CH537456A

CH537456A - Procédé de fabrication de zéaxanthine

Info

Publication number: CH537456A
Application number: CH1562671A
Authority: CH
Inventors: Dasek Jaroslav; Shepherd David; Rude Traelnes Knut
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1971-10-27
Filing date: 1971-10-27
Publication date: 1973-05-31
Also published as: SU575037A3; AU4812372A

Description

La présente invention se rapporte à la préparation par biosynthèse de substances colorées, et elle concerne plus particulièrement la fabrication du pigment jaune appelé zéaxanthine ou 3,3'-dihydroxy-B carotène par culture d'un microorganisme producteur de cette substance.

Ce pigment peut être utilisé, par exemple, à titre d'additif dans l'alimentation des poules afin de renforcer la teinte jaune de la peau de ces animaux ou d'accentuer la coloration des jaunes d'oeufs. On peut envisager également l'utilisation de cette substance comme colorant, par exemple dans l'industrie des cosmétiques.

La synthèse des pigments par certains micro-organismes, en particulier celle des pigments caroténoïdes par des bactéries du genre Flavobacter, est un phénomène connu. Cependant, la préparation industrielle de ces pigments par biosynthèse s'avère généralement délicate, et les rendements obtenus étant souvent très faibles impliquent la mise en oeuvre de quantités de milieux de culture très importants dans la mesure où l'on désire obtenir des quantités appréciables de pigment.

La présente invention se rapporte essentiellement à la préparation de zéaxanthine par biosynthèse selon un procédé simple permettant d'améliorer considérablement le rendement de production de ce pigment. Elle a trait notamment à un procédé de fabrication de zéaxanthine par culture d'un microorganisme du genre Flavobacter producteur de ce pigment, lequel est caractérisé par le fait que l'on cultive ce microorganisme dans un milieu nutritif jusqu'à l'obtention de cellules en état de croissance et de production de zéaxanthine, puis que l'on cultive ces cellules à une température de 22250 C, dans des conditions d'oxygénation suffisantes, dans un milieu de fermentation aqueux nutritif contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg/ml, à titre de source de carbone assimilable,

et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, que l'on maintient les quantités respectives de ces substances dans un rapport sensiblement constant en ajoutant progressivement ces substances au milieu de fermentation au cours de la culture, que l'on recueille les cellules et/ou que l'on extrait la zéaxanthine de ces cellules.

Par l'expression micro-organisme du genre Flavobacter on entend désigner, dans l'exposé qui suit, un micro-organisme choisi parmi les bactéries de ce genre ou un mutant d'un tel micro-organisme. De même, I'expression < r dans des conditions d'oxygénation suffisantes, signifie que la teneur en oxygène du milieu de culture n'est jamais inférieure à une valeur de seuil au-dessous de laquelle elle devient un facteur limitant vis-à-vis du taux de croissance du micro-organisme dans les conditions de culture. Ces conditions d'oxygénation peuvent être obtenues par exemple par aération et agitation énergiques du milieu de culture.

Enfin, I'expression milieu nutritif désigne un milieu de culture contenant les substances nécessaires à la vie du micro-organisme et assimilables par celui-ci; parmi ces substances, on peut citer notamment les sources de carbone et d'azote et les sels minéraux. Cependant, ce milieu nutritif peut également comporter d'autres substances telles que des vitamines, des facteurs de croissance et des oligoéléments.

Selon une forme d'exécution particulière du procédé suivant l'invention, on prépare une culture d'un micro-organisme du genre Flavobacter, que l'on inocule ensuite à un milieu nutritif placé dans un fermenteur et contenant, à titre de sources principales de carbone et d'azote assimilables par le micro-organisme, au moins un hydrate de carbone et au moins une substance contenant des acides aminés libres. On entretient la croissance du micro-organisme dans le fermenteur en assurant une oxygénation suffisante du milieu de culture ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30V) C, et d'un pH approprié.

Lorsque les cellules bactériennes sont parvenues à un stade de croissance suffisant, de préférence lorsque la culture est dans la phase de croissance exponentielle. et quand les cellules ont atteint un stade de production de zéaxanthine, stade aisément décelable grâce à la coloration jaune de ce pigment, on poursuit la culture de ces cellules à une température comprise entre 22 et 250 C, dans des conditions d'oxygénation suffisantes, et dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg/ml, ainsi qu'une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, en maintenant par addition progressive de ces deux substances dans le milieu de fermentation un rapport sensiblement constant entre leurs quantités respectives.

L'hydrate de carbone, constituant la source de carbone principale assimilable par le micro-organisme, peut être choisi parmi des substances telles que le glucose, le lactose ou le sucrose. Cette source principale de carbone assimilable peut également être constituée par un mélange de ces substances.

Parmi les substances susceptibles d'entrer dans la composition de la source principale d'azote aminé, on peut citer, par exemple, la liqueur de trempage de mais, les extraits de levure, les hydrolysats de protéine, en particulier les produits obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de protéines d'origine végétale telles que les protéines de soja ou d'arachide, et/ou l'hydrolysat de caséine appelé tryptone . Cette source d'azote aminé peut également contenir une substance préparée par hydrolyse acide ou enzymatique d'une biomasse récupérée à titre de sous-produit de la biosynthèse d'un pigment caroténoide par culture d'une bactérie du genre Flavobacter, en particulier par hydrolyse d'une biomasse de
Flavobacter cultivée pour préparer de la zéaxanthine et dont on a extrait le pigment.

On poursuit ensuite la culture dans ces conditions pendant un temps suffisant, pour obtenir dans le milieu de culture une quantité substantielle de zéaxanthine, ce pigment étant présent dans les cellules. On peut également, à la fin de cette période, interrompre l'addition progressive des sources de carbone et d'azote et laisser la composition du milieu de culture évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le micro-organisme.

Les résultats expérimentaux ont montré que, lorsque la culture du micro-organisme est effectuée selon ce procédé, la production de zéaxanthine est notablement supérieure à celle d'une culture du même micro-organisme effectuée dans les conditions pratiquées habituellement.

On peut ensuite, éventuellement après concentration du bouillon de culture, extraire la zéaxanthine des cellules à l'aide d'un solvant organique polaire tel que l'acétone, I'al- cool éthylique ou un solvant chloré comme le chloroforme.

Selon une variante, on peut séparer la biomasse du milieu de culture, par exemple par centrifugation, décantation ou filtration. La biomasse peut être utilisée telle quelle, par exemple à titre d'additif dans l'alimentation des poules, ou faire l'objet d'un traitement d'extraction à l'aide d'un solvant organique polaire.

Selon un mode d'exécution du procédé particulièrement avantageux, on prépare une culture d'un micro-organisme du genre Flavobacter que l'on inocule à un milieu nutritif aqueux placé dans un fermenteur et contenant une source principale de carbone constituée par un hydrate de carbone ou un mélange d'hydrates de carbone, de préférence à raison de 6 à 8 O/o en poids, ainsi qu'une source principale d'azote aminé assimilable. On entretient la croissance du micro-organisme en assurant une oxygénation suffisante du milieu, ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 300 C et d'un pH approprié, compris entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5.

Lorsque la concentration du milieu en hydrate de carbone atteint, par valeurs décroissantes, une valeur comprise entre 15 et 35 mg/ml, on ajoute la température du milieu entre 22 et 250 C et on introduit dans le fermenteur, de façon progressive, c'est-à-dire soit par une alimentation continue, soit par quantités successives, au moins un hydrate de carbone et au moins une source de carbone assimilables. On peut introduire ces substances dans le fermenteur soit séparément, soit mélangées pour constituer un substrat nutritif. Cette addition est effectuée à un débit tel que la teneur du milieu de culture en hydrate de carbone reste comprise entre 15 et 35 mg/ml et que les quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé soient dans un rapport constant.

A cet effet, on introduit de préférence dans le fermenteur un substrat contenant ces substances, selon le débit voulu pour maintenir la teneur du milieu en hydrate de carbone entre 15 et 35 mg/ml, la composition chimique du substrat étant telle que les quantités pondérales respectives d'hydrate de carbone et de substance aminée assimilables qu'il contient soient dans un rapport constant, de préférence compris entre 1,6 et 3,4.

Pendant cette fermentation, le pH du milieu de culture est ajusté entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5. L'ajustement du pH peut être effectué à l'aide de solutions alcalines telles que des solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium ou d'ammoniaque ou à l'aide d'un courant d'ammoniac. On utilise de préférence ces deux dernières substances car elles constituent également des sources d'azote aminé assimilables par le micro-organisme.

On poursuit ensuite cette culture pendant un temps suffisant pour obtenir dans le milieu une quantité substantielle de zéaxanthine. On peut également continuer la culture après arrêt des additions progressives de substances nutritives et laisser la composition du milieu évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le micro-organisme.

Des résultats particulièrement intéressants ont été obtenus en cultivant, comme décrit précédemment, des mutants préparés par action de la 1-méthyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, ci-après dénommée NTG, sur certaines bactéries du genre
Flavobacter, selon un procédé de mutation original remarquable par le fait que l'on fait agir la NTG sur la bactérie au sein d'un milieu solidifié.

Selon une forme d'exécution particulière de ce procédé de mutation, on prépare une culture d'une bactérie du genre
Flavobacter, par exemple une bactérie issue de la souche enregistrée auprès de l'ATCC sous le NO 21.081.

Cette culture est diluée dans une solution physiologique stérile et la solution obtenue est ensuite mélangée dans une boîte de Pétri avec une solution aqueuse de NTG dans les proportions convenables, par exemple avec un volume équipa lent d'une solution aqueuse de NTG contenant 1 à 10 mg de cette substance par ml. On verse ensuite sur la solution obtenue de l'agar fondu que l'on mélange soigneusement à la solution. Lorsque l'agar est solidifié on maintient le milieu solide obtenu à une température d'incubation convenable, par exemple entre 25 et 280 C jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié. Les colonies sont ensuite prélevées et repiquées plusieurs fois de suite sur des supports solides nutritifs.

Le micro-organisme mutant obtenu peut ensuite faire l'objet d'un ou de plusieurs autres traitements de mutation ultérieurs en milieu solidifié.

Les résultats expérimentaux ont montré qu'un tel traitement de mutation, effectué au sein d'un milieu solidifié avec un agent mutagène tel que la NTG, permet d'obtenir, à partir de bactéries du genre Flavobacter, des mutants qui produisent, dans des conditions de culture identiques, des quantités de zéaxanthine nettement supérieures à celles qui sont produites par des mutants préparés selon des procédés de mutation traditionnels à partir des mêmes bactéries et à l'aide du même agent mutagène.

Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celle-ci n'étant toutefois pas limitée aux conditions qui y sont décrites.

Dans ces exemples, les compositions des milieux nutritifs sont exprimées en pourcentages pondéraux.

Exemple I
On prépare une culture d'une souche du genre Flavobacter (ATCC NO 21.588) que l'on inocule à raison de 5 oxo en volume à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce mélange nutritif, préalablement stérilisé à 1200 C pendant 40 minutes et refroidi à 280 C, et dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, présente la composition suivante: Glucose ........... ...... ..... 7,0 O/o
(stérilisé séparément en solution concen
trée)
Liqueur de trempage de maïs . . ..... 1,6 O/o
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 0,8 O/o
Extrait de levure . 1,8 Olo
Sulfate de magnésium .. 0,5 O/o
Huile de mais . .. ......... .

. 0,08 O/o
Eau du robinet ..... balance à 100 O/o
Le micro-organisme est cultivé dans le fermenteur à 280 C, sous aération et agitation énergiques, avec ajustement continu du pH du milieu entre 7,2 et 7,3 par addition automatique d'une solution aqueuse diluée d'ammoniaque.

La culture exécutée dans ces conditions présente une phase de latence de 6 à 7 heures, et la production de zéaxanthine commence après 14 heures de culture.

Lorsque la teneur en glucose du milieu de fermentation atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 24 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 240 C et on introduit de façon progressive dans le fermenteur, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé dans un réservoir séparé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
Glucose . - . 32 O/o
Liqueur de trempage de mais . . 4,7 O/o
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 4,3 O/o
Extrait de levure .. . 5,5 O/o
Eau du robinet .. .. balance à 100 O/o
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à 240 C.

Après une durée totale de culture de 50 heures, on mesure la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine. A cet effet, on isole la biomasse du substrat nutritif par centrifugation et l'on extrait la zéaxanthine des cellules à l'aide d'acétone. La solution de zéaxanthine dans l'acétone est dosée par mesures colorimétriques par comparaison avec des solutions titrées de zéaxanthine synthétique dans le même solvant.

La teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine ainsi mesurée est de 20 Fg/ml.

A titre de comparaison, la même souche est cultivée selon un procédé traditionnel. A cet effet, elle est inoculée, à raison de 5 O/o en volume, à une même quantité d'un milieu nutritif préalablement stérilisé et refroidi à 280 C, dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1, et dont la composition est la suivante:
Glucose . . . . . 10,0 O/o
Liqueur de trempage de maïs . . 1,85 %
Hydrolysat de caséine (tryptone) . 1,25 %
Extrait de levure .. 2,1 %
Sulfate de magnésium 0,5 O/o
Huile de maïs .. . .. . 0,08 %
Eau du robinet ... .. balance à 100 O/o
La culture est exécutée sous agitation et aération énergiques, avec ajustement continu du pH entre 7,2 et 7,3.

La phase de latence observée est de 8 heures et la production de zéaxanthine commence après 15 heures de culture. On ajuste la température du milieu à 240 C après 24 heures de culture.

55 heures après le début de la culture, la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine, déterminée comme décrit précédemment, est de 12 ug/ml.

Exemple 2
On prépare une culture d'une souche du genre Flavobacter (ATCC NO 21.081) dans un milieu nutritif aqueux dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
Glucose . . . 3,0 %
Extrait de levure . . . 1,0 %
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 1,0 %
Sulfate de magnésium ... . 0,5 O/o
Eau du robinet ... ... balance à 100 %
Cette culture, qui contient 5g de cellules du micro-organisme par litre de milieu nutritif, est ensuite diluée dans le rapport 1:108 (en volume) par une série d'opérations successives dans une solution physiologique stérile contenant 0,9 % en poids de chlorure de sodium.

On mélange ensuite soigneusement 1 ml de cette solution avec 1 ml d'une solution aqueuse de NTG contenant 5 mg/ml de cette substance, dans une boîte de Pétri. On ajoute ensuite 10 mi d'agar fondu sur la solution ainsi préparée et l'on mélange complètement l'agar et la solution. Lorsque l'agar est solidifié, la boîte de Pétri est incubée à une température de l'ordre de 25 à 280 C, jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié, c'est-à-dire pendant 2 à 4 jours. On sépare ensuite les colonies de la boîte de Pétri puis on les étale sur des supports en agar nutritif en l'absence de NTG, en plusieurs opérations successives.

La souche mutante obtenue est ensuite inoculée à raison de 5 O/o en volume à 100 mi d'un milieu nutritif stérile dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
Glucose .. . .. 3,0 %
Extrait de levure . . .. 1,0 %
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 1,00/o Sulfate de magnésium ... . . 0,5 O/o
Eau du robinet ... .. balance à 100 %
Le micro-organisme est cultivé dans ce milieu à 280 C et en conditions aérobies pendant 24 heures, puis cette culture est à nouveau inoculée à 2 litres d'un milieu nutritif de même composition. Après 24 heures de fermentation dans les mêmes conditions, cette dernière culture est inoculée, à raison de 5 /o en volume, à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur.

Ce milieu nutritif, préalablement stérile à 1200 C pendant 40 minutes et refroidi à 281, C, présente un pH ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, et possède la composition suivante:
Glucose. - -- 7,0 O/o
(stérilisé séparément en solution con
centrée)
Liqueur de trempage de mais . 1,6 /o
Hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 /o
Extrait de levure . 1,8 %
Sulfate de magnésium . 0,5 /o
Huile de maïs . . - - 0,08 %
Eau du robinet .. . balance à 100 e/o
La culture est effectuée dans le fermenteur à 280 C sous aération et agitation énergiques, avec ajustement automatique du pH du milieu entre 7,2 et 7,3.

On observe une phase de latence de 5 à 6 heures, et la production de zéaxanthine commence après 12 heures de culture.

Lorsque la teneur en glucose du milieu de culture atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 22 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 240 C et l'on introduit, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
Glucose . . . . 32,0 /o
Liqueur de trempage de mais -. 4,7 /o
Hydrolysat de caséine (tryptone) . 4,3 %
Extrait de levure -. 5,5 %
Eau du robinet .. .balance à 100 Olo
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à 240 C.

Après une durée totale de culture de 48 heures, la concentration du milieu en glucose a atteint Smg/ml, et sa teneur en zéaxanthine, mesurée comme décrit dans l'exemple 1, est de 335 ssg/ml.

Exemple 3
On prépare un mutant d'une souche Flavobacter (ATCC N 21.081) comme décrit dans l'exemple 1.

La souche mutante est ensuite inoculée à raison de 4 oxo en volume, à un milieu nutritif aqueux préalablement stérilisé à 1200 C pendant 40 minutes, refroidi à 280 C et placé dans un fermenteur. Ce milieu nutritif, dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, possède la composition suivante:
Glucose. . . 7,0 %
Liqueur de trempage de mals . . 1,6 %
Hydrolysat de tourteau d'arachide . 0,7 %
Extrait de levure . 2,0 %
Sulfate de magnésium - - 0,5 Olo Huile de maïs - .. -- . 0,08 /o
Eau du robinet . .. balance à 100 %
Le micro-organisme est cultivé dans le fermenteur à 280 C, comme décrit dans l'exemple 2.

Lorsque la teneur en glucose du milieu atteint 25 mg/ml, on ajuste la température du milieu à 240 C et l'on ajoute progressivement, afin de maintenir la teneur en glucose à un niveau sensiblement constant, un substrat nutritif préalable ment stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et possédant la composition suivante: Glucose . . . ........ 32,0 O/o
Liqueur de trempage de maïs .. . . 4,7 Olo
Hydrolysat de tourteau d'arachide ... 3,5 O/o Extrait de levure ... . 6,0 O/o
Eau du robinet ... ..... balance à 100 Olo
Cette addition est poursuivie pendant 20 heures à une température de 240 C.

Après une durée totale de culture de 51 heures, la teneur du milieu en glucose atteint 7,5 mg/ml. La teneur en zéaxanthine, déterminée comme décrit dans l'exemple 1, est de 312 g/ml.

Claims

REVENDICATION

Procédé de préparation de zéaxanthine par culture d'un micro-organisme du genre Flavobacter producteur de ce pigment, caractérisé par le fait que l'on cultive ce micro-organisme dans un milieu nutritif jusqu'à l'obtention de cellules en état de croissance et de production de zéaxanthine, puis que l'on cultive ces cellules à une température de 22 à 250 C, en conditions aérobies, dans un milieu de fermentation aqueux nutritif contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg/ml, à titre de source de carbone assimilable, et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, que l'on maintient les quantités respectives de ces substances dans un rapport sensiblement constant en ajoutant progressivement ces substances au milieu de fermentation au cours de la culture,

que l'on recueille les cellules et/ou que l'on extrait la zéaxanthine de ces cellules.

SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que l'on maintient le pH du milieu de fermentation entre 6,5 et 8,0.

2. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que l'hydrate de carbone est le glucose, le lactose ou le sucrose.

3. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que la source d'azote aminé contient de la liqueur de trempage de mais.

4. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que la source d'azote aminé contient un extrait de levure.

5. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que la source d'azote aminé contient au moins un hydrolysat de protéine.

6. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que la source d'azote aminé contient un hydrolysat d'une biomasse de Flavobacter.

7. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que l'on extrait la zéaxanthine des cellules par traitement du milieu de culture ou des cellules recueillies, à l'aide d'un solvant organique polaire.

8. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme est issu de la souche No ATCC 21.588.

9. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme est issu de la souche No ATCC 21.081.

10. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que ledit micro-organisme est un mutant dont le parent est une bactérie du genre Flavobacter productrice de zéaxanthine.

11. Procédé selon la revendication et la sous-revendication 10, caractérisé par le fait que ledit mutant est obtenu par action de la 1 -méthyl-3 -nitro-l nitroso-guanidine sur une bactérie du genre Flavobacter au sein d'un milieu solidifié.

12. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 10 et 11, caractérisé par le fait que le mutant est issu de la souche No ATCC 21.081.

13. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 10 et 11, caractérisé par le fait que le mutant est issu de la souche No ATCC 21.588.

14. Procédé selon la revendication, caractérisé par le fait que l'on cultive ledit micro-organisme en conditions aérobies à une température comprise entre 28 et 300 C dans un milieu nutritif contenant au moins un hydrate de carbone et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, qu'on laisse décroître la teneur du milieu en hydrate de carbone jusqu'à une valeur comprise entre 15 et 35 mg/ml, que l'on ajuste la température du milieu de fermentation entre 22 et 250 C, que l'on ajoute progressivement au milieu de fermentation au moins un hydrate de carbone assimilable selon un débit tel que la teneur du milieu de fermentation en hydrate de carbone soit comprise entre 15 et 35 mg/ml et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres,

tout en maintenant la température du milieu entre 22 et 250 C.

15. Procédé selon la revendication ou selon la revendication et la sous-revendication 14, caractérisé par le fait que l'on ajoute progressivement au milieu de culture des quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé qui, exprimées en valeurs pondérales, sont dans un rapport compris entre 1,6 et 3,4.