BRPI1014959B1 - preparação de enzima, seu uso, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptídeo tendo atividade de protease de serina, processo para obter uma preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de protease de serina e uso da enzima - Google Patents

Abstract

enzima protease de serina fúngica, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptídeo, polipeptídeo, processo para obter uma preparação de enzima, preparação de enzima, e, uso da enzima protease de serina. a presente invenção diz respeito a uma enzima protease de serina fúngica que compreende uma sequência de aminoácidos de enzima madura fe_rf6318 com uma sequência de aminoácidos de seq id no: 15. a protease de serina é obtida de fusarium equiseti, mais preferivelmente da cepa depositada cbs 119568. também são reveladas as sequências de ácidos nucleicos que codificam a dita protease, tal como plasmídeo palk2521, que compreendem a sequência de nucleotídeos seq id no: 9 depositada em e. coli rf7664, com o número de acesso dsm 22171, e plasmídeo palk2529 compreendendo o gene de tamanho completo seq id no: 10 depositado em e. coli rf7800 com número de acesso dsm 22172. a dita protease é usada como uma preparação de enzima aplicável em composições de detergente e para tratar fibras, para tratar lã, para tratar pêlo, para tratar couro, para tratar alimento ou ração, ou para quaisquer aplicações que envolvem modificação, degradação ou remoção de material proteináceo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a uma enzima protease de serina fúngica usada em várias aplicações, particularmente em detergentes de roupa e de lava louças. A invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica a dita enzima, um vetor recombinante, uma célula hospedeira para produzir a dita enzima, uma composição de enzima compreendendo a dita enzima, bem como um processo para preparar tal composição. Esta invenção também diz respeito a várias utilizações da dita enzima ou composições que compreendem a dita enzima.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As proteases microbianas estão entre as enzimas hidrolíticas mais importantes e encontram aplicações em vários setores industriais, tais como detergentes, alimento, couro, produtos farmacêuticos, diagnósticos, gestão de resíduos e recuperação da prata. As proteases extracelulares microbianas são responsáveis por uma parte principal, mais de um terço, das vendas totais de enzima industrial em todo o mundo (Cherry e Fidantsef, 2003). Aproximadamente 90 % das proteases comerciais são enzimas detergentes (Gupta et al., 2002). A maioria das proteases comerciais, principalmente neutra e alcalina, é produzida por organismos que pertencem ao gênero Bacillus.

As proteases de serina da família subtilisina, ou subtilisinas produzidas por espécies de Bacillus, formam o maior subgrupo de proteases industriais. Estas enzimas são comercialmente importantes como componente que degrada proteína ou aditivo de detergentes de lavagem. As preparações de detergente comercial atualmente em uso compreendem as proteases de serina alcalinas de ocorrência natural, que se originam de espécies de Bacillus ou são preparações de protease recombinante (Maurer, 2004). Os variantes das enzimas naturais com melhor eficiência catalítica e/ou melhor estabilidade na temperatura, agentes de oxidação e condições de lavagem alteradas foram desenvolvidos por meio de mutagênese sítio-direcionada e/ou alaetória. Os exemplos de proteases comerciais são tais como subtilisina Carlsberg (Alcalase®, Novozymes, DK), subtilisina 309 (Savinase®, Novozymes, DK), Subtilisina 147 (Esperase®, Novozymes, DK), Kannase® (Novozymes, DK), Purafect® (Genencor Inc., USA), Purafect® Ox, Properase® (Genencor Inc., USA) e a série BLAP S e X (Henkel, DE).

Várias proteases de serina alcalinas (EC 3.4.21) e genes que codificam estas enzimas também foram isolados de organismos eucariotos, incluindo levedura e fungos filamentosos. A patente U.S. 3.652.399 e EP 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd., JP) revela uma protease alcalina a partir do gênero Fusarium (estado assexual, teleomorfo) ou Gibberella, (estado sexual, anamorfo) particularmente a partir de Fusarium sp. S-19-5 (ATCC 20192, IFO 8884), F. oxysporum f. sp. lira (IFO 5880) ou G. saubinetti (ATCC 20193, IFO6608), usada na formulação de detergente e outras composições de limpeza. WO 88/03946 e WO 89/04361 (Novo Industri A/S, DK) revelam um aditivo de detergente enzimático e uma composição de detergente compreendendo uma protease e uma lipase, em que a protease fúngica é derivada de Fusarium, particularmente F. oxysporum ou F. solani. Um aditivo de detergente, que compreende a protease com especificidade para ligações peptídicas adjacentes apenas a um ou dois aminoácidos específicos, é revelado em WO89/06270. WO1994025583 (NovoNordisk A/S, DK) revela uma enzima protease do tipo tripsina ativa derivada de uma espécie de Fusarium, em particular uma cepa de F.  oxysporum (DSM 2672), e a sequência de DNA que codifica a mesma. A sequência de aminoácidos de uma protease inédita que deriva-se de Fusarium sp. BLB (FERM BP-10493) é revelada em WO 2006101140 (SODX Co. Ltd, Nakamura). Igualmente, as proteases alcalinas de espécies fúngicas, tais como Tritirachium e Conidiobolus, foram relatadas (revisado em Anwar e Saleemuddin, 1998).

O uso das proteases de serina fúngicas em diferentes aplicações também é conhecido a partir de vários pedidos de patente. Por exemplo, a combinação de uma celulase e uma protease, particularmente uma protease do tipo tripsina de Fusarium sp. DSM 2672, como um aditivo ou composição detergente, é revelado em WO 1992018599 (NovoNordisk A/S). Tais composições de detergente podem compreender adicionalmente inibidores reversíveis de protease para estabilizar a(s) enzima(s) da maneira revelada em WO 1992003529 e WO 1992005239 (NovoNordisk A/S). O processo para remoção ou branqueamento de manchas ou corantes de tecidos celulósicos com um híbrido de enzima que compreende uma sequência de aminoácidos cataliticamente ativa, tal como protease ligada a uma sequência de aminoácidos compreendendo um domínio de ligação de celulose, é revelado em WO 1997028243 (NovoNordisk A/S). WO 1997002753 (NovoNordisk A/S) revela um método para limpeza delicada do equipamento do processo sujo usando uma lipase e uma protease, que é preferivelmente uma protease de serina obtida de Fusarium. O uso de F. equiseti e outros fungos na redução de material orgânico em águas residuais é revelado no pedido de patente EP 1464626 (Biovitis S. A., FR).

Os desafios socio-econômicos e regulamentos governamentais têm forçado a indústria de detergente levar em consideração muitos aspectos ambientais, incluindo não apenas o uso de produtos químicos mais indulgentes, que podem ser usados em quantidades menores e, portanto, levam a menos rastos residuais no ambiente, mas também a necessidade de economizar energia. As enzimas detergentes, particularmente as proteases, são um ingrediente importante em composições de detergente. A necessidade de economizar energia diminuindo as temperaturas de lavagem e o aumento do uso de fibras sintéticas que não podem tolerar altas temperaturas e o estilo de vida atual mudou os hábitos do consumidor com relação a temperaturas de lavagem baixa e criou uma demanda para novas enzimas, que são eficientes em temperaturas baixas.

Apesar do fato de que várias publicações de patente, revisões e artigos foram publicados, nos quais as proteases de serina de vários microrganismos, por exemplo, as proteases alcalinas de temperatura baixa de microrganismos do tipo actinomicetos (Nocardiopsis dassonvillei) e fungos (Paecilomyces marquandii) são reveladas, por exemplo, em EP 0290567 e EP 0290569 (Novo Nordisk A/S, DK), existe ainda uma grande necessidade de proteases de serina alternativas, que são adequadas e eficientes para modificar, degradar e remover materiais proteináceos particularmente em faixas de temperatura baixa ou moderada e que são estáveis na presença de detergentes com propriedades altamente variadas.

A indústria de detergente tem realizado bons avanços na adaptação de seus novos produtos aos hábitos e necessidades do consumidor, às propriedades de novos produtos têxteis e novas máquinas de lavar. É evidente que durante o desenvolvimento de novos detergentes, particularmente composições de lavanderia e de lavar louça, uma ampla faixa de demandas variadas e rapidamente mutáveis foi satisfeita. A fim de satisfazer todas as demandas variadas da indústria de detergente e regulamentos governamentais, os novos ingredientes de protease de serina para as composições de detergente não podem apenas ser capazes de realizar suas tarefas em amplas faixas de pH e temperatura e permanecer estáveis em uma variedade de condições, incluindo intervenções mecânicas e químicas em combinação com uma variedade de diferentes detergentes, é desejável também que a protease de serina possa ser produzida em grandes quantidades, que podem ser processadas à jusante com grande rentabilidade, por separação fácil a partir de caldo de fermentação e micélios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O objetivo da presente invenção é fornecer uma protease de serina de origem fúngica que exibe ampla especificidade de substrato, é ativa em amplas faixas de pH e apresenta uma ampla temperatura ideal, isto é, funções tanto em temperaturas baixas quanto moderadas. As proteases de serina para detergentes de roupa e de louça, devem ser estáveis também na presença de detergentes ou ser compatíveis com os detergentes. Particularmente, o objetivo da invenção é fornecer uma protease de serina que seja capaz de remover material proteináceo, incluindo corantes na lavagem de roupas e louças, em temperaturas menores do que as preparações de enzima comercial presentes, economizando dessa maneira energia. A protease de serina fúngica pode ser produzida em hospedeiros fúngicos de alto rendimento e seu processamento à jusante, por exemplo, separação de caldo de fermentação e micélios, ser fácil de realizar.

A presente invenção diz respeito a uma enzima protease de serina fúngica, que apresenta atividade de protease de serina e compreende uma sequência de aminoácidos da enzima madura Fe_RF6318, da maneira definida em SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos da enzima madura Fe_RF6318 definida em SEQ ID NO:15.

A enzima da invenção é obtida de Fusarium equiseti, mais preferivelmente da cepa depositada CBS 119568.

A enzima apresenta uma massa molecular entre 25 e 35 kDa. A enzima apresenta temperatura ideal na faixa de 30 °C to 70 °C em pH 9. A dita enzima apresenta pH ideal na faixa de pH de pelo menos pH 6 a pH 11 a 50 °C. A temperatura e pH ideais foram determinados usando tempo de reação de 15 minutos e caseína como um substrato. A protease de serina da invenção é capaz de degradar ou remover corantes proteináceos na presença de detergente entre 10 °C e 60 °C.

A enzima protease de serina fúngica da invenção é codificada por uma sequência de polinucleotídeos isolados, que hibridiza em condições severas em uma sequência de polinucleotídeos incluída no plasmídeo pALK2521 que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:9 depositada em E. coli RF7664 com o número de acesso DSM 22171.

A dita enzima é codificada por uma sequência de polinucleotídeos isolados que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da enzima madura Fe_RF6318, da maneira definida em SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos da Fe_RF6318 madura definida em SEQ ID NO: 15. Preferivelmente, a dita enzima é codificada por uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 14.

A enzima protease de serina fúngica de tamanho total da invenção é codificada pela sequência de polinucleotídeos incluída em pALK2529 depositado em Escherichia coli RF7800 com o número de acesso DSM 22172.

A enzima protease de serina fúngica é produzida a partir de um vetor de expressão recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica uma protease de serina fúngica da invenção operavelmente ligada a sequências regulatórias capazes de direcionar a expressão do gene que codifica protease de serina em um hospedeiro adequado. Os hospedeiros adequados incluem hospedeiros heterólogos, preferivelmente hospedeiros microbianos do gênero Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortiriella.

Preferivelmente a dita enzima é produzida em Trichoderma ou Aspergillus, mais preferivelmente em T. reesei.

A presente invenção diz respeito também a uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica uma enzima protease de serina fúngica selecionada do grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e que compreende a sequência de aminoácidos da maneira representada em SEQ ID NO: 15; (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (c) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência codificante da sequência de nucleotídeos da maneira representada em SEQ ID NO: 10; (d) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência codificante da sequência de polinucleotídeos contida em DSM 22171 ou DSM 22172; (e) uma sequência que codifica a molécula de ácido nucleico que difere da sequência codificante de uma molécula de ácido nucleico de qualquer uma de (c) a (d) em virtude da degeneração do código genético; e (f) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza em condições severas em uma molécula de ácido nucleico contida em DSM 22171, e que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos, da maneira representada em SEQ ID NO: 15.

A invenção diz respeito adicionalmente a um vetor de expressão recombinante que compreende a sequência de nucleotídeos da invenção operavelmente ligada às sequências regulatórias capazes de direcionar a expressão do dito gene que codifica a protease de serina em um hospedeiro adequado. Os hospedeiros adequados incluem hospedeiros heterólogos, preferivelmente hospedeiros microbianos do gênero Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortiriella. Preferivelmente, a dita enzima é produzida em Trichoderma ou Aspergillus, mais preferivelmente em T. reesei.

A invenção diz respeito também a uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão recombinante da maneira descrita anteriormente. Preferivelmente, a célula hospedeira é um hospedeiro microbiano, tal como um fungo filamentoso. Os hospedeiros preferidos são de um dos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortiriella. Mais preferivelmente o hospedeiro é Trichoderma ou Aspergillus, mais preferivelmente um fungo filamentoso T. reesei.

A presente invenção diz respeito a um processo de produzir um polipeptídeo com atividade de protease de serina, o dito processo compreendendo as etapas de cultivar a célula hospedeira da invenção e recuperar o polipeptídeo. Está também presente na invenção um polipeptídeo com atividade de protease de serina codificado pela sequência de ácidos nucleicos da invenção, e que é obtido pelo processo descrito anteriormente.

A invenção diz respeito a um processo para obter uma preparação de enzima compreendendo as etapas de cultivar uma célula hospedeira da invenção e tanto recuperar o polipeptídeo a partir das células quanto separar as células a partir do meio de cultura e obter o sobrenadante. Existe também na invenção uma preparação de enzima obtida pelo processo descrito anteriormente.

A invenção diz respeito a uma preparação de enzima que compreende a enzima protease de serina da invenção.

A preparação de enzima da invenção pode compreender adicionalmente outras enzimas selecionadas do grupo de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, pectinase ou oxidase com ou sem um mediador, bem como aditivos adequados selecionados do grupo de estabilizadores, tampões, agentes tensoativos, agentes alvejantes, mediadores, agentes anti-corrosivos, aglutinantes, agentes anti-redepositantes, branqueadores óticos, corantes, pigmentos, produtos cáusticos, abrasivos e conservantes, etc.

O meio de cultura exaurido da produção do hospedeiro pode ser usado como tal, ou as células hospedeiras podem ser removidas, e/ou podem ser concentrados, filtrados ou fracionados. Também pode ser seco. A preparação de enzima da invenção pode estar na forma de líquido, pó ou granulado.

Existe também na invenção o uso da enzima protease de serina ou a preparação de enzima da invenção para detergentes, para tratar fibras, para tratar lã, para tratar pelo, para tratar couro, para tratar alimento ou ração, ou para quaisquer aplicações que envolvem modificação, degradação ou remoção de material proteináceo. Particularmente, a enzima ou preparação de enzima é usada como um aditivo de detergente em líquidos detergentes e pós detergentes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos do gene de Fusarium equiseti RF6318 Fe prtSSA e a sequência de aminoácidos deduzida. O suposto peptídeo sinal, analisado pelo programa SignalP V3.0 está em letras minúsculas e sublinhado. A sequência pro e os aminoácidos deduzidos da sequência pro estão em letras minúsculas. As sequências maduras de nucleotídeos e peptídeos estão em letras maiúsculas (sequência N-terminal determinada a partir da proteína Fe_RF6318 tipo selvagem purificada). O local da suposta sequência intron está em letras minúsculas em itálico e foi marcado por uma linha pontilhada abaixo da sequência de nucleotídeos. O códon de parada é mostrado por um asterisco abaixo da sequência. A sequência N-terminal e as sequências de peptídeos obtidas a partir da proteína tipo selvagem Fe_RF6318 são destacadas com fundo cinza. A figura IA mostra a sequência de nucleotídeos do gene Fe prtSA do códon inicial ATG até o códon CCT (nucleotídeos 898 a 900), a região de sequência que codifica a sequência de aminoácidos de Met 1 a Val278 da proteína Fe_RF6318. A figura IB mostra a sequência de nucleotídeos do gene Fe prtSA do códon CTC (nucleotídeos 901 to 903) até o códon de parada TAA, a região de sequência que codifica a sequência de aminoácidos de Leu279 a Ala412 da proteína Fe_RF6318. A figura 2 mostra esquematicamente o cassete usado para expressar o gene Fe prtSSA em Trichoderma reesei. A figura 3 mostra a proteína recombinante parcialmente purificada Fe_RF6318 analisada em gel SDS PAGE a 12 %. Canaleta 1. Amostra da Fe_RF6318 parcialmente purificada, Canaleta 2. Marcador MW (Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen). A figura 4A descreve o perfil de temperatura de proteína recombinante Fe_RF6318 ensaiado em pH 9 usando o tempo de reação de 15 minutos e a caseína como um substrato. As médias dos pontos de dados são calculados a partir de três medições separadas. A figura 4B descreve o efeito do pH na atividade da proteína Fe_RF6318 recombinante. O tampão usado foi o tampão Britton-Robinson 40 mM, a caseína foi usada como um substrato, o tempo de reação foi de 15 minutos e a temperatura de reação foi 50 °C. As médias dos pontos de dados são calculadas a partir de três medições separadas. Figura 5 descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 116, EMPA) a 30 °C, pH 9, 60 minutos. As preparações comerciais Savinase Ultra® 16L (Novozymes A/S, DK) e Purafect® 4000L (Genencor Inc., USA) foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima -valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 6 descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art. 116, EMPA) a 50 °C, pH 9, 60 minutos. As preparações comerciais Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 7A descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) a 40 °C, aproximadamente em pH 10, 60 minutos na presença de pó detergente (Art. 601, EMPA). A preparação comercial Purafect® 4000L foi usada para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 7B descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) a 40 °C, aproximadamente em pH 10, 60 minutos na presença de pó detergente e agentes alvejantes (Art. 604 e 606, EMPA). A preparação comercial Purafect® 4000L foi usada para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 8A descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) a 50 °C, aproximadamente em pH 10, 60 minutos na presença de pó detergente (Art. 601, EMPA). A preparação comercial Purafect® 4000L foi usada para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima -valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas  com tampão (branco). A figura 8B descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) a 50 °C, aproximadamente em pH 10, 60 minutos na presença de pó detergente e agentes alvejantes (Art. 604 e 606, EMPA). A preparação comercial Purafect® 4000L foi usada para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 9 mostra o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) e detergente líquido Ariel Sensitive a 40 °C, aproximadamente em pH 7,9, 60 minutos. As preparações comerciais Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L foram usadas para comparação. É mostrada no eixo x a dosagem de enzima (unidades de atividade/mL), no eixo y AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 10 mostra o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) com diferentes concentrações de detergente base líquido para tecidos coloridos a 30 °C. As preparações comerciais Purafect® 4000L e Savinase® Ultra 16L foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 10A mostra o desempenho da concentração de detergente de 5 g/L e pH 7,5. A figura 10B mostra o desempenho da concentração de detergente de 5 g/L (dosagem de enzima calculada como proteína). A figura 10C mostra o desempenho da concentração de detergente de 3,3 g/L e pH 7,4. A figura 10D mostra o desempenho da concentração de detergente de 1 g/L e pH 7,3. A figura 11 mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante com mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) com diferentes concentrações de Ariel Sensitive (sem enzimas) em tecidos a 30 °C. As preparações comerciais Purafect® 4000L e Savinase® Ultra 16L foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 11A mostra o desempenho da concentração de detergente de 5 g/L e pH 8. A figura 11B mostra o desempenho da concentração de detergente de 5 g/L (dosagem de enzima calculada como proteína). Figura HC mostra o desempenho da concentração de detergente de 3,3 g/L e pH 7,9. A figura 11D mostra o desempenho da concentração de detergente de 1 g/L e pH 7,6. A figura 12 mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante em diferentes manchas em testes Launder-O-Meter com detergente líquido Ariel Sensitive (sem enzimas) a 30 °C. A preparação comercial Savinase Ultra 16L foi usada para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 12A mostra o desempenho em sangue/leite/tinta/PE- algodão (Art. 117, EMPA). A figura 12B mostra o desempenho em sangue/leite/tinta/algodão (Art. 116, EMPA) A figura 12C mostra o desempenho em grama (Art. 164, EMPA). A figura 13 mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante em diferentes manchas em testes Launder-O-Meter com detergente base líquido para tecidos coloridos a 30 °C. As preparações comerciais Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000 L foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 13 A mostra o desempenho em sangue/leite/tinta/PE- algodão (Art. 117, EMPA). A figura 13B mostra o desempenho em sangue/leite/tinta/algodão (Art. 116, EMPA). A figura 13C mostra o desempenho em grama (Art. 164, EMPA). A figura 13D mostra o desempenho em cacau (Art. 112, EMPA). A figura 14 descreve a eficiência da remoção total da mancha (delta % SR) com a preparação de enzima Fe_RF6318 em oito diferentes manchas sensíveis à protease (Tabela 5) em experimentos de lavagem de grande escala. As preparações comerciais Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L foram usadas para comparação. A figura 14A descreve a eficiência da remoção total da mancha quando as preparações de protease foram dosadas de acordo com a atividade. A figura 14B descreve a eficiência da remoção total da mancha quando as preparações de protease foram dosadas de acordo com a quantidade de proteína. A figura 15 descreve o efeito da remoção da mancha com detergente líquido base para tecidos coloridos em experimento em grande escala a 30 °C. A figura 15A descreve a remoção da mancha em  sangue/leite/tinta/algodão (C-05-014/CFT). A figura 15B descreve a remoção da mancha em sangue/leite/tinta/PE-algodão (C-05-014/CFT). A figura 15C descreve a remoção da mancha em chocolate leite/pigmento/algodão (C-03-030/CFT). A figura 15D descreve a remoção da mancha em óleo de amendoim/leite/algodão (C-05-014/CFT). A figura 15E descreve a remoção da mancha em gema de ovo/pigmento/algodão (CS-38-010/CFT). A figura 16 descreve o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) em temperaturas de 10 °C a 60 °C, pH 9, 60 minutos. As preparações comerciais Savinase Ultra® 16L (Novozymes A/S, DK), Purafect® 4000L (Genencor Inc., USA) e Properase® 4000E (Genencor Inc., USA) foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 16A mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante e as preparações comerciais de protease a 10 °C. A figura 16B mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante e as preparações comerciais de protease a 20 °C. A figura 16C mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante e as preparações comerciais de protease a 30 °C. A figura 16D mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante e as preparações comerciais de protease a 40 °C. A figura 16E mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante e as preparações comerciais de protease a 50 °C. Figura 16F mostra o desempenho da proteína Fe_RF6318 recombinante e as preparações comerciais de protease a 60 °C. A figura 17 mostra o desempenho da proteína de Fe_RF6318 recombinante com relação à mancha de sangue/leite/tinta (Art 117, EMPA) e concentração base líquida de 3,3 g/L a 10 °C e 20 °C. As preparações comerciais Savinase® Ultra 16L, Purafect® 4000L e Properase® 4000 E foram usadas para comparação. AL* (deltaL*) = valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima - valor de luminosidade L* do tecido tratado apenas com tampão (branco). A figura 17A mostra o desempenho a 10 °C. A figura 17B mostra o desempenho a 20 °C.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

SEQ ID NO:1 Sequência de um peptídeo aminoterminal #3792 da protease de Fusarium equiseti RF6318. SEQ ID NO:2 Sequência de um peptídeo tríptico 1246.673 da protease de Fusarium equiseti RF6318. SEQ ID NO:3 Sequência de um peptídeo tríptico 3341.633 da protease de Fusarium equiseti RF6318. SEQ ID NO:4 Sequência de um peptídeo tríptico 1503.799 da protease de Fusarium equiseti RF6318. SEQ ID NO:5 A sequência do oligonucleotídeo iniciador PRO87 derivado do peptídeo aminoterminal SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO:6 A sequência do oligonucleotídeo iniciador PRO88 derivado do peptídeo aminoterminal SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO:7 A sequência do oligonucleotídeo iniciador PRO89 derivado do peptídeo SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:8 A sequência do oligonucleotídeo iniciador PRO90 derivado do peptídeo SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:9 A sequência do fragmento de PCR obtido usando os oligonucleotídeos iniciadores PRO88 (SEQ ID NO:6) e PRO89 (SEQ ID NO:7) e DNA genômico de Fusarium equiseti RF6318 como um  molde. SEQ ID NO: 10 A sequência de nucleotídeos do gene da protease de tamanho total de Fusarium equiseti RF6318 (FeprtS8A). SEQ ID NO: 11 A sequência de aminoácidos deduzida da protease de tamanho total de Fusarium equiseti RF6318 (Fe_RF6318), incluindo aminoácidos de Metl a Ala412. SEQ ID NO: 12 A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da forma de pró-enzima da protease de Fusarium equiseti RF6318. SEQ ID NO: 13 A sequência de aminoácidos da forma de pró- enzima da protease de Fusarium equiseti RF6318, incluindo aminoácidos Ala21 a Ala 412 da protease de tamanho total. SEQ ID NO: 14 A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da forma madura de protease de Fusarium equiseti RF6318. SEQ ID NO: 15 A sequência de aminoácidos da forma madura da protease de Fusarium equiseti RF6318, incluindo aminoácidos Alal24 a Ala412 da enzima de tamanho total.

DEPÓSITOS

A Fusarium equiseti RF6318 foi depositada no Centraalbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, Holanda em 7 de abril de 2006, e atribuída ao número de acesso CBS 119568.

A cepa de E. coli RF7664, incluindo o plasmídeo pALK2521, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 14 janeiro de 2009, e atribuída ao número de acesso DSM 22171.

A cepa de E. coli RF7800, incluindo o plasmídeo pALK2529, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen  GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 14 de janeiro de 2009, e atribuída ao número de acesso DSM 22172.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção fornece uma protease de serina de origem fúngica, cuja protease mostra ampla especificidade de substrato, é estável em grandes faixas de pH e apresenta uma ampla faixa de temperatura ideal, isto é, bom desempenho tanto em temperaturas baixas quanto moderadas. A enzima é ideal para aplicações de detergente, oxidação resistente e agentes de quelação e é eficiente em baixos níveis de enzima em soluções de detergente. Particularmente, a protease de serina é ativa em temperaturas tão baixas quanto 10 °C, a faixa preferida sendo de 10 °C a 60 °C. Assim, a presente invenção fornece uma protease de serina alternativa para uso em detergente e outras aplicações. A protease de serina fúngica pode ser produzida em hospedeiros fúngicos de alto rendimento e seu processamento à jusante, por exemplo, separação de caldo de fermentação e micélios, é fácil de realizar.

"Serina protease" ou "serina endopeptidase" ou "serina endoproteinase" significam em conexão com esta uma enzima classificada como EC 3.4.21 pela Nomenclature of International Union of Biochemistry and Molecular Biology. As proteases de serina são encontradas tanto em organismos de célula única quanto em organismos complexos. Com base em suas similaridades estruturais, as proteases de serina foram agrupadas em pelo menos seis classes (SA, SB, SC, SE, SF e SG; S denotando protease de serina), que foram adicionalmente subagrupadas em famílias com sequências similares de aminoácidos e estruturas tridimensionais (ver, por exemplo, a página de protease de serina em http://www.biochcm.wustl.edu/~protease/, Departamento de Bioquímica e biofísica Molecular, Universidade de Medicina de Washington, St. Louis, MO, USA). Estas enzimas que hidrolisam ou degradam proteína são caracterizadas pela presença de um grupo serina nucleofílico em seus sítio ativo, e as proteases da classe SA e classe SB são também distinguidas apresentando resíduos essenciais de aspartato e histidina e, junto com a serina, formam uma tríade catalítica.

As principais classes incluem o "tipo quimiotripsina", incluindo quimiotripsina, tripsina e elastase (classe SA) e proteases de serina do "tipo subtilisinas" (classe SB). As enzimas alvejam diferentes regiões da cadeia de polipeptídeo, com base nas cadeias laterais dos resíduos de aminoácido que circundam o sítio de clivagem. A protease de serina da presente invenção pertence à classe SB.

As "proteases de serina do tipo subtilisina" caracterizadas, ou "subtilases", são em geral de origem bacteriana. Esta classe de proteases, representada por vários Bacillus, como B. amyloliquifaciens, B. licheniformis e B. subtilis (Rao et at., 1998), é específica para resíduos aromáticos ou hidrofóbicos, tais como tirosina, fenilalanina e leucina.

O termo "atividade de protease de serina" usado na invenção significa atividade hidrolítica em substratos que contêm proteína, por exemplo, caseína, hemoglobina, queratina e BSA. Os métodos para analisar a atividade proteolítica são bem conhecidos na literatura e são referidos, por exemplo, em Gupta et al. (2002).

As proteases podem ser classificadas usando inibidores específicos de grupo. O grupo diverso de "inibidores de protease de serina" inclui inibidores químicos sintéticos e inibidores proteináceos naturais. Um grupo de inibidores naturais são serpinas (abreviado a partir de inibidores de protease de serina), tais como anti-trombina e alfa-1 anti-tripsina. Os inibidores sintéticos artificiais incluem 3,4-dicloroisocoumarina (3,4-DCI), diisopropilfluorfosfato (DFP), fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e tosil- L-lisina clorometil cetona (TLCK). Algumas das proteases de serina são inibidas por reagentes tiol, tal como p-cloromercuribenzoato (PCMB), em virtude da presença de um resíduo de cisteína próximo ao sítio ativo. Assim, a atividade de protease de serina pode ser determinadas em um ensaio a base da clivagem de um substrato específico ou em um ensaio usando qualquer substrato contendo proteína com ou sem um inibidor específico de proteases de serina em condições adequadas.

As proteases de serina são em geral ativas em pH neutro ou alcalino, com um pH ideal entre 7 e 11, e apresentam ampla especificidade de substrato. As "proteases de serina alcalinas" significam enzimas que são ativas e estáveis em pH 9 a pH 11, ou mesmo em pH 10 a 12,5 (Shimogaki et al., 1991) e apresentam ponto isoelétrico em torno de pH 9. Estas representam o maior subgrupo de proteases de serina comerciais. As massas moleculares de proteases de serina alcalinas variam entre 15 e 35 kDa. A temperatura ideal das proteases de serina naturais estão em torno de 60 °C (Rao et al, 1998).

As cepas de microrganismo capazes de produzir a atividade de protease podem ser selecionadas e a atividade em diferentes substratos pode ser determinada. As cepas escolhidas podem ser cultivadas em um meio adequado. Após uma quantidade suficiente de uma protease de serina interessante ser produzida, a enzima pode ser isolada ou purificada e suas propriedades podem ser mais caracterizadas de maneira completa. Alternativamente, os genes que codificam as proteases de serina em vários organismos pode ser isolados e a sequência de aminoácidos codificada pelos genes pode ser comparada com as sequências de aminoácidos da protease de serina isolada e caracterizada aqui nos exemplos.

As enzimas protease produzidas, particularmente as proteases de serina, podem ser purificadas usando métodos convencionais de química enzimática, tais como preparação de sal, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica, cromatografia por afinidade, filtração de gel e cromatografia de interação hidrofóbica. A purificação pode ser monitorada por determinação protéica, ensaios de atividade de enzima e por eletroforese em gel de SDS poliacrilamida. A atividade e estabilidade da enzima purificada em vários valores de temperatura e pH, bem como a massa molecular e o ponto  isoelétrico, podem ser determinadas.

A purificação de uma protease de serina preferida da presente invenção foi demonstrada no exemplo 1b. O sobrenadante filtrado da cultura foi aplicado em uma coluna Q Sepharose FF. O fluxo por meio de fração foi aplicado em coluna de fenil Sepharose HP e as proteínas foram eluídas com um gradiente de sal linear decrescente. As frações que exibem atividade de protease foram agrupadas, concentradas e aplicadas em uma coluna Superdex 75 10/300 GL. A purificação foi seguida por ensaios de atividade em caseína marcada com resorufina, da maneira descrita no exemplo 1b. Naturalmente, é possível separar a enzima da presente invenção usando outros métodos de purificação conhecidos em vez de, ou em além de, os métodos aqui descritos. A protease de serina recombinante foi purificada da maneira descrita no exemplo 5 e usada para caracterização de perfis de pH e temperatura.

A massa molecular da protease de serina purificada pode ser determinadas por espectrometria de massa ou em SDS-PAGE, de acordo com Laemmli (1970). A massa molecular também pode ser prevista a partir da sequência de aminoácidos da enzima. A protease de serina madura ou enzima protease de serina madura apresenta tipicamente uma massa molecular entre 20 a 35 kDa, tipicamente em torno de 25 a 30 kDa (Rao et al, 1998).

As proteases de serina são sintetizadas como "precursores zimogênicos"ou "zimogênios"inativos na forma de uma preproenzima, que são ativadas por remoção da sequência sinal (secreção de peptídeo sinal ou pré-peptídeo) e da pró-sequência (pró-peptídeo) para render uma forma madura ativa da enzima (Chen e Inouye, 2008). Este processo de ativação envolve a ação de proteases e pode resultar a partir de processamentos auto- digestivos ou auto-catalíticos limitados da protease de serina. A pró-sequência pode ser clivada, por exemplo, durante as fases pós-translacionais da produção ou no meio de cultura exaurido ou durante o armazenamento do meio de cultura ou preparação de enzima. A ativação da pró-enzima também pode ser atingida adicionando uma enzima proteolítica capaz de converter a pró-enzima inativa na enzima madura ativa no meio de cultura, onde o organismo hospedeiro é cultivado, ou adicionando a enzima proteolítica ao sobrenadante de cultura após o processo de cultivo. O encurtamento da enzima também pode ser atingido, por exemplo, truncando o gene que codifica o polipeptídeo antes de transformá-lo no hospedeiro de produção.

O termo "madura" significa a forma de enzima que, após a remoção da sequência e pró-peptídeo sinal, compreende os aminoácidos essenciais para atividade enzimática ou catalítica. Em fungos filamentosos, é a forma nativa secretada no meio de cultura.

A temperatura ideal da protease de serina pode ser determinada em um tampão adequado, em diferentes temperaturas, usando caseína como um substrato, da maneira descrita nos exemplos 1c, 5 ou 14, ou usando outros substratos e sistemas de tampão descritos na literatura (por exemplo, Gupta et al, 2002). A determinação do pH ideal pode ser realizada em um tampão adequado em diferentes valores de pH após a atividade em um substrato protéico.

A atividade de protease baseia-se em geral na degradação de substratos adequados. Em aplicações de detergente, as proteases têm que funcionar em substâncias que são pelo menos parcialmente insolúveis. Assim, um importante parâmetro para uma protease detergente é a capacidade de adsorver e hidrolisar estes fragmentos insolúveis.

Um outro parâmetro importante para a seleção de proteases detergentes é seu ponto isoelétrico ou valor pI. As proteases detergentes atuam melhor quando o valor de pH da solução de detergente na qual elas funcionam é aproximadamente o mesmo do valor pI para a enzima. O pI pode ser determinado por foco isoelétrico em um gel de gradiente de pH imobilizado composto de poliacrilamida, amido ou agarose, ou estimando o pI a partir da sequência de aminoácidos, por exemplo, usando a ferramenta pI/MW no servidor ExPASy (http://expasy.Org/tools/piJ:ool.html; Gasteiger et al., 2003).

A terminação N da protease purificada, bem como os peptídeos internos, pode ser sequenciada de acordo com a química de degradação de Edman (Edman e Begg, 1967), da maneira descrita no exemplo 2 ou por outros métodos descritos na literatura.

A enzima protease de serina da invenção pode derivar de qualquer organismo, incluindo bactérias, arqueas, fungos, leveduras e ainda eucarioto superior, tais como plantas. Preferivelmente, a dita enzima origina- se de um fungo, incluindo fungos filamentosos e leveduras, por exemplo, de um gênero selecionado do grupo que compreende Fusarium. As proteases alcalinas fúngicas são vantajosas para as proteases bacterianas em virtude da facilidade do processamento à jusante para produzir uma enzima ou composição de enzima livres de micróbios. O micélio pode ser facilmente removido por meio de técnicas de filtração antes da purificação da enzima.

A presente invenção diz respeito à protease de serina fúngica que apresenta um bom desempenho na presença de detergentes com propriedades altamente variantes em ampla, isto é, de baixa a moderada, faixa de temperatura, tal como 10 °C a 60 °C.

Na presente invenção, bom desempenho na presença de detergente significa que a enzima, neste caso a protease de serina fúngica da invenção, funciona em faixas de temperatura menores que muitas subtilisinas comerciais atualmente para venda. Em outras palavras, bom desempenho significa que a enzima é capaz de degradar ou remover corantes proteináceos ou material em faixas de temperatura baixa a moderada, mas especialmente em faixas de temperatura menores que os produtos comerciais atuais, por exemplo, o produto de enzima comercial Purafect® 4000L (Genencor Inc., USA).

A protease de serina fúngica da invenção funciona em faixas de temperatura baixa. Por exemplo, modificando o pH, selecionando os detergentes com propriedades adequadas, incluindo os agentes protetores de enzima e controlando as condições de lavagem, a atividade da protease de serina da invenção pode ser mantida em temperaturas tão baixas quanto 10 °C. Portanto, a protease de serina da invenção, dependendo das condições de lavagem e ingredientes e aditivos auxiliares em detergentes, é usada particularmente em temperaturas em torno ou abaixo de 50 °C. A enzima funciona também em temperaturas em torno ou abaixo de 45°C, em torno ou abaixo de 40 °C, em torno ou abaixo de 35°C, ou em torno ou abaixo de 30 °C.

Na presença de um detergente, a protease de serina fúngica da invenção funciona da maneira definida anteriormente entre 10 °C e 60 °C. Nos exemplos 6 a 13, experimentos comparativos são descritos, e a partir das figuras 7 a 17 é evidente que o desempenho da protease de serina fúngica Fe_RF6318 em condições variadas e exposta a tratamentos variados, em muitas manchas diferentes em diferentes materiais têxteis, medido como deltaL* ou delta % SR, é de longe melhor que o desempenho dos produtos comerciais, Savinase® Ultra 16L (Novozymes A/S, DK), Purafect® 4000L (Genencor Inc, USA) e Properase® 4000E (Genencor Inc., USA). Particularmente, o efeito da remoção da mancha pela dita protease de serina fúngica Fe_RF6318 em faixas de temperatura baixa a moderada, tal como de 10 °C a 60 °C, é notavelmente maior do que com Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L. Também apresenta maior capacidade de remoção de mancha em uma faixa de 30 °C a 60 °C, quando comparada à Properase® 4000E.

A partir dos ditos resultados experimentais, pode-se concluir que a protease de serina fúngica da invenção é capaz de satisfazer as muitas demandas variadas dos consumidores de detergente e da indústria de detergente, e a indústria que fornece máquina de lavar é bem adequada às exigências dos regulamentos futuros e hábitos do consumidor.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a enzima protease de serina fúngica é um polipeptídeo com atividade de protease de serina e que compreende a enzima madura de Fe_RF6318 com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15, ou pelo menos 86 % com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:11. As enzimas preferidas mostram pelo menos 86 %, preferivelmente pelo menos 87 %, mais preferivelmente pelo menos 88 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade. Ainda mais preferivelmente, as sequências de aminoácidos mostram pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou 96 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. As identidades das duas enzimas são comparadas com a região correspondente de sequências, por exemplo, na região madura ou de tamanho total da protease de serina.

A protease de serina da presente invenção é assinalada como Fe_RF6318, uma protease de serina isolada que origina-se de Fusarium equiseti e é um elemento de classe SB, família 8 das serinas endoproteinases.

O termo "identidade" significa aqui a identidade entre duas sequências de aminoácidos comparadas uma a outra na região correspondente de sequência com aproximadamente a mesma quantidade de aminoácidos. Por exemplo, a identidade de uma sequência de tamanho total ou madura das duas sequências de aminoácidos pode ser comparada. As sequências de aminoácidos das duas moléculas a serem comparadas podem diferir em uma ou mais posições, as quais entretanto não alteram a função biológica ou estrutura das moléculas. Tal variação pode ocorrer naturalmente em decorrência dos diferentes organismos hospedeiros ou mutações na sequência de aminoácidos, ou pode ser atingida por mutagênese específica. A variação pode resultar de deleção, substituição, inserção, adição ou combinação de uma ou mais posições na sequência de aminoácidos. A identidade das sequências é medida usando o alinhamento ClustalW (por exemplo, em www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw). A matriz usada é da maneira a seguir: BLOSUM, abertura de intervalo: 10, extensão de intervalo: 0,5.

Preferivelmente, a protease de serina fúngica é obtida de Fusarium, mais preferivelmente de Fusarium equiseti. De acordo com a modalidade mais preferida, a protease de serina da invenção é obtida da cepa depositada em Centraalbureau voor Schimmelcultures, com o número de acesso CBS 119568.

Uma modalidade preferida da invenção é uma enzima protease de serina fúngica com atividade de protease de serina e uma sequência de aminoácidos da enzima madura Fe_RF6318, da maneira definida em SEQ ID NO: 15. A enzima madura precisa da sequência sinal ou pré-peptídeo e da pró-sequência ou pró-peptídeo. A protease de serina madura da invenção inclui aminoácidos Ala 124 a Ala412 da protease de tamanho total caracterizados em SEQ ID NO:11. Assim, no escopo da invenção, está também a enzima de tamanho total Fe_RF6318 apresentando SEQ ID NO:11, incluindo a sequência sinal (pré-peptídeo) e pró-peptídeo e a enzima madura, bem como a forma de pró-enzima que precisa da sequência sinal (pré- peptídeo), apresentando assim SEQ ID NO: 13.

A presente invenção diz respeito a uma enzima protease de serina fúngica, a forma madura que apresenta uma massa molecular ou peso molecular entre 20 e 35 kDa, preferivelmente entre 25 e 33 kDa, mais preferivelmente entre 28 e 30 kDa. O MW mais preferido é a massa molecular prevista de Fe_RF6318 que é 29 kDa para o polipeptídeo maduro obtido usando a ferramenta Compute pI/MW no servidor ExPASy (Gasteiger et al, 2003).

A enzima da invenção é eficiente em degradar material proteináceo em uma ampla faixa de temperatura. A temperatura ideal da enzima é de 30 °C a 70 °C (cerca de 20 % da atividade máxima), preferivelmente de 40 °C a 60 °C (pelo menos cerca de 40 % da atividade máxima), e mais preferivelmente entre 50 °C e 60 °C (pelo menos 70 % da atividade máxima), mais preferivelmente a 60 °C (a atividade máxima, Fe_RF6318), quando medida em pH 9 usando tempo de reação de 15 minutos e caseína como um substrato, da maneira descrita no exemplo 5.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a enzima protease de serina fúngica apresenta pH ideal em uma faixa de pH de pelo menos pH 6 a pH 11, que exibe mais de 40 % da atividade máxima em pH 10 a 50 °C usando tempo de reação de 15 minutos e caseína como um substrato, da maneira descrita no exemplo 5. Em particular, o pH ideal está entre pH 6 e pH 10 (cerca de 60 % da atividade máxima), e mais preferivelmente entre pH 9 e pH 10 (cerca de 80 % da atividade máxima), e mais preferivelmente em pH 10 a 50 °C.

A protease de serina fúngica da invenção apresenta "bom desempenho na presença de detergente", isto é, é capaz de degradar ou remover corantes proteináceos ou material na presença de detergente em faixas de temperatura baixa, especificamente em faixas de temperatura menores que os produtos comerciais atuais, por exemplo, o produto de enzima comercial Purafect® 4000L (Genencor Inc., USA). Na presença de um detergente, a enzima da invenção funciona entre 10 °C e 60 °C, preferivelmente em torno ou abaixo de 50 °C. A enzima Fe_RF6318 funciona também em temperaturas em torno ou abaixo de 45°C, em torno ou abaixo de 40 °C, em torno ou abaixo de 35°C, ou em torno ou abaixo de 30 °C.

A enzima protease de serina da invenção apresenta pI que, da maneira prevista a partir da sequência de aminoácidos deduzida, está entre pI 9 e pI 9,5, preferivelmente entre pI 9,1 e pI 9,4. O pI previsto da enzima Fe_RF6318 da invenção é pI 9,3.

Os oligonucleotídeos sintetizados na sequência de aminoácidos de peptídeos N-terminais ou trípticos da enzima purificada, ou um produto de PCR obtido usando os oligonucleotídeos anteriores, podem ser usados como sondas no isolamento de DNAc ou um gene genômico que codifica a protease de serina da invenção. A sonda pode ser determinada também com base no nucleotídeo conhecido ou sequências de aminoácidos de proteases de serina homólogas. Os clones de protease de serina também podem ser selecionados com base na atividade em placas que contêm um substrato específico para a enzima ou usando anticorpos específicos para uma protease de serina.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a enzima protease de serina fúngica é codificada por uma sequência de polinucleotídeos isolados que hibridiza em condições severas em um polinucleotídeo ou sequência de sonda incluída no plasmídeo pALK2521, que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:9 em E. coli RF7664, depositado no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) com o número de acesso DSM 22171.

Na presente invenção, o gene o Fe prtSA foi isolado com uma sonda preparada por PCR usando hibridização severa, da maneira descrita no exemplo 3d. Os métodos padrões de biologia molecular podem ser usados no isolamento de DNAc ou um DNA genômico do organismo hospedeiro, por exemplo, os métodos descritos no manual de biologia molecular, tal como Sambrook e Russell, 2001.

A hibridização com uma sonda de DNA tal como, por exemplo, SEQ ID NO: 9 que consiste em mais de 100-200 nucleotídeos, é em geral realizada em composições de "alta severidade", isto é, hibridização em uma temperatura que é 20-25 °C abaixo da temperatura de fusão calculada (Tm) de um híbrido perfeito, a Tm foi calculada de acordo com Bolton e McCarthy (1962). Em geral, a pré-hibridização e hibridização são realizadas pelo menos a 65 °C em SSC 6x (ou 6xSSPE), reagente de Denhardt 5x, SDS 0,5 % (p/v), 100 iig/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e fragmentado. A adição de formamida a 50 % diminui as temperaturas de pré- hibridização e hibridização para 42°C. As lavagens são realizadas em baixa concentração de sal, por exemplo, em SDS SSC 2x-0,5 % (p/v) por 15 minutos em temperatura ambiente (RT), seguido por SSC 2x-SDS 0,1 % (p/v) at RT, e finalmente em SSC 0,lx-SDS 0,1 % (p/v) pelo menos a 65 °C.

De acordo com uma modalidade preferida, a enzima protease de serina fúngica da invenção é codificada por uma molécula isolada de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos caracterizada em SEQ ID NO: 15, ou um polipeptídeo com pelo menos 86 % da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 ou pelo menos 86 % da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11. As enzimas preferidas mostram pelo menos 86 %, preferivelmente pelo menos 87 %, mais preferivelmente pelo menos 88 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade. Ainda mais preferivelmente as sequências de aminoácidos mostram pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou 96 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. As identidades das duas enzimas são comparadas com a região correspondente de sequências, por exemplo, na região madura ou de tamanho total da protease de serina.

Assim, no escopo da invenção, está uma sequência de polipeptídeo que é codificada por uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da protease de serina de tamanho total da invenção, incluindo o pré-peptídeo (sequência sinal) e o pró-peptídeo, além da forma madura da enzima e cuja sequência de aminoácidos é caracterizada em SEQ ID NO: 11. Igualmente, no escopo da invenção, está uma sequência de polipeptídeo que é codificada por uma molécula de ácido nucleico que codifica o pró-peptídeo da enzima protease de serina da invenção, incluindo o pró-peptídeo além da forma madura da enzima, e cuja sequência de  aminoácidos é caracterizada em SEQ ID NO: 13.

Uma modalidade preferida da invenção é a enzima protease de serina fúngica codificada por uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica a forma madura da protease de serina de Fe_RF6318 que apresenta SEQ ID NO: 15.

De acordo com uma modalidade preferida, a enzima protease de serina fúngica da invenção é codificada por uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 14 que codifica a forma madura da enzima Fe_RF6318 (SEQ ID NO:15).

Assim, no escopo da invenção, está o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico com a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 10 compreendendo a "sequência codificante" para a enzima. A expressão "sequência codificante" significa a sequência de nucleotídeos que inicia a partir do códon inicial de tradução (ATG) e para no códon de parada de tradução (TAA, TAG ou TGA). O polipeptídeo de tamanho total traduzido inicia-se em geral com metionina e compreende regiões de intron. Igualmente, no escopo da invenção, está uma enzima protease de serina fúngica codificada por uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 12, que codifica a forma de pró-enzima Fe_RF6318.

De acordo com uma outra modalidade preferida da invenção, a protease de serina fúngica é codificada pela sequência de polinucleotídeos incluída em pALK2529 depositado em E. coli RF7800 com o número de acesso DSM 22172.

Uma modalidade da invenção é a enzima protease de serina produzida a partir de um vetor de expressão recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a enzima protease de serina fúngica, da maneira caracterizada anteriormente, operavelmente ligada às sequências regulatórias capazes de direcionar a expressão do dito gene que codifica a protease de serina em um hospedeiro adequado. A construção do dito vetor de expressão recombinante e o uso do dito vetor são descritos com mais detalhes no exemplo 4.

Os hospedeiros adequados para a produção da enzima protease de serina fúngica são hospedeiros homólogos ou heterólogos, tais como os hospedeiros microbianos incluindo bactérias, leveduras e fungos. Os fungos filamentosos, tais como Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortiriella, são hospedeiros de produção preferidos em virtude da facilidade do processamento à jusante e da recuperação do produto enzimático. Os hospedeiros adequados incluem espécie tais como tipos de cepas de T. reesei, A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori ou A. japonicus, F. venenatum ou F. oxysporum, H. insolens ou H. lanuginosa, N. crassa e C. lucknowense, algumas das quais são listadas como organismos hospedeiros de produção de enzima em, por exemplo, a lista AMFEP 2007 de enzimas comerciais (http://www.amfep.org/list.html). Mais preferivelmente, a enzima é produzida em um hospedeiro fungo filamentoso do gênero Trichoderma ou Aspergillus, tal como T. reesei ou A. niger, A. oryzae ou A. awamori. De acordo com a modalidade mais preferida da invenção, a enzima protease de serina fúngica é produzida em T. reesei.

A presente invenção diz respeito também a uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a enzima protease de serina fúngica selecionada do grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e que compreende a sequência de aminoácidos da maneira representada em SEQ ID NO: 15; (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e pelo menos 86 % de SEQ ID NO: 15;  (c) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência codificante da sequência de nucleotídeos da maneira representada em SEQ ID NO: 10; (d) uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência codificante da sequência de polinucleotídeos contida em DSM 22171 ou DSM 22172; (e) uma sequência que codifica a molécula de ácido nucleico que difere da sequência codificante de uma molécula de ácido nucleico de qualquer uma de (c) a (d), em virtude da degeneração do código genético; e (f) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza em condições severas em uma molécula de ácido nucleico contida em DSM 22171, e que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos da maneira representada em SEQ ID NO: 15.

A molécula de ácido nucleico da invenção pode ser RNA ou DNA, em que o DNA pode ser constituído do DNA genômico ou DNAc.

Os métodos padrões de biologia molecular podem ser usados no isolamento e tratamentos enzimáticos da sequência de polinucleotídeos que codifica a protease de serina fúngica da invenção, incluindo isolamento de DNA genômico e plasmidial, digestão de DNA para produzir fragmentos de DNA, sequenciamento, transformações me E. coli, etc. Os métodos básicos são descritos nos manuais padrões de biologia molecular, por exemplo, Sambrook e Russell, 2001.

O isolamento do gene Fe prtSSA que codifica o polipeptídeo Fe_RF6318 é descrito no exemplo 3. Resumidamente, o fragmento de PCR de 866 bp obtido usando as sequências dos oligonucleotídeos iniciadores degenerados (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7) foi usado para isolar o Fe prtSA de Fusarium equiseti RF6318 em pBluescript II KS+ vetor. O gene Fe prtSSA de tamanho total de Fusarium equiseti foi incluído no plasmídeo  pALK2529, depositado em E. coli na coleção de cultura DSMZ com o número de acesso DSM 22172. A sequência de aminoácidos deduzida da protease de serina foi analisada a partir da sequência de DNA.

A sequência de nucleotídeos de protease de serina Fe prtSSA de Fusarium equiseti (SEQ ID NO: 10) e a sequência deduzida (SEQ ID NO:11) são apresentadas na figura IA-B. O tamanho do gene é 1303 bp (incluindo o códon de parada). Um intron suposto foi encontrado com o tamanho de 64 bps. A sequência protéica deduzida consiste em 412 aminoácidos, incluindo uma sequência sinal prevista de 20 aminoácidos (SignalP V3.0; Nielsen et al, 1997 e Nielsen e Krogh, 1998) e um pró- peptídeo de Ala21 a Argl23. Os peptídeos purificados a partir de Fe_RF6318 tipo selvagem combinaram a sequência de aminoácidos deduzida, indicando que o gene clonado codifica a protease purificada a partir do hospedeiro Fusarium equiseti RF6318 depositado na coleção de cultura CBS com o número de acesso CBS 119568. A massa molecular prevista foi 29 kDa para o polipeptídeo maduro e o pI previsto foi 9,30. Estas previsões foram realizadas usando a ferramenta Compute pI/MW no servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). A sequência de aminoácidos deduzida continha dois possíveis sítios de N-glicosilação (Asn77 e Asn255), mas de acordo com o servidor CBS NetNGlyc V 1.0 apenas um sítio, Asn77 (localizado na sequência pro), é provável. As homologias nas sequências de protease publicadas foram procuradas usando o programa BLAST, versão 2.2.9, no NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Altschul et al., 1990). Os valores de identidade da sequência madura Fe_RF6318 com as regiões correspondentes de sequências homólogas foram obtidos usando o alinhamento ClustalW (Matriz: BLOSUM, Abertura de intervalo: 10, Extensão de intervalo: 0,5 (por exemplo, em www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw) são mostrados na tabela 3.

A protease de serina Fe_RF6318 da presente invenção mostrou maior homologia com a proteína hipotética Gibberella zeae PH-I, locus tag FG03315.1 (acesso EMBL no. XP_383491, não publicado), com a serina endopeptidase de T. harzianum CECT 2413 (acesso EMBL no. CAL25508, Suarez et al., 2007) e com o precursor da proteinase alcalina de T. atroviride S08.066, ALP (acesso EMBL no. M87516, Geremia et al. 1993), o último revelado como uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO:313 em US 60/818.910 (Catalyst Bioscience Inc.). A identidade para a proteína hipotética de G. zeae estava na enzima de tamanho total de 85 %. Quando os polipeptídeos maduros que precisam da sequência e pró-peptídeo sinal foram alinhados, a identidade foi 85 %. A identidade da serina endopeptidase de T. harzianum CECT 2413 foi 70 % (enzima de tamanho total) e 75 % (enzima madura). A identidade de T. atroviride ALP foi 69 % (enzima de tamanho total) e 74 % (enzima madura).

Assim, no escopo da invenção, está uma sequência de polinucleotídeos isolados, ou molécula de ácido nucleico isolada, que codifica uma enzima protease de serina fúngica ou polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da forma madura da enzima Fe_RF6318 caracterizada em SEQ ID NO: 15, isto é, aminoácidos Alal24 a Ala412 da protease de serina de tamanho total de SEQ ID NO: 11.

Adicionalmente, no escopo da presente invenção, estão moléculas de ácido nucleico que codificam um fragmento de um polipeptídeo de protease de serina fúngica, em que o fragmento apresenta atividade de protease de serina e apresenta pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID No: 15, ou pelo menos 86 % com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:11. As enzimas preferidas mostram pelo menos 86 %, preferivelmente pelo menos 87 %, mais preferivelmente pelo menos 88 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade. Ainda mais preferivelmente, as sequências de aminoácidos mostram pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou 96 %, mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. As identidades das duas enzimas são comparadas com a região correspondente de sequências, por exemplo, na região de tamanho total ou madura da protease de serina.

A molécula de ácido nucleico é preferivelmente uma molécula que compreende a sequência codificante da maneira representada em SEQ ID NO: 10, que codifica a forma de tamanho total da enzima protease de serina fúngica desta invenção.

A molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode ser uma molécula que compreende a sequência codificante da sequência de polinucleotídeos contida em DSM 22171 ou DSM 22172. DSM 22171 carrega a sequência de nucleotídeos do fragmento de PCR (SEQ ID NO:9) usado na clonagem do gene Fe prtSSA de tamanho total. DSM 22172 carrega a sequência de nucleotídeos do gene Fe prtS8A de tamanho total (SEQ ID NO: 10).

A molécula de ácido nucleico da invenção também pode ser um análogo da sequência de nucleotídeos caracterizada anteriormente. A "degeneração"significa análogos da sequência de nucleotídeos que diferem em um ou mais nucleotídeos ou códons, mas que codificam a protease recombinante da invenção.

A molécula de ácido nucleico também pode ser uma molécula de ácido nucleico que hibridiza em condições severas em uma sonda de PCR contida no plasmídeo pALK2521, depositado em E. coli com o número de acesso DSM 22171, e que codifica um polipeptídeo com atividade de protease de serina e uma sequência de aminoácidos que na região de sequência correspondente mostra pelo menos 86 % de identidade com a sequência de aminoácidos da maneira representada em SEQ ID NO: 15. O DNA hibridizante pode originar de um fungo que pertence à espécie Fusarium ou pode originar a partir de outras espécies fúngicas.

Assim, no escopo da invenção, está uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos da maneira representada em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e análogos desta.

A presente invenção diz respeito também a um vetor de expressão recombinante, ou construto de expressão recombinante, which pode ser usado para propagar ou expressar a sequência de ácidos nucleicos ou gene que codifica a protease de serina escolhida em um hospedeiro procarioto ou eucarioto adequado. O vetor de expressão recombinante compreende DNA ou sequências de ácidos nucleicos que facilitam ou direcionam a expressão e secreção da protease de serina que codifica sequência em um hospedeiro adequado, tais como promotores, melhoradores, finalizadores (incluindo sinais de finalização de transcrição e tradução) e sinais de sequência operavelmente ligados à sequência de polinucleotídeos que codifica a dita protease de serina. O vetor de expressão pode compreender adicionalmente genes marcadores para seleção das cepas transformantes ou o marcador de seleção pode ser introduzido no hospedeiro em um outro construto de vetor por co-transformação. As ditas sequências regulatórias podem ser homólogas ou heterólogos ao organismo de produção, ou podem ser originar a partir do organismo, a partir do qual o gene que codifica a protease de serina é isolado.

São exemplos de promotores para expressar a protease de serina da invenção em fungos filamentosos hospedeiros os promotores de TAKA amilase, protease alcalina ALP e triose fosfato isomerase de A. oryzae, lipase de Rhizopus miehei, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou A. awamori, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporuma, promotor de celobioidrolase 1 de Chrysosporium lucknowense, celobioidrolase 1 de Trichoderma reesei (Cel7A), etc.

Em levedura, por exemplo, os promotores de enolase (ENO-I), galactoquinase (GALl), álcool desidrogenase (ADH2) e 3-fosfoglicerato quinase de S. cerevisiae podem ser usados para fornecer a expressão.

Exemplos de sequências promotoras para direcionar a transcrição da protease de serina da invenção em um hospedeiro bacteriano são o promotor do operon lac de Escherichia coli, o promotor de agarase dagA de Streptomyces coelicolor, o promotor do gene alfa-amilase (amyV) de B. licheniformis, o promotor do gene de amilase maltogênica (amyM) de B. stearothermophilus, os promotores do gene de xylA e xylB de B. sublitis, etc.

Os finalizadores adequados incluem aqueles dos genes anteriormente mencionados ou quaisquer outras sequências finalizadoras caracterizadas.

Os marcadores de transformação ou seleção adequados incluem aqueles que complementam um defeito no hospedeiro, por exemplo, os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis ou Aspergillus amdS e niaD. A seleção pode se basear também em um marcador que confere resistência ao antibiótico, tal como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina, fleomicina ou higromicina.

A secreção extracelular da protease de serina da invenção é preferível. Assim, o vetor recombinante compreende sequências que facilitam a secreção no hospedeiro selecionado. A sequência sinal da protease de serina da invenção, ou a pró-sequência ou pré-peptídeo, pode ser incluída no vetor de expressão recombinante ou a sequência sinal natural pode ser substituída por uma outra sequência sinal capaz de facilitar a secreção no hospedeiro selecionado. Assim, a sequência sinal escolhida pode ser homóloga ou heterológa à expressão do hospedeiro.

Exemplos de sequências sinais adequadas são aquelas dos organismos fúngicos ou leveduriformes, por exemplo, sequências sinais de genes bem expressos. Tais sequências sinais são bem conhecidas na literatura.

O vetor recombinante pode compreender adicionalmente sequências que facilitam a integração do vetor no DNA cromossômico do hospedeiro para obter a expressão adequada.

A protease Fe_RF6318 da invenção foi expressa com sua própria sequência sinal do promotor T. reesei cbhl (cel7A), da maneira descrita no exemplo 4. O construto de expressão usado para transformar o hospedeiro T. reesei incluiu também o finalizador cbhl e o marcador amdS para selecionar os transformantes a partir das células não transformadas.

A presente invenção diz respeito também às células hospedeiras compreendendo o vetor de expressão recombinante da maneira descrita anteriormente. Os hospedeiros adequados para a produção da enzima protease de serina fúngica são hospedeiros homólogos ou heterólogos, tais como os hospedeiros microbianos incluindo bactérias, leveduras e fungos. Os sistemas de produção em células de planta ou de mamífero também são possíveis.

Os fungos filamentosos, tais como Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortiriella, são hospedeiros de produção preferidos em virtude da facilidade do processamento à jusante e da recuperação do produto enzimático. Os sistemas de hospedeiros de produção e expressão adequados são, por exemplo, o sistema de produção desenvolvido pelo fungo filamentoso hospedeiro Trichoderma reesei (EP 244234), ou sistemas de produção de Aspergillus, tais como as cepas do tipo como A. oryzae ou A. niger (WO 9708325, U.S. 5.843.745, U.S. 5.770.418), A. awamori, A. sojae e A. japonicus, ou o sistema de produção desenvolvido para Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et ah, 1989) ou F. venenatum, e para Neurospora crassa, Rhizopus miehei, Mortiriella alpinis, H. lanuginosa ou H. insolens ou para Chrysosporium lucknowense (U.S. 6.573.086). Os sistemas de produção adequados desenvolvidos para as leveduras são sistemas desenvolvidos para Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Pichia pastoris. Os sistemas de produção adequados desenvolvidos para bactérias são um sistema de produção desenvolvido para Bacillus, por exemplo, para B. subtilis, B.  licheniformis, B. amyloliquefaciens, para E. coli ou para o actinomiceto Streptomyces. Preferivelmente, a protease de serina da invenção é produzida em um fungo filamentoso hospedeiro do gênero Trichoderma ou Aspergillus, tais como cepas do tipo T. reesei, ou A. niger, A. oryzae, A. sojae, A. awamori ou A. japonicus. De acordo com a modalidade mais preferida da invenção, a enzima protease de serina fúngica é produzida em T. reesei.

A célula hospedeira de produção pode ser homóloga ou heterológa à protease de serina da invenção. O hospedeiro pode ser livre de proteases homogêneas em virtude da remoção de proteases tanto por inativação quanto por remoção de uma ou mais proteases do hospedeiro, por exemplo, por deleção do(s) gene(s) que codifica(m) tais proteases homogêneas ou homólogas.

A presente invenção diz respeito também a um processo para produzir um polipeptídeo com atividade de protease de serina, o dito processo compreendendo as etapas de cultivar o natural ou célula hospedeira recombinante, que carrega o vetor de expressão recombinante para uma protease de serina da invenção em condições adequadas e, opcionalmente isolar a dita enzima. O meio de produção pode ser um meio adequado para crescer o organismo hospedeiro e conter indutores para expressão eficiente. Os meio adequados são bem conhecidos na literatura.

A invenção diz respeito a um polipeptídeo com atividade de protease de serina, o dito polipeptídeo que é codificado pela molécula de ácido nucleico da invenção, e que é obtido pelo processo descrito anteriormente. Preferivelmente, o polipeptídeo é uma enzima protease recombinante obtida cultivando a célula hospedeira que carrega o vetor de expressão recombinante para uma protease de serina da invenção.

A invenção diz respeito adicionalmente a um processo para obter uma preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo, o qual apresenta atividade de protease de serina, o dito processo compreendendo as etapas de cultivar uma célula hospedeira que carrega o vetor de expressão da invenção, e tanto recuperar o polipeptídeo a partir das células quanto separar as células a partir do meio de cultura, e obter o sobrenadante com atividade de protease de serina.

A presente invenção diz respeito também a uma preparação de enzima, que compreende a enzima protease de serina caracterizada anteriormente. A preparação ou composição de enzima apresenta atividade de protease de serina e é obtida pelo processo de acordo com a invenção.

Existe na invenção uma preparação de enzima que compreende a protease de serina fúngica da invenção, preferivelmente a protease de serina recombinante obtida cultivando uma célula hospedeira que carrega o vetor de expressão recombinante da invenção.

A dita preparação de enzima pode compreender adicionalmente diferentes tipos de enzimas, além da protease de serina desta invenção, por exemplo, uma outra protease, uma amilase, uma lipase, uma celulase, cutinase, uma pectinase, uma mananase, uma xilanase e/ou uma oxidase tal como uma lacase ou peroxidase com ou sem um mediador. Espera-se que estas enzimas melhorem o desempenho das proteases de serina da invenção removendo os carboidratos e óleo ou gorduras presentes no material a sem manuseado. As ditas enzimas podem ser enzimas naturais ou recombinantes produzidas pela cepa do hospedeiro, ou podem ser adicionadas ao sobrenadante da cultura após o processo de produção.

A dita preparação de enzima pode compreender adicionalmente um aditivo adequado selecionado do grupo de agentes tensoativos ou agente ativo de superfície, tampões, agentes anti-corrosivos, estabilizadores, agentes alvejantes, mediadores, aglutinantes, produtos cáusticos, abrasivos e conservantes, branqueadores óticos, agentes anti- redepositantes, corantes, pigmentos, etc.

Os agentes tensoativos são usados em gordura emulsificante e superfícies úmidas. O agente tensoativo pode ser um não iônico, incluindo semi-polar e/ou aniônico e/ou catiônico e/ou zwiteriônico.

Os tampões podem ser adicionados à preparação de enzima para modificar o pH ou afetar o desempenho ou estabilidade de outros ingredientes.

Os estabilizadores adequados incluem polióis tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico, ou derivados de ácido bórico, peptídeos, etc.

O agente alvejante é usado para oxidas e degradar compostos orgânicos. Exemplos de sistemas de alvejamento químico adequados são fontes de H2O2, tal como perborato ou percarbonato com ou sem ativadores de alvejamento que formam perácido tal como tetra-acetiletilenodiamina, ou alternativamente peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. Os oxidantes químicos podem ser substituídos parcialmente ou completamente usando enzimas oxidante, tal como lacases ou peroxidases. Muitas lacases não funcionam eficientemente na ausência de mediadores.

Os aglutinantes ou agentes complexantes incluem substâncias, tais como zeolita, difosfato, trifosfato, carbonato, citrato, etc. A preparação de enzima pode compreender adicionalmente um ou mais polímeros, tais como carboximetilcelulose, poli(etileno glicol), álcool poli(vinílico), poli(vinilpirrolidona), etc. Também podem ser adicionados amaciantes, produtos cáusticos, conservantes para prevenir a deterioração de outros ingredientes, substâncias abrasivas e que modificam as propriedades de espuma e viscosidade.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a dita preparação de enzima está na forma de líquido, pó ou granulado.

A protease de serina fúngica da presente invenção, assim como outras proteases, particularmente proteases alcalinas, pode ser usada nas indústrias de detergente, proteína, cerveja, carne, fotográfica, couro, panificação e farmacêutica (Kalisz, 1988; Rao et al, 1998). Por exemplo, pode ser usada como uma alternativa para produtos químicos converterem resídio de proteína fibrosa (por exemplo, chifre, pena, unhas e pelo) em biomassa utilizável, concentrado protéico ou aminoácidos (Anwar e Saleemuddin, 1998). O uso de protease de serina fúngica da presente invenção, assim como outras enzimas, pode ser comprovado satisfatoriamente na melhoria da qualidade do couro e na redução da poluição ambiental e economia de energia, e assim como proteases alcalinas, podem ser usada na síntese de peptídeos e reparação da mistura de D,L-aminoácidos. A subtilisina em combinação com antibióticos de amplo espectro no tratamento de queimaduras e feridas é um exemplo do uso de proteases de serina na indústria farmacêutica, portanto, a protease de serina fúngica da presente invenção também pode ser usada desta maneira e, assim como as proteases alcalinas, também pode ser aplicada na remoção de sangue em equipamentos cirúrgicos e limpeza de lentes de contato ou dentaduras. Assim como a protease alcalina de Conidiobolus coronatus, a protease de serina fúngica da presente invenção pode ser usada para substituir a tripsina em culturas de célula animal. As proteases da invenção também podem ser usadas na limpeza de membranas e destruição de de biofilmes. Em assados, as proteases pode ser usada, por exemplo, na destruição da rede do glúten e em outras aplicações alimentares na hidrólise de protepinas de alimento, por exemplo, proteínas no leite. Também podem ser usadas, por exemplo, no tratamento de levedura, rendimento (extraindo mais proteína a partir de ossos de animal), criando novos sabores, reduzindo a amargura, alterando as propriedades emulsificantes, gerando peptídeos bioativos e reduzindo a alergenicidade de proteínas. Os substratos incluem proteínas animal, de planta e microbiana.

A indústria de detergente, particularmente a indústria de detergente de roupa, emergiu como o único principal consumidor de proteases ativas na faixa de pH elevado (Anwar e Saleemuddin, 1998). A protease detergente ideal tem que possuir ampla especificidade de substrato para facilitar a remoção de grande variedade de manchas relacionadas ao alimento, grama, sangue e outras secreções corporais. Deve ser ativa no pH e concentração iônica da solução de detergente, na temperatura e pH da lavagem e tolerar manuseio mecânico, bem como os agentes quelantes e de oxidação adicionados aos detergentes. O pI da protease tem que ser próximo do pH da solução de detergente. Em virtude da presente crise de energia e da conscientização para conservação de energia, atualmente é desejável usar a protease em temperaturas menores.

A presente invenção diz respeito também ao uso da enzima protease de serina, ou da preparação de enzima para detergentes, para tratar fibras têxteis, para tratar lã, para tratar pelo, para tratar couro, para tratar ração ou alimento, ou para qualquer aplicação que envolve modificação, degradação ou remoção de material proteináceo.

Uma modalidade preferida da invenção é, portanto, o uso da enzima protease de serina, da maneira caracterizada anteriormente, como um aditivo de detergente usado para detergente de roupas e composições de lavagem de louça, incluindo composições de lavagem automática de louça.

A expressão "detergente"é usada para significar a substância ou material pretendido para auxiliar na limpeza ou com propriedades de limpeza. O termo "detergência"indica a presença ou grau de propriedade de limpeza. O grau de propriedade de limpeza pode ser testado em diferentes materiais de substrato proteináceo ou contendo proteína ou manchas ou mistura de mancha ligada ao carreador sólido insolúvel em água, tais como fibras têxteis ou vidro. O material proteináceo típico inclui sangue, leite, tinta, ovo, grama e molhos. Com propósitos de teste, as misturas de corantes proteináceos são comercialmente disponíveis. A função da enzima detergente é degradar e remover as manchas contendo proteína. Os resultados do teste dependem do tipo de mancha, da composição do detergente e da natureza e  estado dos têxteis usados no teste de lavagem (Maurer, 2004).

Tipicamente, a protease ou o desempenho da lavagem é medido como "eficiência de remoção de mancha" ou "efeito de remoção de mancha" ou "grau de propriedade de limpeza", significando um aumento visível e mensurável da luminosidade ou mudança na cor do material manchado, por exemplo, em amostras ou roupas testes sujas artificialmente. A luminosidade ou mudança nos valores de cor pode ser medida, por exemplo, medindo a cor como valores de refletância com um espectrofotômetro usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* da maneira descrita nos exemplos 6 a 10. A diminuição ou remoção de mancha proteinácea que indica o desempenho da protease (eficiência de remoção da mancha) é calculada, por exemplo, como AL*, que significa o valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima menos o valor de luminosidade L* do tecido tratado com tampão ou licor de lavagem sem enzima (branco ou controle). A presença de detergente pode melhorar o desempenho da enzima na remoção das manchas.

A protease de serina da presente invenção degrada vários tipos de corantes proteináceos em condições de pH neutro e alcalino e mesmo na presença de detergentes com diferentes composições (da maneira mostrada nos exemplos 6 a 13).

Da maneira mostrada no exemplo 6, a protease de serina da invenção removeu a mancha de sangue/leite/tinta a 50 °C e, especialmente, a 30 °C em tampão de pH 9 melhor do que as preparações comerciais de protease Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L (Figuras 5 e 6). As preparações de enzima foram dosadas como unidades de atividade. O efeito da remoção da mancha em mancha de sangue/leite/tinta foi testado também na faixa completa de temperatura de 10 °C a 60 °C, da maneira descrita no exemplo 12. A preparação da protease Fe_RF6318 mostrou maior capacidade de remoção de mancha comparada com a preparação de protease comercial Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L. Também mostrou maior capacidade de remoção de mancha em uma faixa de 30 °C a 60 °C comparada com Properase® 4000E (Figura 16).

O desempenho da protease Fe_RF6318 foi testado também em pó detergente a 40 °C/50 °C em pH 10, da maneira descrita no exemplo 7. A capacidade da enzima na remoção de mancha de sangue/leite/tinta em material de poliéster-algodão foi ensaiada. Cada preparação de enzima foi dosada como unidades de atividade (iimol de tirosina/minuto). Da maneira mostrada na figuras 7 e 8, a protease da invenção é adequada também para pós detergentes em condições muito alcalinas e sua resistência para agentes alvejantes foi um pouco maior do que com protease comercial Purafect® 4000L.

A protease Fe_RF6318 removeu mancha padrão de sangue/leite/tinta também em detergente base líquido e em Ariel Sensitive (Procter & Gamble, UK) na presença do detergente base líquido e a 30 °C (Exemplo 9). A eficiência na mancha de sangue/leite/tinta foi consideravelmente maior do que com as preparações comerciais Savinase® Ultra 14L e Purafect® 4000L (Figuras 10 e 11). As preparações de enzima foram dosadas como unidades de atividade. O mesmo efeito foi observado também quando a dosagem foi calculada como a quantidade de proteína adicionada (Figura 10B e 11B). As lavagens realizadas com concentração de detergente líquido de 3,3 g/L e a 10 °C e 20 °C mostraram novamente desempenho superior com relação às preparações comerciais Savinase® Ultra 14L, Purafect® 4000L e Properase® 4000E (Exemplo 13; Figura 17).

Além das manchas de sangue/leite/tinta, a protease Fe_RF6318 foi eficiente na remoção de mancas, tais como grama e cacau, quando testada em detergentes líquidos a 30 °C. Os tratamentos foram realizados em ATLAS LP -2 Launder-Ometer. Os resultados (figuras 12 e 13) mostraram que a Fe_RF6318 foi eficiente em várias manchas em temperaturas baixas como 30 °C.

O desempenho da preparação de enzima recombinante Fe_RF6318 produzida em T. reesei foi testado na presença de detergente base líquido em escala completa em uma máquina de lavar a 30 °C (Exemplo 11). Oito diferentes marcadores sensíveis à protease para testar efeitos colaterais são apresentados na tabela 5 e as condições de processo na tabela 6. A dosagem de enzimas usadas nos experimentos de teste foi calculada tanto como atividade de enzima quanto como quantidade de enzima protéica. Os resultados apresentados nas figuras 14A-B mostram que a soma dos resultados obtidos com as diferentes manchas foi maior com a Fe_RF6318 e foi maior que com as preparações comerciais de protease Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L, quando a enzima foi dosada como quantidade de atividade ou como proteína. A Fe_RF6318 foi mais eficiente em manchas de sangue/leite/tinta, chocolate/leite, óleo de amendoim/leite e gema de ovo (Figuras 15 A-E).

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a protease de serina fúngica da invenção é usada em líquidos detergentes e pós detergentes da maneira mostrada nos exemplos 6 a 13. A enzima de preparação enzimática da invenção pode ser formulada para uso em uma lavagem manual ou com máquina ou pode ser formulada para uso na limpeza doméstica de pavimentos ou preferivelmente em operações de lavagem de louça manual e com máquina.

EXEMPLO 1. Produção e purificação da protease de Fusarium equiseti RF6318 (a) Cultivo de Fusarium equiseti RF6318

A cepa fúngica RF6318 foi previamente isolada como um fungo filamentoso que produz celulases. Foi identificada como Fusarium cF. equiseti (Libert) Desmazieres (por Arthur de Cock, Identification Services, Centralbureau Voor Schimmelcultures, P.O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, Holanda). F. equiseti RF6318 mostrou produzir atividade de protease em ensaio de placa de ágar contendo hemoglobina como um substrato. Uma vez que os cultivos em placas foram realizados em cerca de 10 °C, este resultado sugeriu que RF6318 produz uma protease ou proteases que agem em temperaturas baixas. O F. equiseti RF6318 foi crescido, mantido e esporulado em ágar batata dextrose (PD) (Difco) a +4°C. Para a produção de enzima, os esporos de RF6318 em declive foram inoculados em um meio de cultura que continha: 30 g/L de fubá (finamente moído), 5 g/L pó de milhocina, 4 g/L de farinha de soja (desengordurada), 2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de NaCl e 1 g/L de óleo de parafina. O pH do meio foi ajustado antes da esterilização com NaOH para 8,5 e o meio foi autoclavado por 30 minutes a 121°C. O micróbio foi cultivado em volume de 50 mL em um agitador (200 rpm) a 28 °C por 7 dias. O sobrenadante da cultura exaurida mostrou conter atividade de protease alcalina quando as medições de atividade foram realizadas (de acordo com os exemplos 1c, 5 ou 14) em diferentes valores de pH (pH 7-10). Em decorrência desta atividade alcalina, a cepa RF6318 foi escolhida como suposta cepa doadora de gene.

(b) Purificação de protease a partir do meio de cultura de F. equiseti RF6318

As células e sólidos foram removidos do meio de cultura exaurido por centrifugação por 30 minutos, 50.000 g a +4°C (Sorvall RC6 plus). 50 mL do sobrenadante foram usados para a purificação da protease. Após a centrifugação, o pH de sobrenadante foi ajustado para 8,0 com adição de HCl. O sobrenadante foi então filtrado por meio de filtro de 0,44 LUII (MILLEX HV Millipore) e aplicado em uma coluna de 5 mL Q Sepharose FF (GE Healthcare) equilibrada em Tris-HCl 20 mM, pH 8. O fluxo por meio da fração foi coletado e seu pH diminuiu para 7,5 adicionando HCl. O sulfato de amônio sólido foi adicionado ao fluxo por meio de fração para obter uma concentração final de sal de 1 M. O fluxo por meio da fração foi então filtrado por meio de filtro 0,44 gm antes de aplicar na coluna de fenil Sepharose HP (1 mL) (GE Healthcare) equilibrada em Tris-HCl 20 mM-sulfato de amônio 1M, pH 7,5. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de sulfato de amônio decrescente (de 1 a 0 M). As frações de 1 mL foram coletadas e analisadas com relação à atividade de protease em caseína marcada com resorufina (Boehringer Mannheim Biochemica) em pH 8,0 da maneira instruída pelo fabricante. As frações com atividade de protease foram agrupadas e ultra filtradas com membrana de 10 k (Amicon). O filtrado concentrado foi aplicado em uma coluna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com Tris-HCl 20 mM - NaCl 200 mM, pH 7,5. As proteínas foram eluídas com o mesmo tampão e 0,5 mL frações foram coletadas. A atividade de protease destas frações foi analisada. As frações com atividade de protease foram analisadas em eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). As frações mostraram conter uma banda de proteína principal com uma massa molecular de cerca de 29 kDa. As frações escolhidas foram agrupadas. As frações agrupadas foram usadas para a preparação de peptídeos (Exemplo 2). De acordo com as emedições do ensaio de atividade, a proteína purificadas apresentou aeu pH ideal em pH 10. Esta protease purificada de F. equiseti RF6318 é denominada Fe_RF6318.

(c) Ensaio da atividade de protease

A atividade de protease foi ensaiada pelo método caseína de Folin-Ciocalteau usando caseína como um substrato. A taxa de degradação de caseína por uma protease foi medida por monitoramento espectrofotométrico da liberação de fragmentos solúveis em ácido como uma função do tempo. O substrato caseína usado no ensaio foi preparado da maneira a seguir: 6 g de caseína da Hammerstein Grade MP Biomedicals, LLC (101289) foi dissolvido em 500 mL de Tris 100 mM, CaCh 20 pM, MgCfe 7 pM, NaHCO3 25 pM. O pH da solução de substrato foi ajustado para 9,0 com HCl. As reações enzimáticas pararam usando a solução de TCA que continha: TCA 0,11 M, citrato de sódio 0,22 M, ácido acético 0,33 M, Na2CO3 0,5 M em 1.000 mL de água destilada. O reagente de Folin usado no ensaio foi preparado diluindo 25 mL do reagente fenólico de Folin-Ciocalteu 2 N (SIGMA, F 9252) em 100 mL de água destilada. A reação iniciou primeiro incubando 2,5 mL da solução de substrato por 5 minutos a dada temperatura, após o que 0,5 mL da solução de enzima foi adicionado e a reação foi conduzida por 15 minutos ou 30 minutos. Após 15 minutos ou 30 minutos de reação, 2,5 mL de solução de parada de reação foram adicionados, os conteúdos foram misturados e deixados naturalmente por 30 minutos em temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 4.000 rpm por 10 minutos (Hettich Rotanta 460). Um mL de sobrenadante limpo foi pipetado e misturado com 2,5 mL de Na2CO3 0,5 M e 0,5 mL de reagente de Folin diluido. Após esperar por 5 minutos (desenvolvimento da cor), a absorbância da mistura (cor) foi medida a 660 nm contra um branco. O branco foi preparado da maneira a seguir: 0,5 mL de solução de enzima foi misturada com 2,5 mL de solução de parada e 2,5 mL de substrato, e a mistura foi incubada por 15 minutos ou 30 minutos na dada temperatura. Uma unidade da atividade de enzima foi definida como a quantidade de enzima que libera o produto de hidrólise protéico solúvel em ácido que corresponde a 1 ,ug de tirosina por mL da mistura de reação por minuto.

EXEMPLO 2. Sequenciamento de aminoácido N-terminal e interno da protease purificada de F. equiseti Fe_RF6318

Para a determinação das sequências internas, as bandas coradas com azul brilhante de Coomassie foram cortadas do gel de poliacrilamida gel e digeridas "em-gel" essencialmente da maneira descrita por Shevchenko et al. (1996). As proteínas foram reduzidas com ditiotreitol e alquiladas com iodoacetamida antes da digestão com tripsina (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega).

A espectrometria de massa em tandem por tempo de voo 50 quadripolar de ionização por eletroaspersão para novo sequenciamento foi gerada usando um instrumento Q-TOF (Micromass, Manchester, UK) conectado a um cromatógrafo líquido Ultimate nano (LC-Packings, Holanda), essencialmente da maneira descrita previamente (Poutanen et al., 2001), mas usando uma coluna de captura de 150gm x 1,0 mm (3gm, 120Â, #222403, SGE Ltd UK) para pré-concentração de peptídeo.

Para a análise de sequência N-terminal, as proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas por electroblotting em uma membrana de difluoreto de polivinilidina (ProBlott; Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster, Califórnia). Após serem coradas com azul brilhante de Coomassie, as bandas de proteína de interesse foram removidas e submetidas à análise de sequência N-terminal por degradação de Edman em um sequenciador de proteína Procise 494A (Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster, Califórnia).

As sequências de peptídeos N-terminais e internos determinadas a partir da protease Fe_RF6318 purificada são mostradas na tabela 1. As sequências de peptídeos mostraram homologia com as sequências de protease publicadas a partir das proteases de serina de Fusarium oxysporum com números de acesso EMBL Q5R2N9 e 074236. Tabela 1. Sequências de peptídeos N-terminais e internos determinadas a partir da protease Fe_RF6318

EXEMPLO 3. Clonagem do gene de F. equiseti RF6318 que codifica a protease Fe_RF6318 (a) Isolamento de DNA e métodos de biologia molecular usados

Os métodos padrões de biologia molecular foram usados no isolamento e tratamentos enzimáticos de DNA (por exemplo, isolamento de DNA plasmidial, digestão de DNA para produzir fragmentos de DNA) em transformações de E. coli, sequenciamento etc. Os métodos básicos usados foram tanto da maneira descrita pelos fabricantes de enzima, reagente ou estojo quanto da maneira descrita nos manuais padrões de biologia molecular, por exemplo, Sambrook e Russell (2001). O isolamento de DNA genômico de F. equiseti RF6318 foi realizado da maneira descrita em detalhes por Raeder e Broda (1985). (b) Oligonucleotídeos iniciadores para preparação de sonda

A sonda para clonar o gene que codifica a proteína Fe_RF6318 foi sintetizada por PCR. Os oligonucleotídeos degenerados foram planejados com base nas sequências de aminoácidos dos peptídeos obtidos da Fe_RF6318 purificada (Tabela 1). As sequências dos oligonucleotídeos iniciadores são mostradas na tabela 2 (SEQ ID NOs: 5-8). Tabela 2. Oligonucleotídeos (SEQ ID NOs: 5-8) usados como oligonucleotídeos iniciadores de PCR na amplificação de sonda. Oligonucleotídeos, SEQ ID NOs, tamanhos e degeneração de oligonucleotídeo, oligonucleotídeos e os aminoácidos do peptídeo usados no planejamento da sequência de oligonucleotídeos.

aN = A, T, C ou G; R = A ou G, Y = T ou C; "s" entre parênteses= fita sentido, "as" entre parênteses = fira anti-sentido. bAs sequências de peptídeos são incluídas na tabela 1.

(c) Reações de PCR e seleção de sondas para clonagem

O DNA genômico de F. equiseti RF6318 foi usado como um molde para síntese de sonda. As misturas de reação de PCR continham Tris- HCl 10 mM, pH 8,8, KCl 50 mM, Triton X-100 0,1 %, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM, 1 LIM de cada oligonucleotídeo iniciador e 4 unidades de Dynazyme II DNA polimerase (Finnzymes, Finlandia) e aproximadamente 3 lg de DNA genômico por 100 lL de volume de reação. As condições para as reações de PCR foram da maneira a seguir: 5 minutos de desnaturação inicial a 96 °C, seguido por 32 ciclos de 1 min a 96 °C, 30 ciclos de anelamento a 55,5 °C, extensão de 1 minuto a 72 °C e uma extensão final a 72 °C por 5 minutos. A combinação de oligonucleotídeo iniciador PRO88 (SEQ ID NO:6) e PRO89 (SEQ ID NO:7) produziu um produto específico de DNA com o tamanho esperado (de acordo com cálculos que baseiam-se nas sequências de proteases fúngicas publicadas). O produto de DNA foi isolado e purificado a partir da mistura de reação de PCR e clonado no vetor pCR®2.1-TOPO®, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, USA). O fragmento de DNA de 866 bp foi sequenciado a partir deste plasmídeo (SEQ ID NO:9). O plasmídeo pCR®2.1-TOPO® que contém este fragmento de DNA amplificado foi denominado pALK2521. A cepa de E. coli RF7664, incluindo o plasmídeo pALK2521, foi depositada na coleção DSM com o número de acesso DSM 22171.

A sequência de aminoácidos deduzida do fragmento de PCR incluiu as sequências dos peptídeos Fe_RF6318 internos 1246.673 (SEQ ID NO:2) e 3341.633 (SEQ ID NO:3) (tabela 1). Igualmente, a parte C-terminal do peptídeo N-terminal #3792 (SEQ ID NO:1) não incluída no oligonucleotídeo iniciador foi observada a partir da sequência de aminoácidos deduzida (Tabela 1). Isto confirma que o fragmento de DNA obtido a partir da reação de PCR é parte do gene que codifica A proteína Fe_RF6318, e foi assim usado como uma sonda para selecionar o gene de tamanho completo do  DNA genômico de F. equiseti.

(d) Clonagem do gene RF6318 de F. equiseti que codifica a protease Fe_RF6318

O DNA genômico de F. equiseti foi digerido com várias enzimas de restrição para análise Southern blot. A hibridização foi realizada com o fragmento EcoRl de 884 kb, incluindo SEQ ID NO:9, cortado do plasmídeo pALK2521 como uma sonda (Exemplo 3c). A sonda anterior foi marcada usando digoxigenina de acordo com as instruções do fornecedor (Roche, Alemanha). A hibridização foi realizada por toda a noite a 65 °C. Após a hibridização os filtros foram lavados 2 x por 5 minutos em RT usando SSC 2 x - SDS 0.1 %, seguido por 2 x 15 minutos a 65 °C usando SSC 0,1 x - SDS 0.1 %.

Vários fragmentos de hibridização nas digestões de DNA genômico de F. equiseti podem ser detectados. As digestões MunI e BglII genômicas continham fragmento hibridizante com tamanhos de aproximadamente 4,2 kb e 3,2 kb, respectivamente. Os tamanhos dos fragmentos de hibridização simples foram grandes o suficiente para conter o gene de tamanho total gene que codifica a proteína Fe_RF6318, de acordo com cálculos que baseiam-se nas sequências de proteases fúngicas publicadas. Os fragmentos de DNA genômico foram isolados das digestões MunI e BglII genômicas de RF6318 a partir da faixa de tamanho do fragmento hibridizante (aproximadamente 4 kb para digestão MunI e aproximadamente 3 kb para a digestão BglII). Os fragmentos genômicos foram isolados a partir do gel de agarose e foram clonados em pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) vetores clivados com EcoKI e BamHI.

As misturas de ligação foram transformadas em células de Escherichia coli XL10-GoId (Stratagene) e colocadas em placas de LB (Luria-Bertani) contendo 50-100 gg/mL de ampicilina. As colônias de E. coli foram selecionadas para clones positivos usando hibridização colonial com o inserto de pALK2521 como uma sonda. A hibridização foi realizada da maneira descrita para a digestão de DNA genômico RF6318. Quatro clones positivos BglII e oito positivos MunI foram coletados a partir das placas. Eles foram exibidos por digestão por restrição para conter insertos de tamanhos esperados. O inserto do fragmento MunI ligado ao vetor BamHI foi cortado com digestão dupla PstI-SalI. O inserto do fragmento BglII ligado ao vetor EcoRI foi cortado com digestão dupla PstI-NotI. Um Southern blot foi realizado em insertos dos clones coletados (hibridização Southern blot a 68 °C e lavagem 2 x a 5 minutos em RT usando SSC 2 x - SDS 0,1 % seguido por 2 x 15 minutos a 68 °C usando SSC 0,1 x - SDS 0,1 %). Três dos clones BglII coletados e seis dos clones MunI coletados continham o fragmento hibridizante em Southern blot. O gene de tamanho completo que codifica a protease Fe_RF6318 (SEQ ID NO: 10) foi sequenciado a partir do inserto BglII de 3,2 kb e o plasmídeo que contém este inserto foi denominado pALK2529. A cepa E. coli RF7800, incluindo o plasmídeo pALK2529, foi depositada na coleção DSM com o número de acesso DSM 22172. O gene que codifica a proteína Fe_RF6318 foi denominado FeprtSSA.

(e) Caracterização do gene que codifica a protease Fe_RF6318 e a sequência de aminoácidos deduzida

A sequência Fe prtS8A (SEQ ID NO: 10) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 11) são mostradas na figura 1A-B. O tamanho do gene é 1303 bp (incluindo o códon de parada). Um suposto intron foi encontrado com o tamanho de 64 bps (sequências de extremidade 5' e 3' de acordo com aquelas de introns fúngicos, de acordo com Gurr et al. (1987). A sequência protéica deduzida (SEQ ID NO: 11) consiste em 412 aminoácidos incluindo uma sequência sinal prevista de 20 aminoácidos (SignalP V3.0; Nielsen et al., 1997 e Nielsen e Krogh, 1998). O peptídeo N-terminal completo #3792 (também a parte N-terminal não incluída na sequência da sonda) foi incluído na sequência de aminoácidos deduzida. A massa molecular prevista foi 29141.09 Da para o polipeptídeo maduro e o pI previsto foi 9,30. Estas previsões foram realizadas usando a ferramenta Compute pI/MW no servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). A sequência de aminoácidos deduzida continha dois possíveis sítios de N-glicosilação nas posições de aminoácido Asn77 e Asn255 (Figura 1), mas de acordo com o servidor CBS NetNGlyc Vl.0, apenas o sítio na posição Asn77 (localizado na sequência pro) é provável.

(f) Estudos de homologia, identidade e alinhamento

As homologias com as sequências de protease publicadas foram pesquisadas usando o programa BLASTX versão 2.2.9 no NCBI (National Center for Biotechnology Information) com ajustes padrões (Altschul et al, 1990). As melhores homologias estavam em uma proteína hipotética de Gibberella zeae (Fusarium graminearum) (número de acesso EMBL XP_383491) e serina endopeptidase de Trichoderma harzianum (Hypocrea lixii) (número de acesso EMBL CAL25508). Igualmente, a homologia foi observada em uma sequência incluída no pedido de patente U.S. 60/818.910 (Catalyst Bioscience Inc.) como SEQ ID NO:313. A sequência Fe_RF6318 foi alinhada com as sequências homólogas anteriores. Os valores de identidade obtidos usando o alinhamento ClustalW (www.cbi.ac.uk/Tools/clustarw; Matriz: BLOSUM, Abertura de intervalo: 10, Extensão de intervalo: 0,5) são mostrados na tabela 3. Tabela 3. Os valores de identidade (%) obtidos a partir do alinhamento ClustalW das sequências de aminoácidos protease deduzidas. As sequências maduras de aminoácidos que excluem os peptídeos sinais e pró- peptídeos foram alinhadas. Matriz: BLOSUM, Abertura de intervalo: 10, Extensão de intervalo: 0,5, EMBL EBI. G. zeae, XP_383491; T. harzianum CAL25508; U.S. 60/818.910, SEQ ID NO: 313 no pedido.

EXEMPLO 4. Produção da protease Fe RF6318 recombinante em Trichoderma reesei

(a) Preparação do vetor de produção (hospedeiro)

O plasmídeo de expressão pALK2533 foi construído para a produção de protease recombinante Fe_RF6318 em Trichoderma reesei. O gene Fe prtSSA com sua própria sequência sinal foi fundido exatamente ao promotor T. reesei cbhl (cel7A) por PCR. O fragmento do gene Fe prtSSA foi excisado de sua extremidade 3' por BamHI (um sítio criado após o códon de parada em PCR). Este não separa nenhum finalizador original FeprtSSA no construto antes da sequência finalizadora cbh1. Um gene marcador amdS foi adicionado à construção incluindo o promotor cbh1 e o finalizador cbhl. A construção é análoga àquela descrita em Paloheimo et al. (2003) e o cassete de expressão linear de 8,7 kb é apresentado na figura 2. O cassete de expressão foi isolado a partir da parte principal do vetor após a digestão com EcoR1 e foi usado para transformar protoplastos de T. reesei. A cepa hospedeira usada não produz nenhuma das quatro principais celulases de T. reesei (CBHI, CBHII, EGI, EGII). As transformações foram realizadas da mesma maneira em Penttila et al. (1987), com as modificações descritas em Karhunen et al. (1993). Os transformantes foram purificados nas placas de seleção por meio de conidios únicos antes da esporulação em PD.

(b) Produção de protease produção em frascos de agitação e biorreatores de escala laboratorial

Os transformantes foram inoculados a partir dos declínios de PD para frascos de agitação contendo 50 mL de meio complexo indutor de celulase a base de lactose (Joutsjoki et al., 1993) tamponado com KH2PO 5 % em pH 6,0. A produção de dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes da cultura após crescê-los por 7 dias a 30 °C, 250 rpm. Em géis SDS-PAGE, uma banda de proteína principal de cerca de 29 kDa que corresponde à protease recombinante Fe_RF6318 foi detectada a partir dos sobrenadantes de cultura exaurida. A atividade de protease foi ensaiada usando caseína como um substrato da maneira descrita nos exemplos 1c ou 14. As atividades evidentemente maiores comparadas ao hospedeiro foram medidas a partir dos sobrenadantes da cultura. A integração do cassete de expressão nos genomas fúngicos foi confirmada a partir de transformantes escolhidos usando análise Southern blot, na qual várias digestões genômicas foram incluídas e o cassete de expressão foi usado como uma sonda.

Os transformantes de T. reesei que produzem as melhores atividades de protease nos cultivos em frasco de agitação foram escolhidos para serem cultivados em biorreatores de escala laboratorial. O meio complexo indutor de celulase foi usado no cultivos. O meio de cultura exaurido obtido dos cultivos foi usado em testes de aplicação (Exemplos 611) e como material de partida para purificação e caracterização adicional da protease recombinante Fe_RF6318.

EXEMPLO 5. Purificação e caracterização da protease recombinante Fe_RF6318

As células e os sólidos foram removidos do meio de cultura exaurido obtido a partir da fermentação (Exemplo 4) por centrifugação a 30 minutos, 50.000 g a +4 °C (Sorvall RC6 plus). 15 mL do sobrenadante foram usados para a purificação de protease. Todas as etapas de purificação foram realizadas em câmara fria. Após a centrifugação, a amostra foi filtrada por meio de filtro 0,44 um (MILLEX HV Millipore) antes de aplicar em uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (da GE Healthcare) equilibrada em Tris 20 mM pH 8,8. A amostra filtrada em gel foi aplicada em uma coluna de 20 mL Q Sepharose FF (da GE Healthcare) equilibrada em Tris 20 mM pH 8,8. O fluxo através da fração foi coletado e analisado em gel SDS PAGE a 12 % (Fig. 3). Esta amostra de enzima foi usada para caracterização de perfis de pH e temperatura.

Perfil de temperatura

O perfil de temperatura foi obtido para a protease Fe_RF6318 em pH 9 usando o ensaio descrito nos exemplos 1c ou 14 usando tempo de reação de 15 minutos. O resultado é mostrado na figura 4A. A protease apresenta uma temperatura ideal em torno de 60 °C.

Perfil de pH

O perfil de pH da protease foi determinando a 50 °C usando caseína como um substrato, da maneira descrita nos exemplos 1c ou 14. O pH da reação foi ajustado para pH 6-12 usando tampão de Britton-Robinson 40 mM, e o tempo de reação foi de 15 minutos. As reações enzimáticas pararam usando uma solução TCA 0,11 M que continha acetato de sódio 0,22 M e ácido acético 0,33 M. Os resultados são mostrados na figura 4B. A protease recombinante Fe_RF6318 exibe atividade relativa de 60 % a partir de pH 6 até pH 10 com atividade ideal em torno de pH 10. O perfil de pH da protease recombinante purificada Fe_RF6318 correspondeu ao perfil de pH da protease Fe_RF6318 tipo selvagem purificada da maneira descrita no exemplo 1a.

EXEMPLO 6. Desempenho de protease recombinante Fe_RF6318 em tampão com pH 9 em diferentes temperaturas

A preparação de proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 4) foi testada com relação à sua capacidade de remover mancha padrão de sangue/leite/tinta (Art.116, 100 % algodão, EMPA Testmaterialen AG, Suíça) em temperaturas de 30 °C e 50 °C. As preparações comerciais de protease Savinase® Ultra 16 L (Novozymes) e Purafect® 4000L (Genencor International) e tratamento sem enzima (controle) foram usadas para comparação. O tecido manchado foi primeiro cortado em amostras de 1,5 cm x 1,5 cm e os pedaços foram arredondados cortando as extremidades. Os pedaços foram colocados em poços de placas de microtitulação (Nunc 150200). Em cada poço com um diâmetro de 2 cm, 1,5 mL de diluição de enzima em tampão glicina-NaOH pH 9 foi adicionado na superfície do tecido. Cada enzima foi dosada em 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4, e 8 unidades de atividade (juiiol tirosina/min) por 1,5 mL de tampão. A atividade foi medida usando tempo de reação de 30 minutos, da maneira descrita nos exemplos l(c) ou 14, usando tempo para desenvolvimento de cor de 10 minutos após a adição de reagente de Folin diluído. As placas de microtitulação com amostras foram incubadas em um agitador horizontal a 30 °C e 50 °C por 60 minutos com 125 rpm. Após o que as amostras foram rinsadas cuidadosamente em água corrente (aproximadamente 45 °C) e secas por toda a noite ao ar livre, em uma grade, protegidas contra a luz do dia.

O efeito da remoção da mancha foi avaliado medindo a cor como valores de refletância do espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* (fonte de luzD65/2°). A cor de ambos os lados das amostras foi medida após o tratamento. A média de cada valor foi calculada de pelo menos 2 amostras de tecido paralelas medidas em ambos os lados do tecido. O desbotamenteo da mancha de sangue/leite/tinta que indica o desempenho da protease (eficiência de remoção da mancha) foi calculado como AL*, que significa valor de luminosidade L* do tecido tratado com enzima menos o valor de luminosidade L* do tecido tratado com licor de lavagem (tampão) sem enzima (branco, controle).

Os resultados são mostrados nas figuras 5 e 6. A preparação de protease Fe_RF6318 mostrou capacidade de remoção de mancha consideravelmente maior a 50 °C, e especialmente a 30 °C, em tampão de pH 9 comparado às preparações comerciais de protease Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L.

EXEMPLO 7. Desempenho da proteína recombinante Fe_RF6318 com pó detergente a 40°C/50°C e pH 10

A preparação de proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 4) foi testada com relação à sua capacidade de remover mancha padrão de sangue/leite/tinta na presença de fosfato contendo detergente de referência com e sem agente alvejante a 40 °C e 50 °C (pH ca. 10). A mancha padrão Art.117 (sangue/ leite/tinta, poliéster + algodão, EMPA) foi usada como material de teste. A protease comercial Purafect® 4000L e o tratamento sem enzima (controle) foram usados para comparação. Cada enzima foi dosada em 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4, e 8 unidades de atividade (juiiol tirosina/min) por mL de licor de lavagem. A atividade foi medida da maneira descrita no exemplo 6.

Uma quantidade de 3,3 g de fosfato contendo detergente de referência ECE 77 sem branqueador ótico (Art. 601, EMPA) foi dissolvida em 1 litro de água de torneira (água, dH < 4), bem misturada com agitador magnético e temperada com 40 °C/50 °C. O tecido manchado foi cortado em pedaços do tipo descrito no exemplo 6. As amostras foram colocadas em poços de placas de microtitulação (Nunc 150200) e 1,5 mL de licor de lavagem contendo detergente e diluição de enzima em água (abaixo de 60 LIL) foi adicionado na superfície do tecido. As placas com amostras foram incubadas em agitador horizontal a 40 °C/50 °C por 60 minutos com 125 rpm. Após o que as amostras foram cuidadosamente/completamente rinsadas em água corrente (appr. 45 0C) e secas por toda a noite ao ar livre, em uma grade, protegidas da luz do dia. Uma outra série de teste foi realizada da mesma maneira, com a exceção de que 0,81 g de perborato de sódio tetraidratado (Art. 604, EMPA) e 0,16 g de ativador alvejante TAED tetra- acetiletilenodiamina (Art. 606, EMPA) foram adicionados ao detergente.

A cor das amostras após o tratamento foi medida com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* e o efeito de remoção de mancha foi calculado como AL* da maneira descrita no exemplo 6.

Os resultados mostrados nas figuras 7A, 7B, 8A e 8B, mostraram que a protease Fe_RF6318 também é adequada com relação a detergentes em pó em condições muito alcalinas e sua resistência para agentes alvejantes foi um pouco maior que com a protease comercial Purafect® 4000L.

EXEMPLO 8. Desempenho da proteína recombinante Fe RF6318 com detergente líquido a 40 °C

A preparação de proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 4) foi testada com relação à sua capacidade de remover mancha padrão de sangue/leite/tinta na presença de detergente líquido Ariel Sensitive (Procter & Gamble, England), não contendo enzima, a 40 °C e pH ca. 7,9. Mancha padrão, roupa teste suja de maneira artificial Art.117 (sangue/leite/tinta, poliéster + algodão, EMPA) foi usada como material de teste. As preparações comerciais de protease Purafect® 4000L, Savinase® Ultra 16 L e tratamento sem enzima (controle) foram usadas para comparação. Cada enzima foi dosada em 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4, e 8 unidades de atividade (gmol tirosina/min) por mL de licor de lavagem. A atividade foi medida da maneira descrita no exemplo 6.

Uma quantidade de 3,3 g de Ariel Sensitive foi dissolvida em 1 litro de água de torneira (dH < 4), bem misturada com agitador magnético e temperada com 40 °C. O tecido manchado foi cortado em pedaços do tipo descrito no exemplo 6. As amostras foram colocadas em poços de placas de microtitulação (Nunc 150200) e 1,5 mL de licor de lavagem contendo detergente e diluição de enzima em água (abaixo de 60 LI L) foi adicionado na superfície do tecido. As placas com amostras foram incubadas em um agitador horizontal a 40 °C por 60 minutos com 125 rpm. Após o que as amostras foram cuidadosamente rinsadas em água corrente (aproximadamente  450C) e secas por toda a noite ao ar livre, em uma grade, protegidas contra a luz do dia.

A cor das amostras após o tratamento foi medida com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* e o efeito de remoção de mancha foi calculado como AL* da maneira descrita no exemplo 6.

Com base nos resultados mostrados na figura 9, a protease Fe_RF6318 apresenta excelente desempenho com detergente líquido a 40 °C. A eficiência de Fe_RF6318 em mancha de sangue/leite/tinta (poliéster+algodão) foi consideravelmente maior comparada às preparações comerciais Purafect® 4000L e Savinase® Ultra 14 L, quando a mesma quantidade de atividade de protease foi dosada. A dosagem de 4 - 8 unidades de enzimas comerciais por mL de licor de lavagem foi igual à dosagem de cerca de 0,2 - 0,5 % de preparação de enzima por peso de detergente, que é um nível de uso típico para enzimas detergentes.

EXEMPLO 9. Desempenho de proteína recombinante Fe RF6318 com diferentes concentrações de detergente líquido a 30 °C

A preparação de proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 4) foi testada com relação à sua capacidade de remover mancha padrão de sangue/leite/tinta com detergente líquido em concentrações 1 - 5 g/L a 30 °C. Ariel Sensitive (Procter & Gamble, England) que não contém enzimas e detergente base líquido para tecido colorido contendo 25 % de substâncias ativas de lavagem, poliol e polímeros (Tabela 4), foram usados como detergentes e a mancha padrão Art.117 (sangue/leite/tinta, algodão + poliéster, EMPA) foi usada como material de teste. As preparações comerciais de protease Purafect® 4000L, Savinase® Ultra 16 L e tratamento sem enzima (controle) foram usadas para comparação. Cada enzima foi dosada em 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4, e 8 unidades de atividade (junol tirosina/min) por mL de licor de lavagem. A  atividade foi medida da maneira descrita no exemplo 6. Tabela 4. Composição de detergente base líquido para tecido colorido

As quantidades de 1, 3,3 e 5 g de detergente líquido foram dissolvidas em 1 litro de água de torneira (dH < 4), bem misturadas com agitador magnético e temperadas a 30 °. O pH nos licores de lavagem foi ca. 7,3-7,5 com detergente base ou ca. 7,6 - 8,0 com Ariel, dependendo da concentração de detergente. O tecido manchado foi cortado em pedaços do tipo descrito no exemplo 6. As amostras foram colocadas em poços de placas de microtitulação (Nunc 150200) e 1,5 mL de licor de lavagem contendo detergente e diluição de enzima em água (abaixo de 60 LIL) foi adicionado na superfície do tecido. As placas com amostras foram incubadas em um agitador horizontal a 30 °C por 60 minutos com 125 rpm. Após o que as amostras foram cuidadosamente/completamente risadas em água corrente aquecida e secas por toda a noite ao ar livre, em uma grade, protegidas contra a luz do dia.

A cor das amostras após o tratamento foi medida com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* e o efeito de remoção de mancha foi calculado como AL* da maneira descrita no exemplo 6.

Os resultados obtidos com detergente base para tecidos coloridos são mostrados nas figuras 10 A-D e os resultados obtidos com Ariel Sensitive são mostrados nas figuras 11 A-D. A eficiência de Fe_RF6318 em manchas de sangue/leite/tinta foi consideravelmente maior comparada às preparações comerciais Purafect® 4000L e Savinase® Ultra 14 L com ambos os detergentes e em todas as concentração de detergentes, quando a mesma quantidade de atividade foi dosada. Igualmente, se a dosagem for calculada como a quantidade de proteína adicionada (Figuras 10B e 11B), a eficiência de remoção da mancha é melhor com Fe_RF6318. A quantidade de proteína das preparações de enzima foi determinada por ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) usando gamaglobulina bovina (BioRad) como padrão. Os resultados destes testes indicam que a protease Fe_RF6318 apresenta excelente desempenho com detergentes líquidos em baixas temperaturas, do tipo 30 °C.

EXEMPLO 10. Eficiência da proteína recombinante Fe_RF6318 em diferentes manchas com detergentes líquidos a 30 °C (Launder-O-Meter)

A preparação de proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 4) foi testada com relação a sua capacidade de remover diferentes manchas com detergente líquido a 30 °C e comparada às preparações comerciais de protease Purafect® 4000L e/ou Savinase Ultra® 16 L. As seguintes roupas de teste sujas de maneira artificial de EMPA foram usadas: sangue/leite/tinta (Art.117, poliéster + algodão), sangue/leite/tinta (Art.116, algodão), grama (Art. 164, algodão) e cacau (Art.112, algodão). O tecido foi cortado em amostras de 9 cm x 12 cm e as extremidades foram limpas por costuras em zig-zag. Duas séries de teste foram realizadas: primeiro com Ariel Sensitive sem enzimas e segundo com um detergente base líquido para tecido colorido (Exemplo 8). Diferentes grupos de manchas foram usados nos dois experimentos anteriores.

Os tratamentos de remoção de mancha foram realizados em LP-2 Launder-O-Meter da maneira a seguir. Launder-O-Meter foi primeiro pré-aquecido a 30 °C. 450 mL de licor de lavagem temperado contendo 5 g de  detergente por litro de água de torneira (dH < 4) e a diluição da enzima foram adicionados em recipientes contendo manchas Art. 116 e Art. 117 ou manchas Art. 164 e Art. 112. Cada enzima foi dosada em 0, 2, 5, 10 e, em alguns testes, 20 ou 30 unidades de atividade (umol tirosina/min) por mL de licor de lavagem. A atividade foi medida da maneira descrita no exemplo 6. O Launder-O-Meter correu a 30 °C por 60 minutos e pH cerca de 7,5 (detergente base) ou 8 (Ariel). Após o que as amostras foram cuidadosamente rinsadas em água corrente (ca. 20 °C) e secas por toda a noite ao ar livre, em uma grade, protegidas contra a luz do dia.

A cor das amostras após o tratamento foi medida com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b*, e o efeito de remoção de mancha foi calculado como AL* da maneira descrita no exemplo 6. A cor de ambos os lados das amostras foi medida após o tratamento. Foi calculado a média de cada valor em pelo menos 20 medições por amostra. As medições foram evitadas a partir das áreas com marcas enrugadas formadas durante o tratamento em decorrência do dobramento do tecido(em mancas de algodão Art. 116 e Art. 112).

Os resultados obtidos com Ariel® Sensitive (Figura 12 A-C) mostram que a eficiência em sangue/leite/tinta e manchas de grama foi consideravelmente maior com Fe_RF6318, comparada à preparação comercial Savinase® Ultra 16L a 30 °C quando a mesma quantidade de atividade de protease foi dosada. Igualmente, os resultados obtidos com mancha de cacau foram melhor com Fe_RF6318 (dados não mostrados).

Igualmente, os resultados obtidos com detergente base (5g/L) para tecidos coloridos (Figura 13 A-D) mostraram que a eficiência nas manchas de sangue/leite/tinta, grama e cacau foi consideravelmente maior com Fe_RF6318 comparada às preparações comerciais Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L a 30 °C, quando a mesma quantidade de atividade de protease foi dosada. A dosagem de 10 unidades de enzimas comerciais por mL de licor foi igual à dosagem de aproximadamente 0,4 % de preparação de enzima por peso de detergente, o que está em nível típico de uso para enzimas detergentes. Os resultados destes testes indicam que a protease Fe_RF6318 é eficiente em várias manchas em baixas temperaturas do tipo 30 °C.

EXEMPLO 11. Avaliação do desempenho da proteína recombinante Fe_RF6318 em detergente de roupa líquido em experimentos de escala completa a 30 °C

O desempenho da proteína recombinante Fe_RF6318 preparação produzida em Trichoderma (Exemplo 4) foi testado em detergente líquido em escala completa em uma máquina de lavar a 30 °C e comparado às preparações comerciais de protease Purafect® 4000L e Savinase® Ultra 16L e tratamento com detergente sem enzima. Detergente base líquido para tecidos coloridos, da maneira descrita no exemplo 9, e 8 diferentes marcadores sensíveis à protease (Tabela 5) foram usados. Além disso, dois pedaços de solo em cascalho (CFT-SBL) por lavagem foram colocados na rede de lavagem para evitar a contaminação por contato com as outras mostras. Os marcadores eram da CFT (Center For Testmaterials BV, Holanda). As amostras manchadas de 10 cm x 10 cm foram costuradas em toalhas de cozinha. Os parâmetros e condições do processo são descritos na tabela 6. A dosagem de enzimas usadas nos experimentos foi calculada tanto para as atividades de enzima (ca. 0 - 14 unidades de atividade por mL de licor de lavagem) quanto para as quantidade de proteína (ca. 0 - 2,2 mg por litro de licor de lavagem). As atividades de protease e teores de proteína das preparações foram medidas da maneira descrita nos exemplos 6 e 9. Tabela 5. Marcadores sensíveis à protease usados no teste.

Tabela 6. Parâmetros e condições do processo

A avaliação do efeito da remoção de mancha baseou-se na medida da refletância (R 457 nm) com espectrofotômetro Datacolor com um filtro UV e foi calculada como efeito de remoção de mancha percentual (% SR):

Os resultados foram calculados como A % SR (delta %SR), que significa % SR do tecido tratado com enzima menos % SR de tratamento sem enzima (apenas detergente).

Duas lavagens contendo duas amostras de cada mancha foram realizadas com cada dosagem de enzima e três medições foram medidas a partir de cada amostra de mancha, assim, os valores baseiam-se em 12 medições por mancha, por produto.

Os resultados das eficiências da remoção total da sujeira (delta % SR) são mostrados nas figuras 14A-B e figuras 15 A-E. O efeito de remoção de mancha total baseou-se na soma dos resultados obtidos com as oito manchas diferentes sensíveis à protease (Manchas 1-8, a tabela foi maior com Fe_RF6318 comparada às preparações comerciais de protease Purafect® 4000L e Savinase® Ultra 16L, quando as proteases foram dosadas como quantidade de atividade e como proteína por volume de licor de lavagem (Figuras 14A-B). Fe_RF6318 foi eficiente especialmente em sangue/leite/tinta, chocolate/leite, óleo de amendoim/leite e gema de ovo (Figuras 15 A-E).

Um marcador de detergência geral (pigmento/óleo) foi usado como um controle em repetições em diferentes máquinas. Nenhuma diferença entre os vários testes foi observada.

EXEMPLO 12. Desempenho da proteína recombinante Fe_RF6318 em tampão de pH 9 em temperaturas de 10 °C a 60 °C

A proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 4) foi testada com relação à sua capacidade de remover mancha padrão de sangue/leite/tinta (Art.117, poliéster + algodão, EMPA Testmaterialen AG, Swizerland) em temperaturas de 10 a 60 °C. As preparações comerciais de protease Savinase® Ultra 16 L, Purafect® 4000 L e Properase® 4000 E e tratamento sem enzima (controle) foram usadas para comparação. Os testes foram realizados em tampão com pH 9 da maneira descrita no exemplo 6, com a exceção da faixa de temperatura de incubação ser mais ampla, o material manchado ser diferente e a temperatura de rinsagem com água das amostras ser similar à temperatura de lavagem. A cor das amostras após o tratamento foi medida com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* e o efeito de remoção de mancha foi calculado como AL* da maneira descrita no exemplo 6.

Os resultados são mostrados nas figuras 16A-F. A preparação de protease Fe_RF6318 mostrou maior capacidade de remoção de mancha ma faixa de temperatura completa a partir de 10 °C até 60 °C em tampão de pH 9, comparada às preparações comerciais de protease Savinase® Ultra 16L e Purafect® 4000L. Também mostrou maior capacidade de remoção de mancha na faixa de 30 °C a 60 °C comparada à Properase® 4000E.

EXEMPLO 13. Desempenho de proteína recombinante Fe RF6318 com detergente líquido em baixas temperaturas de lavagem a 10 °C e 20 °C

A proteína recombinante Fe_RF6318 produzida em Trichoderma (da maneira descrita no exemplo 2) foi testada com relação à sua capacidade de remover mancha padrão de sangue/leite/tinta (Art.117, algodão + poliéster, EMPA) com detergente base líquido em baixas temperaturas. O método de teste foi similar ao exemplo 9, com a exceção de que apenas a concentração de detergente de 3,3 g/L e menores temperaturas de incubação, 10 °C e 20 °C, foram usadas. A temperatura da água de rinsagem das amostras foi similar à temperatura de lavagem.

A cor das amostras após o tratamento foi medida com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* e o efeito de remoção de mancha foi calculado como AL* da maneira descrita no exemplo 6. Para o tratamento sem enzima (branco), a solução de detergente foi usada como licor de lavagem.

Os resultados obtidos com concentração de detergente base líquido de 3,3 g/L a 10 °C e 20 °C são mostrados na figura 17 A e B. A eficiência de Fe_RF6318 em mancha de sangue/leite/tinta foi consideravelmente maior tanto a 10 °C quanto a 20 °C comparada às preparações comerciais Savinase® Ultra 16L, Purafect® 4000L e Properase® 4000E, quando a mesma quantidade de atividade foi dosada. Os resultados destes testes indicam que a protease Fe_RF6318 apresenta excelente desempenho com detergentes líquidos temperaturas de lavagem muito baixas.

EXEMPLO 14. Ensaio de atividade de protease II

A atividade de protease foi ensaiada pelo método caseína de Folin-Ciocalteau usando caseína como um substrato. A taxa de degradação de caseína por uma protease foi medida por monitoramento espectrofotométrico da liberação de fragmentos solúveis em ácido como uma função do tempo. O substrato de caseína usado no ensaio foi preparado da maneira a seguir: 6 g de caseína Hammerstein Grade MP Biomedicals, LLC (101289) foram dissolvidos em 500 mL de Tris 30 mM, CaCl2 2,0 mM, MgCl2 0,7 mM, NaHCO3 2,5 mM. O pH da solução de substrato foi ajustado para 8,5 com HCl. As reações enzimáticas pararam usando solução de TCA 0,11 M. O reagente de Folin usado no ensaio foi preparado diluindo 25 mL de reagente fenólico de Folin-Ciocalteu 2N (SIGMA, F 9252) em 100 mL de água destilada. A reação iniciou primeiro incubando 2,5 mL da solução de substrato por 5 minutos a 50 °C, após o que 0,5 mL de solução de enzima foi adicionado e a reação foi conduzida por 30 minutos. Após 30 minutos de reação, 2,5 mL de solução de parada de reação foram adicionados, os conteúdos foram misturados e permaneceram naturalmente por 30 minutos em temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 4.000 rpm por 10 minutos (Hettich Rotanta 460). Um mL de sobrenadante limpo foi misturado com 2,5 mL de Na2CO3 0,5 M e 0,5 mL de reagente de Folin diluído. Após a lavagem por pelo menos 5 minutos (desenvolvimento da cor), a absorbância da mistura (cor) foi medida a 660 nm contra um branco. O branco foi preparado da maneira s seguir: 0,5 mL de solução de enzima foi misturado com 2,5 mL de solução de parada e 2,5 mL de substrato, e a mistura foi incubada por 30 min a 50 °C. Uma unidade de atividade de enzima foi definida como a quantidade de enzima que libera o produto de hidrólise de proteína solúvel em ácido correspondendo a 1 ,ug de tirosina por mL (ou g) da mistura de reação por minuto.

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Claims (31)

1. Preparação de enzima, caracterizadapelo fato de que compreende uma enzima protease de serina fúngica como definida na SEQ ID NO: 15, em que a preparação compreende ainda aditivos adequados selecionados do grupo de estabilizadores, tampões, agentes tensoativos, agentes alvejantes, mediadores, agentes anti-corrosivos, aglutinantes, agentes anti-redepositantes, branqueadores óticos, corantes, pigmentos, produtos cáusticos, abrasivos e conservantes ou suas combinações.

2. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a dita enzima é obtida de Fusarium equiseti.

3. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadapelo fato de que a dita enzima apresenta atividade de protease de serina e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:15.

4. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadapelo fato de que uma forma madura da dita enzima apresenta uma massa molecular entre 20 e 35 kDa.

5. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadapelo fato de que a temperatura ideal da dita enzima em pH 9 usando tempo de reação de 15 minutos e caseína como um substrato é de 30 °C a 70 °C.

6. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadapelo fato de que a dita enzima apresenta pH ideal a 50 °C, usando tempo de reação de 15 minutos e caseína como um substrato em faixas de pH de pelo menos pH 6 a pH 11.

7. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadapelo fato de que a dita enzima é capaz de degradar e remover corantes proteináceos na presença de detergente entre 10 °C e 60 °C.

8. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é codificada por uma sequência de polinucleotídeos isolada como definida na SEQ ID NO:14 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo.

9. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é codificada pela sequência de polinucleotídeos incluída em pALK2529, depositada em Escherichia coli RF7800 com o número de acesso DSM 22172.

10. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é produzida a partir de um vetor de expressão recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO:14 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo, operavelmente ligada às sequências regulatórias capazes de direcionar a expressão do gene que codifica protease de serina em um hospedeiro adequado.

11. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é produzida em um hospedeiro heterólogo.

12. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é produzida em um hospedeiro microbiano.

13. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é produzida em um hospedeiro do gênero Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortirella.

14. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é produzida em Trichoderma ou Aspergillus.

15. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita enzima é produzida em T. reesei.

16. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1 ou 15, caracterizada pelo fato de que a dita preparação compreende outras enzimas selecionadas do grupo de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, pectinase ou oxidase com ou sem um mediador.

17. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a dita preparação compreende um aditivo adequado selecionado do grupo de estabilizadores, tampões, agentes tensoativos, aglutinantes, agentes alvejantes, mediadores, agentes anti-corrosivos, agentes anti-redepositantes, substâncias cáusticas, abrasivos, branquadores óticos, corantes, pigmentos, e conservantes.

18. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a dita preparação de enzima está na forma de líquido, pó ou granulado

19. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 14, operavelmente ligada às sequências regulatórias capazes de direcionar a expressão do dito gene que codifica a protease de serina em um hospedeiro adequado.

20. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão recombinante, como definido na reivindicação 19, em que a célula é um fungo filamentoso.

21. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o dito hospedeiro é de um gênero Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium e Mortierella.

22. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o dito hospedeiro é Trichoderma ou Aspergillus.

23. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o dito hospedeiro é T. reesei.

24. Processo para produzir um polipeptídeo tendo atividade de protease de serina compreendida pela preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende as etapas de cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 20, e recuperar o polipeptídeo.

25. Processo para obter uma preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de protease de serina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de cultivar uma célula hospedeira, como definida na reivindicação 20, e tanto recuperar o polipeptídeo das células quanto separar as células a partir do meio de cultura e obter o sobrenadante.

26. Uso da enzima expressa pelo vetor como definido na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser para detergentes, para tratar fibras, para tratar lã, para tratar pelo, para tratar couro, para tratar alimento ou ração, ou para quaisquer aplicações que envolvem modificação, degradação ou remoção de material proteináceo.

27. Uso da enzima expressa pelo vetor como definido na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é como um aditivo de detergente.

28. Uso de uma preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser para detergentes, para tratar fibras, para tratar lã, para tratar pelo, para tratar couro, para tratar alimento ou ração, ou para quaisquer aplicações que envolvem modificação, degradação ou remoção de material proteináceo.

29. Uso de uma preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser como um aditivo de detergente.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de ser em líquidos detergentes.

31. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de ser em pós detergentes.

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