BRPI1105703A2 - Métodos para determinar zigosidade em uma amostra volumosa - Google Patents
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Abstract
Métodos para determinar zigosidade em uma amostra volumosa. A presente invenção refere-se a métodos para determinar a presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeos inserida em um sítio de inserção especifico em um ácido nucleico e os métodos incluem: isolar um ácido nucleico a partir de uma amostra de tecido volumosa; colocar o ácido nucleico em contato com um iniciador direto capaz de se ligar ao ácido nucleico a montante do sitio de inserção, um primeiro iniciador reverso específico para a sequência de nucleotídeos inserida e um segundo iniciador reverso capaz de se ligar ao ácido nucleico a jusante do sítio de inserção. Os iniciadores podem ser usados para reproduzir ácidos nucleicos entre os iniciadores. Os ácidos nucleicos reproduzidos podem ser analisados para determinar se uma sequência de nucleotídeos inserida está presente ou ausente na amostra.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA DETERMINAR ZIGOSIDADE EM UMA AMOSTRA VOLUMOSA".
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
Este pedido de patente reivindica o benefício da data de depósi- to do pedido de patente provisório número de série US 61/428.142, deposi- tado em 29 de dezembro de 2010, intitulado "Methods to Determine Zygosity in a Bulked Sample".
ANTECEDENTES O teste de controle de qualidade quanto a qualquer contamina- ção em uma linhagem acabada é muito crítico para a produção exitosa de sementes híbridas e para manter e construir um bom relacionamento de ne- gócios com os clientes. A contaminação durante a ampliação de sementes de uma linhagem acabada pode advir da polinização de plantas transgênicas ou não transgênicas não intencionais cultivadas perto do local de produção ou durante o processamento de sementes e mais essencialmente, a conta- minação devida a vazamento de polens a partir de plantas estéreis. Para assegurar que a linhagem acabada seja completamente homozigótica e livre de qualquer hemizigoto, linhagens nulas ou transgênicas não intencionadas, o método das fileiras do aparelho de teste é atualmente seguido. O método das fileiras do aparelho de teste utiliza tecnologia ELISA para estimar o es- tado de zigosidade baseado nos níveis de proteínas em uma base vegetal individual. Como o ensaio se baseia em uma única base vegetal, ele é muito moroso bem como oneroso. Além disso, há um custo adicional para trans- portar o método das fileiras do aparelho de teste para o campo. O método ELISA é útil para detectar o silenciamento da expressão de transgenes de- tectando o nível de proteínas. Ele não é sensível e robusto para detectar qualquer contaminação com hemizigoto, nula ou qualquer outra contamina- ção não intencionada no lote de sementes acabadas. Além disso, quando o método ELISA é usado, uma amostragem separada de tecido é necessária para testar a presença adventícia.
DESCRIÇÃO
As modalidades específicas da invenção incluem métodos para determinar a presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeos inse- rida em um sítio de inserção específico em um ácido nucleico. As modalida- des podem compreender: isolar ácido nucleico a partir de uma amostra vo- lumosa; colocar o ácido nucleico em contato com um iniciador direto capaz de se ligar ao ácido nucleico a montante do sítio de inserção, e um iniciador reverso capaz de se ligar ao ácido nucleico a jusante do sírio de inserção.
Os iniciadores podem ser usados para reproduzir ácidos nucleicos entre os iniciadores. Os ácidos nucleicos reproduzidos podem ser analisados para determinar se uma sequência de nucleotídeos inserida está presente ou au- sente em uma amostra volumosa.
As modalidades podem compreender: isolar ácido nucleico a partir da amostra; colocar o ácido nucleico em contato com um iniciador dire- to capaz de se ligar ao ácido nucleico a montante do sítio de inserção, e um iniciador reverso capaz de se ligar ao ácido nucleico a jusante do sítio de inserção. Os iniciadores podem ser usados para reproduzir ácidos nucleicos entre os iniciadores na primeira parte e na segunda parte. Os ácidos nuclei- cos reproduzidos podem ser analisados para determinar se a sequência de nucleotídeos inserida está presente ou ausente na amostra. Uma segunda reação multiplexada com a reação acima ou como uma reação singleplexa- da pode ser conduzida usando um iniciador direto ou um iniciador reverso que detecta um gene ou sequência endógena. Esta segunda reação pode ser usada como um controle interno para determinar a qualidade e a quanti- dade do DNA e/ou as condições da PCR usadas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1A é uma representação esquemática dos elementos para um método de determinar a presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeos em um sítio de inserção específico de acordo com uma mo- dalidade da invenção. Na figura, a sequência de nucleotídeos possivelmente inserida (110) está representada pelo bloco escuro, enquanto que o genoma circundante (120) está indicado pelos segmentos vazados. Estão represen- tados também o iniciador direto (130), o primeiro iniciador reverso (140), e o segundo iniciador reverso (150). Estão representadas ainda a sonda especí- fica da inserção opcional (160) e a sonda específica do tipo selvagem (170). A figura 1B ilustra um ensaio modificado que inclui executar um protocolo-padrão de zigosidade em duas reações separadas: Reação 1 in- clui um iniciador comum, um iniciador específico do tipo selvagem, e uma sonda específica do tipo selvagem (FAM); e Reação 2 inclui o controle en- dógeno (gene Invertasel) com sonda VIC. A figura 2A é uma representação esquemática de um primeiro produto replicado (200) de acordo com uma modalidade da invenção. Estão representados também o iniciador direto (130), o primeiro iniciador reverso (140), e a sonda específica da inserção opcional (160). A figura 2B é uma representação esquemática de um primeiro produto replicado (200) de acordo com uma modalidade da invenção. Estão representados também o iniciador direto (130), o segundo iniciador reversor (150), e a sonda específica do tipo selvagem opcional (170). A figura 3 é uma representação esquemática dos elementos pa- ra um método de determinar a presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeos inserida em um sítio de inserção específico de acordo com uma modalidade da invenção. Uma primeira reação (400) envolve a sequência de nucleotídeos possivelmente inserida (110) que está representada pelo bloco escuro, enquanto que o genoma circundante (120) está indicado pelos seg- mentos vazados. Estão representados também o iniciador direto (130), o primeiro iniciador reverso (140), e a sonda específica da inserção opcional (160).
Uma segunda reação (500) envolve a sequência de nucleotídeos possivelmente inserida (110) que está representada pelo bloco escuro, en- quanto que o genoma circundante (120) está indicado por segmentos vaza- dos. Estão representados também o iniciador direto (130), o segundo inicia- dor reverso (150), e a sonda específica do tipo selvagem opcional (170). A figura 4 é uma representação gráfica dos resultados da fluo- rescência de FAM a partir de um Roche LightCiclor 480. A figura 5 é uma representação gráfica dos resultados da fluo- rescência de VIC a partir de um Roche LightCiclor 480.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
As modalidades da invenção incluem métodos para determinar a presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeos inserida em um sítio de inserção específico em uma amostra de ácidos nucleicos. Em algu- mas modalidades, os ácidos nucleicos podem ser isolados e/ou purificados a partir de uma única fonte ou uma população de fontes, população esta que pode incluir um ou mais indivíduos que podem ou não ter cada um ácidos nucleicos distintos. Em outras modalidades, a fonte de ácidos nucleicos po- de ser, porém sem limitações, animal, vegetal, bactérias, Archaea, protistas, fungos, protozoários, cromistas, eucariotos, procariotos, in vivo, in vitro, célu- la, semente, gameta, milho, soja, trigo, colza, arroz, e fontes geradas.
Em modalidades específicas, o método pode compreender ob- ter, isolar, purificar e/ou purificar parcialmente ácido nucleico. Fazendo refe- rência à figura 1, os ácidos nucleicos isolados podem ser colocados em con- tato com um iniciador direto (130) capaz de se ligar ao ácido nucleico a mon- tante do sítio de inserção (120) e um primeiro iniciador reverso (140) capaz de se ligar especificamente à sequência dentro da sequência de nucleotí- deos inserida (110) (caso presente), e um segundo iniciador reverso (150) capaz de se ligar especificamente a uma sequência a jusante (120) do sítio de inserção e permitindo que os iniciadores sofram anelação aos ácidos nu- cleicos isolados. As sequências intervenientes entre os iniciadores podem ser então reproduzidas, caso possível, usando os iniciadores para replicação dos iniciadores, por intermédio de técnicas bem conhecidas nessa área, tal como, porém sem limitações, Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). No caso de sítios de inserção nos quais a sequência de nucleotídeos inserida (110) está presente e é maior do que um fragmento reproduzível por méto- dos padronizados (por exemplo, > 5 kb), os produtos da reprodução podem incluir um primeiro produto replicado (figura 2A (200)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o primeiro iniciador reverso (140), mas pode genericamente carecer de um segundo produto replicado (figura 2B (300)) iniciado a partir do segundo iniciador reverso (150). No caso de sítios de inserção nos quais a sequência de nucleotídeos inserida não está presente, os produtos da reprodução podem incluir o segundo produto repli- cado (figura 2B (300)) que compreende as sequências entre o iniciador dire- to (130) e o segundo iniciador reverso (150). Quando a sequência de nucleo- tídeos inserida (110) está presente em alguns, porém não em todos sítios de inserção no ácido nucleico, resultará uma mistura dos dois produtos. Os re- sultados da reprodução são então analisados para determinar a presença e/ou níveis relativos do primeiro produto replicado (200) e/ou do segundo produto replicado (300).
No caso de sítios de inserção nos quais a sequência de nucleo- tídeos inserida está presente, os produtos da reprodução do ácido nucleico podem incluir o primeiro produto replicado (figura 2A (200)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o primeiro iniciador reverso (150). No caso de sítios de inserção nos quais a sequência de nucleotídeos inserida não está presente, os produtos da reprodução podem incluir o se- gundo produto replicado (figura 2B (300)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o segundo iniciador reverso (150). Quando a sequência de nucleotídeos inserida (110) está presente em alguns, porém não em todos os sítios de inserção no ácido nucleico, resultará uma mistura dos dois produtos. Os resultados da reprodução são então analisados para determinar a presença e/ou níveis relativos do primeiro produto replicado (200) e/ou do segundo produto replicado (300).
Em outras modalidades, na presença da sequência de nucleotí- deos inserida no sítio de inserção, o iniciador direto e o primeiro iniciador reverso estarão menos do que aproximadamente 5 kb afastados e o inicia- dor direto e o segundo iniciador reverso estarão mais do que aproximada- mente 5 kb afastados. Em outras modalidades, quando a sequência de nu- cleotídeos inserida está ausente do sítio de inserção, o iniciador direto e o segundo iniciador reverso estarão menos do que aproximadamente 5 kb a- fastados.
Em modalidades específicas, fazendo referência à figura 3, o á- cido nucleico isolado pode ser dividido em várias partes. Uma primeira parte do ácido nucleico pode ser colocada em contato com um iniciador direto (130) capaz de se ligar ao ácido nucleico a montante do sítio de inserção (120) e um primeiro iniciador reverso (140) capaz de se ligar especificamen- te à sequência dentro da sequência de nucleotídeos inserida (110) (caso presente), e permitindo que os iniciadores sofram anelação aos ácidos nu- cleicos isolados. As sequências intervenientes entre os iniciadores podem ser então reproduzidos, caso possível, usando os iniciadores para iniciar a replicação, por intermédio de técnicas bem conhecidas nessa área, tal como, porém sem limitações, PCR. No caso de sítios de inserção nos quais a se- quência de nucleotídeos inserida (110) está presente, os produtos da repro- dução podem incluir um primeiro produto replicado (figura 2A (200)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o primeiro inicia- dor reverso (140).
Uma segunda parte do ácido nucleico pode ser colocada em contato com um iniciador direto (130) capaz de se ligar ao ácido nucleico a montante do sítio de inserção (120) e um segundo iniciador reverso (150) capaz de se ligar especificamente a uma sequência a jusante (120) do sítio de inserção, e permitindo que os iniciadores sofram anelação ao ácido nu- cleico isolado. As sequências intervenientes entre os iniciadores podem ser então reproduzidas, caso possível, usando os iniciadores para iniciar a repli- cação, por intermédio de técnicas bem conhecidas nessa área, tal como, porém sem limitações, PCR. No caso de sítios de inserção nos quais a se- quência de nucleotídeos inserida (110) não está presente, os produtos da reprodução podem incluir um segundo produto replicado (figura 2B (300)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o segundo iniciador reverso (150).
No caso de sítios de inserção nos quais a sequência de nucleo- tídeos inserida está presente, os produtos da reprodução da primeira parte do ácido nucleico podem incluir o primeiro produto replicado (figura 2A (200)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o primeiro iniciador reverso (150). No caso de sítios de inserção nos quais a sequência de nucleotídeos inserida não está presente, os produtos da reprodução da segunda parte do ácido nucleico podem incluir o segundo produto replicado (figura 2B (300)) que compreende as sequências entre o iniciador direto (130) e o segundo iniciador reverso (150).
Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para de- tectar a presença da inserção no ácido nucleico quando a inserção está pre- sente em menos do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% dos sítios de inserção nos ácidos nucleicos. Em certas modalidades, os mé- todos podem ser usados para detectar a ausência da inserção no ácido nu- cleico quando a inserção está ausente em menos do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% dos sítios de inserção nos ácidos nucleicos.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico que contém o sítio de inserção pode ser qualquer tipo de ácido nucléico, incluindo, porém sem limitações, DNA, RNA, PNA, ou outras formas modificadas de ácidos nuclei- cos.
Em outras modalidades, a presença e/ou as quantidades do pri- meiro e/ou segundo produto da replicação podem ser detectadas por qual- quer meio conhecido nessas técnicas, tais como, porém sem limitações, sondas específicas da inserção (160) e sondas específicas do tipo selvagem (170) respectivamente. Em modalidades específicas, uma sonda pode ser uma sequência de nucleotídeos capaz de se ligar em um sítio específico no primeiro e/ou segundo produto da replicação. A anelação de uma sonda po- de ocorrer durante ou depois da replicação. A título de exemplos não límitativos, a presença e/ou quantida- des do primeiro e/ou segundo produto da replicação podem ser detectadas através do uso de cromatografia, géis, marcadores, grupamentos, Southern blots, e Northern blots.
Em certas modalidades, o fluoróforo pode ser afixado a uma ou mais sondas para facilitar a detecção. Adicionalmente, uma molécula extinto- ra de fluoróforo também pode ser afixada à sonda. Os exemplos dessas sondas que contêm um fluoróforo e uma molécula extintora de fluoróforo incluem o sistema TaqMan® e reagentes disponíveis na Roche Molecular Diagnostics e/ou Applied Biosystems. Em outras modalidades, a produção e os níveis do primeiro e/ou segundo produtos da reprodução podem ser moni- torados em tempo real.
Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser usados para determinar a zigosidade de ácidos nucleico (por exemplo, ge- noma(s)) em um sítio de inserção específico. Os resultados dos ensaios nos quais o primeiro produto replicado (200) está presente e o segundo produto da replicação (300) está ausente indicam que os ácidos nucleicos são ho- mozigóticos quanto á presença da inserção. Os resultados dos ensaios nos quais o primeiro produto replicado (200) está ausente e o segundo produto da replicação (300) está presente indicam que os ácidos nucleicos são ho- mozigóticos quanto á ausência da inserção. Os resultados dos ensaios nos quais o primeiro produto da replicação (200) e também o segundo produto da replicação (300) estão presentes indicam que os ácidos nucleicos são heterozigóticos quanto à inserção (por exemplo, pelo menos um sítio de in- serção contém a inserção e pelo menos um sítio de inserção não contém a inserção).
Em modalidades específicas, os conjuntos de iniciadores e/ou sondas podem ser combinados com um ou mais outros conjuntos de inicia- dores e sondas de modo a permitir a detecção da presença ou ausência de uma ou mais inserções dentro de um ou mais sítios de inserção específicos no ácido nucleico de uma amostra. Como aqui utilizado, o termo "conjunto de iniciadores e/ou sondas" inclui pelo menos um iniciador direto capaz de se ligar a um sítio a montante de um sítio de inserção específico e pelo me- nos um iniciador reverso capaz de se ligar a um sírio a jusante de um sítio de inserção específico ou dentro de uma inserção específica. Em outras mo- dalidades, múltiplos conjuntos de iniciadores e/ou sondas podem ser usados para detectar uma inserção específica em um ou mais sítios de inserção es- pecíficos e/ou múltiplas inserções em múltiplos sítios de inserção específi- cos.
Em certas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser usados para triar uma população quanto à presença ou ausência de uma inserção em um sítio de inserção específico. Em outras modalidades, a pre- sença de um sítio de inserção específico pode ser determinada para cada membro da população.
Como aqui utilizado, o termo "sítio de inserção específico" deno- ta uma localização conhecida ou sequência conservada dentro de um ácido nucleico onde uma inserção pode ser inserida de forma reprodutível. Em certas modalidades, a presença de um sítio de inserção específico pode ser determinada para cada ácido nucleico em uma amostra, a título de exemplo não limitativo, através da produção de um primeiro (200) ou um segundo (300) produto replicado pelos métodos aqui descritos. Em outras modalida- des, as sequências que flanqueiam o sítio de inserção específico ou as se- quências dentro da inserção podem ser conservadas. Em outras modalida- des, tal conservação nas sequências que flanqueiam o sítio de inserção es- pecífico ou dentro da inserção pode ser limitada os sítios de ligação dos ini- ciadores e/ou sondas. Como utilizado neste contexto, o termo "conservado" denota que um iniciador e/ou sonda específica é capaz de se ligar especifí- camente à área que é "conservada". Em modalidades específicas, o inicia- dor e/ou sonda específica deve permanecer ligada à área "conservada" sob condições altamente severas.
Como aqui utilizados, os termos "a montante" e "a jusante" são termos relativos e designam lados opostos de um sítio de inserção em um ácido nucleico. Qual direção está localizada "a montante" e "a jusante" de um sítio de inserção não é denotada pelos termos, apenas que elas ficam em lados opostos do sítio de inserção.
Como aqui utilizados, os termos "iniciador direto" e "iniciador re- verso" são termos relativos que denotam iniciadores que se ligam a diferen- tes locais em um ácido nucleico de modo a permitir a reprodução dos ácidos nucleicos entre si por métodos disponíveis nessas técnicas, tal como, porém sem limitações, PCR. Onde um iniciador específico está ligado a um sítio da sequência de ácidos nucleicos não é denotado pelos termos "direto" e "re- verso", apenas que eles ficam em lados opostos da sequência a ser repro- duzida e podem atuar como iniciadores para uma polimerase na reprodução.
Como aqui utilizados, os termos "compreender", "incluir", "con- ter", "caracterizado por" e seus equivalentes gramaticais são termos inclusi- vos ou ilimitados que não excluem elementos adicionais não citados, ou eta- pas dos métodos, mas incluem também os termos mais restritivos "consistir em" e "consistir essencialmente em". A presente invenção será descrita adicionalmente nos exemplos que se seguem, que são oferecidos a título ilustrativo e não pretendem limi- tar de forma alguma a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Material Vegetal: Triagem de linhagens parentais: Para determinar se a sequência limítrofe no sítio de inserção do transgene é altamente conservada e que os iniciadores específicos do evento podem ser usados na totalidade de vários anteceden- tes genéticos, um total de 92 linhagens endogâmicas diversas foram tríadas, que representaram diferentes grupos heteróticos e locais tais como América do Norte, América do Sul, Europa, pedúnculo rígido, pedúnculo maleável, fontes públicas e patenteadas (Tabela 1).
Tabela 1. Lista de materiais usados para triar sequência limítrofe no sítio de inserção do transgene.
Tipo de Material Grupo Heterótico Origem Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Flint Européia Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Público Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Pedúnculo maleável Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Tipo de Material Grupo Heterótico Origem Público Misto Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Flint Sul-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Misto Norte-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Misto Sul-americana Público Pedúnculo rígido Norte-americana Público Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo maleável Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Tipo de Material Grupo Heterótico Origem Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Público Lancaster Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Pedúnculo maleável Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo maleável Norte-americana Público Pedúnculo maleável Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Lancaster Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Pedúnculo rígido Norte-americana Patenteado Misto Norte-americana Patenteado Suwan Sul-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Pedúnculo maleável Norte-americana Patenteado Misto Norte-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Tropical Sul-americana Patenteado Misto Sul-americana Patenteado Misto Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Patenteado Lodent Norte-americana Triagem Volumosa de Sementes: Para demonstrar a aplicação do teste baseado em DNA em amostras de sementes volumosas e para determinar a sensibilidade da detecção, as coleções de sementes mencionadas abaixo foram criadas usando DAS-59122 homozigótica pura conhecida, DAS-59122 hemizigótica, e sementes nulas (convencionais). Elas foram contadas dentro de seis tubos Falcone de 50 ml_ diferentes: 1. 100 sementes DAS-59122 homozigóticas, replicação-1 2. 100 sementes DAS-59122 homozigóticas, replicação-2 3. 99 sementes DAS-59122 homozigóticas, e uma semente DAS 59122 hemizigótica, replicação-1 4. 99 sementes DAS-59122 homozigóticas, e uma semente DAS 59122 hemizigótica, replicação-2 5. 99 sementes DAS 59122 homozigóticas e uma semente nula (conven- cional), replicação-1 6. 99 sementes DAS 59122 homozigóticas e uma semente nula (conven- cional), replicação-2 Exemplo 2: Moaaem de sementes e extração do DNA
As sementes foram moídas finamente o o DNA genômico foi iso- lado usando o kit Qiagen DNEasy kit (Valencia, CA). Cinco extrações do DNA genômico separadas foram completadas a partir de cada lote de se- mentes. O DNA genômico purificado foi quantificado usando o kit Quantlt Picogreen DNA e diluído até concentrações padronizadas.
Exemplo 3: Ensaios de Ziaosidade Baseados em TaaMan: A análise da zigosidade foi conduzida usando diferentes conjun- tos de reagentes que consistiram em diferentes sequências de iniciadores e sondas. O método e os reagentes foram desenhados especificamente para o evento DAS-59122. Um esquema do desenho do ensaio de zigosidade está ilustrado na figura 1. O método utilizou um iniciador específico do gene, um iniciador do tipo selvagem (comum) específico do gene além de duas son- das. As sondas consistiram em uma sonda específica do tipo selvagem e uma específica transgênica. O primeiro método incorporou todos os iniciado- res e sondas dentro da mesma reação ("método de uma única reação"). Pa- ra aumentar a sensibilidade de detecção da zigosidade, um método adicional também foi testado, no qual duas reações separadas independentes foram realizadas (figura 3) ("método de múltiplas reações"). Um conjunto de poços continha o iniciador específico do tipo selvagem, um iniciador comum, e uma sonda específica do tipo selvagem. O outro conjunto de poços continha o iniciador específico do transgene, o iniciador comum, e a sonda específica do transgene. Por exemplo, neste método apenas dois iniciadores e uma sonda foram usados em um formato de placa com 384 poços na qual um quadrante continha o iniciador específico do tipo selvagem + iniciador co- mum + sonda específica do tipo selvagem, outro quadrante continha o inici- ador específico do transgene + iniciador comum + sonda específica do transgene.
Taqman Modificado no Ponto Final: Uma mistura principal contendo os seguintes componentes foi preparada, 15,35 pL; 10X Tampão de PCR, 2,50 pl_; MgCI2 25 mM,1.50 pL; dNTP 10 mM (2,5 mM cada), 2,0 pL; iniciador di- reto comum 20 pM (SEQ ID NO:1), 0,25 pL; iniciador reverso do tipo selva- gem 20 pM (SEQ ID NO:2), 0,25 pL; sonda marcada dupla do tipo selvagem 10 pM (SEQ ID NO:3) marcada com VIC na extremidade 3' e BHQ2 na ex- tremidade 5', 0,20 pL; HotStar Taq (5 U/pL), 0,20 pL; e 10 ng/pL de DNA
Genômico, 3,0 pL.
Uma segunda mistura principal contendo os seguintes compo- nentes foi preparada: água 15,35 pL; 10X Tampão de PCR, 2,50 pL; MgCI2 25 mM, 1,50 pL; dNTP 10 mM (2,5 mM cada), 2,0 pL; iniciador direto comum 20 pM (SEQ ID NO:1), 0,25 pL; iniciador reverso 591227 20 pM (SEQ ID NO:4), 0,25 pL; sonda 591227 com dupla marcação 10 pM (SEQ ID NO:5) marcada com FAM na extremidade 3' e BHQ1 na extremidade 5', 0,20 pL;
HotStar Taq (5 U/pL), 0,20 pL; e DNA Genômico 10 ng/pL, 3,0 pL.
Ambos coquetéis foram pipetados para dentro de poços individuais e amplificados usando um Sistema GenAmp PCR 9700 para as seguintes con- dições: 95°C por 15 minutos (1 ciclo); 95°C por 15 segundos, 60°C por 60 se- gundos (35 ciclos). As leituras de fluorescência foram analisadas e a zigosidade foi determinada a partir da excitação do fluoróforo VIC ou FAM.
Resultados: Depois de determinar a natureza conservada de sequências limítrofes no sítio da ligação de iniciador, os iniciadores foram desenhados e testados em coleções de sementes volumosas usando um ensaio padrão de zigosidade Taqman. Os resultados indicaram que o método de uma única reação foi sensível para detectar contaminação de sementes nulas em se- mentes volumosas homozigóticas puras com 1 % de sensibilidade de detec- ção. Entretanto, método de uma única reação foi inconsistente em detectar qualquer contaminação de sementes hemizigóticas em um nível de 1% de presença. A insensibilidade poderia ser dever à amplificação preferencial da reação 1 (vide figura 1) devido à disponibilidade abundante do modelo. Para superar esta competição de recursos durante a reação PCR, o método de uma única reação foi modificado para múltiplas reações separadas (figura 3).
Esta modificação resultou na amplificação seletiva de apenas a região pre- tendida sem qualquer competição de recursos. O uso do método de múlti- plas reações (teste de zigosidade de sementes parentais) nas "coleções de sementes" parentais se demonstrou consistente na detecção de contamina- ção de semente hemizigótica bem como convencional (nula) em um volume de sementes homozigóticas puras a 1% de sensibilidade de detecção (Tabe- la 2). Os resultados foram confirmados também através de PCR em tempo real usando o Light Ciclor 480 da Roche para assegurar que não havia quaisquer produtos artificiais na reação PCR ou na instalação.
Triagem de Linhagens Parentais: Os iniciadores específicos de eventos podem ser usados na totalidade de vários antecedentes genéticos, 92 linha- gens endógamas diversas (Tabela 1) que representam diferentes grupos heteróticos cultivados em locais tais como América do Norte, América do Sul e Europa foram usadas para testar o método de múltiplas reações. Estas linhagens foram testadas e confirmadas como sendo livres de contaminação de transgenes usando o protocolo descrito acima. A análise usando um ciclor térmico Roche 480 em tempo real (figuras 4 e 5) bem como ensaios baseados em TaqMan no ponto final indi- cou que todas linhagens endógamas testadas têm a sequência limítrofe con- servada que flanqueia a inserção do transgene. Elas foram amplificadas exitosamente com iniciador/sonda específica do tipo selvagem (WT) confir- mando que os iniciadores e sondas do ensaio para o evento DAS 59122-7 podem ser usados na totalidade de programas de introgressão para teste de zigosidade de sementes parentais em linhagens acabadas.
Alguns dos benefícios do método de múltiplas reações incluem todas as vantagens de simplicidade e confiabilidade de um teste de DNA sobre o teste ELISA. O mais importante é que ele permite o teste de zigosi- dade usando coleções de sementes volumosas ao invés do teste ELISA que apenas pode detectar plantas individuais. Além disso, este método pode cor- tar os custos operacionais para fileiras do aparelho de teste e teste ELISA em dez vezes. Este método pode também aumentar a sensibilidade do en- saio e detectará outros contaminantes. O método de múltiplas reações pode ser usado também como um "indicador" para o teste da presença adventícia (AP) a jusante que pode ser utilizado para testar eventos não intencionados e demonstrará também o estado homozigótico puro da amostra volumosa. O teste com o método de múltiplas reações se demonstrou alta- mente sensível em detectar a presença de qualquer contaminação de se- mentes hemizigóticas ou nulas em um lote de sementes de linhagens aca- badas homozigóticas puras. Demonstrou-se que o método de múltiplas rea- ções o método de múltiplas reações pode detectar contaminação em um nível de 1% de contaminação (1 em 100 sementes). Esta nova metodologia resultou no estabelecimento de uma nova função da Análise Molecular de Alto Volume de Produção (HTMA), teste de melhor pureza em linhagens a- cabadas, e pode também proporcionar uma economia de dez vezes para operações no campo.
Embora esta invenção tenha sido descrita em certas modalida- des, a presente invenção pode ser modificada adicionalmente dentro do es- pírito e âmbito deste relatório descritivo. Este pedido de patente pretende, portanto, cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção que usam seus princípios genéricos. Além disso, este pedido de patente preten- de cobrir tais afastamentos do presente relatório descritivo que estejam den- tro da prática conhecida ou costumeira nas técnicas às quais esta invenção pertence e que caiam dentro dos limites das reivindicações apensadas.
Claims (20)
1. Método para determinar a presença ou ausência de uma se- quência de nucleotídeos inserida em um sítio de inserção específico em um ácido nucleico, onde o método compreende: isolar o ácido nucleico a partir da amostra; colocar o ácido nucleico em contato com: um iniciador direto capaz de se ligar ao ácido nucleico a montan- te do sítio de inserção; e um iniciador reverso capaz de se ligar ao ácido nucleico a jusan- te do sítio de inserção; usar os iniciadores para reproduzir ácidos nucleicos entre os ini- ciadores; e analisar os ácidos nucleicos reproduzidos para determinar se a sequência de nucleotídeos inserida está presente ou ausente na amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a- inda colocar o ácido nucleico, durante ou depois da reprodução em contato com uma sonda específica para um fragmento amplificado na presença da sequência de nucleotídeos inserida.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a- inda colocar o ácido nucleico, durante ou depois da reprodução, em contato com uma sonda específica para um fragmento amplificado na ausência da sequência de nucleotídeos inserida.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a- inda colocar o ácido nucleico, durante ou depois da reprodução, em contato com uma sonda específica para um fragmento amplificado na ausência da sequência de nucleotídeos inserida.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra compreende mais do que uma iteração de um sítio de inserção específico.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra compreende ácido nucleico de múltiplos organismos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que a sequên- cia de nucleotídeos inserida está presente em menos do que 1% dos sítios de inserção específicos no ácido nucleico.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que a sequên- cia de nucleotídeos inserida está presente em mais do que 99% dos sítios de inserção específicos no ácido nucleico.
9. Método para determinar a presença ou ausência de uma se- quência de nucleotídeos inserida em um sítio de inserção específico, em que o método compreende: isolar ácido nucleico a partir da amostra; colocar um ácido nucleico em contato com um iniciador direto capaz de se ligar ao ácido nucleico a montante do sítio de inserção, e um iniciador reverso capaz de se ligar ao ácido nucleico a jusante do sítio de inserção; usar os iniciadores para reproduzir ácidos nucleicos entre os ini- ciadores na primeira parte e na segunda parte do ácido nucleico; e analisar os resultados da reprodução para determinar se a se- quência de nucleotídeos está presente ou ausente na amostra.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, compreendendo ainda colocar o ácido nucleico, durante ou depois da reprodução, em contato com um sonda específica para um fragmento amplificado na presença da sequência de nucleotídeos inserida.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, compreendendo ainda colocar o ácido nucleico, durante ou depois da reprodução, em contato com um sonda específica para um fragmento amplificado na ausência da sequência de nucleotídeos inserida.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, compreendendo ainda colocar o ácido nucleico, durante ou depois da reprodução, em contato com uma sonda específica para um fragmento amplificado na ausência da sequência de nucleotídeos inserida.
13. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que a amostra compreende mais do que uma iteração do sítio de inserção específico.
14. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que a amostra compreende ácido nucleico de múltiplos organismos diferentes.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a se- quência de nucleotídeos inserida está presente em menos do que 1% dos sítios de inserção específicos no ácido nucleico.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a se- quência de nucleotídeos inserida está presente em mais do que 99% dos sítios de inserção específicos no ácido nucleico.
17. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o método é usado para determinar a zigosidade usando uma amostra de tecido volu- mosa.
18. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o método é usado para determinar a contaminação de quaisquer transgenes não in- tencionados.
19. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o método é usado como um indicador da presença/ausência de eventos adventícios em uma amostra volumosa.
20. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o método é usado para determinar contaminação de quaisquer linhagens não transgê- nicas.
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