JP2008088158A - 親水性活性物質含有微粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 タンパク質を効率よく封入しうる親水性部分を内部に有し、生体内での安定性向上や体内動態を改善しうる微粒子ならびに該微粒子分散体の製造法を提供する。
【解決手段】 両親媒性ポリマーを含み、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントから成る親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントから成る疎水性外層とから成り、疎水性外層に表面改質剤が結合した親水性活性物質含有微粒子を製造する方法であって、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程
（ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程
を含む親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、生理活性物質、薬剤、造影剤、遺伝子等を効果的に送達する微粒子の製造方法に関する。

ナノパーティクル、マイクロパーティクル、ナノスフィア、マイクロスフィアあるいはマイクロカプセルなどと呼ばれる微粒子に薬剤を封入した微粒子製剤が開発され、薬物のキャリアとして用いることが検討されている。

ポリマー化合物を基材とする微粒子製剤としては、生分解性であるポリ乳酸またはポリ乳酸・ポリグリコール酸を用いた微粒子、親水性ポリマーと疎水性ポリマーを共有結合させた両親媒性ポリマーであるＡ−ＢまたはＡ−Ｂ−Ａタイプのブロックコポリマーを用いたポリマーミセルやナノパーティクルが挙げられる。これらの微粒子製剤においては、薬剤を内包すべきコンパートメントは疎水的環境であり、親水性薬剤を微粒子内に封入する効率は低い。特に、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬を、該粒子に生理活性を保った状態で封入することは難しい。

このような課題を解決するために、両親媒性ポリマーの界面活性作用を利用して、親水性活性物質の水溶液を、両親媒性ポリマーを添加した有機溶媒中で、所謂、逆相エマルジョン（逆ミセル）を形成させた後、微粒子を形成する方法 (特許文献１〜２参照)が提案されてきた。
特許文献１では、疎水性セグメントとして生体内分解性ポリマーを親水性セグメントとしてポリアミノ酸を有する両親媒性ブロックコポリマーを使用して逆相ミセルを形成させ、内部が親水環境であり外層が疎水的である微粒子が記載されている。しかしながら、このような微粒子について、具体的な製造方法には言及されていない。

特許文献２では、両親媒性ブロックコポリマーを溶解させた有機溶媒を用い、内水相に親水性活性物質を含有させたＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を乾燥することで微粒子を製造している。しかしながら、このような粒子では、乾燥条件下でも除去されない有機溶媒を用いているため、粒径が１００ミクロンから数ミリメートルと非常に大きい。

また、親水性活性物質を内包する微粒子製造法として上記以外に、ソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを利用した微粒子製造する方法も提案されている（特許文献３，参照）。

特許文献３では、水溶性固体物質を内封したＷ／Ｏ型エマルジョンを脱水してＳ／Ｏ型サスペンションとし、外水相に分散させて得られたＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを、多孔質膜を透過させることで単分散かつ粒径を制御可能なＳ／Ｏ／Ｗエマルジョンを製造する方法を提案しているが、得られたエマルジョンは、液体製剤で保存安定性に乏しく、また外水相を除去して保存安定性の良好な微粒子製剤とすることは出来ない。
特開平１１−２６９０９７号公報 特表２００４−５１１６３１号公報 特開２００４−８８３７号公報

上記のように、ブロックポリマーなどの両親媒性ポリマーを使用した微粒子開発が行われているが、親水性薬物を効率よく封入可能な微粒子を製造し、医薬品として有用な水系分散体とする方法はない。

本発明の目的は、タンパク質を効率良く封入しうる親水性部分を内部に有し、生体内での安定性向上や体内動態を改善しうる微粒子、特に、ナノサイズの微粒子ならびに該微粒子分散体の製造法を提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。

本発明は以下のような構成を有する。
両親媒性ポリマーを含み、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントから成る親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントから成る疎水性外層とから成り、疎水性外層に表面改質剤が結合した親水性活性物質含有微粒子を製造する方法であって、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程
（ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程を含む親水性活性物質含有微粒子の製造方法。

本発明においては、（１）両親媒性ポリマーにより形成された逆相エマルジョン中に親水性活性物質を封入し、（２）この構造を一旦固形分として安定化し、（３）さらに水系溶媒等への分散性を付与するために、表面改質剤を付与するという製造法により、親水性活性物質を封入し、各種溶媒に分散可能なミクロ〜ナノサイズの微粒子を提供することが可能となる。

本発明の製造法を用いることにより、タンパク質などの生理活性物質を効率よく封入し、生体内での安定性向上や体内動態を改善しうるミクロ〜ナノサイズの微粒子ならびに医薬品として有用な該微粒子分散体を提供することができる。更に、本発明は、例えば、親水性かつ分子量の大きいタンパク質・ペプチド医薬、核酸医薬などを効果的に内包する微粒子および医薬品組成物を製造することができる。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の製造方法における微粒子は、両親媒性ポリマーを含み、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、疎水性外層に表面改質剤が結合した親水性活性物質含有微粒子である。

本発明における両親媒性ポリマーは、少なくとも２種類以上のセグメントから構成され、そのうち少なくとも１種類以上のセグメントが親水性であり、更に少なくとも１種類以上のセグメントが疎水性である。ここで、親水性とは、任意のセグメントの水への溶解度が、他のセグメントより高いとき、該セグメントを親水性であると言う。親水セグメントは、水に可溶であることが望ましいが、難溶であっても他のセグメントと比較して、水への溶解度が高ければ良い。また、疎水性とは、任意のセグメントの水への溶解度が、他のセグメントより低いとき、該セグメントを疎水性であるという。疎水性セグメントは、水に不溶であることが望ましいが、可溶であっても他のセグメントと比較して、水への溶解度が低ければ良い。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の製造方法は、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程
（ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程
を含む。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の製造方法では、逆相エマルジョンは、親水性活性物質を含む水系溶媒を、両親倍性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に添加し、混和することで形成される。必要であれば、例えば、マグネティックスターラーなどの撹拌装置、タービン型攪拌機、ホモジナイザー、多孔質膜を装備した膜乳化装置などを使用しても良い。

工程（ａ）における水系溶媒には、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を使用する。該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸などが挙げられる。

工程（ａ）における水非混和性有機溶媒は、該両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが可溶で且つ、親水性セグメントが難溶または不溶であることが望ましいが、両セグメントが難溶もしくは両セグメントが可溶いずれであっても良い。該非水混和性有機溶媒は、凍結乾燥により揮散除去できることが望ましい。該水非混和性有機溶媒の水への溶解度は、１０ｇ（有機溶媒）／１００ｍＬ（水）以下、好ましくは１ｇ（有機溶媒）／１００ｍＬ（水）以下、更に好ましくは０．１ｇ（有機溶媒）／１００ｍＬ（水）以下である。水非混和性有機溶媒としては、好ましくは、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロフォルムが挙げられる。該有機溶媒に対する水系溶媒の比は、一般的には１０００：１〜１：１、より好ましくは１００：１〜３：１である。該有機溶媒中の両親媒性ポリマーの濃度は、有機溶媒、両親媒性ポリマーの種類によって異なるが、０．０１〜９０％（w/w）、より好ましくは０．１〜５０％（w/w）、更に好ましくは、１〜２０％（w/w）である。

工程（a）における、親水性活性物質を含む水系溶媒、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成する工程において、製剤学的目的に応じて、２種以上の両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成しても良い。

工程（ａ）における、親水性活性物質を含む水系溶媒、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成する工程において、逆相エマルジョンの形成を補助し、均一かつ微小な逆相エマルジョンを形成する目的のために、共剤を添加することができる。共剤としては、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物が望ましい。これら共剤のアルキル鎖の構造は、特に限定されず、直鎖構造でも分岐構造でも良く、飽和アルキルでも、不飽和アルキルでも良い。本発明において、共剤としては、tert-ブタノール、iso-プロパノール、ペンタノールがとくに好ましい。

本発明における逆相エマルジョンの平均粒径は、所望する微粒子の粒径によりとくに限定されないが、本発明の目的である医薬品用の微粒子を製造するには、１００マイクロメートル以下であることが望ましく、より好ましくは５０マイクロメートル以下、さらに好ましくは５００ナノメートル以下、さらに好ましくは１５０ナノメートル以下である。逆相エマルジョンの平均粒径は、さらにより好ましくは、１０ナノメートルから１５０ナノメートルであり、さらにより好ましくは５０ナノメートルから１００ナノメートルである。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の製造方法は、
（ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程
を含むことが重要である。

工程（b）において、逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、加熱、減圧乾燥、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過、再沈殿および、それらの組み合わせが挙げられる。

凍結乾燥は、逆相エマルジョン中の粒子の合一などによる構造変化が少なく、また、親水性活性物質の高温による変性を回避しうるので、とくに好ましい。凍結乾燥の条件、装置としては、凍結過程と減圧下での乾燥工程を含むものであり、凍結乾燥の常法である予備凍結、減圧・低温下での一次乾燥、減圧下での二次乾燥を経る工程がとくに好ましい。例えば逆相エマルジョンを構成する、水系溶媒と水非混和性有機溶媒の融点以下に冷却・凍結し、次いで減圧乾燥することにより、凍結乾燥した親水性活性物質含有固形分が得られる。予備凍結の温度としては、溶媒組成から適宜実験的に決定すれば良いが、−２０℃以下が好ましい。また、乾燥過程における減圧度も、溶媒組成から適宜実験的に決定すれば良いが、３０００Pa以下が好ましく、より好ましくは、５００Ｐａ以下が乾燥時間の短縮のためにより好ましい。凍結乾燥には、コールドトラップを備え真空ポンプと接続可能なラボ用凍結乾燥機や医薬品の製造などに用いられる棚式真空凍結乾燥機を使用することが好ましく、液体窒素、冷媒などによる予備凍結の後、冷却下または室温で真空ポンプなどの減圧装置で減圧乾燥を行えば良い。

工程（ｂ）において得られる親水性活性成分含有固形分は、逆相エマルジョンの構造を反映した両親媒性ポリマーと親水性活性物質を含む微粒子の凝集体として得られる。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の製造方法は、
（ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程
を含む。

工程（ｃ）において、親水性活性成分含有固形分を表面改質剤を含む液相に導入する方法は、例えば、親水性活性成分含有固形分を表面改質剤を含む液相に添加するか、親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させて、得られた分散液（ソリッド・イン・オイル（Ｓ／Ｏ）サスペンション）を表面改質剤を含む液相に添加しても良い。

親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させる場合、分散媒としてはとくに限定されるものではないが、親水性活性成分含有固形分を構成する逆相エマルジョンの構造を反映した両親媒性ポリマーと親水性活性物質を含む微粒子構造を保持する目的で、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントまたは親水性セグメントのいずれかを実質的に溶解しない溶媒であることが好ましく、水非混和性有機溶媒でも水混和性有機溶媒であっても良い。

両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが可溶で且つ、親水性セグメントを実質的に溶解しない溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロフォルム、ジオキサン、トルエン、キシレンなどが挙げられる。

親水性活性物質含有固形分を分散させる分散媒には、親水性活性物質含有微粒子の分解もしくは崩壊による親水性活性物質の放出速度の制御を目的に、分散媒に可溶な各種添加剤、例えば酸性化合物、塩基性化合物、両親媒性ポリマーまたは生分解性ポリマーなどを含有しても良い。

工程（c）における液相は、表面改質剤を可溶で且つ、工程（ｃ）における分散媒よりも高い沸点を有することが好ましく、水系溶媒、有機溶媒のいずれであっても良い。水系溶媒としては、水あるいは水溶性成分を含有する水溶液が好ましい。該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸などが挙げられる。また、有機溶媒としては、例えば、シリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、流動パラフィン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、グリセロール、オレイン酸などが挙げられる。液相が水系溶媒で、かつ、分散媒が水非混和性有機溶媒の場合には、工程（c）で得られる:懸濁液は、いわゆるソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンとなり、液相が有機溶媒でかつ分散媒と混和しない場合には、ソリッド・イン・オイル・イン・オイル（Ｓ／Ｏ_１／Ｏ_２）型エマルジョンとなる。

工程（c）おける液相には、表面改質剤に加え、製剤学的な目的に応じて、各種添加物、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖などを含有しても良い。

工程（c）において、より微細な親水性活性物質含有微粒子を製造する目的で、形成されるソリッド・イン・オイル・イン・ウォーター（Ｓ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンまたはソリッド・イン・オイル・イン・オイル（Ｓ／Ｏ_１／Ｏ_２）型エマルジョンの乳化操作を行っても良い。乳化方法は、安定なエマルジョンを調製できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、撹拌による方法、高圧ホモジナイザー、高速ホモミキサーなどを用いる方法などが挙げられるが、多孔質膜を介して親水性活性成分含有固形分分散液を液相に透過分散するか、もしくは、親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させて、得られた分散液を、表面改質剤を含む液相に添加した後に、得られた懸濁液を多孔質膜に透過する乳化方法（以下「膜乳化法」という）を利用して粒径を制御することが好ましい。また、一旦、多孔質膜を透過して得られた液を、さらに孔径の小さな多孔膜に透過させることも、粒径を制御する上で好ましい。
膜乳化法に用いる多孔質膜の形状は特に限定されるものではなく、本発明粒子の製造条件に応じて適宜決定すれば良い。例えば、板状（平膜状）、円筒状（パイプ状）等の形状が挙げられる。また、多孔質の細孔径も限定されるものではなく、所望の粒径等に応じて適宜選択すれば良い。多孔質膜の材質も限定的ではなく、ガラス、セラミックス、シリコン、樹脂、金属、酸化物膜等が挙げられるが、多孔質ガラスは、孔径の均一性などの点で好ましい
多孔質ガラスとは、一般にガラスからなる多孔体をいい、限定するものではないが、原料となるSiO2 （ケイ砂）、H3 BO3 （硼酸）、Na2 CO3 （ソーダ灰）から通常の溶融プロセスによりNa2 O-B2 O3 -SiO2 系ガラスを作製し、これを成形した後に数百℃で熱処理を行い、ガラス内部でSiO2 リッチ相とNa2 O-B2 O3 リッチ相に数nmのスケールでスピノーダル分解による分相を生じさせ、この分相ガラスを酸溶液に浸漬し、Na2 O-B2 O3 相のみを酸で溶出させることにより得られる、SiO2 骨格を持つガラス多孔体が挙げられる。

多孔質ガラス膜としては、シラス多孔質ガラス膜（略称SPG膜）がとくに好ましい。

膜乳化法に用いる多孔質膜の界面化学的性質は、本発明粒子の製造条件に応じて適宜選択すれば良い。例えば、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製する場合には、液相が水であるため、親水性膜が好適である。Ｓ／Ｏ_１／Ｏ_２型エマルジョンを調製する場合には、液相となる外有機相（Ｏ_２）によって選択することができ、外有機相（Ｏ_２）が疎水性有機溶媒であれば、疎水性膜が好ましく、外有機相が親水性有機溶媒であれば、親水性膜が好ましい。
多孔質膜の膜表面が親水性であれば、疎水化処理することで疎水化膜として使用することができる。疎水化の方法には、例えば、シランカップリング剤など種々の反応試薬を用いて炭化水素基を導入する方法、あるいは有機系コーティング剤を付与する方法などがある。

多孔質膜の細孔径は、平均径が０．０５〜２０μｍ程度のものを用いるのが好ましく、より好ましくは０．０５〜１μｍ、さらに好ましくは０．０５〜０．１μｍである。

多孔質膜への透過条件は、通常、加圧下（１ｋＰａ〜２０ＭＰａ程度）で、０℃〜４０℃程度である。

工程（c）で、親水性活性成分含有固形分を一旦分散媒に分散させて、得られた分散液を表面改質剤を含む液相に添加した場合には、分散媒を除去することで、所望の親水性活性物質含有微粒子の懸濁液が得られる。分散媒を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、液中乾燥、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過、再沈殿が挙げられ、液中乾燥、凍結乾燥が特に好ましい。工程（ｃ）において、液相として水系溶媒を用いた場合には、本工程により、医薬品に好適な親水性活性物質含有微粒子の水系分散体が得られる。

本発明により得られた親水性活性物質含有微粒子分散体を用い、液相を除去することにより、親水性活性物質含有微粒子としても良い。液相を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、蒸発による留去、透析、凍結乾燥、遠心操作、濾過が好ましい。

本発明により得られる親水性活性物質含有微粒子の平均粒径は、５０マイクロメートル以下であることが望ましく、より好ましくは、５０ナノメートル〜５０マイクロメートル、さらに好ましくは、５０ナノメートルから１０００ナノメートルである。

本発明により得られる親水性活性物質含有微粒子の平均粒径は、さらに好ましくは、５００ナノメートル以下、あるいは、５０ナノメートルから５００ナノメートルである。本発明により得られる親水性活性物質含有微粒子の平均粒径は、さらにより好ましくは、５０ナノメートルから１００ナノメートルである。親水性活性物質含有粒子の平均粒径は、レーザー散乱型粒度分布計（たとえばＭｉｃｒｏｔｒａｃ ＡＳＶＲ／Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ−ＨＲＡ（９３２０−Ｘ１００））を用いて直接平均粒径を測定する。

本発明により得られる親水性活性物質含有微粒子の形状は特に限定されないが、球状、楕円状、不定形であることができる。

本発明における親水性活性物質含有微粒子を構成する両親媒性ポリマーの親水性セグメントとしては、特に限定されないが、生体適合性ポリマーであることが好ましい。本発明において、生体適合性ポリマーとは、生体に投与した際に著しく有害な影響を及ぼさないものを言い、より具体的には、ラットに該ポリマーを経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを言う。さらには、両親媒性ポリマーの親水性セグメントがポリエチレングリコールまたはデキストランを含むことが好ましく、両親媒性ポリマーの親水性セグメントがポリエチレングリコールまたはデキストランであることがより好ましい。

両親媒性ポリマーの親水性セグメントの分子量は、５０,０００以下であることが望ましく、より好ましくは、１０，０００以下であり、さらに好ましくは、５,０００以下である。

本明細書での分子量は、数平均分子量を言い、数平均分子量とは，分子の大きさの重み付けを考慮しない方法で算出した平均分子量であり、ポリマー末端基数の算出に用いることができる。一般には，ポリマーの末端基定量を行って求めることができるが、ポリスチレンを基準物質としてゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の分子量として求めることもできる。

本発明において、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、生分解性ポリマーを含むことが好ましい。両親媒性ポリマーの疎水性セグメントとしては、生体適合性ポリマーであることがより好ましい。本発明において、生体適合性ポリマーとは、生体に投与した際に著しく有害な影響を及ぼさないものを言い、より具体的には、ラットに該ポリマーを経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを言う。

本発明の親水性活性物質含有微粒子は、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが、生体投与時に著しく有害な影響を与えるものでないことが好ましく、生分解性ポリマーであることがより好ましい。本発明において、生分解性ポリマーとは、生体投与後に該ポリマーが代謝を受け低分子化し、体外に排泄されうるものを言う。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、脂肪族ポリエステル、ポリアミノ酸などが好ましく、ポリ(イプシロン−カプロラクトン)、ポリ乳酸またはポリグリコール酸、さらには、それらの共重合体や類縁体のいずれかから構成されることが好ましい。本発明の微粒子の両親媒性ポリマーの疎水性セグメントの分子量は、１０００から１００,０００であることが好ましい。

本発明における両親媒性ポリマーの構造は、ブロック型、グラフト型、ブランチ型いずれかの構造を有するコポリマーであることが好ましい。親水性セグメントの平均分子量に対する疎水性セグメントの平均分子量の値としては、望ましくは、０．１倍から２０倍であり、より望ましくは、０．１倍から１０倍である。親水性セグメントの平均分子量に対する疎水性セグメントの平均分子量の値としては、望ましくは２倍から１０倍であり、更に望ましくは、２倍から７倍である。
本発明における表面改質剤は、該表面改質剤が溶媒または微粒子外部に存在する物質と接触可能な場所に存在する限りにおいては、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントに化学結合していても良く、物理的に吸着していても良い。表面改質剤は、工程（c）において粒子表面に物理吸着あるいは化学吸着するものでも良いし、工程（ｃ）の後の、分散媒の除去時に物理吸着あるいは化学吸着するものでも良く、表面改質剤は、Ｓ／Ｏ／Ｗエ型マルジョンの水−油界面あるいはＳ／Ｏ_１／Ｏ_２型エマルジョンの油−油エマルジョン界面を安定化するものであることが望ましい。表面改質剤としては、望ましくは、微粒子のコロイド安定性を向上させる性質を有する化合物である。表面改質剤は、１種でも複数の混合物でも良い。ここでコロイド安定性を向上させるとは、微粒子の溶媒中における凝集を防ぐことまたは遅延させることを言う。

表面改質剤の化学構造は、親水性ポリマーであることが好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤は、親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質、または、もしくは多糖類のいずれかであることが好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤は、親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質もしくは多糖類のいずれかの類縁体であることが好ましい。

該親水性ポリマーの類縁体としては、親水性ポリマーを長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤は、親水性ポリマーがポリエチレングリコールの場合、BASFから市販されるPluronic（BASFの登録商標）もしくは同等品が好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤のポリアミノ酸としては、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸またはこれらの類縁体が好ましい。とくに、ポリアスパラギン酸もしくはポリグルタミン酸の一部に長鎖アルキル基を導入した類縁体はとくに好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤のタンパク質は、ゼラチン、カゼインまたはアルブミンが粒子の分散性向上のために好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤の多糖類としては、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランが好ましく、特にコレステロール化プルランは、粒子の分散性向上のために好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤の多糖類は、セルロース、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルランもしくはデキストランのいずれかの類縁体が好ましい。

本発明では、表面改質剤は、両親媒性化合物または親水性ポリマーであることが好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤では、両親媒性化合物は、脂質であることが好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤では、両親媒性化合物は、界面活性剤であることが好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤では、界面活性剤としては、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール共重合体、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン性活性剤や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ステアリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩またはレシチンが好ましい。

さらに、本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤は、ペプチド、蛋白質、糖類およびその類縁体が好ましく、例えば、ターゲッティング抗体や塩基性ペプチドが挙げられる。これらのペプチド、蛋白質、糖類は、長鎖アルキルなどの疎水基を部分的に修飾するなどした類縁体や前述の親水性ポリマーや両親媒性化合物を修飾した類縁体が特に好ましい。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の液相中における表面改質剤濃度は、表面改質剤の種類によって異なるが、好ましくは、０．０１〜９０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは、５〜１０％（ｗ／ｖ）である。

本発明の親水性活性物質含有微粒子の表面改質剤の結合量は、好ましくは、粒子重量に対して０．０００１％から１％である。

本発明において、親水性活性物質は、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸または診断用途の造影成分が例示される。また、親水性活性物質としては、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、修飾核酸のいずれかから選択されることが好ましい。また、親水性活性物質が疎水性薬物の場合であっても、可溶化剤などで水溶性とすることで本発明の微粒子に含有させても良い。可溶化剤としては、シクロデキストリンやその類縁体がとくに好ましい。
本発明の親水性活性物質として使用される生理活性タンパクとしては、ペプチドホルモン、生理活性タンパク、酵素タンパク、抗体などがある。例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、アンギオテンシン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ガストリン、成長ホルモン、プロラクチン（黄体刺激ホルモン）、ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）、サイロトロピックホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、プロチレリン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、コルチコトロピン、ソマトロピン、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）、ソマトスタチン（成長ホルモン刺激因子）、視床下部ホルモン（ＧｎＲＨ）、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン類、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）類、ＢＭＰ（骨形成蛋白）類、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、リゾチーム、ワクチン等をあげることができる。これら生理活性タンパクは、天然のタンパクまたはペプチドであっても、その配列の一部を改変した誘導体であっても、ポリエチレングリコールや糖鎖などで修飾したものであっても構わない。核酸としては、カチオン性界面活性剤、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよびそれらの類縁体と複合化したものであってもよい。
本発明により得られる親水性活性物質含有微粒子分散体または親水性活性物質含有微粒子を医薬品組成物として用いるには、両親媒性ポリマー、親水性活性物質、表面改質剤、分散媒の他に製剤学的に有用な各種添加剤を含有していても良く、添加できる添加物は、好ましくは、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖である。

本発明により得られる親水性活性物質含有微粒子分散体または親水性活性物質含有微粒子を含有する医薬品組成物の投与方法および応用分野は、多岐の利用が可能である。例えば、該医薬品組成物は、薬剤を経口投与、非経口投与、経腸投与、経肺投与、局所投与（鼻、皮膚、眼）および体腔投与等に利用できる。

以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものでない。

参考例１ 逆相エマルジョンの形成
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール-ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００もしくは３７,０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに加熱し溶解させた。該ポリマー溶液に、攪拌速度１,６００ｒｐｍで攪拌しつつ、西洋わさびペルオキシダーゼ水溶液（１ｗｔ％西洋わさびペルオキシダーゼ、９ｗｔ％スクロース、１０ｍＭ Tris-HCl pH 7.4） ５０―２００μＬを滴下した。更に１時間攪拌することで逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンの粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。

＜結果＞
最小数平均粒径が２５．１ｎｍに達する逆相エマルジョンが形成された（図１）。ｚ−平均粒径は、検討したポリマー濃度範囲において、２００ｎｍから数ミクロンに渡って変化した。

参考例２ 逆相エマルジョンの形成
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）６０ｍｇを酢酸エチル６００ｍｇに溶解しポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１２０ｍｇの水を添加した。この溶液に１０μLのｔｅｒｔ−ブタノールを添加していき、波長６００ｎｍの光の透過率から濁度の変化を追った（図２）。透過率が９９．７％となったｔｅｒｔ−ブタノール８０μＬの条件でＤＬＳ測定を行い、逆相エマルジョンの粒径を測定したところ、１５．７ｎｍであった。

参考例３ 有機溶媒に分散した親水性活性成分含有固形分の粒径分布
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのフルオロセイン標識デキストラン（ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ）水溶液１４μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌し逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル３ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンション中の固形分の粒径は、（装置Zetasizer ３０００HAS (MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。

＜結果＞Ｓ／Ｏサスペンション中の凍結乾燥体のＺ−平均粒径は５７５ｎｍであった。

実施例１ Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンおよび親水性活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液１４μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μＬに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍＬに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により有機溶媒を除去して、微粒子分散液とした。該微粒子分散液を１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して微粒子を回収した。該微粒子を表面改質剤である１０％Pluronic Ｆ−６８含有水溶液１ｍＬに分散させ、液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。凍結乾燥して得られた微粒子粉末を純水１ｍＬに分散させ、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して微粒子を回収した。回収した微粒子をクロロフォルム２ｍＬに分散させた後、純水を１ｍＬ加えて、微粒子中に含有されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを抽出し、蛍光光度計（HORIBA, Fluoro MAX-3）にてＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎの定量を行った。

〈結果〉
微粒子中に含有されているＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ量を定量した結果、封入率は約３０％と決定された。

実施例２ SPG膜を利用したS/O/W型エマルジョンおよび親水性生理活性物質含有微粒子の製造法
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の分子量３７，０００）１０ｍｇを炭酸ジメチル２００μＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にｔｅｒｔ−ブタノール４０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液２８μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を４００μＬの炭酸ジメチルに分散させた。該分散液を、１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液４ｍＬに滴下し、ボルテックスで撹拌して乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを細孔径９．４μｍの親水性ＳＰＧ膜に膜乳化装置を使用して100kPaで圧入し、液中乾燥により有機溶媒を除去して、微粒子分散液とした。該微粒子分散液中の微粒子の粒径は、（装置Zetasizer ３０００HAS (MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはＣＯＮＴＩＮ法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。また、共焦点レーザー顕微鏡を用いて微粒子観察を行った。

〈結果〉
微粒子分散液中の微粒子のＺ−平均粒径は、４８７ｎｍであり、共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎが封入された微粒子が形成されていることが確認された。

実施例３ S/O/O型エマルジョンおよび親水性生理活性物質含有微粒子の製造法
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液１４μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を２００μＬのジオキサンに分散させた。該分散液を、表面改質剤として１０ｗｔ％のＳｐａｎ８０を含有したグリセロールもしくはオレイン酸１ｍＬに導入した。撹拌後、ジオキサンを減圧留去して親水性活性物質含有微粒子を得た。該微粒子を蛍光顕微鏡で観察したところ、５μｍ以下の微粒子が形成していることが確認された。

実施例４ 親水性生理活性物質含有微粒子の製造法
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μＬに溶解し、５０ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液１４μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μＬに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍＬに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により有機溶媒を除去して、微粒子分散液とした。該微粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。凍結乾燥して得られた微粒子粉末から３０．０ｍｇを秤量し、純水１ｍＬに分散させ、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分間）することで、未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清とＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子を分離・回収した。回収したＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子はジメチルホルムアミド２５０μＬに溶解させることで微粒子を崩壊させ、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎをジメチルホルムアミドに溶解させた。未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清５０μＬと、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含むジメチルホルムアミド 溶液５０μＬを、それぞれMilli-Q3ｍＬに添加し、よく撹拌した後、蛍光分光光度計（HORIBA, Fluoro MAX-3、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いてＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎの定量を行い、全回収量に対する封入率を算出した。

〈結果〉
微粒子中に含有されているＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ量を定量した結果、封入率は約５５％と決定された。

実施例５ 親水性生理活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液１４μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分をポリ（ラクチド-コ−グリコリド）（ラクチド：グリコリド＝５０：５０、分子量４０，０００〜７５，０００）０．５ｍｇを溶解した炭酸ジメチル２００μＬに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを所定濃度のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍＬに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により有機溶媒を除去して、微粒子分散液とした。該微粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。凍結乾燥して得られた微粒子粉末から３０．０ｍｇを秤量し、純水１ｍＬに分散させ、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分間）することで、未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清とＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子を分離・回収した。回収したＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子はジメチルホルムアミド２５０μＬに溶解させることで微粒子を崩壊させ、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎをジメチルホルムアミドに溶解させた。未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清５０μＬと、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含むジメチルホルムアミド 溶液５０μＬを、それぞれMilli-Q3ｍＬに添加し、よく撹拌した後、蛍光分光光度計（HORIBA, Fluoro MAX-3、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いてＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎの定量を行い、全回収量に対する封入率を算出した。

〈結果〉
Ｓ／Ｏサスペンション調製時にポリ（ラクチド-コ−グリコリド）（ラクチド：グリコリド＝５０：５０、分子量４０，０００〜７５，０００）を添加した結果、微粒子中に含有されているＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの封入率が約７５％に向上した。

実施例６ 親水性生理活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）の分子量３７，０００）５ｍｇを炭酸ジメチル１００μＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液１４μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分をポリ（ラクチド-コ−グリコリド）（ラクチド：グリコリド＝７５：２５、分子量７０，０００〜１２０，０００）を１．２５ｍｇ、２．５ｍｇ、３．７５ｍｇ溶解した炭酸ジメチル２００μＬにそれぞれ分散させて、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを所定濃度のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍＬに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により有機溶媒を除去して、微粒子分散液とした。該微粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。凍結乾燥して得られた微粒子粉末から３０．０ｍｇを秤量し、純水１ｍＬに分散させ、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分間）することで、未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清とＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子を分離・回収した。回収したＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子はジメチルホルムアミド２５０μＬに溶解させることで微粒子を崩壊させ、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎをジメチルホルムアミドに溶解させた。未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清５０μＬと、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含むジメチルホルムアミド 溶液５０μＬを、それぞれMilli-Q3ｍＬに添加し、よく撹拌した後、蛍光分光光度計（HORIBA, Fluoro MAX-3、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いてＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎの定量を行い、全回収量に対する封入率を算出した。

〈結果〉
Ｓ／Ｏサスペンション調製時にポリ（ラクチド-コ−グリコリド）（ラクチド：グリコリド＝７５：２５、分子量７０，０００〜１２０，０００）を添加した結果、微粒子中に含有されているＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの封入率が約７０％に向上した。

実施例７ 親水性生理活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーである２種類のポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の分子量４７，０００または分子量６１，０００）５ｍｇを、それぞれ炭酸ジメチル１００μＬに溶解してポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にｔｅｒｔ−ブタノール２０μＬを添加後、１０ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ水溶液２０μＬを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンを液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を炭酸ジメチル２００μＬに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンションを調製した。該Ｓ／Ｏサスペンションを所定濃度のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有水溶液２ｍＬに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンを調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンから液中乾燥により有機溶媒を除去して、微粒子分散液とした。該微粒子分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（EYELA、FREEZE DRYER FD-1000）を用いて、トラップ冷却温度−４5℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。凍結乾燥して得られた微粒子粉末から３０．０ｍｇを秤量し、純水１ｍＬに分散させ、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分間）することで、未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清とＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子を分離・回収した。回収したＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎ封入微粒子はジメチルホルムアミド２５０μＬに溶解させることで微粒子を崩壊させ、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎをジメチルホルムアミドに溶解させた。未封入ＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含む上清５０μＬと、封入されていたＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎを含むジメチルホルムアミド 溶液５０μＬを、それぞれMilli-Q3ｍＬに添加し、よく撹拌した後、蛍光分光光度計（HORIBA, Fluoro MAX-3、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を用いてＦＩＴＣ-Ｄｅｘｔｒａｎの定量を行い、全回収量に対する封入率を算出した。

〈結果〉
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）を用いて調製した微粒子中に含有されているＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ量を定量した結果、封入率が約８０％に向上した。

逆相エマルジョンの形成：ポリマー組成、添加水量の粒径への影響 逆相エマルジョンの形成：ｔｅｒｔ−ブタノール添加時の濁度変化

Claims (12)

1. 両親媒性ポリマーを含み、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントから成る親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントから成る疎水性外層とから成り、疎水性外層に表面改質剤が結合した親水性活性物質含有微粒子を製造する方法であって、
   （ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒を混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
   （ｂ）逆相エマルジョンから溶媒を除去して親水性活性成分含有固形分を得る工程
   （ｃ）親水性活性成分含有固形分または親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入する工程
   を含む親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
2. 逆相エマルジョンから溶媒を除去する方法が、凍結乾燥法である請求項１記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
3. 親水性活性成分含有固形分分散液の分散媒が、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントまたは親水性セグメントのいずれかを実質的に溶解しない溶媒である請求項１〜２に記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
4. 液相が水系溶媒または水混和性有機溶媒である請求項１〜３記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
5. 親水性活性成分含有固形分分散液を多孔質膜を透過させて、表面改質剤を含む液相に導入することを特徴とする請求項１〜４に記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
6. 親水性活性成分含有固形分分散液を、表面改質剤を含む液相に導入し、さらに当該懸濁液を多孔質膜に透過させることを特徴とする請求項１〜４に記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法
7. 逆相エマルジョンの平均粒径が、１０〜５００ナノメートルである請求項１〜６のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
8. 逆相エマルジョンの平均粒径が、１０ナノメートル〜１００マイクロメートルである請求項１〜６のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
9. 両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが生分解性ポリマーを含み、親水性セグメントがポリエチレングリコールまたはデキストランを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
10. 両親媒性ポリマーが、ブロック構造、グラフト構造またはブランチ構造のいずれかの構造を有するコポリマーである請求項１〜９のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
11. 表面改質剤が、両親媒性化合物または親水性ポリマーである請求項１〜１０のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
12. 親水性活性物質含有微粒子の平均粒径が、５０ナノメートル〜５０マイクロメートルである請求項１〜１１のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法

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