BRPI1002997A2 - sorgo sacarino transgÊnico com composiÇço de lignina alterada e processo de preparaÇço do mesmo - Google Patents

Abstract

SORGO SACARINO TRANSGÊNICO COM COMPOSIÇçO DE LIGNINA ALTERADA E PROCESSO DE PREPARAÇçO DO MESMO. A presente invenção fornece uma planta de sorgo sacarino, caracterizada pelo conteúdo de lignina e/ou composição de lignina alterada, em comparação com uma planta selvagem e isso é atingido pela manipulação da expressão de cafeoil-CoA-O-metiltransferase (CCoAOMT) no sorgo sacarino por incorporação de uma construção de silenciamento de gene, compreendendo uma sequência de DNA isolada, representada por SEQ ID NO 1.

Description

SORGO SACARINO TRANSGÊNICO COM COMPOSIÇÃO D^ f

ALTERADA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DO ME ^s

Dados do Pedido Relacionado

Este pedido é uma prorrogação parcial do Pedido Norte-Americano N2 12/545.699, arquivado em 21 de agosto de 2009, que é uma continuação sob 35 U.S.C. § 120 do Pedido de Patente Internacional Ns PCT/IB2008/000380, arquivado em 20 de fevereiro de 2008, que reivindica a prioridade ao Pedido de Patente Indiano N2 1481/ CHE/2006, arquivado em 21 de fevereiro de 2007. Essas divulgações são incorporadas no presente para referência em sua íntegra. Campo da Invenção

A presente invenção está no campo da biotecnologia e, mais particularmente, no desenvolvimento de uma planta tendo composição de Iignina alterada. Histórico e estado da técnica

O sorgo sacarino, Sorghum bicolor (L.) Moench é a única safra que fornece grão e caule, que podem ser usados para a produção de álcool, açúcar, xarope, combustível etc. O sorgo sacarino oferece as seguintes vantagens sobre as outras safras:

• O período de cultivo (aproximadamente 4 meses) e a exigência de água (8000m3 durante duas safras) são 4 vezes menores do que aqueles da cana de

açúcar (12 a 16 meses e 36000m3, respectivamente).

• O custo do cultivo de sorgo sacarino é 3 vezes menor do que a cana de

açúcar.

Semente propagada.

Adequado para produção de safra mecanizada.

·

O processo de produção de etanol a partir do sorgo sacarino é • 0&aí cia >., 2/29 ^

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amigavelmente ecológico, em comparação com aquele dos melaços. tu ^li., • A qualidade de queima do etanol é superior - menos enxofre do qy&a partir .xf da cana de açúcar e alta octanagem.

Vide a brochura do Instituto Internacional de Pesquisa de Safras para Trópicos Semi-Áridos (ICRISAT), "Sorgo Sacarino: Safra de Alimentos, Ração, Forragem e Combustível", publicado em 2006.

Mas a preocupação primária para uso dessa planta é a presença de lignina, que afeta adversamente o processo de extração de materiais benéficos. Apesar do suco açucarado, o caule oferece grande potencial para produção de biocombustível. Entretanto, devido à presença de lignina, assim como em outras plantas de cultivo, afeta a separação dos açúcares disponíveis, como xilose, arabinose, glicose etc.

A lignina é um polímero fenilpropanóide complexo. As plantas compreendem aproximadamente 25-30% de lignina com base no peso seco. A lignina é primariamente depositada nas paredes celulares de tecidos de suporte e condutivos, como fibras e elementos traqueais. A rigidez mecânica da lignina fortalece esses tecidos de maneira que os elementos traqueais podem suportar a pressão negativa, gerada a partir da transpiração sem colapso do tecido.

Entretanto, a lignina é desfavorável em vários outros aspectos. A lignina diminui a digestibilidade de safras de forragem animal e deve ser removida durante o processo de celulose e produção de papel, que exige o uso de produtos químicos, nocivos ao meio-ambiente. A lignina também parece ter um impacto negativo na utilização de biomassa de planta e árvore.

A lignina é considerada como polimerizada de forma desidrogenativa a partir dos monolignóis álcool p-coumaril, álcool coniferil e álcool sinapil. Esses monolignóis são sintetizados através da via fenilpropanóide. Estruturalmente, esses monolignóis ^ptvaI * 3/29 &

> ^ Or1 %

diferem apenas pelo grupo metóxi nas posições 3C e 5C do anel ai^afioQ./^·^. £ Proporção variante dos monolignóis determina o tipo de Iignina como Iignina A Iignina G oferece mais resistência do que a S durante sacarificação enzimática. As Iigninas G são mais condensadas devido a mais quantidades de ligações intermoleculares, dessa forma, mostrando mais resistência.

Portanto, é desejável desenvolver uma planta de sorgo sacarino com composição de Iignina alterada, composição esta compreendendo mais de Iignina S e menos de Iignina G, conforme comparada com a selvagem. A fim de atingir isso, é também exigido que a planta modificada deva ter mais conteúdo de biomassa e sua arquitetura bioquímica seja favorável para processamento downstream.

Diversas abordagens foram realizadas para diminuir ou alterar a composição de conteúdo de Iignina para aumentar a razão S/G. Entretanto, os resultados foram considerados como sendo contraditórios, possivelmente devido à falta de compreensão da via biossintética da Iignina e devido a abordagens adequadas inapropriadas para regulação descendente da atividade enzimática biossintética da lignina, incluindo escolha do promotor do transgene usado, construção de cassetes e tudo acima exposto, seleção de transformantes. A regulação das enzimas de etapas iniciais, como fenilalanina amônia-liase, cinamato 4-hidroxilase, 4- hidroxicinamato CoA ligase, reduziu o conteúdo de lignina. Entretanto, esta leva a efeitos pleiotrópicos, incluindo forma da folha alterada, lesão fluorescente localizada, crescimento interrompido, atividade de pólen reduzida, morfologia da flor alterada e pigmentação, nível reduzido de fenilpropanóides solúveis, diminuição na razão S/G etc. (Elkind et al, 1990; Bate etal, 1994; Sewalt et al, 1997). Efeitos semelhantes por outros trabalhadores para alterar ou modificar a razão S/G resultaram em plantas fenotipicamente defeituosas. Demonstrou-se que a regulação descendente da 4/29 "Τ ο

atividade de ácido caféico O-metiltransferase poderia resultar em dfeifftérçgp ^ 5

- - *****

dramática na biossíntese de Iignina siringil, mas com pouco efeito na Iignina guaiacil, que é indesejada já que as últimas são mais resistentes à degradação química. Entretanto, até o momento, qualquer alteração na composição de Iignina no sorgo sacarino é realizada primariamente por gene COMT de regulação descendente.

É, portanto, interessante desenvolver uma planta de sorgo sacarino modificada tendo composição de Iignina alterada e bioquimicamente adequada para processamento downstream. A fim de atingir a mesma, o inventor tentou descobrir genes capazes de alterar a composição de Iignina na planta de sorgo sacarino e planta esta sendo suscetível à degradação enzimática fácil, em comparação com a planta de controle, bem como plantas de sorgo reguladas de forma descendente por COMT, geradas no presente estudo através de abordagem de silenciamento de gene semelhante. Resumo da invenção

A presente invenção é direcionada para uma seqüência de polipeptídeo capaz de alterar a composição de Iignina no sorgo sacarino. A regulação descendente do referido polinucleotídeo nas plantas de sorgo sacarino causa a formação de mais S-Iignina em comparação com G-lignina, maior conteúdo de açúcar livre e mostra melhores características morfológicas nas plantas modificadas, em comparação com a planta selvagem. Análise com base em computador da seqüência isolada revela uma similaridade com CCoAOMT das plantas artólogas. Entretanto, até o momento, nenhuma literatura divulga a presença de CCoAOMT e seu papel na modulação da composição de Iignina no sorgo sacarino. A seguir, a seqüência de polinucleotídeo é referida como SEQ ID NO 1, que possui 5/29 ^al ^ ^ Ν*

propriedades semelhantes ao CCoAOMT, cuja seqüência foi parc^lipènte^

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identificada. X

De acordo com um aspecto da invenção, uma seqüência de polinucleotídeo isolada é fornecida, onde a seqüência é obtida de Sorghum bicolor que codifica a Cafeoil-CoA-O-metiltransferase (CCoAOMT), e é representada pela SEQ ID NO 1. De acordo com alguns aspectos, o DNA pode ser cDNA.

Um aspecto adicional da invenção relaciona-se a uma construção de silenciamento de gene mediado por RNAi, compreendendo um fragmento adequado de ácido nucléico, representado pela SEQ ID NO 1, onde o ácido nucléico é operavelmente associado com um promotor, em que o fragmento de ácido nucléico está na orientação senso e antisenso de fragmento duplo e facilita a produção in vivo do RNAi a, no mínimo, uma porção de uma SEQ ID NO 1. Vetores compreendendo a construção são fornecidos em um aspecto adicional da invenção e em alguns aspectos da invenção, o vetor pode ser um vetor pUC18. Um aspecto adicional da invenção relaciona-se com os primers diretos e

reversos, representados pela SEQÜÊNCIA ID NO 3 e 4. Os primers são úteis na amplificação de CCoAOMT.

De forma surpreendente, descobriu-se que a regulação descendente da SEQ ID NO 1 no sorgo sacarino resulta em uma planta que é superior às plantas, obtidas por COMT de regulação descendente com relação à biomassa, amido e conteúdo de açúcar livre e propriedades fenotípicas. Descrição breve das Figuras

Figura 1: Crescimento elevado da planta TO de sorgo transformada tipo anti- CCoAOMT (direita) em comparação com a planta de controle (esquerda). Figura 2: Crescimento elevado de sorgo transgênico (planta T1) com gene do 6/29 <1α Λ tipo CCoAOMT regulado de forma descendente, representado pela SEQ^O^O 1 no % campo. ^

Figura 3: Panícula da planta de controle (esquerda) e planta transforníàdffl^èf gene do tipo CCoAOMT (direita).

Figura 4: Variação no tamanho da semente em plantas anti-CCoAOMT (esquerda) em comparação com as plantas de controle (direita) Figura 5: Construções anti-CCoAOMT mediadas, de fragmento duplo que facilitaram a produção in vivo específica de RNAi contra gene CCoAOMT endógeno. Figura 6: Seleção de plantas por amplificação por PCR de genes marcadores de linhagens transformadas de COMT e CCoAOMT.

Figura 7: Análise por Southern das progênies Ti de CCoAOMT juntamente com as respectivas transformantes T0 e uma planta de controle mostrando herança dos transgenes integrados. Descrição detalhada da presente invenção Conformemente1 a presente invenção fornece uma planta de sorgo sacarino,

cacterizada pela composição de Iignina alterada, em comparação com uma planta selvagem e isso é atingido por regulação descendente da expressão de polinucleotídeo, representado pela SEQ ID NO 1 no sorgo sacarino.

Um dos aspectos da invenção é o silenciamento de gene mediado por RNAi do gene endógeno, representado pela SEQ ID NO 1, tal que quando o ácido nucléico exógeno é transcrito, a atividade da SEQ ID NO 1 endógena é regulada de forma descendente.

Fornecido aqui também está um processo de produção de uma planta de sorgo sacarino modificada que possui composição de Iignina alterada. O referido processo compreende a transfecção de uma célula da planta com cassetes de λο^'Λ <k/i 7/29 -^v

silenciamento de gene mediado por RNA de fragmento duplo (dsRN^^tiá^T^.^ Je

seqüência de nucleotídeo representada na SEQ ID NO 1 que facilita a

vivo de RNAi contra o gene endógeno e associada com o conteúdo reduzido de G-

Iignina em comparação com a planta selvagem.

Duas linhagens transgênicas foram desenvolvidas, uma com anti-COMT e

outra com anti-SEQ ID NO 1, e a planta transformada anti-SEQ ID NO 1 mostrou características fenotípicas desejáveis, bem como benéficas como crescimento elevado, forma da panícula, quantidade elevada de semente por panícula, tamanho e peso elevados e, dessa forma, fornece mais biomassa como matéria-prima para uso downstream e maior conteúdo de amido e açúcar livre, em comparação com a planta transformada anti-COMT. As plantas transformadas com construções anti- COMT e anti-SEQ ID NO 1, doravante, denominadas como "Planta C" e "Planta T", respectivamente.

A modificação genética do sorgo sacarino com SEQ ID NO 1 tem uma implicação de longo alcance. O uso proposto da biomassa de sorgo seria no processo de fermentação. No processo de fermentação, é muito importante ter biomassa com alto conteúdo de açúcar e preferivelmente açúcar solúvel. É pertinente mencionar aqui que mediante a análise morfológica e bioquímica da planta de sorgo modificada, um aumento substancial na biomassa e no conteúdo de celulose foi observado.

Busca por um novo gene no sorgo sacarino, capaz de alterar a composição de lignina:

A] Isolamento do RNA total do caule de Sorgo maduro por método de fenol quente:

1mg de caule de sorgo fresco foi coletado e picado em pedaços pequenos e moídos

AC^aI Cfi Λ f yi

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no almofariz com pilão na presença de nitrogênio líquido até ficar em pó.

de polivinilpirrolidona (PVP) e 200μΙ de β-mercapto etanol (β-ΜΕ) foram adia%ia<^%^

com o pó. Tampão de extração de RNA a 5ml e fenol saturado a 5ml misturados previamente e aquecidos em banho-maria a 80°C foram adicionados ao pó, bem misturados e deixados para descongelar. A amostra descongelada, então, transferida em um tubo de centrífuga e aquecida em banho-maria a 80°C durante 20 minutos. O tubo foi mantido em temperatura ambiente durante 5-10 minutos e 5ml de clorofórmio foram adicionados e o tubo foi turbilhonado muito bem. Então, o tubo foi centrifugado a 10.OOOrpm durante 10 minutos em temperatura ambiente, o sobrenadante foi coletado em um tubo corex. 1/10 do volume de Na-acetato e 2 volumes de etanol resfriado foram adicionados ao tubo e deixados precipitarem a -20°C durante a noite. No dia seguinte, o tubo corex foi centrifugado a 10.OOOrpm durante 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi seca em ar. A pelota foi dissolvida em 1ml de água tratada com DEPC e distribuída em dois tubos microfuge. Volume igual de fenol saturado adicionado, agitado gentilmente e centrifugado a 10.OOOrpm durante 5 minutos e o sobrenadante foi coletado. A etapa de fenol foi repetida até o sobrenadante se tornar claro. Seguida pela etapa de fenol, quantidade igual de clorofórmio foi adicionada e centrifugada a 10.OOOrpm durante 5 minutos, o sobrenadante foi coletado. 1/10 do volume de Na-acetato e 2 volumes de etanol resfriado foram adicionados ao tubo e deixados precipitarem a -20°C durante 1 hora. Foi, então, centrifugado a 10.OOOrpm durante 10 minutos e o sobrenadante foi descartado, a pelota foi lavada com 70% de etanol, bem seca e finalmente dissolvida em formamida e mantida em -70°C para preservação. Composição do tampão de extração de RNA (pH 8): LiCI-IOOmM TRIS-100 mM 9/29

EDTA-IOmM

SDS -1 %

Purificação de mRNA por matriz de oligo (dT) celulose:

100mg de oligo (dT) celulose foram suspensos em tampão de eluição a 1ml e mantidos em temperatura ambiente durante a noite. O tampão de eluição foi removido por centrifugação curta. A coluna foi equilibrada com 1ml de tampão de ligação. O tampão de ligação foi removido por centrifugação curta. 1mg de amostra de RNA em formamida foi precipitado na noite anterior e lavado com 70% de etanol, seco e dissolvido completamente em 1ml de tampão de ligação e aquecido a 65°C durante 5 minutos e rapidamente resfriado no gelo durante 5 minutos. Então, a amostra de RNA foi carregada na matriz de oligo-dT celulose. A ligação foi autorizada durante 30 minutos com agitação suave. Essa suspensão foi centrifugada por centrifugação curta. A coluna foi lavada 3 vezes durante 30 minutos cada com 1ml de tampão de lavagem para remover o tampão de ligação. Poli (A*) mRNA foi extraído duas vezes com 200μΙ de tampão de eluição, centrifugado a 13.000rpm durante 30 segundos. O pool eluído foi reajustado com 0,5M de NaCI adicionando- se NaCI conformemente. O procedimento completo foi repetido duas vezes mais a partir da etapa de adição de tampão de ligação à eluição. A amostra reunida re- ligada, re-lavada, re-eluída foi precipitada com 1/10 de volume de Na-acetato e 2,5 de volume de etanol durante 1 hora. A pelota foi lavada com 70% de etanol, seca e suspensa novamente em água tratada com DEPC. Composição dos tampões: a) Tampão de ligação de Oligo(dT): TRIS-HCI (pH 7,5) -10mM EDTA -1 mM NaCI - 500 mM

10/29

SDS - 0,5 %

b Tampão de lavagem de Oligo(dT):

TRIS-HCI (pH 7,5)-10mM NaCI-100 mM EDTA -1 mM

c) Tampão de eluição de Oligo(dT):

TRIS-HCI (pH 7,5)- 10 mM EDTA-ImM

Síntese de cDNA a partir de mRNA isolado de tecido do caule maduro:

Usando transcrição reversa, cDNA foi preparado a partir do mRNA, que foi isolado do sorgo sacarino. Um primer é enrijecido ao mRNA fornecendo uma extremidade 3' livre que pode ser usada para extensão pela enzima transcriptase reversa. A enzima é empregada no prolongamento de 5' a 3' comum, conforme direcionado pelo pareamento de base complementar com o modelo de mRNA para formar uma molécula híbrida, consistindo de um modelo de RNA de base de filamento pareado com o filamento de cDNA complementar. Após degradação do mRNA original, uma DNA polimerase foi usada para sintetizar o filamento de DNA complementar para converter o cDNA de filamento único em um cDNA duplo.

O cDNA completo desejado foi isolado usando PCR (reação em Cadeia da Polimerase) com primers degenerados, criados a partir da seqüência de aminoácido conservada do gene a partir do sistema de planta heteróloga, seguido por RACE 5' e 3' (Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA). O cDNA foi sintetizado com primer oligo(dT)i8 ancorado e primer hexâmero randômico usando kit de Reação de . üVi λ, 11/29

RT-PCR Padrão da Roche. Em um tubo estéril, sem nuclease, de paredfè £

\ ^

PCR no gelo, a mistura de primer modelo foi preparada para uma reação a^SOi^j^ adicionando-se os componentes na ordem listada abaixo. Mistura de primer modelo:

Componente Volu me Cone. final PoIi(A)+ mRNA 1 μΙ 10 ng de poli(A)+ mRNA Primer oligo(dT)i8 ancorado, 50ρηιοΙ/μΙ 1 μΙ 2,5 μΜ Primer hexâmero randoômico, 600ρηιοΙ/μΙ 2 μΙ 60 μΜ Água de grau de PCR 9 μΙ

Volumetotal 13 μΙ

A mistura de primer modelo foi aquecida durante 10 minutos a 65°C em um cycler de bloqueio térmico com uma tampa aquecida para desnaturar as estruturas secundárias. Imediatamente, o tubo foi colocado no gelo. Os componentes restantes da mistura de RT foram adicionados na ordem listada abaixo.

Componente Volume Cone. final Tampão de Reação de Transcriptase 4 μΙ 1X (8 mM de Reversa de Transcrição (5X) MgCI2) Inibidor Protetor de RNase, 401Ι/μΙ 0,5 μΙ 20 U Mistura de Desoxinucleotídeo, 10mM 2 μΙ 1mM cada cada Transcriptase Reversa de Transcrição, 0,5 μΙ 10 U U/μ I

Volume final 20 μΙ

Os reagentes foram misturados cuidadosamente e centrifugados brevemente e mantidos no cycler de bloqueio térmico durante 10 minutos a 25°C, seguido por 30 minutos a 55°C. A Transcriptase Reversa de Transcrição foi inativada através de aquecimento da mesma a 85°C durante 5 minutos. A reação foi interrompida , ^aidaAi SS -fOil

12/29 -HV

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colocando ο tubo no gelo. ^ Rmy

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Criação e síntese dos primers e amplificação por PCR: ^^

Dois primers 5' e 3' degenerados foram criados. Um local de BamHI no primer 5' e um local de EcoRI no primer 3' foram introduzidos para clonagem do fragmento amplificado por PCR. Análise de seqüência de aminoácido traduzida do fragmento amplificado mostrou identificação com o CCoAOMT heterólogo. As seqüências dos primers degenerados são:

Primer direto: 5' gaa ttc gga tcc a(c/t)c a(a/g)g a(a/g)g tng gnc a(c/t)a a 3' (SEQ ID NO 3)

Primer reverso: 5' gaa ttc (g/a)tt cca nag ngt (g/a)tt (g/a)tc (g/a)ta 3' (SEQ ID NO 4)

Etapas Ciclo total Temperatura (0C) Duração (min) Desnaturação primária 1 94 4 Desnaturação 94 0,4 Enrijecimento 58 0,4 Extensão 30 72 1 Extensão final 1 72 7

Clonagem do fragmento parcial de SEQ ID NO 1:

Tanto o fragmento amplificado por PCR quanto o vetor pUC18 foram digeridos com enzimas de restrição BamHI e EcoRI para clonagem já que foi introduzido nos primers. Tanto o vetor quanto o fragmento amplificado digeridos foram purificados por gel de agarose LMP. Os produtos purificados foram submetidos à ligação com T4 DNA ligase. Uma parte da mistura de ligação foi, então, transformada em células competentes DH10B e colocadas sobre ampicilina (100pg/ml). As colônias transformadas foram selecionadas. O DNA de plasmídeo recombinante foi isolado dos clones e sequenciado. O fragmento clonado foi, ainda, amplificado com primers específicos (SEQ ID NO 5 e 6) e digerido com BamHI e Sacl e unido em orientação senso-antisenso com a ajuda do Iigador arbitrário tendo locais de BamHI e Bglll. Esse fragmento senso e antisenso foi, então, colocado em . „ c.al da /> 13/29

um vetor binário sob um promotor adequado para gerar cassete induzido^c^sRMiI.^ g

—OL. £

para CCoAOMT para transformação mediada por Agrobactéria na planta. As seqüências dos primers específicos são:

Primer direto: 5' gaa ttc gga tcc cat cag gaa gta ggg cac aa 3' (SEQ ID NO 5) Primer reverso: 5' cc gag ctc gtt cca cag tgt gtt gtc ata 3' (SEQ ID NO 6) Isolamento da SEQ ID NO 1 de extensão completa:

A SEQ ID NO 1 de extensão completa foi isolada através de amplificação de extremidades 5' e 3' do cDNA de sorgo usando kit de 573' RACE de 2- geração em etapas. Os fragmentos foram, então, clonados e caracterizados. Os primers foram gerados a partir da seqüência de nucleotídeo identificada de SEQ ID NO 1 parcial. Clonagem da SEQID NO 1 no vetor TA:

O fragmento amplificado por PCR foi purificado por gel de agarose LMP e clonado nos vetores TA. Uma parte da mistura de ligação foi, então, transformada em células competentes DH10B e colocadas sobre ampicilina (lOOpg/ml). As colônias transformadas foram selecionadas e caracterizadas por sequenciamento. Caracterização dos clones e análise baseada em software dos clones sequenciados:

Clones brancos selecionados foram inicialmente caracterizados pelo isolamento do DNA de plasmídeo e digestão por restrição com BamHI e EcoRI para a presença da inserção. Então, três desses clones para cada fragmento foram sequenciados pelo método de sequenciamento Big Dye Terminator para confirmação adicional usando sistema analítico baseado em computador como análise de NCBI blast e alinhamento de Clustal W.

Seqüência de nucleotídeo conforme obtida a partir do resultado de sequenciamento: A seqüência do gene foi considerada como sendo de 759 bases. 14/29 \ Y ^Zv. ^ .2o V^

A seqüência de DNA de codificação do gene foi considerada como iniciá^cRjr^p^^.. g da base em 1 e terminando na base 759. A seqüência de nucleotídeo, d^vant|s%<ítv denominada SEQ ID NO 1 e é conforme segue: 5'-

ATGGCCGAAAACGGCGAAGAGCAGCAGGCGAACGGCAACGGCGAGCAGAAGA CCCGGCATCAGGAAGTAGGGCACAAGAGCCTGCTCAAGAGCGACGAGCTCTAC CAGTACATCCTGGACACGAGCGTGTACCCGCGGGAGCCGGAGAGCATGAAGG AGCTCCGCGAGATCACCGCCAAGCACCCATGGAACCTGATGACGACCTCCGCC GACGAGGGGCAGTTCCTCAACATGCTCATCAAGCTCATCGGCGCCAAGAAGAC CATGGAGATCCGCGTCTACACCGGCTACTCCCTCCTTGCTACTGCCATGGCTCT TCCCGATGATGGCAAGATTCTAGCTATGGATATTAACCGGGAAAACTACGAGAT TGGTCTTCCAGTGATTGAAAAGGCTGGACTGGCCCACAAGATCGACTTCCGCGA GGGCCCCGCGCTCCCCGTCCTCGACGACCTCATCGCCGACGAGAAGAACCAC GGGTCGTTCGACTTCGTCTTCGTGGACGCCGACAAGGACAACTACCTCAACTAC CACGACCGGCTGCTCAAGCTGGTGAAGCTGGGGGGCCTCATCGGCTATGACAA CACACTGTGGAACGGGAGCGTCGTGCTGCCCGACGACGCCCCGATGCGGAAG TACATTCGCTTCTACCGCGATTTCGTCCTCGTCCTGAACAAGGCGCTCGCGGCG GATGATCGCGTCGAGATCTGCCAGCTCCCCGTCGGTGACGGTGTGACGCTGTG CCGGCGCGTCAAGTGA - 3' (SEQ ID NO 1) Análise baseada no computador da seqüência para caracterização adicional:

A seqüência de DNA foi, então, traduzida para obter a seqüência de aminoácido usando o software Jellyfish. A seqüência traduzida é: MAENGEEQQANGNGEQKTRHQEVGHKSLLKSDELYQYILDTSVYPREPESMKELR EITAKHPWNLMTTSADEGQFLNMLIKLIGAKKTMEIRVYTGYSLLATAMALPDDGKIL AMDINRENYEIGLPVIEKAGLAHKIDFREGPALPVLDDLIADEKNHGSFDFVFVDADK 15/29 y p]g zf H Hub.""^j9k

DNYLNYHDRLLKLVKLGGLIGYDNTLWNGSWLPDDAPMRKYIRFYRDF^VLKmy^'

jiuV "*<

AADDRVEICQLPVGDGVTLCRRVK* (SEQ ID NO 2) "

Essa seqüência de aminoácido traduzida foi, então, submetida à análise de blasto usando blastP em NCBI e homologia máxima foi encontrada com seu CCoAOMT relativo próximo de Zea mays. Dessa forma, a seqüência foi analisada, adicionalmente, com relação à homologia com as isoformas de CCoAOMT de milho, disponíveis no banco de dados Genbank usando software de Clustal W (mostrado abaixo) e revelou 95% de identificação com a isoforma CCoAOMT de milho. CCoAOMTI de Milho

------MATTATEAAPAQEQQANGNGEQKTRHSEVGHKSLLKSDDLYQYILDTSVYPRE

P (SEQ ID NO 7) CCoAOMT de Sorgo

------------MAENGEEQQANGNGEQKTRHQEVGHKSLLKSDELYQYILDTSVYPREP

(SEQ ID NO 8) CoAOMT2 de Milho

MATTATEATKTTAPAQEQQANGNGNGEQKTRHSEVGHKSLLKSDDLYQYILDTSVY PREP (SEQ ID NO 9) CCoAOMT de Arroz

—MAEAASAAAAATTEQANGSSGGEQKTRHSEVGHKSLLKSDDLYQYILETSVYPR EH (SEQ ID NO 10)

CCoAOMTI de Milho

ESMKELREVTAKHPWNLMTTSADEGQFLNMLIKLIGAKKTMEIGVYTGYSLLATALA LPE (SEQ IDNO 11) CCoAOMT de Sorgo 16/29 ^ X iT' te. f

ESMKELREITAKHPWNLMTTSADEGOFLNMLIKLIGAKKTMEIRVYTGY^L^TA^^— | PD (SEQ ID NO 12) \ _

CCoAOMT2 de Milho

ESMKELREITAKHPWNLMTTSADEGQFLNMLIKLIGAKKTMEIGVYTGYSLLATALAL PE (SEQ ID NO 13) CCoAOMT de Arroz

ECMKELREVTANHPWNLMTTSADEGQFLNLLLKLIGAKKTMEIGVYTGYSLLATALAI PD (SEQ ID NO 14)

* λ*****.**.*****************.*.*********** ***********.*.*.

CCoAOMTI de Milho

DGTILAMDINRENYELGLPCIEKAGVAHKIDFREGPALPVLDDLIAEEKNHGSFDFVF VD (SEQ ID NO 15) CCoAOMT de Sorgo

DGKILAMDINRENYEIGLPVIEKAGLAHKIDFREGPALPVLDDLIADEKNHGSFDFVFV D (SEQ ID NO 16) CCoAOMT2 de Milho

DGTILAMDINRENYELGLPCINKAGVGHKIDFREGPALPVLDDLVADKEQHGSFDFA FVD (SEQ ID NO 17) CCoAOMT de Arroz

DGTILAMDINRENYELGLPSIEKAGVAHKIDFREGPALPVLDQLVEEEGNHGSFDFVF VD (SEQ ID NO 18)

CCoAOMTI de Milho

ADKDNYLNYHERLLKLVKLGGLIGYDNTLWNGSWLPDDAPMRKYIRFYRDFVLVLN KAL (SEQ IDNO 19) . ,y^al dí- jr, 17/29 7 Jft.^ %

& Rub- '^(A^- U-

CCoAOMT de Sorgo % £

ADKDNYLNYHDRLLKLVKLGGLIGYDNTLWNGSWLPDDAPMRKYIRFYRDF^VO^ KAL (SEQ ID NO 20) CCoAOMT2 de Milho

ADKDNYLNYHERLLKLVRPGGLIGYDNTLWNGSWLPDDAPMRKYIRFYRDFVLAL NSAL (SEQ ID NO 21) CCoAOMT de Arroz

ADKDNYLNYHERLMKLVKVGGLVGYDNTLWNGSWLPADAPMRKYIRYYRDFVLEL NKAL (SEQ ID NO 22)

JQ **********.**.***. ***.************** *********.****** ** **

CCoAOMTI de Milho AADDRVEICQLPVGDGVTLCRRVK (SEQ ID NO 23) CCoAOMT de Sorgo AADDRVEICQLPVGDGVTLCRRVK (SEQ ID NO 24) CCoAOMT2 de Milho AADDRVEICQLPVGDGVTLCRRVK (SEQ ID NO 25)

CCoAOMT de Arroz AADHRVEICQLPVGDGITLCRRVK (SEQ ID NO 26)

***************.*******

Avaliando o papel da SEQ ID NO 1 no sorgo sacarino:

A seqüência foi, então, submetida à NCBI blast para identificação de sua semelhança com a seqüência disponível no banco de dados e considerada como altamente idêntica (97% de identificação) com uma proteína hipotética de sorgo. Apesar de essa proteína hipotética ter sido considerada semelhante ao gene CCoAOMT, mas sua funcionalidade ainda não foi testada. Dessa forma, realizamos uma abordagem para estabelecer o efeito do gene isolado, já que a seqüência de nucleotídeo de um gene é mais importante do que sua funcionalidade na estratégia antisenso, em regulação descendente de CCoAOMT in-planta. Preparações de Construção compreendendo SEQID NO 1: Promotor: A transcrição de DNA em mRNA é regulada por uma região referida como o promotor. A região de promotor contém seqüência de bases ^iTeTijVi'

18/29

sinaliza a RNA polimerase para associá-la com DNA e iniciar a transcrição de mRNA usando um dos filamentos de DNA como um modelo para criar um filamento de RNA complementar correspondente. Já que a região 5' do filamento de RNA é complementar à região 3', esta gerará um RNA de filamento duplo, que subseqüentemente será degradado usando maquinário responsável para a produção de RNA de curta interferência (RNAi). A seqüência promotora inclui a seqüência de consenso com caixa TATA (TATAAT (SEQ ID NO 27)), que é comumente par de base 20-30 (bp) upstream (por convenção -30 a -20bp relativa ao local de início de transcrição) do local de início da transcrição. A caixa TATA é o único elemento promotor upstream que tem uma localização relativamente fixa com relação ao ponto de início. A seqüência de consenso com caixa CAAT está centralizada em -75, mas funciona em distâncias que variam consideravelmente do ponto de início e em qualquer uma das orientações. Outro elemento promotor comum é a caixa GC em -90, que contém seqüência de consenso GGGCGG (SEQ ID NO 28). Esta pode ocorrer em múltiplas cópias e em qualquer uma das orientações. Outra seqüência que confere máxima eficiência pode também ser encontrada na região do promotor. Nas combinações de promotor e gene estrutural, o promotor está preferivelmente posicionai aproximadamente na mesma distância do local de início da transcrição heteróloga já que é do local de início de transcrição em seu cenário natural. O promotor pode ser constitutivo ou induzível.

O promotor da ubiqutina do milho usado na presente investigação mostrou ser altamente ativo e constitutivamente expressado em muitos tecidos. Este contém o primeiro íntron do gene da ubiquitina do milho para expressão seletiva em plantas. 19/29 % 7' 1

O promotor foi clonado no vetor no local Hindlll/BamHI sob o qual o fr^i^i^^fe^ indução de dsRNA da SEQ ID NO 1 foi colocado. Um gene marcador seleá^s^l^ higromicina fosfotransferase, sob o promotor 2x 35s foi incluído para permitir a seleção de células de planta possuindo a construção desejada.

A geração de construção de dsRNA foi realizada através da junção da região

adequada do fragmento de cDNA desejado na orientação senso e antisenso através do ligador. Essa construção é introduzida em um vetor de expressão para transformação das plantas de sorgo para descobrir qual papel esta possui na via metabólica. O vetor preferivelmente contém uma origem procariótica de replicação, tendo uma ampla variação de hospedeiro. Um marcador selecionável deve também ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas que possuem a construção desejada. Marcadores selecionáveis procarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, como canamicina.

Outras seqüências de DNA que codificam funções adicionais podem também estar presentes no vetor, assim como é conhecido na técnica. Por exemplo, no caso de transformações de Agrobactéria, seqüência de T-DNA também serão incluídas para transferência subsequente para cromossomos de planta.

Para expressão na planta, um vetor binário foi usado no qual o gene de interesse pode ser introduzido. Os cassetes de expressão recombinantes conterão, além das seqüências desejadas, uma região de promotor de planta, um local de iniciação de transcrição e uma seqüência terminadora de transcrição. Local de enzima de restrição único nas extremidades 5' e 3' dos cassetes é tipicamente incluído para permitir a inserção fácil em um vetor pré-existente. Seqüências que controlam expressão genética eucariótica são bem conhecidas na técnica. Geração de plantas transgênicas: 20/29 ^ \ Duas linhagens transgênicas foram desenvolvidas. As plantas tran^^^aíJatSK,,. ^

A ""^-SL

com construções anti-COMT, doravante, denominadas como "Planta CH^planta^R tendo anti-SEQ ID NO 1 denominadas como "Planta Τ". A planta T mostrou características fenotípicas desejáveis, bem como benéficas como crescimento elevado, forma da panícula, quantidade elevada de semente por panícula, tamanho e peso elevados e, dessa forma, fornece mais biomassa como matéria-prima para uso downstream.

Transformação de sorgo sacarino (Sorghum bicoloi)'.

Superfícies de semente, esterilizadas com Tween 20 (5min) e cloreto de mercúrio a 0,2% (7min) foram lavadas com água destilada estéril. Então, as sementes foram incubadas em papel filtro estéril, embebido com água destilada estéril em placas de Petri. Após 3 dias de incubação no escuro, os ápices caulinares gerados foram removidos e infectados com meio de infecção tendo suspensão de Agrobactéría durante 20 minutos. Os tecidos das plantas foram inoculados em meio de co-cultivo e mantidos no escuro durante 3 dias a 25°C. Os tecidos das plantes foram ocasionalmente lavados com cefotaxima e água destilada para prevenir a contaminação bacteriana e transferidos em MS com 2mg/l de 2,4-D, 30mg/l de sacarose e 250mg/l de cefotaxima e mantidos no escuro durante 12 dias para formação de calo. A porção de calo nas extremidades de corte dos ápices caulinares foi removida e transferida para meio de regeneração com seleção de higromicina (MS com 30g/l de sacarose, 2mg/l de BAP e 2mg/l de higromicina) e mantidas em 2:1 condição periódica de claro/escuro a 28°C. Após 2 semanas, os calos verdes foram transferidos no mesmo meio contendo maior concentração de marcador de seleção (4mg/l de higromicina). Ápices obtidos foram transferidos no mesmo meio com maior concentração de higromicina (5mg/l) durante 2 meses com subcultivo Λ otvai da ^

ν'?/0 -fO.

τ -<-■·.

ν

periódico a cada 2 semanas. Ápices prolongados foram deixados erpá| j^giô^de..^ enraizamento para geração de raiz. Plântulas totalmente cultivadas foram fôfàjmente selecionadas em meio líquido de !4 MS com 6mg/l de higromicina. As plântulas geradas a partir de um calo único foram descritas como linhagem única.

A transformação mediada por Agrobactéria:

O processo de transformação mediado por Agrobactéria da invenção pode ser dividido em diversas etapas. As etapas básicas incluem uma etapa de infecção; uma etapa de co-cultivo; uma etapa de descanso opcional; uma etapa de seleção; e uma etapa de regeneração. Na etapa de infecção, as células a serem transformadas são isoladas e

expostas à Agrobactéria. Se as células alvo forem embriões imaturos, os embriões são isolados e as células entram em contato com uma suspensão de Agrobactéria. Conforme observado acima, a Agrobactéria foi modificada para conter um gene ou ácido nucléico de interesse. O ácido nucléico é inserido na região de T-DNA do vetor. Técnicas moleculares gerais usadas na invenção são fornecidas, por exemplo, por Sambrook et ai. (eds.) Clonagem Molecular: Um Manual Laboratorial, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y

A concentração de Agrobactéria usada na etapa de infecção e etapa de co- cultivo pode afetar a freqüência de transformação. De forma semelhante, concentrações muito altos de Agrobactéria podem danificar o tecido a ser transformado, como os embriões imaturos e resultar em uma resposta de calo reduzida. Dessa forma, a concentração de Agrobactéria útil nos métodos da invenção pode variar, dependendo da estirpe de Agrobactéria utilizada, o tecido a ser transformado, o genótipo de sorgo a ser transformado e semelhantes. Para otimizar o protocolo de transformação de uma linhagem ou tecido de sorgo .C Λ*' * ..'·.. 22/29 Ht. 2Λ Ό.

particular, o tecido a ser transformado, (embriões imaturos, por exemplo^pode*"^^4> incubado com várias concentrações de Agrobactéria. De forma semelhante, o nível de expressão do gene marcador e a eficiência de transformação podem ser avaliados para várias concentrações de Agrobactéria. Enquanto a concentração de Agrobactéria pode variar, geralmente a densidade ótica de 0,7 a 1,0 em 600nm foi usada na presente invenção.

O tecido a ser transformado é geralmente adicionado à suspensão de Agrobactéria em uma fase de contato líquida, contendo uma concentração de Agrobactéria para otimizar as eficiências de transformação. A fase de contato facilita o contato máximo das células/tecido a ser transformadas(o) com a suspensão de Agrobactéria. As células entram em contato com a suspensão de Agrobactéria durante um período de, no mínimo, 3 minutos a aproximadamente 15 minutos, preferivelmente aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 10 minutos, mais preferivelmente aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 8 minutos. A fase de contato líquida da etapa de infecção é realizada em uma solução

líquida de meios de MS juntamente com 68,5g/l de sacarose, 36g/l de glicose, 100μΜ de acetoseringona e pH ajustado para 5,2. Os outros meios usados nesta invenção são: Meios de co-cultivo (MS com 20g/l de sacarose, 10g/I de glicose, 2mg/ I de 2,4-D, 100μΜ de acetoseringona e 8,5g/l de ágar, pH 5,8), Meios de cultura bacteriana (meios YEP - Extrato de levedura - 10g/l, Peptona - lOg/l e Cloreto de Sódio - 5g/l), Meios de Infecção (MS com 68,5g/l de sacarose, 36g/l de glicose e 100μΜ de acetoseringona, pH 5,2), Meios de Regeneração (MS com 30g/l de sacarose, 2mg/l de BAP e 8,5g/l de ágar) e Meios de Enraizamento (A de MS com 20g/l de sacarose, 0,5mg/l de IAA e 0,5mg/l de NAA). Concentração de Agrobactéria durante a infecção 23/29 % 7' %

O.D de Agrobactéria - entre 0,7-1,0. ^ fi^b.- g

Λρ. a etapa de co-Cvo. oU ap*s a etaPa «e d™o, onde células transformadas são expostas à pressão seletiva para selecionar aquelas células que receberam e estão expressando polipeptídeo do ácido nucléico heterólogo, introduzido por Agrobactéria. Onde as células forem embriões, os embriões são transferidos para placas com meio sólido que inclui um antibiótico para inibir o crescimento da Agrobactéria e um agente de seleção. O agente usado para selecionar as transformantes selecionará o crescimento preferencial de tecidos das plantas, contendo, no mínimo, uma inserção de marcador selecionável, posicionada dentro do vetor binário superior e distribuída pela Agrobactéria.

Geralmente, qualquer um dos meios, conhecidos na técnica, adequados para a cultura do sorgo, podem ser usado na etapa de seleção, como os meios contendo sais do N6 ou sais do MS, suplementados com 30g/l de sacarose, 2mg/l de 2,4-D e mantidos no escuro durante 15 dias. Durante a seleção, os embriões são cultivados até formação de calo ser observada. Tipicamente, os calos crescidos no meio de seleção são deixados para crescer a um tamanho de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2cm de diâmetro.

Após os calos terem atingido o tamanho adequado, os calos são cultivos em meio de regeneração no escuro durante diversas semanas, geralmente aproximadamente 1 a 3 semanas para permitir que os embriões somáticos amadureçam. Os meios de regeneração preferidos incluem meios contendo meios de MS, suplementados com 30g/l de sacarose, 2mg/l de BAP e 8,5g/l de ágar. Os calos são, então, cultivados em meio de enraizamento em um ciclo claro/escuro até ápices e raízes de desenvolverem. Plântulas pequenas são, então, transferidas para tubos contendo meio de enraizamento e deixadas para crescerem e desenvolverem mais raízes aproximadamente mais uma semana. As plantas são, então, transplantado ρβι^ΐΜ- mistura de solo em potes na estufa.

24/29

Avaliação das linhagens transformadas, putativas, induzidas por dsRNA:

5

As transformantes T0 putativas dos transgenes indutores de dsRNA,

recuperadas através de seleção de higromicina, foram ainda avaliuadas por análise de PCR para confirmar a presença de gene resistente à higromicina. Dessa forma, uma análise de PCR foi realizada usando o DNA genômico, isolado dos indivíduos transformados, juntamente com planta de controle não transformada e um conjunto de primers específicos de gene (primer 5': atg aaa aag cct gaa ctc acc gcg acg tct e primer 3': gca tca gct cat cga gag cct gcg cga cgg). Uma amplificação de produto de aproximadamente 547 bp foi observada em todas as transformantes que indicaram a presença de gene resistente à higromicina. A amplificação foi considerada como ausente na planta de Sorgo não transformada. Dessa forma, seria esperado que o dsRNA incluindo cassetes de gene COMT e CCoAOMT podem ter inserido no genoma das transformantes T0 putativas, já que foi mantido ligado com o gene resistente à higromicina (hptll).

Análise de Southern das plantas transgênicas: A análise de Southern das plantas transgênicas foi realizada para verificar o modelo de integração, bem como a quantidade de cópia da construção de gene integrado. Para isso, o DNA foi insolado das plantas de controle, TO e T1. 10mg de DNA de cada uma das plantas foi digerido com Hindlll e executado em um gel de agarose a 1%. O gel foi, então, transferido para a membrana de Náilon (GE healthcare), ligado de forma cruzada e finalmente hibridizado com sondas de gene COMT e CCoAOMT, respectivamente (Figura 6 e 7). ^oaa/ Civ -ν \

25/29 OJ ^ S'

\ v^ v^ M

As progênies Τ1 foram produzidas a partir de sementes de autopolinaçib de "*·>& plantas TO. As sementes foram analisadas, permitindo que elas crescessem no meio basal contendo higromicina. Oito sementes foram encontradas como germinando sob higromicina. As mudas resistentes foram, então, deixadas para crescer a um estágio maduro em contenção. As plantas foram analisadas com relação à presença de gene de higromicina por PCR, usando dois primers específicos de gene. Finalmente, a análise de Southern das plantas transgênicas T1 foi realizada para verificar o modelo de integração, bem como a quantidade de cópia da construção de gene integrado e a integração única foi observada nas plantas transgênicas anti- SEQ ID NO 1, exceto em T1-1. Além disso, o modelo de integração foi considerado semelhante em todos os casos. A atividade de enzima nas plantas T1 foi considerada como sendo quase a mesma em comparação com a planta TO. Análise das atividades de enzima endógena em linhagens transformadas:

Atividades de enzima foram analisadas no tecido de sorgo sacarino transformado para avaliar a alteração da composição de lignina. Os resultados foram tabulados na Tabela 1. A Tabela 2 claramente indica que a regulação descendente de SEQ ID NO 1 resultou em uma redução no conteúdo de lignina. O resultou mostrou que o conteúdo de lignina no tecido do caule foi reduzido para aproximadamente 14% e 27% nas planta C e planta T, respectivamente. A Tabela 3 divulga a razão S/G nas plantas transformadas e também de controle. Os resultados mostraram que a razão S/G foi elevada em ambas as plantas. A alteração na razão S/G foi mais proeminente na planta T. Por isso, poderia se esperar que esse aumento na razão S/G facilita a extratabilidade dos materiais celulósicos de ambas as plantas transgênicas, particularmente da planta T. Tabela 1: Atividade de enzima no tecido do caule de plantas CeT: _

\

Atividade de

CCtSAOWT

Linhagens

Atividade de COMT

(pmol/seg/mg de proteína total) (pmol/seg/mg de proteína total)

Controle

4,8

14,3

Plantas C

2,3

15,3

Plantas T

4,6

4,9

Alteração nos parâmetros de crescimento de linhagens transgênicas:

As linhagens transgênicas mostraram alteração do crescimento quando comparadas com o controle. O incremento na altura da planta foi considerado como estando correlacionado com o aumento da altura internodal, bem como a quantidade de internodos. Diferente do crescimento vegetativo elevado, uma alteração também foi observada nos tamanhos da semente nas plantas transgências em comparação com a planta de controle. Esse aumento nos tamanhos da semente foi verificada através do peso da semente. O incremento foi considerado como sendo de - 45% sobre as sementes de controle.

Análise bioquímica das plantas de sorgo sacarino transformadas:

Análise de conteúdo de Iignina e composição nas plantas transgênicas por método químico:

A composição de Iignina com relação ao tipo G e S foi determinada por

derivatização, seguida por divisão redutiva (DFRC). Os produtos de degradação monomérica de Iignina foram identificados por análise de CG-FID, usando acetila, derivado do álcool coniferil e sinapil como padrão. A redução do conteúdo de Iignina total em comparação com o controle foi ~ 28% no caso de planta T. Mas a redução foi a um grau menor (~14%) na planta C. Tabela 2: Determinação da concentração de Iignina de caule de Sorgo traw^l usando o método Espectrofotométrico com Brometo de Acetila:

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- χαχ^'

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Tecido do caule Brometo de Acetila Conteúdo de Iignina (gm/kg de parede celular seca) Planta de controle 76,14 Planta C 65,65 Planta T 54,84

Tabela 3: Composição de Iignina do

ecido do caule de plantas CeT.

Planta de Sorgo Tipo S (%) Tipo G (%) Razão S/G Planta de controle 22,29 77,71 0,29 Plantas C 39,99 60,01 0,66 Plantas T 63,51 36,49 1,74

Estimativa de celulose:

Um segmento do caule (20mg por peso fresco) de plantas de controle e de

sorgo transgênicas foi coletado, congelado em nitrogênio líquido e moído a um pó fino. O pó foi tratado com 3ml de reagente acético/nítrico (10:1) em banho com água fervente durante 30 minutos, resfriado e, então, centrifugado durante 15-20 minutos. O sobrenadante foi armazenado para estimar o conteúdo de açúcar solúvel. A pelota foi lavada, tratada com ácido sulfúrico a 67% e deixada descansar durante 1 hora. A amostra tratada foi, então, diluída 15 vezes. 5ml de reagente de antrona foram adicionados a 1 ml da amostra tratada e não tratada, bem misturada, mantida em banho com água fervente durante 10 minutos, resfriada rapidamente e medida em O.D. 360nm. Os resultados foram expressados como uma média de três amostras em cada caso.

O conteúdo de carboidrato da semente e do tecido do caule foi estimado seguindo os protocolos descritos nos Métodos. Observou-se que o conteúdo de celulose foi elevado em 48% nas plantas C e em 36% nas plantas T (Tabela 4). É importante observar que apesar do maior conteúdo de celulose nas plantas C . . γίν'Λ· Qii /j 28/29 'C

7' Η*. '34 fc.

(Tabela 4), descobriu-se que ο açúcar solúvel aumenta mais significati^rf1íáiTte1.n^^' &

10 Λ.

η

-

r

plantas T (Tabela 5). Maior conteúdo de açúcar solúvel ajudaria no prõfe^sc^tftè?0 fermentação.

Tabela 4: Determinação do conteúdo de celulose no tecido do caule de sorgo Amostras Conteúdo de celulose

(mg/g de FW)

Controle 86

LinhagemAnti-COMT 127

Linhagem semelhante a Anti-CCoAOMT 117

Tabela 5: Determinação do conteúdo de açúcar solúvel no tecido do caule de sorgo Amostras Conteúdo de açúcar solúvel

_(mg/g de FW)_

Controle 10,3

Anti-COMTLinhagem 12,1

semelhante a Anti-CCoAOMT Linhagem 29,5

Estimativa de amido nas sementes:

As sementes foram homogeneizadas em etanol a 80% quente para remover o açúcar e centrifugadas. A pelota foi lavada repetidamente com etanol a 80% e, então, seca. A pelota foi tratada com 5ml de água e 6,5ml de ácido perclórico a 52% durante 20 minutos. O extrato foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi diluído 250 vezes. 5ml de reagente de antrona foram adicionados a 1ml da amostra, mantidas em banho com água fervente durante oito minutos e medida em O.D. 630nm. Os resultados foram expressados como uma média de três amostras em cada caso. AOiu* 4ΐ Λ 29/29 , ^

0 conteúdo de amido da semente e do tecido do caule foi estim^o èègjj|jnp^

tK v^cS

Η Λ ,Λ*

os protocolos descritos nos Métodos. Foi também observado que o corwèúftenPle amido nas sementes foi elevado em aproximadamente 20 e 30% nas plantas C e plantas T, respectivamente (Tabela 3). Poderia ser sugerido que o acúmulo de amido, diferente de outros componentes, pode ser responsável pelo aumento do peso da semente.

Tabela 6: Determinação do conteúdo de amido na semente

Amostras Peso Médio da Semente Conteúdo Médio de Amido

(mg) (mg/semente)

Controle 29,4 16,6

Linhagem Anti-COMT 38,3 20,2

LinhagemsemeIhanteaAnti-CCoAOMT 42,3 22,1

Durante todo esse pedido, várias patentes e publicações foram citadas. As divulgações dessas patentes e publicações na íntegra são, neste ato, incorporadas para referência neste pedido, a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.

Enquanto a presente invenção foi descrita para quais são consideradas, no momento, as configurações preferidas, a invenção não é, portanto, limitada. Ao contrário, a invenção é proposta para abranger várias modificações e arranjos equivalentes, incluídos no espírito e escopo da descrição detalhada fornecida acima.

Claims (7)

1. SEQÜÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLADA, CARACTERIZARÁ - ψϋ^ ser obtida do Sorghum bicolor, que codifica Cafeoil-CoA-O-metiltransferase (CCoAOMT), representada pela SEQ ID NO 1.

2. SEQÜÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLADA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo DNA ser cDNA.

3. CASSETE DE SILENCIAMENTO DE GENE, MEDIADO, DE DUPLO FILAMENTO, CARACTERIZADO por compreender um ácido nucléico, representado pela SEQ ID NO 1, ácido nucléico este que é operavelmente associado com um promotor, em que o fragmento de ácido nucléico está na orientação sense e antisense de fragmento duplo e facilita a produção in vivo do RNAi a, no mínimo, uma porção de uma SEQ ID NO 1.

4. PRIMERS DIRETO E REVERSO, CARACTERIZADO por serem representados pela SEQÜÊNCIA ID NO 5 e 6.

5. VETOR, CARACTERIZADO por compreender uma construção da reivindicação 3.

6. VETOR, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo vetor usado ser um vetor binário.

7. PLANTA TRANSGÊNICA, CARACTERIZADA por compreender um cassete da reivindicação 3.