CH626916A5

CH626916A5 -

Info

Publication number: CH626916A5
Application number: CH1492475A
Authority: CH
Inventors: Bauke Te Nijenhuis
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1974-11-19
Filing date: 1975-11-18
Publication date: 1981-12-15
Also published as: NO753801L; SE435396B; JPS5182783A; SE442749B; FR2292042B1; JPS5624512B2; DK146964C; DK518575A; DE2551742C3; DE2551742A1; NL167995C; FI753247A7; IE42844L; NL7513433A; JPS55148086A; IT1050910B; NO147311B; SE8104191L; SE7512938L; FR2292042A1

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein proteolytisch wirkendes Enzym (nachstehend kurz als Protease bezeichnet) mit hoher proteolytischer Aktivität in alkalischen Medien zu schaffen, das sich als Zusatz für Waschmittel eignet. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Das Enzym kann in überraschend hohen Ausbeuten aus dem Mikroorganismus Bacillus nov. spec., mit der Bezeichnung PB 92, seinen nach üblichen Methoden hergestellten Mutanten oder Varianten erhalten werden. Die Ausbeuten sind höher als die, die beispielsweise mit dem in der NL-OS 72.07050 beschriebenen Stamm von Bacillus firmus erhalten werden. Ein weiterer unerwarteter Vorteil der Erfindung ist die überraschend gute Waschwirkung des Enzyms in perborathaltigen Waschmitteln. Eine Kultur des Mikroorganismenstammes Bacillus PB 92 ist im Laboratorium für Mikrobiologie der Technischen Universität Delft, Niederlande, hinterlegt und hat dort die Bezeichnung OR-60 erhalten. Das Hinterlegungsdatum ist der 15. November 1974.

Die Protease der Erfindung wird durch Züchten von Bacillus PB 92 oder seiner Mutanten oder Varianten in einem Nährmedium, das übliche Kohlenstoff-, Energie- und Stickstoffquellen, Calcium- und Magnesiumsalze sowie Spurenelemente enthält, unter aeroben Bedingungen und anschliessendes Isolieren des erhaltenen, proteolytisch wirkenden Enzyms aus der Kulturbrühe hergestellt.

Eigenschaften des Enzyms a) Beziehung pH- Wert/Aktivität

Zur Bestimmung der Beziehung pH-Wert/Aktivität wird die Hämoglobinmethode nach Anson (vgl. J. Gen. Physiology, Bd. 22 (1939), Seiten 79 bis 89) so genau wie möglich angewandt. Anweisungen, die nicht in dem Artikel von Anson angegeben sind, sind nachstehend aufgeführt:

5

Substrat

Rinderhämoglobulin, Proteasesubstrat gemäss Anson. rein lyophilisiert.

10 Substratlösung

Das Hämoglobin wird unter Rühren mit Wasser zu einer 22prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) vermischt. 10 ml dieser frisch angesetzten, konzentrierten Lösung werden mit 8 ml 1 n Natronlauge, 72 ml Wasser und 36 g Harnstoff versetzt 15 und verdünnt. Die alkalische Lösung wird 60 Minuten auf 25 °C erwärmt, um das Hämoglobulin zu denaturieren.

Es werden die nachstehenden Pufferlösungen, Harnstoff und Natriumäthylmercurithiosalicylat (Thiomersal) zugegeben. Der pH-Wert wird mit einer Elektrode (Ingold HA) eingestellt. 20 Das Volumen wird so eingestellt, dass eine 2,2prozentige Hämoglobinlösung erhalten wird.

Als pH-Vergleichslösung werden Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 8,00, 9,00,10,00,11,00 und 12,00 eingesetzt. Es wird ein digitales pH-Meter verwendet. 25 Die Zusammensetzung des Puffers für die Substratlösung mit einem pH-Wert von 8 folgt nach der Beschreibung für die Trypsinbestimmung. Die Zusammensetzung der übrigen Pufferlösungen sind aus Dawson et al., «Date for Biochemical Research», 2. Ausgabe (1969), Oxford, S. 475 ff. entnommen. 30 Die Komponenten werden zur Substratlösung gegeben, bis die nachstehenden Endkonzentrationen erhalten werden: pH-Bereich 8,3-10,3: Puffersystem Glycin-NaOH (0,05 M) pH-Bereich 10,8-11,3: Puffersystem Na2HP04-Na0H (0,025M)

35pH-Bereich 11,7—12,5: Puffersystem KCI-Na OH (0,05M). Enzymlösung

Es werden frische Lösungen in Wasser hergestellt. Eine verdünnte Lösung hat eine Enzymkonzentration von 200 DE/ml. 40 Die Bezeichnung DE bezieht sich auf Delft-Einheiten, die sich wiederum auf eine Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität beziehen, die in der GB-PS 1 353 317 beschrieben ist.

Inkubation

45 Jede Analyse besteht aus zwei Bestimmungen und einer Blindbestimmung. Die Substrat- und Enzymlösungen werden in einem Wasserbad auf 25 °C eingestellt. Der pH-Wert der Substratlösungen wird mit einer Elektrode (Ingold HA) bestimmt, wobei für pH-Werte unter 11,0 auch eine Elektrode (Ingold so LOT) verwendet wird. Als pH-Vergleichslösungen werden Puffer-Vergleichslösungen verwendet. 2,5 ml der Substratlösung werden in einem Zentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Enzymlösung versetzt und unmittelbar danach mit einem Glasstab, der mit einem Griff versehen ist, durch Rühren vermischt. Die Blindlö-55 sung, die kein Enzym enthält, wird ebenfalls inkubiert.

Die Inkubation wird nach 10 Minuten durch Zugabe von 5 ml 0,3 n Trichloressigsäure beendet. Zur Blindlösung werden 5 ml der Trichloressigsäurelösung und 0,5 ml Enzymlösung zugegeben. Die Trichloressigsäurelösung wird mit einer ZIPPET-60 TE zugegeben. Das Gemisch wird anschliessend mit dem Glasstab, der mit einem Griff versehen ist, noch in den Zentrifugenröhrchen stark gerührt. Anschliessend werden die Zentrifugenröhrchen in ein Wasserbad von 2 °C eingebracht.

Die Drift des pH-Wertes während der Inkubation wird zu 65 Beginn und am Ende der Inkubation mit einer Elektrode (LOT-Elektrode für pH-Werte unterhalb 11,0 und HA-Elektrode für pH-Werte oberhalb 11,0) gemessen. Die Drift des pH-Wertes beträgt weniger als 0,1 pH-Einheiten bei der Inkubation von

3

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Enzymlösungen, die 50 oder weniger DE/ml enthalten und weniger als 0,15 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 200 bis 500 DE/ml enthalten. Als Grundlage dienen Mittelwerte, die mit der HA-Elektrode erhalten wurden.

Zentrifugation

Nachdem die Inkubationslösungen mindestens 30 Minuten bei 2 °C gehalten wurden, werden die Zentrifugenröhrchen bei 6000 g zentrifugiert.

Farbentwicklung

Die Farbentwicklung wird in einem Wasserbad bei 25 °C durchgeführt. 5 ml des Überstandes werden mit 10 ml 0,5 n Natronlauge versetzt. Das Gemisch wird anschliessend sofort mit einer Vortex-Genie-Vorrichtung gerührt. Nach genau 2 Minuten wird das Gemisch mit 3 ml eines Phenolreagenzes mit einer ZIPPETTE unter fortwährendem Rühren versetzt. Als Phenolreagenz wird das Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz verwendet, das mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt wird.

Die Farbentwicklung wird mit einem Spektrometer mit automatischem Spalt bei 750 nm genau 6 Minuten nach der Phe-noI-Reagenz-Zugabe gemessen. Als Vergleichslösung zur Bestimmung der Farbentwicklung wird eine Tyrosinlösung verwendet, die 8 X 10~ 7 Tyrosinäquivalente in 5 ml 0,2 n Salzsäure mit 0,5 Volumenprozent Formaldehyd enthält. Die Farbentwicklung der Vergleichslösung wird in gleichmässigen Abständen überprüft. Die Abweichungen vom Mittelwert liegen dabei unter 1 % bei einem Ansatz eines verdünnten Phenolreagenzes.

Das Enzym weist folgende proteolytische Aktivität auf:

pH-Werte 8,3 8,8 9,4 9,8 10,3 10,8 11,3 11,7 12,5 relative

Aktivität 85 87 91 88 87 94 91 99 100

b) Elektrophoreseuntersuchung

Das Verhalten des Enzyms kann weiterhin durch die Zymo-gramm-Methode gekennzeichnet werden, die auf einer Kombination der Discelektrophorose in Polyacrylamidgel und einer visuellen Beobachtung der Aktivität beruht. Die Methode ist von Zuidweg et al. in Biotech, and Bioeng., Bd. 14 (1972) Seiten 685 bis 714 beschrieben und gestattet einen direkten Vergleich der Enzympräparate. Der Vergleich wird a) mit dem Enzym der Erfindung b) einer Protease, die von einem Stamm der Gattung Bacillus erhalten wurde, der bei der National Collection of Type Cultures in London unter der Bezeichnung NCTC 4553 hinterlegt wurde (vgl. GB-PS 1 205 403),

c) einem im Handel erhältlichen, proteolytisch wirkendem Enzym MAXATASE und d) einem im Handel erhältlichen Enzym ESPERASE durchgeführt und ist in der Figur gezeigt. Die Figur weist nur die Hauptkomponenten der Präparate auf (als Puffersystem wird in der elektrophoretischen Trennung das System E verwendet, das 2-Amino-2-hydroxymethyI-l,3-propandiol und Borsäure enthält).

Die visuelle Beobachtung der Aktivität wird nach der Immersion-Kontakt-Technik (vgl. die Beschreibung von Zuidweg et al., a.a.O.) durchgeführt.

Die Figur zeigt, dass das Enzym der Erfindung aus mehreren Verbindungen besteht, wobei sich die Zusammensetzung des Enzyms von den Zusammensetzungen der übrigen Enzym-Präparate unterscheidet.

Aminosäurezusammensetzung des Enzyms der Erfindung

Die Aminosäurezusammensetzung der zwei Hauptkomponenten A und B (vgl. Figur) wird bestimmt und ist in Tabelle I

im Vergleich zu den Aminosäurezusammensetzungen mehrerer bekannter Enzyme

1. Subtilisin Carlsberg (vgl. Delange und Smith, J. Biol. Chem. Bd. 243 (1968) S. 2134)

5 2. Enzym von Bacillus Sacchariticus (vgl. US-PS 3 622 458)

3. Enzym von Bacillus firmus (vgl. NL-OS 72.07050) und

4. Enzym von B 221 (vgl. K. Horikoshi, Agr. Biol. Chem.. Bd. 35 (1971), S. 1407) gezeigt.

Der Fehler dieser Bestimmungen liegt bei ±10%. 10 Die Tabelle zeigt weiterhin die Molekulargewichte der Enzyme und ihre isoelektrischen Punkte.

Tabelle I

j5 Aminosäure (1) (2) (3)

Enzym der Erfindung (4) Komp. Komp. (A) (B)

20 LYS

9

6

4

6

HIS

5

6

8

7

6

ARG

4

3

6

8

9

8

ASP

28

20

23

29

27

28

THR

19

14

18

16

25

SER

32

37

22

23

30

GLU

12

14

16

15

PRO

9

10

12

16

12

13

GLY

36

25

30

39

31

33

30 ALA

42

27

32

45

36

CYS

0

VAL

31

20

21

27

22

MET

5

3

2

4

3

35ILEU

10

12

7

9

8

9

LEU

16

12

16

22

18

TYR

13

9

6

7

6

PHE

4

2

40 TRY

1

3

-

5

3

Mol.-

Gewicht

27,300

22,700 26,000

30,000

25,500

25,:

45 Isoelek

trischer

9,3

11,0

9,4

10,5

10,:

Punkt

so Taxonomie

Die taxonome Bestimmung wurde gemäss Smith, Gordon und Clark, «Aérobic Sporeforming Bacteria», U.S. Dept. of Agr., Monographie Nr. 16 (1952), durchgeführt. Die Sporulie-rung des Mikroorganismus Bacillus PB 92 kann durch Kultivie-55 ren lyophilisierter Kulturen von 65 Tage alten TSB-Agarkultu-ren (TSB: Trypton-Soya-Brühe aus Oxoid) auf TSB-Agar induziert werden.

Morphologie

60 a) Vegetative Zellen: (bewegliche) Stäbchen, abgerundete Enden, im allgemeinen vereinzelt, aber auch in kurzen Ketten von 2 bis 8 Stäbchen; manchmal sehr lange Ketten mit einer Länge von mindestens 1000 |i.

b) Sporangien: Manchmal etwas verdickt 65 c) Sporen: 0,6-0,8 sowie 1,0-1,3 |i; ellipsoid, dickwandig; subterminal bis parazentral.

d) Schattenformen: ziemlich viele; auch in der Mitte einer Kette von normalen Zellen.

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Weitere Eigenschaften

Maximale Wachstumstemperatur: 50 °C

Gram-positiv; nur aerob

Wachstum auf Nähragar bei pH-Wert von 7,2: etwas langsamerer Wachstumsbeginn als bei einem pH-Wert von 9,4. Die Kanten der Kolonien sind bei dem pH-Wert von 7,2 glattrandig, bei einem pH-Wert von 9,4 aber gewellt bis faserförmig.

Keine Pigmentbildung auf Tyrosinagar bei einem pH-Wert von 9,5.

Schwache Stärkehydrolyse auf Kartoffelstärke/Nähragar bei einem pH-Wert von 9,5.

Starke Verflüssigung von Gelatine auf Gelatine/Nähragar bei einem pH-Wert von 9,5.

Deutlicher Caseinabbau auf Milchagar bei einem pH-Wert von 8,4.

Kein oder kein wesentliches Wachstum auf Glucose- oder Mannitagar mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle.

Positive Nitratreduktion in einer Nitrat/Nährbrühe bei einem pH-Wert von 9,5.

Isolierung

Der Mikroorganismus, der das Enzym der Erfindung produziert, wurde aus einer Bodenprobe in Sambia mit einer spezifischen Isolationsmethode bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,5 isoliert.

Züchtung

Das von dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 produzierte Enzym wird durch Züchten des Mikroorganismus und anschliessendes Abtrennen des produzierten Enzyms in üblicher Weise erhalten. Zur Erzielung hoher Ausbeuten des Enzyms ist ein Medium nötig, das gut assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequellen, wie Glucose, Sucrose, Dextrine oder Stärke, und Stickstoffquellen organischen Ursprungs enthält, wie Casein, Hefe oder Sojamehl. Weiterhin werden vorzugsweise bestimmte Mengen von Calcium- und Magnesiumsalzen sowie mehrere Spurenelemente zugegeben.

Während der Züchtung ist eine gute Belüftung notwendig. Der pH-Wert des Mediums wird bei 6,5 bis 10, vorzugsweise bei 7 bis 9, gehalten. Die Züchtungstemperatur liegt bei 37 °C.

Bei Beachtung dieser Massnahmen können sehr hohe Ausbeuten (Proteaseaktivität pro g umgesetzte Glucose) erhalten werden. Die Ausbeute ist hinreichend hoch für eine wirtschaftliche Herstellung des Enzyms.

Abtrennung des Enzyms

Das Enzym wird aus der Kulturbrühe in üblicher Weise abgetrennt. Die Brühe wird filtriert, um die Mikroorganismen und unlösliches Material abzutrennen. Zur Herstellung wasserfreier Waschmittel wird das Enzym im allgemeinen durch Zugabe wassermischbarer organischer Lösungsmittel oder anorganischer Salze, wie Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, zum Filtrat ausgefällt. Für eine wirtschaftliche Herstellung wird das Fil-tratvolumen zuerst durch Derdampf en eingeengt, bevor die Lösungsmittel oder die Salze zugegeben werden. Für flüssige Waschmittel können die filtrierte Brühe oder das wieder aufgelöste Enzym verwendet werden.

Nach dem Ausfällen wird das Enzym durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Anschliessend wird der erhaltene Filterrückstand getrocknet.

Formulierung

Das Enzym kann in üblicher Weise Waschmitteln einverleibt werden. Die Menge des verwendeten Enzyms entspricht im allgemeinen der Menge, bei der das gesamte Waschmittel eine proteolytische Aktivität von ungefähr 100 bis 5000 DE/g, vorzugsweise 500 bis 1000 DE/g, besitzt. Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität ist in der GB-PS 1 353 317 beschrieben.

Die Waschmittel mit dem Enzym der Erfindung enthalten weiterhin ein Tensid, einen Wasserweichmacher, ein Alkalimetallsilikat und ein schwach alkalisches Bicarbonat. Als Tenside in Waschmitteln werden diejenigen Tenside eingesetzt, die all-5 gemein in Waschmitteln mit enzymatischer Aktivität verwendet werden. Im allgemeinen können nicht-ionische und anionische oberflächenaktive Verbindungen, wie wasserlösliche Seifen, anionische, nicht-ionische, ampholytische oder zwitterionische Tenside, verwendet werden. Ein Beispiel eines allgemein ver-io wendeten Tensids ist Dodecylbenzolsulfonat. Üblicherweise liegen die Tenside, die allein oder im Gemisch verwendet werden können, in einer Menge von ungefähr 4 bis 20% des Waschmittels vor.

Die Waschmittel der Erfindung können weitere zusätzliche 15 Verbindungen enthalten, die allgemein in Waschmitteln mit proteolytischer Aktivität verwendet werden. Sie enthalten üblicherweise komplexe Phosphate, beispielsweise ein Alkalime-talltripolyphosphat oder ein Alkalimetallpyrophosphat, vorzugsweise in Mengen von etwa 40 bis 50 Gewichtsprozent, be-20 zogen auf das Waschmittel. Weiterhin oder alternativ können Verbindungen, wie ein Alkalimetallcyanotriacetat oder ein Al-kalimetallcitrat, verwendet werden. Ihre Wirkung in Waschmitteln ist komplex, wobei aber ihre Wirkung als Wasserweichmacher die grösste Bedeutung hat. Weitere Verbindungen, die üb-25 licherweise zur Herstellung von Waschmitteln verwendet werden, sind Alkalimetallsilikate, im allgemeinen in Mengen von 1 bis 10 Gewichtsprozent, schwach alkalische Verbindungen, d.h. Alkalimetallbicarbonate, im allgemeinen in Mengen von höchstens 20 Gewichtsprozent, Füllstoffe, beispielsweise Alkalime-30 tallsulfate, und weitere Verbindungen, wie Carboxymethylcellu-lose, Duftstoffe und optische Aufheller. Eine weitere üblich verwendete Verbindung ist ein Alkalimetallperborat, insbesondere Natriumperborat. In Verbindung mit den Perboraten zeigt das Enzym der Erfindung eine unerwartet hohe Stabilität. 35 Die Waschmittel können in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen der Komponenten oder durch Herstellen eines Teilgemisches, das anschliessend mit den üblichen Komponenten vermischt wird. Vorzugsweise wird das Enzym mit einem oder mehreren der üblichen Verbindungen, 40 beispielsweise dem Füllstoff, vermischt, um ein Konzentrat mit einer zuvor bestimmten enzymatischen Aktivität herzustellen, das wiederum mit den anderen Komponenten vermischt werden kann.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

45

Beispiel 1

Züchtung des Mikroorganismus Bacillus PB 92.

Es wird folgendes Medium verwendet: 50 g/Liter

Hefe (bezogen auf das Trockengewicht) 22

K2HP04.3H20 5

MgS04.7H20 0,05

CaCl2 0,05

55 FeS04.7H20 0,005

MnS04.4H20 0,005

Die Komponenten des Mediums werden in 90% des Endvo-60 lumens gelöst. Anschliessend wird die Lösung 1 Stunde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 120 °C sterilisiert.

Die Impfkultur wird durch Impfen von 100 ml Trypticase-Soja-Brühe (Oxoid), zu der nach 20minütigem Sterilisieren bei 65120 °C 4 ml 1 M Natriumcarbonatlösung aus einem Schrägröhr-chen zugegeben wurde, mit dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 erhalten. Die Impfkultur wird 24 Stunden bei 30 °C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.

5

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Das Medium wird bei 37 °C und einem pH-Wert von 8,0 mit 1 Volumenteil der Impfkultur pro 100 Volumenteile Medium beimpft. Die Hauptzüchtung wird bei 37 °C in Rührfermentern durchgeführt, die mit einer pH-Regelvorrichtung, einer Temperaturregelvorrichtung, einer Antischaumvorrichtung und einer Vorrichtung für das kontinuierliche Messen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs und der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit ausgerüstet ist. 17 Stunden nach dem Impfen wird eine 30prozentige Glucoselösung, die 1 Stunde bei 120 °C sterilisiert wurde, bis zu einer Endkonzentration von 30 g Glucose pro Liter Medium zugegeben.

Die erhaltenen Ergebnisse weisen auf eine Ausbeute des proteolytisch wirkenden Enzyms von etwa 8 X105 DE/g verbrauchte Glucose hin.

In Beispiel 1 der NL-OS 72.07050 ist ein Züchtungsversuch beschrieben, bei dem eine Endausbeute von 11X106 DE/Liter Kulturbrühe erhalten wird (50 Anson-Einheiten entsprechen etwa 11X106 DE). Die Menge der verwendeten Kohlenhydrate entspricht etwa 75 g Glucose/Liter Kulturbrühe. Die Ausbeute an Protease/g verbrauchte Glucose im Beispiel der NL-OS 72.07050 entspricht 1,5 X105 DE. Das bedeutet, dass die Ausbeute des Enzyms der Erfindung etwa 5 mal grösser ist.

Beispiel 2

Waschwirkung

Die Waschuntersuchungen werden auf folgende Weise ausgeführt:

a) zu untersuchende Kleidungsstückproben: EMPA-116 (verschmutzt mit Blut, Milch und chinesischer Tinte) von der Eidgenössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt für Industrie, Bauwesen und Gewerbe, St. Gallen, Schweiz. Die zu untersuchenden Kleidungsstückproben werden im Dunkeln und luftdicht aufbewahrt. Zur Waschuntersuchung werden Stücke von 5 X 5 cm aus einem visuell homogenen Teil des Kleidungsstücks ausgeschnitten.

b) Waschlaugen: 4 g eines perborathaltigen, handelsüblichen Waschmittels ohne Enzym pro Liter synthetisches Leitungswasser mit einer Härte von 15 °d (deutscher Härtegrad). Das synthetische Wasser wird auf folgende Weise hergestellt: 10 ml einer Lösung von 0,656% MgCl2 in destilliertem Wasser werden mit 10 ml einer Lösung von 2% CaCI2 (pA) in destilliertem Wasser in einem 1000 ml Messkolben versetzt und kräftig vermischt. Die erhaltene Lösung wird anschliessend unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 2,1 % NaHC03 vermischt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

15

25

30

35

40

c) Waschuntersuchung: 250 ml Waschlauge werden jeweils in einer ausreichenden Zahl von 300 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Enzym wird anschliessend in einer Menge von 0, 250, 500 und 1000 DE/g Waschmittel jeweils in einem doppelten Ansatz zugegeben. Die Erlenmeyerkolben werden in einem Schüttelthermostaten bei 45 °C gehalten, in dem sie unter Schütteln aufgewärmt werden. Anschliessend wird jeweils eine Kleidungsstückprobe in den Erlenmeyerkolben zugegeben, die genau 1 Stunde bei 45 °C geschüttelt werden. Nach dem Waschen wird die Waschlauge dekantiert. Es werden 250 ml synthetisches Leitungswasser zu den Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Die Kolben werden mit Gummistopfen verschlossen und genau 1 Minute kräftig geschüttelt. Die Kleidungsstückproben werden in einem Becherglas gesammelt, in dem sie mit langsam fliessenden Leitungswasser gespült werden. Nach Zugabe der letzten Kleidungsstückproben wird das Spülen etwa 10 Minuten fortgesetzt. Anschliessend lässt man die Kleidungsstückproben, die in einem weissen sauberen Handtuch zusammengefaltet sind, an der Luft im Dunkeln trocknen.

Nach dem Trocknen wird die Remission in einem Remissionsmessgerät beidseitig bestimmt, wobei MgO als Referenzsubstanz verwendet wird. Die Mittelwerte werden hinsichtlich einer vollständig rein gewaschenen Kleidungsstückprobe berechnet, die eine Remission von 65,8% bezogen auf MgO besitzt.

Vergleich des Enzyms der Erfindung mit M AXA TASE und ESPERASE

Die Waschuntersuchungen werden gemäss der vorstehenden Weise bei einem pH-Wert von 9,7 durchgeführt. In Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengefasst.

Tabellen

DE/g % Remission Enzym der Erfindung

MAXATASE ESPERASE

A

0

20

—

250

41

21

30

10

31

11

500

46

26

33

13

36

16

1000

52

32

36

16

39

19

Die Tabelle zeigt, dass unter den Untersuchungsbedingungen das Enzym der Erfindung eine bessere Waschwirkung als die handelsüblichen Enzyme Maxatase und Esperase aufweist.

1 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung einer Protease, dadurch gekennzeichnet, dass man Bacillus nov. spec. PB 92, OR-60, unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das Kohlenstoff-, Energie- und Stickstoff quellen, Calcium- und Magnesiumsalze sowie Spurenelemente enthält, züchtet und die entstandene Protease aus der Kulturbrühe isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Protease durch Filtrieren der Kulturbrühe, Fällen des Enzyms im Filtrat mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln oder anorganischen Salzen, Abfiltrieren oder Ab-zentrifugieren sowie anschliessendes Trocknen des Niederschlags isoliert.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Protease, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

4. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten Protease als Komponente eines Waschmittels, das ausserdem ein Tensid, einen Wasserweichmacher, ein Alkalimetallsilikat und ein schwach alkalisches Bicarbonat enthält.

Proteolytisch wirkende Enzyme mit hoher proteolytischer Aktivität im alkalischen Bereich sind bekannt. Von Vedder (vgl. Antonie van Leeuwenhoek, Bd. 1 (1934), Seiten 141 bis 147) wurde ein Mikroorganismus beschrieben, der als Bacillus alcalo-philus bezeichnet wurde. Dieser Mikroorganismus kann Gelatine und Hämoglobin in stark alkalischem Medium abbauen. Diese Eigenschaft des Mikroorganismus wird, wie spätere Untersuchungen ergaben (vgl. GB-PS 1 205 403), der Wirkung eines Enzyms zugeschrieben. Enzyme mit hoher Aktivität in alkalischen Medien sind auch aus der GB-PS 1 243 784 und der NL-OS 72.07050 bekannt. Darin werden mehrere proteolytisch wirkende Enzyme beschrieben, die von Mikroorganismen der Gattung Bacillus gebildet werden und in Waschmitteln verwendet werden können, die normalerweise alkalisch sind, wenn sie in der Waschflüssigkeit aufgelöst werden.