BRPI1006628B1 - Método para produzir uma enzima lipolítica - Google Patents

Abstract

método para produzir uma enzima lipolítica a presente invenção fornece um método para produzir uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de: (i) fornecer uma célula de trichoderma reesei que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica que compreende a sequência de aminoácidos exibida como a seq id no: 3 ou seq id no: 4; e (ii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) dita enzima lipolítica.

Description

1/103 “MÉTODO PARA PRODUZIR UMA ENZIMA LIPOLÍTICA”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um método para produzir uma enzima lipolítica em Trichoderma reesei e a enzima lipolítica obtida a partir deste. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso do Trichoderma para expressar uma enzima lipolítica.

Antecedentes da Invenção [002] As lipases (CE 3.1.1.3), que podem ser definidas como carboxilesterases que catalisam a hidrólise de acilgliceróis, são enzimas muito importantes do ponto de vista fisiológico, sendo uma das três principais enzimas digestivas, juntamente com as amilases e proteases. Elas hidrolisam lipídeos em glicerol e ácidos graxos, mas também podem funcionar em reações de esterificação ou transesterificação.

[003] As lipases têm aplicações em diversos processos industriais, tais como processamento de óleos e gorduras, fabricação de detergentes, processamento de papel e fabricação de queijos e na indústria de panificação.

[004] A publicação WO 98/45453 divulga uma enzima lipolítica (e suas variantes) derivada do fungo filamentoso Aspergillus tubingensis. Esta enzima é por vezes referida como “lipase 3”. A publicação WO 98/45453 caracteriza várias características físico-químicas da lipase 3. Também são descritos os usos desta enzima lipolítica para melhorar as propriedades do pão, em particular para melhorar as propriedades do pão.

[005] A publicação WO 98/45453 também descreveu a clonagem e expressão da lipase 3 e suas variantes no Aspergillus tubingensis. Verificou-se que esta enzima lipolítica poderia ser superexpressa no Aspergillus tubingensis, no entanto, a enzima estava superglicosilada no A. tubingensis, o que, em algumas situações, pode diminuir sua atividade.

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2/103 [006] Há a necessidade de um método para a produção da lipase 3 e suas variantes e outras enzimas lipolíticas em escala comercial e usando hospedeiros de expressão que proporcionam altos níveis de expressão e rendimento da proteína. Além disso, há também uma necessidade de superar o problema de diminuição da atividade enzimática devido à superglicosilação da enzima lipolítica tal como observado, por exemplo, quando ela é superexpressa no A. tubingensis.

Descrição Resumida da Invenção [007] Foi surpreendentemente revelado que o Trichoderma reesei é um hospedeiro de expressão altamente eficiente para enzimas lipolíticas - especificamente para a lipase 3, suas variantes e outras enzimas lipolíticas.

[008] Assim, em um primeiro aspecto da presente invenção é fornecido um método de produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) fornecimento de uma célula de Trichoderma reesei compreendendo:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica, em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica com a sequência da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que

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3/103 codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes; e (ii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica.

[009] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um método de produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) transfecção ou modificação de uma célula de Trichoderma reesei com:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a

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4/103 complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes;

(ii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica.

[010] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um método de produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) transfecção ou modificação de uma célula de Trichoderma reesei com:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes;

(ii) repetindo a etapa (i) na célula para transfectar sequencialmente ou modificar a célula com pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga adicional conforme definido em (i)(a), (i)(b) ou (i)(c); (por exemplo, como uma

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5/103 sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que tem identidade de sequência, de pelo menos 40%, com a SEQ ID NO: 1 ou 2 ); e (iii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica.

[011] A presente invenção fornece ainda uma enzima lipolítica obtenível por um método da presente invenção.

[012] É também fornecido pela presente invenção, um produto alimentício para consumo humano compreendendo a dita enzima lipolítica que é obtenível por um método da presente invenção.

[013] A presente invenção fornece ainda uma célula de Trichoderma reesei transformada ou transfectada compreendendo:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma proteína enzima lipolítica possuindo pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica à sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes;

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6/103 [014] Em outro aspecto a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo:

(i) pelo menos uma sequência de nucleotídeos em que a dita sequência de nucleotídeos:

(a) codifica uma proteína enzima lipolítica possuindo pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) codifica uma enzima lipolítica e compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 40% de identidade de sequência com a sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica à sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sequências sob condições estringentes; e (ii) pelo menos um promotor de celobiohidrolase, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos mencionada está sob o controle do pelo menos um promotor de celobiohidrolase mencionado.

[015] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de uma célula de Trichoderma reesei na expressão de:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica, em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou

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7/103 uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica com a sequência da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica, em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica à sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes;

para melhorar um ou mais dos seguintes: expressão da enzima lipolítica, glicosilação da enzima lipolítica, atividade ou rendimento enzimático.

[016] Surpreendentemente, nós revelamos que o Trichoderma reesei é capaz de produzir as enzimas lipolíticas com rendimentos significativamente elevados.

[017] Além disso, revelamos que as enzimas lipolíticas produzidas pela metodologia da presente invenção surpreendentemente não estão superglicosiladas e, portanto, possuem boa atividade enzimática.

[018] Bradner et al. (Em Current Genetics, 44: 224-230, (2003)) utilizou o Trichoderma reesei como organismo hospedeiro para expressão em suas buscas por enzimas lipolíticas desconhecida anteriormente. Uma lipase a partir de um Penicillium allii isolado da Antártida foi clonada e expressa em Trichoderma reesei. Bradner et al. concluíram que os métodos descritos seriam úteis para a prospecção de genes de lipases potencialmente novos, mas nenhuma sugestão foi feita sobre o T. reesei poder ser utilizado para a superexpressão de proteínas.

[019] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) fornecimento de uma célula de Trichoderma reesei transformada ou transfectada compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos

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8/103 heteróloga que codifica uma enzima lipolítica;

(ii) cultivo das células em pH 4 a 5,5 em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica.

(iii) isolamento, purificação ou concentração da enzima em um meio com pH 5,5 a 6,5.

[020] Neste aspecto, a enzima lipolítica preferencialmente:

(a) compreende uma sequência de aminoácidos exibida como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2, e/ou (b) é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 40% de identidade de sequência com a sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica com a sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sequências sob condições estringentes.

Descrição Detalhada da Invenção [021] Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos heteróloga está operacionalmente conectada (diretamente ou indiretamente) a uma sequência promotora de tal forma que a sequência de nucleotídeos heteróloga esteja sob o controle da sequência promotora.

[022] A sequência promotora pode ser de qualquer promotor adequado - tal como um promotor que está naturalmente associado com a sequência de nucleotídeos que codifica a enzima lipolítica e/ou um promotor

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9/103 heterólogo, como uma sequência promotora de celobiohidrolase 1 ou o promotor de Tef ou promotor da glicoamilase. Outras sequências de promotores do Trichoderma derivados dos genes stp (número de série 12/193.614), cbh2, egll, egl2, gpdl, podem estar ligadas à sequência de nucleotídeos da enzima lipolítica.

[023] Para alguns exemplos de realização, a sequência de nucleotídeos que codifica a enzima lipolítica pode incluir um ou mais introns.

[024] Para alguns exemplos de realização, a sequência de nucleotídeos que codifica a enzima lipolítica é uma sequência genômica.

[025] Para alguns exemplos de realização, a sequência de nucleotídeos que codifica a enzima lipolítica é uma sequência de cDNA.

[026] O método da presente invenção pode compreender a etapa adicional de isolamento e/ou purificação e/ou recuperação da enzima lipolítica.

[027] Para alguns exemplos de realização o nível de enzima lipolítica expressa é alto o suficiente para que se possa utilizar o caldo do meio no qual a enzima foi secretada (de preferência após a remoção da(s) célula(s)) ou em uma forma concentrada (de preferência após a remoção da(s) célula (s)).

[028] Portanto, em um aspecto preferido, o método da presente invenção inclui a(s) seguinte(s) etapa(s) adicional(is) de isolamento e/ou purificação e/ou recuperação da enzima lipolítica.

[029] Em um aspecto mais preferido, o método da presente invenção inclui a(s) seguinte(s) etapa(s) adicional(ais) de remoção da(s) célula(s) a partir do meio (por exemplo, caldo) onde a enzima foi secretada.

[030] Em um aspecto mais preferido, o método da presente invenção inclui a(s) seguinte(s) etapa(s) adicional(ais) de remoção da(s) célula(s) a partir do meio (por exemplo, caldo) no qual a enzima foi secretada;

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10/103 e, em seguida, concentrando o meio.

[031] A(s) célula(s) pode(m) ser retirada(s) do meio através de técnicas de separação adequadas - por exemplo, técnicas de filtração adequadas e/ou técnicas de centrifugação adequadas. Um exemplo específico é o uso da ultrafiltração para preparar UFCs (concentrados por ultrafiltração).

[032] Em um exemplo de realização, o pH do meio de cultura é de cerca de pH 4 a cerca de pH 5,5, e preferencialmente cerca de pH 4.

[033] Em um exemplo de realização, o pH do meio de cultura é cerca de pH 4.

[034] Em um exemplo de realização preferido, antes do isolamento e/ou purificação e/ou concentração da enzima, o pH do meio é elevado no final da execução da fermentação quando níveis suficientes da enzima solúvel secretada são atingidos.

[035] Em um exemplo de realização, o pH do meio para o isolamento e/ou purificação e/ou concentração da enzima está acima de pH 5,5 a cerca de pH 6,5.

[036] Assim, em um exemplo de realização, o pH do meio de cultura é de cerca de pH 4 e em seguida o pH do meio é elevado de modo que o pH do meio para o isolamento e/ou purificação e/ou concentração da enzima está acima de pH 5,5 a cerca de pH 6,5.

[037] Assim, em um exemplo de realização, o pH do meio de cultura é de cerca de pH 4 e em seguida o pH do meio é elevado de modo que o pH do meio para o isolamento e/ou purificação e/ou concentração da enzima está acima de pH 6 a cerca de pH 6,5.

[038] Em um exemplo de realização preferido, o pH do meio para o cultivo é de cerca de pH 4,5 e em seguida o pH do meio é elevado de modo que o pH do meio para o isolamento e/ou purificação e/ou concentração da enzima seja de cerca de pH 6.

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11/103 [039] Preferencialmente, a célula de Trichoderma reesei é fornecida pela transformação desta com, ou é transformada com a sequência de nucleotídeos utilizando a eletroporação, tal como pela metodologia de eletroporação divulgada na publicação WO 2008/153712 A2.

[040] Em outro exemplo de realização, a célula de Trichoderma reesei pode ser fornecida pela transformação desta, ou pode ser transformada, com a sequência de nucleotídeos utilizando transformação por biobalística.

[041] Adequadamente, pode haver pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica a enzima lipolítica na célula de Trichoderma reesei. Em alguns exemplos de realização, deve haver duas ou mais cópias (ou seja, cópias múltiplas), ou cada sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção na célula de Trichoderma reesei. Por exemplo, em um exemplo de realização, pode haver pelo menos duas sequências de nucleotídeos que codifica a enzima lipolítica no Trichoderma reesei. Em outros exemplos de realização, pode haver pelo menos três, tal como pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam a dita enzima lipolítica. Adequadamente, pode ser de até cerca de seis, de preferência até cerca de sete, de preferência até cerca de oito, de preferência até cerca de dez sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam a enzima lipolítica na célula de Trichoderma reesei. Em alguns exemplos de realização, cada sequência de nucleotídeos heteróloga é associada e está sob o controle de um promotor. Adequadamente, cada sequência de nucleotídeos heteróloga pode ter um promotor separado associado a ela e estar sob o controle desse promotor. Os promotores podem ser iguais ou diferentes.

[042] Assim, em um exemplo de realização, a célula de Trichoderma reesei pode compreender ou ser transfectadas ou transformadas com pelo menos duas sequências de nucleotídeos heterólogas que codifica a

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12/103 enzima lipolítica. Em outro exemplo de realização, a célula de Trichoderma reesei pode compreender, ou ser transfectada ou transformada, com pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6 sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam a enzima lipolítica. Em um exemplo de realização, há até cerca de 6 sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção. Em alguns exemplos de realização, pode haver até cerca de 10 sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção. Em alguns exemplos de realização, cada sequência de nucleotídeos heteróloga está associada e sob o controle de um promotor. Adequadamente cada sequência de nucleotídeos heteróloga pode ter um promotor separado associado a ela e estar sob o controle desse promotor.

[043] Adequadamente, a sequência (ou cada sequência) de nucleotídeos heteróloga pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo sinal, em que tal sequência de nucleotídeos que codifica o dito peptídeo sinal está operacionalmente ligado a sequência de nucleotídeos que codifica a dita enzima lipolítica. Se houver várias sequências de nucleotídeos heterólogas e quando mais de uma possuir uma sequência sinal associada a esta, então as sequências sinais pode ser a mesma ou diferentes.

[044] Adequadamente a enzima lipolítica pode compreender um peptídeo sinal endógeno ou exógeno. Quando o peptídeo sinal é endógeno isso significa que o peptídeo sinal é aquele que está naturalmente ligado com a enzima lipolítica quando produzido naturalmente. Por exemplo, o peptídeo sinal pode ser o peptídeo sinal no Aspergillus tubingensis, que está naturalmente ligado com a enzima lipolítica quando encontrado no Aspergillus tubingensis.

[045] O termo “heterólogo” conforme utilizado no presente significa que é não ocorre naturalmente na célula de Trichoderma reesei. Em

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13/103 outras palavras, é exógeno para a célula de Trichoderma reesei. Por exemplo, o termo “sequência de nucleotídeos heteróloga” conforme utilizado no presente significa que a sequência de nucleotídeos não ocorre naturalmente na célula de Trichoderma reesei. Em outras palavras, a sequência de nucleotídeos é exógeno para a célula de Trichoderma reesei. O termo também inclui cópias múltiplas da sequência de ocorrência natural, como tal, várias cópias adicionais poderiam ser heterólogas.

[046] Em um exemplo de realização, a sequência de nucleotídeos heteróloga é preferencialmente obtida, ou é obtenível, a partir de um microrganismo, particularmente um fungo.

[047] Em um exemplo de realização, a sequência de nucleotídeos heteróloga é preferencialmente obtida, ou é obtenível, a partir do Aspergillus, particularmente o Aspergillus tubingensis.

[048] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um método de produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) fornecimento de uma célula de Trichoderma reesei compreendendo:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica, em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica com a sequência da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou

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14/103 (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes; e (ii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica; e em que a dita célula de Trichoderma reesei tem pelo menos dois genes que codificam enzimas não lipolíticas suprimidas.

[049] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um método de produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) transfecção ou modificação de uma célula de Trichoderma reesei com:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende

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15/103 uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes;

(ii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica; e em que a dita célula de Trichoderma reesei tem pelo menos dois genes que codificam enzimas não lipolíticas suprimidas.

[050] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um método de produção de uma enzima lipolítica compreendendo as etapas de:

(i) transfecção ou modificação de uma célula de Trichoderma reesei com:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 30% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de

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16/103 identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes;

(ii) repetindo a etapa (i) na célula para transfectar sequencialmente ou modificar a célula com pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga adicional conforme definido em (i)(a), (i)(b) ou (i)(c); (por exemplo, como uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos exibida como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que tem identidade de sequência, de pelo menos 40%, com a SEQ ID NO: 1 ou 2 ); e (iii) cultivo das células em condições que permitam a expressão da(s) dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) a dita enzima lipolítica; e em que a dita célula de Trichoderma reesei tem pelo menos dois genes que codificam enzimas não lipolíticas suprimidas.

[051] A presente invenção fornece ainda uma enzima lipolítica obtenível pelos métodos da presente invenção.

[052] É também fornecido pela presente invenção, um produto alimentício para consumo humano compreendendo a dita enzima lipolítica que é obtenível por um método da presente invenção.

[053] A presente invenção fornece ainda uma célula de Trichoderma reesei transformada ou transfectada compreendendo:

(a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma proteína enzima lipolítica possuindo pelo menos 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2; e/ou (b) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência de nucleotídeos exibida como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 40% de identidade de

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17/103 sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e/ou (c) pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica em que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica à sequência SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou a complementar a qualquer uma destas sob condições estringentes; e em que a dita célula de Trichoderma reesei tem pelo menos dois genes que codificam enzimas não lipolíticas suprimidas.

[054] Preferencialmente, há pelo menos a supressão de três genes que codificam enzimas não lipolíticas.

[055] Preferencialmente, há pelo menos a supressão de quatro genes que codificam enzimas não lipolíticas.

[056] “Suprimido” significa que a célula não expressa a enzima não lipolítica relevante no mesmo nível que uma célula não transformada/transfectada. Em alguns exemplos de realização, “suprimido” significa que a célula não expressa a enzima não lipolítica relevante. A supressão pode ser provocada por técnicas conhecidas no estado da técnica, tal como por deleções.

[057] Preferencialmente, pelo menos um dos genes que codifica uma enzima não lipolítica que está suprimido é um gene da celulase.

[058] Preferencialmente, pelo menos dois dos genes que codificam uma enzima não lipolítica que está suprimido são genes da celulase.

[059] Um exemplo de pelo menos um dos genes que codifica uma enzima não lipolítica que está suprimido é um gene que codifica uma celobiohidrolase (por exemplo, CBHI ou CBHII).

[060] Outro exemplo de pelo menos um gene que codifica uma enzima não lipolítica que está suprimido é um gene que codifica uma

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18/103 endoglucanase (por exemplo, EGI e EGII).

[061] Em alguns exemplos de realização, a célula de Trichoderma reesei da presente invenção é uma célula em que um ou ambos os genes de codificação de celobiohidrolase (CBHI e CBHII) e/ou um ou ambos os genes de codificação da endoglucanase (EGI e EGII) estão deletados ou interrompidos. Adequadamente a célula de Trichoderma reesei pode ser uma célula não geneticamente modificada (no-GMM) ou derivada desta, por exemplo, uma derivada da cepa RL-P37. Adequadamente a célula de Trichoderma reesei pode ser uma derivada da cepa RL-P37, que é produzida usando o método descrito no Exemplo 10.

[062] Em alguns exemplos de realização, a sequência de nucleotídeos heteróloga pode codificar uma enzima lipolítica compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; ou uma sequência compreendendo uma ou várias adições, deleções ou substituições de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 2.

[063] Em alguns exemplos de realização, a sequência de nucleotídeos heteróloga pode codificar uma enzima lipolítica e compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou uma sequência compreendendo uma ou várias adições, deleções ou substituições de nucleotídeos em comparação com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID No. 4.

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19/103 [064] Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma enzima lipolítica compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos, 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência compreendendo uma ou várias adições, deleções ou substituições de aminoácidos em relação a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[065] Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma enzima lipolítica e compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos, 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou uma sequência compreendendo uma ou várias adições, deleções ou substituições de nucleotídeos em relação a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

[066] As identidades de sequência de aminoácidos de uma série de enzimas lipolíticas para a lipase de Aspergillus tubingensis possuindo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 3 (também denominada de lipase 3 no presente) são apresentados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Enzimas Lipolíticas com a Identidade de Sequência para a Enzima Lipolítica de

Aspergillus tubingensis (Lipase 3).

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Lipases de diferentes fungos	N° De Acesso	% de identidade de sequência de aminoácidos
A. niger CBS 513.88	XP 001397501.1	93
Aspergillus niger	ABG73613.1	93
Aspergillus niger	ABG37906.1	93
Aspergillus nidulans FGSCA4	XP_681315.1	61
Aspergillus clavatus NRRL 1	XP_001276337.1	57
Neosartorya fischeri NRRL 181	XP_001266329.1	60
Aspergillus fumigatus Af293	XP_748138.1	59
Aspergillus oryzae RIB40	XP 001818694.1	56
Aspergillus terreus NIH2624	XP_001218444.1	54
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255	CAP96359.1	55
Aspergillus niger	ABG73614.1	54
Aspergillus niger	XP 001393532.1	53
Thermomyces lanuginosus	O59952.1	50
Penicillium marneffei ATCC 18224	XP_002147144.1	49
Aspergillus oryzae R	XP 001824529.1	44
Phaeosphaeria nodorum	XP 001796872.1	45

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Lipases de diferentes fungos	N° De Acesso	% de identidade de sequência de aminoácidos
SN15
Penicillium cyclopium	P61869.1	42
Penicillium camemberti.	1TIA A	42

[067] A célula hospedeira de Trichoderma reesei utilizada na presente invenção pode ser qualquer célula de Trichoderma reesei. A célula pode ser considerada como sendo uma célula de Trichoderma reesei do tipo selvagem. A célula de Trichoderma reesei pode ser uma em que o(s) gene(s) que codifica(m) uma ou mais celobiohidrolases secretadas (CBHI ou CBHII) foi(foram) deletados ou interrompidos para que não fossem expressos. Adequadamente a célula de Trichoderma reesei pode ser uma célula não geneticamente modificada ou derivada desta, por exemplo, uma derivada da cepa RL-P37. Adequadamente a célula de Trichoderma reesei pode ser uma derivada da cepa RL-P37, que é produzida usando o método descrito no Exemplo 10.

[068] A presente invenção pode ser realizada em um fermentador que pode compreender cerca de 3 litros a cerca de 20 litros de meio de cultura. Em outro exemplo de realização, a presente invenção é realizada como uma fermentação em escala de 10 a 16 litros, e preferencialmente de 14 litros. Em um exemplo de realização, a fermentação é preferencialmente realizada com mais de cerca de 12 litros, e preferencialmente mais do que cerca de 14 litros.

[069] A célula hospedeira de Trichoderma reesei é preferencialmente adequada para uso na fermentação em grande escala.

[070] Em exemplos de realização preferidos, a presente invenção é realizada em escala comercial. A este respeito, a fermentação da

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22/103 presente invenção é realizada em uma escala de fermentação de mais de 50.000 litros, preferencialmente uma escala de fermentação maior do que cerca de 80.000 litros, e preferencialmente uma escala de fermentação maior do que cerca de 200.000 litros.

[071] Em um exemplo de realização, a proteína total produzida pelo método da presente invenção é bem superior a cerca de 20 g/litro.

[072] Da proteína total produzida na presente invenção, a maior parte é a enzima lipolítica desejada. Em um exemplo de realização, a proteína total secretada produzida pelo método da presente invenção compreende pelo menos 50% da enzima lipolítica desejada. Em um exemplo de realização, a proteína total secretada produzida pelo método da presente invenção compreende pelo menos 60% da enzima lipolítica desejada. Em um exemplo de realização, a proteína total secretada produzida pelo método da presente invenção compreende pelo menos 70% da enzima lipolítica desejada. Em um exemplo de realização, a proteína total secretada produzida pelo método da presente invenção compreende pelo menos 80% da enzima lipolítica desejada.

[073] Adequadamente a presente invenção pode compreender a seleção de transformantes que foram selecionados para a produção da enzima lipolítica (produtores de grande quantidade da enzima desejada são preferencialmente selecionados).

[074] Em um exemplo de realização adequado, a presente invenção pode compreender uma primeira fase da transformação em que uma célula de Trichoderma reesei é transformada com pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica a enzima lipolítica definida no presente, a seleção de transformantes que foram selecionados para a produção da enzima lipolítica (produtores de grande quantidade da enzima desejada são preferencialmente selecionados), e uma segunda etapa de transformação (ou seja, etapa de retransformação) de um transformante

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23/103 selecionado com pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica a enzima lipolítica definida na presente invenção, seguido por outra etapa de seleção de novos transformantes que foram selecionados para a produção da enzima lipolítica (em que os produtores de grande quantidade da enzima desejada são preferencialmente selecionados).

[075] Em alguns exemplos de realização, a enzima lipolítica produzida pela presente invenção pode ser glicosilada. Em alguns exemplos de realização, a enzima lipolítica pode ser N-glicosilada no N32 (quando numeradas usando a SEQ ID NO: 2) ou em uma posição equivalente para outras enzimas lipolíticas de acordo com a invenção. Este aspecto pode dar vantagens significativas de modo que a atividade da enzima não é interrompida ou reduzida pela glicosilação da enzima. Sem querer se comprometer com a teoria, a redução na atividade da enzima lipolítica pode ser observada quando ela é produzida em outros hospedeiros, tais como A. tubingensis e acredita-se que isso ocorra devido ao excesso de glicosilação da enzima, pelo menos no sítio N242.

[076] A enzima lipolítica produzida pela presente invenção é, portanto, distinguível daquela a partir da qual a enzima lipolítica é produzida em outros hospedeiros, por exemplo, A. tubingensis, por causa do grau de glicosilação da enzima, particularmente no sítio N32. Em alguns exemplos de realização da presente invenção a enzima tem glicosilação, pelo menos, no sítio N32.

[077] Uma enzima lipolítica adequada pode ser produzida com um peptídeo sinal. Em outras palavras, a sequência de nucleotídeos heteróloga à utilizada na presente invenção compreende uma parte dela que codifica um peptídeo sinal.

[078] O peptídeo sinal pode ser usado para direcionar a secreção da enzima lipolítica através de uma membrana celular específica. As

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24/103 sequências de peptídeo sinal podem ser endógenas ou exógenas para a sequência que codifica a enzima lipolítica. Por exemplo, o peptídeo sinal pode ser o peptídeo sinal que é endógena para a enzima lipolítica do Aspergillus tubingensis. Alternativamente, a sequência de codificação do peptídeo sinal pode ser obtida (ou é obtenível) a partir de um gene de celobiohidrolase de Trichoderma reesei.

[079] No entanto, pode ser usada qualquer sequência de codificação do peptídeo sinal de escolha capaz de direcionar a enzima lipolítica expressa na via de excreção de uma célula de Trichoderma reesei.

[080] Quando nos referimos a melhorar um ou mais dos seguintes: expressão da enzima lipolítica, glicosilação da enzima lipolítica, atividade enzimática e/ou rendimento este é comparado com métodos convencionais de expressão desta enzima lipolítica. Por exemplo, na presente invenção é fornecida uma expressão melhorada da enzima lipolítica, glicosilação da enzima lipolítica, atividade enzimática e/ou rendimento em comparação com a produção da enzima lipolítica em outro organismo hospedeiro (ou seja, um organismo hospedeiro que não o T. reesei). Especificamente, há uma expressão melhorada da enzima lipolítica, glicosilação da enzima lipolítica, atividade enzimática e/ou rendimento da enzima lipolítica pela presente invenção (ou seja, produzida na célula Trichoderma reesei) em comparação com a expressão da mesma enzima lipolítica em uma célula de Aspergillus tubingensis (por exemplo, conforme ensinado na publicação WO98/45453, incorporado ao presente pela referência).

[081] O termo “glicosilação melhorada” conforme utilizado no presente significa que, preferencialmente, a glicosilação ocorre no N32 (quando numeradas usando a SEQ ID NO: 2). Sem querer se comprometer com a teoria, em algumas situações, a enzima lipolítica produzida em células

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25/103 hospedeiras que não o T. reesei (e particularmente em Aspergillus tubingensis (por exemplo, conforme ensinado na publicação WO98/45453)) pode ser glicosilada (ou hiperglicosilada), particularmente no N242. Portanto, a enzima lipolítica produzida em células hospedeiras que não o T. reesei e particularmente em Aspergillus tubingensis (por exemplo, conforme ensinado na publicação WO98/45453) pode ser glicosilada tanto no sítio N32 quanto no N242. No entanto, e sem querer se comprometer com a teoria, o sítio N242 está na vizinhança de um dos resíduos de sítio ativo, ou seja, His258 da SEQ ID NO: 2. Assim, acredita-se que a glicosilação (ou hiperglicosilação) no sítio N242 pode levar a uma redução da atividade (ou seja, atividade da lipase) da enzima. A enzima lipolítica da presente invenção não possui essa redução na atividade. A glicosilação da enzima lipolítica da presente invenção pode ocorrer no sítio N32 que está distante dos resíduos de sítio ativo, tais como o His258.

[082] O termo “atividade enzimática melhorada” conforme utilizado no presente, significa que a atividade lipase é a mesma ou maior do que a atividade da enzima lipolítica produzida naturalmente pelo Aspergillus tubingensis.

[083] Por “atividade da enzima” queremos dizer, pelo menos, atividade de lipase. Atividade da enzima (atividade de lipase, por exemplo) pode ser mensurada utilizando os protocolos pertinentes estabelecidos abaixo na seção Exemplos.

[084] Foi surpreendentemente revelado que a enzima lipolítica produzida de acordo com a presente invenção é de fácil isolamento a partir do meio no qual ela foi excretada - ou seja, o caldo de cultura (fermentação) como níveis de expressão elevados são obtidos. A Figura 2 exibe um esquema para o método da presente invenção.

[085] Assim, de acordo com um aspecto preferido da presente invenção, o método da presente invenção pode envolver uma ou mais das

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26/103 seguintes etapas para o meio no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo celular: diluição do meio (de preferência com água); separação da(s) célula(s) a partir do meio; concentração do meio (preferencialmente quando o dito meio está livre de células); granulação do dito meio (preferencialmente quando o dito meio está livre de células).

[086] Em um aspecto preferido da presente invenção, o método da presente invenção envolve as seguintes etapas para o meio no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo celular: diluição do meio (de preferência com água); separação da(s) célula(s) a partir do meio; concentração do meio (preferencialmente quando o dito meio está livre de células); granulação do dito meio (preferencialmente quando o dito meio está livre de células).

[087] Em um aspecto preferido da presente invenção, o método da presente invenção envolve as seguintes etapas para o meio no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo celular: diluição do meio (de preferência com água); separação da(s) célula(s) a partir do meio; concentração do meio (preferencialmente quando o dito meio está livre de células); e granulação do dito meio (preferencialmente quando o dito meio está livre de células).

[088] Em um aspecto preferido da presente invenção, o método da presente invenção envolve as seguintes etapas para o meio no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo celular: diluição do meio com água; separação da(s) célula(s) a partir do meio; concentração do meio em que o dito meio está livre de células; granulação do dito meio em que o dito meio está livre de células.

[089] Em um aspecto preferido da presente invenção, o método da presente invenção envolve as seguintes etapas para o meio no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo celular: diluição do

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27/103 meio com água; separação da(s) célula(s) a partir do meio; concentração do meio em que o dito meio está livre de células; e opcionalmente a granulação do dito meio em que o dito meio está livre de células.

[090] De acordo com outros aspectos da presente invenção a enzima da presente invenção é então utilizada em um método para preparar um alimento ou um gênero alimentício destinado ao consumo humano, em que o dito método mistura a dita enzima com um alimento ou ingrediente de produto alimentício adequado. Preferencialmente, a dita enzima está no meio em no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo de célula. Preferencialmente o dito meio é livre de células (ou seja, a(s) célula(s) foi(foram) separada(s) do meio). Preferencialmente o dito meio é concentrado. Em alguns exemplos de realização, o meio é preferencialmente granulado.

[091] Preferencialmente a lipase é precipitada para fora da solução no caldo de fermentação. Preferencialmente, a lipase precipitada é resolubilizada pelo ajuste do pH. Preferencialmente, o pH é ajustado a um pH acima do pH do caldo de fermentação.

Vantagens [092] Além das vantagens mencionadas acima, outra vantagem da presente invenção é que ela permite a produção em escala comercial da enzima lipolítica. O método da presente invenção permite que a enzima lipolítica seja produzida em um alto rendimento.

[093] Uma vantagem da presente invenção é que foi surpreendentemente revelado que com ela é possível ir diretamente da etapa de transformação e etapa de seleção (ou seja, a partir da placa de microtitulação) para a fermentação em grande escala (por exemplo, fermentação de pelo menos 14 litros). Isto é surpreendentemente possível porque a etapa de seleção (particularmente os resultados da placa de microtitulação) é altamente preditiva do bom desempenho na fermentação em

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28/103 grande escala. Isto contrasta com os métodos convencionais, onde muitas vezes é necessário cultivar a cepa em frascos antes de ir para a fermentação em maior escala. Isto tem vantagens significativas na redução do tempo de produção e/ou simplificação do processo global e/ou redução de custos.

[094] Uma vantagem adicional da presente invenção é que ela fornece uma expressão maior/aumentada e/ou um rendimento melhorado da enzima lipolítica em comparação com métodos convencionais de expressão desta enzima lipolítica. Por exemplo, na presente invenção é fornecida uma expressão maior/aumentada e/ou com melhor rendimento da enzima lipolítica em comparação com a produção da enzima lipolítica em outro organismo hospedeiro (isto é, um organismo hospedeiro que não o T. reesei). Em particular, existe uma expressão aumentada e/ou um rendimento melhorado da enzima lipolítica pela presente invenção (ou seja, produzida na célula de Trichoderma reesei) em comparação com a expressão da mesma enzima lipolítica em uma célula de Aspergillus tubingensis (por exemplo, conforme ensinado na publicação WO98/45453, incorporado ao presente pela referência).

[095] Uma vantagem adicional da presente invenção é que a enzima lipolítica produzida de acordo com a presente invenção é de fácil produção e isolamento e/ou purificação e/ou concentração.

[096] Uma vantagem adicional da presente invenção é que a enzima lipolítica produzida de acordo com a presente invenção é de fácil resolubilização.

[097] Uma vantagem adicional da presente invenção é que a enzima lipolítica produzida de acordo com a presente invenção pode ser usada como um granulado ou como uma solução.

Enzima Lipolítica [098] O termo “enzima lipolítica” conforme utilizado na presente

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29/103 invenção significa uma enzima com atividade de hidrólise do triacilglicerol (classificada como CE 3.1.1.3).

[099] Adequadamente, a enzima lipolítica da presente invenção pode exibir uma ou mais das seguintes atividades adicionais: atividade de glicolipase (EC 3.1.1.26), atividade de fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), atividade de fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) ou atividade de fosfolipase B (EC 3.1.1.5). O termo “atividade de glicolipase”, conforme utilizado no presente abrange a “atividade galactolipase”.

[0100] Adequadamente, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção pode ter pelo menos uma ou mais das seguintes atividades: atividade de glicolipase (EC 3.1.1.26) e/ou 1 (EC 3.1.1.32) e/ou atividade de fosfolipase A2 (E.C. 3.1.1.4) e/ou atividade de fosfolipase B (EC 3.1.1.5).

Isolada [0101] Em um aspecto, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção está preferencialmente na forma isolada. O termo “isolado” significa que a enzima lipolítica é pelo menos substancialmente livre de outro componente com o qual a enzima lipolítica naturalmente está associada na natureza e como é encontrada na natureza. O termo “isolada” pode significar que a enzima lipolítica é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente no meio de cultura na qual ela é produzida. A enzima lipolítica da presente invenção pode ser fornecida em uma forma na qual está substancialmente livre de um ou mais contaminantes com o qual a substância poderia estar associada, ou a qual a enzima pode ser produzida no hospedeiro T. reesei. Assim, por exemplo, ela pode ser substancialmente livre de célula(s) ou um ou mais polipeptídeo(s) e/ou molécula(s) de ácido nucleico potencialmente contaminante(s). A enzima lipolítica pode ser isolada através da separação da(s) célula(s) a partir do caldo durante ou depois da fermentação, para que a enzima lipolítica permaneça no caldo. A enzima lipolítica pode ser

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30/103 isolada, sujeitando o caldo de fermentação à separação de células por meio da filtração a vácuo.

Purificada [0102] Em um aspecto, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção está preferencialmente na forma purificada. O termo “purificado” significa que o dado componente está presente em um nível elevado. O componente é desejavelmente o componente predominantemente presente em uma composição. Preferencialmente, está presente em um nível de pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80% do dito nível que está sendo determinado em uma base peso seco/peso seco em relação à composição total sob consideração. Para alguns exemplos de realização o valor é de pelo menos cerca de 85% do dito nível que está sendo determinado em uma base peso seco/peso seco com relação à composição total sob consideração.

Concentrado [0103] Em um aspecto, a enzima lipolítica de acordo com a presente invenção é preferencialmente utilizada como um concentrado. O concentrado pode ser uma forma concentrada do meio no qual a enzima foi excretada. Preferencialmente, o concentrado pode ser uma forma concentrada do meio no qual a enzima foi secretada e na qual a(s) célula(s) foram removidas.

Sequência de Nucleotídeos [0104] O escopo da presente invenção compreende sequências de nucleotídeos que codificam proteínas possuindo as propriedades específicas e/ou parâmetros definidos no presente.

[0105] O termo “sequência de nucleotídeos”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a uma sequência de oligonucleotídeos ou

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31/103 sequência de polinucleotídeos, e variantes, homólogos, fragmentos e derivados destas (tais como porções das mesmas). A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, que pode ser de duplafita ou fita simples seja esta representando a fita sense ou anti-sense.

[0106] AO termo “sequência de nucleotídeos” em relação com a presente invenção inclui o DNA genômico, cDNA, DNA sintético, e RNA. Preferencialmente este termo significa DNA, mais preferivelmente a sequência de cDNA codificadora da presente invenção.

[0107] Em um exemplo de realização preferido, a sequência de nucleotídeos, quando se referindo e quando abrangida pelo escopo da presente invenção per se, não inclui a sequência de nucleotídeos nativa de acordo com a presente invenção, quando em seu ambiente natural e quando ela está ligada à sua sequência naturalmente associada que também está em seu ambiente natural. Para facilidade de referência, vamos chamar essa realização preferida de “sequência de nucleotídeos não nativa”. Neste sentido, o termo “sequência de nucleotídeos nativa” significa uma sequência de nucleotídeos inteira que está em seu ambiente nativo e quando operacionalmente ligada a um promotor com o qual ela é naturalmente associada, no qual o dito promotor também está em seu ambiente nativo. No entanto, as sequências de aminoácidos abrangidas pelo escopo da presente invenção podem ser isoladas e/ou purificadas após a expressão de uma sequência de nucleotídeos em seu organismo nativo. De preferência, no entanto, a sequência de aminoácidos abrangida pelo escopo da presente invenção pode ser expressa por uma sequência de nucleotídeos em seu organismo nativo, mas a sequência de nucleotídeos não está sob o controle do promotor com o qual a dita sequência de nucleotídeos está naturalmente associada dentro desse organismo.

[0108] Normalmente, a sequência de nucleotídeos abrangida pelo

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32/103 escopo da presente invenção é preparada usando técnicas de DNA recombinante (ou seja, DNA recombinante). Entretanto, em um exemplo de realização alternativo da invenção, a sequência de nucleotídeos pode ser sintetizada, no todo ou em parte, através de métodos químicos conhecidos no estado da técnica (vide Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

Preparação da Sequência de Nucleotídeos [0109] A sequência de nucleotídeos codificante ou uma proteína que tem as propriedades específicas conforme definido na presente invenção ou uma proteína que é adequada para modificação podem ser identificadas e/ou isoladas e/ou purificadas a partir de qualquer célula ou organismo produtor da dita proteína. Vários métodos são bem conhecidos dentro do estado da técnica para a identificação e/ou isolamento e/ou purificação de sequências de nucleotídeos. A título de exemplo, uma vez uma sequência adequada foi identificada e/ou isolada e/ou purificada, as técnicas de PCR para preparar mais de uma sequência podem ser usadas.

[0110] A título de exemplo, um DNA genômico e/ou biblioteca de cDNA podem ser construídos com o DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo produtor da enzima. Se a sequência de aminoácidos da enzima é conhecida, sondas de oligonucleotídeos marcadas podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar a clones que codificam a enzimas a partir da biblioteca genômica preparada a partir do organismo. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeos marcada contendo sequências homólogas a outro gene de enzima conhecida poderia ser usada para identificar os clones codificadores de enzimas. Neste último caso, hibridação e condições de lavagem de menor estringência são usadas.

[0111] Alternativamente, os clones de codificação da enzima poderiam ser identificados através da inserção de fragmentos de DNA

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33/103 genômico em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, e transformando bactérias negativas para aquela enzima com a biblioteca de DNA genômico resultante, e depois semeando as bactérias transformadas em placas de ágar contendo um substrato para enzima (ou seja, maltose), permitindo assim que os clones expressando a enzima sejam identificados.

[0112] Alternativamente, a sequência de nucleotídeos que codifica a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos padronizados estabelecidos, por exemplo, o método de fosforoamidita descrito por Beucage SL et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, págs. 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805. No método de fosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

[0113] A sequência de nucleotídeos pode ser de origem mista genômica e sintética, de origem mista sintética e de cDNA, ou de origem mista genômica e de cDNA, preparada pela ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (conforme o caso) de acordo com técnicas padrão. Cada fragmento ligado corresponde a várias partes de toda a sequência de nucleotídeos. A sequência de DNA também pode ser preparada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers específicos, por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.683.202 ou em Saiki R.K. et al., (Science (1988) 239, páginas 487-491).

Sequências de Aminoácidos [0114] O escopo da presente invenção também abrange sequências de aminoácidos de enzimas possuindo propriedades específicas, conforme definido no presente.

[0115] Conforme utilizado no presente, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “polipeptídeo” e/ou “proteína”. Em alguns

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34/103 casos, o termo “sequência de aminoácido” é sinônimo do termo “peptídeo”. Em alguns casos, o termo “sequência de aminoácido” é sinônimo do termo “enzima”.

[0116] A sequência de aminoácido pode ser preparada/isolados a partir de uma fonte adequada, ou pode ser produzida de forma sintética, ou ela pode ser preparada pelo uso de técnicas de DNA recombinante.

[0117] A proteína abrangida na presente invenção pode ser usada em conjunto com outras proteínas, principalmente enzimas. Assim, a presente invenção também abrange uma combinação de proteínas no qual a combinação compreende a proteína/enzima da presente invenção e uma outra proteína/enzima, que pode ser uma outra proteína/enzima de acordo com a presente invenção. Este aspecto é discutido em uma seção posterior.

[0118] Preferencialmente, a sequência de aminoácidos quando relacionada à, e quando abrangida pelo escopo da presente invenção per se, não é uma enzima nativa. Neste sentido, o termo “enzima nativa” significa uma enzima inteira que está em seu ambiente nativo e quando ela foi expressa por sua sequência de nucleotídeos nativa.

Identidade de Sequência ou Homologia de Sequência [0119] A presente invenção também abrange o uso de sequências possuindo um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com sequência(s) de aminoácidos de um polipeptídeo que possui propriedades específicas definidas na presente invenção ou com qualquer sequência de nucleotídeos codificando um dito polipeptídeo (designado a seguir como “sequência(s) homóloga(s)”). No presente, o termo “homólogo” significa uma entidade possuindo uma determinada homologia com as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos em questão. No presente, o termo “homologia” pode ser equiparado ao termo “identidade”.

[0120] As sequências de aminoácidos e/ou de nucleotídeos

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35/103 homólogas deverão fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que mantém a atividade funcional e/ou atividade aumenta da enzima.

[0121] No presente contexto, entende-se como sequência homóloga aquela que inclui uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85 ou 90% idêntica, e preferencialmente, pelo menos, 95 ou 98% idêntica à sequência em questão. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos e etc. assim como a sequência de aminoácido em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferível expressar o termo homologia em termos de identidade de sequência.

[0122] No presente contexto, entende-se como sequência homóloga aquela que inclui uma sequência de nucleotídeos que pode ser pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85 ou 90% idêntica, e preferencialmente, pelo menos 95 ou 98% idêntica à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da presente invenção (a sequência em questão). Tipicamente, os homólogos compreenderão as mesmas sequências que codificam os sítios ativos etc. tal como a sequência em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferível expressar o termo homologia em termos de identidade de sequência.

[0123] As comparações de homologia podem ser conduzidas visualmente, ou de modo mais geral, com o auxílio de programas de comparação de sequências disponíveis. Estes programas para computadores disponíveis no mercado podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências.

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36/103 [0124] A % de homologia pode ser calculada sobre sequências contíguas, ou seja, uma sequência está alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é comparado diretamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado de alinhamento “ungapped” (sem lacunas). Normalmente, tais alinhamentos ungapped são realizados apenas sobre um número relativamente pequeno de resíduos.

[0125] Embora este seja um método muito simples e consistente, ele não consegue levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências de outra forma idênticas, uma inserção ou deleção fará com que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam colocados fora do alinhamento, resultando assim em uma grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é executado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência é projetada para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizar indevidamente a pontuação (escore) de homologia global. Isto é obtido por meio da inserção de gaps (lacunas) no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia local.

[0126] No entanto, estes métodos mais complexos atribuem “gap penalties” (ou seja, penalidades para a introdução de lacunas) para cada lacuna presente no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com o mínimo de lacunas possível - refletindo o maior parentesco entre as duas sequências comparadas - irá obter uma pontuação mais elevada do que um alinhamento com muitas lacunas. A “penalidade para lacuna afim” (affine gap cost) é normalmente usada para penalizar de forma relativamente alta a existência de uma lacuna e atribuir uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação de lacuna mais usado. Penalidades de lacunas altas,

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37/103 irão, naturalmente, produzir alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades para lacunas sejam modificadas. No entanto, é preferível usar os valores padrões pré-estabelecidos quando se utiliza tais softwares para comparações de sequências.

[0127] O cálculo da % de homologia máxima, portanto, em primeiro lugar requer a produção de um alinhamento ótimo, levando em consideração as penalidades para lacuna. Um programa de computador adequado para a realização de tal alinhamento é Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.). Exemplos de softwares que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, o pacote BLAST (vide Ausubel et al 1999 “Short Protocols in Molecular Biology”, 4° Ed - Capítulo 18), BLAST 2 (vide FEMS Microbiol Lett., 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999., 177(1):187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al 1990., J. Mol.Biol. 403-410) e AlignX. Pelo menos, BLAST, BLAST 2 e FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (vide Ausubel et al., 1999, páginas 7-58 a 7-60).

[0128] Embora a % de homologia final possa ser mensurada em termos de identidade, o processo de alinhamento em si normalmente não é baseado em uma comparação de pares do tipo “tudo ou nada”. Em vez disso, uma matriz de pontuação de similaridade em escala é geralmente usada para atribuir a pontuação para cada comparação de par em par com base na similaridade química ou distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz comumente utilizada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para a suíte de programas BLAST. Os programas Vector NTI usam geralmente valores padrões públicos ou, se fornecido, uma tabela de comparação de símbolos personalizada (consulte o manual do usuário para mais detalhes). Para algumas aplicações, é preferível usar os valores predefinidos (default) para o

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38/103 pacote Vector NTI Advance™ 11.

[0129] Alternativamente, a percentagem de homologias pode ser calculada usando o recurso de alinhamento múltiplo no Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1) 237-244).

[0130] Uma vez que o software tenha produzido um alinhamento ideal, é possível calcular a % de homologia, e preferencialmente a % de identidade de sequência. O software normalmente faz isso como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0131] As penalidades para lacunas (gap penalties) devem ser usadas quando é feita a determinação da identidade de sequência, em seguida, os seguintes parâmetros são preferencialmente usados para o alinhamento em pares:

PARA BLAST
ABERTURA DE LACUNA (GAP OPEN)	0
EXTENSÃO DE LACUNA (GAP EXTENSION)	0

PARA CLUSTAL	DNA	PROTEÍNA
TAMANHO DE PALAVRA (WORD SIZE)	2	1	K triplo
PENALIDADES PARA LACUNAS (GAP PENALTIES)	15	10

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39/103

PARA CLUSTAL	dna	PROTEÍNA
EXTENSÃO DE LACUNA(GAP EXTENSION)	6,66	0,1

[0132] Em um exemplo de realização, o CLUSTAL pode ser usado com a penalidade para lacunas (gap penalty) e extensão de lacuna (gap extension) ajustado conforme definido acima.

[0133] Adequadamente, o grau de identidade com relação a uma sequência de nucleotídeos é determinado ao longo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, preferencialmente ao longo de pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, preferencialmente ao longo de pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, mais preferencialmente ao longo de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, e mais preferencialmente ao longo de pelo menos 60 nucleotídeos contíguos, e preferivelmente ao longo de pelo menos 100 nucleotídeos contíguos.

[0134] Adequadamente, o grau de identidade com relação a uma sequência de nucleotídeos pode ser determinado ao longo de toda a sequência.

Variantes/Homólogos/Derivados [0135] A presente invenção também abrange o uso de variantes, homólogos e derivados de qualquer sequência de aminoácidos de uma proteína ou de qualquer sequência de nucleotídeos que codifica tal proteína.

[0136] No presente, o termo “homólogo” significa uma entidade possuindo uma determinada homologia com as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos em questão. No presente, o termo “homologia” pode ser equiparado ao termo “identidade”.

[0137] No presente contexto, entende-se como sequência homóloga aquela que inclui uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo

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40/103 menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90% idêntica, e preferencialmente, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência em questão. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos e etc. assim como a sequência de aminoácido em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferível expressar o termo homologia em termos de identidade de sequência.

[0138] No presente contexto, entende-se como uma sequência homóloga aquela que inclui uma sequência de nucleotídeos que pode ser pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90% idêntica, e preferencialmente, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima da presente invenção (a sequência em questão). Tipicamente, os homólogos compreenderão as mesmas sequências que codificam os sítios ativos etc. tal como a sequência em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (ou seja, resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferível expressar o termo homologia em termos de identidade de sequência.

[0139] As comparações de homologia podem ser conduzidas visualmente, ou de modo mais geral, com o auxílio de programas de comparação de sequências disponíveis. Estes programas para computadores disponíveis no mercado podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências.

[0140] A % de homologia pode ser calculada sobre sequências contíguas, ou seja, uma sequência está alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é comparado diretamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado

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41/103 de alinhamento “ungapped” (sem lacunas). Normalmente, tais alinhamentos ungapped são realizados apenas sobre um número relativamente pequeno de resíduos.

[0141] Embora este seja um método muito simples e consistente, ele não consegue levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências de outra forma idênticas, uma inserção ou deleção fará com que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam colocados fora do alinhamento, resultando assim em uma grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é executado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência é projetada para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções, sem penalizar indevidamente a pontuação (escore) de homologia global. Isto é obtido por meio da inserção de gaps (lacunas) no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia local.

[0142] No entanto, estes métodos mais complexos atribuem “gap penalties” (ou seja, penalidades para a introdução de lacunas) para cada lacuna presente no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com o mínimo de lacunas possível - refletindo o maior parentesco entre as duas sequências comparadas - irá obter uma pontuação mais elevada do que um alinhamento com muitas lacunas. A “penalidade para lacuna afim” (affine gap cost) é normalmente usada para penalizar de forma relativamente alta a existência de uma lacuna e atribuir uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação de lacuna mais usado. Penalidades de lacunas altas, irão, naturalmente, produzir alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades para lacunas sejam modificadas. No entanto, é preferível usar os valores padrões pré-estabelecidos quando se utiliza tais softwares para comparações de

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42/103 sequências. Por exemplo, quando usando o pacote GCG Wisconsin BestFit a penalidade de lacuna (gap penalty) padrão para sequências de aminoácidos é de -12 por uma lacuna e -4 para cada extensão.

[0143] O cálculo da % de homologia máxima, portanto, em primeiro lugar requer a produção de um alinhamento ótimo, levando em consideração as penalidades para lacuna. Um programa de computador adequado para a realização de tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem, mas não estão limitados ao pacote BLAST (vide Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4^a Ed - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) e a suíte de ferramentas de comparação GENEWORKS. Tanto o BLAST quanto o FASTA está disponível para pesquisas offline e online (vide Ausubel et al. 1999, Short Protocols in Molecular Biology. páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumas aplicações, é preferível usar o programa GCG BestFit. A nova ferramenta, chamada de “BLAST 2 Sequences” também está disponível para comparar sequências de proteínas e nucleotídeos (vide, FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

[0144] Embora a % de homologia final possa ser mensurada em termos de identidade, o processo de alinhamento em si normalmente não é baseado em uma comparação de pares do tipo “tudo ou nada”. Em vez disso, uma matriz de pontuação de similaridade em escala é geralmente usada para atribuir a pontuação para cada comparação de par em par com base na similaridade química ou distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz comumente utilizada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para a suíte de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsin usam geralmente valores padrões públicos ou, se fornecido, uma tabela de comparação de símbolos

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43/103 personalizada (consulte o manual do usuário para mais detalhes). Para algumas aplicações, é preferível usar os valores padrões pré-definidos públicos para o pacote GCG, ou no caso de outros softwares, uma matriz padrão, tal como BLOSUM62.

[0145] Alternativamente, a percentagem de homologias pode ser ®

calculada usando o recurso de alinhamento múltiplo no DNASIS (Hitachi Software), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1) 237-244).

[0146] Uma vez que o software tenha produzido um alinhamento ideal, é possível calcular a % de homologia, e preferencialmente a % de identidade de sequência. O software normalmente faz isso como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0147] As sequências também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos deliberadas podem ser feitas com base na similaridade da polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos, contanto que a atividade de ligação secundária da substância seja mantida. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem a lisina e arginina; e aminoácidos com cabeça polar não carregada possuindo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem a leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[0148] Substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e, preferencialmente na mesma linha na terceira coluna, podem ser substituídos entre si:

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44/103

ALIFÁTICO	Apolar	G A P
		I L V
	Polar - não carregado	C S T M
		N Q
	Polar - carregado	D E
		K R
AROMÁTICO		H F W Y

[0149] A presente invenção também abrange substituições homólogas (substituição e reposição são ambas utilizadas para designar a troca de um resíduo de aminoácido existente por um resíduo alternativo) que podem ocorrer, ou seja, substituições comparáveis (like-for-like), tais como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar e etc. Também pode ocorrer uma substituição não homóloga, ou seja, de uma classe de resíduo para outra ou, alternativamente, a inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (designada a seguir como Z), ornitina ácido diaminobutírico (designada a seguir como B), ornitina norleucina (designada a seguir como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

[0150] Também podem ser feitas substituições por aminoácidos não naturais incluindo: aminoácidos alfa* e alfa-dissubstituído*, aminoácidos Nalquila*, ácido lático*, derivados halogenados de aminoácidos naturais, tais como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, Lalil-glicina*, β-alanina*, ácido L-amino butírico*, ácido L—amino butírico*, ácido L-amino isobutírico*, ácido L-amino capróico#, ácido 7-amino heptanóico*, Lmetionina sulfona*, L-norleucina*, L-Norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, Lhidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metila de fenilalanina (Fen), tais como 4-metil-Fen*, pentametil-Fen*, L-Fen (4-amino)#, L-Tir (metila)*, L-Fen (4isopropila)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)*, ácido LPetição 870180147020, de 31/10/2018, pág. 54/137

45/103 diaminopropiônico e L-Fen (4-benzila)*. A notação * foi utilizada com o propósito da discussão acima (relativas à substituição ou homóloga ou não homóloga), para indicar a natureza hidrofóbica do derivado, ao passo que # foi utilizado para indicar a natureza hidrofílica do derivado, #* indica características anfipáticas.

[0151] As sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer outros dois resíduos de aminoácidos da sequência, incluindo grupos alquila, tais como grupos metila, etila ou propila, além de espaçadores de aminoácidos como resíduos de glicina ou -alanina. Uma forma de variação adicional envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptóide, e será bem compreendido pelos técnicos hábeis no assunto. Para que não restem dúvidas, “a forma peptóide” é usada para se referir a resíduos de aminoácidos variantes em que o grupo substituinte -carbono está no átomo de nitrogênio do resíduo ao invés do -carbono. Processos para a preparação de peptídeos na forma peptóide são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, Simon RJ et al. PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 e DC Horwell, Trends Biotechnol.(1995) 13 (4), 132-134.

[0152] As sequências de nucleotídeos para uso na presente invenção podem estar incluídas dentro daqueles nucleotídeos sintéticos ou modificados. Uma variedade de diferentes tipos de modificação de oligonucleotídeos é conhecida no estado da técnica. Dentre estes podemos incluir aqueles que possuem estruturas principais de metilfosfonato e fosforotioato e/ou a adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula. Para os propósitos da presente invenção, deve-se compreender que as sequências de nucleotídeos descritas no presente documento podem ser modificadas por qualquer método disponível no estado da técnica. Tais modificações podem ser realizadas a fim de aumentar a

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46/103 atividade in vivo ou a vida útil das sequências de nucleotídeos da presente invenção.

[0153] A presente invenção também abrange o uso de sequências de nucleotídeos que são complementares às sequências aqui apresentadas, ou qualquer derivado ou fragmento derivado destas. Se a sequência é complementar a um fragmento da mesma, então a sequência pode ser usada como uma sonda para identificar as sequências de codificação semelhantes em outros organismos, e etc.

[0154] Os polinucleotídeos que não são 100% homólogos às sequências da presente invenção, mas caem dentro do escopo da invenção podem ser obtidos de diversas maneiras. Outros variantes de sequências descritas no presente documento podem ser obtidos, por exemplo, por sondagens de bibliotecas de DNA feitas a partir de uma gama de indivíduos, por exemplo, indivíduos a partir de diferentes populações. Além disso, outros homólogos podem ser obtidos e tais homólogos e fragmentos destes, em geral, serão capazes de se hibridizarem seletivamente com as sequências exibidas na listagem de sequências da presente invenção. Tais sequências podem ser obtidas pela sondagem feita a partir de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas de DNA genômico de outras espécies animais, e tais sondagens de bibliotecas com as sondas compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das sequências da lista sequência anexa em condições de média a alta estringência. Considerações semelhantes se aplicam para a obtenção de espécies homólogas e variantes alélicas das sequências de nucleotídeos ou polipeptídeos da invenção.

[0155] Cepas e espécies variantes homólogas também podem ser obtidas usando a PCR degenerada (ou com “primers degenerados”) que utilizará primers projetados para atingir as sequências de aminoácidos conservadas codificando variantes e homólogos dentro das sequências da

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47/103 presente invenção. As sequências conservadas podem ser previstas, por exemplo, por meio do alinhamento das sequências de aminoácidos a partir das diversas variantes/homólogas. Os alinhamentos de sequência podem ser realizados pelo uso de softwares de computador conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp é amplamente utilizado.

[0156] Os primers degenerados utilizados na PCR irão conter uma ou mais posições degeneradas e serão utilizados em condições de menor estringência do que aqueles usados para a clonagem de sequências com primers de sequência única contra sequências conhecidas.

[0157] Alternativamente, tais polinucleotídeos podem ser obtidos pela mutagênese sítio dirigida de sequências caracterizadas. Isto pode ser útil quando, por exemplo, alterações silenciosas na sequência do códon são necessárias para otimizar as preferências de uso de códon para uma célula hospedeira específica na qual as sequências de polinucleotídeos estão sendo expressas. Outras alterações na sequência podem ser desejadas, a fim de introduzir sítios para o reconhecimento de enzimas de restrição, ou para alterar as propriedades ou funções dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos.

[0158] Os polinucleotídeos (sequências de nucleotídeos) da presente invenção podem ser usados para produzir uma primer, por exemplo, um primer de PCR, um primer para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcada com um marcador que é revelado por meios convencionais utilizando marcadores radioativos ou não radioativos, ou os polinucleotídeos podem ser clonados em vetores. Tais primers, sondas e outros fragmentos serão de pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 20, por exemplo, pelo menos, 25, 30 ou 40 nucleotídeos de comprimento, e são também abrangidos pelo termo polinucleotídeos da invenção conforme utilizado

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48/103 no presente.

[0159] Os polinucleotídeos, tal como polinucleotídeos de DNA e sondas de acordo com a invenção podem ser produzidos recombinantemente, sinteticamente, ou por qualquer método disponível para os técnicos hábeis no assunto. Eles também podem ser clonados por técnicas convencionais.

[0160] Normalmente, os primers serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma produção gradativa com um nucleotídeo de cada vez da sequência de ácido nucleico desejada. Técnicas para essa realização utilizando técnicas automatizadas estão disponíveis no estado da técnica.

[0161] Polinucleotídeos mais longos irão geralmente ser produzidos usando meios recombinantes, por exemplo, usando uma técnica de clonagem baseada em PCR (reação em cadeia da polimerase). Os primers podem ser projetados para conter sítios de reconhecimento de enzimas de restrição adequados de modo que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor de clonagem apropriado.

Hibridização [0162] A presente invenção também engloba sequências que são complementares às sequências de ácidos nucleicos da presente invenção ou sequências que são capazes de hibridizarem, seja com as sequências da presente invenção ou as sequências complementares a elas.

[0163] O termo “hibridização”, conforme utilizado no presente deve incluir “o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se une com uma cadeia complementar por meio do pareamento de bases”, bem como o processo de amplificação realizado pelas tecnologias da reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0164] A presente invenção também abrange o uso de sequências de nucleotídeos que são capazes de se hibridizarem com as sequências que são complementares às sequências apresentadas na presente

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49/103 invenção, ou com qualquer derivado ou fragmento derivado destas.

[0165] O termo “variante” também abrange sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizarem com as sequências de nucleotídeos apresentadas na presente invenção.

[0166] Preferencialmente, o termo “variante” abrange sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizar sob condições estringentes (por exemplo, a 50 °C e 0,2x SSC {IxSSC = 0,15 M de NaCI, 0,015 M de citrato de Na3 em pH 7,0}) com as sequências de nucleotídeos apresentadas na presente invenção.

[0167] Mais preferivelmente, o termo “variante” abrange sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizar sob condições de alta estringência (por exemplo, a 60 °C e 0,1x SSC {1xSSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de Na3 em pH 7,0}) com as sequências de nucleotídeos apresentadas na presente invenção.

[0168] A presente invenção também se refere às sequências de nucleotídeos que podem hibridizar com as sequências de nucleotídeos da presente invenção (incluindo as sequências complementares àquelas apresentadas na presente invenção).

[0169] A presente invenção também se refere às sequências de nucleotídeos que são complementares às sequências que podem hibridizar com as sequências de nucleotídeos da presente invenção (incluindo as sequências complementares às apresentadas na presente invenção).

[0170] Também estão incluídas no escopo da presente invenção as sequências de polinucleotídeos que são capazes de hibridizar com as sequências de nucleotídeos apresentadas na presente invenção sob condições estringência de intermediária a máxima.

[0171] Em um aspecto preferido, a presente invenção abrange sequências de nucleotídeos que podem hibridizar com a sequência de

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50/103 nucleotídeos da presente invenção, ou o complemento da mesma, sob condições estringentes (por exemplo, 50 °C e 0,2xSSC).

[0172] Em um aspecto mias preferido, a presente invenção abrange sequências de nucleotídeos que podem hibridizar com a sequência de nucleotídeos da presente invenção, ou o complemento da mesma, sob condições de alta estringência (por exemplo, 65 °C e 0,1xSSC).

Evolução Molecular [0173] Como um exemplo não limitante, é possível produzir várias mutações em um sítio específico ou aleatório dentro de uma sequência de nucleotídeos, tanto in vivo como in vitro, e posteriormente selecionar a melhor funcionalidade do polipeptídeo codificado por vários meios.

[0174] Além disso, as mutações ou variantes naturais de uma sequência de polinucleotídeos podem ser recombinadas com tanto com sequencias do tipo selvagem como com qualquer outra mutação ou variante natural para a produção de novos variantes. Tais novas variantes também podem ser selecionadas para uma melhor funcionalidade do polipeptídeo codificado. A produção de novas variantes preferidas pode ser obtida por meio de vários métodos bem estabelecidos no estado da técnica, por exemplo, a mutagênese “Error Threshold Mutagenesis” (WO 92/18645), mutagênese aleatória mediada por oligonucleotídeos (US 5.723.323), pelo método de shuffling (troca) de DNA (US 5.605.793) e agrupamento (assembly) do gene exo-mediada (WO00/58517). A aplicação desses e de outros métodos de evolução moleculares dirigidos e aleatórios permite a identificação e seleção de variantes das enzimas da presente invenção, que possuem características preferenciais sem qualquer conhecimento prévio da estrutura ou função da proteína e permite a produção de mutações ou variantes não previsíveis, porém benéficos. Há numerosos exemplos da aplicação da evolução molecular no estado da técnica para a otimização ou alteração de atividade enzimática,

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51/103 tais exemplos incluem, mas não estão limitados a uma ou mais das seguintes:

[0175] expressão e/ou atividade otimizada em uma célula hospedeira ou in vitro, atividade enzimática aumentada, especificidade do produto e/ou substrato alterada, aumento ou diminuição da estabilidade estrutural ou enzimática, atividade/especificidade enzimática alterada nas condições ambientais preferenciais, por exemplo, temperatura, pH, substrato.

Mutagênese Sítio-Dirigida [0176] Uma vez que uma sequência de nucleotídeos codificadora de proteína foi isolada, ou uma sequência de nucleotídeos codificadora de proteína putativa foi identificada, pode ser desejável mutar (modificar) a sequência, a fim de preparar uma proteína da presente invenção.

[0177] As mutações podem ser introduzidas utilizando oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm sequências de nucleotídeos que flanqueiam os sítios de mutação desejados.

[0178] Um método adequado é divulgado em Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Outro método de introdução de mutações em sequências de nucleotídeos que codificam enzimas é descrito em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).

Recombinante [0179] Em um aspecto a sequência para uso na presente invenção é uma sequência recombinante - ou seja, uma sequência que foi preparada usando técnicas de DNA recombinante.

[0180] Estas técnicas de DNA recombinante estão dentro das capacidades de um técnico hábil no assunto. Tais técnicas são explanadas na literatura, por exemplo, em J. Sambrook, Fritsch E. F., e Maniatis T., 1989, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’, Segunda Edição, Livros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sintéticos

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52/103 [0181] Em um aspecto a sequência para uso na presente invenção é uma sequência sintética - ou seja, uma sequência que foi preparada pela síntese enzimática ou química in vitro. Isto inclui, mas não se limita a, sequências feitas com a utilização preferencial de códon (codon usage) para organismos hospedeiros T. reesei.

Expressão de Enzimas [0182] A sequência de nucleotídeos para uso na presente invenção pode ser incorporada em um vetor recombinante replicável. O vetor pode ser usado para replicar e expressar a sequência de nucleotídeos, na forma de proteína, e/ou a partir de uma célula hospedeira compatível.

[0183] Expressão pode ser controlada usando sequências de controle, por exemplo, sequências regulatórias.

[0184] A proteína produzida por uma célula hospedeira recombinante pela expressão da sequência de nucleotídeos pode ser secretada ou pode ficar contida intracelularmente, dependendo da sequência e/ou o vetor utilizado. As sequências de codificação podem ser projetadas com sequências sinais que direcionam a secreção das sequências que codificam a substância através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica específica.

Vetor de Expressão [0185] O termo “vetor de expressão” significa uma construção capaz de promover a expressão de maneira in vivo ou in vitro.

[0186] Preferencialmente, o vetor de expressão é incorporado ao genoma de um organismo hospedeiro adequado. O termo “incorporado” abrange preferencialmente a incorporação estável no genoma.

[0187] A sequência de nucleotídeos da presente invenção pode estar presente em um vetor no qual a sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada às sequências regulatórias capazes de fornecer a

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53/103 expressão da sequência de nucleotídeos por meio de um organismo hospedeiro adequado.

[0188] Os vetores para uso na presente invenção podem ser transformados em uma célula hospedeira adequada, conforme descrito abaixo para fornecer a expressão de um polipeptídeo da presente invenção.

[0189] A escolha do vetor, por exemplo, um vetor plasmídeo, cosmídeo, ou fago, dependerá muitas vezes da célula hospedeira a qual ele será introduzido.

[0190] Os vetores para uso na presente invenção podem conter um ou mais genes marcadores de seleção, tal como um gene que confere resistência a antibióticos, por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Alternativamente, a seleção pode ser obtida pela cotransformação (conforme descrito na publicação WO91/17243).

[0191] Vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA, ou podem ser usados para transfecção, transformação, transdução ou infecção de uma célula hospedeira.

[0192] Assim, em um exemplo de realização adicional, a invenção fornece um método de produção de sequências de nucleotídeos da presente invenção pela introdução de uma sequência de nucleotídeos da presente invenção em um vetor replicável, e introduzindo o vetor em uma célula hospedeira compatível, e cultivando a célula hospedeira em condições que promovam a replicação do vetor.

[0193] O vetor pode ainda compreender uma sequência de nucleotídeos que permita que o vetor possa replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais sequências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 e pIJ702.

Sequências Reguladoras [0194] Em algumas aplicações, a sequência de nucleotídeos para

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54/103 uso na presente invenção está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora que é capaz de promover a expressão da sequência de nucleotídeos, tal como pela célula hospedeira escolhida. A título de exemplo, a presente invenção cobre abrange um vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos da presente invenção operacionalmente ligada a tal sequência reguladora, ou seja, o vetor é um vetor de expressão.

[0195] O termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permitam funcionar na forma desejada. Uma sequência reguladora “operacionalmente ligada” a uma sequência de codificação está ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0196] O termo “sequências reguladoras” inclui promotores e facilitadores (enhancers) e outros sinais de regulação da expressão.

[0197] O termo “promotor” é usado no sentido normal encontrado no estado da técnica, por exemplo, um sítio de ligação da RNA polimerase.

[0198] Uma expressão melhorada da sequência de nucleotídeos que codifica a enzima da presente invenção também pode ser obtida pela seleção de regiões regulatórias heterólogas, por exemplo, promotor, líder de secreção e regiões terminadoras.

[0199] Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção está operacionalmente ligada a pelo menos um promotor.

[0200] Outros promotores podem ser usados para direcionar a expressão do polipeptídeo da presente invenção.

[0201] Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição da sequência de nucleotídeos em um hospedeiro bacteriano, fúngico ou de levedura são bem conhecidas no estado da técnica.

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55/103 [0202] Em um exemplo de realização, um promotor adequado pode ser um promotor de celobiohidrolase.

[0203] Em um exemplo de realização um promotor adequado pode ser um promotor de celobiohidrolase obtido (ou obtenível) a partir do T. reesei.

[0204] O promotor pode incluir adicionalmente características para garantir ou aumentar a expressão em um hospedeiro adequado. Por exemplo, as características podem ser regiões conservadas, tais como sítios de ligação de fatores de transcrição ou sítios de ligação de repressor deletados.

Construções [0205] O termo “construção” - que é sinônimo de termos como “conjugado”, “cassete” e “híbrido” - inclui uma sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a presente invenção, ligado diretamente ou indiretamente a um promotor.

[0206] Um exemplo de um ligamento indireto é o fornecimento de um grupo espaçador adequado, tal como uma sequência intron, como o SH1intron ou intron ADH, intermediário ao promotor e a sequência de nucleotídeos da presente invenção. O mesmo é verdadeiro para o termo “fundido” em relação a presente invenção que inclui a ligação direta ou indireta. Em alguns casos, os termos não abrangem a combinação natural da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína normalmente associada com o promotor do gene tipo selvagem e quando ambos estão em seu ambiente natural.

[0207] A construção pode ainda conter ou expressar um marcador, que permite a seleção da construção genética.

[0208] Para algumas aplicações, a construção da presente invenção compreende preferencialmente pelo menos a sequência de nucleotídeos da presente invenção operacionalmente ligada a um promotor.

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Células Hospedeiras [0209] O termo “célula hospedeira” - em relação a presente invenção inclui qualquer célula de T. reesei que compreenda tanto a sequência de nucleotídeos quanto um vetor de expressão, conforme descrito anteriormente e que seja usada na produção de uma proteína recombinante possuindo propriedades específicas conforme definido na presente invenção.

[0210] Assim, um exemplo de realização adicional da presente invenção fornece células hospedeiras de T. reesei transformadas ou transfectadas com uma sequência de nucleotídeos que expressa a proteína da presente invenção.

[0211] O uso de uma célula hospedeira de T. reesei pode fornecer modificações pós-traducionais (por exemplo, miristoilação, glicosilação, truncamento, lapidação e fosforilação de serina, tirosina, ou treonina) que podem ser necessárias para conferir atividade biológica ideal nos produtos de expressão recombinantes da presente invenção.

Organismo [0212] O termo “organismo” em relação a presente invenção inclui o T. reesei, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídio de acordo com a presente invenção e/ou os produtos obtidos dele e/ou de modo que um promotor pode permitir a expressão da sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção, quando presente no organismo.

[0213] Um organismo adequado é o T. reesei.

[0214] O termo “organismo transgênico” em relação a presente invenção inclui um T. reesei, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídio de acordo com a presente invenção e/ou os produtos obtidos dele e/ou em que um promotor pode permitir a expressão da sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção dentro do organismo.

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Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos é incorporada ao genoma do organismo.

[0215] O termo “organismo transgênico” não abrange sequências de codificação de nucleotídeos nativas em seu ambiente natural quando elas estão sob o controle de seu promotor nativo que também está em seu ambiente natural.

[0216] Portanto, o organismo transgênico da presente invenção inclui um organismo compreendendo qualquer uma, ou combinações das sequências de nucleotídeos que codifica o polipeptídio de acordo com a presente invenção, construções de acordo com a presente invenção, vetores de acordo com a presente invenção, plasmídeos de acordo com a presente invenção, células de acordo com a presente invenção, tecidos de acordo com a presente invenção, ou produtos derivados destes.

[0217] Por exemplo, o organismo transgênico pode também compreender a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídio da presente invenção sob o controle de um promotor heterólogo.

Transformação de Células Hospedeiras/ Organismos [0218] Células de fungos filamentosos podem ser transformadas usando vários métodos conhecidos no estado da técnica - como um processo que envolve a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos, seguida pela regeneração da parede celular de uma maneira conhecida.

[0219] Os ensinamentos gerais sobre a transformação de fungos são apresentados nas seções seguintes.

Fungo Transformado [0220] O organismo hospedeiro é o T. reesei e similares.

[0221] A transformação de fungos filamentosos é discutida na US-A-5741665 que afirma que técnicas padrão para a transformação de fungos

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58/103 filamentosos e cultivo dos fungos são bem conhecidas no estado da técnica. Uma extensa revisão de técnicas como a aplicada para N. crassa é encontrada, por exemplo, em Davis e deSerres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

[0222] Ensinamentos adicionais que também podem ser utilizados na transformação de fungos filamentosos são revisados na US-A5674707.

[0223] Além disso, a expressão gênica em fungos filamentosos é ensinada em Punt et al.(2002) Trends Biotechnol, de Maio de 2002, 20(5):2006, Archer & Crit Rev Peberdy Biotechnol (1997) 17(4):273-306.

[0224] A presente invenção abrange a produção de fungos filamentosos transgênicos de acordo com a presente invenção preparados pelo uso destas técnicas padrão.

Cultura e Produção [0225] As células hospedeiras de T. reesei transformadas com a sequência de nucleotídeos da presente invenção podem ser cultivadas em condições propícias para a produção do polipeptídeo codificado e que facilitam a recuperação do polipeptídeo a partir da(s) célula(s) e/ou do meio de cultura.

[0226] Em um exemplo de realização, a(s) célula(s) de T. reesei transformada(s) ou transfectada(s) fornecida(s) de acordo com a presente invenção é(são) cultivada(s) em condições seletivas para permitir a seleção da(s) célula(s) transformada(s) ou transfectada(s) com a enzima lipolítica conforme definido na presente invenção.

[0227] O meio utilizado para cultivar a(s) célula(s) pode ser qualquer meio convencional para o cultivo da célula hospedeira em questão e obtenção da expressão do polipeptídeo.

[0228] A proteína produzida por uma célula recombinante pode ser exibida na superfície da célula.

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59/103 [0229] A proteína pode ser secretada pelas células hospedeiras, podendo ser convenientemente recuperadas a partir do meio de cultura usando procedimentos bem conhecidos.

Secreção [0230] Muitas vezes, é desejável que a proteína seja secretada a partir do hospedeiro de expressão diretamente no meio de cultura onde a proteína pode ser mais facilmente recuperada. De acordo com a presente invenção, a sequência líder de secreção pode ser selecionada com base no hospedeiro de expressão desejado. As sequências sinais híbridas também podem ser usadas no contexto da presente invenção.

[0231] Exemplos típicos de sequências líderes de secreção heterólogas são aquelas originárias do gene da amiloglucosidase (AG) de fungos (glaA - ambas as versões de 18 e 24 de aminoácidos, por exemplo, do Aspergillus), o gene do fator-a (de leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces e Hansenula) ou o gene da a-amilase (Bacillus).

[0232] Em um exemplo de realização, o peptídeo sinal é preferencialmente aquele exibido na SEQ ID NO: 1, em negrito na Figura 15. Em um exemplo de realização, o peptídeo sinal mostrado em negrito na figura 15 é clivado pós-traducionalmente para fornecer um peptídeo possuindo a sequência exibida na SEQ ID NO: 2. 2.

Detecção [0233] Uma variedade de protocolos para detectar e mensurar a expressão da sequência de aminoácidos é conhecida no estado da técnica. Exemplos incluem o ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[0234] Uma grande variedade de marcadores e técnicas de conjugação é conhecida pelos técnicos do assunto e podem ser usados em

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60/103 diversos testes de ácidos nucleicos e aminoácidos.

[0235] Várias empresas como a Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), e US Biochemical Corp. (Cleveland, OH) oferecem kits comerciais e protocolos para estes procedimentos.

[0236] Moléculas repórteres ou marcadores adequados incluem os radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogênicos bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas e similares. As patentes que ensinam o uso de tais marcadores incluem: US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 e US-A-4.366.241.

[0237] Além disso, as imunoglobulinas recombinantes podem ser produzidas conforme demonstrado na Patente US-A-4.816.567.

Proteínas de Fusão [0238] A sequência de aminoácidos para uso de acordo com a presente invenção pode ser produzida como uma proteína de fusão, por exemplo, para auxiliar na extração e purificação. Exemplos de parceiros de proteínas de fusão incluem glutationa-S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (domínios de ligação ao DNA e/ou ativação transcricional) e (-galactosidase). Também pode ser conveniente incluir um sítio de clivagem proteolítica entre o parceiro da proteína de fusão e a sequência da proteína de interesse para permitir a remoção das sequências da proteína de fusão.

[0239] Preferencialmente, a proteína de fusão não irá dificultar a atividade da sequência da proteína.

POIs Adicionais [0240] As sequências para uso de acordo com a presente invenção também podem ser usadas em conjunto com uma ou mais proteínas de interesse adicionais (POIs) ou sequências de nucleotídeos de interesse

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61/103 (NOIs).

[0241] Exemplos não limitantes de POIs incluem: proteínas ou enzimas envolvidas no metabolismo do amido, proteínas ou enzimas envolvidas no metabolismo do glicogênio, acetil esterases, aminopeptidases, amilases, arabinases, arabinofuranosidases, carboxipeptidases, catalases, celulases, quitinases, quimosina, cutinase, deoxirribonucleases, epimerases, esterases, -galactosidases, -galactosidases, -glucanases, glucanlisases, endoglucanases, glucoamilases, glicose oxidases, -glicosidases, -glicosidases, glucuronidases, hemicelulases, hexose oxidases, hidrolases, invertases, isomerases, lacases, fosfolipases, galactolipases, aciltransferase lipídica, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectato liases, acetil pectina esterases, pectina depolimerases, pectina metil esterases, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitases, poligalacturonases, proteases, ramnogalacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases, proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (Dhexose: O2-oxidoredutase, EC 1.1.3.5), ou combinações destas. A NOI pode ser até mesmo uma sequência antisense para qualquer uma dessas sequências.

[0242] A POI pode ser até mesmo uma proteína de fusão, por exemplo, para auxiliar na extração e purificação.

[0243] A POI pode até mesmo estar fundida a uma sequência de secreção.

[0244] Outras sequências também podem facilitar a secreção ou aumentar o rendimento da POI secretada. Tais sequências poderiam codificam proteínas denominadas de chaperonas, por exemplo, o produto do gene cyp B de Aspergillus niger descrito no pedido de patente UK 9.821.198.0.

[0245] A NOI pode ser projetada a fim de alterar a sua atividade por uma série de razões, incluindo, mas não se limitando a, alterações que

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62/103 modificam o processamento e/ou expressão do produto de expressão dela. A título de exemplo, a NOI também pode ser modificada para otimizar a expressão em uma célula hospedeira específica. Outras alterações na sequência podem ser desejadas a fim de introduzir sítios de reconhecimento de enzimas de restrição.

[0246] A NOI pode incluir em seu interior nucleotídeos sintéticos ou modificados - tais como estruturas principais de metilfosfonato e fosforotioato.

[0247] A NOI pode ser modificada para aumentar a estabilidade intracelular e a meia-vida. Possíveis modificações incluem, mas não estão limitadas a, adição de sequências flanqueadoras nas extremidades 5' e/ou 3' da molécula ou o uso de ligações de fosforotioato ou 2' O-metila ao invés de fosfodiesterase dentro da cadeia principal da molécula.

Produção/Aplicação em Larga Escala [0248] Em um exemplo de realização preferido da presente invenção, a enzima lipolítica é utilizada para aplicações em larga escala e/ou é produzida em larga escala.

[0249] O termo larga escala significa em um fermentador ou condições de cultivo de pelo menos 1000 litros.

[0250] Preferencialmente, a enzima lipolítica é produzida em uma quantidade de pelo menos 5 g por litro do volume de cultura celular total após o cultivo do organismo hospedeiro. Preferencialmente, a enzima lipolítica é produzida em uma quantidade de pelo menos 10g por litro do volume de cultura celular total após o cultivo do organismo hospedeiro. Preferencialmente, a enzima lipolítica é produzida em uma quantidade de pelo menos 15g por litro do volume de cultura celular total após o cultivo do organismo hospedeiro. Preferencialmente, a enzima lipolítica é produzida em uma quantidade de pelo menos 20g por litro do volume de cultura celular total após o cultivo do

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63/103 organismo hospedeiro.

Fermentação [0251] As enzimas da presente invenção podem ser produzidas tanto pela cultura sólida quanto submersa, incluindo os processos batch (descontínuo), fed-batch (descontínuo alimentado) ou de fluxo contínuo. Cultivo é realizado em um meio de crescimento que compreende um meio com sais minerais aquoso, fatores de crescimento orgânicos, carbono e material de fonte de energia, oxigênio molecular, e, claro, um inoculo inicial de uma ou mais espécies de microrganismo(s) especifico(s) que será(ão) empregada(s).

[0252] Além da fonte de carbono e energia, oxigênio, nitrogênio assimilável e um inóculo do microrganismo, são necessários; o fornecimento de quantidades adequadas em proporções adequadas de nutrientes minerais para garantir o crescimento adequado dos microrganismos, maximizar a assimilação do carbono e fonte de energia pelas células no processo de conversão microbiana, e atingir o rendimento celular máximo com densidade celular máxima nos meios de fermentação.

[0253] A composição do meio aquoso mineral pode variar em um amplo intervalo, dependendo em parte do microrganismo e do substrato empregado, tal como é conhecido no estado da técnica. A meio mineral deve incluir, além do nitrogênio, quantidades adequadas de fósforo, magnésio, cálcio, potássio, enxofre, sódio e, nas formas iônicas assimiláveis solúveis e combinadas adequadas, e também deve estar preferencialmente presente determinados oligoelementos como o cobre, manganês, molibdênio, ferro, zinco, boro e iodo, e outros, novamente na forma solúvel assimilável adequada, todos conforme conhecidos no estado da técnica.

[0254] A reação de fermentação é um processo aeróbio em que o oxigênio molecular necessário é fornecido por um gás contendo oxigênio molecular, tal como o ar, ar rico em oxigênio, ou mesmo oxigênio molecular

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64/103 substancialmente puro, desde que mantenha o conteúdo do tanque de fermentação com uma pressão parcial de oxigênio adequada e eficaz para auxiliar as espécies de microrganismo a crescer de forma próspera. Na prática, com a utilização de um substrato de hidrocarboneto oxigenado, a necessidade de oxigênio para o crescimento do microrganismo é reduzida. No entanto, o oxigênio molecular deve ser fornecido para o crescimento, uma vez que a assimilação do substrato e o crescimento correspondente dos microrganismos é, em parte, um processo de combustão.

[0255] Embora a taxa de aeração possa variar em uma faixa considerável, a aeração é geralmente conduzida a uma taxa que está na faixa de cerca de 0,5 a 10, e preferencialmente entre cerca de 0,5 a 7, ~ volumes (na pressão empregada e a 25 °C) de gás contendo oxigênio por volume líquido no fermentador por minuto. Esta quantidade baseia-se no ar com conteúdo normal de oxigênio sendo fornecido ao reator, e em termos de oxigênio puro os respectivos intervalos seriam de cerca de 0,1 a 1,7, ou preferencialmente entre cerca de 0,1 a 1,3 volumes (para a pressão empregada e a 25 °C) de oxigênio por volume de líquido no fermentador por minuto.

[0256] A pressão empregada para o processo de conversão microbiana pode variar amplamente. Pressões geralmente estão dentro da faixa de cerca de 0-50 psig, atualmente são preferencialmente usadas pressões de 0 - 30 psig, mais preferencialmente pelo menos uma pouco pressão um pouco maior que a pressão atmosférica, como um balanço entre equipamentos e custo operacional versus a solubilidade de oxigênio alcançada. Pressões maiores que a pressão atmosférica são vantajosas na medida em que tais pressões tendem a aumentar a concentração de oxigênio dissolvido na fermentação aquosa, que por sua vez pode ajudar a aumentar as taxas de crescimento celular. Ao mesmo tempo, isso é contrabalançado pelo fato de que altas pressões atmosféricas fazer aumentar os custos de equipamentos e

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65/103 operacional.

[0257] A temperatura de fermentação pode variar um pouco, mas para fungos filamentosos, como o Trichoderma reesei, a temperatura geralmente estará dentro da faixa de cerca de 20 °C a 40 °C, em geral, de preferência na faixa de cerca de 25 °C a 34 °C, dependendo a cepa de microrganismo escolhida.

[0258] Os microrganismos também necessitam de uma fonte de nitrogênio assimilável. A fonte de nitrogênio assimilável pode ser qualquer composto contendo nitrogênio ou composto capaz de liberar nitrogênio em uma forma adequada para utilização metabólica pelo microrganismo. Embora possa ser empregada uma variedade de compostos de fonte de nitrogênio orgânicos, tal como hidrolisados de proteína, usualmente são utilizados compostos contendo nitrogênio mais baratos, como a amônia, hidróxido de amônio, ureia e diversos sais de amônio, tais como fosfato de amônio, sulfato de amônio, pirofosfato de amônio, cloreto de amônio, ou podem ser utilizados vários outros compostos de amônio. O próprio gás de amônia é conveniente para operações em grande escala, e pode ser empregado por meio de borbulhamento através da fermentação aquosa (meio de fermentação) em quantidades adequadas. Ao mesmo tempo, a amônia também pode ser empregada para auxiliar no controle do pH.

[0259] A faixa de pH na fermentação microbiana aquosa (mistura de fermentação) deve estar na faixa exemplar de cerca de 2,0 a 8,0. Com fungos filamentosos, o pH normalmente está dentro da faixa de cerca de 2,5 a 8,0; com o Trichoderma reesei, o pH normalmente está dentro da faixa de cerca de 3,0 a 7,0. A preferência da faixa de pH para certos microrganismos são dependentes, até certa ponto, do meio empregado, bem como do microrganismo específico, e, assim, alterar um pouco o pH com a mudança do meio pode ser facilmente determinado pelo técnico hábil no assunto.

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66/103 [0260] Embora o tempo médio de retenção da mistura de fermentação no fermentador pode variar consideravelmente, dependendo em parte da temperatura de fermentação e da cultura empregada, ele geralmente vai estar dentro do intervalo de cerca de 24 a 500 horas, e preferencialmente cerca de 24 a 400 horas. Preferivelmente, a fermentação é realizada de tal forma que o substrato contendo carbono pode ser controlado como um fator limitante, proporcionando assim uma boa conversão do substrato contendo carbono para as células e evitando assim a contaminação das células com uma quantidade substancial de substrato não convertido. Este último não é um problema quando são utilizados substratos solúveis em água, uma vez que qualquer vestígio é facilmente lavado. Entretanto, pode ser um problema no caso de substratos não solúveis em água, e necessita a adição de etapas de tratamento de produto, tal como etapas de lavagem adequadas. Conforme descrito acima, o tempo para atingir a este nível não é crítico e pode variar de acordo com o microrganismo específico e o processo de fermentação sendo realizado. No entanto, é bem conhecido no estado da técnica modos para se determinar a concentração da fonte de carbono no meio de fermentação, e saber se o nível desejado da fonte de carbono foi ou não alcançado.

[0261] Embora a fermentação possa ser conduzida como uma operação do tipo batch (descontínua) ou do tipo contínua, a operação do tipo fed-batch (descontínua alimentada) é mais preferida pela facilidade de controle, produção de quantidades de produto uniforme, e utiliza equipamentos mais econômicos. Se desejado, parte ou a totalidade do material de fonte de energia e carbono e/ou parte da fonte de nitrogênio assimilável, como a amônia, pode ser adicionado ao meio mineral aquoso antes da alimentação do meio mineral aquoso ao fermentador. Cada um dos fluxos introduzidos dentro do reator é preferencialmente controlado em uma taxa predeterminada, ou em resposta a uma necessidade determinável através do monitoramento, tal como a

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67/103 concentração de substrato de carbono e energia, pH, oxigênio dissolvido, oxigênio ou dióxido de carbono nos gases de escape do fermentador, densidade celular mensurável pela transmitância de luz, ou coisa método similar. As taxas de alimentação dos diversos materiais podem ser variadas, de modo a obter uma taxa de crescimento celular tão rápida quanto possível, para ser consistente com a utilização eficiente do carbono e fonte de energia, para, e desse modo, obter um rendimento de células de microrganismos em relação ao custo do substrato tão alto quanto possível.

[0262] Tanto na operação batch quanto na operação fed-batch preferida, todos os equipamentos, reator, ou meios de fermentação, ou recipiente, tubulações, dispositivos de circulação ou de arrefecimento e similares, são inicialmente esterilizados, geralmente empregando vapor, por exemplo, a aproximadamente 121 °C por cerca de pelo menos 15 minutos. O reator esterilizado é então inoculado com uma cultura do microrganismo selecionado na presença de todos os nutrientes necessários, incluindo o oxigênio e o substrato contendo carbono. O tipo de fermentador empregado não é crítico, embora atualmente seja preferida a operação no Biolafitte de 15L (Saint-Germain-en-Laye, França).

[0263] A coleta e purificação das enzimas da presente invenção a partir do caldo de fermentação também podem ser feitas por meio de procedimentos conhecidos no estado da técnica. O caldo de fermentação geralmente contêm restos celulares, incluindo células, vários contaminantes sólidos em suspensão e outras biomassas, bem como o produto enzima desejado da presente invenção, que são preferencialmente removidos do caldo de fermentação por meio de técnicas conhecidas. Processos adequados para essa remoção incluem técnicas convencionais de separação sólido-líquido como, por exemplo, centrifugação, filtração, diálise, microfiltração, filtração rotativa à vácuo, ou outros processos conhecidos para produzir um filtrado livre

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68/103 de células. Pode ser preferível concentrar ainda mais o caldo de fermentação ou o filtrado livre de células utilizando técnicas, como a ultrafiltração, evaporação ou precipitação. A precipitação de componentes proteináceos do sobrenadante ou filtrado pode ser obtida por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio. A purificação adicional pode opcionalmente ser alcançada por cristalização ou por uma variedade de métodos cromatográficos, por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade ou procedimentos reconhecidos de técnicas similares.

[0264] A lipase pode ser ainda formulada antes da utilização nos produtos alimentícios. A lipase pode estar em uma formulação líquida, seca ou granulada.

[0265] Em um exemplo de realização um veículo pode ser usado, preferencialmente o veículo é trigo ou um componente do trigo.

[0266] Em um exemplo de realização a lipase é seca sobre o trigo ou seca sobre um ou mais componentes do trigo.

[0267] Em um exemplo de realização a lipase está em uma formulação líquida adequada para o consumo, e preferencialmente tal composição líquida contém um tampão, sais, sorbitol e/ou glicerol.

[0268] Em um exemplo de realização, a lipase é granulada ou cogranulada com outras enzimas.

Alimento [0269] A enzima da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - um alimento. Na presente invenção, o termo “alimento” significa alimentos destinados ao consumo humano. Da mesma forma, os termos “produto alimentício” ou “gênero alimentício” significa alimentos destinados ao consumo humano.

[0270] O alimento pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo

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69/103 de administração.

[0271] Quando usado como, ou na preparação de, um alimento tal como um alimento funcional - a enzima da presente invenção pode ser usada em conjunto com um ou mais dos seguintes: um veículo nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo.

Ingrediente Alimentar [0272] A enzima da presente invenção pode ser usada como ingrediente de alimentos e/ou pode estar compreendida em uma composição alimentar aditiva para os seres humanos.

[0273] Conforme utilizado no presente o termo “ingrediente alimentar” inclui uma formulação que é, ou pode ser adicionada aos alimentos funcionais ou produtos alimentares como um suplemento nutricional e/ou suplemento de fibras.

[0274] O ingrediente alimentar pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

Suplementos Alimentares [0275] A composição da presente invenção pode ser - ou pode ser adicionada a - suplementos alimentares para os seres humanos.

Alimentos Funcionais [0276] A composição da presente invenção pode ser - ou pode ser adicionada a - alimentos funcionais para os seres humanos.

[0277] Conforme utilizado no presente, o termo “alimento funcional” significa um alimento que é capaz de fornecer não só um efeito nutricional e/ou uma satisfação ao paladar para um ser humano, mas que também é capaz de proporcionar um efeito mais benéfico para o consumidor.

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70/103 [0278] Consequentemente, os alimentos funcionais são alimentos comuns que possuem componentes ou ingredientes (tais como os descritos na presente invenção) incorporados a eles que dão ao alimento uma função específica - por exemplo, um benefício médico ou fisiológico - que não seja um efeito puramente nutricional para um ser humano.

[0279] Embora não exista uma definição legal de um alimento funcional, a maioria das partes com interesse nesta área concorda que eles são alimentos comercializados como possuindo efeitos específicos sobre a saúde.

[0280] Alguns alimentos funcionais são nutracêuticos. No presente, o termo “nutracêutico” significa um alimento que é capaz de fornecer não só um efeito nutricional e/ou uma satisfação ao paladar para um ser humano, como também é capaz de proporcionar um efeito (ou outro beneficio) terapêutico para o consumidor. Os nutracêuticos atravessam as linhas tradicionais de divisão entre alimentos e medicamentos.

[0281] Pesquisas sugerem que os consumidores dão maior ênfase sobre o quê os alimentos funcionais alegam com relação às doenças do coração. A prevenção do câncer é outro aspecto da nutrição que causa grande interesse dos consumidores, mas curiosamente esta é a área na qual os consumidores sentem que menos poderiam exercer controle. Na verdade, segundo a Organização Mundial de Saúde, pelo menos 35% dos casos de câncer estão relacionados com a dieta. Além disso, as alegações relativas aos efeitos sobre a osteoporose saúde do intestino e obesidade também são fatores-chave que são susceptíveis de incitar a compra de alimentos funcionais e direcionar o desenvolvimento de mercado.

Produtos Alimentares [0282] A composição da presente invenção pode ser usada na preparação de produtos alimentares para os seres humanos, como um ou mais dentre: geleias, marmeladas, gelatinas, produtos lácteos (como leite ou queijo),

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71/103 produtos de carne, produtos de aves, produtos de peixe e produtos de panificação.

[0283] A título de exemplo, a enzima da presente invenção pode ser usada como ingrediente para refrigerantes, suco de frutas ou uma bebida compreendendo proteína de soro de leite, chás saudáveis, bebidas de cacau, bebidas lácteas e bebidas bactérias ácido lácticas, iogurte e bebidas a base de iogurte, queijo, sorvetes, gelados e sobremesas, doces, bolos e biscoitos, misturas para bolos, salgadinhos, cereais matinais, macarrão instantâneo e cup noodles, sopas instantâneas e sopas de copo, alimentos e bebidas balanceadas, adoçantes, tacos, tortillas, barras de snack de textura melhorada, barras de fibra, recheios de frutas estáveis ao cozimento, glacê, recheio de padaria sabor chocolate, recheio sabor ‘cheese cake’, recheio de bolo sabor frutas, donuts e bolos gelados, recheios de padaria estáveis ao calor, recheios de padaria instantâneos, recheios para biscoitos, recheios de padaria prontos para uso, recheios de baixa caloria, bebida nutricional para adultos, bebidas de soja/suco acidificados, bebida de chocolate submetida à retorta/asséptica, mistura para bares, bebidas em pó, leite achocolatado ou puro/soja fortificado com cálcio, bebida de café fortificada com cálcio.

[0284] Uma enzima de acordo com a presente invenção pode ainda ser utilizada como ingrediente em produtos alimentares, tais como molho de queijo americano, agente antiaglomerante para o queijo ralado e desfiado, dips, cream cheese, cobertura de creme azedo (sour cream) sem gordura e misturada a seco, chantilly (creme de leite batido) congelado/descongelado, cobertura de chantilly estável ao congelamento/descongelamento, queijo cheddar light, natural e com baixo teor de gordura, iogurte estilo suíço com baixo teor de gordura, sobremesas congeladas aeradas, novelty bars, embalagem de sorvete, de rótulo amigável, econômicos e indulgência de embalagens de sorvete, sorvete de baixo teor de gordura: sorvetes de máquina

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72/103 (soft serve), molho sabor churrasco (barbecue), molho dip de queijo, molho de queijo cottage, mistura seca para molho Alfredo, mistura de molho de queijo, mistura seca de molho de tomate e entre outros.

[0285] Para determinados aspectos, o gênero alimentício é preferencialmente uma bebida.

[0286] Para determinados aspectos, o gênero alimentício é preferencialmente um produto de padaria -, como pão, pão doce (bolo dinamarquês), bolachas ou biscoitos.

Ração [0287] A enzima da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - uma ração para animal ou um componente desta. Assim, a presente invenção também abrange um alimento para animal compreendendo ou feito a partir da enzima da presente invenção e um processo para a produção do mesmo.

Detergente [0288] A enzima da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - um detergente ou um componente desse. Assim, a presente invenção também abrange um detergente compreendendo ou feito a partir da enzima da presente invenção e um processo para a produção do mesmo.

Técnicas Gerais de Metodologia de DNA Recombinante [0289] A presente invenção emprega, salvo quando indicado de outra forma, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro das capacidades de um técnico hábil no assunto. Tais técnicas são esclarecidas na literatura. A Laboratory Manual”. Segunda Edição, Livros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 e suplementos periódicos; “Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13, e 16, John Wiley & Sons,

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Nova Iorque); B. Roe, J. Crabtree, e A. Kahn, 1996, “DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques”. John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach”. Irl Press; e D. M. J. Lilley & J. E. Dahlberg, 1992, “Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology”, Academic Press. Cada um destes textos gerais está incorporado ao presente pela referência.

[0290] A invenção será agora descrita apenas a título exemplificativo com referência as seguintes figuras e exemplos.

Breve Descrição das Figuras [0291] A presente invenção é adicionalmente ilustrada com referência as figuras anexas em que:

[0292] A Figura 1 exibe um modelo das modificações tradicionais previstas de uma enzima lipolítica (por vezes referida na presente invenção como “lipase 3”) e exibida aqui como SEQ ID NO: 2; os resíduos no sítio ativo são mostrados em um círculo - veja Ser146, Asp201, His258; há 7 resíduos de cisteína e 4 estão envolvidos em pontes de bissulfeto, mostrado como uma linha tracejada e como uma linha sólida acima dos resíduos, há dois sítios para a glicosilação N-ligado, ou seja, N32 e N242, que são mostrados em negrito e estão sublinhados (este último, ou seja, N242, está próximo do sítio ativo His). NOTA: a numeração nesta figura refere-se à enzima lipolítica exibida como SEQ ID NO: 2, sem o peptídeo sinal de 27 aminoácidos - portanto, quando referindo-se à enzima lipolítica mostrada na SEQ ID NO: 1 (ou seja, com o peptídeo sinal) a numeração em relação aos resíduos do sítio ativo precisa ser ajustada pela adição de 27 aminoácidos.

[0293] A Figura 2 exibe um esquema do método da presente invenção.

[0294] A Figura 3 exibe um diagrama esquemático do DNA

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74/103 genômico da enzima lipolítica do Aspergillus tubingensis.

[0295] A Figura 4 exibe a construção de expressão “ATlipase3Trex”.

[0296] A Figura 5 exibe os resultados de um ensaio da atividade lipase realizada no sobrenadante de transformantes de Trichoderma reesei.

[0297] A Figura 6 exibe um perfil de proteínas por SDS-PAGE realizado no sobrenadante de transformantes de Trichoderma reesei. A faixa indicada com uma seta mostra um dos transformantes que expressam níveis muito elevados de enzima lipolítica (“lipase 3”).

[0298] A Figura 7 exibe um perfil de proteínas por SDS-PAGE do sobrenadante de transformantes de Trichoderma reesei cultivados em um fermentador de 3 litros. A seta indica a banda da proteína enzima lipolítica (“lipase 3”).

[0299] A tabela A exibe a produção da proteína enzima lipolítica (lipase 3) no caldo de fermentação quando a enzima lipolítica é expressa em diferentes hospedeiros de expressão. O rendimento é expresso como uma % de aumento no rendimento em cada organismo:

Aspergillus tubingensis;

Pichia pastoris;

Hansenula polymorpha;

Trichoderma reesei.

A Figura 9 exibe uma análise de Southern blot demonstrando a cepa de T. reesei que foi transformada com várias cópias do gene da enzima lipolítica “lipase 3”, as pistas são marcadas da seguinte forma:

M - cepa do hospedeiro não transformada;

B - cepa transformada usando a transformação por biobalística;

E - cepa transformada utilizando a eletroporação.

[0300] A Figura 10 exibe um perfil de proteínas por SDS-PAGE

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75/103 usado para caracterizar a enzima lipolítica (“lipase 3”), expressa em Trichoderma reesei. As amostras de culturas cultivadas em diferentes caldos mostrou a proteína lipase 3 como bandas duplas ou triplas.

[0301] A Figura 11a exibe dois UFCs (concentrados por ultrafiltração) diferentes mostrando a precipitação da enzima lipolítica “lipase 3”. A proteína menos concentrada no UFC 1035 mostra precipitação pesada e a proteína mais concentrada no UFC 1036 mostra uma precipitação muito pesada. A precipitação é dependente da concentração - quanto maior a concentração de proteína mais provavelmente a proteína é precipitada.

[0302] A Figura 11b exibe uma análise por SDS-PAGE mostrando a presença da proteína enzima lipolítica “lipase 3” no precipitado da Figura 11a:

Pista 1 - Centrifugado filtrado do sobrenadante bruto;

Pista 2 - Sedimento ressolubilizado a partir do UFC 1035;

Pista 3 - Sedimento ressolubilizado a partir do UFC 1036;

[0303] A Figura 12 exibe a ressolubilização de enzima lipolítica precipitada (“lipase 3”) utilizando diferentes concentrações de tampão fosfato de sódio. As amostras estavam em pH 5,30.

Pista 1 - Controle, bruto;

Pistas 2-6: 5 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM & 50 mM de fosfato de sódio;

[0304] A Figura 13 exibe a caracterização da enzima lipolítica “lipase 3” recombinante pela análise de MALDI-TOF/MS da lipase glicosilada em comparação com a de-glicosilada. O tamanho do N-glicano é de cerca de 1384 Da e as moléculas de enzima lipolítica (lipase 3) podem ter glicanos anexados no sítio N32 (quando se considera a SEQ ID NO: 2);

[0305] A Figura 14 exibe uma análise de proteínas SDS-PAGE da enzima lipolítica (lipase 3) purificada submetida a deglicosilação. Desglicosilação da enzima: Endo-H, 2,0 mg/ml. A endo-H foi adicionada na

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76/103 proporção de 1:50 e 1:100 (p/p) e incubada por 20 horas em temperatura ambiente, pH 5,5.

Pista 1 - Controle

Pista 2 - diluição de 1:100 do sobrenadante

Pista 3 - diluição de 1:50 do sobrenadante [0306] As atividades específicas são apresentadas na tabela 1 abaixo. A glicosilação N-ligada não tem efeito sobre a atividade específica da enzima lipolítica (lipase 3). A deglicosilação da enzima lipolítica (lipase 3) não afetou a atividade da enzima;

[0307] A Figura 15 exibe a sequência de aminoácidos (SEQ ID No. 1) de uma enzima lipolítica de Aspergillus tubingensis em que o peptídeo sinal endógeno é mostrado em negrito.

[0308] A Figura 16 exibe a sequência de aminoácidos (SEQ ID No. 2) de uma enzima lipolítica a partir do Aspergillus tubingensis que é a mesma que a SEQ ID No. 1, exceto que o peptídeo sinal endógeno foi removido.

[0309] A Figura 17 exibe a sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima lipolítica de Aspergillus tubingensis (conforme exibido na SEQ ID NO: 1), incluindo a sequência de sinal - a sequência de nucleotídeos é uma sequência de DNA genômico (e foi designada como SEQ ID NO: 3). A sequência sinal é exibida em negrito e os introns são mostrados em letras minúsculas.

[0310] A Figura 18 exibe a sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima lipolítica de Aspergillus tubingensis (conforme exibido na SEQ ID NO: 2), não incluindo a sequência sinal - a sequência de nucleotídeos é uma sequência de DNA genômico (e foi designada como SEQ ID NO: 4). Os introns são exibidos em letras minúsculas.

[0311] A Figura 19 exibe a sequência do promotor do gene celobiohidrolase 1 (cbhl) designado como SEQ ID NO: 5.

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Exemplo 1

Expressão da Lipase 3 de Aspergillus tubingensis em Trichoderma reesei

1. Construção de Expressão e Cepa Utilizada para a Transformação [0312] O plasmídeo de DNA pDONR^TM 221 obtido a partir da Invitrogen (catálogo no.12536-017) foi usado como o vetor doador. O pDONR221::lip 3 contendo o DNA genômico da lipase 3 de Aspergillus tubingensis (Figura 3) foi recombinado para o vetor de destino T. reesei gateway pTrex3G (descrito em detalhes na publicação WO 05/001036), resultando na construção de expressão final ATlipase3Trex (Figura 4).

[0313] O cassete de expressão continha as regiões promotora e terminadora do gene celobiohidrolase 1 (cbh1) de T. reesei. Também continha o gene amdS da acetamidase de Aspergillus nidulans como marcador de seleção para a transformação do T. reesei.

[0314] O DNA genômico da lipase 3 de Aspergillus tubingensis codifica uma enzima lipase 3 lipolítica possuindo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1.

[0315] O termo “lipase 3”, quando utilizado na presente invenção refere-se a uma enzima lipolítica compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, tal como a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1. A SEQ ID NO: 1 contém a sequência sinal; e a SEQ ID NO: 2 é a proteína lipase madura sem a sequência sinal.

[0316] A cepa utilizada para a transformação foi um Trichoderma reesei derivado de uma cepa não modificada geneticamente: RL-P37 a partir da qual os genes que codificam as duas celobiohidrolases secretadas, CBHI e CBHII, e duas das endoglucanases secretadas, EGI e EGII, foram deletadas.

O Vetor de Expressão pTrex3g.

[0317] A seguir é descrita a construção do vetor pTrex3g que

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78/103 pode ser usado para expressar os genes da presente invenção.

[0318] Este vetor é baseado no vetor de E. coli pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, EUA) que é um vetor baseado em fagomídeo pUC118 (Brosius, J. (1989) DNA 8:759) com um sítio de clonagem múltipla estendido contendo 64 sequências hexâmeros de reconhecimento de enzimas de restrição. Ele foi projetado como um vetor de destino Gateway (Hartley, JL, Temple, GF e Brasch, MA (2000) Genome Research 10:1788-1795) para permitir a inserção usando a tecnologia Gateway (Invitrogen) de qualquer quadro de leitura aberto desejado entre as regiões do promotor e terminador do gene cbhl de T. reesei. Ele também contém o gene amdS de Aspergillus nidulans para uso como marcador de seleção na transformação de T. reesei.

[0319] Os detalhes da pTrex3g são os seguintes. O vetor é de

10,3 kb de tamanho.

[0320] Estão inseridos na região de poliligante do pSL1180 os seguintes segmentos de DNA:

1. Um segmento de 2.2 bp de DNA da região promotora do gene cbh1 de T reesei.

2. O quadro de leitura Gateway de 1,7 kb; Um cassete adquirido da lnvitrogen que inclui os sítios de recombinação attRl e attR2 em cada extremidade que flanqueia o gene de resistência ao cloranfenicol (CmR) e o gene ccdB.

3. Um segmento de 336 bp de DNA da região terminadora do gene cbh1 de T reesei.

4. Um fragmento de DNA de 2,7 kb contendo o gene amdS de Aspergillus nidulans com seu promotor nativo e regiões terminadoras.

2. Transformação de T. reesei com Deleção Quádrupla da Cepa Hospedeira [0321] A construção de expressão, ATlipase3Trex, contendo o

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79/103 gene da lipase 3 de A. tubingensis foi transformado em uma cepa de T. reesei utilizando eletroporação ou transformação por biobalística de bombardeamento de partículas usando o sistema PDS-1000 Helium (Cat BioRad. No. 16502257). Os produtos da PCR contendo apenas DNA de fungos ou plasmídeo de expressão inteiro foram usados para gerar transformantes pela transformação por biobalística e eletroporação.

A. Transformação por Eletroporação [0322] A cepa hospedeira de T. reesei para ser transformada foi cultivada até a esporulação total em placas PDA durante 5 dias. Os esporos de duas placas foram coletados com 1,2 M de sorbitol e filtrados através de miracloth para a retirada do ágar. Os esporos foram transferidos para um tubo tipo falcon de 50 ml e lavados por centrifugação repetida de 5 a 6 vezes com 50 ml de água. Os esporos foram ressuspensos em um volume pequeno (menos de 2x o volume do sedimento), utilizando a solução de sorbitol 1,2 M. A suspensão de esporos foi então mantida em gelo. 90 pl da suspensão de esporos foi aliquotada na cuveta de eletroporação (E-shot, cuveta de eletroporação padrão de 0,1 centímetros da Invitrogen). 10-20 pL da construção de DNA (plasmídeo da Figura 4 ou produto da PCR) foram adicionados à suspensão de esporos e a eletroporação foi fixada em 16kV/cm, 25pF, 50Ω. Após a eletroporação, a suspensão de esporos foi deixada no gelo, ressuspensa em 5 partes de sorbitol 1M e 1 parte de YEPD, e deixado para germinar pela incubação a 28 °C com agitação de 250 rpm durante a noite. No dia seguinte, os germinantes foram semeados em placas de ágar contendo acetamida. Os transformantes foram escolhidos e transferidos individualmente para placas de ágar acetamida.

B. Transformação pelo Bombardeio de Partículas (Transformação por

Biobalística) [0323] Uma suspensão de esporos de uma cepa com deleções

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80/103 quádruplas de T. reesei foi preparada. 200 μΙ da suspensão de esporos foram espalhadas no centro de placas de acetamida com meio mínimo (MM). (Placas de acetamida MM tinham a seguinte composição: 0,6 g/l de acetamida; 1,68g/l de CsCl; 20g/l de glicose; 20g/l de KH2PO4, 0,6 g/l de CaCl2 2H2O; 1 ml/l solução de oligoelementos 1000x; 20g/l de ágar noble, e pH5,5. A solução oligoelementos 1000x continha 5,0 g/l de FeSO4 7H2O; 1,6 g/l de MnSO4; 1.4g/l de ZnSO4 7H2O e 1,0 g/l de CoCl2 6H2O. A suspensão de esporos foi deixada para secar sobre a superfície do meio acetamida MM por 1 hora em capela estéril. A transformação foi realizada seguindo as instruções do fabricante. 60mg de partículas de tungstênio foram colocadas em um tubo de microcentrífuga. 1ml de etanol foi adicionado e deixado em repouso por 15 segundos. O etanol foi removido e as partículas foram lavadas três vezes com dH2O estéril antes de serem adicionado 250 μl de glicerol estéril 50% (v/v). 25 μl da suspensão de partículas de tungstênio foram colocadas em um tubo de microcentrífuga. Enquanto agitado continuamente em um vortex, os seguintes foram adicionados: 5 μl (100-200 ng/μθ de plasmídeo DNA, 25 μl de CaCl2 2,5 M e 10 μl de espermidina 0,1 M. As partículas foram centrifugadas por 3 segundos. O sobrenadante foi removido e as partículas foram lavadas com 200 μl de etanol 100% e centrifugadas por 3 segundos. O sobrenadante foi removido. 24 μύ de etanol 100% foram adicionado e misturado utilizando uma pipeta, então alíquotas de 8 μl das partículas foram removidas e colocadas no centro dos discos microcarregadores que foram mantidos em um dessecador. Quando a solução de tungstênio/DNA secou o disco microcarregador foi colocado na câmara de bombardeio junto com a placa de acetamida MM com esporos e o processo de bombardeio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Após o bombardeamento dos esporos plaqueados com partículas de DNA tungstênio, as placas foram incubadas a 28 °C. As colônias transformadas foram transferidas para placas com meio acetamida MM fresco

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81/103 e incubadas a 28 °C.

3. Crescimento de Transformantes em Placas de Microtitulação [0324] Após 5 dias de crescimento em placas de acetamida MM, os transformantes obtidos por eletroporação ou por transformação por biobalística exibindo morfologia estável foram inoculados em 200 μΙ de meio definido com glicose/soforose em placas de microtitulação de 96 poços. O meio definido com glicose/soforose (por litro) consiste de 5g de NH42SO4, 33 g de tampão Pipps de, 9g de Ácidos Casamino, 4,5 g de KH2PO4, 1g de CaCl2 (anidro), 1g de MgSO4.7H2O, pH 5,5 ajustado com NaOH 50% com H2O milli-Q para trazer a um volume de 966,5 mL. Após a esterilização, foram adicionados os seguintes: 5 mL de Mazu, 26 mL de Glicose/Soforose 60% e 400X de traço de metais T. reesei 2,5 mL. A placa de microtitulação foi incubada em uma câmara de crescimento com oxigênio a 28 °C durante 5 dias.

Exemplo 2

Seleção pelo Ensaio de “Spot” para Lipase & SDS-PAGE [0325] O micélio foi removido por centrifugação e o sobrenadante foi analisado para atividade da lipase utilizando o ensaio de spot. O ensaio em placa da Lipase é baseada na liberação de ácidos graxos a partir do substrato (tributirina), na presença da lipase. A cor rosa é formada quando o ácido graxo é liberado e forma um complexo com rodamina B. A placa de ensaio continha 2,0g de ágar Bacto (dissolvido por aquecimento por 5 minutos em 100 ml de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5. A solução foi mantida a 70 °C em banho-maria, sob agitação, 0,5 ml de Rodamina 2% e 40ml de tributirina foram adicionados. A mistura foi submetida à sonicação por 2 minutos e 10-15 ml foi vertido em placas de Petri. Buracos foram perfurados e o sobrenadante da cultura foi aplicado aos buracos. As placas foram incubadas a 37 °C até que uma cor rosa se desenvolvesse indicando a presença de atividade lipolítica. O sobrenadante (10 μθ a partir dos transformantes foi verificado quanto à

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82/103 atividade da lipase utilizando o ensaio “spot test”, conforme mostrado na Figura 5, as setas indicam o aparecimento da cor rosa após 30 minutos de incubação a 37 °C, mostrando a elevada atividade da lipase.

[0326] O perfil proteico dos transformantes exibindo atividade lipase elevada foi determinado por SDS-PAGE utilizando gel de poliacrilamida NuPAGE 4-12% e MES como tampão de corrida. As amostras do sobrenadante foram misturadas com o volume adequado de tampão de carregamento de amostra 2x com agente redutor. Os géis foram corados com “Simply blue Safestain' (Invitrogen). Na Figura 6 a pista marcada com uma seta exibe um dos transformantes expressando níveis muito elevados de lipase 3 aparecendo como uma banda dupla. O resto dos transformantes demonstrou bandas únicas distintas e ligeiramente distorcidas. O melhor transformante cultivado em um fermentador de 3 litros deu um título de proteína total secretada de pelo menos 20g/litro e a análise de SDS-PAGE mostrou uma larga banda da lipase (Figura 7).

Exemplo 3

Fermentação em Larga Escala (14 litros) de Transformantes Lipase 3 [0327] Os transformantes de Trichoderma reesei foram cultivados em fermentadores, conforme descrito na publicação WO 2004/035070. Quatro transformantes diferentes, gerados por eletroporação, foram cultivados. A dosagem de proteína total e atividade da lipase no sobrenadante de cultura, após a remoção das células, indicou que mais de 20 gramas de lipase por litro estava presente após 160 horas de fermentação. Duas linhagens, gerada pela transformação biobalística também foram cultivadas. Estes exibiram um excesso de 20 gramas de lipase por litro no sobrenadante de cultura após 160 horas de fermentação. A quantidade de lipase produzida por estes três transformantes foi muito além da quantidade de lipase produzida pelas três outras espécies hospedeiras microbianas (Tabela A).

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83/103 [0328] Os transformantes de Trichoderma reesei foram cultivados em fermentadores. Quatro transformantes diferentes, gerados por eletroporação, foram cultivados. A dosagem de proteína total e atividade da lipase no sobrenadante de cultura, após a remoção das células, indicou que mais de 20 gramas de lipase por litro estava presente após 160 horas de fermentação. Duas linhagens, gerada pela transformação biobalística também foram cultivadas. Estes exibiram um excesso de 20 gramas de lipase por litro no sobrenadante de cultura após 160 horas de fermentação. A quantidade de lipase 3 produzida por estes três transformantes foi muito além da quantidade de lipase produzida pelas três outras espécies hospedeiras microbianas (Tabela A).

Tabela A

Hospedeiro de Expressão	Aumento do rendimento (%) de Lipase 3
1. Aspergillus tubingensis	100
2. Pichia pastoris;	570
3. Hansenula polymorpha	850
4. Trichoderma reesei	4200
5. Trichoderma reesei	8570

Exemplo 4

SOLUBILIDADE DA LIPASE 3 [0329] Surpreendentemente os presentes inventores revelaram que o Trichoderma reesei é capaz de produzir lipase 3 em níveis muito elevados. O processamento subsequente (a jusante) da lipase após a fermentação exige a concentração do caldo de cultura em 4x pela ultrafiltração utilizando uma membrana com um valor de corte (cut-off) de peso molecular de 10.000. A lipase 3 é propensa a precipitação conforme mostrado na Figura 11a. A precipitação pesada é observada no UFC mais concentrado. A presença de

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84/103 proteína lipase 3 no precipitado foi confirmada por SDS-PAGE.

[0330] As Figuras 11a e 11b mostram que a precipitação da lipase 3 é dependente da concentração.

[0331] A Figura 11a exibe dois concentrados por ultrafiltração (UFCs) diferentes mostrando a precipitação da lipase 3. O UFC 1035 contém menos proteína concentrada e mostra precipitação pesada. O UFC 1036 contém mais proteína concentrada e mostra precipitação muito pesada.

[0332] A Figura 11b exibe uma análise por SDS-PAGE mostrando a presença da proteína lipase 3 no precipitado exibido na Figura 11a:

Pista 1 - Centrifugado filtrado do sobrenadante bruto;

Pista 2 - Sedimento ressolubilizado a partir do UFC 1035;

Pista 3 - Sedimento ressolubilizado a partir do UFC 1036;

[0333] Para a ressolubilização de lipase precipita, foi utilizado tampão estoque. O tampão de estoque consiste em 1,0 M de tampão fosfato de Na, pH 8,0 Na2HPO4.2H2O (177,99 g) adicionado a 900 ml de água DI. Para 10,0 g de amostras de lipase 3 bruta UFC 1036, pH 4,44 foi adicionado 50, 100, 200, 400 e 500 ml de solução tampão estoque para uma concentração final de 5, 10, 20, 40 e 50 mM de fosfato de Na, respectivamente. Todos os frascos foram misturados e deixados em temperatura ambiente por alguns minutos.

[0334] Conforme mostrado na Figura 12, a adição de fosfato-Na acima de 40 mM provocou a precipitação da lipase 3 na solução. A solução resultante era clara e livre de qualquer matéria sólida. O pH das amostras foi mensurado em pH 5,3 (a 50 mM de concentração de Na-P).

Exemplo 5

Caracterização de Lipase 3 Recombinante 3 pela Análise de MALDITOF/MS & Digestão Proteolítica [0335] A Lipase 3 expressa por T. reesi foi purificada a partir do

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85/103 sobrenadante da cultura utilizando uma combinação de cromatografia de troca iônica e de interação hidrofóbica. A deglicosilação foi realizada com endoglicosidase H no tampão de reação que consistia de 50 mM de citrato de sódio, pH 5,5. A endoglicosidase H (2,0 mg/mL) foi adicionada a lipase 3 a uma proporção de proteína de 1/1000 a 1/100 (p/p). A reação de deglicosilação foi realizada a 37 °C por 3 horas. A amostra de proteína que reagiu foi colocada em uma coluna tipo ZipTip® (Micro coluna C4 de fase reversa) (Millipore, Bedford, MA) para a limpeza da amostra antes da análise de MALDI-TOF/MS. O processo de limpeza foi realizado para dessalinizar as amostras. Pelo menos, cinco ciclos de solução de lavagem que consiste de metanol 5% em 0,1% de TFA/água de lavagem foi usada. Posteriormente as amostras foram eluídas para a espectrometria de massa.

Análise da Proteína Intacta por MALDI-TOF/MS [0336] A amostra de proteína dessalinizada foi preparada para análise de MALDI-TOF/MS pela cocristalização de um volume igual (1 pL) da amostra com matriz de ácido sinapínico (saturada em acetonitrila 50%, 0,1% de ácido fórmico) usando o método da gota seca. Os espectros de massa das proteínas foram obtidos utilizando um espectrômetro de massa Voyager DESTR MALDI-TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As configurações do MS foram as seguintes para a faixa de 20.000-80.000 m/z: modo linear de operação, modo de extração atrasada, polaridade positiva, tensão de aceleração de 25 kV, tensão de rede em 93%, e tempo de atraso de extração 750 nsec. 300 disparos de laser/espectro e BSA foram usados como calibrador externo.

Digestão Proteolítica e Mapeamento de Sitio(s) de N-glicosilação pela

Análise de LC/MS/MS [0337] Todas as amostras líquidas tratadas com Endo-H foram precipitadas com TCA 10% seguido pelas reações de redução com 20 mM de

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DTT @ 50°C por 15-20 minutos. A reação de alquilação também foi realizado com ^{55 mM de iodoacetamida}. a reação de alquilação foi autorizada a prosseguir no escuro por 45 min em temperatura ambiente. ^{A digestões} proteolítica foi realizada pela incubação com diversas proteases em 25 mM de bicarbonato de amônio 4 horas a 37 °C (a relação de enzima para substrato foi de 1:20). O mapeamento peptídico realizado utilizando três digestões proteolíticas diferentes (tripsina, quimotripsina, endoproteinase glic) sobre a lipase glicosilada confirmou a ausência de modificação da proteína através truncamento e a presença de uma proteína lipase intacta com extremidades Ne C-terminais autênticas.

[0338] A lipase 3 tem dois sítios de N-glicosilação potenciais no N32 e N242. O Mapeamento de peptídeos foi realizado para ambas lipase 3, não tratada e tratada com Endo-H. Para determinar o local de N-glicosilação, os dados MS e MS/MS foram adquiridos usando o sistema Surveyor® LC acoplado ao LCQ Advantage ou LCQ Deca XP (ThermoFinnigan, San Jose, CA). O gradiente de HPLC foi programado entre 0% a 70% B por mais de 50 minutos. Solvente A: TFA 0,1% em água; e solvente B: TFA 0,08% em acetonitrila. O processamento de dados foi realizado utilizando o TurboSEQUEST e Xcalibur (ThermoFinnigan, San Jose, CA).

[0339] Conforme mostrado na Figura 13, o SDS-PAGE mostrou a lipase recombinante secretada pelo Trichoderma aparecendo como uma banda dupla antes do tratamento com a endoglicosidase H. A análise de MALDI-TOF/MS mostrou que as espécie de maior peso molecular era uma forma glicosilada da lipase 3 com um peso molecular de 30.236 Daltons e as espécies de menor peso molecular era uma forma deglicosilada com peso molecular de 29.210 Daltons. Experimentalmente as amostras de lipase deglicosiladas foram geradas usando a endoglicosidase H. Os pesos moleculares observados após o tratamento com a endoglicosidase H foram

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87/103 de 29.035 Dalton (presume-se ser uma forma não glicosilada), 29.219 (presume-se ser uma forma de lipase 3 com um N-acetilglucosamina N-ligado na posição N32 ou N242) e 29.422 (presume-se ser uma forma de lipase 3 com 2 resíduos de N-acetilglucosamina ligados a cadeia principal da proteína nas posições N32 e N242). A cadeia de glicano que está presente antes da deglicosilação com a endoglicosidase H tem um peso molecular de aproximadamente 1384 daltons com a maioria das moléculas de lipase possuindo um glicano anexado apenas ao sítio N32 (numerado de acordo com a SEQ ID NO: 2).

Exemplo 6

Atividade Específica da Enzima Lipolítica Lipase 3 Produzida em T. reesei

Utilizando Dois Substratos Diferentes [0340] A lipase 3 purificada foi submetida a deglicosilação pelo tratamento com endoglicosidase H. As amostras não tratadas e deglicosiladas foram caracterizadas pela medição das atividades específicas usando substratos tanto de cadeia curta (C4) como de cadeia longa (C18).

[0341] Conforme mostrado na Figura 14 e Tabela 2 a presença de cadeias laterais de glicano não tem efeito sobre a atividade específica da proteína.

[0342] A Tabela 2 mostra os resultados dos experimentos de deglicosilação. A amostra foi a lipase 3 de Trichoderma purificada e a enzima de deglicosilação foi a Endo-H.

Tabela 2

	Atividade Específica, %
Amostra	LIPU/ml (Cadeia curta, C4)	LUSol/ml (Cadeia longa, C18)

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88/103

Controle (pista 1)	100	100
1:100 Endo-H (pista 2)	99.4	103
1:50 Endo-H (pista 3)	97.7	105

Exemplo 7

Analise por Southern blot [0343] A Figura 9 exibe uma análise de Southern blot demonstrando a cepa de T. reesei que foi transformada com várias cópias do gene da enzima lipolítica “lipase 3”, as pistas são marcadas da seguinte forma:

M - cepa do hospedeiro não transformada;

B - cepa transformada usando a transformação por biobalística;

E - cepa transformada utilizando a eletroporação.

Exemplo 8

Estudos de Expressões [0344] A lipase de Thermomyces lanuginosus foi clonada e expressa em T. reesei. Os transformantes foram isolados e o melhor produtor de lipase foi testado em uma fermentação em escala de 14 litros para investigar se o Trichoderma reesei é uma cepa hospedeira adequada para a expressão de outras lipases. A proteína total no final da fermentação (200 horas) foi estimada em mais de 20 g/L, conforme mostrado na Figura 14. A análise por SDS-PAGE mostrou que a proteína lipase foi dominantemente produzida. A atividade da lipase mensurada no final da fermentação foi de 30.000 U/mL usando o ensaio DGGR. O caldo foi filtrado e concentrado por UFC e em uma alta concentração a lipase parecia precipitar. Foi facilmente trazida de volta para solução pela diluição em tampão ou sal.

Exemplo 9

Estudos se Expressão [0345] A Tabela 3 fornece os resultados de uma série de estudos

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89/103 de expressão.

[0346] Os presentes inventores revelaram surpreendentemente que a enzima lipolítica “Lipase 3” produzida em Trichoderma reesei é menos glicosilada (especificamente com menos glicosilação N-ligada) em comparação com a mesma enzima produzida em outros organismos.

Tabela 3

Comparação com outros Hospedeiros Usados para Expressar a Lipase 3 de

Aspergillus Tubingensis.

Hospedeiro de Expressão	Glicosilação nos sítios N32 & N242	Qualidade da proteína
Aspergillus tubigensis 3M	Hiperglicosilação (superglicosilação 10%) (ambos os sítios N32 & N242)	Atividade reduzida
Pichia pastoris GS115	Hiperglicosilação (ambos os sítios N32 & N242) O-glicanos	Atividade > atividade observada com A. tubigensis da cepa lipase recombinante
Hansenula polymorpha RB11	Glicosilação (ambos os sítios N32 & N242) Glicano 1%	Atividade > atividade observada com A. tubigensis da cepa lipase recombinante
T. reesei	Maioria da N- glicosilação no N32	Atividade é a mesma como da lipase 3 nativa não recombinante do Aspergillus cepa 1M341

Exemplo 10

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90/103 [0347] As células hospedeiras para expressão adequadas para uso na presente invenção podem ser uma cepa de T. reesei em que os genes que codificam a celobiohidrolase I (CBHI, Cel7a), celobiohidrolase II (CBHII, Cel6a), endoglucanase I (EGI, Cel7b), e endoglucanase II (EGII, Cel5a) foram inativadas pela deleção ou interrupção usando técnicas de genética molecular. Esta cepa (cepa com deleção quádrupla) é útil como um hospedeiro para a superexpressão dos genes que codificam outras proteínas secretadas pelo T. reesei.

[0348] Preferencialmente as células hospedeiras adequadas para uso na presente invenção podem ser derivadas de uma célula de Trichoderma reesei da cepa RL-P37 usando os métodos descritos na publicação WO 2005/001036 e US28026376 A1.

[0349] Uma cepa de T. reesei adequada para uso na presente invenção pode ser derivada da cepa disponível publicamente de T. reesei RLP37. O T. reesei de cepa RL-P37 pode ser modificado para formar o T. reesei cepa 1A52 conforme descrito na publicação WO 05/001036. O T. reesei cepa 1A52 pode ser modificada, conforme descrito na US 20080026376 para formar uma célula T. reesei utilizável na presente invenção.

[0350] A RL-P37 pode ser modificada para formar o T. reesei cepa 1A52 conforme descrito abaixo.

[0351] A cepa hospedeira de T. reesei usada pode ser derivada da cepa publicamente disponível RL-P37, que foi utilizada para a fabricação de preparações comerciais de celulase pela Genencor International, Inc. A derivação e caracterização desta cepa foi publicada anteriormente (SheirNeiss, G. e Montenecourt, BS (1 984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53; Patente US 4.797.361). É uma cepa mutante que superproduz celulase que foi obtida como resultado de diversas etapas de mutagênese da cepa do tipo selvagem (QM6a).

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91/103 (1) Isolamento de uma cepa mutante pyr4.

[0352] A fim de preparar uma cepa RL-P37 para transformação com DNA plasmidial foi necessário isolar um derivado possuindo uma mutação nula no gene pyr4.

[0353] O gene pyr4 codifica a descarboxilase-5'-monofosfato orotidina, uma enzima necessária para a biossíntese de uridina. O inibidor do ácido 5-fluoroorótico (FOA) tóxico é incorporado na uridina por células do tipo selvagem e, portanto, envenena as células. No entanto, as células defeituosas do gene pyr4 são resistentes a esse inibidor, mas exigem a uridina para o crescimento. É, portanto, possível selecionar cepas mutantes para pyr4 usando o FOA. Na prática, esporos de T. reesei cepa RL-P37 foram semeados sobre a superfície de um meio solidificado contendo 2 mg/ml de uridina e 1,2 mg/ml de FOA. Colônias espontaneamente resistentes ao FOA apareceram dentro de três a quatro dias. Os mutantes resistentes ao FOA que necessitavam de uridina para o crescimento foram identificados. A fim de identificar os mutantes que tinham protoplastos com gene pyr4 especificamente defeituosos foram gerados e transformados com um plasmídeo contendo um gene pyr4 do tipo selvagem (Smith, JL, Bayliss, FT e Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19:27-33). OS protoplastos após a transformação foram semeados em meio sem uridina. O subsequente crescimento de colônias transformadas demonstrou a complementação de um gene pyr4 defeituoso pelo gene pyr4 de origem plasmidial. Desta forma a cepa GC69 foi identificada como um mutante para pyr4 da cepa RL-P37.

(2) Construção de um plasmídeo criado para deletar o gene que codifica CBHl.

[0354] O gene cbhl, que codifica a proteína CBHI, foi clonado a partir do DNA genômico da cepa RL-P37 por hibridização com uma sonda de oligonucleotídeos desenvolvida em função da sequência publicada para este

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92/103 gene (Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. e Innis, M. (1983) Biotechnology 1:691-696). O gene cbhl reside sobre um fragmento Pstl de 6,5 kb e foi inserido no sítio Pstl do pUC4K (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, EUA), substituindo o gene de resistência a canamicina desse vetor. O plasmídeo resultante, pUC4K::cbh1, foi então cortada com Hindlll e o maior fragmento foi isolado e religado para formar o pUC4K::cbh1AH/H. Este procedimento removeu toda a sequência codificadora de cbhl e aproximadamente 1,2 kb das sequência flanqueadoras a 5' e 1,2 kb da sequência flanqueadoras 3'. Aproximadamente 1 kb de DNA flanqueador permaneceu em ambas extremidades do fragmento Pstl original. O gene pyr4 do T. reesei foi clonado como um fragmento de 6,5 kb Hindlll de DNA genômico no pUCl8 para formar o pTpyr2 (Smith, JL, Bayliss, FT e Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19:27-33). O plasmídeo pUC4K::cbh1 AH/H foi cortado com Hindlll e as extremidades foram desfosforilada com fosfatase alcalina intestinal bezerro. Este DNA foi ligado com o fragmento de 6,5 kb Hindlll contendo o gene pyr4 para formar o pACBHlpyr4.

[0355] A digestão do pACBHlpyr4 com EcoRl liberou um fragmento maior que consistia das regiões flanqueadoras do locus cbh1 em ambas as extremidades com o gene pyr4 substituindo a sequência de codificação de cbh1 no centro. O único DNA neste fragmento que não foi derivado do T. reesei foi um fragmento de 21 pb derivado do sítio múltiplo de clonagem do pUC4K.

(3) Deleção do gene cbhl de T. reesei.

[0356] Protoplastos isolados de micélio da cepa GC69 foram transformados com o plasmídeo digerido EcoRl pACBHlpyr4 usando métodos descritos por Smith et al., 1991. Transformantes estáveis foram obtidos e aqueles a partir dos quais o gene cbh1 foi excluído foram identificados conforme descrito abaixo.

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93/103 [0357] O DNA total foi isolado a partir dos transformantes e digerido com Pstl, submetido a eletroforese em gel se agarose e submetido a um blotting em papel de filtro. O filtro foi então hibridizado com pÁCBHlpyr4 marcado com P³² e o padrão de hibridização foi observado por autoradiografia. Esta sonda hibridizou com os genes cbhl e pyr4 nativos em uma cepa não transformadas. Em um transformante (a cepa P37PÁCBHI) foi observado um padrão de hibridização que poderia seria previsto se um evento de integração de cross-over duplo tivesse ocorrido. Ou seja, o gene cbhl foi deletado pela integração de uma única cópia do fragmento EcoRl maior obtido a partir do pÁCBHlpyr4 no locus cbhl da cepa RL-P37.

[0358] A análise por Southern também foi realizada conforme descrito acima, exceto que a sonda utilizada foi a plntCBHI radiomarcada. Este plasmídeo consiste de um vetor pUC contendo um fragmento Bglll de 2 kb do locus cbh1 dentro da região que foi deletada no pUC4K::cbh1ÁH/H. Este plasmídeo hibridiza no locus cbh1 da cepa GC69, mas não hibridiza com o DNA da cepa P37PÁCBHI. Isso confirma que o gene cbh1 foi deletado e que o fragmento de DNA pUC a partir do pÁCBHlpyr4 não foi incorporado pela cepa deletada.

[0359] A análise de proteínas secretadas pela separação em géis de focalização isoelétrica mostrou que a proteína CBHl não foi produzida pela cepa P37PÁCBHI.

(4) Geração de um mutante do P37PÁCBHI, pyr4 nulo.

[0360] Esporos dos transformantes (P37PÁCBHI), que foram submetidos a deleção do gene cbhl foram espalhados em meio contendo FOA. Um derivado deficiente de pyr4 deste transformante foi posteriormente obtido usando os métodos descritos na seção anterior. Esta cepa deficiente de pyr4 foi designada de P37PÁCBHIPyr26. A análise Southern demonstrou que uma deleção espontânea havia ocorrido quando a cepa P37PÁCBHIPyr26 foi

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94/103 selecionada. Esta deleção removeu completamente o gene pyr4 que tinha integrado no locus cbhl na cepa P37PÁCBHI, bem como DNA flanqueador a partir do locus cbhl para além da extensão do fragmento Pstl de 6,5 kb do DNA genômico que foi originalmente clonado.

(5) Construção de um vetor projetado para deletar o gene cbh2.

[0361] O gene cbh2 de T. reesei, que codifica a proteína CBHll, foi clonado como um fragmento EcoRl de 4,1 kb de DNA genômico (Chen et al., 1987, Biotechnology 5:274-278). Este fragmento de 4.1 kb foi inserido entre os sítios EcoRl do pUC4XL. O último plasmídeo é um derivado de pUC (construído por RM Berka, Genencor International Inc.), que contém um sítio múltiplo de clonagem com um padrão simétrico de sítios de endonucleases de restrição dispostos na seguinte ordem demonstrada. EcoRI, BamHI, Sacl, Smal, Hindlll, Xhol, Bglll, Clal, Bglll, Xhol, Hindll I, Smal, Sacl, BamHI, EcoRI. O plasmídeo, pPÁCBHll foi construído no qual um 1,7 kb da região central deste clone cbh2, entre um sítio Hindlll (a 74 pb do sítio de iniciação da tradução CBHll 3') e um sítio ClaI (a 265 pb do último códon de CBHII 3'), foi removido e substituído por um fragmento de DNA de 1,6 kb Hindlll-Clal contendo o gene pyr4 de T. reesei obtido da seguinte forma. O gene pyr4 de T. reesei foi retirado do pTpyr2 em um fragmento de 1,6 kb Nhel-Sphl e inserido entre os sítios Sphl e Xbal do pUC219 (derivado do pUC119 através da expansão do sítio múltiplo de clonagem para incluir sítios de restrição para Bglll, Clal e Xhol; Wilson et al. 1989, 77:69 Gene 78) para criar o p219M (Smith et al., 1991, Curr. Genet.19:27-33). O gene pyr4 poderia então ser removido como um fragmento Hindlll-Clal com sete bp de DNA em uma extremidade e seis bp de DNA na outra ponta derivada a partir do sítio de clonagem múltiplo e inserido nos sítios Hindlll e Clal do gene cbh2 para formar o plasmídeo pPÁCBHII.

[0362] A digestão deste plasmídeo com EcoRl libera um

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95/103 fragmento de 0,7 kb do DNA flanqueador a partir do locus cbh2 em uma extremidade, 1,7 kb de DNA flanqueador a partir do locus cbh2 na outra extremidade no gene pyr4 de e T. reesei no meio. Os únicos DNAs neste fragmento que não foram derivados de T. reesei foram os fragmentos de 6 bp e 7 pb do sítio de clonagem múltiplo pUC219 em cada extremidade do gene pyr4.

(6) Deleção do gene cbh2 a partir da estirpe P37PÁCBHIPyr26 [0363] Os protoplastos de cepa P37PÁCBHIPyr26 foram gerados e transformados com a digestão com EcoRl do pPÁCBHII de acordo com os métodos descritos no item 3 acima. Os transformantes estáveis foram cultivados em frascos para agitação e a proteína no sobrenadante da cultura foi examinada por focalização isoelétrica. Um transformante (designado P37PÁÁCBH67) foi identificado que não produziu qualquer proteína CBHll (nem CBHI).

[0364] O DNA foi extraído a partir da cepa P37PÁÁCBH67, digerido com EcoRl e Asp718, e submetido a eletroforese em gel de agarose. O DNA deste gel foi submetido ao método de blotting em uma membrana de filtro e hibridizado com pPÁCBHII marcado com P³² O fragmento EcoRl de 4,1 kb contendo o gene cbh2 tipo selvagem foi observado no DNA a partir de uma cepa controle não transformada. Em contrapartia, na cepa P37PÁÁCBH67 a banda única de 4,1 kb foi eliminada e substituída por duas bandas de aproximadamente 0,9 e 3,1 kb. Este é o padrão esperado se uma cópia única do fragmento de EcoRl maior a partir do pPÁCBHll foi integrado precisamente no locus de cbh2 e deletado o gene cbh2.

[0365] As mesmas amostras de DNA foram também digeridas com EcoRl e análise Southern foi realizada conforme descrito anteriormente. Neste exemplo, a sonda foi plntCBHII marcada com P³² Este plasmídeo contém uma porção da sequência que codifica o gene cbh2 de dentro do

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96/103 segmento de DNA cbh2 que foi deletado no plasmídeo pPÁCBHII. Não foi observada hibridização com o DNA a partir da cepa P37PACBH67 confirmando que o gene cbh2 foi deletado e que o fragmento do plasmídeo pUC de pPÁCBHlI não haviam sido incorporado por esta cepa.

(7) A seleção de um mutante pyr4 nulo de cepa P37PÁACBH67.

[0366] Esporos dos transformantes (P37PÁÁCBH67), que foi deletado para ambos cbhl e cbh2 foram espalhados em meio contendo FOA. Um derivado deficiente de pyr4 deste transformante foi subsequentemente obtido usando os métodos descritos na seção 1 acima. Esta cepa deficiente de pyr4 foi designada de P37PÁCBH67Pyr1. A análise Southern demonstrou que uma deleção espontânea havia ocorrido quando a cepa P37PÁÁCBH67Pyr1 foi selecionada. Esta deleção removeu completamente o gene pyr4 que tinha integrado no locus cbh2 na cepa P37PACBH67, bem como DNA flanqueador a partir do locus cbh2 para além da extensão do fragmento EcoRI de 4,1 kb do DNA genômico que foi originalmente clonado. Os fragmentos curtos (6 pb e 7 pb) de DNA obtidos a partir do sítio de clonagem múltiplo pUC219 que estavam presentes em ambas as extremidades do gene pyr4 também foram removidos do genoma por esta deleção.

(8) Construção de um plasmídeo projetado para interromper o gene egl2.

O gene egl2, que codifica EGll (anteriormente referido como EGlll por alguns), foi clonado a partir do T. reesei e a sequência de DNA publicado (Saloheimo et al, 1988, Gene 63:. 11-21). Nós obtivemos o gene a partir da cepa RL-P37 como um fragmento Pstl-Xhol de aproximadamente 4 kb de DNA genômico inserido entre os sítios Pstl e Xhol do pUC219. O gene pyr4 de T. reesei, presente em um fragmento SalI de 2,7 kb do DNA genômico obtido a partir de pTpyr2, foi inserido em um sítio Sall dentro da sequência de

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97/103 codificação EGLL para criar o plasmídeo pEGII::P-1. Isso resultou na interrupção da sequência de codificação de EGLL, mas sem a deleção de qualquer sequência. O plasmídeo, pEGII::P-1, pode ser digerido com Hindlll e BamHl para produzir um fragmento linear de DNA derivado exclusivamente de T. reesei exceto por 5 pb em uma extremidade e 16 pb na outra extremidade sendo que ambos são derivados do sítio múltiplo de clonagem do pUC219.

(9) Interrupção do gene egl2 da cepa P37PÁCBH67Pyr1. [0367] A cepa P37PÁÁCBH67Pyr1 foi transformada com pEGII::P-1, que havia sido previamente digerida com Hindlll e BamHl e os e transformantes estáveis foram selecionados. O DNA total foi isolado a partir dos transformantes e a análise Southern foi usada para identificar cepas nas quais o fragmento de DNA plasmidial contendo os genes egl2 e pyr4 havia sido integrado no locus egl2 e, consequentemente, interrompeu a sequência codificadora de EGLL. A análise Southern foi realizada utilizando como sonda um fragmento DNA Pstl de T. reesei de aproximadamente 4 kb contendo o gene egl2. Quando o DNA isolado a partir da cepa P37PÁÁ67P1 foi digerido com Pstl para análise Southern, o locus egl2 foi posteriormente visualizado como uma banda única de kb 4 no autoradiografia. Entretanto, em um transformante com interrompimento do gene egl2, esta banda foi perdida e foi substituída por duas novas bandas conforme esperado. Quando o DNA foi digerido com Bglll ou EcoRV o tamanho da banda correspondente ao gene egl2 aumentou de tamanho em aproximadamente 2,7 kb (o tamanho do fragmento pyr4 inserido) entre a cepa P37PÁÁ67P1 não transformada e os transformantes com o gene egl2 interrompido. Estes últimos transformantes, agora com deleções para os genes cbhl, cbh2 e egl2, foram designados como cepa B31. A análise Southern confirmou ainda que o fragmento de DNA pUC do pEGII::P-1 não foi incorporado a esta cepa.

(10) A seleção de um mutante pyr4 nulo de cepa B31.

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98/103 [0368] Esporos dos transformantes (B31), com deleções para os genes cbhl, cbh2 e egl2 foram semeados em meio contendo FOA. Um derivado deficiente de pyr4 deste transformante foi subsequentemente obtido usando os métodos descritos na seção 1 acima. Esta cepa deficiente de pyr4 foi designada B31 P6. A análise Southern demonstrou que uma deleção espontânea havia ocorrido quando a cepa B31P6 foi selecionada. Esta deleção removeu a maior parte do gene pyr4 que havia sido integrada no locus egl2 na cepa B31, mas não se estendeu para o DNA flanqueador do locus egl2.

(11) Construção de um plasmídeo projetado para deletar o gene egll.

[0369] O gene egll de T. reesei foi clonado e a sequência de DNA do gene foi publicada (Penttila et al, 1986, Gene 45;. 253-263;. Arsdell van et al, 1987, Biotechnology 5:60-64). Obtemos este gene a partir do T. reesei cepa RL-P37 como um fragmento de DNA genômico Hindlll de 4,2 kb inserido no sítio Hindlll do pUC100 (um derivado do pUC18 com um oligonucleotídeo inserido no sítio múltiplo de clonagem acrescentando sítios de restrição para Bglll, Clal e Xhol) para formar o pUCEGI. Um fragmento EcoRV de aproximadamente 1 kb que se estende desde uma posição próxima do meio da sequência codificadora de EGI até uma posição além da extremidade 3' da sequência codificadora foi removido e substituído por um fragmento de DNA scal de T. reesei de 3,5 kb contendo o gene pyr4 obtido do pTpyr2. O plasmídeo resultante foi denominado de pPÁEGI.

[0370] O plasmídeo, pPÁEGl poderia ser digerido com Hindlll para liberar um fragmento de DNA que compreende apenas de DNA genômico de T. reesei possuindo um segmento do gene egl1 em ambas extremidades e o gene pyr4, substituindo parte da sequência codificadora de EGI, no centro.

(12) A deleção do gene eal1 na cepa B31P6.

[0371] Duas formas de pPÁEGl foram construídas, que diferiam

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99/103 apenas na orientação do gene pyr4 no que diz respeito às regiões flanqueadoras de egll. A cepa B31P6 foi transformada com uma mistura de ambas as formas do plasmídeo após elas terem sido digeridas com Hindlll. O DNA total foi extraído de transformantes estáveis, digerido com Hindlll e submetidos a análise Southern. A sonda utilizada foi a pUCEGI radiomarcada. A hibridização foi observada em um fragmento de DNA de 4,2 kb da cepa B31P6 representando o gene egll recuperado. Um transformante (cepa 1A52) foi identificado no qual este fragmento de 4,2 kb não estava mais presente, mas havia sido substituído por um fragmento de aproximadamente 6,8 kb. Este é o padrão esperado se o fragmento Hindlll maior do pPÁEGI foi integrado precisamente conforme previsto no locus egll levando a deleção de parte da sequência codificadora de EGI e a inserção de pyr4 nesta posição. Usando um plasmídeo pUC como uma sonda para análise Southern foi confirmado que o fragmento de DNA pUC do pPÁEGI não havia sido incorporado na cepa 1A52.

[0372] O T. reesei cepa 1A52 pode ser modificada para formar uma célula T. reesei utilizável na presente invenção.

Exemplo 11

Protocolos De Ensaio

Ensaio para a Atividade de Hidrólise de Triacilglicerol (Classificado como EC 3.1.1.3)

Ensaios LIPU/LUSol para a Atividade de Hidrólise de Triacilgliceróis [0373] A determinação da atividade da lipase por LIPU é realizada pela enzimação de uma emulsão de tributirilglicerol. A hidrólise enzimática de lipídeos libera ácidos graxos livres. Por titulação contínua do ácido graxo livre liberado, a atividade da lipase é determinada a partir do consumo de base. 1 LIPU (unidade de lipase) (também denominada de unidade 1 na presente invenção) é definida como a quantidade de enzima, que libera 1 pmol de ácido graxo livre por minuto nas dadas condições do ensaio.

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100/103 [0374] As amostras de enzima foram dissolvidas em água desmineralizada. O titulante foi de 0,05 M de NaOH. O substrato foi uma emulsão homogeneizada de 5% (v/v) de tributirinaglicerol (Merck, item n°. 1.01958), goma arábica 0,10% (p/v) (Sigma, item n° G9752), glicerol 7,5% (p/v) (Merck, item n°.: 1.04092), 51 mM de NaCl (Merck, item n°: 1.06404), 0,50 mM de KH2PO4 (Merck, item n°: 1.04873). O pH da reação foi de 5,5 e temperatura de reação foi de 30 °C. 2,00 mL de amostra foram adicionados à 25,0 mL de substrato climatizado na temperatura de reação. A atividade foi calculada a partir da inclinação de uma curva de titulação linear com o consumo de titulante registrado em função do tempo de reação.

[0375] Os substratos utilizados são tributirina (Lipu) e Óleo de girassol (LUSol).

Ensaio DGGR para a Atividade de Hidrólise de Triacilgliceróis [0376] Este ensaio foi usado para mensurar a lipase de Thermomyces lanuginosus expressa em Trichoderma.

[0377] Os substratos e tampões utilizados neste ensaio foram os seguintes:

[0378] 03,32 mM de 1,2-Di-O-lauril-rac-glicero-3-(6-ácido metilresorufina éster glutárico) dissolvido em DMSO (substrato, 2,5mg/mL);

[0379] A solução estoque consistindo de 50 mg de substrato adicionado a 20mL de DMSO é sonicada, aliquotada e estocada a -80 °C até o uso. O tampão usado é 0,5 M de HEPES pH 8 + 60gpg de Ca:Mg “dureza da água 3:1 (vide CAM300) e goma arábica 4%. O estoque da enzima lipase (1 mg/L) é usado como padrão.

[0380] Para o ensaio, o tampão de ensaio A 50 ml é preparado pela adição de 5 mL de HEPES + Ca:Mg e 25 ml de goma arábica 4% para 10ml de água. O tampão de ensaio é incubado na temperatura de ensaio desejada (normalmente 25 °C). 10 pL das amostras de enzima são adicionados em uma

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101/103 placa de 96 poços na temperatura de ensaio. É recomendado 1-10ppm de enzima ativa na amostra.

[0381] Para melhores resultados combinar concentração desconhecida a +/- duas vezes a atividade do padrão.

[0382] A taxa de interferência de fundo (background) (sem enzima, ou seja, tampão de ensaio) é determinada.

[0383] 10ml de substrato DGGR 3,32mM em DMSO são adicionados ao tampão de ensaio que é misturado com um vortex. São adicionados 200uL de substrato no tampão de ensaio imediatamente nas amostras de enzima em microplacas a partir de um reservatório de reagente usando uma pipeta multicanal. A placa de microtitulação, é bem misturada e imediatamente transferida para o leitor de placas. Uma OD a 580 nm para até 10 min é mensurada na temperatura de ensaio desejada (normalmente 25 °C). O cálculo da atividade da enzima é feito subtraindo-se a taxa de fundo da desconhecida e do padrão para se obter a diferença entre taxas. E determinar a relação da diferença entre taxas da amostra desconhecida e do padrão e multiplicar pela concentração do padrão. Todas as diluições são incluídas no cálculo:

concentração desconhecida = (taxa desconhecido * concentração padrão) / taxa do padrão.

Determinação da Atividade da Lipase de Triacilglicerídio : Ensaio

Baseado em Triglicérides (Tributirina) como Substrato (LIPU) [0384] Atividade da lipase com base na tributirina é mensurada de acordo com a Food Chemical Codex, Quarta Edição, National Academy Press, 1996, pág. 803, com as modificações de que a amostra é dissolvida em água deionizada, em vez de tampão glicina, e o ponto do pH stat é estabelecido em

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5,5 em vez de 7.

[0385] 1 LIPU é definida como a quantidade de enzima que pode liberar 1 mol de ácido butírico mol por minuto nas condições de ensaio.

Ensaio para a Atividade de Fosfolipase

Atividade fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32)

Atividade fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4)

Atividade fosfolipase B (EC 3.1.1.5)

Substrato [0386] 1,75% de L-Planta Fosfatidilcolina 95% (441.601 Avanti Polar Lipids), Triton X-100 6,3% (# T9284, Sigma) e 5 mM de CaCl2 dissolvido em 50 mM de HEPES pH 7,0 buffer.

Procedimento de ensaio [0387] As amostras, a calibração e os controles foram diluídos em 10 mM de HEPES pH 7,0, Triton X-100 0,1% (# T9284, Sigma). A análise foi realizada utilizando um analisador automático Konelab (Thermo, Finlândia). O ensaio foi executado a 30 °C. 34 pL de substrato foram termostatizados por 180 segundos, antes da adição de 4 pL de amostra. A enzimação durou 600s. A quantidade de ácidos graxos livres liberados durante a enzimação foi mensurada usando o kit NEFA C (999-75406, WAKO, Alemanha). 56 pL de NEFA A foram adicionados e a mistura foi incubada por 300 s. Em seguida, foram adicionados 113 pL de NEFA B e a mistura foi incubada por 300s. A OD520 nm foi então mensurada. A atividade da enzima LATU (pmol FFA/minmL) foi calculada com base em uma preparação enzimática padrão.

Ensaio para Atividade Glicolipase (Galactolipase).

Substrato [0388] Didalactosildiglicerídio, 1,75% (441.601 purificada a partir de lipídios de trigo), Triton X-100 6,3% (# T9284, Sigma) e 5 mM de CaCl2 dissolvido em 50 mM de HEPES pH 7,0 buffer.

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Procedimento de ensaio [0389] As amostras, a calibração e os controles foram diluídos em 10 mM de HEPES pH 7,0, Triton X-100 0,1% (# T9284, Sigma). A análise foi realizada utilizando um analisador automático Konelab (Thermo, Finlândia). O ensaio foi executado a 30 °C. 34 pL de substrato foram termostatizados por 180 segundos, antes da adição de 4 pL de amostra. A enzimação durou 600s. A quantidade de ácidos graxos livres liberados durante a enzimação foi mensurada usando o kit NEFA C (999-75406, WAKO, Alemanha). 56 pL de NEFA A foram adicionados e a mistura foi incubada por 300 s. Em seguida, foram adicionados 113 pL de NEFA B e a mistura foi incubada por 300s. A OD520 nm foi então mensurada. A atividade da enzima GLU-K (pmol FFA/minmL) foi calculada com base em uma preparação enzimática padrão.

[0390] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são incorporadas ao presente pela referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da presente invenção serão evidentes para os técnicos hábeis no assunto sem se afastar do escopo e espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação a exemplos de realizações específicos preferidos, deve-se compreender que a presente invenção, conforme reivindicado, não deve ser indevidamente limitada a tais exemplos específicos. De fato, pretende-se que as várias modificações nas realizações da invenção que são óbvias para os técnicos hábeis nas áreas de bioquímica e biotecnologia ou afins, estejam inclusas no escopo das reivindicações seguintes.

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Claims (12)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA ENZIMA LIPOLÍTICA, caracterizado por compreender as etapas de:

   (i) fornecer uma célula de Trichoderma reesei transformada ou transfectada que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima lipolítica, em que a sequência de nucleotídeos consiste em uma sequência de nucleotídeos exibida como a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; e (ii) cultivar a célula em condições que permitam a expressão de dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) dita enzima lipolítica.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência de nucleotídeos heteróloga compreender adicionalmente uma sequência promotora, em que a sequência promotora é uma sequência promotora de celobiohidrolase.
3. 3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo dito método compreender a etapa adicional de concentrar e/ou isolar e/ou recuperar a enzima lipolítica.
4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela célula de Trichoderma reesei ser preparada por transformação ou transfecção de uma célula de Trichoderma reesei com a sequência de nucleotídeos.
5. 5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela célula de Trichoderma reesei ser fornecida através de sua transformação com, ou ser transformada com a sequência de nucleotídeos utilizando transformação por biobalística.
6. 6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela célula de Trichoderma reesei compreender um ou

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   2/3 mais genes suprimidos selecionados a partir de cbhl, cbh2, egll, egl2, eall e pyr4.
7. 7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por após expressão da sequência de nucleotídeos, a célula de Trichoderma reesei ser removida do meio no qual a enzima foi secretada.
8. 8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por após expressão da sequência de nucleotídeos, a célula de Trichoderma reesei ser removida do meio no qual a enzima foi secretada; e, então, o meio livre de células ser concentrado.
9. 9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo pH do meio no qual a enzima é secretada ser elevado para entre 5,5 a 6,5 após um período de tempo de 24 a 500 horas, para produzir níveis suficientes da enzima secretada e antes do isolamento e/ou purificação e/ou concentração da enzima.
10. 10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelas seguintes etapas serem realizadas ao meio no qual a enzima da presente invenção foi secretada após o cultivo da célula: ajustar o pH do meio entre 5,5 a 6,5, diluir o meio com água; separar a(s) célula(s) do meio; concentrar o meio em que dito meio é livre de células; e, opcionalmente, granular o dito meio em que dito meio é livre de células.
11. 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de:

    (ii) cultivar a célula em um pH 4 a 5,5 sob condições que permitam a expressão de dita(s) sequência(s) de nucleotídeos heteróloga(s) que codifica(m) dita enzima lipolítica;

    (iii) isolar, purificar ou concentrar a enzima em um meio em pH

    5,5 a 6,5.
12. 12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

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    3/3

    1 a 11, caracterizado pela enzima lipolítica consistir em uma sequência de aminoácidos exibida como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.