BRPI1005855A2 - vacina recombinante para helmintos em pichia pastoris, e, processos de produÇço e purificaÇço de proteina como vacina para helmintos - Google Patents

Abstract

VACINA RECOMBINANTE PARA HELMINTOS EM PICHIA PASTORIS, E, PROCESSOS DE PRODUÇçO E PURIFICAÇçO DE PROTEÍNA COMO VACINA PARA HELMINTOS. A presente invenção esta relacionada ao campo de produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pa.storis. Mais especificamente, a invenção descreve a produção de proteína Sm14 Schistosoma mansoni em forma recombinante, onde foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sm14 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir uma vacina eficazmente. Também foram aperfeiçoados os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

Description

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VACINA RECOMBINANTE PARA HELMINTOS EM PICHIA PASTORIS, E,

PROCESSOS DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA COMO VACINA PARA HELMINTOS

Canpo de Aplicação

A presente invenção esta relacionada ao campo de produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pastoris. Mais especificamente, a invenção descreve a produção de proteína Sml4 do Schistosoma mansoni em forma recombinante, onde foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sml4 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir uma vacina eficazmente. Também foram aperfeiçoados os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial. Fundamentos da Invenção

A proteína Sml4 que tem um peso molecular aproximado de 14,8 kDa e apresenta um significativo grau de identidade com as proteínas que pertencem à família de proteínas que se ligam a ácidos graxos, já foi amplamente estudada e descrita pelo depositante em seus pedidos de patente anteriores.

A estrutura tridimensional da proteína Sml4 foi prevista através de modelagem molecular por homologia computadorizada assim como por cristalografia e Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura da proteína Sml4 permitiu a identificação dos epítopos protetores em potencial e, possibilitou o uso do rSml4 como antígeno de vacinação. A estrutura da proteína Sml4f assim como os modelos construídos para as proteínas homólogas de Fasciola hepática (sendo a FABP tipo 3 a que compartilha maior identidade seqüencial, 4 9%) mostram que estas moléculas adotam configurações tridimensionais semelhantes às moléculas de outros membros da família de proteínas que se ligam a lipídeos ("Fatty Acid Binding Proteins" - FABP).

Assim, com base em todo o estado da arte de conhecimento dos inventores, será demonstrada aqui a capacidade que as formas recombinantes da proteína Sml4 tem de conferir uma alta proteção contra infecções causadas por helmintos supostamente patogênicos em relação a humanos e animais.

Nos trabalhos que mostraram pela primeira vez a atividade protetora da proteína Sml4, a proteína recombinante correspondente era expressa com o vetor pGEMEX-Sml4, em forma de corpúsculos de inclusão. Após o isolamento e lavagem dos corpúsculos, a proteína era purificada através de eletroforese preparativa por eletroeluição da banda correspondente (Tendler et al., 1996). Essa metodologia, entretanto, não era adequada para produção da proteína em escala maior. Posteriormente, a proteína Sml4 passou a ser produzida com uma fusão de seis histidinas consecutivas (6xHis) no extremo amino terminal no sistema de expressão de Escherichia coli, na forma de corpúsculos de inclusão. Após a obtenção e solubilização dos corpúsculos era necessário fazer o re-enovelamento (refolding), para obter uma proteína funcional imunologicamente ativa (Ramos et al., 2001).

e Assim, verifica-se que apesar de todo o conhecimento

adquirido pelos inventores, ainda existem desvantagens a

serem superadas para a obtenção de um material antigênico

que possa ser obtido com alto rendimento, em escala

industrial em condições de GMP, e que não perca a característica de estabilidade. Sumário da Invenção

A presente invenção propõe uma plataforma produtora de vacina recombinante para helmintos em Pichia pastoris. Através da referida plataforma é possível alcançar uma vacina recombinante para helmintos (em P. pastoris) , incluindo os processos de produção e purificação da proteína Sml4 desenvolvida no sistema de Pichia pastoris.

A invenção propõe ainda um gene sintético para a expressão da proteína Sml4. A transformação genética de Pichia pastoris com este gene sintético sob controle do promotor AOXl permite produzir e purificar a proteína Sml4.

Assim, a invenção permite a obtenção da proteína Sml4 a partir de um gene sintético contendo códons otimizados para a alta expressão em Pichia pastoris, SEQ ID NO: 3 (seqüência final do gene), assim como os procedimentos de purificação da proteína Sml4. Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a estratégia para a construção do plasmídeo pPIC9K-Sml4-MV.

A Figura 2 mostra a clonagem de Sml4-MV em pPIC9K.

Figura 3 mostra a análise por PCR de clones de P. pastoris. A Figura 4 mostra a indução da expressão da proteína Sml4 nos clones P. pastoris GS115/pPIC9K-Sml4-MV.

A Figura 5 mostra a indução da expressão da proteína Sml4 em P. pastoris GS115/pPIC9K-Sml4-MV.

A Figura 6 mostra o resultado da purificação da

proteína Sml4.

A Figura 7 mostra o resultado do cromatograma da gel- filtração da proteína Sml4-MV produzida em P. pastoris.

A Figura 8 mostra a análise por western blot da proteína purificada de P. pastoris.

A Figura 9 mostra o espectro de dicroísmo circular da proteína Sml4 purificada de P. pastoris. Descrição Detalhada da Invenção

O objetivo principal da presente invenção, qual seja, produzir uma vacina recombinante para helmintos,

alcançável através da produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pastoris. De acordo com a invenção foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sml4 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir a vacina de forma eficaz. A presente invenção contempla ainda os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

0 sistema de expressão na levedura metilotrófica Pichia pastoris apresenta importantes vantagens quando comparado aos sistemas baseados em E. coli, para a produção de proteínas recombinantes em escala industrial. Dentre

e essas vantagens podemos citar, por exemplo, a estabilidade das cepas transformadas, alta expressão, cultura em alta densidade celular, facilidade para o escalonamento da cultura, não apresenta perigo para a saúde humana, e não produz endotoxinas (Fabe et al., 1995). Esta última vantagem, sendo um dos fatores que influenciaram na mudança do micro-organismo para expressão da proteína, pois, a necessidade de detecção ou quantificação das endotoxinas produzidas por bactérias Gram-negativas a cada lote, seria um fator limitante, visto que, produtos gerados em E.coli que serão posteriormente aplicados em humanos, deverão estar livres de endotoxinas bacterianas. Esta exigência adicional dificultaria os processos de produção com E. coli o que impacta negativamente no custo final de produção.

A invenção será agora descrita através de sua melhor forma de realização.

1. OBTENÇÃO DA CEPA RECOMBINANTE DE PICHIA PASTORIS

1.1 Gene sintético para a expressão da proteina Sml4 em P. pastoris:

Num primeiro passo foi desenhado e sintetizado um gene contendo códons otimizados para se obter máxima expressão da proteina Sml4 em P. pastoris. No presente caso foi utilizada a proteína Sml4-MV, entretanto pode ser utilizada qualquer forma da proteína Sml4.

Na literatura existe evidência sobre o uso diferencial de códons entre proteínas expressas em pouca quantidade e em alta quantidade, num mesmo organismo (Roymondal and Sahoo, 2009). Porém, as tabelas de uso de códons disponíveis em bases de dados (por exemplo: (www.kazusa.or.jp/codon) contém dados de todas as proteínas do organismo, sem levar em consideração o nível de expressão gênica. Por este motivo, para o desenho do gene, inicialmente foi elaborada uma tabela de uso de códons

tendo como base de dados de seqüências que codificam as proteínas recombinantes expressas acima de 1 grama por Litro de cultura em P. pastoris (ver tabela 1), assim como a seqüência "da proteína AOXl (que representa 30% da proteína total da P. pastoris, após a indução com metanol).

0 Tabela 1: Lista de proteínas recombinantes com alta expressão em P. pastoris.

Proteína expressa (mg/L) Referencia Hydroxynitrile lyase 22000 Hasslacher, M. et al. (1997) Protein Expr. Purif. 11: 61-71 Mouse gelatin 14800 Werten, M.W. et al. (1999) Yeast 15: 1087-1096 Tetanus toxin fragment C 12000 Clare, J.J. et al. (1991) Bio/Technology 9: 455-460 Hiaman tumor necrosis factor 10000 Sreekrishna, K. et al. (1989) Biochemistry 28: 4117-4125 a-amylase 2500 Paifer, E. et al. (1994) Yeast 10: 1415-1419 T2A peroxidase 2470 Thomas, L. et al. (1998) Can. J. Microbiol. 44: 364-372 Catalase L 2300 Calera, J.A. et al. (1997) Infect. Immun. 65: 4718-4724 Hirudin 1500 Rosenfeld, S.A. et al. (1996) Protein Expr. Purif. 8: 476-482. Para o desenho do gene foi escolhida a seqüência da proteína Sml4-mv, que tem um resíduo de valina na posição 62 - no lugar da cisteína, que a torna mais estável (Ramos et al., 2009), aqui representada como SEQ ID no:l. SEQ ID NO: 1

mssflgkwkl seshnfdavm sklgvswatr qigntvtptv tftmdgdkmt mltestfknl svt fkfgee f dekts dgrnv ksweknses kltqtqvdpk nttvivrevd gdtmkttvtv gdvtairnyk rls

Após uma primeira seleção dos códons segundo a tabela criada com os dados das proteínas da Tabela 1, foi realizada uma depuração de seqüências que resultaram em sítios de terminação de transcrição (ATTTA) doadores e receptores crípticos de splicing (MAGGTRAGT e YYYNTAGC, respectivamente) e seqüências repetitivas (sítios de corte para as enzimas de restrição BamHI e EcoRI). A SEQ ID NO:2 mostra a seqüência desenhada para expressar a proteína Sml4-MV em Pichia pastoris. SEQ ID NO:2

1 atgtcttctt tcttgggtaa gtggaagttg tctgaatctc acaacttcga 51 cgctgttatg tctaagttgg gtgtttcttg ggctaccaga caaattggta 101 acaccgttac tccaaccgtt accttcacca tggacggtga caagatgact 151 atgttgaccg agtctacctt caagaacttg tctgttactt tcaagttcgg 201 tgaagagttc gacgaaaaga cttctgacgg tagaaacgtt aagtctgttg 251 ttgaaaagaa ctctgaatct aagttgactc aaactcaagt tgacccaaag 301 aacactaccg ttatcgttag agaagttgac ggtgacacta tgaagactac 351 tgttaccgtt ggtgacgtta ccgctatcag aaactacaag agattgtctt 401 aa

Na extremidade 5' da seqüência desenhada foi adicionada a seqüência Kozak do gene da proteína AOXl de P. pastoris (AAACG). Finalmente foram adicionados os sítios de restrição para BamHI (GGATCC) e EcoRI (GAATTC) nas extremidades 5' e 3' do gene desenhado, respectivamente.

A SEQ ID NO:3 mostra a seqüência final do gene sintético para a produção da proteína Sml4. SEQ ID NO:3

1 GGATCCAAAC GATGTCTTCT TTCTTGGGTA AGTGGAAGTT GTCTGAATCT 51 CACAACTTCG ACGCTGTTAT GTCTAAGTTG GGTGTTTCTT GGGCTACCAG 101 ACAAATTGGT AACACCGTTA CTCCAACCGT TACCTTCACC ATGGACGGTG 151 ACAAGATGAC TATGTTGACC GAGTCTACCT TCAAGAACTT GTCTGTTACT 201 TTCAAGTTCG GTGAAGAGTT CGACGAAAAG ACTTCTGACG GTAGAAACGT 251 TAAGTCTGTT GTTGAAAAGA ACTCTGAATC TAAGTTGACT CAAACTCAAG 301 TTGACCCAAA GAACACTACC GTTATCGTTA GAGAAGTTGA CGGTGACACT 351 ATGAAGACTA CTGTTACCGT TGGTGACGTT ACCGCTATCA GAAACTACAA 401 GAGATTGTCT TAAGAATTC

Após a síntese da seqüência desenhada (SEQ ID NO: 3) foi realizada a clonagem e posterior seqüenciamento do gene sintético no vetor pCR2.1 para confirmação da fidelidade da seqüência sintetizada com a seqüência desenhada. 1.2 Construção do plasmídeo para a expressão da proteína Sml4 em Pichia pastoris:

0 gene sintetizado foi clonado no vetor pPIC9K, onde a proteína Sml4 é expressa sem fusão nenhuma, possibilitando sua produção intracelular.

O vetor pPIC9K (Invitrogen) foi escolhido para a construção do plasmídeo de expressão da Sml4 em P. pastoris pelos seguintes motivos:

(1) Possibilidade de ser utilizado para expressar proteínas intracelulares substituindo o gene do fator-alfa pelo gene de interesse, a través do sítio de restrição BamHI do vetor, situado antes da seqüência Kozak e do início de tradução. Para isso, foi necessário recriar a seqüência Kozak antes do ATG da ORF a ser expressa, como realizado no desenho do gene sintético da Sml4.

(2) Possui a vantagem de poder selecionar clones com múltiplas cópias integradas no genoma, pela seleção de resistência contra o antibiótico G418. Essa possibilidade não existia no pPIC9, usada anteriormente.

A estratégia da construção do plasmídeo pPIC9K-Sml4 esta descrita na Figura 1.

Com o plasmídeo pCR21-Sml4-MV, foi transformada a cepa DH5cc de E. coli, para sua propagação. Posteriormente o pDNA foi purificado com o Qiaprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Este plasmídeo, assim como o vetor pPIC9K foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI (ambas da New England Biolabs) simultaneamente. Após a digestão, os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio. Os fragmentos correspondentes ao vetor pPIC9K e ao inserto Sml4-MV sintético foram excisados do gel de agarose e purificados com o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Os fragmentos purificados foram ligados usando a T4 DNA ligase (New England Biolabs) . A cepa DH5a de E. coli, foi transformada com a reação de ligação e os clones foram selecionados em meio LB ágar contendo ampicilina. O ρDNA de alguns clones resistentes a ampicilina foi purificado e analisado por restrição com as enzimas BamHI e EcoRI, mostrado na Figura 2. Na Figura 2 é mostrado o resultado da clonagem de Sml4-MV em pPIC9K, onde a seleção de clones foi conforme a seguir:

M.- IKb DNA ladder + phiX174/HaeIII

1.- pPIC9K/BamHI + EcoRI

2.- pCR21-Sml4-MV/BamHI + EcoRI

3 a 11.- Clones pPIC9K-Sml4-MV/ BamHI + EcoRI.

Na Figura 2 as setas marcam a posição de inserto e vetor da clonagem.

Os clones que apresentaram a banda correspondente ao inserto foram selecionados e sequenciados com o primer A0X5' para confirmar o sucesso da clonagem e a fidelidade da seqüência. Desta forma, a seqüência sintética para a expressão da proteína Sml4 ficou sob controle do forte promotor da álcool oxidase 1 (AOXl), que é induzido pelo metanol (Cregg et al.r 1993).

1.3 Transformação da P. pastoris com o plasmídeo pPIC9K- Sml4-MV e seleção de clones recombinante com múltiplas cópias

Para a produção da proteína a cepa GS115 (his4) de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo pPIC9K-Sml4. 0 plasmídeo pPIC9K-Sml4-MV foi purificado com o kit Maxiprep(Qiagen). 0 DNA plasmideal foi digerido separadamente com as enzimas BglII e SacI (New England Biolabs), usando 20 pg de DNA para cada reação. As reações de digestão foram separadas por eletroforese em gel de agarose e bandas com os fragmentos de DNA contendo a gene sintético da Sml4-MV foram cortados do gel e o DNA purificado. Células competentes para eletroporação da cepa GS115 foram preparadas e transformadas separadamente com o DNA purificado das reações de restrição para BglII e SacI (10 Ug de ρDNA por cada transformação). A digestão com a enzima BglII dirige a recombinação do cassete de expressão no gene da AOXl, no genoma da P. pastoris, enguanto que a digestão com SacI pode se integrar em outras regiões.

Após a transformação, as células foram semeadas no meio RD (meio sem histidina, que contém: 1 M sorbitol; 2% dextrose; 1,34% YNB; 4xl0~5% biotina; e 0, 005% de cada aminoácido: L-glutamato, L-methionina, L-lisina, L-leucina, e L-isoleucina para a seleção das cepas transformadas pelo marcador de auxotrofia his4. Os clones que conseguiram crescer no meio sem histidina, foram submetidos à seleção com o antibiótico G418, nas concentrações 0,5; 1; 2 e 4 mg/ml no meio de cultura YPD (1% Extrato de Levedura, 2% Peptona; 2% dextrose) a 300C em placas de microcultura. Apenas os clones transformados com o plasmideo pPIC9K-Sml4- MV digerido com a enzima SacI conseguiram crescer com o G418 na concentração 4 mg/ml, que caracteriza a inserção de múltiplas cópias do cassete de expressão no genoma de P. pastoris.

Para confirmar se os clones selecionados apresentavam o cassete de expressão do gene sintético, o DNA genômico de 17 clones foi purificado e usado em reações de PCR com os primers A0X5' e AOX3'. 0 plasmideo pPIC9K-Sml4-MV foi usado como controle positivo. A Figura 3 mostra a análise por PCR de clones de P. pastoris GS115 transformados com pPIC9K- Sml4-MV e selecionados com 4mg/ml de G418. Μ. - phiX174/HaeIII

1 a 17. - Clones GS115/pPIC9K-Sml4-MV

18. - Controle positivo: plasmídeo pPIC9K-Sml4-MV.

Como demonstrado na Figura 3, todos os clones selecionado com 4 mg/ml de G418 apresentaram a seqüência Sm14-MV sintético.

Para testar a expressão da proteina Sml4, os clones

foram crescidos em meio BMG (Buffered Minimal Glycerol

médium, contendo: If34% YNB; 0,04% biotina, 0,1 M fosfato

de potássio pH 6,0; e 1% glicerol) por 48 horas e depois

transferidos ao meio BMM (Buffered Minimal Methanol médium,

contendo os mesmos componentes que o meio BMG, porém o

glicerol foi substituído por 0,5% de metanol e adicionado

EDTA para concentração final de ImM) , para a indução da

expressão da proteina recombinante. Após 72 horas,

adicionando 0,5% de metanol cada 24 horas, as proteínas

totais de cada clone foram analisadas por SDS-PAGE (Figura

4). A Figura 4 mostra o resultado da indução da expressão

da proteína Sml4 nos clones P. pastoris GS115/pPIC9K-Sml4- MV.

M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

1. - Controle positivo proteína Sml4 sem fusão purificada de E. coli

2 a 18. - Proteína total dos clones 1-17 GS115/pPic9K- Sml4-MV apos a indução com metanol.

1.4 Indução da expressão da Sml 4 recombinante em P. pastoris GS115/ pPIC9K-Sml4-MV A Figura 5 mostra a indução da expressão da proteína Sml 4 em P. pastoris GS115/pPIC9K-Sml4-MV, onde: M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

1.- Amostra não induzida, no meio BMG

2 a 7.- Indução da expressão por O, 24, 48, 72 e 91 horas, respectivamente, no meio BMM

8.- Controle positivo proteína Sml4 sem fusão purificada de E. coli

Em todos os clones selecionados foi possível observar uma banda majoritária que coincide com o tamanho da proteína Sml4 sem fusão, purificada de E. coli.

Para confirmar se a proteína foi induzida pelo metanol, o clone n° 1 foi crescido no meio BMG por 4 8 horas (Figura 5, canaleta 1) a 250 rpm, a 30°C e e posteriormente foi transferido para o meio BMM (0,5% de metanol). Foram coletadas amostras de diferentes intervalos de tempo (Figura 5, canaletas 2 a 7) . Cada 24 horas o metanol foi adicionado na cultura, para a concentração final de 0,5%.

Como é possível observar na Figura 5, no meio BMG não se obteve a expressão da proteína induzida com o metanol (Figura 5, canaleta 1), assim como no tempo zero com o meio indutor BMM (Figura 5, canaleta 2) . A indução foi visível após 24 horas de cultura no meio BMM e foi estável durante o crescimento celular, até as 91 horas que foi o prazo de duração do experimento.

Desta forma, foi comprovada a indução especifica da proteína recombinante correspondente a Sml4 em P. pastoris. No experimento, usando apenas meio BMM e metanol a 0,5%, foi possível atingir um rendimento de 26 gramas de massa celular úmida por litro de cultura, mantendo um bom nível de expressão da proteína Sml4, que compõe a proteína majoritária das células após a indução com metanol. Através do uso de um fermentador e meios mais apropriados para a produção de proteínas recombinantes em P. pastoris, é possível atingir tanto uma maior massa celular, assim como ter uma maior expressão da Sml4.

2. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA SMl 4 RECOMBINANTE EXPRESSA NA CEPA P. pastoris GS115/ pPIC9K-Sml4-MV

O protocolo de purificação da proteína Sml4

recombinante a partir do citoplasma de P. pastoris foi

baseado na metodologia desenvolvida no Laboratório de

Esquistossomose Experimental do Instituto Oswaldo Cruz

(IOC) para a purificação da Sml4 sem fusão no sistema de E. coli.

Lise: A purificação da proteína recombinante se inicia com a Iise das células de p. pastoris. Para isso, as células são ressuspendidas 30mM Tris-HCl 30mM pH 9,5 e lisadas no French press. O lisado é clarificado por centrifugação (Figura 6, canaleta 2).

Captura: O lisado clarificado é carregado na resina Q- Sepharose XL (GE Healthcare) equilibrada com o'tampão A (30 mM Tris-HCl pH 9,5). Toda a proteína Sml4 do lisado é absorvida pela resina, pois não se tem a proteína Sml4 no material não absorvida na resina (Figura 6, canaleta 3). Depois de carregar a proteína, a coluna é lavada com tampão A. A proteína é eluída com tampão B (30 mM Tris-HCl pH 8,0), no sistema AKTA-fplc (GE Healthcare) (Figura 6, canaletas 4 -6).

Polimento: A proteína eluída da resina Q-sepharose XL apresenta poucas proteínas contaminantes. Para separar estas proteínas da proteína Sml4f foi usada a gel- filtração. Para isso, as frações da cromatografia de troca iônica contendo a proteína Sml4 foram reunidas e concentradas na membrana Centriprep YM-IO (Millipore) e o material foi aplicado na coluna Sephacryl SlOO HR 26/60 (GE Healthcare) usando PBS pH 7,4 como fase móvel. A pico cromatográfico (Figura 6, canaleta 8) apresentou um volume de retenção idêntico à proteína sem fusão produzida em E. coli (figura 7).

A Figura 6 mostra o resultado da purificação da proteína Sml4, onde

M.- Low Molecular Weight marker (Marcador de baixo peso molecular)

1.- Controle positivo proteína Sml4 sem fusão purificada de E. coli

2.- Lisado clarificado, 2.- Proteínas não absorvidas na resina Q-sepharose XL

3-6,- Frações eluidas de resina Q-sepharose XL

7.- Pool das frações da cromatográfica de troca iônica

8.- Pico da gel-filtração na coluna sephacryl S-IOO HR 26/60

A Figura 7 mostra o resultado do cromatograma da gel- filtração da proteína Sml4-MV produzida em Pichia pastoris. 4 - ANÁLISE DA PROTEÍNA Sml 4 RECOMBINANTE PRODUZIDA EM Pxchia pastoris A proteína recombinante foi purificada de Pichia pastoris, usando as mesmas características físico-químicas que a proteína Sml4-MV sem fusão expressa em E. coli. A proteína purificada desta forma de P. pastoris corresponde em tamanho com a proteína induzida especificamente pelo metanol. Sendo que no cassete de expressão temos o gene sintético da proteína Sml4-MV sob controle do promotor AOXl, deduzimos que a proteína expressa e purificada de P. pastoris é a proteína Sml4-MV.

Para comprovar esta afirmação, a proteína purificada de P. pastoris foi analisada por western blot, usando soro anti-Sml4 de coelho (Figura 8). A Figura 8 representa a análise por western blot da proteína purificada de P. pastoris.

1 e 2.- Proteína Sml4-MV purificada de P. pastoris

3.- Controle positivo proteína Sml4 sem fusão purificada de

E. coli.

Neste experimento foi possível observar que os anticorpos anti-Sml4 reconheceram especificamente a proteína purificada de P. pastoris (o soro dos coelhos não reconhece proteínas endógenas de P pastoris, dados não mostrados), confirmando de esta forma sua identidade.

Por fim foi necessário identificar se a proteína purificada de P. pastoris possui estrutura correspondente ao enovelamento beta, característico das proteínas da família das Fatty Acid Binding Proteinf à qual a Sml4 pertence. Para isso, as amostras de proteínas foram analisadas por dicroísmo circular, usando o espectrofotopolarímetro J-815 (JASCO) (Figura 9). A Figura 9 mostra o espectro de dicroísmo circular da proteína Sml4 purificada de P. pastoris.

Como se observa na Figura 9, o espectro corresponde a uma proteína com estrutura beta. Este espectro foi semelhante a os espectros de dicroísmo circular de lotes da proteína Sml4 purificados anteriormente de E. coli no laboratório de Esquistossomose Experimental.

Assim, a partir do relato acima podemos concluir que a presente invenção permite:

desenhar e sintetizar um gene sintético para a alta expressão da proteína Sml4-MV em Pichia pastoris;

construir um plasmídeo de expressão pPIC9K-Sml4-MV que contém a seqüência do gene sintético sob controle do promotor AOXl;

obter uma cepa de P. pastoris produtora da proteína Sml4; e,

purificar a proteína Sml4 em duas etapas cromatográficas, factíveis de escalonamento para sua produção industrial.

Portanto, a presente invenção aqui descrita mostra que a proteína Sml4 confere proteção contra a infecção por Schistosoma mansoni em camundongos, nas plataformas E. coli e P. pastoris. REFERENCIAS

(1) Cregg, J.M., Vedvick, T.S. and Raschke, W.C.. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. BioTechnology v. 11, p. 905-910, 1993. (2) Faber, Κ.N., Harder, W., and Veenhuis, Μ. Review: Methylotropic Yeasts as Factories for the Production of Foreign Proteins. Yeast. v. 11, p. 1331-1344, 1995.

(3) Ramos, C.R., Spisni, A., Oyama, S.Jr., Sforça, M.L., Ramos, H.R, Vilar, M.M., Alves, A.C., Figueredo, R.C., Tendler, M., Zanchin, N.I., Pertinhez, T.A., Ho, P.L. Stability improvement of the fatty acid binding protein Sml4 from S. mansoni by Cys replacement: structural and functional characterization of a vaccine candidate. Biochim Biophys Acta. v. 1794, p. 655 - 662, 2009.

(4) Ramos, C.R., Vilar, M.M., Nascimento, A.L., Ho, P.L., Thaumaturgo, N., Edelenyi, R., Almeida, M., Dias, W.O., Diogo, C.M., Tendler, M. r-Sml4 - pRSETA efficacy in experimental animais. Mem Inst Oswaldo Cruz.v. 96, p.131 - 135, 2001.

(5) Roymondal, U.D. and Sahoo, S.S. Predicting gene expression levei from relative codon usage bias: an application to Escherichia coli genome. DNA Res. v. 16, p. 13 - 30, 2009.

(6) Tendler, M., Brito, C.A., Vilar, M.M., Serra-Freire, N., Diogo, C.M., Almeida, M.S., Delbem, A.C., Da Silva, J.F., Savino, W., Garratt, R.C., Katz, N., Simpson, A.S. A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sml4, is the potential basis of a dual-purpose anti-helminth ' vaccine. Proe Natl Aead Sei USA. v. 93, p. 269 - 273, 1996.

Claims (6)

1. Gene sintético caracterizado por possuir a SEQ ID NO: 3.

2. Processo de produção de proteína Sml 4 recombinante em Pichia pastoris caracterizado por: (a) sintetizar o gene definido pela SEQ ID NO:3 (b) clonagem do gene sintetizado no vetor pPIC9K, pelo sitio de BamHI e reconstituindo a seqüência Kozak do gene AOXl antes do códon de início da proteína Sml4, para expressão de proteína Sml 4 em forma intracelular.; (c) transformação da P. pastoris com o plasmídeo pPIC9K-Sml4-MV e seleção de clones recombinante com múltiplas cópias;

3. Processo de purificação de proteína recombinante expressa em Pichia pastoris caracterizado por consistir nas seguintes etapas: (a) efetuar a Iise das células de P. pastoris (b) clarificar o lisado obtido na etapa (a) (c) carregar o lisado clarificado em resina de troca aniônica e depois de carregar a proteína, a proteína é eluída por troca de pH na coluna. (d) separar as proteínas contaminantes da proteína recombinante por gel-filtração.

4. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por ser aplicado para a purificação de proteínas ligadoras de ácidos graxos de outros parasitas com propriedades físico-químicas semelhantes à proteína Sml4, como é o caso da proteína FABP tipo 3 de Fasciola hepática.

5. Uso da proteína expressa em Pichia pastoris caracterizado por ser como agente terapêutico, vacinai, e de diagnóstico.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por ser no tratamento de infecções causadas por helmintos, em especial contra esquistossomose, fasciolose, equinococose e outras helmintoses de importância humana e veterinária.