LU83094A1 - Procede pour la fabrication de l'enzyme alpha-galactoxydase et procede pour l'hydrolyse du raffinose par utilisation de cet enzume - Google Patents

Description

Frocédé poux’ la fabrication de 1'*<-.-vir® -, 1 -1 oy v-'i'j?ô et procédé pour 1'hydrolyse du rafflnuse par utilisatien de cet enzyme.

La présente Invention concerne un procédé pour la ;| 5 fabrication de l’enzyme alpha-galaetoxydase (E.C. :.5.1.2.2 ) il par la culture des micro-organismes du genre yaecharcmyces et Ιηυΐ concerne également l'hydrolyse du raffinose par utilisation de cet enzyme. i

Le raffinose, un trlsaecharide oui se produit en 10 quantités importantes dans les betteraves sucrières, retarde la cristallisation du saccharose et par conséouent les rendements d extraction sont diminués. Ce fait pose un sérieux pro-jj blême économique pour les sucreries de sorte que l'hydrolyse |j du raffinose devient une nécessité afin d'améliorer à la fois jj 15 la qualité et le rendement du procédé de cristallisation du ! sucre extrait.

Beaucoup d articles décrivent des procédés enzymatiques pour hydrolyser le raffinose qui utilisent des enzvmes extraites d'un certain nombre d'espèces de micrc-oreanismes i 20 du genre Absldia, Aspergillus, Bacillus, Clrcinej.iaj Escnerichia,

Micro- coccus Sortieren a , Pénicillium etc.

- Toutefois, en cultivant un grand nombre de miero- ί organismes, l'extrait cellulaire contient non seulement \ 1'3-*ph a-gala et oxyda se mais également contient i ' invertase, de ii :‘S s°rte, que dans le traitement des mélasses de betteraves su- ericres, l'hydrolyse du raffinose s,acc0®Pagne d'un* fa-or non désirable de l'hydrolyse du saccharose.

j; L'avantage extraordinaire de la présente invention I] ’ est au fait que les micro-organismes choisis par qes aupeurs I * A‘° de la présente invention, et qui appartiennent au genre | Raççharomyces combinent d'une façon heureuse le bénéfice d'une j - durée de culture nettement réduite par rapport à celle des | moisissures avec la propriété de posséder une grand* i - enzymatique de l'alpha-galaero/vd-^e mais non g '"'-J **- -owiVitt: ; 35 enzymatloue de 1'Invertase.

; Ces micro-organismes, qui ont été isolés à partir | des e»ux résiduaires des broyeurs d'olives dans la réeiGn ae | Monterotondo (Rome, Italie) ont été classés sous les nûfns £ul.

! // I 'r *“ % * vants : Caeeharomyoes cereylsi ae, va r, oiea ce nus et Paccha-romyces cerevlslae, va r, ol&aglncgug et ont été dûmvnt dé posé s au Northern Regional c'.rter du U3 Repartirent of Agriculture, Peoria, Illinois, où ils ont reçu respectlvement les déslgna-5 tions HRRL Y 12056 et NRRL Y 12057.

Leurs caractéristiques de culture, et leurs propriétés morphologiques et physiologiques sont indiquées ei-iegsus.

A.- Caractérlstlques de culture , 1. Millau solide (3 jours) : agar et malt 10 Les colonies sont butyreuses, de couleur crème et brillante 2. Milieu liquide (3 jours) : extrait de malt.

j · Un dépôt s'est formé (dans le S. Cerevlslae, var oleaglnosus, on observe un léger anneau).

15 B.- Propriétés morphologiques ί 1. Caractéristiques des cellules végétatives :

Les cellules sont ellipsoïdales, cylindrioues et j auelauefols allongées.

?. Formation de pseudomycélium ou de mycélium vrai : ; 20 Un pseudomvcélium rudimentaire est présent dans les t j conditions anaéroYdes.

j 0,- Caractéristiques sexuelles :

Les cellules végétatives sont directement transfer-ί rr.ées en asel qui contiennent, de une à quatre spo-eg ·: ·'. sphéroïdales.

r>. - Propriétés ohvsi ologieues 1. Utilisation des sources de carbone I a) Fermentation : S , ct:j y vi sj_ae S . cer cvLoi au

-J Q

var . oly-ooeu·.. y <jr . ai caq i no su a I Glucose ·* -r (idldCtoaC *· t I l il .1 L U S C - -r ; ntc.

1 l»rt*«i 1 ose H éi i 1) i ose -s + i Itaffinose - + if if.

// b ) As 5 î Ια i ! .1 t i 'II. : S , π ίτν i s i .-r ί . I L'I.'.'liü.

\ .1 r . u 1 ï'*it'' us r· v · u 1 LiiiÎ.-iî-.' -ii'' i| r Glucose ' 1 Gülue 1 ose 1 1 j Maltose j 1 I, r e d 1 u s e 2 - 10 M é 1 i b i o s e 4 "* .

! Hat f i no se + - I . > ! D-mannltol + , D - (j 1 uc i t ο 1 2 ! -..-.thanol i i dlycérol y i 2 c i ijé 1 s e 1.1 ; uc ; . * — les iU^res ·_·· mp..':-:és currenés ne sont pas assimilés. r.c. ?. .-ssimi lat i or. ue composés azotés : Π trait .i*.r ρο·. assinr. : néoali:' o. ('roissancc à *”°·· : pcsiti v*. tour la dass! i'ieation, le pi *r. décrit par ·.?.

'an der ''ait dans "Tse Veasts", ."a;.-· éaition, éditeur I d . L:ode r, a été soi vi .

; Les cul tu sers ne s s-:u.s r.,i appartiennent à la p-esente invention peuvent être p; v.pare-es uans a en eondl ti <. r.e aéroi les par un nuel eor.uue je:, pr.i-r-.ié;? '-onnus, par exemple , et. ouiti va nt en su r ta , >·η i>_- pr- , a::- en cultures immer :-0- utilisant des appareils de rerrreutari c;. équipés d * d.-:i taten: r·.

lin milieu de culture roi peut être solide eu lieu: se contient une source de carncn« arr i mi la r-> e et une source cl a 7 te et ne sels r un *1 a» λ y., -’om.ne sources ue car ton-.:, pe^t utiliser le glucose, le méllhiooe, le raffln.se et tous les autres sucres, le jtlycerol et l'acétate de soàiur;:.

Comme sources ci'azot-, ·'r. peut utiliser des composés azotés minéraux et des composés ar. .-tés rvani aies tels nue ff if ! ) t , extrait de viande, extra 1 fc -.je le vu ;-e , peptones, tri ptone, | amlnoaeides, hydrolysats de es seine, farine ie soja et sels ammoniacaux.

Un autre avantage dominant provenant de l'utilisa-5 tlon des micro-organismes en question est le fait qu'ils fabriquent l'enzyme quand ils sont cultivés sur le glucose (l’enzyme est le constituant).

Un milieu de culture approprié a par exemple la composition suivante :

Extrait de levure 5-20 g/1

•l \J

\ (grammes par litre)

Glucose 10 g/1

Traces de UaHpPC/,, 1 ' MgSO^, (NHjpUO, 1 g/1 15 j La gamme du pH pour la culture va de ü a 7 et est de

; préférence de 5,0 à 5,5, la température est comprise entre 20°C

et êG°C, de préférence entre 05°C et ?o°C.

La production d’enzome peut être augmentée par l'addition de petites quantités de ir.élibicse, oui, comme on le ' ü sait, est le disaccharide provenant de l'hydrolyse partielle du raffinose. Le méiibicse peut être ajouté directement au milieu ue culture avant: 11 inoeulum, ou quand le stase de eroissar. logarithmique est terminé, dette durée d'induction peut varier ne 3Λ heures à heures et de oréférence est eornorise entre ''if.

-.0 heures et kk heures.

• Les cellules recueillies pendant la fermentation ou à la fin de celle-ci peuvent être utilisées telles quelles on sous forme de poudre sèche.

L'une autre façon, en peut utiliser les extraits de : _ x{> .. * ; ’ ces cellules bruts ou purifiés.

j ; pour cela, les cellules sont broyées par un quel- i j con :ue des procédés connus et on utilise l'extrait brut ou ; purifié contenant 1‘ensyme.

! | Récemment, un autre perfeeti or.r.e oent technique et j "55 ^ ’ , | economique a pu être réalisé en îmmo'*-irisant 1 ’enzyme par con> ; 3; in al son avec des composés maeromcléoulaires, en formant des

I liaisons chimiques avec 1s matrice, ou par des liaisons lor.ica.rS

| ou également par Immobil iss tien physique de 1’enzyme ou ses j // ! il . » ο ce]Iules.

Les ce!lu]es ainsi obtenues sont ajoutées, telles quelles ou Immobilisées, au mélange réactionnel qui contient les mélasses a un pH allant de ·’* à. 7 et à. une température ; I 5 âe 30°C à 60°C. Le raffino.se contenu dans les mélasses est b ainsi hydrolyse en galactose et saccharose, le rendement de / celui-ci est ainsi amélioré.

ij La présente invention est illustrée par les exerr- j pies descriptifs et non limitatifs ci-après.

J 10 EXEMPLE 1 î I - On prépare un bouillon de culture ayant la compcsi- I tion suivante : ! ! - ' (NH^ ) 2S0^ 3 cj/1 I m M(jS0..7H,0 3 g /1

I ~ ^ L

I Nü-HPO, . 12}lo0 li, 6g/J

;j C H l.

KH,PO. 3 y /1

L H

I Ha C 1 U, J y / i I ?0 CaCl 0 0.03 cj/1 !

Extrait de levure 20 q/1

S

i· i I ! e i i Li i 0 s e J 0 g / 1 f I r-£. On dissout ce s composés dans l’eau désionisée et or.

‘j; jj ael.itnaà pH 7,5 avec l’acide enî ornyari que .

ji* f 1 Le milieu ae culture ainsi préparé est reparti dans 1 des flacons L rien ma ver· de F,00 crrr à large col ? 10v ml ae I * ' I bouillon par flacon, stérilisation à llccr pendant 30 minutes ! , tO Les flacons .sont ensemencés avec 1 ml d’une culture ae 1s I souche du Saccharomyces cerevislae varJ oleaceus dans des . ballons de 050 ml contenant qü ml au même bouillon et la 1 croissance est amorcée à ?5°r pensant 16 heures tout eu agl- 1 tant flBO tours/mlnute..

135 Les flacons de fermentation sont mis en Incubation sous agitation (IRQ tours/mlnute) à ?5°0.

I i*G heures après l’ensemencement, les cellules ae = I cultures du bouillon srut recueillies par centrifugation et I lavées avec un tampon cnosphate (G, 1 ’-j pH 5,o}. Λ partir ce ! if ï i / κ i ; 100 ml de bouillon de culture, on obtient 0,ô5 g de \ cellules sèches.

r . Les cellules humides recueillies des 100 ml de I bouillon sont remises en suspension dans 100 ml de tampon ! 5 phosphate (0,1 K, pH 5,6) et l'activité enzymatique est 7 | examinée. 1 g de cellules sèches contient environ 1.10 I unités enzyme. L'activité enzymatique est mesurée par le | procédé suivant. * jj A 1 ml d'une suspension de cellules temponnée, on 110 ajoute ^ ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 5,6) et quelques . - gouttes de toluène pour rompre les parois des cellules.

Après 15 minutes d'incubation sous agitation à A0°C, la suspension est additionnée de 10 ml d'une solution à 1 ^ (poids/volume) de mélibiose dans le tampon phosphate 15 (0,1 M, pH 5,6).

I La réaction est soumise à l'incubation à 40°c pendant ? heures dans un bain-marie agité et est arrêtée ; en faisant bouilli·- pendant I5 minutes les échantillons prélevés du mélange réactionnel.

?0 La concentration du glucose telle qu'obtenue p&r l'hydrolyse ce mélibiose pendant la réaction est déterminée i avec le procédé colcrirnélrique GCL-Perid par r-.oeh ringer

Mannheim GmbH.

La densité optique des échantillons colorés est 05 mesurée à la température ordinaire avec un spect r opho t on-gt r -"noieman", de Perkin-Elmer, le trajet optique de la cuvette, est de 0,1 dm à la longueur d'onde de -.-6 miilimicrons.

Pi l'or, prend comme unité la quantité d’enzyme oui produit un microgramme de glucose en G heures dans 50 conditions -d'essai établies ci-dessus, les unités d'enzvrr-Par gramme de cellules séchées peuvent être calculées I * la formule suivante : I __ u fEPn“E0n; · 10:· : 35 grammes de cellules séchées E référence . 6 I où : ! // i /r' \ 17

! -V

• ·«* , i j E est la densité optique de l'échantillon prélevé cil A · apres 2 heures; E est la densité optiaue de l'échantillon prélevé à Oh zéro heure; 5 Ξ est la densité optique d'une solution de reference .; glucose de référence qui contient 18,2 microgrammes l| de glucose par millilitre; il G est la auantité en grammes de cellules séchées dans j 1 100 ml de bouillon de culture.

\ v EXEMPLE 2 fi .........

i t On prépare un bouillon de culture ayant la composition s , · suivante : I; 1 (nV2sî\ 5 g /1 i :! 15 L; HgS04.7H20 0,5 g /1 i 1 ; Na2HP04.12H?0 A, 6 g/] h'H-PO. 3 g /1

2 A

PQ NaCl 0. 1 cj/1

Cad 2 0,05 g/1 I Extrait de levure 10 g/3 I Glucose 10g/] t p5 Les composés indiqués ci-dessus sont dissous dans j. l'eau désionisée et le pH est réglé à 5,3 avec de l'acide i- | chlorhvdrioue.

f Les cultures dans ce bouillon de la souche I , Paceharomyces eerevisiae, var, oleaceus, préparées comme 1 ;*0 indiqué aans· l'exemple I, sont mises en incubation sous agita tion orbitale {lBü tours/minute) à 27°C.

. ‘ 39 heures après l'ensemencement, les cellules du j bouillon de culture sont recueillies par centrifugation et ,! lavées avec un tampon phosphate (0,1 K pH 5,6).

• 35 A partir de 100 ml de bouillon de culture, on 1 obtient 0,5Ao g de cellules séchées. Les cellules recueillies a ; partir des 100 ml de bouillon sont remises en suspension dans j 100 ml de tampon phosphate (0,1 K, pH 5,6) et essayées pour t / lr: il . · 6 déterminer l'activité enzymatique. 1 g de cellules séchées £ contient 9,4.10 unités enzyme.

* EXEMPLE 5

On prépare un milieu de culture ayant la composition 5 suivante : ()£ SO^ 3,00 g/1

MgSU^. 70^0 . 0,3 g/1 lla-HPO. . 1?H,0 if,6 a/1 10 KH2P0^ 3,00 g /1

NaCl 0,1 g /1 . / CaCl, 005 g/1

Extrait de levure 10 g/1 I5 Glucose 10 g/1 Méllblûse 1 g/1

Les composés mentionnes ci-dessus sont dissous dans l'eau dés i anisée et le pH est réglé à avec de l'acide 20 chlorhydrique.

Les cultures de la souche Gaccharorr.yces cerevlsiae, var. oleaceus, préparées comme dans l'exemple 1, sont mises en incubation avec agitation orhi taie (180 tours/minute j a C’7cu. i*;· heures après 1 1 ensemencement, les cellules provenant des cultures du bouillon sont recueillies par centrifugation et lavées avec le tampon phosphate (0,1 F., pH 5,6). A partir ces 10G ml de culture du bouillon, on obtient 0,59½ g de cellules séchées.

* . Les cellules recueillies à partir des IGG ml de du bouillon de culture sont remises en suspension dans 10G mi de tampon phosphate (0,1 M,pH 5,6) et essayées pour déterminer l'activité enzymatique : 1 g Je cellules séchées contient 1,6.10' unités enzyme.

EXEMPLE 7 65

On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante : // A'· // * '.j I (NH.KSO, · no y /1 A c 4 IUjSO. . 7H,ü Ü, Oi> tj/1 H x i j HaHPÜ. . 1211,0 A, 6 y/1 : J, H l.

| 5 K11, P 0 . 3,0 y/1

j jj! Λ H

'j (la Cl 0,1 y/1 ;j CaCl, °,°5 I ^ f Extrait de levure 10( 0 y/1 I 10 j . C1 u ο o i. e 5,0 g/1

! - - : s > A

| Les composés mentionnés ci-dessus sont dissous dans i l'eau désionlsée et le pH est réglé à 5,3 avec de l'acide f 15 1 chlorhydriaue.

nés cultures de Saccharoir.vces cerevisiae, var.

i ’j ----t-- l oleaceus dans un bouillon de ce genre, préparées comme dans j: l'exemple 1, sont mises en incubation sous agitation orbitale | (180 tours/minute ) a 2QcC. heures après l'ensemencement du ’ ' bouillon de culture, les cellules sont recueillies par centri- | fugation et lavées avec le tampon phosphate (0,1 K, pH 5,6).

f I A partir des 100 ml de bouillon de culture, on obtient 0,355g I de cellules séchées.

' 6 ml du bouillon de culture sont ajoutés à 50 ml ijri O , v I de mêlasse à io° Prix contenant 1,6 en poids de raffinose

II

I par rapport aux matières solides totales, et sont réglés à ur.

| PH de 5,2 avec H?S0)t. Le traitement est effectué à Â0°C sous r agitation pendant lo heures. La concentration de galactose, I * I . un produit de l'hydrolyse du raffinose pendant la réaction, " est déterminée avec le procédé d'essai U7 Lactose/galactcse | _ de fioenringer Manhenim Ot;.bH. Dans les conditions mentionnées ! ci-dessus, on obtient 153 mi croir.de s de galactose, équivalent | - à l’hydrolyse des 30 % du raffincse présent en totalité.

/ ; r /

Claims (2)

1ύ »,* r, 1 CA TI Ο!! S

1. Procédé pour la faPricati on de l'enzyme alpha-galactoxydase consistant ,à provoquer une ferm&îLation de levures du genre Paccharomyces cerevlslae qui a lieu dans une gamme 5 de pH de à 7 et à une température comprise entre pO°C et 40°C.

2. Procédé pour l'hydrolyse enzymatique du raffinc-se, caractér'isé par le fait que la -réaction a lieu en présence de cellules, d'extraits enzymatiques, d 'extraitsenzymatiquesenri - 10 chis provenant de levures du genre Paecharomyees cerevlslae, ou en présence d'enzymes ou de cellules immobilisées. Â'^f 'f / * 4 /f r/ // " L