ZP_00144509；Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii，ATCC49256)，(GFGGPPSGN；稻恶苗赤霉)，(AY371321；Ginkgobiloba)，(AB055496；巴西橡胶树)，(AB017971；人)，(MCI276129；Mucorcircinelloides f.lusitanicus)，(AB016044；小家鼠)，(AABX01000298，基因座NCU01427；粗糙链孢霉)，(NCU20940；粗糙链孢霉)，(NZ_AAKL01000008，基因座ZP_00943566；Ralstonia solanacearumUW551)，(AB118238；褐家鼠)，(SCU31632；酿酒酵母)，(AB016095；Synechococcus elongates)，(SAGGPS；Sinapis alba)，(SSOGDS；酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))，(NC_007759，基因座YP_461832；Syntrophus aciditrophicus SB)，(NC_006840，基因座YP_204095；Vibriofischeri ES114)，(NM_112315；拟南芥)，(ERWCRTE；Pantoea agglomerans)，(D90087，基因座BAA14124；Pantoea ananatis)，(X52291，基因座CAA36538；荚膜红细菌)，(AF195122，基因座AAF24294；类球红球菌)，和(NC_004350，基因座NP_721015；变异链球菌(Streptococcus mutans)UA159)。

5.2.5.9 萜合酶

在一些实施方案中，宿主细胞还包含编码能修饰聚异戊二烯以形成半萜，单萜，倍半萜，双萜，三萜，四萜，多萜，类固醇化合物，类胡萝卜素或经修饰的类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码蒈烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AF461460，区域43.1926；挪威云杉(Picea abies))和(AF527416，区域：78.1871；Salvia stenophylla)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码牦牛儿醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AJ457070；Cinnamomum tenuipilum)，(AY362553；Ocimum basilicum)，(DQ234300；Perilla frutescens株1864)，(DQ234299；Perilla citriodora株1861)，(DQ234298；Perilla citriodora株4935)，和(DQ088667；Perilla citriodora)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码芳樟醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AF497485；拟南芥)，(AC002294，基因座AAB71482；拟南芥)，(AY059757；拟南芥)，(NM_104793；拟南芥)，(AF154124；Artemisia annua)，(AF067603；Clarkia breweri)，(AF067602；Clarkia concinna)，(AF067601；Clarkia breweri)，(U58314；Clarkia breweri)，(AY840091；Lycopersicon esculentum)，(DQ263741；Lavandula angustifolia)，(AY083653；Mentha citrate)，(AY693647；Ocimum basilicum)，(XM_463918；稻(Oryza sativa))，(AP004078，基因座BAD07605；稻)，(XM_463918，基因座XP_463918；稻)，(AY917193；Perilla citriodora)，(AF271259；Perillafrutescens)，(AY473623；挪威云杉)，(DQ195274；Picea sitchensis)，和(AF444798；Perilla frutescens var.crispa cultivar No.79)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码柠檬烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(+)-柠檬烯合酶(AF514287，区域：47.1867；Citruslimon)和(AY055214，区域：48.1889；Agastache rugosa)和(-)-柠檬烯合酶(DQ195275，区域：1.1905；Picea sitchensis)，(AF006193，区域：73.1986；Abies grandis)，和(MHC4SLSP，区域：29.1828；Mentha spicata)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码香叶烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(U87908；Abies grandis)，(AY195609；金鱼草)，(AY195608；金鱼草)，(NM_127982；拟南芥TPS10)，(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)，(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)，(AF271259；Perillafrutescens)，(AY473626；挪威云杉)，(AF369919；挪威云杉)，和(AJ304839；Quercus ilex)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码罗勒烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AY195607；金鱼草)，(AY195609；金鱼草)，(AY195608；金鱼草)，(AK221024；拟南芥)，(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)，(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)，(NM_117775；拟南芥ATTPS03)，(NM_001036574；拟南芥ATTPS03)，(NM_127982；拟南芥TPS10)，(AB110642；Citrus unshiu CitMTSL4)，和(AY575970；Lotuscorniculatus var.japonicus)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码α-蒎烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(+)α-蒎烯合酶(AF543530，区域：1.1887；Pinustaeda)，(-)α-蒎烯合酶(AF543527，区域：32.1921；Pinus taeda)，和(+)/(-)α-蒎烯合酶(AGU87909，区域：6111892；Abies grandis)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码β-蒎烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(-)β-蒎烯合酶(AF276072，区域：1.1749；Artemisiaannua)和(AF514288，区域：26.1834；Citrus limon)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码香桧烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于AF051901，区域：26.1798，来自Salvia officinalis。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码γ-萜品烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括：(AF514286，区域：30.1832，来自Citrus limon)和(AB110640，区域1.1803，来自Citrus unshiu)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码萜品油烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(AY693650，来自Oscimum basilicum)和(AY906866，区域：10.1887，来自Pseudotsuga menziesii)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码紫穗槐双烯合酶。合适的核苷酸序列的例子是美国专利公开文本No.2004/0005678中的SEQ ID NO.37。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码α-法呢烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：DQ309034，来自Pyrus communis cultivar d'Anjou(梨；基因名AFS1)和AY182241，来自Malus domestica(苹果；基因AFS1)。Pechouus et al.,Planta219(1):84-94(2004)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码β-法呢烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号AF024615，来自胡椒薄荷(薄荷；基因Tspa11)，和AY835398，来自Artemisia annua。Picaud et al.,Phytochemistry66(9):961-967(2005)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码法尼醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号AF529266，来自玉蜀黍和YDR481C，来自酿酒酵母(基因Pho8)。Song,L.,Applied Biochemistry and Biotechnology128:149-158(2006)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码橙花叔醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于AF529266，来自玉蜀黍(玉米；基因tps1)。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码广藿香醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于AY508730，区域：1.1659，来自Pogostemon cablin。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码诺卡酮合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于AF441124，区域：1.1647，来自Citrus sinensis和AY917195，区域：1.1653，来自Perilla frutescens。

在一些实施方案中，异源核苷酸编码松香双烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(U50768；Abies grandis)和(AY473621；挪威云杉)。

在一些实施方案中，宿主细胞生成C₅类异戊二烯。这些化合物衍生自一个异戊二烯单元，也称作半萜。半萜的一个例示性例子是异戊二烯。在其它实施方案中，类异戊二烯是C₁₀类异戊二烯。这些化合物衍生自两个异戊二烯单元，也称作单萜。单萜的例示性例子是柠檬烯，香茅醇，牦牛儿醇，薄荷醇，紫苏醇，芳樟醇，崔柏酮，和香叶烯。在其它实施方案中，类异戊二烯是C₁₅类异戊二烯。这些化合物衍生自三个异戊二烯单元，也称作倍半萜。倍半萜的例示性例子是蜚蠊酮(periplanone)B，银杏内酯(gingkolide)B，紫穗槐双烯，青蒿素，青蒿素酸，瓦伦烯，诺卡酮，epi-cedrol，epi-aristolochene，法尼醇，棉酚(gossypol)，sanonin，蜚蠊酮，毛喉素(forskolin)，和广藿香醇(也称为百秋李醇(patchouli alcohol))。在其它实施方案中，类异戊二烯是C₂₀类异戊二烯。这些化合物衍生自四个异戊二烯单元，也称作双萜。双萜的例示性例子是蓖麻烯(casbene)，eleutherobin，帕利他赛(paclitaxel)，prostratin，伪蕨素(pseudopterosin)和紫杉二烯(taxadiene)。在还有其它实施例中，类异戊二烯是C₂₀₊类异戊二烯。这些化合物衍生自超过四个异戊二烯单元，包括：三萜(C₃₀类异戊二烯化合物，衍生自六个异戊二烯单元)，诸如arbrusideE，鸦胆丁(bruceantin)，睾酮，孕酮，可的松(cortisone)，洋地黄毒苷和鲨烯；四萜(C₄₀类异戊二烯化合物，衍生自八个类异戊二烯)，诸如β-胡萝卜素；和多萜(C₄₀₊类异戊二烯化合物，衍生自超过八个异戊二烯单元)，诸如聚异戊二烯。在一些实施方案中，类异戊二烯选自下组：松香双烯，紫穗槐双烯，蒈烯，α-法呢烯，β-法呢烯，法尼醇，牦牛儿醇，牦牛儿基牦牛儿醇，异戊二烯，芳樟醇，柠檬烯，香叶烯，橙花叔醇，罗勒烯，广藿香醇，β-蒎烯，香桧烯，γ-萜品烯，萜品油烯和瓦伦烯。类异戊二烯化合物还包括但不限于类胡萝卜素(诸如番茄红素，α-和β-胡萝卜素，α-和β-隐黄质(cryptoxanthin)，胭脂树橙(bixin)，玉米黄质(zeaxanthin)，变胞藻黄素(astaxanthin)和叶黄素(lutein))，类固醇化合物，及由经其它化学基团修饰的类异戊二烯构成的化合物，诸如混合萜-生物碱，和辅酶Q-10。

5.3 生成经遗传修饰的细胞的方法

本文中还提供用于生成经遗传工程化改造以包含上文描述的一种或多种修饰的宿主细胞，例如编码选自ADA，利用NADH的HMG-CoA还原酶，AACS，PK，PTA，和甲羟戊酸途径中的其它酶的一种或多种酶的一种或多种异源核酸。异源酶在宿主细胞中的表达可通过向宿主细胞中引入包含在容许在宿主细胞中表达的调控元件控制下的、编码该酶的核苷酸序列的核酸来实现。在一些实施方案中，核酸是染色体外质粒。在其它实施方案中，核酸是能将核苷酸序列整合入宿主细胞染色体中的染色体整合载体。

可通过本领域技术人员已知的任何方法将编码这些蛋白质的核酸引入宿主细胞中，没有限制(参见例如Hinnen et al.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1292-3；Cregg et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385；Goeddel et al.eds,1990,Methods in Enzymology,vol.185,Academic Press,Inc.,CA；Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,NY；and Ausubel et al.,eds.,Current Edition,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,NY)。例示性技术包括但不限于原生质球法，电穿孔，PEG1000介导的转化，和乙酸锂或氯化锂介导的转化。

宿主细胞中酶的拷贝数可通过修饰编码酶的基因的转录来改变。这可通过例如下述方式来实现，修饰编码酶的核苷酸序列的拷贝数(例如通过使用更高或更低拷贝数的、包含核苷酸序列的表达载体，或将核苷酸序列的另外拷贝引入宿主细胞基因组中，或删除或破坏宿主细胞基因组中的核苷酸序列)，通过改变操纵子的多顺反子mRNA上编码序列的次序，或将操纵子拆解成每个具有自己的控制元件的各个基因，或提高与核苷酸序列可操作连接的启动子或操纵基因的强度。或者/另外，宿主细胞中酶的拷贝数可通过修饰编码酶的mRNA的翻译水平来改变。这可通过例如下述方式来实现，修饰mRNA的稳定性，修饰核糖体结合位点的序列，修饰核糖体结合位点和酶编码序列的起始密码之间的距离或序列，修饰位于酶编码区起始密码子5’侧附近或“上游”的整个顺反子间区，使用发夹或专门化序列稳定mRNA转录物的3’末端，修饰酶的密码子使用，改变酶生物合成中使用的罕用密码子rRNA的表达，和/或提高酶的稳定性，例如经由其编码序列的突变来实现。

可以以数种方式改变宿主细胞中酶的活性，包括但不限于表达酶在宿主细胞中展现出升高或降低的溶解性的经修饰形式，表达酶缺少抑制酶活性的结构域的经改变形式，表达酶具有对底物更高或更低的Kcat或更低或更高的Km的修饰形式，或表达酶更多或更少受途径中的另一分子的反馈或前馈调节的经改变形式。

在一些实施方案中，用于遗传修饰宿主细胞的核酸包含一种或多种选择标记，其可用于选择经转化的宿主细胞和对宿主细胞施加选择压力以维持外来DNA。

在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性标记。抗生素抗性标记的例示性例子包括但不限于BLA、NAT1、PAT、AUR1-C、PDR4、SMR1、CAT、小鼠dhfr、HPH、DSDA、KAN^R，和SH BLE基因产物。来自大肠杆菌的BLA基因产物赋予对β-内酰胺抗生素(例如窄谱头孢菌素、头霉素、和碳青霉烯类(ertapenem)、头孢孟多(cefamandole)和头孢哌酮(cefoperazone))及对除替莫西林(temocillin)以外的所有抗革兰氏阴性细菌青霉素的抗性；来自S.noursei的NAT1基因产物赋予对诺尔丝菌素的抗性；来自产绿色链霉菌Tu94的PAT基因产物赋予对双丙氨磷(bialophos)的抗性；来自酿酒酵母的AUR1-C基因产物赋予对Auerobasidin A(AbA)的抗性；PDR4基因产物赋予对蓝菌素(cerulenin)的抗性；SMR1基因产物赋予对嘧磺隆(sulfometuron)甲基的抗性；来自Tn9转座子的CAT基因产物赋予对氯霉素的抗性；小鼠dhfr基因产物赋予对甲氨蝶呤的抗性；Klebsiella pneumonia的HPH基因产物赋予对潮霉素B的抗性；大肠杆菌的DSDA基因产物允许细胞在以D-丝氨酸作为唯一氮源的板上生长；Tn903转座子的KAN^R基因赋予对G418的抗性；来自Streptoalloteichus hindustanus的SH BLE基因产物赋予对Zeocin(博来霉素)的抗性。在一些实施方案中，在分离本文中公开的经遗传修饰的宿主细胞后删除抗生素抗性标记。

在一些实施方案中，选择标记在经遗传修饰的微生物中挽救营养缺陷型(例如营养性营养缺陷型)。在此类实施方案中，亲本微生物包含在氨基酸或核苷酸生物合成途径中发挥功能的一或多种基因产物的功能性破坏，使得非功能性的亲本细胞没有能力在未补充一种或多种营养物的培养基中生长。此类基因产物包括但不限于酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2和URA3基因产物。然后可通过用编码受到破坏的基因产物的功能性拷贝的表达载体或染色体整合构建体转化亲本细胞来挽救营养缺陷型表型，而且可以根据亲本细胞的营养缺陷型表型的丧失来选择所生成的经遗传修饰的宿主细胞。利用URA3、TRP1和LYS2基因作为选择标记具有突出的优点，因为正和负选择二者都是可能的。正选择通过URA3、TRP1和LYS2突变的营养缺陷型补足来进行，而负选择基于阻止原养型菌株生长但分别允许URA3、TRP1和LYS2突变体生长的特异性抑制剂，即分别为5-氟-乳清酸(FOA)、5-氟邻氨基苯甲酸和氨基己二酸(αAA)。在其它实施方案中，选择标记挽救可通过已知的选择方法来鉴定的其它非致死性缺陷或表型。

本文中描述在公开文本的方法、组合物和生物中有用的具体基因和蛋白质；然而，应当认识到的是，与此类基因的绝对同一性不是必要的。例如，可为了活性的目的，可改变包含编码多肽或酶的序列的特定基因或多核苷酸并筛选活性。通常，此类改变包含保守突变和沉默突变。可使用本领域已知的方法对此类经修饰或突变的多核苷酸和多肽筛选功能性酶的表达。

由于遗传密码固有的简并性，编码基本上相同的或功能上等同的多肽的其它多核苷酸也可用于克隆和表达编码此类酶的多核苷酸。

如本领域技术人员会理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达会是有益的。遗传密码(有64种可能的密码子)是冗余的，但是大多数生物通常使用这些密码子的一个子集。在一个物种中最常利用的密码子称作最适密码子，而那些不是经常利用的密码子分类为罕见或低使用率密码子。可以在有时称作“密码子优化”或“物种密码子偏好控制”的过程中替代密码子以反映宿主的优选密码子使用率。

可制备包含特定原核或真核宿主优选的密码子的经优化的编码序列(Murray et al.,1989,Nucl Acids Res.17:477-508)，例如用于提高翻译速率或生成具有期望特性(诸如与自未经优化的序列生成的转录物相比，更长的半衰期)的重组RNA转录物。也可修饰翻译终止密码子以反映宿主的偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin et al.,1996,Nucl Acids Res.24:216-8)。

本领域技术人员会认识到的是，由于遗传密码子的简并性质，可使用在其核苷酸序列上不同的多种DNA分子来编码本公开文本的给定酶。编码上文描述的生物合成酶的天然DNA序列在本文中仅为了例示本公开文本的实施方案而提到，而且本公开文本包括编码本公开文本的方法中利用的酶的多肽和蛋白质的氨基酸序列的任何序列的DNA分子。类似地，多肽在其氨基酸序列中通常可容许一处或多处氨基酸替代，删除和插入而不失去或显著失去期望活性。本公开文本包括具有与本文中描述的具体蛋白质不同的氨基酸序列的多肽，只要经修饰的或变异的多肽具有其参照多肽的合成代谢或分解代谢酶促活性。而且，由本文中显示的DNA序列编码的氨基酸序列仅例示本公开文本的实施方案。

此外，本公开文本还涵盖对本文中提供的组合物和方法有用的酶的同系物。在一些实施方案中，当氨基酸序列具有至少约30％，40％，50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性时，两种蛋白质(或蛋白质的区域)是实质性同源的。为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，以最佳比较为目的比对序列(例如可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中引入缺口以实现最佳比对，而且为了比较的目的可忽略非同源序列)。在一个实施方案中，参照序列为比较目的而比对的长度是参照序列长度的至少30％，通常至少40％，更通常至少50％，甚至更通常至少60％，甚至更通常至少70％，80％，90％，100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置在第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸所占据时，那么两分子在该位置处是同一的(如本文中使用的，氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等同)。两条序列之间的百分比同一性是两条序列共享的、同一的位置的数目的函数，此时要考虑为两条序列的最佳比对需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度。

当涉及蛋白质或多肽使用“同源”时，会认识到的是，不同一的残基位置常常是因保守氨基酸替代而不同。“保守氨基酸替代”指氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一种氨基酸残基替代。一般而言，保守氨基酸替代不会实质性改变蛋白质的功能特性。在两条或更多条氨基酸序列彼此因保守替代而不同时，可上调百分比序列同一性或同源性程度以针对替代的保守性质进行修正。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的(参见例如Pearson W.R.,1994,Methods in Mol Biol25:365-89)。

下述的六组，每组包含相互作为保守替代的氨基酸：1)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。

通常使用序列分析软件来测量多肽的序列同源性(也称作百分比序列同一性)。用于将分子序列与包含来自不同生物的大量序列的数据库进行比较的一种典型算法是计算机程序BLAST。当搜索包含来自不同生物的大量序列的数据库时，通常是比较氨基酸序列。

此外，本领域普通技术人员知道，可通过遗传/蛋白质工程技术来优化任何编码前述酶(或本文中提到的任何其它(或任何控制或调控其表达的调节元件))的基因，诸如定向进化或合理诱变。此类行动容许本领域普通技术人员针对在酵母中的表达或活性优化酶。

而且，可以自其它真菌或细菌物种鉴定编码这些酶的基因，而且可以为了调控这种途径而进行表达。多种生物可充当这些酶的来源，包括但不限于糖酵母(Saccharomyces spp.)，包括酿酒酵母和葡萄汁糖酵母(S.uvarum)，克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)，包括耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)，乳克鲁维酵母(K.lactis)，和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)，毕赤酵母(Pichia spp.)，汉逊氏酵母(Hansenula spp.)，包括多形汉逊氏酵母(H.polymorpha)，假丝酵母(Candida spp.)，丝孢酵母(Trichosporon spp.)，Yamadazyma spp.，包括Y.spp.stipitis，Torulaspora pretoriensis，东方伊氏酵母(Issatchenkia orientalis)，裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces spp.)，包括粟酒裂殖糖酵母，隐球酵母(Cryptococcus spp.)，曲霉(Aspergillus spp.)，链孢霉(Neurospora spp.)，或黑粉菌(Ustilago spp.)。来自厌氧真菌的基因的来源包括但不限于Piromyces spp.，Orpinomyces spp.，或Neocallimastix spp.。有用的原核酶的来源包括但不限于大肠杆菌，运动发酵单胞菌，金黄色葡萄球菌，芽孢杆菌(Bacillus spp.)，梭菌(Clostridium spp.)，棒杆菌(Corynebacterium spp.)，假单胞菌(Pseudomonas spp.)，乳球菌(Lactococcusspp.)，肠杆菌(Enterobacter spp.)，和沙门氏菌(Salmonella spp.)。

本领域技术人员已知的技术可适合于鉴定另外的同源基因和同源酶。一般而言，可通过功能分析来鉴定类似基因和/或类似酶，而且会具有功能相似性。本领域技术人员已知的技术均可适合于鉴定类似基因和类似酶。例如，用于鉴定同源的或类似的ADA基因，蛋白质或酶的技术可包括但不限于基于已公开的ADA基因/酶序列使用引物通过PCR克隆基因，或使用设计成扩增ADA基因中的保守区域的简并引物通过简并PCR克隆基因。此外，本领域技术人员可使用技术来鉴定具有功能同源性或相似性的同源或类似基因，蛋白质或酶。技术包括经由针对酶的催化活性的体外酶测定法对细胞或细胞培养物检查所述活性(例如本文所述或记载于Kiritani,K.,Branched-Chain AminoAcids Methods Enzymology,1970)，然后经由纯化来分离具有所述活性的酶，经由诸如Edman降解等技术确定酶的蛋白质序列，针对可能的核酸序列设计PCR引物，经由PCR扩增所述的DNA序列，并克隆所述核酸序列。用于鉴定同源的或相似的基因和/或同源的或相似的酶，类似基因和/或类似酶或蛋白质的技术还包括将有关候选基因或酶的数据与数据库(诸如BRENDA，KEGG，或MetaCYC)比较。根据本文中的教导，可以在上文描述的数据库内鉴定出候选基因或酶。

5.4 生产类异戊二烯的方法

另一方面，本文中提供用于生产类异戊二烯的方法，该方法包括下述步骤：(a)在适合于生成类异戊二烯化合物的条件下在含碳源的培养基中培养本文中描述的任何经遗传修饰的宿主细胞的群体；并(b)自培养基回收所述类异戊二烯化合物。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含一种或多种选自下组的修饰：ADA的异源表达，利用NADH的HMG-CoA还原酶的异源表达，AACS的异源表达，磷酸转酮酶的异源表达，磷酸转乙酰酶的异源表达，和甲羟戊酸途径中的一种或多种酶的异源表达；而且，与不包含经遗传修饰的宿主细胞的一种或多种修饰或仅包含上述修饰中的一个子集但在其它方面遗传上同一的亲本细胞相比，经遗传修饰的宿主细胞以增多的量生成类异戊二烯化合物。在一些实施方案中，增多的量是至少1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％或大于100％，如例如在产率，产量，生产力方面，以克每升细胞培养物，毫克每克细胞干重，基于每单位体积的细胞培养物，基于每单位细胞干重，基于每单位体积细胞培养物每单位时间，或基于每单位细胞干重每单位时间测量的。

在一些实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯，其高于约10克每升发酵培养基。在一些此类实施方案中，以每升细胞培养物约10到约50克，高于约15克，高于约20克，高于约25克，或高于约30克的量生成类异戊二烯。

在一些实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯，其为每克细胞干重高于约50毫克。在一些此类实施方案中，以每克细胞干重约50到约1500毫克，高于约100毫克，高于约150毫克，高于约200毫克，高于约250毫克，高于约500毫克，高于约750毫克，或高于约1000毫克的量生成类异戊二烯。

在一些实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯，其为基于单位体积的细胞培养物比亲本细胞生成类异戊二烯的水平高至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约75倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，或至少约1,000倍，或更多。

在一些实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯，其为基于每单位细胞干重比亲本细胞生成类异戊二烯的水平高至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约75倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，或至少约1,000倍，或更多。

在一些实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯，其为基于每单位体积的细胞培养物每单位时间，比亲本细胞生成类异戊二烯的水平高至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约75倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，或至少约1,000倍，或更多。

在一些实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯，其为基于每单位细胞干重每单位时间比亲本细胞生成类异戊二烯的水平高至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约75倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，或至少约1,000倍，或更多。

在大多数实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯是通过诱导化合物可诱导的。可以在诱导化合物缺失下容易地操作此类宿主细胞。然后添加诱导化合物以诱导宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯。在其它实施方案中，宿主细胞以升高的水平生成类异戊二烯是通过改变培养条件(诸如例如生长温度，培养基组成等)可诱导的。

5.4.1培养基和培养条件

用于微生物培养物维持和生长的材料和方法是微生物和发酵科学领域技术人员公知的(参见例如Bailey et al.,Biochemical EngineeringFundamentals,second edition,McGraw Hill,New York,1986)。根据宿主细胞、发酵和工艺的具体要求，必需考虑应用适宜的培养基，pH，温度，和好氧，微好氧或厌氧条件的要求。

可以在合适的培养基(例如有或没有泛酸盐补充)中在合适的容器(包括但不限于细胞培养板，摇瓶或发酵罐)中实施本文中提供的生产类异戊二烯的方法。此外，可以以本领域已知的支持微生物产品工业生产的任何发酵规模实施该方法。可以使用任何适合的发酵罐，包括搅拌釜发酵罐，气升式发酵罐，鼓泡式发酵罐(bubble fermentor)，或其任何组合。在使用酿酒酵母作为宿主细胞的具体实施方案中，可以在发酵罐中使菌株生长，如详细记载于Kosaric,et al,in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,SixthEdition,Volume12,pages398-473,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KDaA,Weinheim,Germany。

在一些实施方案中，培养基为能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的微生物能在其中存活(即维持生长和存活力)的任何培养基。在一些实施方案中，培养基为包含可同化的碳源，氮源和磷酸源的含水培养基。此类培养基还可包含适宜的盐，矿物质，金属和其它营养物。在一些实施方案中，递增或连续地将碳源和每种必需细胞营养物添加到发酵培养基中，而且每种所需营养物基本上维持在生长中的细胞有效同化需要的最低水平，例如依照基于细胞将碳源转化成生物质的代谢或呼吸功能预先确定的细胞生长曲线。

用于培养微生物的合适条件和合适培养基是本领域公知的。在一些实施方案中，合适培养基补充有一种或多种额外的试剂，诸如例如诱导物(例如当一种或多种编码基因产物的核苷酸序列处于可诱导启动子的控制之下时)，阻遏物(例如当一种或多种编码基因产物的核苷酸序列处于可阻遏启动子的控制之下时)，或选择试剂(例如用于选择包含遗传修饰的微生物的抗生素)。

在一些实施方案中，碳源为单糖(简单糖)，二糖，多糖，不可发酵的碳源，或其一种或多种组合。合适的单糖的非限制性例子包括葡萄糖，半乳糖，甘露糖，果糖，核糖，及其组合。合适的二糖的非限制性例子包括蔗糖，乳糖，麦芽糖，海藻糖，纤维二糖，及其组合。合适的多糖的非限制性例子包括淀粉，糖原，纤维素，几丁质，及其组合。合适的不可发酵的碳源的非限制性例子包括乙酸和甘油。

培养基中碳源(诸如葡萄糖)的浓度应当促进细胞生长，但是不应过高以至于阻抑所使用的微生物生长。通常，以实现期望水平的生长和生物质的水平但以不可检测的水平(检测限为约<0.1g/l)添加碳源(诸如葡萄糖)来运行培养。在其它实施方案中，培养基中碳源(诸如葡萄糖)的浓度高于约1g/L，优选高于约2g/L，更优选高于约5g/L。此外，培养基中碳源(诸如葡萄糖)的浓度通常低于约100g/L，优选低于约50g/L，更优选低于约20g/L。应当指出，提到培养组分浓度可以指初始的和/或进行中的组分浓度。在一些情况中，可能期望在培养期间容许培养基变成碳源耗尽。

可用于合适培养基的可同化氮源包括但不限于简单氮源，有机氮源和复合氮源。此类氮源包括无水氨，铵盐和动物，植物和/或微生物起源的物质。合适的氮源包括但不限于蛋白质水解产物，微生物生物质水解产物，胨，酵母提取物，硫酸铵，脲和氨基酸。通常，培养基中氮源的浓度高于约0.1g/L，优选高于约0.25g/L，更优选高于约1.0g/L。然而，超过某些浓度将氮源添加到培养基中对微生物生长是不利的。结果是，培养基中氮源的浓度低于约20g/L，优选低于约10g/L，更优选低于约5g/L。此外，在一些情况中，可能期望在培养期间容许培养基变成氮源耗尽。

有效的培养基可含有其它化合物，诸如无机盐，维生素，痕量金属或生长促进物。此类其它化合物也可以存在于有效培养基中的碳源，氮源或矿物质源中，或者可以专门添加到培养基中。

培养基还可以含有合适的磷酸源。此类磷酸源包括无机和有机磷酸源。优选的磷酸源包括但不限于磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钾，磷酸铵，及其混合物。通常，培养基中磷酸的浓度高于约1.0g/L，优选高于约2.0g/L，更优选高于约5.0g/L。然而，超过某些浓度将磷酸添加到培养基中对微生物生长是不利的。因而，培养基中磷酸的浓度通常低于约20g/L，优选低于约15g/L，更优选低于约10g/L。

合适的培养基还可以含有镁源，优选以生理学可接受盐的形式，诸如七水合硫酸镁，尽管可以以提供类似量的镁的浓度使用其它镁源。通常，培养基中镁的浓度高于约0.5g/L，优选高于约1.0g/L，更优选高于约2.0g/L。然而，超过某些浓度将镁添加到培养基中对微生物生长是不利的。因而，培养基中镁的浓度通常低于约10g/L，优选低于约5g/L，更优选低于约3g/L。此外，在一些情况中，可能期望在培养期间容许培养基变成镁源耗尽。

在一些实施方案中，培养基还可含有生物学可接受螯合剂，诸如二水合柠檬酸三钠。在此类情况中，培养基中螯合剂的浓度高于约0.2g/L，优选高于约0.5g/L，更优选高于约1g/L。然而，超过某些浓度将螯合剂添加到培养基中对微生物生长是不利的。因而，培养基中螯合剂的浓度通常低于约10g/L，优选低于约5g/L，更优选低于约2g/L。

培养基最初还可以包括生物学可接受酸或碱以维持培养基的期望pH。生物学可接受酸包括但不限于盐酸，硫酸，硝酸，磷酸及其混合物。生物学可接受碱包括但不限于氢氧化铵，氢氧化钠，氢氧化钾及其混合物。在一些实施方案中，所使用的碱是氢氧化铵。

培养基还可以包括生物学可接受钙源，包括但不限于氯化钙。通常，培养基中钙源(诸如二水合氯化钙)的浓度在约5mg/L到约2000mg/L的范围内，优选在约20mg/L到约1000mg/L的范围内，更优选在约50mg/L到约500mg/L的范围内。

培养基还可以包括氯化钠。通常，培养基中氯化钠的浓度在约0.1g/L到约5g/L的范围内，优选在约1g/L到约4g/L的范围内，更优选在约2g/L到约4g/L的范围内。

在一些实施方案中，培养基还可以包括痕量金属。此类痕量金属可以作为储液(为了方便起见，它可以与培养基的其余组分分开配制)添加到培养基中。通常，此类痕量金属溶液添加到培养基中的量高于约1ml/L，优选高于约5mL/L，更优选高于约10mL/L。然而，超过某些浓度将痕量金属添加到培养基中对微生物生长是不利的。因而，此类痕量金属溶液添加到培养基中的量通常低于约100mL/L，优选低于约50mL/L，更优选低于约30mL/L。应当注意，除了以储液添加痕量金属之外，可以分开添加单独的组分，每种在独立地与上述痕量金属溶液范围规定的组分量对应的范围内。

培养基可以包括其它维生素，诸如泛酸盐，生物素，钙，泛酸盐，肌醇，吡哆醇-HCl和硫胺素-HCl。此类维生素可以作为储液(为了方便起见，它可以与培养基的其余组分分开配制)添加到培养基中。然而，超过某些浓度将维生素添加到培养基中对微生物生长是不利的。

本文中描述的发酵方法可以以常规培养模式实施，包括但不限于分批，补料-分批，细胞再循环，连续和半连续。在一些实施方案中，以补料-分批模式进行发酵。在此类情况中，培养基中的一些组分在发酵期间耗尽，包括发酵的生产阶段期间耗尽的泛酸。在一些实施方案中，可以在(例如生产阶段的)开始时给培养物补充相对较高浓度的此类组合，使得生长和/或类异戊二烯生成在需要添加之前的一段时间得到支持。通过以培养物消耗的水平进行添加，贯穿整个培养维持这些组分的优选范围。可通过例如定期对培养液取样和测定浓度来监测培养基中组分的水平。或者，一旦开发出标准培养规程，可以以与贯穿整个培养的特定时间时的已知水平对应的时间间隔进行添加。如本领域技术人员会认识到的，在培养期间，随着培养基中的细胞密度升高，营养物的消耗速率加快。而且，如本领域已知的，为了避免将外来微生物引入到培养基中，使用无菌添加方法实施添加。此外，在培养期间可以添加少量的消泡剂。

培养基的温度可以是适合于经遗传修饰的细胞生长和/或类异戊二烯生成的任何温度。例如，在用接种物接种培养基之前，可以将培养基的温度调节并维持在约20℃到约45℃的范围内，优选在约25℃到约40℃的范围内，更优选在约28℃到约32℃的范围内。

可以通过向培养基中添加酸或碱来控制培养基的pH。在此类情况中，当使用氨来控制pH时，它也可以方便地充当培养基中的氮源。优选地，将pH维持于约3.0到约8.0，更优选约3.5到约7.0，最优选约4.0到约6.5。

在一些实施方案中，在培养期间监测培养基中的碳源浓度，诸如葡萄糖浓度。可使用已知技术来监测培养基中的葡萄糖浓度，诸如例如使用可用于监测上清液(例如培养基的无细胞组分)中的葡萄糖浓度的葡萄糖氧化酶测试或高压液相层析。如先前所述，碳源浓度应当保持在发生细胞生长抑制的水平以下。尽管此类浓度在不同生物之间有变化，但是对于作为碳源的葡萄糖，在高于约60g/L的葡萄糖浓度发生细胞生长抑制，而且易于通过试验来测定。因而，当使用葡萄糖作为碳源时，优选将葡萄糖补料到发酵罐中并维持在检测限以下。或者，将培养基中的葡萄糖浓度维持在约1g/L到约100g/L的范围内，更优选在约2g/L到约50g/L的范围内，仍更优选在约5g/L到约20g/L的范围内。尽管可以通过添加例如基本上纯的葡萄糖溶液将碳源浓度维持于期望水平，但是可接受且可能优选的是通过添加小份(aliquots)原始培养基来维持培养基中的碳源浓度。可能期望使用小份原始培养基的原因在于能同时维持培养基中其它营养物(例如氮源和磷酸源)的浓度。类似地，可以通过添加小份痕量金属溶液来维持培养基中的痕量金属浓度。

5.4.2 类异戊二烯的回收

一旦由宿主细胞生成类异戊二烯，就可以使用本领域已知的任何合适的分离和纯化方法将其回收或分离供随后使用。在一些实施方案中，通过离心将包含类异戊二烯的有机相与发酵液分开。在其它实施方案中，包含类异戊二烯的有机相与发酵液自发分开。在其它实施方案中，通过将破乳剂(deemulsifier)和/或成核剂(nucleating agent)添加到发酵反应中将包含类异戊二烯的有机相与发酵液分开。破乳剂的例示性例子包括絮凝剂(flocculant)和凝集剂(coagulant)。成核剂的例示性例子包括类异戊二烯本身的小液滴，和有机溶剂，诸如十二烷，异丙基肉豆蔻酸酯(isopropylmyristrate)和甲基油酸酯。

在这些细胞中生成的类异戊二烯可存在于培养物上清液中和/或与宿主细胞相结合的。在类异戊二烯与宿主细胞相结合的实施方案中，类异戊二烯的回收可包括透化或裂解细胞的方法。或者/同时，可以使用包括但不限于层析，提取，溶剂提取，膜分离，电透析，反渗透，蒸馏，化学衍生化和结晶的回收工回收培养基中的类异戊二烯。

在一些实施方案中，将类异戊二烯与可能存在于有机相中的其它产物分开。在一些实施方案中，使用吸附，蒸馏，气液提取(去除(stripping))，液液提取(溶剂提取)，超滤和标准层析技术来实现分离。

6.实施例

6.1 实施例1：

NADH特异性HMG-CoA还原酶的鉴定和表征

此实施例描述先前不知道具有NADH辅因子特异性的HMG-CoA还原酶的鉴定和表征。

6.1.1 材料和方法

6.1.1.1 菌株工程化改造

使用野生型酿酒酵母菌株(CEN.PK2，Mat a，ura^3-，TRP1⁺，leu2^-，MAL2-8C，SUC2)作为宿主来表达甲羟戊酸(MevT)途径(由此，乙酰-CoA硫解酶(ERG10)将乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA；HMG-CoA合酶(ERG13)将乙酰乙酰-CoA转化成HMG-CoA；而HMG-CoA还原酶将HMG-CoA转化成甲羟戊酸(图1))。

用编码自金黄色葡萄球菌(ZP_06815052)，Herpetosiphon aurantiacus(YP_001546303)，Pseudomonas mevalonii(P13702)，食酸戴尔福特菌(YP_001561318)，Menthanosaeta thermofila(YP_843364)或Silicibacterpomeoyri(YP_164994)衍生的异源II类HMG-CoA还原酶或N端截短型的酿酒酵母HMG-CoA还原酶(tHMG-CoA还原酶)(EEU05004)任一的质粒转化此菌株。针对酵母表达对II类HMG-CoA还原酶进行密码子优化并进行化学合成，它们具有C端FLAG-HIS标签，例外是合成的P.mevalonii HMG-CoA还原酶具有下述额外的修饰：

NotI位点—GAL1启动子—NdeI位点—[P.mevalonii HMG-CoA还原酶]---EcoRI位点—FLAG标签—HIS标签—终止密码子---PGK1终止子---NotI位点。

将此DNA克隆到pBluescript SK+载体(Stratagene)的NotI位点中。使用野生型CENPK2菌株的基因组DNA提取物作为模板且使用寡核苷酸YT_164_30_Gal7F(其在5’末端包含SacI和NotI限制性位点)和YT_164_30_Gal7R(其在3’末端包含NdeI限制性位点)(参见表2)PCR扩增酵母Gal7启动子。将PCR产物克隆到pCR II-TOPO载体(Invitrogen)上。用SacI和NotI切割这两种质粒，并用切下来的Sc.GAL7启动子掉换P.mevaloniiHMG-CoA还原酶基因上游的Gal1启动子。用NotI消化所得质粒和pAM70(SEQ ID NO:23)，即一种带有URA3标记的酵母附加型载体pRS426。然后，通过将NotI片段连接到pAM70的NotI消化位点中，构建质粒pAM01147(SEQID NO:24)。使用此质粒作为基础质粒，用P.mevalonii HMG-CoA还原酶编码序列调换任何感兴趣的HMG-CoA还原酶编码序列(包括酵母tHMG-CoA还原酶)，这通过用NdeI和EcoRI消化质粒，并连接经过消化的、分别在5’和3’末端具有NdeI和EcoRI位点的感兴趣的HMG-CoA还原酶编码序列来进行。在大肠杆菌菌株DH5α中实施质粒DNA的扩增。然后用包含不同HMG-CoA还原酶编码序列的质粒转化菌株Y1389，并在无尿嘧啶、含2％葡萄糖的CSM培养板上选择转化子。使用标准乙酸锂规程进行所有的DNA介导的进入酵母细胞的转化，如记载于Gietz RW and Woods RA,Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology,Part B.San Diego,CA:Academic Press Inc.pp.87-96(2002)。

使用下文所示整合构建体(SEQ ID NO:25)将Sc.乙酰乙酰-CoA硫解酶(ERG10)和Sc.HMG-CoA合酶(ERG13)的基因组整合靶向宿主菌株的Gal80基因座。

使用100ng Y002基因组DNA作为模板PCR扩增整合构建体的每种组分。用寡核苷酸YT_164_36_001和YT_164_36_003(见表2)实施上游GAL80基因座位置-1000到-1的PCR扩增利。使用寡核苷酸对YT_164_36_002和YT_164_36_005(用于ERG13)及YT_164_36_006和YT_164_36_009(用于ERG10)进行酵母ERG10和ERG13基因的PCR扩增。使用寡核苷酸YT_164_36_004和YT_164_36_007扩增GAL1/10启动子，而使用引物YT_164_36_008和YT_164_36_011扩增LEU2基因。用寡核苷酸YT_164_36_010和YT_164_36_012进行下游GAL80基因座位置23到1000(在终止密码子之后)的PCR扩增。将各100fmol的每段DNA加到单个管中，并使用引物YT_164_36_001和YT_164_36_012通过缝合PCR反应进行组装(如记载于美国专利No.8,221,982，据此通过提述收录其内容)。凝胶纯化具有预期分子量的PCR产物。

表2：用于菌株工程化改造的引物

用ERG10/ERG13整合构建体转化用不同HMG-CoA还原酶(如上文指示的)转化的Y1389的衍生物，从而创建下文表3中列举的菌株。在无尿嘧啶和亮氨酸、含2％葡萄糖的CSM培养板上选择转化子。通过表型分析和菌落PCR确认所有的基因破坏和替换。

表3：菌株描述

菌株编号	描述	adh1敲除后的菌株编号
			Y1431	具有酿酒酵母tHMG-CoA还原酶的MevT	Y1804
Y1432	具有金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶的MevT
			Y1433	具有P.mevalonii HMG-CoA还原酶的MevT	Y1805
Y1435	具有食酸戴尔福特菌HMG-CoA还原酶的MevT	Y1806
			Y1436	具有M.thermofila HMG-CoA还原酶的MevT
Y1486	具有H.aurantiacus HMG-CoA还原酶的MevT
			Y1487	具有S.pomeroyi HMG-CoA还原酶的MevT	Y1807

对于菌株Y1431，Y1433，Y1435和Y1487，使用下文所示破坏构建体(SEQID NO:44)敲除ADH1基因。

ADH15’同源性

Kan A

ADH13’同源性

通过美国专利No.8,221,982中记载的多核苷酸组装方法生成破坏构建体。整合构建体的ADH15’同源区与ADH1编码序列的位置-563到-77同源，而ADH13’同源区与位置87到538(在ADH1基因的终止密码子之后)同源。使用引物RYSE0和RYSE19扩增产物。用产物转化菌株Y1431，Y1433，Y1435和Y1487(表2)，并在含2％葡萄糖和G418(Geneticin)的YPD培养基上选择转化子。通过表型分析和菌落PCR确认ADH1基因破坏。

6.1.1.2 细胞培养

在3ml含2％蔗糖的酵母氮基础(YNB)培养基中培养给定酵母菌株的单菌落，作为过夜起始培养物。次日，在250ml一次性PETG无菌烧瓶(Nalgene)中在40ml YNB-4％蔗糖生产培养基中自起始培养物稀释以初始OD₆₀₀0.05制备生产烧瓶。在以250RPM摇动下将烧瓶于30℃温育下文指示的持续时间。

6.1.1.3 使用无细胞提取物的HMG-CoA还原酶活性测定法

将酵母细胞培养48小时(用于HMG-CoA还原酶活性测定法(图8))或72小时(用于甲羟戊酸测定法(表4))，并通过在能正确承载Falcon管的旋转吊桶转子JS-5.3中在15mL Falcon管中以4000x g离心10分钟来收获酵母细胞。使用冷的裂解缓冲液(添加有迷你无EDTA蛋白酶抑制剂片(Roche)的100mM Tris pH7.0，1mM DTT和1mM EDTA)在1ml中重悬浮所得细胞团粒并清洗一次。然后将细胞转移到带有O环盖的2mL塑料螺旋盖微量离心管(Fisher Brand520-GRD)中，并使用破坏珠(0.5Mm，Fisher)和打珠器(beadbeater)以6M/S裂解细胞1分钟。将管立即置于冰水浴中至少5分钟。将管以最低8000x g旋转20分钟。将上清液转移到一只新的冷的管中。使用经典蛋白质Bradford测定法(Bradford MM A rapid and sensitive method forquantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding.Anal.Biochem72,248-254(1976))测量蛋白质浓度。

对于HMG-CoA还原酶测定法，首先在96孔板中于30℃预温育反应缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液pH7.0，100mM KCl，1mM DTT和1mM EDTA)。在每个孔中添加终浓度150μM的NADH或NADPH任一，终浓度400μM的HMG-CoA和5mM终浓度的DTT至总体积190μl。通过添加10μl稀释到线性活性范围的无细胞提取物来启动测定法。使用Molecular Devices SpectramaxM5读板仪通过测量NADPH或NADH的340nm吸光度的降低来监测反应。使用340nm吸光度的线的斜率连同蛋白质的浓度来计算每份无细胞提取物的HMGr比活性。

6.1.1.4 有机酸和醇测量

通过取1ml发酵液并将样品转移到1.5ml eppendorf管中来制备用于有机酸和醇测定法的样品。使用台式eppendorf离心机将样品以13,000RPM旋转1分钟。然后在15mM硫酸中稀释上清液(1:1v/v)。将混合物涡旋震荡并以13,000RPM离心1分钟。将澄清的上清液转移到管形瓶中供HPLC分析用。

使用HPLC Thermofisher及通过使用Column Waters IC-Pak7.8mm x300mm，7μm，(Waters)进行的离子排斥层析及折射率(RI)检测(Thermofisher)对甘油和甲羟戊酸实施HPLC分析。使用15mM硫酸含水流动相以0.6mL/min流速进行等度洗脱。

6.1.2 结果

6.1.2.1 II类HMG-CoA还原酶辅因子特异性的确定

如图8中显示的，来自食酸戴尔福特菌和S.pomeroyi的HMG-CoA还原酶在体外展现出对NADH的高特异性和高比活性。这些HMG-CoA还原酶在NADPH存在下几乎不展现比活性，而在NADH存在下比活性接近400nmol/mg/min。类似地，来自P.mevalonii的HMG-CoA还原酶展现出对作为辅因子的NADH的选择性，与先前发表的报告一致。参见例如Hedl et al.,J.Bacteriol186(7):1927-1932(2004)。相反，来自酿酒酵母，金黄色葡萄球菌和H.aurantiacus的HMG-CoA还原酶在NADH存在下未显示可测量的活性，而来自M.thermofila的HMG-CoA还原酶在NADPH和NADH二者存在下显示几乎检测不到的活性。这些结果指示来自食酸戴尔福特菌和S.pomeroyi的HMG-CoA还原酶是NADH选择性HMG-CoA还原酶，与来自P.mevalonii的HMG-CoA还原酶相似。

此外，表4指示与包含包括利用NADPH的HMG-CoA还原酶(分别来自酿酒酵母，金黄色葡萄球菌和H.aurantiacus)的MevT途径的菌株相比，包含包括利用NADH的HMG-CoA还原酶(分别来自P.mevalonii，食酸戴尔福特菌和S.pomeroyi)的MevT途径的菌株生成实质性更少的甲羟戊酸。这提示在体内需要额外的NADH源以运用利用NADH的HMG-CoA还原酶的完整催化能力通向甲羟戊酸和下游类异戊二烯生成。

表4：利用NADPH的HMG-CoA还原酶对利用NADH的HMG-CoA还原酶的甲羟戊酸产量

HMG-CoA还原酶来源	甲羟戊酸产量(g/L)	辅因子特异性
			酿酒酵母	1.11	NADPH
金黄色葡萄球菌	1.74	NADPH
			H.aurantiacus	1.84	NADPH
			P.mevalonii	0.41	NADH
食酸戴尔福特菌	0.42	NADH
			S.pomeoyri	0.57	NADH

6.1.2.2 升高的细胞内NADH改善利用NADH的HMG-CoA还原酶活性

如图9-11中指示的，在引入提高细胞内NADH浓度的代谢扰动后，在包含包括利用NADH的HMG-CoA还原酶的MevT途径的细胞中甲羟戊酸产量得到实质性提高。ADH1以NADH依赖性方式将乙醛还原成乙醇。在adh1Δ背景中，宿主细胞遭受生长下降(图9)和甘油产量升高(图10)，这指示可能是细胞内NADH积累所致的氧化还原失衡。然而，虽然包含包括利用NADPH的HMG-CoA还原酶(酿酒酵母(Sc.)tHMG-CoA还原酶)的MevT途径的细胞在adh1Δ背景中展现甲羟戊酸产量降低，但是包含包括利用NADH的HMG-CoA还原酶(分别来自P.mevalonii，食酸戴尔福特菌和S.pomeroyi)的MevT途径的细胞展现甲羟戊酸产量实质性提高(图11)，尽管也显示出氧化还原应激的迹象。这些数据提示利用NADH的HMG-CoA还原酶能够利用升高的细胞内NADH集合来加强甲羟戊酸生成。这些结果还提示在升高的细胞内NADH源缺失下利用NADH的HMG-CoA还原酶是辅因子受限的。

值得注意的是，先前发表的报告已经指出P.mevalonii的HMG-CoA还原酶用于甲羟戊酸的降解。参见Anderson et al.,J.Bacteriol.,(171(12):6468-6472(1989)。P.mevalonii是已经鉴定为能够以甲羟戊酸作为其唯一碳源存活的少数原核生物之一。然而，这里呈现的结果证明P.mevalonii HMG-CoA还原酶用于甲羟戊酸生物合成途径的出乎意料的效用。

6.2 实施例2：

凭借乙酰-CoA的备选路径和备选MEV途径酶实现的改善的类异戊二烯生成 和氧化还原平衡

此实施例证明可通过利用胞质溶胶乙酰-CoA生成的备选路径(例如经由乙醛脱氢酶，乙酰化(ADA，E.C.1.2.1.10)的异源表达，代替野生型PDH旁路)及与备选MEV途径酶的各种组合来改善来自MEV途径的甲羟戊酸和下游类异戊二烯产量。这些结果显示用生成NADH的ADA替换生成NADPH的PDH旁路酶引入的氧化还原失衡可通过将ADA表达与MEV途径中利用NADH的HMG-CoA还原酶和/或与磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶的异源表达(这也能提供额外的胞质溶胶乙酰-CoA生成备选路径)组合而得到部分缓解。这些结果还证明ADA向MEV途径提供乙酰-CoA底物的催化能力通过提供热力学上有利的、乙酰-CoA变成乙酰乙酰-CoA的下游转化(诸如由乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶提供的)而得到实质性改善。

6.2.1 材料和方法

6.2.1.1 菌株工程化改造

构建表5中列举的菌株以确定：(1)与利用NADPH的HMG-CoA还原酶相比，当ADA与利用NADH的HMG-CoA还原酶配对时对细胞生长和异源类异戊二烯产量的影响；(2)磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶的表达对由ADA的表达引起的氧化还原失衡的影响；和(3)乙酰乙酰-CoA合酶表达对表达ADA的菌株中甲羟戊酸水平的影响。

表5

菌株名称	描述
		Y968	野生型CEN.PK2
Y12869	acs1^acs2^ald6^；2x Dz.eutE
		Y12746	acs1^acs2^ald6^；2x Dz.eutE；3x Lm.PK；1x Ck.PTA
Y12869.ms63908	带有构建体ms63908的Y12869
		Y12869.ms63909	带有构建体ms63909的Y12869
Y968.ms63908	带有构建体ms63908的Y968
		Y968.ms63909	带有构建体ms63909的Y968
Y12869.ms63907.ms64472	带有构建体ms64472的Y12869.ms63907
		Y12869.ms63909.ms64472	带有构建体ms64472的Y12869.ms63909
Y968.ms63907.ms64472	带有构建体ms64472的Y968.ms63907
		Y968.ms63909.ms64472	带有构建体ms64472的Y968.ms63909

6.2.1.1.1Y968

Y968是野生型酿酒酵母CEN.PK2，Matα。Y12869，Y12746，及其所有衍生物的起始菌株是酿酒酵母菌株(CEN.PK2，Matα，ura3-52，trp1-289，leu2-3,122，his3^1)，Y003。使用标准乙酸锂规程进行所有DNA介导的进入酿酒酵母的转化，如记载于Gietz RW and Woods RA,Guide to Yeast Geneticsand Molecular and Cell Biology.Part B.San Diego,CA:Academic Press Inc.pp.87-96(2002)，在所有情况中，通过基因组DNA的PCR扩增确认构建体的整合。

6.2.1.1.2Y12869

Y12869是经由对Y003进行的三次连续整合生成的。首先，通过引入由天然酿酒酵母LEU2基因(其侧翼为由ACS2基因座的上游和下游核苷酸序列组成的序列)组成的整合构建体(i2235；SEQ ID NO:45)来删除基因ACS2。一旦引入酿酒酵母宿主细胞中，此构建体能通过同源重组整合到基因组的ACS2基因座中，通过用其整合序列替换ACS2编码序列来功能性破坏ACS2。将转化子涂布到含2％EtOH作为唯一碳源的CSM-leu板上，并通过PCR扩增进行确认。所得菌株是Y4940。

接着，用下文显示的整合构建体(i74804；SEQ ID NO:46)在Y4940中删除ALD6并引入Dickeya zeae eutE。

此整合构建体包含选择标记(TRP1)，以及在TDH3启动子(在天然酿酒酵母TDH3编码区上游840个碱基对)和TEF2终止子(在天然酿酒酵母TEF2编码区下游508碱基对)控制之下的两个拷贝的编码来自Dickeya zeae的基因eutE(NCBI参照序列：YP_003003316.1)的、经过酵母密码子优化的序列。这些组分的侧翼是ALD6基因座的上游和下游核苷酸序列。一旦引入宿主细胞中，此构建体通过同源重组整合到宿主细胞基因组中，通过用其整合序列替换ALD6编码序列来功能性破坏ALD6。使用美国专利No.8,221,982中记载的方法来组装该构建体。将该构建体转化到Y4940中，在含2％葡萄糖的CSM-TRP板上选择转化子，并通过PCR扩增进行确认。所得菌株是12602。

接着，通过引入由在其本身的启动子和终止子控制之下的天然酿酒酵母HIS3基因(其侧翼为ACS1的上游和下游核苷酸序列)组成的整合构建体(i76220；SEQ ID NO:47)删除Y12602中的ACS1。将转化子涂布到含2％葡萄糖作为唯一碳源的CSM -his板上，并通过PCR扩增进行确认。所得菌株是Y12747。

接着，用自天然URA3序列扩增的PCR产物转化Y12747。此序列恢复ura3-52突变。参见Rose and Winston,Mol Gen Genet 193:557-560(1984)。将转化子涂布到含2％葡萄糖作为唯一碳源的CSM-ura板上，并通过PCR扩增进行确认。所得菌株是Y12869。

6.2.1.1.3 Y12746

Y12746是经由对Y4940进行的三次连续整合生成的。首先，用下文显示的整合构建体(i73830；SEQ ID NO:48)转化Y4940。

此整合构建体包含选择标记(URA3)；在TDH3启动子(在TDH3编码序列上游870 bp)和TDH3终止子(在TDH3编码序列下游259 bp)控制之下的、来自Leuconostoc mesenteroides的磷酸转酮酶(NCBI参照序列YP_819405.1)的经过酵母密码子优化的形式；在TDH3启动子(在TDH3编码序列上游870bp)和PGK1终止子(在PGK1编码序列下游259 bp)控制之下的、克氏梭菌磷酸转乙酰酶(NCBI参照序列：YP_001394780.1)的经过酵母密码子优化的形式；侧翼为由酿酒酵母BUD9基因座的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。一旦引入宿主细胞中，此构建体通过同源重组整合到宿主细胞基因组中，通过用其整合序列替换BUD9编码序列来功能性破坏BUD9。使用美国专利No.8,221,982中记载的方法来组装该构建体。在含2％葡萄糖的CSM-URA板上选择转化子。

用下文显示的构建体(i74810；SEQ ID NO:49)转化所得菌株。

此构建体包含选择标记(TRP1)；在TDH3启动子(在TDH3编码序列上游870bp)和TDH3终止子(在TDH3编码序列下游259bp)控制之下的两个拷贝的来自Leuconostoc mesenteroides的磷酸转酮酶；侧翼是由ALD6基因座的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。一旦引入宿主细胞中，此构建体通过同源重组整合到宿主细胞基因组中，通过用其整合序列替换ALD6编码序列来功能性破坏ALD6。使用美国专利No.8,221,982中记载的方法来组装该构建体。在含2％葡萄糖的CSM-URA板上选择转化子，并通过PCR扩增进行确认。

最后，用下文显示的构建体(i76221；SEQ ID NO:50)转化所得菌株。

此构建体包含选择标记(HIS3)；以及在TDH3启动子(在天然酿酒酵母TDH3编码区上游840碱基对)和TEF2终止子(在天然酿酒酵母TEF2编码区下游508碱基对)控制之下的两个拷贝的编码来自Dickeya zeae的基因eutE(NCBI参照序列：YP_003003316.1)的、经过酵母密码子优化的序列。这些组分的侧翼是ACS1基因座的上游和下游核苷酸序列。一旦引入宿主细胞中，此构建体通过同源重组整合到宿主细胞基因组中，通过用其整合序列替换ACS1编码序列来功能性破坏ACS1。使用美国专利No.8,221,982中记载的方法来组装该构建体。在含2％葡萄糖的CSM-HIS板上选择转化子，并通过PCR扩增进行确认。所得菌株是Y12746。

6.2.1.1.4 ms63907，ms63908，ms63909，和ms64472整合构建体

下文显示ms63907整合构建体(i84022；SEQ ID NO:51)。

此构建体包含编码选择标记(URA3)的核苷酸序列；在其本身的启动子控制之下的一个拷贝的天然酵母GAL4转录因子；2种天然酵母甲羟戊酸途径酶(编码乙酰乙酰-CoA的硫解酶的ERG10和编码HMG-CoA合酶的ERG13)，以及两个拷贝的、Silicibacter pomeroyi HMG-CoA还原酶的经过酵母密码子优化的形式，均在半乳糖可诱导的启动子(酿酒酵母基因GAL1和GAL10的启动子)控制之下，侧翼是由酿酒酵母HO内切核酸酶基因座的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。一旦引入宿主细胞中，ms63907构建体通过同源整合整合到宿主细胞基因组中，通过用其整合序列替换HO编码序列来功能性破坏HO。使用美国专利No.8,221,982中记载的方法来组装该构建体。在含2％葡萄糖的CSM-URA板上选择转化子，并通过PCR扩增进行确认。

ms63908整合构建体(i84024；SEQ ID NO:52)与ms63907相同，只是有下述两项例外：第一，ERG10被与AHP1终止子(在酿酒酵母中AHP1编码序列下游125bp)融合的、链霉菌CL190中编码乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶(登录号：AB540131.1)的nphT7基因的、经过酵母密码子优化的形式替换；第二，编码S.pomeroyi HMG-CoA还原酶的序列被tHMGr，即编码天然酿酒酵母HMG-CoA还原酶的截短型HMG1编码序列替换。

ms63909整合构建体(i84026；SEQ ID NO:53)与ms63907相同，只是有下述一项例外：编码S.pomeroyi HMG-CoA还原酶的序列被tHMGr，即编码天然酿酒酵母HMG-CoA还原酶的截短型HMG1编码序列替换。

下文显示ms64472整合构建体(i85207；SEQ ID NO:54)。

此构建体包含编码选择标记(URA3)的核苷酸序列；5种天然酵母麦角固醇途径酶(编码甲羟戊酸激酶的ERG12，编码磷酸甲羟戊酸激酶的ERG8，编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的ERG19，编码二甲基烯丙基二磷酸异构酶的IDI1，和编码法呢基焦磷酸合成酶的ERG20)，以及Artemisia annua法呢烯合酶的、经过进化(evolved)、经过酵母密码子优化的形式，均在半乳糖可诱导的启动子(酿酒酵母基因GAL1，GAL10，和GAL7d的启动子)控制之下。这些序列的侧翼是由GAL80的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。一旦引入宿主细胞中，ms64472构建体通过同源整合整合到宿主细胞基因组中，通过用其整合序列替换GAL80编码序列来功能性破坏GAL80。使用美国No.8,221,982中记载的方法来组装该构建体。在含2％葡萄糖的CSM-URA板上选择转化子，并通过PCR扩增进行确认。

6.2.1.2 甲羟戊酸的定量

在96孔板的孔中在含50mM琥珀酸盐pH5.0，和20g/L蔗糖的种子培养基(15g/L硫酸铵，8g/L磷酸钾，6.1g/L硫酸镁，150mg/L EDTA，57.5mg/L硫酸锌，4.8mg/L氯化钴，3.24mg/L氯化镁，5mg/L硫酸铜，29.4mg/L氯化钙，27.8mg/L硫酸铁，4.8mg/L钼酸钠，0.6mg/L生物素，12mg/L泛酸钙，12mg/L烟酸，30mg/L肌醇，12mg/L盐酸硫胺素，12mg/L盐酸吡哆醇，0.24mg/L对氨基苯甲酸)中接种单菌落，并于30℃培养3天。然后，在含50mM琥珀酸盐pH5.0和40g/L半乳糖的种子培养基中传代培养14.4ul培养物，并于30℃培养2天。

为了定量分泌的甲羟戊酸，首先将全细胞培养液以14,000RPM旋转沉降5分钟。然后将10ul澄清的培养液与190ul测定缓冲液(1mM CoA，2mMNAD，0.2mg/ml经过纯化和冻干的Pseudomonas mevalonii HMG-CoA还原酶，0.1mg/ml经过纯化和冻干的Pseudomonas mevalonii HMG-CoA裂解酶，95mM TrisCl pH8.5，20mM MgCl₂，和5mM DTT)一起温育。将样品于30℃温育30分钟，然后在Beckman M5读板仪上测定340nm吸光度。通过绘制到用经过纯化的甲羟戊酸生成的标准曲线上来定量甲羟戊酸浓度。

6.2.1.3 法呢烯的定量

首先如上所述培养培养物。为了定量法呢烯，将600ul2-丁氧基乙醇添加到150ul全细胞培养液中，分3次添加，每次200ul，每次添加之间在96孔板摇床上以1000rpm摇动90秒。然后将样品温育40分钟。将8ul2-丁氧基乙醇提取物与200ul异丙醇在96孔UV板(Costar3635)中混合，然后在读板仪上读取222吸光度。

6.2.1.4 光密度的定量

在96孔测定板中，将8ul培养物与稀释剂(20％PEG200，20％乙醇，2％Triton X-114)混合，并于室温温育30分钟。漩涡震荡测定板，之后在BeckmanM5读板仪上测量OD₆₀₀。

6.2.1.5 分量发酵

在5ml含50mM琥珀酸盐pH5.0和20g/L蔗糖的种子培养基中自单菌落培养接种培养物Y967，Y12869和Y12746。生长3天后，在25ml含50mM琥珀酸盐pH5.0和40g/L蔗糖的种子培养基中传代培养预培养物至初始光密度(OD)为0.1。10小时后，在50ml含50mM琥珀酸盐pH5.0和40g/L蔗糖的种子培养基中再次传代培养培养物至OD为0.05。于30℃培养培养物。当OD为大约3时，将3个烧瓶一分为二，旋转沉降，并弃去培养基。将培养物在1.5L含40g/L葡萄糖(无琥珀酸盐)的种子培养基中重悬浮，并转移到发酵罐中。在2L Biostat B plus容器(Sartorius，Germany)中实施发酵实验。搅拌控制于1200rpm，并以0.5L/min对发酵罐连续鼓入空气。用14.4M NH₄OH将pH维持于5.0，并将温度维持于30℃。大致每1.5小时采集样品以测量OD，细胞干重，有机酸和糖。

6.2.2 结果

6.2.2.1 与利用NADPH的HMGr相比，与利用NADH的HMGr配对时ADA菌株生成更多类异戊二烯

图12A显示包含PDH旁路删除(acs1Δacs2Δald6Δ)且异源表达ADA(Dz.eutE)的菌株Y12869在表达包含利用NADH的HMGr的MEV途径(构建体ms63907)时比包含利用NADPH的HMGr的MEV途径(构建体ms63909)生成更多法呢烯。相反，图12B显示包含完整PDH旁路的菌株Y968在与利用NADPH的HMGr配对时生成更多法呢烯。这些结果证明利用ADA自MEV途径生成类异戊二烯在MEV途径包含利用NADH的HMGr时得到改善。

6.2.2.2 ADA的表达引起的氧化还原失衡在PK和PTA与糖酵解分享流量时得到缓解

天然酵母经由糖酵解消耗每个葡萄糖产生两个NADH。在发酵成乙醇时，两个NADH被再氧化成NAD⁺。然而，一部分葡萄糖被转化成生物质，而非发酵成乙醇，导致NADH过量。这些过量的NADH经由磷酸二羟基丙酮变成甘油3-磷酸的还原反应被再氧化成NAD⁺，甘油3-磷酸被水解成甘油。使用酰化乙醛脱氢酶代替天然PDH旁路的菌株生成NADH代替NADPH，导致NADH进一步过量。对于转化成生物质的每个葡萄糖，使用ADA代替天然PDH旁路的菌株生成两倍量的NADH，这意味着为了再氧化过量的NADH必须生成两倍量的甘油。如图13A中显示的，Y12869(一种使用ADA代替野生型PDH旁路的菌株)在分批葡萄糖发酵中生成Y968(包含完整PDH旁路)两倍量的甘油，同时消耗相当水平的葡萄糖。这些结果证明Y12869是氧化还原失衡的，如ADA反应的化学计量预测的。

向ADA菌株添加磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶提供备选的非糖酵解路径自葡萄糖生成AcCoA，降低经由糖酵解生成的NADH及改善氧化还原平衡。如图13B中显示的，Y12745(一种除ADA外还携带磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶的菌株)在分批葡萄糖发酵中生成Y12869一半量的甘油，同时消耗相当水平的葡萄糖。

6.2.2.3 ADA菌株中的节省ATP以热力学驱动力为代价，这通过下游对乙酰-CoA的强拉动得到缓解

用于形成乙酰-CoA的天然PDH旁路反应是热力学上有利的，因为该反应与ATP水解成AMP相偶联。相反，酰化乙醛脱氢酶反应不与ATP偶联，而且比用于形成乙酰-CoA的天然PDH旁路反应更加接近平衡得多。在使用天然酿酒酵母途径基因来生成甲羟戊酸时，使用ADA的菌株比使用野生型PDH旁路的菌株生成少得多的甲羟戊酸，尽管ADA和Ald6在体外具有相当的动力学特性。如图14(第一和第二栏)中显示的，ADA菌株(Y12869.ms63909)中的甲羟戊酸产量仅为野生型等同菌株(Y968.ms63909)的～30％，尽管在体外测量到充足的动力学能力。这个结果反映了由ADA将乙醛转化成乙酰-CoA缺乏热力学驱动力。

Erg10乙酰-CoA硫解酶催化自两个乙酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA，这是一种热力学上不利的反应。由nphT7编码的乙酰乙酰-CoA合酶(即乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶)催化自乙酰-CoA和丙二酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA，这是一种因丙二酰-CoA脱羧而在热力学上有利的反应。将这种热力学上有利的反应直接置于AcCoA生成的下游提供热力学驱动力，提高ADA的正向活性。如图14(第三和第四栏)中显示的，当nphT7过表达代替ERG10时，Y968.ms63908和Y12869.ms63908生成相当水平的甲羟戊酸。而且，它们比MEV途径第一步使用ERG10的等同菌株(Y968.ms63909和Y12869.63909)生成实质性更多的甲羟戊酸。

通过提述将本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请收入本文，如同专门且个别地指出通过提述收录每一篇出版物或专利申请。尽管为了清楚理解的目的已经通过例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是对本领域普通技术人员显而易见的是根据本发明的教导，可以对其进行某些改变和变更而不偏离所附权利要求的精神或范围。

Claims (36)

1.能够生成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞，该细胞包含：

(a)编码甲羟戊酸(MEV)途径中一种或多种用于生成异戊烯焦磷酸的酶的一种或多种异源核酸；和

(b)编码乙醛脱氢酶(乙酰化)(ADA)(E.C.1.2.1.10)的异源核酸。

2.权利要求1的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。

3.权利要求1或2的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基转移酶。

4.权利要求1-3中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括利用NADH将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)转化为甲羟戊酸的酶。

5.权利要求1-4中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括利用NADH的HMG-CoA还原酶。

6.权利要求1-5中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含编码磷酸转酮酶(PK)的异源核酸。

7.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含编码磷酸转乙酰酶(PTA)的异源核酸。

8.权利要求1-7中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含天然丙酮酸脱氢酶(PDH)旁路中一种或多种酶的功能性破坏。

9.权利要求8的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述PDH旁路中的一种或多种酶选自：乙酰-CoA合酶1(ACS1)，乙酰-CoA合酶2(ACS2)，和醛脱氢酶6(ALD6)。

10.权利要求9的经遗传修饰的宿主细胞，其中ACS1是功能性破坏的。

11.权利要求9的经遗传修饰的宿主细胞，其中ACS2是功能性破坏的。

12.权利要求9的经遗传修饰的宿主细胞，其中ALD6是功能性破坏的。

13.权利要求9的经遗传修饰的宿主细胞，其中ACS1和ACS2是功能性破坏的。

14.权利要求9的经遗传修饰的宿主细胞，其中ACS1，ACS2和ALD6是功能性破坏的。

15.权利要求1-14中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含一种或多种具有醇脱氢酶(ADH)活性的酶的功能性破坏。

16.权利要求15的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种具有ADH活性的酶选自：醇脱氢酶1(ADH1)，醇脱氢酶3(ADH3)，醇脱氢酶4(ADH4)，和醇脱氢酶5(ADH5)。

17.权利要求1和4-16中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将两分子乙酰-CoA缩合以形成乙酰乙酰-CoA的酶。

18.权利要求1-17中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合以形成HMG-CoA的酶。

19.权利要求1-3，6-16和17中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶。

20.权利要求1-19中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶。

21.权利要求1-20中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶。

22.权利要求1-21中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶包括将甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。

23.权利要求1-22中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述MEV途径中的一种或多种酶选自：HMG-CoA合酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。

24.权利要求1-23中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码MEV途径中所有酶的众多异源核酸。

25.权利要求1-24中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述编码MEV途径中一种或多种酶的一种或多种异源核酸在一种转录调节物的控制下。

26.权利要求1-24中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述编码MEV途径中一种或多种酶的一种或多种异源核酸在多种转录调节物的控制下。

27.权利要求1-26中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核酸。

28.权利要求1-27中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含编码能缩合IPP和/或DMAPP分子以形成聚异戊二烯(polyprenyl)化合物的酶的异源核酸。

29.权利要求1-28中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其还包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核酸。

30.权利要求29的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶选自下组：蒈烯(carene)合酶，牦牛儿醇(geraniol)合酶，芳樟醇(linalool)合酶，柠檬烯(limonene)合酶，香叶烯(myrcene)合酶，罗勒烯(ocimene)合酶，α-蒎烯(pinene)合酶，β-蒎烯合酶，γ-萜品烯(terpinene)合酶，萜品油烯(terpinolene)合酶，紫穗槐双烯(amorphadiene)合酶，α-法呢烯(farnesene)合酶，β-法呢烯合酶，法尼醇(farnesol)合酶，橙花叔醇(nerolidol)合酶，广藿香醇(patchouliol)合酶，诺卡酮(nootkatone)合酶和松香双烯(abietadiene)合酶。

31.权利要求29的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述类异戊二烯选自下组：半萜，单萜，双萜，三萜，四萜，倍半萜和多萜。

32.权利要求29的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述类异戊二烯是倍半萜。

33.权利要求29的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述类异戊二烯是C₅-C₂₀类异戊二烯。

34.权利要求29的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述类异戊二烯选自下组：松香双烯，紫穗槐双烯，蒈烯，α-法呢烯，β-法呢烯，法尼醇，牦牛儿醇，牦牛儿基牦牛儿醇(geranylgeranitol)，异戊二烯(isoprene)，芳樟醇，柠檬烯，香叶烯，橙花叔醇，罗勒烯，广藿香醇，β-蒎烯，香桧烯(sabinene)，γ-萜品烯，萜品油烯，和瓦伦烯(valencene)。

35.权利要求1-34中任一项的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述细胞是酵母细胞。

36.生产类异戊二烯的方法，其包括：

(a)在适于生成所述类异戊二烯化合物的条件下在含碳源的培养基中培养权利要求1-35中任一项的经遗传修饰的酵母细胞的群体；并

(b)自该培养基回收所述类异戊二烯化合物。