BRPI1005919B1

BRPI1005919B1 - Composição imunogênica

Info

Publication number: BRPI1005919B1
Application number: BRPI1005919-9A
Authority: BR
Inventors: Reiji Nishio; Nobuo Ida
Original assignee: Toray Industries, Inc
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2021-06-22
Also published as: DK2402032T3; BRPI1005919A2; CA2753567A1; ES2755361T3; CA2753567C; CN102333541A; AU2010218752A1; EP2402032A4; HUE046865T2; KR20110128284A; AU2010218752B2; CN102333541B; MX2011008923A; US9056095B2; PL2402032T3; WO2010098432A1; JP6008345B2; PT2402032T; EP2402032B1; JPWO2010098432A1

Abstract

“composição imunogênica” a presente invenção se refere a uma composição imunogênica que compreende, como um ingrediente eficaz, um complexo de micropartículas de adjuvante-antíigeno contendo um antígeno encapsulado em uma micropartícula de adjuvante composta pelo polímero(s) anfifílico(s) cujo segmento hidrofóbico é um poli(hidróxi ácido), ou uma partícula composta pelo complexo de micropartículas de adjuvante-antígeno associados em conjunto, a qual pode induzir uma alta resposta imune contra o antígeno mesmo com uma pequena quantidade do antígeno e uma pequena quantidade de doses, de modo que a composição imunogênica seja útil como uma vacina eficaz para terapia e profilaxia de doenças infecciosas, câncer e similares.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que compreende como ingrediente eficaz um complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno que contém um antígeno encapsulado em uma micropartícula de adjuvante composta de um polímero(s) anfifílico(s).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Para a melhoria da capacidade de ativação imune de um antígeno, um adjuvante é usado junto com o antígeno. Embora o adjuvante completo de Freund (CFA) seja conhecido por ter um efeito excelente como um adjuvante, o CFA é composto de bactérias mortas e emulsão de óleo e, portanto, tem efeitos colaterais fortes como reação inflamatória forte e formação de tumefação ulcerativa (granuloma) no sítio de administração. Portanto, o uso do CFA para humanos não é permitido tendo em vista a segurança. Os adjuvantes cuja administração a humanos é permitida são limitados. Exemplos dos adjuvantes cuja administração a humanos é permitida incluem adjuvantes de hidróxido de alumínio, mas suas capacidades de imuno- ativação não são necessariamente suficientes e, portanto, precisam ser repetidamente administrado para permitir a aquisição de imunidade. Portanto, o desenvolvimento de uma composição imunogênica com o uso de um adjuvante forte e eficiente, cuja composição pode ser usada para humanos, é necessário.

[003] Para o desenvolvimento de um adjuvante inovador direcionado para a obtenção de uma capacidade de imuno-ativação alta, um método em que um antígeno é encapsulado em uma micropartícula foi testado. Foi relatado que a administração de um antígeno microencapsulado melhora as reações imunológicas como a produção de anticorpo comparada ao caso de administração de um antígeno sozinho, mas o efeito de sua administração não é necessariamente alto, e apenas um efeito em quase o mesmo nível que o caso do adjuvante de hidróxido de alumínio mencionado acima foi relatado. Considera-se que isso ocorre devido à dificuldade na encapsulação eficiente de moléculas de antígeno hidrofílico como proteína em micropartículas estudadas até hoje, como as micropartículas que compreendem copolímeros de ácido poliglicólico-ácido polilático hidrofóbico, enquanto mantêm as estruturas das moléculas de antígeno (Documento de não patente 1).

[004] Recentemente, uma tecnologia de micropartícula inovadora foi relatada (Documentos de Patente 1 e 2), cuja tecnologia usa um polímero anfifílico e permite a encapsulação altamente eficiente de uma proteína de alto peso molecular. Embora essa micropartícula inovadora tenha sido estudada por seu desempenho de liberação sustentada para fármacos, sua função adjuvante em casos em que um antígeno é encapsulado na mesma não foi estudada. Além disso, em termos do mecanismo através do qual uma micropartícula que contém um antígeno funciona como adjuvante, considera-se que a função para a liberação sustentada das moléculas de antígeno, assim como o mecanismo através do qual a micropartícula que contém um antígeno é incorporada em sua totalidade em um imunócito e libera o antígeno na célula, é importante e considera-se, ainda, que a função de liberação de fármaco a partir da partícula e o desempenho como um adjuvante não são necessariamente correlacionados um ao outro. Portanto, é difícil deduzir a função de adjuvante a partir do desempenho de liberação sustentada da partícula e um adjuvante eficaz que tenha um desempenho muito melhor do que adjuvantes de alumínio ainda não foi realizado até hoje por tecnologias convencionais com o uso de micropartículas, apesar da demanda por seu desenvolvimento.

DOCUMENTOS DE PATENTE

[005] [Documento de Patente 1] W02006/095668

[006] [Documento de Patente 2] JP 2008-088158 A

[007] Documentos de Não-Patente

[008] [Documento de Não-Patente 1] Advanced drug delivery reviews, 2005, vol. 57, pp. 391 a 410

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

[009] A presente invenção tem como objetivo fornecer uma composição imunogênica que mostra uma alta capacidade de imuno-ativação mesmo com uma pequena quantidade de antígeno e/ou um pequeno número de doses.

MEIOS PARA SOLUCIONAR OS PROBLEMAS

[010] Para solucionar os problemas descritos acima, os presentes inventores estudaram um método através do qual um alto nível de imuno-ativação pode ser induzido com o uso de uma pequena quantidade de antígeno e com um pequeno número de doses do mesmo e, como consequência, encontraram que um complexo de micropartícula de adjuvante- antígeno que contém um antígeno encapsulado em uma micropartícula de adjuvante tem alta capacidade de imuno-ativação in vivo. Isto é, a presente invenção tem a seguinte constituição. (1) Composição imunogênica que compreende como ingrediente eficaz um complexo de micropartículas de adjuvante-antígeno contendo um antígeno encapsulado em uma micropartícula de adjuvante composta de polímero(s) anfifílico(s) cujo segmento hidrofóbico é um poli(hidróxi ácido). (2) Composição imunogênica de acordo com (1), que compreende, como um ingrediente eficaz, uma partícula composta do complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno associados. (3) Composição imunogênica de acordo com (1) ou (2), em que a micropartícula de adjuvante tem uma porção hidrofílica no interior da mesma, sendo que a porção hidrofílica é composta de um segmento hidrofílico do polímero anfifílico e tem uma camada externa composta de uma porção hidrofóbica constituída pelo segmento hidrofóbico do polímero anfifílico. (4) A composição imunogênica de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o segmento hidrofílico do polímero anfifílico é um polissacarídeo ou um polietileno glicol. (5) Composição imunogênica, de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o polímero anfifílico é um polímero anfifílico de enxerto composto de uma cadeia principal composta de polissacarídeo e uma cadeia de enxerto de poli(hidróxiácido). (6) Composição imunogênica, de acordo com (4) ou (5), em que o polissacarídeo é dextrano. (7) Composição imunogênica, de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o polímero anfifílico é um polímero de bloco composto de um poli (hidróxiácido) e um polietileno glicol. (8) Composição imunogênica, de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que o poli(hidróxiácido) é um ácido poli(láctico-co-glicólico). (9) Composição imunogênica, de acordo com qualquer um de (1) a (8), que compreende, ainda, um modificador de superfície ligado ao poli(hidróxiácido) da micropartícula de adjuvante. (10) Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma de (1) a (9), em que o tamanho de partícula médio do complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno ou a partícula composta do complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno associados juntos é de 0,1 a 50 μm. (11) Composição imunogênica, de acordo com qualquer um de (1) a (10), que compreende, ainda, uma substância de imuno-ativação. (12) Composição imunogênica, de acordo com (11), em que a substância de imuno-ativação é um ácido nucleico. (13) Composição imunogênica, de acordo com (11) ou (12), em que a substância de imuno-ativação é CpG.

EFEITO DA INVENÇÃO

[011] Através da presente invenção, uma composição imunogênica com a qual a imuno-ativação é mais forte do que antes é possível in vivo é fornecida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[012] A Figura 1 mostra a avaliação imunológica 1 de composições imunogênicas que contêm OVA.

[013] A Figura 2 mostra a avaliação imunológica (IgG total) de composições imunogênicas que contêm CEA.

[014] A Figura 3 mostra a avaliação imunológica (IgG2a) de composições imunogênicas que contêm CEA.

[015] A Figura 4 mostra a avaliação imunológica 2 de composições imunogênicas que contêm OVA.

[016] A Figura 5 mostra a avaliação imunológica 3 de composições imunogênicas que contêm OVA.

[017] A Figura 6 mostra a avaliação imunológica de composições imunogênicas que contêm proteína estrutural HCV.

[018] A Figura 7 mostra a avaliação imunológica 2 de composições imunogênicas que contêm CEA.

[019] A Figura 8 mostra a avaliação imunológica 3 de composições imunogênicas que contêm CEA.

[020] A Figura 9 mostra a avaliação imunológica 4 de composições imunogênicas que contêm OVA.

[021] A Figura 10 mostra a avaliação imunológica 4 de composições imunogênicas que contêm CEA.

[022] A Figura 11 mostra a avaliação imunológica (razão de IgG2a/IgG1) de composições imunogênicas que contêm CEA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[023] A presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que compreende um complexo de micropartícula de adjuvante- antígeno que contém um antígeno encapsulado em uma micropartícula de adjuvante composta de um polímero(s) anfifílico(s) cujo segmento hidrofóbico é um poli(hidróxiácido).

[024] Primeiramente, o polímero anfifílico que constitui a micropartícula de adjuvante é descrito. Ser "anfifílico" significa que ambas as propriedades de hidrofilicidade e hidrofobicidade são retidas. Quando a solubilidade de certa porção em água é mais alta que aquela de outras porções, diz-se que a porção é hidrofílica. A porção hidrofílica é, de preferência, solúvel em água, mas mesmo em casos em que a porção tem uma solubilidade em água pobre, é suficiente se a solubilidade em água for mais alta do que aquela de outras porções. Quando a solubilidade de certa porção em água é mais baixa que aquela de outras porções, diz-se que o segmento é hidrofóbico. A porção hidrofóbica é, de preferência, insolúvel em água, mas mesmo em casos em que a porção é solúvel em água, é suficiente se a solubilidade em água for mais baixa do que aquela de outras porções.

[025] O polímero anfifílico significa um polímero que tem a anfifilicidade supracitada como a molécula integral. O polímero significa que a molécula tem uma estrutura molecular em que o segmento hidrofílico ou o segmento hidrofóbico do polímero anfifílico, ou ambos, é/são constituído(s) por uma estrutura(s) em que unidades mínimas (monômeros) são repetidas. O polímero anfifílico da presente invenção pode ter uma estrutura que tem um segmento(s) hidrofílico(s) e um segmento(s) hidrofóbico(s), e pode ser um polímero de bloco linear que tem um segmento(s) hidrofílico(s) e um segmento(s) hidrofóbico(s) ligados um ao outro; um polímero ramificado que tem uma ramificação(ões) em que um ou ambos o segmento(s) hidrofílico(s) e o segmento(s) hidrofílico(s) existe(m); ou um polímero de enxerto em que diversos segmentos hidrofóbicos são enxertados a um segmento hidrofílico ou diversos segmentos hidrofílicos são enxertados em um segmento hidrofóbico. O polímero anfifílico da presente invenção é, de preferência, um polímero que tem um segmento hidrofílico, com mais preferência, um polímero de bloco linear que tem um de cada de um segmento hidrofílico e um segmento hidrofóbico, ou um polímero de enxerto que tem diversos segmentos hidrofóbicos enxertados em uma cadeia principal de segmento hidrofílico.

[026] O polímero anfifílico que constitui a composição imunogênica pode ser um conjunto de diversos tipos de polímeros anfifílicos compostos de polímeros constituintes que têm porções hidrofílicas diferentes e/ou poções hidrofílicas, ou um conjunto de polímeros anfifílicos que têm os mesmos polímeros constituintes, mas tendo tipos de padrões de ligação, contanto que o polímero anfifílico tenha propriedades como uma micropartícula de adjuvante. Tendo em vista o alcance do desempenho estável e melhoria da produtividade, o polímero anfifílico é, de preferência, um conjunto de um pequeno número de tipos de polímeros anfifílicos, mais preferivelmente, um conjunto de principalmente não mais do que 2 tipos de polímeros anfifílicos, e ainda mais preferivelmente constituído por, principalmente, um único tipo de polímero anfifílico.

[027] Na presente invenção, o segmento hidrofóbico do polímero anfifílico é um poli(hidróxiácido). O poli(hidróxiácido) não é restrito, e, de preferência, um polímero biocompatível que não tem um efeito severamente adverso mediante a administração a um corpo vivo. A biocompatibilidade, na presente invenção, significa que LD50 no caso de administração oral dos polímeros a ratos não é menor do que 2.000 mg/kg. Além disso, o polímero pode ser um copolímero de diversos tipos de hidróxiácidos e é, de preferência, um polímero de não mais do que 2 tipos de hidróxiácidos. Exemplos preferidos particulares do poli(hidróxiácido) incluem o ácido poliglicólico, ácido poliláctico, ácido poli(2-hidróxibutírico), ácido poli(2-hidroxivalérico), ácido poli(2- hidroxicaproico), ácido poli(2-hidroxicáprico) e ácido poli(málico); e os derivados e copolímeros desses compostos macromoleculares; dentre os quais os copolímeros de ácido poliláctico, ácido poliglicólico e o ácido poli (láctico-co- glicólico) são mais preferíveis. Além disso, em casos em que o poli(hidróxiácido) é um ácido poli(láctico-co-glicólico), a razão de composição do ácido poli(láctico-co-glicólico) (ácido láctico/ácido glicólico) (mol/mol%) não é restrita, contato que a finalidade da presente invenção seja alcançada com a mesma, e a razão seja de preferência 100/0 a 30/70, com mais preferência 60/40 a 40/60.

[028] O segmento hidrofílico do polímero anfifílico não é restrito e, de preferência, é um polímero biocompatível, como no caso do segmento hidrofóbico. Além disso, para render uma capacidade de adjuvante persistente à micropartícula de adjuvante composta de um polímero anfifílico, o segmento é, de preferência, um polímero refratário que não é facilmente decomposto em um corpo vivo ou célula de um mamífero ou ave. Exemplos particulares do polímero biocompatível e refratário incluem polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool de polivinila, polietilenoimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, polímero de poli-1,3-dioxolano, 2-metacriloiloxietil fosforil colina, poli-1,3,6-trioxano, poliamino ácido e polissacarídeos refratários (por exemplo, celulose, quitina, quitosano, goma gelana, ácido algínico, ácido hialurônico, pululano e dextrano). Em casos em que o segmento hidrofílico é polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool de polivinila, polietilenoimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli-1,3-dioxolano, polímero de 2-metacriloiloxietil fosforil colina, poli-1,3,6-trioxano ou poliaminoácido, o polímero anfifílico é, de preferência, um polímero de bloco linear que tem um de cada dentre segmento hidrofílico e segmento hidrofóbico, e, em casos em que o segmento hidrofílico é um polissacarídeo, o polímero anfifílico é, de preferência, um polímero de enxerto que tem diversos segmentos hidrofóbicos enxertados em uma cadeia principal de segmento hidrofílico. Além disso, o segmento hidrofílico do polímero anfifílico é, de preferência, polietileno glicol ou um polissacarídeo refratário e o polissacarídeo é, com mais preferência, dextrano.

[029] O polímero anfifílico que tem um segmento(s) hidrofóbico(s) composto de poli(hidróxiácido) e um segmento(s) hidrofílico(s) tem, de preferência, imiscibilidade à água como um polímero integral, em vista da capacidade de encapsulação de antígeno e persistência mediante a administração a um corpo vivo.

[030] O peso molecular médio do segmento hidrofílico do polímero anfifílico não é restrito e, no caso de um polímero de bloco, em que um segmento(s) hidrofílico(s) e um segmento(s) hidrofílico(s) são ligados de maneira linear um ao outro, o peso molecular médio é, de preferência, de 1.000 a 50.000, com mais preferência de 2.000 a 15.000. O termo "bloco", aqui, significa uma porção em uma molécula de polímero, cuja porção é composta de não menos do que 5 unidades de monômero e é diferente da(s) outra(s) porção(ões) adjacente(s) em termos de estrutura química ou configuração. Um polímero constituído por pelo menos dois blocos ligados linearmente entre si é chamado de polímero de bloco. Cada bloco em si que constitui o polímero de bloco pode ser um polímero gradiente ou alternante aleatório composto de não menos do que 2 tipos de unidades de monômero. Na presente invenção, o polímero de bloco é, de preferência, constituído por um de cada dentre um polímero que forma um segmento hidrofílico e um polihidróxiácido.

[031] No caso de um polímero de enxerto que tem um segmento(s) hidrofóbico(s) enxertados em uma cadeia principal de segmento hidrofílico, o peso molecular médio do segmento hidrofílico [e, de preferência, de 1.000 a 100.000, com mais preferência, de 2.000 a 50.000, com ainda mais preferência, 10.000 a 40.000. o número das cadeias de enxerto é, de preferência, de 2 a 50. O número das cadeias de enxerto pode ser calculado com base na razão entre a cadeia principal de segmento hidrofílico e a cadeia principal de segmento hidrofóbico; o peso molecular médio do segmento hidrofóbico; e o peso molecular médio da cadeia principal de segmento hidrofílico usada; que são obtidos pela medição de 1H-NMR.

[032] A razão de peso molecular médio preferível entre o segmento hidrofóbico e o segmento hidrofílico varia dependendo do polímero anfifílico, e, no caso de um polímero de bloco em que um segmento(s) hidrofóbico(s) e um segmento(s) hidrofílico(s) são linearmente ligados um ao outro, a razão de peso molecular médio entre o segmento(s) hidrofílico(s) e o segmento(s) hidrofóbico(s) é, de preferência não menos do que 1:1, com mais preferência não menos do que 1:2, com ainda mais preferência, não menos do que 1:4, especialmente com mais preferência, não menos do que 1:4 e não mais do que 1:25.

[033] De preferência, no caso de um polímero de enxerto que tem diversos segmentos hidrofóbicos enxertados em uma cadeia principal de segmento hidrofílico, a razão de peso molecular médio entre a porção de cadeia principal de segmento hidrofílico e as cadeias de enxerto de segmento hidrofóbico integrais não é menor do que 1:3 e o peso molecular médio de cada cadeia de enxerto é de 2.500 a 40.000. Com mais preferência, a razão de peso molecular médio geral não é menor do que 1:5 e o peso molecular médio de cada cadeia de enxerto é de 5.000 a 40.000.

[034] Deve-se notar que o peso molecular médio mencionado acima é um número de peso molecular médio, a não que seja especificado de outro modo. O número de peso molecular médio é um peso molecular médio calculado sem pesar pelo tamanho molecular, e os números de peso molecular médio do polímero anfifílico e dos polímeros que constituem o(s) segmento(s) hidrofílico(s) do polímero anfifílico podem ser calculados como pesos moleculares em termos de poliestireno e pululano medidos por cromatografia de permeação de gel (GPC). Além disso, o peso molecular médio de poli(hidróxiácido) pode ser calculado pela medição por ressonância magnética nuclear (NMR), com base na razão entre o valor de integração de pico para resíduos terminais e o valor de integração de pico para os outros.

[035] O polímero anfifílico usado na presente invenção pode ser sintetizado por um método conhecido, e exemplos do método incluem um método em que um polímero de poli(hidróxiácido) é adicionado a um polímero a ser usado como um segmento hidrofílico e a reação de condensação é executada com a mistura resultante para produzir um polímero anfifílico; um método em que os monômeros ativados por hidróxiácido são adicionados a um polímero a ser usado como um segmento hidrofílico e a reação de polimerização é realizada com a mistura resultante para produzir um polímero anfifílico; e um método em que, contrariamente, monômeros para constituir um segmento hidrofílico são adicionados a um segmento hidrofóbico que é um polímero de poli(hidróxiácido) e a reação de polimerização é executada com a mistura resultante para produzir um polímero anfifílico.

[036] Por exemplo, um polímero anfifílico constituído por polietileno glicol e poli(hidróxiácido) pode ser produzido por um método no qual monômeros ativados por hidróxiácido são adicionados a polietileno glicol na presença de um catalisador de estanho, e a reação de polimerização é executada com a mistura resultante para a introdução do poli(hidróxiácido), produzindo, por meio disso, um polímero de bloco anfifílico [Journal of Controlled Release, 71, p. 203 a 211 (2001)].

[037] Além disso, por exemplo, um polímero anfifílico do tipo enxerto constituído por um polissacarídeo e uma cadeia(s) de enxerto de poli(hidróxiácido) pode ser produzido conforme descrito em (1), (2) ou (3) abaixo: (1) método em que, na presença de um catalisador de estanho, monômeros ativados por hidróxiacido são adicionados a um polissacarídeo e a reação de polimerização é executada, introduzindo, por meio disso, poli(hidróxiácido), para produzir um polímero anfifílico do tipo enxerto [Macromolecules, 31, p. 1.032 a 1.039 (1998)]; (2) método em que grupos de hidroxila não protegidos em uma parte de um polissacarídeo em que a maioria de seus grupos hidroxila que são protegidos por substituintes é ativada por uma base, e os monômeros ativados por hidróxiacido são adicionados aos mesmos para introduzir uma cadeia (s) de enxerto composta de poli(hidróxiácido), seguida, finalmente, pela remoção dos grupos de proteção, produzindo, assim, um polímero anfifílico do tipo enxerto [Polimer, 44, p. 3927 a 3933, (2003)]; e (3) método em que a reação de condensação de um copolímero de poli(hidróxiácido) com um polissacarídeo é realizada com o uso de um agente de desidratação e/ou um agente de ativação de grupo funcional, produzindo, através disso, um polímero anfifílico do tipo enxerto [Macromolecules, 33, p. 3680 a 3685 (2000)].

[038] A micropartícula de adjuvante é descrita abaixo. A micropartícula de adjuvante é uma micropartícula que tem uma capacidade de adjuvante e a capacidade de adjuvante significa uma capacidade com a qual a imuno-resposta mediante a administração de um antígeno a um corpo vivo pode ser causada em um nível mais alto do que no caso da administração do antígeno sozinho. Além disso, na presente invenção, a micropartícula de adjuvante é uma micropartícula composta de um polímero anfifílico, e um antígeno é encapsulado na micropartícula de adjuvante para formar um complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno, que é um ingrediente eficaz da composição imunogênica da presente invenção.

[039] A estrutura da micropartícula de adjuvante não é restrita e uma estrutura em que o segmento hidrofílico do polímero anfifílico é incluído na micropartícula de adjuvante e o segmento hidrofóbico do polímero anfifílico é contido como uma camada externa é preferida em vista da manutenção estável do antígeno encapsulado. O método de produção de uma micropartícula de adjuvante que tem tal estrutura não é restrito, e exemplos do método de produção incluem um método que compreende: (a) a etapa de mistura de um solvente aquoso A com um solvente orgânico miscível em água B em que um polímero anfifílico é dissolvido para formar uma emulsão de fase reversa; e (b) a etapa de remoção do solvente da emulsão de fase reversa para obter uma micropartícula de adjuvante. Nesse processo, pela inclusão de um antígeno no solvente aquoso A, um complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno em que o antígeno é encapsulado, pode ser constituído. As etapas (a) e (b) são descritas abaixo.

[040] Como o solvente aquoso A na etapa (a), a água, ou uma solução aquosa contendo um componente solúvel em água é usada. Exemplos de componente solúvel em água incluem sais inorgânicos, açúcares, sais orgânicos e aminoácidos.

[041] O solvente orgânico imiscível em água B na etapa (a) é, de preferência, um solvente no qual o poli(hidróxiácido) do polímero anfifílico é solúvel e o polímero que constitui o segmento hidrofílico é insuficientemente solúvel ou insolúvel, e, de preferência, o solvente pode ser removido por vaporização por secagem a congelamento. A solubilidade do solvente orgânico imiscível em água B em água é, de preferência, não mais do que 30 g (solvente orgânico imiscível em água B)/100 ml (água). Exemplos particulares do solvente orgânico imiscível em água B incluem acetato de etila, acetato de isopropila, acetato de butila, carbonato de dimetila, carbonato de dietila, cloreto de metileno e cloroforme.

[042] A razão entre o solvente orgânico imiscível em água B e o solvente aquoso A é de 1.000:1 para 1:1, de preferência, 100:1 a 1:1. A concentração do polímero anfifílico no solvente orgânico imiscível em água B varia dependendo dos tipos de solvente orgânico imiscível em água B e do polímero anfifílico, e a concentração é 0,01 a 90% (p/p), de preferência 0,1 a 50% (p/p), com mais preferência, 1 a 20% (p/p).

[043] Na etapa (a), no processo de formação de uma emulsão de fase reversa com um solvente aquoso A e um solvente orgânico imiscível em água B em que um polímero anfifílico é dissolvido, a emulsão de fase reversa pode ser formada com o uso, dependendo do fim farmacêutico, de um solvente orgânico imiscível em água B no qual dois ou mais tipos de polímeros anfifílicos são dissolvidos.

[044] Na etapa (a), para auxiliar a formação de uma emulsão de fase reversa e para formar uma emulsão de fase reversa fina e uniforme, um aditivo pode ser adicionado. O aditivo é, de preferência, um composto selecionado a partir de aquil alcoóis C3-C6, alquil aminas C3-C6 e alquila ácidos carboxílicos C3-C6. A estrutura de cada cadeia de alquila nesses aditivos não é restrita, e a cadeia de alquila pode ter ou uma estrutura linear ou uma estrutura ramificada, e pode ser ou uma alquila saturada ou uma alquila não saturada. Na presente invenção, o aditivo é especial e preferivelmente tert-butanol, isopropanol ou pentanol.

[045] Na etapa (b), o método de remoção do solvente da emulsão de fase reversa não é restrito e exemplos dos mesmos incluem aquecimento, secagem sob pressão reduzida, diálise, secagem por congelamento, centrifugação, filtragem e reprecipitação, e combinações dos mesmos. Dentre os métodos de remoção do solvente da emulsão de fase reversa, a secagem por congelamento é preferível já que causa menos mudanças estruturais devido à fusão das partículas na emulsão de fase reversa, ou similares. As condições e o aparelho para a secagem por congelamento são aquelas que permitem a inclusão de um processo de congelamento e uma etapa de secagem sob pressão reduzida, e o processo de secagem por congelamento compreende especial e preferivelmente congelamento anterior, secagem primária sob pressão reduzida a uma baixa temperatura, e secagem secundária sob pressão reduzida, que são realizados convencionalmente em secagem por congelamento. Por exemplo, em casos em que uma dispersão de um complexo de micropartícula de adjuvante- antígeno em um solvente imiscível em água deve ser obtido, a emulsão de fase reversa é resfriada/fcongelada não mais do que os pontos de fusão do solvente aquoso A e do solvente orgânico imiscível em água B, e então seca sob pressão reduzida, para obter micropartícula de adjuvantes secas por congelamento. A temperatura para o congelamento anterior pode ser experimentalmente determinada conforme for apropriado dependendo da composição do solvente, e é, de preferência, não mais do que -20°C. O grau de redução da pressão durante o processo de secagem também pode ser determinado conforme for apropriado dependendo da composição do solvente, e é, de preferência, não mais do que 3.000 Pa, com mais preferência, não mais do que 500 Pa, em vista do encurtamento do tempo de secagem. A secagem por congelamento é, de preferência, realizada com o uso de um secador por congelamento para uso em laboratório que tem uma armadilha criogênica e pode ser conectado a uma bomba a vácuo, ou um secador por congelamento do tipo de prateleira usado para a produção de elementos farmacêuticos ou similares. Após o congelamento anterior com nitrogênio líquido, um meio de resfriamento ou similares, a secagem sob pressão reduzida pode ser realizada com resfriamento ou à temperatura ambiente com o uso de um dispositivo de vácuo como uma bomba de vácuo.

[046] O tipo de antígeno encapsulado na micropartícula de adjuvante não é restrito, e pode ser um peptídeo, proteína, glicoproteína, glicolipídeo, lipídeo, carboidrato, ácido nucleico ou polissacarídeo; ou um vírus, células bacterianas, substância alergênica, tecido ou célula compreendendo os mesmos. Exemplos particulares dos mesmos incluem antígenos derivados de pólen, antígenos derivados do vírus da hepatite A, antígenos derivados do vírus da hepatite B, antígenos derivados do vírus da hepatite C, antígenos derivados do vírus de hepatite D, antígenos derivados do vírus de hepatite E, antígenos derivados do vírus da hepatite F, antígenos derivados do vírus HIV, antígenos derivados do vírus da influenza, antígenos derivados de vírus do herpes (HSV- 1, HSV-2), antígenos derivados de anthrax, antígenos derivados de clamídia, antígenos derivados de pneumococcus, antígenos derivados do vírus de encefalite japonesa, antígenos derivados do vírus do sarampo, antígenos derivados do vírus da rubéola, antígenos derivados de Clostridium tetani, antígenos derivados do vírus de varicela, antígenos derivados do vírus de SARS, antígenos derivados do vírus de EB, antígenos derivados do vírus de papiloma, antígenos derivados do vírus Helicobacter pylori, antígenos derivados do vírus da raiva, antígenos derivados do vírus do Oeste do Nilo, antígenos derivados do hantavirus, antígenos derivados de Streptococcus, antígenos derivados de Staphylococcus, antígenos derivados de Bordetella pertussis, antígenos derivados de Mycobacterium tuberculosis, antígenos derivados de Plasmodium, antígenos derivados de poliovírus, antígenos derivados de várias infecções zoonóticas, antígenos de câncer e antígenos derivados de várias alergias alimentícias.

[047] O antígeno encapsulado não precisa ser um antígeno único. Em vista da aplicação da presente invenção, uma imuno-resposta pode ser induzida contra células cancerosas, bactérias, vírus ou similares que sejam constituídos por mais de um constituinte. Em tais casos, o antígeno pode ser diversos tipos de proteínas ou similares que podem causar imuno-respostas, ou uma mistura de substâncias cujos tipos não podem ser especificados. Além disso, a inclusão de diversos tipos de antígenos para induzir positivamente imuno-respostas contra os diversos tipos de antígenos é um dos modos de usar a composição imunogênica da presente invenção. De preferência, não menos do que 3 tipos, com mais preferência um único tipo de antígeno(s) é/são encapsulados na micropartícula de adjuvante.

[048] O complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno na presente invenção pode mudar a capacidade de retenção do antígeno dependendo do(s) tipo(s) do(s) polímero(s) constituindo a micropartícula de adjuvante e do método de preparação. O mecanismo através do qual a imunogenicidade é fornecida pelo complexo de micropartícula de adjuvante- antígeno na presente invenção pode incluir diversos processos, como um processo em que o antígeno liberado da micropartícula de adjuvante é reconhecido por células imunocompetentes, e um processo em que a micropartícula de adjuvante em si é reconhecida por células imunocompetentes. Um excelente efeito pode ser obtido também pelo efeito sinergístico desses processos.

[049] O tipo de imuno-resposta induzida pelo processo no qual o complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno faz as células imunocompetentes reconhecerem o antígeno varia dependendo do tipo do processo, e um processo preferido pode ser selecionado dependendo do tipo de imuno-resposta a ser induzida e do local de administração. Ou seja, o antígeno não precisa, necessariamente, ser liberado do complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno, e o modo com o qual a imunogenecidade ótima de interesse é realizada é alcançado pela otimização dependendo do antígeno e do tipo de imuno-resposta a ser ativada em um método preferível de uso do mesmo. Entretanto, em casos em que o antígeno é extremamente rapidamente liberado do complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno, uma ação de imuno-ativação contínua de longo prazo, que é uma propriedade excelente da presente invenção, não pode ser obtida, de modo que, preferencialmente, não menos do que 10% do antígeno no complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno ainda seja retido no corpo vivo como o complexo uma semana após a administração, e, com mais preferência, não menos do que 50% do antígeno ainda esteja encapsulado uma semana após a administração. Esses comportamentos de liberação podem ser confirmados, conforme mostrado nos Exemplos, por uma avaliação in vitro imitando o ambiente in vivo.

[050] O complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno obtém um bom efeito como um componente eficaz da composição imunogênica da presente invenção mesmo em um estado de partícula em que o complexo é associado. O termo "associação" na presente invenção significa que duas ou mais partículas são ligadas uma à outra por uma força interpartícula ou através de outra substância, para formar um agregado. A força interpartícula não é restrita, e exemplos da mesma incluem a interação hidrofóbica, ligação de hidrogênio, força de van der Waals e similares. A associação não é restrita ao estado em que as micropartículas estão em contato umas com as outras, e uma substância que tem uma afinidade com as micropartículas pode existir entre as micropartículas, ou as micropartículas podem ser dispersas em uma matriz. Como a substância que tem uma afinidade com as micropartículas, ou com a matriz, é preferível um polímero, e um polímero anfifílico cuja porção hidrofóbica seja poli(hidróxiácido) e que tenha o mesmo constituinte que aquele da micropartícula de adjuvante é mais preferido. Exemplos particulares dos mesmos incluem polímeros anfifílicos, cada um composto por uma cadeia principal de polissacarídeo e cadeia(s) de enxerto de poli(hidróxiácido), polímeros em bloco, cada um composto por polietileno glicol e poli(hidróxiácido), e poli(hidróxiácido).

[051] A associação do complexo de micropartícula de adjuvante- antígeno pode ser ou em um estado em que os complexes são re-isolados mediante seu uso, ou pode ser em um estado em que eles não são re-isoaldos mediante seu uso. Deve-se notar que, mesmo em casos em que o formato da partícula formada por associação do complexo de micropartícula de adjuvante- antígeno está em um estado a partir do qual a associação do complexo não pode ser conhecida, a partícula é considerada como sido formada por associação do complexo contanto que o processo de produção da partícula compreenda a etapa de associar o complexo.

[052] A etapa de associar os complexos não é restrita e exemplos particulares da mesma incluem uma etapa de introduzir o complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno ou uma dispersão de complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno a uma fase líquida C que contém um modificador de superfície para remover o meio de dispersão, causando, assim, associação. Essa etapa é descrita abaixo.

[053] Em casos em que o complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno é disperso em um meio de dispersão para preparar a dispersão do complexo, o meio de dispersão não é restrito, e em casos em que a micropartícula de adjuvante tem uma porção hidrofílica no interior da mesma, a sendo que a porção hidrofílica é composta de um segmento hidrofílico de um polímero anfifílico, e tem uma camada externa que compreende uma porção hidrofóbica composta de um segmento hidrofóbico de um polímero anfifílico, o meio de dispersão é, de preferência, um solvente em que o poli(hidróxiácido) do polímero anfifílico é solúvel e o polímero que constitui o segmento hidrofílico é substancialmente insolúvel, com a finalidade de proteger a estrutura da micropartícula de adjuvante. Nesse caso, o solvente pode ser ou um solvente orgânico imiscível em água ou um solvente orgânico miscível em água. Exemplos particulares do solvente no qual o poli(hidróxiácido) do polímero anfifílico é solúvel e o polímero que constitui o segmento hidrofílico é substancialmente insolúvel incluem acetato de etila, acetato de isopropila, acetato de butila, carbonato de dimetila, carbonato de dietila, cloreto de metileno, dioxano de cloroforme, dioxano, tolueno e xileno.

[054] De preferência, a fase líquida C é uma em que um modificador de superfície é solúvel, e tem um ponto de ebulição mais alto do que o meio de dispersão. A fase líquida C pode ser qualquer uma de um solvente aquoso, solvente orgânico imiscível em água e solvente orgânico miscível em água. Como o solvente aquoso, água ou uma solução aquosa contendo um componente solúvel em água é preferível, e exemplos do componente solúvel em água incluem sais inorgânicos, açúcares, sais orgânicos e aminoácidos. Exemplos do solvente orgânico imiscível em água incluem óleo de silicone, óleo de gergelim, óleo de soja, óleo de milho, olho de algodão em rama, óleo de coco, óleo de semente de linho, óleo mineral, óleo de rícino, óleo de rícino hidrogenado, parafina líquida, n-hexano, n-heptano, glicerol e ácido oleico. Exemplos do solvente orgânico miscível em água incluem glicerina, acetona, etanol, ácido acético, dipropileno glicol, trietanolamina e trietileno glicol. Entre esses, na presente invenção, a fase líquida C em, de preferência, um solvente aquoso ou um solvente orgânico miscível em água. Em casos em que a fase líquida C é um solvente aquoso e o meio de dispersão é um solvente orgânico imiscível em água, a suspensão obtida de um complexo de micropartícula de adjuvante-antígeno está na forma da dita emulsão sólido-em-óleo-em-água (S/O/W), e, em casos em que a fase líquida C é um solvente orgânico imiscível em água ou um solvente orgânico miscível em água e imiscível no meio de dispersão, a suspensão está na forma de uma emulsão de sólido-em-óleo-em-óleo (S/O1/O2).

[055] O modificador de superfície é preferencialmente um composto que estabiliza uma interface de água-óleo da emulsão S/O/W ou da interface de óleo-óleo da emulsão S/01/02, tal composto tem uma propriedade para melhorar a estabilidade coloidal da partícula formada por associação do complexo de micropartícula adjvante-antígeno. A melhora da estabilidade coloidal no presente documento significa a prevenção ou atraso de agregação, no solvente, das partículas formadas por associação do complexo de micropartícula adjvante-antígeno. O modificador de superfície pode ser um agente único ou uma mistura de agentes plurais.

[056] O modificador de superfície usado na presente invenção é preferencialmente um polímero hidrofílico ou um composto anfifílico.

[057] O polímero hidrofílico como o modificador de superfície é preferencialmente polietileno glicol, polivinila pirrolidona, álcool polivinílico, polietilenoimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli-1,3-dioxolano, polímero 2-metacriloil oxietil fosforila colina, poli-1,3,6-trioxano, poliaminoácido, peptídeo, proteína ou polissacarídeo de açúcar, ou um análogo de qualquer um destes. Exemplos de análogos do polímero hidrofílico incluem, mas não são limitados a, tensoativos preparados a partir de polímeros hidrofílicos por, por exemplo, modificação parcial de grupos hidrofóbicos como uma alquila de cadeia longa.

[058] O análogo de polietileno glicol como o modificador de superfície é preferencialmente "Pluronic" (marca registrada junto a BASF) disponível comercialmente junto a BASF, ou seu equivalente.

[059] O poliaminoácido como o modificador de superfície é preferencialmente ácido poliaspártico ou ácido poliglutâmico, ou seu análogo. Os análogos preparados através da introdução de alquila de cadeia longa a uma parte de ácido poliaspártico ou ácido poliglutâmico são mais preferenciais.

[060] Exemplos do peptídeo como o modificador de superfície incluem peptídeos básicos, e a proteína como o modificador de superfície é preferencialmente gelatina, caseína ou albumina em vista do aumento da dispersibilidade. Exemplos preferenciais da proteína também incluem anticorpos.

[061] O açúcar como o modificador de superfície é preferencialmente um monossacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo. O polissacarídeo é preferencialmente celulose, quitina, quitosana, goma gelana, ácido algínico, ácido hialurônico, pululano ou dextrano, e pululano portador de colesterol é especialmente preferencial, em vista do aumento da dispersibilidade da partícula. Um análogo de qualquer celulose, quitina, quitosana, goma gelana, ácido algínico, ácido hialurônico, pululano e dextrano é preferencial.

[062] O peptídeo, proteína ou açúcar como o modificador de superfície é especialmente preferencial um análogo preparado por, por exemplo, modificação parcial de grupos hidrofóbicos como alquila de cadeia longa, ou um análogo preparado por modificar o polímero hidrofílico ou composto anfifílico supracitados.

[063] Exemplos do composto anfifílico como o modificador de superfície incluem lipídeos e tensoativos. Exemplos preferenciais dos tensoativos incluem tensoativos não-iônicos como copolímeros polioxietileno polipropileno glicol, ésteres de ácido graxo sacarose, ésteres de ácido graxo polietileno glicol, polioxietileno sorbitano éster de ácido monograxo, polioxietileno sorbitano éster de ácido digraxo, polioxietileno glicerol éster de ácido monograxo, polioxietileno glicerol éster de ácido digraxo, poliglicerol éster de ácido graxo, polioxietileno óleo de rícino e polioxietileno óleo de rícino hidrogenado; sulfatos de alquila como lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de amônio e sulfato estearila de sódio; e lectina.

[064] A razão de volume entre o meio disperso, em que o complexo de micropartícula adjvante-antígeno é dispersado e a fase líquida C é de 1.000:1 a 1:1.000, preferencialmente de 100:1 a 1:100. O número de associação do complexo de micropartícula adjvante-antígeno obtido varia, dependendo desta razão de volume, e, conforme a razão da fase líquida C aumenta a dispersão, na água, de partículas produzidas por associação de um número maior do complexo de micropartícula adjvante-antígeno é obtida, enquanto, a razão da fase líquida C diminui, o número de associação diminui. Em casos onde a razão da fase líquida C é menor do que uma razão de solução de 1:4, a maioria das partículas na dispersão em água são cada uma constituídas por um único complexo de micropartícula adjvante-antígeno. Desse modo, através de controlar a razão de volume da fase líquida C na série de processos para produção da partícula formada por associação do complexo de micropartícula adjvante-antígeno, o complexo de micropartícula adjvante- antígeno e a partícula formados por associação do complexo podem ser preparados seletivamente.

[065] Quando o meio disperso que contém o complexo de micropartícula adjvante-antígeno é misturado com a fase líquida C, um dispositivo de agitação como um agitador magnético, agitador de turbina, homogeneizador, aparelho de emulsificação de membrana equipado com uma membrana porosa, ou similares podem ser usados como for necessário.

[066] A fase líquida C pode conter, adicionalmente ao modificador de superfície, diversos aditivos como um tampão, antioxidante, sal, polímero e/ou açúcar dependendo do propósito farmacêutico. Além disso, o meio disperso em que o complexo de micropartícula adjvante-antígeno deve ser disperso, pode conter diversos aditivos solúveis no meio disperso, como um composto ácido, composto básico, polímero anfifílico e/ou polímero biodegradável, para o propósito de controlar a taxa de liberação do antígeno encapsulado por degradação ou desintegração do complexo.

[067] Além disso, uma operação de emulsificação da emulsão formada sólido-em-óleo-em-água (S/O/W) ou emulsão sólido-em-óleo-em-óleo (S/01/02) pode ser executada para o propósito de produzir uma partícula mais fina formada por associação dos complexos de micropartícula adjvante- antígeno. O método de emulsificação não é restrito, enquanto uma emulsão estável pode ser preparada deste modo, e exemplos do mesmo incluem métodos através de agitação e métodos que usam um homogeneizador de alta pressão, homomisturador de alta velocidade ou semelhantes.

[068] Em casos em que o complexo de micropartícula adjvante- antígeno é disperso no meio disperso, e a dispersão obtida é adicionada a fase líquida C que contém o modificador de superfície, uma suspensão da partícula formada por associação da micropartícula de adjuvante desejada pode ser obtida através da remoção do meio disperso. O método de remoção do meio disperso não é restrito, e exemplos do mesmo incluem evaporação de solvente, diálise, secagem por congelamento, centrifugação, filtragem e reprecipitação, entre os quais a evaporação de solvente e secagem por congelamento são especialmente preferenciais. Em casos onde um solvente aquoso foi usado como a fase líquida C, uma dispersão de partícula aquosa formada por associação de complexo de micropartícula adjvante-antígeno pode ser obtida através desta etapa.

[069] Em uma realização preferencial, o modificador de superfície é ligado ao complexo de micropartícula adjvante-antígeno ou a partícula formada por associação do complexo de micropartícula adjvante- antígeno. A aglutinação no presente documento pode ser tanto uma ligação não-covalente ou quanto uma ligação covalente. A ligação não-covalente é preferencialmente uma interação hidrofóbica, e pode também ser uma interação eletrostática, ligação de hidrogênio ou força van der Waals, ou uma combinação destas ligações. Na ligação não-covalente, poli(hidróxi ácido) da micropartícula que contém um polímero anfifílico é preferencialmente ligado à porção hidrofóbica do modificador de superfície por uma interação hidrofóbica, e, neste caso, o meio disperso para o complexo de micropartícula adjvante- antígeno na dispersão de micropartícula é preferencialmente água, tampão, solução salina fisiológica, modificador de solução de superfície aquoso ou solvente hidrofílico.

[070] O tamanho médio de partícula do complexo de micropartícula adjvante-antígeno ou das partículas formadas por associação do complexo é preferencialmente de 0,1 a 50 μm, mais preferencialmente de 0,1 a 10 μm. Em particular, o tamanho médio de partícula do complexo de micropartícula adjvante-antígeno é preferencialmente de 0,1 a 1 μm, mais preferencialmente de 0,1 a 0,5 μm, e o tamanho médio de partícula do complexo de micropartícula adjvante-antígeno é preferencialmente de 0,1 a 50 μm, mais preferencialmente de 0,1 a 10 μm, ainda mais preferencialmente de 1 a 10 μm. O tamanho médio de partícula do complexo de micropartícula adjvante-antígeno ou de partícula formada por associação do complexo pode ser diretamente medido usando análise de imagem por um microscópio eletrônico de varredura (SEM: e.g., S-4800 fabricado por Hitachi, Ltd.).

[071] A composição imunogênica da presente invenção é uma composição que pode induzir uma resposta imune em um organismo vivo, e contém o complexo de micropartícula adjvante-antígeno como uma substância imunogênica. O tipo da resposta imune que é induzida pela composição imunogênica não é restrita. Os exemplos do tipo de resposta imune a ser induzida inclui a resposta imune Th1 e a resposta imune Th2, e é conhecido no estado da técnica que uma destas respostas imunes é predominantemente induzida dependendo do antígeno, o sítio de administração, e o tipo de método de administração. A presente invenção pode induzir ambas as respostas imunes Th1 e Th2. A Resposta imune Th1 pode ser induzida efetivamente pelo complexo de micropartícula adjvante-antígeno da presente invenção que tem um tamanho de partícula pequeno, ou da partícula formada por associação dos complexos, como mostrado nos exemplos. Os graus da resposta imune Th1 e da resposta imune Th2 podem ser avaliados por diversos métodos conhecidos. Por exemplo, no caso do camundongo, a quantidade de produção do Anticorpo IgG2a é conhecida como sendo um índice para a resposta imune Th1. Além disso, como índices para a resposta imune Th2, o anticorpo IgH1 e a quantidade total de anticorpo IgG são conhecidos.

[072] A composição imunogênica da presente invenção contém como um ingrediente eficiente o complexo de micropartícula adjvante-antígeno ou a partícula formada por associação do complexo, e então, tem uma capacidade adjuvante, mas, através de uma inclusão adicional de uma substância de imunoativação, uma maior capacidade de imunoativação pode ser realizada. A substância de imunoativação pode ser contida do lado de fora da micropartícula de adjuvante ou encapsulada na mesma, e a substância é preferencialmente encapsulada na micropartícula de adjuvante. A substância de imunoativação não é restrita na medida em que pode funcionar como uma substância de imunoativação, e exemplos da mesma incluem óleos, sais de alumínio, sais de cálcio, polímeros formadores de gel, citoquinas de imunoativação e receptores ligantes de TLR, entre os quais as citoquinas de imunoativação e os receptores ligantes de TLR são preferenciais.

[073] Exemplos de citoquinas de imunoativação incluem interleucina 12, interferon a, interleucina 18, TNFa, interleucina 6, NO, interferon r e interferon β.

[074] Exemplos de receptores ligantes de TLR incluem lipoproteínas; RNAs de filamento duplo como poli I:C e poli I:CLC; flagelina; RNAs de filamento único; CpG; profilina; MPL; QS21; e TDM, entre os quais ácidos nucleicos como RNAs de filamento duplo, RNAs de filamento único e CpG são preferenciais, e CpG é mais preferencial. O CpG no presente documento significa não metilado CpG motivos (citosina-guanina) DNAs existentes em vírus, bactéria e semelhantes (ver Pedido de Patente Traduzido e Aberto à Inspeção Pública sob No JP 2001-503254). Diversas sequências eficazes são relatadas como motivos CpG, e o tipo da sequência não é restrita, desde que tenha uma capacidade de imunoativação, e a sequência pode ser preparada usando um análogo base ou pode ser selecionado a partir de diversos tipos de produtos modificados.

[075] Em casos onde a composição imunogênica da presente invenção é usada como uma composição farmacêutica ou uma vacina, diversos aditivos farmacêuticos úteis podem ser contidos, adicionalmente ao polímero anfifílico, substância ativa hidrofílica, modificador de superfície e meio disperso. Exemplos dos aditivos que podem ser adicionados incluem tampões, antioxidantes, sais, polímero e açúcares.

[076] O método de indução de uma resposta imune usando a composição imunogênica da presente invenção não é restrito, e a composição imunogênica pode ser administrada a um organismo vivo ou levado a ter contato com células imunocompetentes removidas para fora de um organismo vivo. O método de administração da composição imunogênica a um organismo vivo não é restrito, e exemplos do mesmo incluem administração subcutânea, administração intra-dérmica, administração intra-muscular, administração transnasal, administração pulmonar, administração oral, administração sublingual, administração intravaginal, administração intraperitonial e administração de nó de linfa, entre as quais a administração intra-dérmica e administração subcutânea são preferenciais.

[077] Com relação à quantidade da composição imunogênica da presente invenção a ser usada através de indução da resposta imune, a quantidade necessária de antígeno necessário para a indução da reação imune de interesse é determinada apropriadamente, dependendo do tipo de antígeno, método de administração, e número de doses. Por exemplo, em casos onde a composição imunogênica da presente invenção é administrada de maneira subcutânea a um humano para induzir a resposta imune, de 0,01 a 1.000 μg por dose do antígeno é administrado, tal antígeno é contido na composição imunogênica. O número de doses também pode ser determinado de maneira apropriada de modo similar à dose, e a resposta imune pode ser induzida por 1 a 10 vezes de administração, já que a composição imunogênica da presente invenção tem uma ação para induzir uma resposta imune continuamente.

[078] O organismo vivo ao qual a composição imunogênica é administrada pode ser um animal humano ou não-humano, e o organismo vivo é preferencialmente humano; ou porco, vaca, pássaro, ovelha, cavalo, jumento, cabra ou camelo, cachorro, gato, furão, coelho, macaco, rato, camundongo ou cobaia, que é mantida como gado, animal de estimação ou animal experimental. EXEMPLOS

[079] Os exemplos são descritos abaixo, mas a presente invenção não é restrita a estes exemplos. EXEMPLO 1 SÍNTESE DE DEXTRANO-POLI(ÁCIDO LÁCTIC-CO-GLICÓLICO) (PLGA) (1-1) SÍNTESE DE TMS-DEXTRANO.

[080] Dextrano (Nacalai Tesque; classe especial de acordo com padrões Nacalai; número de peso molecular médio, 13.000; 5,0 g) foi adicionado a formamida (100 ml), e a mistura resultante foi aquecida a 80°C. A esta solução, foi adicionado 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (100 ml) em forma de gotas por 20 minutos. Consequentemente, a mistura resultante foi agitada a 80°C por 2 horas. Após o término da reação, a solução de reação foi deixada esfriando até a temperatura ambiente, e duas camadas foram separadas uma da outra com um funil separador. A camada superior foi concentrada sob pressão reduzida, e metanol (300 ml) foi adicionado a esta, seguindo por filtragem e secagem dos sólidos obtidos, para obter TMS-dextrano (Composto (1)) (11,4 g) como sólidos brancos.

[081] Através do mesmo método, os Compostos (2) e (3) foram preparados usando dextrano (produzido por Sigma; peso molecular médio, não mais do que 1.500); Compostos (4) e (5) foram preparados usando dextrano (fabricado por SERVA; peso molecular médio, não mais do que 5.000); Composto (6) foi preparado usando dextrano (o mesmo reagente do que o usado para a preparação do Composto (1)); e Compostos (7), (8) e (9) foram preparados utilizando dextrano (fabricado por Nacalai Tesque; peso molecular médio, 40.000). (1-2) Síntese de Dextrano-PLGA (Compostos (12)-(23))

[082] O Composto (1) (0.5 g) e ter-butóxido de potássio (35 mg) foram secados sob calor, sob pressão reduzida por 2 horas, e tetrahidrofurano (10 ml) foi adicionado aos mesmos, seguido pela agitação da mistura resultante por 1,5 horas em temperatura ambiente. A esta solução, uma solução de (DL)- lactídeo (0,56 g) e glicolídeo (0,45 g) em tetrahidrofurano (15 ml) foi adicionado por gotas, e a mistura resultante foi agitada por 5 minutos, seguida de adicionar 2 gotas de ácido acético para parar a reação. Após o término da reação, o solvente foi concentrado sob pressão reduzida, e purificação de reprecipitação com o sistema clorofórmio-metanol e o sistema clorofórmio-dietila foi executado, para obter sólidos brancos, que foram então dissolvidos em clorofórmio (9 ml). A solução resultante, trifluoroácido acético (1.0 ml) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada a uma temperatura ambiente por 30 minutos. Após o término da reação, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, e o resíduo foi dissolvido em clorofórmio (10 ml), seguido pela adição da solução resultante a dietil éter que foi resfriada de maneira preliminar a 0°C e o produto obtido foi filtrado, para obter dextrano-PLGA como sólidos brancos (Composto (12)). Através do mesmo método, Composto (13) foi sintetizado com (DL)-lactídeo (0.78g) e glicolídeo (0.63g); o Composto (14) foi sintetizado com (DL)-lactídeo (1.12g) e glicolídeo (0.9g); o Composto (15) foi sintetizado com (DL)-lactídeo (1.67g) e glicolídeo (1.35g).

[083] Além disso, o Composto (16) foi sintetizado usando o Composto (2) com (DL)-lactídeo (0.56g) e glicolídeo (0.45g); o Composto (17) foi sintetizado usando Composto (3) com (DL)-lactídeo (0.67g) e glicolídeo (0.54g); Composto (18) foi sintetizado usando Composto (4) com (DL)-lactídeo (0.78g) e glicolídeo (0.63g); Composto (19) foi sintetizado usando Composto (5) com (DL)-lactídeo (0.89g) e glicolídeo (0.72g); Composto (20) foi sintetizado usando Composto (6) com (DL)-lactídeo (0.78g) e glicolídeo (0.63g); Composto (21) foi sintetizado usando Composto (7) com (DL)-lactídeo (0.78g) e glicolídeo (0.63g); Composto (22) foi sintetizado usando Composto (8) com (DL)-lactídeo (1.12g) e glicolídeo (0.9g); e Composto (23) foi sintetizado usando Composto (9) com (DL)-lactídeo (1.12g) e glicolídeo (0.9g).

[084] O peso médio de peso molecular e o número médio de peso molecular de cada um dos polímeros e Compostos (12) a (15) foram determinados por medição GPC (coluna: fabricado por Tosoh Corporation, TSK-gel a-5000x2, DMF solvente; detector: RI; standard: pululano). O número médio de peso molecular e o número de cadeias de enxertos de Compostos (12) a (23) foram determinados pela medição 1H-NMR (Tabela 1). TABELA 1

EXEMPLO 2 SÍNTESE DE PEG-PLGA (COMPOSTOS (10), (11))

[085] Polietileno glicol monometil éter (NIPPON OIL & FATS CO., LTD.; SUNBRIGHT MEH-20H; número de peso molecular médio, 5,128; Mw/Mn=1.02), (DL)-lactídeo e glicolídeo foram misturados com quantidades de alimentação mostradas na Tabela 2, e a mistura resultante foi aquecida a 140°C. Após a agitação da mistura por 20 minutos, octilato de estanho (II) (0.05 % em peso com relação a polietileno glicol monometil éter) foi adicionado a mistura, e a mistura resultante foi agitada a 180°C por 3 horas. O liquido de reação foi deixado resfriar a temperatura ambiente, e dissolvido em clorofórmio (de modo que a concentração se torne cerca de 100 mg/ml), seguido pela purificação de reprecipitação com dietil éter que foi resfriado de maneira preliminar a 0°C. Os sólidos obtidos foram filtrados, e secados sob pressão reduzida, para obter um polímero PEG-PLGA como sólidos brancos ou marrons claros.

[086] O número de peso molecular médio do polímero foi determinado por 1H-NMR (Tabela 2). TABELA 2

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE MICROPARTÍCULA ADJVANTE-ANTÍGENO USANDO POLÍMEROS DEX-G-PLGA (DEX-G-PLGA PARTÍCULAS (1)-(28))

[087] Em 100 μl de carbonato dimetil, 5 mg de dextrano- poli(ácido látic-co-glicólico) (PLGA) (Compostos (12)-(23)) no Exemplo 1 foram dissolvidos, para preparar uma solução de polímero 50 mg/ml. A esta solução de polímero, 20 μl de ter-butanol foi adicionado, e 50 μl do antígeno encapsulado ((OVA (ovalbumina) (Sigma) ou CEA (antígeno carcinoembrionário) (COSMO BIO Co., Ltd.)) e/ou substância de imunoativação (CpG) mostrada na Tabela 3 foi/foram adicionada as concentrações descritas, e a mistura resultante foi agitada com um misturador vórtice, para produzir uma emulsão de fase reversa. Conforme Cpg, 5'-gggggggCGACGATCGTCAgG-3' (letras minúsculas representam bases de fosforotioato-modificado) (síntese de contrato por Sigma-Genosys) foi usado.

[088] A emulsão de fase reversa foi sujeita a congelamento anterior com nitrogênio líquido, e secado por congelamento usando um secador congelador (EYELA, SECADOR CONGELADOR FD-1000) a uma temperatura de resfriamento de captura de -45°C a um grau de vácuo de 20 Pa por 24 horas. Os sólidos obtidos foram dispersos no meio de dispersão na quantidade mostrada na Tabela 3, para preparar uma suspensão S/O. A suspensão S/O foi adicionada por gotas a 2 ml de uma solução aquosa 10% Pluronic que contém F-68, e a mistura resultante foi agitada/emulsificada pelo método de agitação descrito na Tabela 3, para preparar uma Emulsão S/O/W. A partir da Emulsão S/O/W, o solvente orgânico imiscível em água foi removido por evaporação de solvente, para fornecer um complexo de dispersão de micropartícula adjvante- antígeno. A dispersão foi sujeita a congelamento anterior com nitrogênio líquido, e secado por congelamento usando um secador congelador (EYELA, SECADOR CONGELADOR FD-1000) a uma temperatura de resfriamento de captura de -45°C a um grau de vácuo de 20 Pa por 24 horas, para obter pó seco de um complexo de micropartícula adjvante-antígeno (tamanho médio de partícula de 0,4 μm) e uma partícula (tamanho médio de partícula, de 5 a 40 μm) formado por associação do complexo de micropartícula adjvante-antígeno. O resultado do cálculo do tamanho médio de partícula da partícula obtida por observação com um microscópio eletrônico de varredura (SEM: S-4800 fabricado por Hitachi, Ltd.) é mostrado na Tabela 3. TABELA 3

[089] Exemplo 4 Preparação de Complexos de micropartícula adjvante-antígeno Usando Polímeros PEG-PLGA (PEG-PLGA partículas de (1) a (4)) em 100 μl de carbonato dimetila, 5 mg de PEG-PLGA polímero preparado no Exemplo 2 (Composto (10) ou (11)) foi dissolvido, para preparar uma solução de polímero 50 mg/ml. A esta solução de polímero, 20 μl de terbutanol foram adicionados, e 50 μl da solução que contém antígeno mostrada na Tabela 4 foi adicionada à mistura resultante, seguida pela agitação da mistura, para produzir uma solução de emulsão de fase reversa. A solução de emulsão de fase reversa foi submetida a congelamento anterior nitrogênio líquido, e secado por congelamento usando um secador congelador (EYELA, SECADOR CONGELADOR FD-1000) a uma temperatura de resfriamento de captura de -45°C a um grau de vácuo de 20 Pa por 24 horas. Os sólidos obtidos foram dispersos em acetato etila na quantidade mostrada na Tabela 4, para preparar uma suspensão S/O. A suspensão S/O foi adicionada por gotas a 2 ml uma solução aquosa 10% Pluronic que contém F-68, e a mistura resultante foi agitada/emulsificada com um misturador vórtice, para preparar uma Emulsão S/O/W. A partir da Emulsão S/O/W, o solvente orgânico imiscível em água foi removido por evaporação de solvente, para fornecer um complexo de micropartícula adjvante-antígeno dispersão. A dispersão foi submetida a congelamento anterior com nitrogênio líquido, e secado por congelamento usando um secador congelador (EYELA, SECADOR CONGELADOR FD-1000) a uma temperatura de resfriamento de captura de -45°C a um grau de vácuo de 20 Pa por 24 horas, para obter pó seco de um complexo de micropartícula adjvante-antígeno. O resultado do cálculo do tamanho médio de partícula do complexo de micropartícula adjvante-antígeno por observação com um microscópio eletrônico de varredura (SEM: S-4800 fabricado por Hitachi, Ltd.) é mostrado na Tabela 4. TABELA 4

EXEMPLO COMPARATIVO 1 PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS DE HOMOPOLÍMERO PLGA QUE CONTÉM ANTÍGENO (PLGA PARTÍCULAS (1) E (2))

[090] Partículas PLGA que contém um antígeno foram preparadas usando uma tecnologia conhecida (International Journal of Pharmaceutics, 2007, vol. 334, página 137-148). Em 15 ml de cloreto de metileno, 200 mg de PLGA (fabricado por SIGMA; peso molecular médio, 40,000-75,000) foram dissolvidos, para preparar solução 13,3 mg/ml PLGA. Para 2 ml de solução de polímero, 100 μl de 5 mg/ml solução aquosa OVA foi adicionado com agitação a 19.000 rpm (com um homogeneizador fabricado por Polytron), e a agitação foi executada adicionalmente da mesma maneira por 5 minutos, para produzir uma solução W/O. A solução W/O foi adicionada a 20 ml de 1% solução de álcool polivinílico aquosa sob agitação a 19.000 rpm, e a agitação foi executada adicionalmente da mesma maneira por 5 minutos, para produzir uma solução W/O/W. A solução W/O/W foi agitada a 200 rpm por 12 horas e então submetida a congelamento anterior com nitrogênio líquido, seguido por secagem por congelamento usando um secador congelador (EYELA, FREEZER DRYER FD-1000) a uma temperatura de resfriamento de captura de -45°C a um grau de vácuo de 20 Pa por 12 horas, para obter uma partícula PLGA que contém um antígeno. A partícula obtida foi observada com um microscópio eletrônico de varredura (SEM: S-4800 vendido pela Hitachi, Ltd.) para calcular o tamanho médio de partícula, e o tamanho médio de partícula foi revelado como 2 μm. Além disso, a partícula PLGA (2) foi preparada usando uma solução aquosa CEA (0,25 mg/ml) e o tamanho médio de partícula foi calculado da mesma maneira com SEM. O tamanho médio de partícula foi revelado como 2 μm. EXEMPLO 5 MEDIDA DE RAZÕES DE ENCAPSULAÇÃO DE ANTÍGENO E CAPACIDADES DE RETENÇÃO DE ANTÍGENO DE COMPLEXOS DE CEA-MICROPARTÍCULA DE ADJUVANTE E PARTÍCULAS ASSOCIADAS DOS MESMOS MÉTODO

[091] Em um tubo Eppendorf 1,5 ml, 20 mg de cada um dos complexos de micropartícula de adjuvante e suas partículas (mais adiante neste documento chamadas de partículas encapsuladas CEA) preparadas pelos métodos dos Exemplos 3 e 4 foram dispostas, e dissolvidas em 1 ml de tampão A (PBS suplementado com 0,1% albumina de soro bovino, 0.1% Pluronic F-68 e 0.02 % azida de sódio), seguido pela separação em partículas (precipitado) e o sobrenadante por centrifugação a 18.000xg por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado em outro tubo, e as partículas foram suspensas de novo em 1 ml de um tampão, seguido pela execução da separação novamente em partículas e o sobrenadante por centrifugação sob as condições acima. Esta operação de lavagem foi repetida mais uma vez (um total de três vezes a centrifugação), e a concentração CEA do sobrenadante coletado por cada vez que a centrifugação foi medida usando um kit ELISA (fabricado por Hope Laboratories, TM-201).

[092] A partir da quantidade de CEA alimentada através da preparação da partícula (por um peso de partícula encapsulada CEA de 20 mg), o total de quantidades de CEA sobrenadantes obtidas pelas três vezes de centrifugação foram subtraídos, e a taxa de encapsulação foi calculada de acordo com a equação seguinte. [Equação 1] Taxa de Encapsulação (%) = [(Quantidade alimentada de cEA (ng) - Total CEA quantidade em sobrenadante (ng))/Quantidade alimentada de cEA (ng)] x 100

[093] Em termos de medição da capacidade de liberação do antígeno, a partícula após as três vezes de lavagem foi suspendida /dispersada em 1,2 ml de tampão A. Uma parte deste líquido (40 μl) foi transferida a outro tubo, e a centrifugação foi executada a 18.000x g por 10 minutos para precipitar a partícula, seguido por coletar 30 μl do sobrenadante em outro tubo (amostra 0-hora). A partícula de suspensão restante foi levemente misturada por uma inversão em um tubo Eppendorf 1,5 ml disposto em uma 37°C incubadora usando um rotador a uma taxa de 6 rpm. A partir deste líquido, alíquotas de uma pequena quantidade (40 μl) foram coletadas com tempo, e o sobrenadante foi separado por centrifugação da mesma maneira descrita acima. A concentração CEA na amostra coletada de sobrenadante em cada ponto de tempo foi medida pelo método ELISA descrito acima, e a taxa de liberação (%) foi calculada de acordo com a equação seguinte. [Equação 2] Taxa de liberação (%) = [CEA concentração em sobrenadante (ng/ml) x 1,2 (ml) x 100]/Quantidade de CEA encapsulado em 20 mg de CEA partícula (ng) RESULTADOS

[094] As taxas de encapsulação de antígeno de partículas de encapsulação de CEA foram como mostrado na Tabela 5, e foi revelado que o antígeno foi encapsulado em qualquer partícula encapsulada CEA a uma taxa alta. A capacidade de retenção para o antígeno foi baixa na partícula Dex-g- PLGA partícula (7) que tem cadeias hidrofóbicas curtas de enxertos, em que 67,3% do antígeno encapsulado foi liberado em uma semana. Por outro lado, conforme o comprimento da cadeia de enxerto hidrofóbica aumentou, a capacidade de retenção do antígeno aumentou. Em partículas Dex-g-PLGA que têm cadeias de enxerto hidrofóbicas longas, cerca de 90% do antígeno alimentado ainda estava encapsulado mesmo após uma semana. Ainda na partícula PEG-PLGA, apenas cerca de 4% do antígeno foi liberado em uma semana, mostrando uma alta capacidade de retenção de antígeno. TABELA 5

TABELA 5: TAXAS DE ENCAPSULAÇÃO E CAPACIDADES DE RETENÇÃO DE EXEMPLO 6 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA QUE CONTÉM OVA EM CAMUNDONGOS (1) MÉTODO

[095] Entre as partículas associadas a um complexo de micropartículas de adjuvante de OVA (doravante referido como partícula associada de encapsulação de OVA) e complexos de micropartículas de adjuvante de OVA (doravante referido como partículas de encapsulação de OVA) preparados nos Exemplos 3 e 4, 40 mg (50 μg em termos da quantidade alimentada por antígeno), sendo que cada uma dentre as partículas associadas de encapsulação de OVA que tem cadeias hidrofóbicas com diferentes comprimentos (partículas Dex-g-PLGA (2), (3) e (4)); uma partícula associada de encapsulação de OVA e uma partícula de encapsulação de OVA que tem diferentes tamanhos de partículas a partir da partícula Dex-g-PLGA (3) (partículas Dex-g-PLGA (5) e (6)); e uma partícula PEG-PLGA (3); foi suspensa/dispersa em 3 ml de tampão fosfato-salino (PBS), seguido por centrifugação a 80xg por 5 minutos a fim de precipitar a partícula e transferir o sobrenadante para outro tubo. O sobrenadante foi centrifugado novamente a 80xg por 5 minutos a fim de precipitar a partícula remanescente, e o sobrenadante resultante foi removido. O precipitado obtido na primeira centrifugação e na segunda centrifugação foram combinados e re-dispersados em 1 ml de PBS, seguido por 3 repetições da mesma operação de centrifugação, com isso removendo o antígeno que não foi encapsulado na partícula. O precipitado foi finalmente re-dispersado em 150 μl de PBS, a fim de fornecer um líquido para administração. Este líquido foi subcutaneamente administrado através de injeção única nas costas de camundongos Balb/C machos (Japão SLC, Inc.) com 9 semanas de vida. A administração, através de injeção única, da partícula PLGA produzida no exemplo comparativo 1 ou a solução antígeno (50 μl) sozinha, como no exemplo comparativo; ou uma solução preparada pela mistura de 50 μl da solução antígeno com 50 μl do adjuvante "Imject Alum" (manufaturado por Thermo Scientific, referido neste documento também como Alum), como um exemplo de referência; foi realizada. Sob cada condição, a administração foi realizada para 4 indivíduos de camundongos, e os valores médios dos títulos de anticorpos são mostrados na figura 1.

[096] Os camundongos, após a administração, foram mantidos em um ambiente no qual os camundongos tem acesso livre a comida e água, enquanto sangue é coletado da veia do rabo em tempo. No sangue coletado, foi adicionado heparina para uma concentração final de 3,3 IU/ml, e centrifugação foi realizada a 5.000 rpm por 5 minutos a fim de coletar plasma do sangue, e em seguida mediu-se o título do anticorpo contra OVA no plasma do sangue.

[097] O título do anticorpo foi medido através do seguinte método. Em uma microplaca de 96 cavidades (MaxiSorp, manufaturado por Nunc), 100 μl de uma solução PBS contendo 1 μg/ml OVA foi colocada, e a placa foi deixada para descansar a 4°C durante a noite. A solução foi descartada, e 400 μl de PBS suplementado com 0,5% de BSA foi colocado na placa, e em seguida um bloqueio foi realizado em temperatura ambiente por 2 horas. As cavidades foram lavadas uma vez com 400 μl de um líquido de lavagem (PBS suplementado com 0,05% de Tween 20), e 100 μl de uma amostra de plasma do sangue que foi diluída com um líquido de diluição de 1.000 a 100.000 vezes (PBS suplementado com 0,25% de BSA e 0,05% de Tween 20) foi colocada em cada cavidade, em seguida permitiu-se que a reação procedesse em temperatura ambiente por 40 minutos com agitação. As cavidades foram lavadas três vezes com o líquido de lavagem, e 100 μl de anticorpo IgG anti-camundongo (Zymed) marcado com HRP (peroxidase de rábano silvestre) (10.000 vezes diluída com o líquido de diluição) foi colocado em cada cavidade, e em seguida permitiu-se que a reação procedesse em temperatura ambiente for 20 minutos com agitação. As cavidades foram lavadas três vezes com o líquido de lavagem, e 100 μl de um líquido corante (0,1 M tampão citrato/acetato de sódio (pH 4,5) contendo 0,006% de peróxido de hidrogênio e 0,2 mg/ml tetrametilbenzidina) foi colocada em cada cavidade, em seguida foi permitido que a reação procedesse em temperatura ambiente por 10 minutos com agitação. A reação foi parada pela adição de 100 μl de 1 N de ácido sulfúrico, e a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas. Como uma amostra padrão, um anticorpo monoclonal anti-OVA serialmente diluído (HYB 094-05, manufaturado por Antibody Shop) foi medido ao mesmo tempo a fim de fornecer uma curva de calibração, e a quantidade de anticorpo em cada amostra foi calculada como uma concentração por peso (ng/ml). RESULTADOS

[098] As mudanças no valor médio do título do anticorpo antiOVA em plasma do sangue com tempo é mostrado na figura 1. A partícula de encapsulação de OVA e a partícula associada de encapsulação de OVA usando partícula Dex-g-PLGA (partículas Dex-g-PLGA (2), (3), (4), (5) e (6)), e a partícula associada de encapsulação de OVA usando PEG-PLGA (partícula PEG-PLGA (3)) mostrou efeito de aumento contínuo título do anticorpo por não menos do que 6 semanas, mostrando valores muito maiores do que os casos de administração da partícula PLGA ou do antígeno sozinho nos exemplos comparativos e do que o caso de administração do antígeno+Alum no exemplo de referência. A partícula Dex-g-PLGA (6), que tem um tamanho de partícula pequeno, mostrou uma tendência para ter o maior aumento do efeito de título do anticorpo. EXEMPLO 7 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA QUE CONTÉM CEA EM CAMUNDONGOS MÉTODO

[099] Os Complexos de micropartículas de adjuvante CEA (referido neste documento como partículas de encapsulação de CEA) e partículas associadas dos mesmos (referido neste documento como partículas associadas de encapsulação de CEA) preparadas pelos métodos dos exemplos 3 e 4 foram avaliadas pelo mesmo método do exemplo 6. A dose por indivíduo foi 1 mg (5 μg em termos de antígeno), e esta dose foi administrada através de injeção única. Como as partículas de encapsulação de CEA e a Partículas associadas de encapsulação de CEA, a Partículas Dex-g-PLGA (8), (9) e (10), que tem cadeias de enxerto hidrofóbico com tamanhos diferentes; as partículas Dex-g-PLGA (11) e (12), que foram preparadas usando Composto (4) como no caso da partícula Dex-g-PLGA (9) e que tem tamanhos de partícula diferentes; a partícula Dex-g-PLGA (13), que foi preparada através da incorporação do antígeno e 25 μg de CpG na partícula Dex-g-PLGA (9); e a partícula PEG-PLGA (4); foram avaliadas. Além disso, 50 μl de uma solução aquosa contendo 5 μg do antígeno, como um exemplo comparativo; e uma mistura de 50 μl de uma solução aquosa contendo 5μg do antígeno e 50 μl de Alum, como um exemplo de referência; foram administrados através de injeção única. Sob cada condição, a administração foi realizada para 4 indivíduos de camundongos, e os valores médios para os respectivos grupos são mostrados na figura 2 e figura 3.

[0100] O título do anticorpo contra CEA foi medido pelo seguinte método. Em uma microplaca de 96 cavidades (MaxiSorp, manufaturado por Nunc), 100 μl de uma Solução PBS contendo 1 μg/ml de proteína CEA foi colocada, e a placa foi deixada para descansar a 4°C durante a noite. A solução foi descartada, e 400 μl de PBS suplementado com 0,5% BSA foi colocado na placa, e em seguida realizou-se o bloqueio em temperatura ambiente por 2 horas. As cavidades foram lavadas uma vez com 400 μl de um líquido de lavagem (PBS suplementado com 0,05% de Tween 20), e 100 μl de uma amostra de plasma do sangue que foi diluída 1.000 a 100.000 vezes com um líquido de diluição (PBS suplementado com de 0,25% BSA e 0,05% de Tween 20) foi colocado em cada cavidade, em seguida, permitiu-se que a reação procedesse em temperatura ambiente por 40 minutos com agitação. As cavidades foram lavadas três vezes com o líquido de lavagem, e 100 μl de HRP anticorpo IgG anti-camundongo (Zymed) marcado com (peroxidase de rábano silvestre) (10.000 vezes diluída com o líquido de diluição) foi colocado em cada cavidade, e em seguida permitiu-se que a reação proceda em temperatura ambiente por 20 minutos com agitação. As cavidades foram lavadas três vezes com o líquido de lavagem, e 100 μl de um líquido corante (0,1 M de tampão citrato/acetato de sódio (pH 4,5) contendo 0,006% de peróxido de hidrogênio e 0,2 mg/ml de tetrametilbenzidina) foi colocado em cada cavidade, e em seguida permitiu-se que a reação prosseguisse em temperatura ambiente por 10 minutos com agitação. A reação foi parada por adição de 100 μl de 1 N de ácido sulfúrico, e a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas. Como uma amostra padrão, um anticorpo monoclonal anti-CEA serialmente diluída (MA1-5308, manufaturado por Affinity Bioreagents) foi medido ao mesmo tempo a fim de fornecer uma curva de calibração, e a quantidade do anticorpo em cada amostra foi calculada como uma concentração por peso (ng/ml). Para medição do título do anticorpo IgG2a, um HRP marcado com anticorpo IgG2a anti-camundongo (A90-107P, manufaturado por Bethyl) foi usado no lugar do HRP marcado com anticorpo IgG anti-camundongo, e uma amostra de plasma do sangue de um único indivíduo do camundongo cujo título do anticorpo aumentou foi usado como uma amostra de referência. Amostras preparadas através da diluição serial desta amostra foram usadas como um padrão a fim de preparar uma curva de calibração. O título do anticorpo correspondente à amostra diluída 64.000 vezes foi representada como 1 U. RESULTADOS

[0101] As partículas de encapsulação de CEA e as partículas associadas de encapsulação de CEA usando partícula Dex-g-PLGA (as partículas Dex-g-PLGA (8), (9), (10), (11) e (12), e a partícula PEG-PLGA (4)) mostraram aumento contínuo no título do anticorpo por cerca de 6 semanas. Entre estes, a partícula de encapsulação de CEA que tem um tamanho de partícula pequeno (partícula Dex-g-PLGA (12)) mostrou o maior efeito de aumento do título do anticorpo. Além disso, a partícula Dex-g-PLGA (13) contendo CpG juntamente com o antígeno mostrou um maior efeito de aumento do título do anticorpo do que a partícula Dex-g-PLGA (9) (Figura 2).

[0102] Aumento contínuo no título do anticorpo anti-IgG2a foi confirmado pelas partículas Dex-g-PLGA (8), (9), (10), (11) e (12), e a partícula PEG-PLGA (4). A partícula Dex-g-PLGA (13) preparada através da incorporação do antígeno e CpG na partícula Dex-g-PLGA (9) mostrou um maior efeito de aumento do título do anticorpo do que a partícula Dex-g-PLGA (9). Por outro lado, no exemplo de referência em que a mistura do antígeno e Alum foi administrada, o aumento contínuo no título do anticorpo foi observado, mas o efeito foi mais fraco do que nos casos das outras partículas Dex-g- PLGA. Foi confirmado que a composição imunogênica da presente invenção imunidade mediada por célula ativada, pela qual aumento no título de camundongo IgG2a é conhecido por ser um índice, continuamente por um longo tempo (Figura 3). EXEMPLO 8 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA QUE CONTÉM OVA EM CAMUNDONGOS (2) MÉTODO Usando um polímero de partícula Dex-g-PLGA preparado através do mesmo método como no caso do Composto (4) no exemplo 1, uma partícula preparada através do mesmo método como no caso da partícula Dex-g-PLGA (3) no exemplo 3 (partícula Dex-g-PLGA (A)) foi avaliado pelo método descrito no exemplo 6. A dose por indivíduo foi 16 mg (20 μg em termos de quantidade do encapsulado OVA), e esta dose foi administrada através de injeção única. Além disso, como um exemplo de referência, uma solução preparada através da mistura de 50μl de uma solução aquosa contendo 20 μg do antígeno OVA e 50 μl de Alum foi administrado através de injeção, uma vez, ou três vezes em intervalos de 1 semana. Sob cada condição, a administração foi realizada para 2 indivíduos de camundongos, e os valores médios dos títulos de anticorpos são representados na figura 4 como valores medidos da absorbância a 450 nm. RESULTADOS

[0103] As mudanças no anticorpo anti-OVA em plasma do sangue com tempo é mostrado na figura 4. No exemplo de referência no qual a mistura de Alum e o antígeno foi administrado uma vez, o aumento no título do anticorpo foi dificilmente observado. No exemplo de referência no qual Alum e o antígeno foram administrados três vezes, aumento expressivo no título do anticorpo foi observado após a terceira administração, mas o aumento foi transitório, e no aumento foi observado no Dia 35 e além. Nos camundongos para qual a composição imunogênica da presente invenção (partícula Dex-g- PLGA (A)) foi administrado através de injeção única, aumento contínuo foi observado a partir de duas semanas após a administração, e aumento contínuo no título do anticorpo foi confirmado até o Dia 56. EXEMPLO 9 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA QUE CONTÉM OVA EM CAMUNDONGOS (3) MÉTODO

[0104] A avaliação foi realizada através do mesmo método como no exemplo 6. A dose da partícula associada de encapsulação de OVA por indivíduo foi 10 mg (12,5 μg em termos de quantidade alimentada de antígeno). Uma partícula preparada usando um polímero de partícula Dex-g-PLGA preparado pelo mesmo método como no caso do Composto (4) no exemplo 1, no qual a partícula foi preparada através do mesmo método como no caso da partícula Dex-g-PLGA (3) no exemplo 3 (partícula Dex-g-PLGA (B)); uma partícula preparada usando um polímero de partícula Dex-g-PLGA preparado através do mesmo método como no caso do Composto (4) no exemplo 1, no qual a partícula foi preparada através da incorporação do CpG juntamente com OVA durante a preparação da partícula Dex-g-PLGA (3) no Exemplo 3 de tal forma que a dose do CpG por indivíduo seja 6,25 μg (partícula Dex-g-PLGA (C)); ou a partícula PEG-PLGA (1) ou (2); foi administrado através de injeção única. Como um exemplo comparativo, 12,5 do antígeno foi administrado, e, como um exemplo de referência, uma mistura de 12,5 μg do antígeno e 6,25 μg de CpG foi administrado, através de injeção única. Sangue foi coletado a partir de 4 semanas após a administração em intervalos de 1 semana, e o título do anticorpo foi medido através do mesmo método como no exemplo 6. Sob cada condição, a administração foi realizada para 2 indivíduos de camundongos, e os valores médios dos títulos de anticorpos são mostrados na Figura 5. RESULTADOS

[0105] Qualquer partícula associada de encapsulação de OVA (as partículas PEG-PLGA (1) e (2), e as partículas Dex-g-PLGA (B) e (C)) causaram aumento no título do anticorpo do animal para qual a partícula foi administrada, por não menos do que 6 semanas após a administração. As partículas Dex-g-PLGA mostrou capacidades de imunoativação maiores do que as partículas PEG-PLGA. Além disso, a partícula de encapsulação de OVA na qual o CpG é encapsulado (partícula Dex-g-PLGA (C)) mostrou um maior efeito de aumento do título do anticorpo do que a partícula de encapsulação de OVA que não contem CpG (partícula Dex-g-PLGA (B)). EXEMPLO 10 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA CONTENDO PROTEÍNA ESTRUTURAL HCV EM CAMUNDONGOS MÉTODO

[0106] Usando um polímero de partícula Dex-g-PLGA preparado através do mesmo método como no caso do Composto (4) no Exemplo 1, e usando o mesmo método de preparação como no caso da partícula Dex-g- PLGA (3) no exemplo 3, uma partícula Dex-g-PLGA (D) (referido neste documento como partícula associada à encapsulação de HCV-E2) foi preparada, na qual a partícula Dexg-PLGA (D) foi formada por associação de um Complexo micropartículas de adjuvante proteína estrutural HCV contendo uma proteína estrutural HCV. Esta partícula foi administrada através de injeção única pelo mesmo método como o usado no exemplo 6. Como a proteína estrutural HCV, uma proteína quimérica composta da proteína E2 derivada da cepa J6CF e a proteína FC de IgG humano, na qual a proteína quimérica foi preparada de acordo com o método descrito no pedido de patente japonês No 2008-254338, foi usada. A dose por indivíduo foi 80 mg (1,5 μg em termos de antígeno). Além disso, a mistura de 25 μg de CpG e a partícula Dex-g-PLGA (D), e uma mistura de 25 μg de CpG, 50 μl de Alum e a partícula Dex-g-PLGA (D) foram administradas através de injeção única, respectivamente. Como no exemplo comparativo, 1,5 μg do antígeno sozinho foi administrado, e, como exemplos de referência, 100 μl de uma solução aquosa contendo 1,5 μg do antígeno e 25 μg de CpG, 100 μl de uma solução aquosa contendo 1,5 μg do antígeno e 50 μl de Alum, e 100 μl de uma solução aquosa contendo 1,5 μg do antígeno, 50 μl de Alum e 25 μg de CpG foram administrados através de injeção única, respectivamente. Sob cada condição, a administração foi realizada para 2 indivíduos de camundongos.

[0107] O título do anticorpo contra a proteína estrutural HCV foi medido através do seguinte método. Em uma microplaca de 96 cavidades (MaxiSorp, manufaturado por Nunc), 100 μ1 de uma solução PBS contendo 0,5 μg/ml de proteína estrutural HCV foi colocada, e a placa foi deixada para descansar a 4°C durante a noite. A solução foi descartada, e 400 μl de PBS suplementado com 0,5% BSA foi colocada em cada cavidade, seguida de realização de bloqueio em temperatura ambiente por 2 horas. As cavidades foram lavadas uma vez com 400 μl de um líquido de lavagem (PBS suplementado com 0,05% de Tween 20), e 100 μl de uma amostra de plasma do sangue que foi diluída de 1.000 a 100.000 vezes com um líquido de diluição (PBS suplementado com 0,25% de BSA e 0,05% de Tween 20) foi colocado em cada cavidade, seguido pela permissão reação em prosseguir em temperatura ambiente por 40 minutos com agitação. As cavidades foram lavadas três vezes com o líquido de lavagem, e 100 μl de anticorpo IgG anti- camundongo (Zymed) marcado com HRP (peroxidase de rábano silvestre) (10.000 vezes diluída com o líquido de diluição) foi colocado em cada cavidade, seguido pela permissão da reação de proceder em temperatura ambiente por 20 minutos com agitação. As cavidades foram lavadas três vezes com o líquido de lavagem, e 100 μl de um líquido corante (0,1 M de tampão citrato/acetato de sódio (pH 4,5) contendo 0,006% de peróxido de hidrogênio e 0,2 mg/ml de tetrametilbenzidina) foi colocado em cada cavidade, seguido pela permissão da reação de proceder em temperatura ambiente por 10 minutos com agitação. A reação foi parada pela adição de 100 μ1 de 1 N de ácido sulfúrico, e a absorbância a 450 ciclos foi medida usando um leitor de microplacas.

[0108] Na figura 6, os valores médios dos títulos de anticorpos são representados como valores medidos da absorbância a 450 nm. RESULTADOS

[0109] A partícula associada à encapsulação de HCV-E2 (partícula Dex-g-PLGA (D)) mostrou efeito de aumento contínuo do título de anticorpo por 7 semanas. Além disso, no caso em que a partícula associada à encapsulação de HCV-E2 foi misturada com CpG, e no caso em que a partícula associada à encapsulação de HCV-E2 foi misturada com CpG e Alum, um maior efeito de aumento do título do anticorpo foi obtido em comparação com o caso em que a partícula associada à encapsulação de HCV-E2 sozinha foi administrada.

[0110] No exemplo comparativo em que o antígeno sozinho foi administrado, o aumento no título do anticorpo foi dificilmente observado. No exemplo de referências em que a mistura do antígeno e Alum; mistura do antígeno e CpG; ou mistura do antígeno, CpG e Alum; foi administrado, o efeito do aumento do título do anticorpo foi maior do que no caso de administração do antígeno sozinho, mas o efeito de aumento do título foi muito menor do que no caso da administração da partícula associada à encapsulação de HCV-E2. EXEMPLO 11 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA CONTENDO CEA EM CAMUNDONGOS (2) MÉTODO

[0111] As micropartículas de adjuvante CEA associadas a um complexo de partículas preparadas pelos métodos nos exemplos 3 e 4 (referidas neste documento como partículas associadas de encapsulação de CEA) foram avaliadas através do mesmo método como o usado no exemplo 7. A dose por indivíduo foi 400 μg (1 μg em termos de antígeno), e esta dose foi administrada na Semana 0 e Semana 4. Como as partículas associadas de encapsulação de CEA, as partículas Dex-g-PLGA (14) e (15) que tem cadeias hidrofóbicas de dextrano tendo um peso molecular de 1.500, partículas Dex-g- PLGA (16) e (17) que tem cadeias hidrofóbicas de dextrano tendo um peso molecular de 5.000, partícula Dex-g-PLGA (18) que tem cadeias hidrofílicas de dextrano tendo um peso molecular de 175.000, e partícula Dex-g-PLGA (19) que tem cadeias hidrofílicas de dextrano tendo um peso molecular de 40.000 foram avaliadas. Sob cada condição, a administração foi realizada para 5 indivíduos de camundongos, e o valor médio em cada grupo é mostrado na figura 7. O título do anticorpo contra o CEA foi medido através do mesmo método como o usado no exemplo 7. RESULTADOS

[0112] As partículas associadas de encapsulação de CEA usando partícula Dex-g-PLGA (partículas Dex-g-PLGA (14), (15), (16), (17), (18) e (19)) mostrou aumento contínuo no título do anticorpo. Entre estes, as partículas associadas de encapsulação de CEA constituídas por dextrano com um peso molecular de 175.000 e um peso molecular de 40.000 (partículas Dex-g-PLGA (18) e (19)) mostrou maior efeito de aumento do título dos anticorpos do que as partículas associadas de encapsulação de CEA constituídas por cadeias hidrofílicas de dextrano com um peso molecular de 1.500 e um peso molecular de 5.000 (partículas Dex-g-PLGA (14), (15), (16) e (17)) (Figura 7). EXEMPLO 12 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA CONTENDO CEA EM CAMUNDONGOS (3) MÉTODO

[0113] As micropartículas de adjuvante CEA associadas a um complexo de partículas (referidas neste documento como partículas associadas de encapsulação de CEA) preparadas pelos métodos dos exemplos 3 e 4 foram avaliadas através do mesmo método usado no exemplo 7. A dose por indivíduo foi 400 μg (1 μg em termos de antígeno), e esta dose foi administrada na Semana 0 e Semana 4. Como nas partículas associadas de encapsulação de CEA, 3 tipos de partículas que foram preparadas usando o mesmo polímero mas que tem tamanhos de partícula diferentes (partícula Dex-g-PLGA (20) (tamanho de partícula, 0,4 μm), partícula Dex-g-PLGA (21) (tamanho de partícula, 5 μm) e partícula Dex-g-PLGA (tamanho de partícula, 40 μm)) foram avaliadas. Sob cada condição, a administração foi realizada para indivíduos de camundongos, e o valor médio em cada grupo é mostrado na figura 8. O título do anticorpo contra CEA foi medido através do mesmo método usado no exemplo 7. RESULTADOS

[0114] A partícula de encapsulação de CEA e partículas associadas de encapsulação de CEA usando partícula Dex-g-PLGA (partículas Dex-g-PLGA (20), (21) e (22)) mostrou aumento contínuo no título do anticorpo. Entre estes, a partícula Dex-g-PLGA (20) que tem um tamanho médio de partícula de 0,4 μm mostrou o maior efeito de aumento do título do anticorpo; a partícula Dex-g-PLGA (21) que tem um tamanho médio de partícula de 5 μm mostrou o segundo maior efeito de aumento do título do anticorpo; e a partícula Dex-g-PLGA (22) que tem um tamanho médio de partícula de 40 μm mostrou o menor efeito do aumento do título do anticorpo (Figura 8). EXEMPLO 13 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA QUE CONTÉM OVA EM CAMUNDONGOS (4) MÉTODO

[0115] A avaliação foi realizada através do mesmo método usado no exemplo 9. A dose por administração foi 20 μg em termos de quantidade do antígeno em todos os casos, e o antígeno foi administrado um total de 3 vezes na Semana 0, Semana 2 e Semana 4. A avaliação foi realizada por comparação entre os casos em que uma mistura de 20 μg de OVA e a partícula Dex-g-PLGA (24) contendo no antígeno (16 mg em termos de polímero quantidade) foi administrado, o caso em que a partícula Dex-g-PLGA (23) contendo 20 μg de OVA (16 mg em termos de quantidade de polímero) foi administrado, o caso em que uma mistura de 20 μg de OVA e 50 μl de Alum foi administrado, e o caso em que 20 μg de OVA e a partícula Dex-g-PLGA (24) contida no antígeno foram administradas em sítios diferentes. O título do anticorpo no sangue foi medido através do mesmo método usado no exemplo 9. Sob cada condição, a administração foi realizada por 2 indivíduos de camundongos. A figura 9 mostra o valor médio do título do anticorpo. RESULTADOS

[0116] Todas as partículas mostraram o efeito do aumento do título do anticorpo. A partícula associada de encapsulação de OVA (partícula Dex-g-PLGA (23)) mostrou um maior efeito de aumento do título do anticorpo comparado com o caso em que a mistura de OVA e a partícula (partícula Dex- g-PLGA (24)) contida no antígeno foi administrada, e o caso em que o OVA e a partícula Dex-g-PLGA (24) foram administrados em sítios diferentes. EXEMPLO 14 ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA CONTENDO CEA EM CAMUNDONGOS (4) MÉTODO

[0117] A avaliação foi realizada através do mesmo método usado no exemplo 7. Somente no caso em que uma mistura de CEA e Alum foi administrada, um total de 3 vezes de administração foi realizada na Semana 0, Semana 2 e Semana 4, e nos outros casos em que as partículas de encapsulação de CEA e partículas associadas de encapsulação de CEA foram administradas, uma única administração foi realizada na Semana O. A avaliação foi realizada por comparação entre partículas que foram preparadas usando o mesmo polímero mas que tem tamanhos de partícula diferentes: partícula Dex-g-PLGA (25) (tamanho de partícula, 0,4 μm; conteúdo de polímero, 4 mg; quantidade de administração de antígeno, 10 μg), partícula Dex-g-PLGA (26) (tamanho de partícula, 5 μm; conteúdo de polímero, 4 mg; quantidade de administração de antígeno, 10 μg), partícula Dex-g-PLGA (27) (tamanho de partícula, 40 μm; conteúdo de polímero, 4 mg; quantidade de administração de antígeno, 10 μg), e partícula Dex-g-PLGA (28) (tamanho de partícula, 0,4 μm; conteúdo de polímero, 4 mg; quantidade de administração de antígeno, 1 μg). Além disso, em termos de partícula Dex-g-PLGA (25), comparações foram feitas com os casos em que a quantidade de administração foi reduzida para 1/10 (conteúdo de polímero, 400 μg; quantidade de administração de antígeno, 1 μg) ou 1/100 (conteúdo de polímero, 40 μg; quantidade de administração de antígeno, 0.1 μg). Como um exemplo comparativo, a partícula PLGA (2) preparada por encapsulação de CEA foram avaliadas. Sob cada condição, uma administração foi realizada por 6 indivíduos de camundongos, e o título do anticorpo, IgG1 e IgG2a no sangue foram medidos através do mesmo método usado no exemplo 7. As Figuras 10 e Figura 11 mostram os valores médios. RESULTADOS

[0118] As partículas de encapsulação de CEA (partículas Dex-g- PLGA (25) e (26)) que tem um tamanho médio de partícula de 0,4 p.m e um tamanho médio de partícula de 5 μm mostrou maior efeito de aumento do título do anticorpo comparado com a partícula de encapsulação de CEA (partícula Dex-g-PLGA (27)) que tem um tamanho médio de partícula de 40 μm. Apesar de a partícula Dex-g-PLGA (25) mostrar um alto efeito do aumento do título do anticorpo, a redução de sua quantidade de administração para 1/10 ou 1/100 resultou em diminuição no efeito do aumento do título do anticorpo, e no caso em que a quantidade de administração da partícula for 1/100, somente um baixo efeito do aumento do título do anticorpo pode ser obtido. Comparação entre a administração da partícula Dex-g-PLGA (25) em uma quantidade de 1/10 e uma administração da partícula Dex-g-PLGA (28), ambos dos quais a quantidade do antígeno administrado foi 1 μg, mostrou que a administração de uma maior quantidade do polímero resulta em um maior efeito de aumento do título do anticorpo (Figura 10).

[0119] Além disso, para sangue na Semana 6, o título do anticorpo IgG2a foi medido através do mesmo método usado no exemplo 7, e o título do anticorpo IgG1 foi medido através do mesmo método usado na medição do título do anticorpo IgG2a usando um anticorpo IgG1. De acordo com a medição da razão entre estes, a administração de uma mistura de Alum e o anticorpo resultou em um baixo valor IgG2a/IgG1, enquanto a administração da partícula Dex-g-PLGA (25), (26) ou (27) resultou em um alto valor IgG2a/IgG1, mostrando uma tendência que um tamanho de partícula menor resulta em um valor mais alto de IgG2a/IgG1 (Figura 11).

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

[0120] A composição imunogênica da presente invenção pode ser usada como uma vacina para terapia e/ou profilaxia de doenças infecciosas, câncer e similares.

Claims

1. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada por compreender uma micropartícula polissacarídeo-PLGA de adjuvante-antígeno contendo um antígeno encapsulado em uma micropartícula de adjuvante composta por polímero(s) anfifílico(s), cujo segmento hidrofóbico é um poli(hidróxi ácido) e cujo segmento hidrofílico é um polissacarídeo refratário.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender, como um ingrediente eficaz, uma partícula composta pelo dito complexo de micropartículas de adjuvante-antígeno associados em conjunto.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pela dita micropartícula de adjuvante ter uma porção hidrofílica composta por um segmento hidrofílico de dito polímero anfifílico e ter uma camada exterior composta por uma porção hidrofóbica constituída pelo dito segmento hidrofóbico do dito polímero anfifílico.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito polímero anfifílico ser um polímero anfifílico de enxerto composto por uma cadeia principal de polissacarídeo e uma cadeia de enxerto de poli(hidróxi ácido).

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo dito polissacarídeo ser dextrano.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo dito poli(hidróxi ácido) ser um poli(ácido lático-co-glicólico).

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por compreender adicionalmente um modificador de superfície ligado ao dito poli(hidróxi ácido) da dita micropartícula de adjuvante, em que dito modificador de superfície é de preferência um polímero hidrofílico ou um composto anfifílico.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo polímero hidrofílico ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool de polivinila, polietilenoimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, polímero de poli-1,3- dioxolano, 2-metacriloiloxietil fosforil colina, poli-1,3,6-trioxano, poliaminoácido, peptídeo, proteína ou polissacarídeo de açúcar, ou um análogo de qualquer um destes.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo composto anfifílico ser selecionado a partir do grupo que consiste em lipídeos e tensoativos, em que os tensoativos são tensoativos não- iônicos, como copolímeros polioxietileno polipropileno glicol, ésteres de ácido graxo sacarose, ésteres de ácido graxo polietileno glicol, polioxietileno sorbitano éster de ácido monograxo, polioxietileno sorbitano éster de ácido digraxo, polioxietileno glicerol éster de ácido monograxo, polioxietileno glicerol éster de ácido digraxo, poliglicerol éster de ácido graxo, polioxietileno óleo de rícino e polioxietileno óleo de rícino hidrogenado; sulfatos de alquila como lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de amônio e sulfato estearila de sódio; e lectina.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo tamanho médio de partícula do dito complexo de micropartículas de adjuvante-antígeno ou da dita partícula composta pelo dito complexo de micropartículas de adjuvante-antígeno associados em conjunto ser de 0,1 a 50 μm.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por compreender adicionalmente uma substância de imunoativação como um ingrediente eficaz.

12. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela dita substância de imunoativação ser um ácido nucleico.

13. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizada pela dita substância de imunoativação ser CpG.