BRPI1006058B1

BRPI1006058B1 - Método de fermentação de um amido a etanol e caldo de fermentação

Info

Publication number: BRPI1006058B1
Application number: BRPI1006058-8A
Authority: BR
Inventors: Julio Pimentel; James D. Wilson
Original assignee: Anitox Corporation
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2024-01-23
Also published as: EP2504445A2; EP2504445A4; BRPI1006058A2; CA2774048C; CA2774048A1; EP2504445B1; HUE053162T2; CN102666864B; PT2504445T; WO2011066318A3; ES2854723T3; WO2011066318A2; PL2504445T3; CN102666864A; LT2504445T; US8883470B2; US20120225465A1

Abstract

fermentação de carboidrato. a presente invenção refere-se a um método de alto rendimento para fermentar o carboidrato para produzir etanol, compreendendo: a) tratamento do carboidrato com uma composição contendo de 10 a 90 % em peso de um aldeído selecionado do grupo consistindo em formaldeído, paraformaldeído, glutaraldeído e misturas dos mesmos, 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um i jlb de 4 a 18, 0 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano, ou óleos essenciais, 1 a 50 % em peso de ácidos orgânicos selecionados de ácidos graxos c1-24 os seus sais, e ésteres de glicerídio dos mesmos, e 1 a 50 % em peso de água, b) fermentação do dito carboidrato na presença de levedura em um caldo de fermentação, e c) isolamento do etanol em um rendimento mais alto do que seria obtido sem etapa a).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método de alto rendi mento para produzir o etanol a partir da fermentação de carboidrato, tratando o material de entrada de carboidrato com um aldeído, um ácido graxo, um terpeno e um tensoativo.

ANTECEDENTES

[002] Em 2009, o Padrão de Combustíveis Renovável (RFS) exi giu a mistura de 41,95 bilhões de litros de etanol e outros biocombustí- veis no mercado de combustíveis para motor dos Estados Unidos para satisfazer futuras demandas. Isto resultará em um aumento no nível de necessidades de milho pela indústria e exigirá também que as capacidades das plantas sejam aumentadas. Somente no ano passado, a capacidade operacional anual dos EUA aumentou em 10,20 bilhões de litros, um aumento de 34 % maior que 2007. Este crescimento na capacidade de produção foi permitido pela realização, lançamento, e operação de novas refinarias de etanol.

[003] O etanol, um promissor biocombustível proveniente de re cursos renováveis, é produzido do amido de grãos de cereais (milho, sorgo, trigo, triticale, centeio, cevada maltada, arroz), colheitas de tubérculos (batatas) ou pelo uso direto do açúcar no melaço, do caldo de cana de açúcar ou do açúcar do suco de beterraba. O etanol também pode ser produzido pela fermentação de material a base de celulose (grama de alimento, árvores de pinheiro), mas esta tecnologia não foi amplamente comercializada.

[004] Oitenta por cento do etanol mundial são produzidos pelo Brasil e pelos EUA. Desses, 60 % são produzidos pela fermentação por levedura do milho ou do caldo de cana de açúcar. A produção de etanol através de fermentação anaeróbica de uma fonte de carbono pela levedura Saccharomyces cerevisiae é um dos melhores processos biotecnológicos conhecidos e contribui para uma produção mundial de mais de 35 bilhões de litros de etanol por ano (Bayrock, 2007).

[005] O processo da produção de etanol a partir de cereais co meça com a hidrólise do amido. A hidrólise do amido resulta na conversão da amilose, na maior parte um α-D-(1-4)-glicano linear, e ami- lopectina ramificada, um α-D-(1-4)-glicano que tem as ligações α-D-(1- 6) no ponto de ramificação, no açúcar fermentável que posteriormente é convertido no etanol pela levedura (Majovic, 2006), e bactérias (Di- en, 2003). As bactérias são usadas para a produção do etanol a partir do material contendo celulose em sua maior parte, elas incluem Zymomonas spp., E. coli projetada, Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Acetivibrio celluloyticus dentre outras (Dien, 2003).

[006] Em um sistema de produção de etanol, o núcleo do grão do milho inteiro é moído e misturado com água. A mistura é depois cozida até a fervura para gelatinizar o amido e reduzir a contaminação bacte- riana. Após esta liquefação, as enzimas e a levedura são acrescentadas para iniciar o processo de fermentação para produzir o etanol.

[007] A moagem seca e a moagem úmida são dois processos primários usados para produzir o etanol nos Estados Unidos.

[008] No processo de moagem seca, o núcleo do grão do milho inteiro ou outro material com amido são moídos até formar uma farinha e misturados com a água para formar uma pasta fluida. Depois, as enzimas são acrescentadas à mistura, que é processada em um cozimento em alta temperatura, resfriada e transferida para fermentadores onde a levedura é acrescentada e a conversão de açúcar ao etanol inicia. Após a fermentação, a mistura resultante é transferida para colunas de destilação onde o etanol é separado. Os sólidos que resultam após a fermentação e a separação de etanol são processados para produzir grãos secos de destilaria com solúvéis (DDGS) que são usados para a criação animal, por exemplo, alimentos de aves domésticas, porcos e gado. Mais de 80 % da capacidade de etanol de hoje utilizam o processo de moagem seca (RFS, 2006).

[009] No processo de moagem úmida, o grão é embebido ou imerso em água para facilitar a separação do grão nos seus componentes nutritivos básicos, tais como germe de milho, fibra, glúten e componentes de amido. Após a imersão, a pasta fluida de milho é processada através de uma série de moedores e os componentes são separados. O componente de glúten é filtrado e seco para produzir o alimento de glúten de milho (CGM), um produto com alto valor proteico usado como um ingrediente alimentício para manutenção de animais. O amido e qualquer água restante da pasta são depois processados por um dos três modos: Fermentação para produção de etanol, secagem e venda como amido de milho seco ou modificado, ou processado em xarope de milho (RFS, 2006).

[0010] Ambos os processos de moagem úmida e seca utilizam somente a parte de amido do núcleo do grão de milho para a produção de etanol. A proteína, a gordura, a fibra e outros componentes nutritivos restantes permanecem disponíveis para o usado como alimento.

[0011] No processo de fermentação convencional, a cultura de le vedura é acrescentada ao amido do núcleo do grão de milho e incubada por 72 horas para deixar por tempo suficiente para a população de levedura aumentar até a concentração necessária (Maye, 2006). Leva de 45 a 60 minutos para a população de levedura atingir seu dobro. Precisa-se de muitas horas de tal propagação para produzir a quantidade necessária de leveduras para fermentar uma quantidade tão grande de solução de açúcar (Maye, 2006).

[0012] Um processo chamado de hidrólise de amido bruto conver te o amido em açúcar que é depois fermentado ao etanol, ignorando a condições convencionais de gelatinização do amido. As enzimas usadas na sacarificação/fermentação são a alfa amilase fúngica e a glico- amilase (amiloglicosidase) (Thomas, 2001). Essas sacarificação e fermentação simultâneas permitem que concentrações mais altas do amido sejam fermentadas e resultem em níveis mais elevados de eta- nol. Se a fonte de açúcar for de colheitas, tais como cana de açúcar, sacarina, frutas ou melaço, a sacarificação não é necessária e a fermentação pode iniciar com a adição de levedura e água (Maye, 2006).

[0013] Uma das preocupações importantes com os sistemas de fermentação em batelada ou contínua é a dificuldade da manutenção de ausência de contaminação bacteriana. Infelizmente, a atmosfera ótima para a fermentação é também ótima para o crescimento bacteri- ano. A contaminação geralmente se origina da colheita do material à base de carboidrato. A lavagem do material pode ajudar a reduzir o nível de contaminação (Maye, 2006).

[0014] Apesar de esforços de evitar a contaminação com a limpe za e desinfecção dos tanques de sacarificação e sistemas de propagação contínua de leveduras, os biofilmes podem agir como reservatórios das bactérias que continuamente reintroduzem contaminantes (Bischoff, 2009).

[0015] Diversas bactérias gram positivo e gram negativo foram iso ladas de espécies da fermentação de etanol combustível incluindo Lactobacillus, Pediococcus, Staphylococcus,

[0016] Enterococcus, Acetobacter, Gluconobacter e Clostridium (Bischoff, 2009). Quase dois terços das bactérias isoladas foram espécies de bactérias do ácido lático, por exemplo, lactobacilos (Skinner, 2007).

[0017] Em uma pesquisa conduzida por Skinner e Leathers (2004), de 44 a 60 % dos contaminantes no processo de moagem úmida foram identificados como lactobacilos. No processo de moagem seca, de 37 a 87 % dos contaminantes foram identificados como lactobacilos.

[0018] A contaminação de lactobacilos na faixa de 106 para 107 cfu/mL de pasta fluida de milho pode reduzir o rendimento de etanol em 1 a 3 %. Na indústria, mesmo com um programa de controle bacte- riano ativo para controlar a proliferação de lactobacilos, as perdas de carboidratos para os lactobacilos podem fazer a diferença entre a rentabilidade e o prejuízo (Bayrock, 2007). Os lactobacilos não somente toleram pHs baixos, alta acidez e concentrações relativamente altas de etanol, como também multiplicam sob as condições da fermentação alcoólica (Thomas, 2001). Os contaminantes bacterianos competem por fatores de crescimento necessários para a levedura e também produzem subprodutos que são inibidores da levedura, particularmente os ácidos lático e acético.

[0019] A contaminação da pasta fluida de carboidrato durante o processo de fermentação alcoólica resulta em a) um rendimento reduzido de etanol, b) aumento do direcionamento de carboidratos para a produção de glicerol e ácidos láticos, c) uma rápida perda de viabilidade das leveduras após a exaustão do açúcar fermentável, e d) redução da proliferação de leveduras na pasta em que a contaminação por lactobacilos já cresceu a um número elevado (Thomas, 2001).

[0020] Uma pesquisa recente de contaminantes bacterianos das plantas industriais a base de milho nos EUA encontrou que as cargas bacterianas em uma instalação de moagem úmida foram de aproximadamente 106 cfu/mL de pasta fluida enquanto aquelas nas instalações moagem a seco podem chegar a 108 cfu/mL de pasta fluida de milho (Bischoff, 2007; Chang, 1997).

[0021] A presença de subprodutos de lactobacilos, isto é, ácidos acético e lático, durante a fermentação afeta o crescimento e o metabolismo da levedura, e foi sugerido como uma das causas da fermentação emperrada ou lenta (Thomas, 2001). Se o teor de ácido lático na pasta se aproximar de 0,8 % e/ou a concentração de ácido acético exceder 0,05 %, as leveduras produtoras de etanol ficam estressadas (Bayrock, 2007). Os lactobacilos podem estressar as células de levedura, que liberam nutrientes, particularmente aminoácidos e peptídeos que podem estimular o crescimento bacteriano (Oliva-Neto, 2004). Uma concentração de ácido lático de 8 gL em uma fermentação de batelada de melaço de beterraba reduziu a viabilidade das leveduras em 95 % e reduziu a taxa de produção de álcool em 80 % (Bayrock, 2001).

[0022] A presença de lactobacilos na fermentação de etanol pode reduzir o rendimento de etanol em 44 % após 4 dias de operação com pH controlado. Isto coincide com um aumento do L. paracasei para > 1010 cfu/mL e um aumento de quatro vezes na concentração de ácido lático para 20 g/L. Uma redução de 80 % da densidade de levedura foi observada com concentrações de etanol, ácido lático e ácido acético de 70, 38 e 7,5 g L respectivamente (Bayrock, 2001).

[0023] De Oliva-Neto e Yokoya (1994) avaliaram o efeito da con taminação bacteriana em um processo de fermentação alcoólico com batelada alimentada. Eles mostraram que o L. fermentum inibirá fortemente a levedura de panificação comercial em um processo com batelada alimentada. Quando o ácido total (lático e acético) excedeu os 4,8 g/L ele interferiu com em formação de broto de levedura e viabilidade com 6 g/L de redução na eficiência alcoólica.

[0024] Outros mostraram que: a) 106 lactobacilos/mL de pasta re sulta em aproximadamente 1 % v/v de redução do etanol final produzido pela levedura (Narendranath, 2004), b) desafiando do sistema de fermentação com 108 cfu/mL de L. fermentum reduziu o rendimento de etanol em 27 % e aumentou a glicose residual de 6,2 para 45,5 gL (Bischoff, 2009), c) o uso de 105 cfu lactobacilos/mL produziu uma redução de 8 % do rendimento de etanol e um aumento de 3,2 vezes na glicose residual (Bischoff, 2009).

[0025] Os métodos para controlar bactérias incluem a adição de mais cultura de levedura, limpeza estrita e saneamento, lavagem ácida da levedura destinada à reutilização, e o uso de antibióticos durante a fermentação (Hynes, 1997). Uma taxa de inoculação de levedura aumentada de 3 x 107cfu/mL de pasta resultou em uma redução maior do que 80 % na produção de ácido lático pelo L. plantarum e numa redução maior do que 55 % na produção de ácido lático pelo L. paracasei, quando a pasta foi infeccionada com 1 x 108 lactobacilos/mL (Naren- dranath, 2004; Bischoff, 2009).

[0026] Vários agentes foram testados para o controle de contami- nantes bacterianos em condições de laboratório incluindo antissépticos, tais como peróxido de hidrogênio, metabissulfito de potássio, e 3,4,4'-triclorocarbanilida e antibióticos, tais como penicilina, tetraciclina, monesina e virginiamicina. A penicilina e a virginiamicina são comercialmente vendidas hoje para tratar infecções bacterianas da fermentação de etanol combustível e algumas instalações usam esses antibióticos profilaticamente (Skinner, 2004).

[0027] Se nenhum antibiótico for usado, é comum uma perda de 1 a 5 % no rendimento de etanol.Uma planta de etanol combustível de 189,27 milhões de litros que funciona com um nível de ácido lático de 0,3 % p/p na cerveja da sua destilaria está perdendo aproximadamente 2.154.600,00 litros de etanol a cada ano devido à contaminação bacteriana (Maye, 2006). Na ausência de um antibiótico, o número de bactérias aumenta de 1x106 cfu/mL para 6x106cfu/mL durante um período de fermentação de 48 horas e 5,8 mg de ácido lático é produzido (Hynes, 1997).

[0028] Um programa de controle bacteriano muito eficaz envolve o uso da virginiamicina. Algumas características da virginiamicina são: a) em concentrações baixas, por exemplo, de 0,3 a 5 ppm é eficaz contra diversos microrganismos incluindo os lactobacilos, b) os microrganismos não tendem a desenvolver resistência, c) não inibe significativamente a levedura, d) não é afetada pelo pH ou pela concentração de álcool e e) é inativado durante a destilação de etanol, por isso nenhum resíduo permanece no álcool ou nos grãos destilados (Bayrock, 2007; Narendranath, 2000; Hynes, 1997).

[0029] Atualmente, a virginiamicina é o único antibiótico conhecido para ser usado na planta de moagem a seco (Bischoff, 2007). A dose recomendada da virginiamicina em fermentações de etanol combustível é geralmente de 0,25 a 2,0 ppm (Bischoff, 2009) mas a Concentração Iinibidora Mínima (MIC) varia de 0,5 a maior do que 64 ppm (Hynes, 1997).

[0030] O L. fermentum pode ser seletivamente controlado pelo pe- róxido de hidrogênio em concentrações de 1 a 10 mM em um processo de fermentação de etanol (Narendranath, 2000). Os lactobacilos não têm a enzima catalase, portanto não podem decompor o peróxido de hidrogênio e por isso são incapazes de eliminar o seu efeito tóxico (Narendranath, 2000).

[0031] O peróxido de hidrogênio e ureia (UHP) foi usado como um antisséptico para aplicações tópicas em feridas e contra a gengivite e a placa dental (Narendranath, 2000) e também serve como um anti- bacteriano durante a fermentação. O UHP não somente expõe uma atividade bactericida excelente contra os lactobacilos, mas também tem uma vantagem importante de fornecer o nitrogênio utilizável na forma da ureia para estimular o crescimento de leveduras e das taxas de fermentação (Narendranath, 2000).

[0032] Outros métodos de controlar a contaminação bacteriana incluem o uso de sulfetos. Os sulfetos demonstraram uma atividade bactericida somente na presença de oxigênio e foram mais eficazes no extermínio facultativo de L. casei que possui elevados níveis de enzi- mas relacionadas ao peróxido de hidrogênio, incluindo a peroxidase (Chang, 1997). A carga bacteriana também foi reduzida quando a concentração do sulfeto variou de 100 para 400 mg/L mas somente na presença de oxigênio. Esta concentração não afetou as populações de levedura (Chang, 1997).

[0033] Um agente presente no sobrenadante de culturas de leve dura reduz o crescimento de lactobacilos. Este composto ainda não foi caracterizado, embora se conheça que ele é resistente ao congelamento, instável em altas temperaturas e destruído quando mantido em 90°C durante 20 minutos (Oliva-Neto, 2004).

[0034] O ácido succínico sozinho a níveis de 600 mg/L reduz as concentrações de lactobacilos em 78 %, na presença de etanol essa redução chega até 96 % (Oliva-Neto 2004).

[0035] Um inibidor de aderência microbiana na forma de anticor pos de ovos de ave e específico para microrganismos que produzem o ácido lático foi desenvolvido para uso em fermentadores (Nash 2009).

[0036] Somente os estudos de laboratório mostraram que os anti corpos, o sulfeto e os produtos de peróxido podem ser benéficos no controle de lactobacilos, um problema com estes produtos é a diminuição da concentração devido à oxidação e decomposição dos produtos químicos que necessitam de monitoração constante durante todo o processo de fermentação para manter uma concentração eficaz. A suscetibilidade reduzida da virginiamicina foi observada em lactobacilos isolados de plantas de etanol de moagem a seco que usam a virgi- niamicina e o surgimento de isolados com a resistência à múltiplas drogas tanto a penicilina como a virginiamicina também foi relatado (Bischoff 2009). Portanto são necessárias as alternativas para evitar a redução do rendimento de etanol a partir da fermentação de carboidrato. LISTAGEM DE REFERÊNCIA Bayrock, Dennis, 2007. Method of reducing the growth of Lactobacillus in a process of ethanol production by yeast fermentation comprising adding a pristinamycin type antimicrobial agent and/or a polyether ionophore antimicrobial agent dissolved in an organic solvent. PCT patent N° WO 2007/145858 Bayrock, D.P., K.C.Thomas and W.M. Ingledew, 2003. Control of Lactobacillus contaminants in continuous fuel ethanol fermentations by constant or pulsed addition of penicillin. G. App. Microbiol. Bio- technol 62: 498-502. Bayrock, D. and W.M. Ingledew, 2001. Changes in steady state on introduction of a Lactobacillus contaminant to a continuous culture ethanol fermentation. J. Industrial Microbiology and Biotechnology 27: 39-45. Bischoff, K.M., S. Liu, T.D. Leathers and R.E. Worthington, 2009. Modeling bacterial Contamination of Fuel Ethanol Fermentation. Biotechno. Bioeng 103: 117-122. Bischoff, K.M., K.A. Skinner-Nemec and T.D. Leathers, 2007. Antimicrobial susceptibility of Lactobacillus species isolated from commercial ethanol plants. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. Chang I.N., B.H. Kim and P.K. Shin, 1997. Use of sulfite and hydrogen peroxide to control bacterial contamination in ethanol fermentation. Applied and Environmental Microbiology 63(1): 1-6. Dien, B.S., M.A. Cotta and T.W. Jeffries, 2003. Bacteria engineered for fuel ethanol production: current status. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 258-266. Hynes, S.H., Kjarsgaard, K.C. Thomas and W.M. Ingledew, 1 97. Use of virginiamycin to control the growth of lactic acid bacteria during alcohol fermentation. J Industrial Microbiology and Biotechnology 18: 284-291. Majovic, L, S. Nikolic, M. Rakin and M. Vukasinovic, 2006. Production of Bioethanol from Corn Meal Hydrolyzates. Fuel 85: 17501755. Maye, John P., 2006. Use of hop acids in fuel ethanol production. Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 20060263484 Narendranath, N. V. and R. Power, 2004. Effect of yeast inoculation rate on the metabolism of contaminant lactobacilli during fermentation of corn mash. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31 : 581-584. Narendranath, N.V., K.C. Thomas and W.M. Ingledew, 2000. Urea hydrogen peroxide reduces the number of lactobacilli, nourish yeast, leaves no residues in the ethanol fermentation. Applied and Environmental Microbiology 66(10): 4187-4192. Nash, Peter, et al 2009. Immunogen adherence inhibitor directed to Lactobacillus organisms and method of making and using it. Pedido de Patente dos Estados Unidos N°20090117129 Oliva-Neto, P., M.A. Ferreira and F. Yokoya, 2004. Screening for yeast with antibacterial properties from ethanol distillery. Bioresource Technology 92: 1-6. RFA "Renewable Fuels Association" 2006 and 2009. Skinner-Nemec, K.A., N. N Nichols and T.D. Leathers, 2007. Biofilm formation by bacterial contaminants of fuel ethanol production. Biotechnol. Lett. 29: 379-383. Skinner, K.A. and T.D. Leathers, 2004. Bacterial Contaminants of Fuel Ethanol Production. J. Ind. Microbiol. Biotech. 31: 401408. Thomas, K.C., S.H. Hynes and W.M. Ingledew, 2001. Effect of lactobacilli on yeast growth, viability and batch and semi-continuous alcoholic fermentation on corn mash. J. Applied Microbiology 90: 819828.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0037] Um objetivo da invenção é fornecer uma composição quí- mica que evite "a fermentação emperrada" durante a produção de eta- nol inibindo ou reduzindo o crescimento de Lactobacillus spp. e outras bactérias durante a fermentação do milho, outro amido ou um material à base de celulose. Outro objetivo é fornecer um método de fermentação de carboidratos a etanol, compreendendo: a) tratamento do carboidrato a ser fermentado com uma composição contendo: 10 a 90 % em peso de um aldeído selecionado do grupo consistindo em formaldeído, paraformaldeído, glutaraldeído e misturas dos mesmos, 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um HLB de 4 a 18. 0 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano, ou óleos essenciais, 1 a 50 % em peso de ácidos orgânicos selecionados de ácidos graxos de C1 a C24, os seus sais, glicerídeos e ésteres dos mesmos, e 1 a 50 % em peso de água; b) fermentação do dito carboidrato na presença de levedura e/ou uma enzima no caldo de fermentação, e c) isolamento do etanol.

[0038] Outro objetivo da invenção deve fornecer um método para a produção crescente de etanol em um sistema de fermentação inicialmente emperrado acrescentando uma composição que compreende: a) 10 a 90 % em peso de um aldeído selecionado do grupo consistindo em formaldeído, paraformaldeído, glutaraldeído e misturas dos mesmos, b) 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um HLB de 4 a 18, c) 1 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano, ou óleos essenciais, d) 1 a 50 % em peso de ácidos orgânicos selecionados de ácidos graxos de C1 a C24, os seus sais, glicerídeos e ésteres dos mesmos, e e) 1 a 50 % em peso de água. Outro objetivo da invenção deve reduzir o uso de antibióticos durante a fermentação de carboidratos que acrescentam ao sistema de fermentação uma composição que compreende: a) 10 a 90 % em peso de um aldeído selecionado do grupo consistindo em formaldeído, paraformaldeído, glutaraldeído e misturas dos mesmos, b) 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um HLB de 4 a 18 c) 1 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano, ou óleos essenciais, d) 1 a 50 % em peso de ácidos orgânicos selecionados de ácidos graxos de C1 a C24, os seus sais, glicerídeos e ésteres dos mesmos, e e) 1 a 50 % em peso de água.

[0039] Outro objetivo da invenção deve reduzir a presença de an tibiótico no subproduto resultante da fermentação de carboidrato de grãos, por exemplo, destilados, glúten de milho e outros.

[0040] Outro objetivo da invenção deve reduzir resíduos em produ tos de origem animal pela alimentação dos animais com subprodutos da fermentação resultante de não antibióticos mas de substratos tratados de acordo com a presente invenção.

[0041] Outro objetivo é inibir o desenvolvimento de cepas resisten tes a antibióticos de bactérias que ocorrem durante a fermentação.

[0042] Outro objetivo deve aumentar o rendimento de etanol a par tir do carboidrato fermentado.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS DEFINIÇÕES

[0043] "A fermentação Emperrada" ocorre quando a fermentação do amido ao etanol é incompleta e parou devido à alta concentração bacteriana e ao teor de ácido no fermentador.

[0044] "Percentagem em peso" (% em peso) de um componente está baseada no peso total da formulação ou composição na qual o componente está incluído.

[0045] "Aldeído" inclui formaldeído, paraformaldeído, e outros al deídos ativos.

[0046] "Ácido orgânico" inclui fórmico, acético, propiônico, butírico e outro ácidos graxos de C1 a C24, ou mono, di, ou triglicerídeos de ácidos graxos de C1 a C24 ou os seus ésteres.

[0047] "Terpeno antimicrobiano" pode incluir dissulfeto de alila, citral, pineno, nerol, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, anetol, cânfora, mentol, limoneno, farnesol, caroteno, timol, borneol, mirceno, ter- peneno, linalool, ou misturas dos mesmos. Mais especificamente, os terpenos podem compreender dissulfeto de alila, timol, citral, eugenol, limoneno, carvacrol, e carvona, ou misturas dos mesmos. O componente de terpeno pode incluir outros terpenos com propriedades anti- microbianas e óleos essenciais.

[0048] As bactérias que podem interferir com na fermentação de etanol incluem Lactobacillus e

[0049] Leuconostoc, que causam a maior parte de problemas. Ou tras de tais bactérias incluem Pediococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus e Clostridia.

[0050] No etanol produzido do milho, os antibióticos são o biocida comum, por exemplo, virginimicina, penicilina, clindamicina, tilosina, cloranfenicol, cefalosporina e tetraciclina.

[0051] Contudo no etanol produzido da cana-de-açúcar, desde que o produto final não seja alimentado a animais, outros biocidas podem ser usados, desde que os resíduos não apresentem o mesmo problema. Em tais casos os biocidas convenientes incluem carbamatos, compostos de amônio quaternários, fenóis e antibióticos (por exemplo, virginiamicina, penicilina, clindamicina, tilosina, cloranfenicol, cefalos- porina e tetraciclina).

[0052] O termo "quantidade eficaz" de um composto significa uma quantidade capaz de executar a função ou possuindo a propriedade para a qual a quantidade eficaz é expressada, tais como uma quantidade não tóxica mas suficiente para fornecer benefícios antimicrobia- nos. Assim uma quantidade eficaz pode ser determinada por um dos profissionais normalmente versados na técnica pela experimentação regular.

[0053] As formulações variam não somente nas concentrações dos componentes principais, por exemplo, aldeídos, ácidos orgânicos, mas também na concentração dos tipos de terpenos, tensoativo(s) e água. A presente invenção pode ser modificada acrescentando ou eliminando o terpeno, tipo de ácido orgânico, e usando outro tipo de ten- soativo.

COMPOSIÇÕES.

[0054] Em geral, uma composição da presente invenção contém: a) 10 a 90 % em peso de um aldeído selecionado do grupo consistindo em formaldeído, paraformaldeído, glutaraldeído e misturas dos mesmos, b) 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um HLB de 4 a 18, c) 1 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano, ou óleos essenciais, d) 1 a 50 % em peso de um ácido orgânico ou misturas de ácidos orgânicos selecionados de acético, propiônico, butírico e outro ácidos graxos de C1 a C24, formas salinas, glicerídeos e ésteres dos mesmos, e, e) 1 a 50 % em peso de água.

[0055] Os terpenos antimicrobianos, extratos de planta ou óleos essenciais que contêm terpenos podem ser usados nas composições da presente invenção bem como os terpenos mais purificados. Os ter- penos estão prontamente disponíveis comercialmente ou podem ser produzidos por métodos conhecidos na técnica, tais como extração por solvente ou extração/destilação a vapor ou síntese química.

[0056] O tensoativo é não iônico incluído os tensoativos de óleo de rícino etoxilados com 1 a 200 moléculas de etileno distribuídas normalmente em torno da média, preferivelmente uma média de 10 a 80. Outros tensoativos com características semelhantes podem ser usados incluindo os tensoativos Tween.

MÉTODOS.

[0057] A presente invenção é eficaz contra bactérias. Os exemplos destes agentes infecciosos incluem Lactobacillus spp., E. coli, Salmonella spp., Clostridium spp., Campylobacter spp., Shigella spp., Bra- chyspira spp., Listeria spp., Arcobacter spp., e outros.

[0058] A mistura da presente invenção é aplicada por um bocal de borrifo.

[0059] A mistura é aplicada para fornecer uma distribuição unifor me e homogênea em todas as partes do substrato de carboidrato.

[0060] Várias patentes e suas publicações são referidas em todas as partes do presente relatório descritivo. As divulgações de cada documento são aqui incorporadas pela referência na sua integridade.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0061] Este exemplo mostra a formulação do produto à base de formaldeído usado em exemplos subsequentes.

EXEMPLO 2

[0062] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito de uma Fór mula A na sobrevivência de lactobacilos.

Materiais e Métodos:

[0063] Lactobacillus plantarum (B-4496) foi obtido de Genômicos Microbianos USDA e Bioprocessing Research em Illinois. L. plantarum foi cultivado em caldo Difco ® Lactobacilli MRS (Man-Rogosa-Sharpe). A cultura de caldo foi diluída com a água de peptona estéril para obter concentrações diferentes de lactobacilos. As diluições foram tratadas com concentrações diferentes da Fórmula A (0, 1, 2 e 3 kg/MT) e incubadas durante 24 horas na temperatura ambiente (20°C). Após incubação, as amostras em triplicatas foram tomadas e plaqueadas no caldo MRS contendo1,5 % Difco ® agente de solidificação de agar granulado. As placas foram incubadas em 37°C durante a noite e as colônias contadas após 24 horas. A média de cfu/mL para cada tratamento é mostrada na seguinte tabela:

[0064] Observou-se que o uso 2 kg/MT do produto a base de for- maldeído reduziu o crescimento de lactobacilos em uma cultura con- tendo107 cfu/mL.

EXEMPLO 3

[0065] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da Fórmula A na sobrevivência de leveduras e lactobacilos durante a fermentação.

Material e Métodos:

[0066] Estéril, finamente o milho moído foi misturado com a água estéril em um fermentador de vidro. Depois, uma solução de enzima comercial contendo alfa amilase e mistura de glicoamilase (Stargen: Genencor) para processar do amido não cozinhado foi acrescentado. Levedura de Fali (1010 cfu/g; Fleischmann) usado como a levedura fermentativa foi acrescentada às misturas lodosas de milho misturando-se. Finalmente, Lactobacillus plantarum (B-4496), obtido de Genô- micos Microbianos USDA e Bioprocessing Research no Illinois e cultivado em Difco caldo MRS de lactobacilos, foi usado como o contami- nante bacteriano representativo do fermentador. Um produto baseado em foi acrescentado como a etapa final do processo.

[0067] Os tratamentos usados são mostrados na tabela abaixo. As amostras tomadas em 4h, 24h, 48h, 72h e 96 horas foram analisadas para contagem de lactobacilos e Levedura. Os tratamentos são como se segue:

[0068] Os resultados são mostrados nas seguintes tabelas:

[0069] Observou-se que 1 kg / tonelada do produto a base de for- maldeído reduziu o nível de lactobacilos, mas não afetou o nível da levedura.

EXEMPLO 4

[0070] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da Fórmula A na sobrevivência de leveduras e lactobacilos durante a fermentação

Material e Métodos:

[0071] O milho inteiro naturalmente contaminado foi obtido de uma fonte comercial. Os lactobacilos que naturalmente ocorrem no milho foram encontrados como estando em 300 cfu/g. Neste estudo o milho inteiro foi tratado com a Fórmula A em 0, 1, 2 e 3 kg/MT. Após 24h, 20g do milho de cada tratamento foi finamente moído e acrescentado a fermentadores de vidro com água, enzima e levedura como descrito abaixo. Amostras tomadas em 4, 24, 48 e 72 horas foram analisadas para contagem de lactobacilos e levedura. Os tratamentos são como se segue:

[0072] Os resultados são mostrados nas seguintes tabelas:

[0073] Observou-se que o uso da fórmula A não afetou o cresci mento de levedura e ele diminuiu o número de lactobacilos a 0 no nível de tratamento mais alto.

EXEMPLO 5

[0074] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da Fórmula A na sobrevivência de leveduras e lactobacilos durante a fermentação.

Material e Métodos:

[0075] O milho inteiro naturalmente contaminado foi obtido de uma fonte comercial. Os lactobacilos que naturalmente ocorrem no milho foram encontrados como estando em 300 cfu/g. Neste estudo, o milho inteiro foi tratado com a Fórmula A em 0, 1, 2 e 3 kg/MT. Após 24h, 20g do milho de cada tratamento foi finamente moído e acrescentado a fermentadores de vidro com água, enzima e levedura como descrito abaixo. Lactobacillus plantarum (B-4496) cultivado no caldo MRS foi acrescentado às garrafas de fermentação (0,1 mL de 6.2 105 cfu x/mL). As amostras foram tomadas após fermentação de 72 horas de contagem de lactobacilos e levedura. Os tratamentos são listados na seguinte tabela.

[0076] Os resultados são mostrados na seguinte tabela.

[0077] Não houve nenhum efeito do tratamento químico na con centração de levedura. A contagem de lactobacilos diminuiu como o nível do tratamento químico aumentou no milho.

EXEMPLO 6

[0078] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da Fórmula A na sobrevivência de leveduras e lactobacilos durante a fermentação.

Material e Métodos:

[0079] O milho inteiro naturalmente contaminado foi obtido de uma fonte comercial. Os lactobacilos que naturalmente ocorrem no milho foram encontrados como estando em 300 cfu/g. Neste estudo, o milho inteiro foi tratado com a Fórmula A em 0, 1, 2 e 3 kg/MT. Após 24h, 20g do milho de cada tratamento foi finamente moído e acrescentado a fermentadores de vidro com água, enzima e levedura como descrito abaixo. Lactobacillus plantarum (B-4496) cultivado no caldo MRS foi acrescentado às garrafas de fermentação (0,1 mL de 6,2x105 cfu /mL). As amostras foram tomadas após fermentação de 72 horas de contagem de lactobacilos e levedura.

[0080] Os resultad os são mostrados na seguinte ta bela.

[0081] Não houve nenhum efeito do tratamento químico na con- centração de levedura. A contagem de lactobacilos diminuiu como o tratamento químico foi aumentado no milho.

EXEMPLO 7

[0082] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito o formaldeí- do na sobrevivência de leveduras e lactobacilos durante a fermentação.

Material e Métodos:

[0083] O milho inteiro obtido de uma fonte comercial foi tratado com a formalina (solução de formaldeído de 37 %) em 0, 0,9, 1,8 e 2,7 kg MT. Após 24h, 30 g de com de cada tratamento foram finamente moídos e acrescentaram a fermentadores de vidro com água, enzima e levedura como descrito abaixo.

[0084] Lactobacillus plantarum (B-4496) cultivado no caldo MRS foi acrescentado às garrafas de fermentação (0,2 mL de 6,2 x 105 cfu/g). As amostras foram tomadas após fermentação de 72 horas de contagem de lactobacilos e levedura. O teor inteiro das garrafas de fermentações foi centrifugado durante 30 minutos em 5000 rpm, filtradas através de gaze e através de um filtro de 0,45μ para quantificar a produção de etanol. Os tratamentos são listados na seguinte tabela.

[0085] Os resultados são mostrados na seguinte tabela. CONCLUSÕES 1. O inóculo de Lactobacillus plantarum não se multiplicou em nenhum dos tratamentos. 2. O uso da solução de formaldeído de 37 % pareceu ter um efeito negativo sobre o crescimento de levedura.

EXEMPLO 8

[0086] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito de formalde- ído na sobrevivência de leveduras e lactobacilos durante a fermentação.

Material e Métodos:

[0087] O milho inteiro obtido de uma fonte comercial foi tratado com a solução de formaldeído de 37 % em 0, 0,9, 1,8 e 2.,7 kg MT. Após 24h, 30g do milho de cada tratamento foi finamente moído e acrescentado a fermentadores de vidro com água, enzima e levedura como descrito abaixo. A plantação de lactobacilos (B-4496) cultivado no caldo MRS foi acrescentada às garrafas de fermentação (0.1 mL de 6,2 x 1010cfu/mL). As amostras foram tomadas após fermentação de 72 horas de contagem de lactobacilos e levedura. O teor inteiro das garrafas de fermentações foi centrifugado durante 30 minutos em 5000 rpm, filtradas através de gaze e através de um filtro de 0,22 μ para quantificar a produção de etanol. Os tratamentos são listados na se- guinte tabela.

[0088] Os resultados são mostrados nas seguintes tabelas. CONCLUSÕES 1. O formaldeído produz uma ligeiramente redução (1 log) no índice cfu (unidades formadoras de colônias) quando os lactobacilos foram acrescentados em concentrações mais altas. 2. O formaldeído reduziu ligeiramente a concentração de levedura. 3. O tratamento de formaldeído reduziu a densidade da solução de fermentação indicando um aumento no teor de etanol.

EXEMPLOS DE 9 A 12.

[0089] A produção de etanol e o perfil microbiológico foram anali sados em quatro estudos de fermentação usando milho tratado com 0 (controle), 0,45 e 0,90 Kg/MT Formaldeído. O milho moído e a água foram misturados e incubados na temperatura ambiente em jarros fer- mentadores de 250 mL herméticos durante 6 horas. Isto foi feito para aumentar os lactobacilos naturalmente ocorrem no milho. Os estudos prévios mostraram que o nível de lactobacilos é menos de 100 cfu/g no milho. Outros reagentes foram acrescentados nos fermentadores como descrito na seguinte tabela.

[0090] Após a adição de todos os reagentes, os fermentadores foram selados com um tampão contendo um selo de água. Os fermen- tadores foram mantidos sob agitação constante (velocidade baixa) na temperatura ambiente (21-23 °C) durante 72 horas antes da amostra- gem de levedura, lactobacilos e produção de álcool. A contagem de lactobacilos foi determinada no caldo MRS contendo 1,5 % Difco® Agar. As placas foram incubadas em uma câmara anaeróbica em 37°C durante 48 horas e as colônias contadas. A contagem de levedura foi determinada em placas PDA. As placas foram incubadas em 27°C durante 48 horas e as colônias contadas. O álcool foi determinado por FT-IR. (Sistema de FOSS).

[0091] Destes estudos podemos concluir que o tratamento do mi lho com o formaldeído melhorou o rendimento de etanol. Este efeito parece ser devido ao controle de lactobacilos.

EXEMPLOS DE 13 A16.

[0092] Os lactobacilos selvagens e o perfil de levedura/mofo foram determinados em quatro estudos usando milho tratado com 0 (contro- le), 0,45 e 0,90 kg/MT Formaldeído (HCHO). O milho moído e a água foram misturados e incubados na temperatura ambiente (21 a 23 °C) em um ambiente anaeróbico durante 24 horas. A 5 g do milho moído 45 mL de Butterfield foram acrescentados e incubados durante a noite em um reservatório fechado enquanto agitação na temperatura ambiente. Após incubação, as amostras foram tomadas para enumerar le- vedura/mofo selvagem e lactobacilos. Os resultados são apresentados na seguinte tabela.

[0093] Estes estudos mostraram uma redução nos níveis de lacto bacilos e de levedura/mofo no milho tratados com formaldeído.

[0094] Será evidente para aqueles versado na técnica que as vari ações e as modificações da invenção podem ser feitas sem fugir do espírito e do alcance dos ensinamentos acima. Compreende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados como exemplos somente e não são restritivos.

Claims

1. Método de fermentação de um amido a etanol, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a formação de um caldo de fermentação compreendendo o amido, uma enzima para hidrolisar o amido a açúcares fermentáveis, uma levedura para converter os açúcares fermentáveis a etanol, e uma composição contendo: 10 a 90 % em peso de formaldeído, 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) de 4 a 18, 0 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano ou óleos essenciais contendo o terpeno antimicrobiano, em que o terpeno anti- microbiano é selecionado do grupo que consiste em dissulfureto de alila, citral, pinena, nerol, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, aneto- la, cânfora, mentol, limoneno, farnesol, caroteno, timol, borneol, mirce- no, terpeneno, linalol, e misturas dos mesmos, 1 a 50 % em peso de ácidos orgânicos selecionados do grupo que consiste em ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, os seus sais, glicerídeos e ésteres dos mesmos, e 1 a 50 % em peso de água, o referido caldo de fermentação compreende 38-333 partes por milhão (ppm) de formaldeído; b) a fermentação do caldo de fermentação de modo que a enzima hidrolisa o amido a açúcares fermentáveis e a levedura converte os açúcares fermentáveis a etanol; e c) o isolamento do etanol a partir do restante do caldo de fermentação.

2. Método de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição e o caldo de fermentação são livres de carbamatos, compostos de amônio quaternário e fenóis.

3. Método de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ou ácido butírico.

4. Método de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) o caldo de fermentação compreende ainda um antibiótico para controlar lactobacilos selecionado do grupo que consiste em viri- nimicina, penicilina, clindamicina, tilosina, cloranfenicol, cefalosporina, tetraciclina; ou (ii) a composição e o caldo de fermentação são livres de antibióticos usados para controlar bactérias no caldo de fermentação.

5. Método de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição e o caldo de fermentação é livre de virginiamicina.

6. Método de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material que permanece após o isolamento do etanol é coletado e acrescentado ao alimento animal.

7. Caldo de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: uma fonte de amido, levedura, e/ou uma enzima, e uma composição contendo 10 a 90 % em peso de formaldeído, 1 a 50 % em peso de um tensoativo possuindo um equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) de 4 a 18, 0 a 20 % em peso de um terpeno antimicrobiano ou óleos essenciais contendo o terpeno antimicrobiano, em que o terpeno anti- microbiano é selecionado do grupo que consiste em dissulfureto de alila, citral, pinena, nerol, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, aneto- la, cânfora, mentol, limoneno, farnesol, caroteno, timol, borneol, mirce- no, terpeneno, linalol, e misturas dos mesmos, 1 a 50 % em peso de ácidos orgânicos selecionados do grupo que consiste em ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, os seus sais, glicerídeos e ésteres dos mesmos, e 1 a 50 % em peso de água, em que o referido caldo de fermentação compreende 38333 partes por milhão (ppm) de formaldeído.

8. Caldo de fermentação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a fonte de amido é milho, sorgo, trigo, triticale, centeio, cevada, arroz ou tubérculos.