MX2013003005A - Gen sintético para expresión de schistosoma mansoni-14 en pichia pastoris, procedimientos de producción de schistosoma mansoni-14 y su uso como vacuna y medio de diagnóstico. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la producción de proteínas recombinantes usando un gen sintético para una expresión aumentada de la proteína en Pichia pastoris; más específicamente, la invención describe la producción de una proteína recombinante de Sm14 de Schistosoma mansoni; al proporcionar un gen sintético para una producción aumentada de la proteína de Sm14, produciendo este gen y manipular genéticamente la cepa de Pichia pastoris con dicho gen para producir una vacuna de forma efectiva; también se proporcionan métodos mejorados para producir y purificar esta proteína a partir de células de P. pastoris, que se pueden modular para producción industrial.

Description

GEN SINTÉTICO PARA EXPRESIÓN DE SCHISTOSOMA MANSONI-W EN PICHIA PASTORIS, PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCIÓN DE SCHISTOSOMA MANSONI-U Y SU USO COMO VACUNA Y MEDIO DE DIAGNÓSTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la producción de proteína recombinante utilizando un gen sintético asociado con la expresión de proteínas superiores en Pichia pastorís. Más específicamente, esta invención describe la producción de la proteína recombinante de Schistosoma mansoni Sm14. Se creó un gen sintético para promover la expresión elevada de Sm14, y con este gen se obtuvo y manipuló genéticamente una cepa de Pichia pastorís para producir una vacuna de forma eficaz. También se ha mejora la producción de esa proteína y los procesos de purificación de células de P. pastorís; la producción industrial de tales procesos puede planificarse.

Fundamentos de la invención El peso molecular de la proteína Sm14 es aproximadamente 14.8 kDa y es apreciablemente semejante a proteínas que pertenecen a la familia de proteínas que se une a ácidos grasos. El solicitante la ha estudiado y descrito extensamente en sus solicitudes de patentes anteriores.

La estructura tridimensional de la proteína Sm14 fue pronosticada mediante modelado molecular por homología computarizada, asi como por cristalografía y resonancia magnética nuclear. La estructura de la proteína Sm1 permitió identificar epítopos protectores potenciales y permitió utilizar rSm14 como un antígeno de vacunación.

La estructura de Sm1 , así como los modelos construidos para proteínas homologas de Fasciola hepática (FABP tipo 3 es la de mayor identidad de secuencia compartida, 49%) muestra que aquellas moléculas adoptan configuraciones tridimensionales que son semejantes a moléculas de otras familias de proteínas que se unen a lípídos (proteínas de unión a ácido -FABP).

Por lo tanto, con base en el conocimiento de todo el estado de la técnica recopilado por los inventores, se demostrará aquí cómo las formas recombínantes de Sm14 pueden proporcionar una protección significativa contra infecciones causadas por helmintos patógenos en relación con humanos y animales.

En documentos que demostraron la actividad protectora de Sm14 por primera vez, la correspondiente proteína recombinante fue expresada con el vector pGEMEX-Sm14 como cuerpos de inclusión. Después que los cuerpos fueron aislados y lavados, la proteína se purificó por electroforesis preparativa de la banda correspondiente (Tendler et al., 1996) por electroelución. Sin embargo, esta metodología no fue adecuada para producir proteínas en una escala más grande. Más tarde, Sm1 comenzó a ser producido con una fusión de seis histidinas consecutivas (6xHis) en la amino-terminal de extremo del sistema de expresión de Escherichia coli , como cuerpos de inclusión. Después de obtener y solubilizar los cuerpos, fue necesario el repliegue para obtener una proteína funcional e ¡nmunológicamente activa (Ramos et al., 2001).

Por lo tanto, a pesar de todo el conocimiento recopilado por los inventores, todavía hay desventajas a superarse para obtener el material antigénico que puede obtenerse con alto rendimiento, a escala industrial y bajo condiciones de BPM, y que no perderá su característica de estabilidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención propone una plataforma para producir una vacuna recombinante contra helmintos en Pichia pastoris. A través de la plataforma antedicha es posible obtener una vacuna recombinante contra helmintos (en P. pastoris), incluyendo los procesos de producción y purificación de Sm14 desarrollado en el sistema de Pichia pastoris.

La invención también propone un gen sintético para la expresión de la proteína Sm14. La transformación genética de Pichia pastoris con este gen sintético bajo control del promotor AOX1 permite producir y purificar Sm14.

Por lo tanto, la invención permite obtener Sm14 de un gen sintético que contiene codones optimizados para la expresión elevada en Pichia pastorís, SEO. ID NO: 3 (secuencia final de gen), así como procedimientos de purificación de Sm14.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la estrategia para construir el plásmido pPIC9K-Sm14-MV.

La figura 2 muestra la clonación de Sm14-MV en pPIC9K.

La figura 3 muestra el análisis de PCR de clones de P. pastorís . La figura 4 muestra la inducción de la expresión de Sm14 en los clones de P. pastorís GS1 15/pPIC9K-Sm14-MV.

La figura 5 muestra la inducción de la expresión de Sm14 en P. pastorís GS115/pPIC9K-Sm14-MV.

La figura 6 muestra los resultados de la purificación de Sm14. La figura 7 muestra los resultados del cromatograma con filtración de gel de la proteína Sm14-MV producida en P. pastorís.

La figura 8 muestra un análisis Western blot de la proteína purificada de P. pastorís.

La figura 9 muestra el espectro de dicroísmo circular de la proteína purificada Sm14 de P. pastorís.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El principal propósito de esta invención es producir una vacuna recombinante contra helmintos. Este objetivo puede lograrse produciendo proteínas recombinantes utilizando un gen sintético para la expresión de proteína superior en Pichia pastorís. Según la invención se creó un gen sintético para promover la expresión superior de Sm14, y con este gen se obtuvo una cepa de Pichia pastorís para producir una vacuna de forma eficaz. Esta invención también incluye los procesos de producción y de purificación de células de P. pastorís; tales procesos pueden planificarse para producción industrial.

El sistema de expresión en la levadura metilotrófica Pichia pastorís tiene ventajas significativas cuando se compara con sistemas basados en E. coli para producir proteínas recombinantes a escala industrial. Entre tales ventajas se puede mencionar, por ejemplo, la estabilidad de cepas transformadas, expresión superior, cultivo con densidad celular elevada, planificación simple del cultivo, nulos riesgos para la salud humana y no produce endotoxinas (Fabe et al., 1995). Esta última ventaja es uno de los factores que influyeron el cambio de microorganismo para la expresión de proteína. Esto es porque la necesidad de detectar o cuantificar las endotoxinas producidas por bacterias Gram-negativas en cada lote sería un factor limitante, ya que los productos generados en E. coli que más tarde serán utilizados en seres humanos debe estar libre de endotoxinas bacterianas. Este requerimiento adicional dificultaría los procesos de producción de E. coli y esto tendría un impacto negativo en los costos finales de producción.

La presente invención ahora se describirá a través de su mejor ejecución. 1. Cómo obtener la cepa recombinante de Pichia pastorís 1.1 Gen sintético para la expresión de Sm14 en P. pastorís: Primero se diseñó y sintetizó un gen que contenía codones que fueron optimizados para obtener la expresión máxima de Sm14 en P. pastorís. En este caso se utilizó Sm14-MV; sin embargo cualquier forma de Sm1 puede ser utilizada.

Existe evidencia en la literatura acerca del uso diferencial de codones entre proteínas con niveles de expresión superiores y bajos en el mismo organismo (Roymondal y Sahoo, 2009). Sin embargo, los cuadros de uso de codones disponibles en bases de datos (por ejemplo: (www.kazusa.or.jp/codon) contienen los datos de todas las proteínas del cuerpo y no toman el nivel de expresión génica en cuenta. Por esta razón, para diseñar el gen se preparó inicialmente un cuadro de uso de codones basada en datos acerca de las secuencias que codifican las proteínas recombinantes expresadas por encima de 1 gramo por litro de cultivo en P. pastorís (ver cuadro 1), así como la secuencia para la proteína AOX1 (que representa 30% del total de la proteína de P. pastorís, después de inducción con metanol).

CUADRO 1 Lista de proteínas recombinantes de expresión superior en P. pastoris Para el diseño de genes se escogió la secuencia de la proteína Sm14- V, que tiene un residuo de valina en la posición 62 - reemplazando la cisteína, lo que lo hace más estable (Ramos et al., 2009); se representa aquí como SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO: 1 MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDKMT MLTESTFKNL SVTFKFGEEF DEKTSDGRNV KSWEKNSES KLTQTQVDPK NTTVIVREVD GDTMKTTVTV GDVTAIRNYK RLS Después de la primera selección de codones según el cuadro preparado con datos de proteína del cuadro 1 , se realizaron depuraciones de secuencia que resultaron en sitios de terminación de transcripción de donante (ATTTA) y receptores crípticos de empalme (MAGGTRAGT y YYYNTAGC, respectivamente) y secuencias repetitivas (sitios de escisión para las enzimas de restricción BamHI y EcoRI). SEQ ID NO:2 muestra la secuencia diseñada para expresar la proteína Sm14-MV en Pichia pastorís.

SEQ ID NO:2 1 ATGTCTTCTT TCTTGGGTAA GTGGAAGTTG TCTGAATCTC ACAACTTCGA 51 CGCTGTTATG TCTAAGTTGG GTGTTTCTTG GGCTACCAGA CAAATTGGTA 101 ACACCGTTAC TCCAACCGTT ACCTTCACCA TGGACGGTGA CAAGATGACT 151 ATGTTGACCG AGTCTACCTT CAAGAACTTG TCTGTTACTT TCAAGTTCGG 201 TGAAGAGTTC GACGAAAAGA CTTCTGACGG TAGAAACGTT AAGTCTGTTG 251 TTGAAAAGAA CTCTGAATCT AAGTTGACTC AAACTCAAGT TGACCCAAAG 301 AACACTACCG TTATCGTTAG AGAAGTTGAC GGTGACACTA TGAAGACTAC 351 TGTTACCGTT GGTGACGTTA CCGCTATCAG AAACTACAAG AGATTGTCTT 401 AA Se agregó la secuencia de Kozak del gen de la proteína AOX1 de P. pastorís (AAACG) al extremo 5' de la secuencia diseñada. Por último, se agregaron sitios de restricción para BamHI (GGATCC) y EcoRI (GAATTC) a los extremos 5' y 3' del gen diseñado, respectivamente.

SEQ ID NO:3 muestra la secuencia final del gen sintético para la producción de la proteína Sm 14.

SEQ ID N0:3 1 GGATCCAAAC GATGTCTTCT TTCTTGGGTA AGTGGAAGTT GTCTGAATCT 51 CACAACTTCG ACGCTGTTAT GTCTAAGTTG GGTGTTTCTT GGGCTACCAG 101 ACAAATTGGT AACACCGTTA CTCCAACCGT TACCTTCACC ATGGACGGTG 151 ACAAGATGAC TATGTTGACC GAGTCTACCT TCAAGAACTT GTCTGTTACT 201 TTCAAGTTCG GTGAAGAGTT CGACGAAAAG ACTTCTGACG GTAGAAACGT 251 TAAGTCTGTT GTTGAAAAGA ACTCTGAATC TAAGTTGACT CAAACTCAAG 301 TTGACCCAAA GAACACTACC GTTATCGTTA GAGAAGTTGA CGGTGACACT 351 ATGAAGACTA CTGTTACCGT TGGTGACGTT ACCGCTATCA GAAACTACAA 401 GAGATTGTCT TAAGAATTC Después de sintetizar la secuencia (SEQ ID NO:3), se realizó la clonación y posterior secuenciando del gen sintético en el vector pCR2.1 para confirmar que la secuencia sintetizada fue fiel a la secuencia diseñada. 1.2 Construcción de plásmido para la expresión de Sm14 en Pichia pastorís: El gen sintetizado fue clonado en el vector pPIC9K donde la proteína Sm14 se expresa sin fusión alguna, haciendo su producción intracelular posible.

El vector pPIC9K (Invitrogen) fue escogido para la construcción del plásmido de expresión Sm14 en P. pastorís por las razones siguientes: (1) Puede ser utilizado para expresar las proteínas intracelulares que reemplazan el gen de factor alfa con el gen de elección, por a través del sitio de restricción BamHI del vector, ubicado antes de la secuencia de Kozak y el principio de la traducción. Para hacer esto fue necesario recrear la secuencia de Kozak antes de expresar el ATG de ORF, según el diseño del gen sintético Sm14. (2) Ofrece la ventaja de permitir una selección de clones con múltiples copias integradas al genoma, seleccionando la resistencia al antibiótico G418. No había tal posibilidad con pPIC9, utilizado anteriormente.

La estrategia para construir el plásmido pPIC9K-Sm14 se describe en la figura 1.

Con el plásmido pCR21-Sm14-MV, se cambió la cepa DH5 dea E. coli para su propagación. Después el ADNp fue purificado con Qiaprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Este plásmido, así como el vector pPIC9K, fueron digeridos simultáneamente con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (ambos de New England Biolabs). Después de la digestión, los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis con gel de agarosa que contiene bromuro de etidío. Los fragmentos que corresponden al vector pPIC9K y al inserto sintético Sm14-MV fueron extirpados del gel de agarosa y purificados con un QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Los fragmentos purificados se ligaron utilizando T4 ADN ligasa (New England Biolabs). La cepa DH5oc de E.coli se transformó mediante la reacción de ligadura y los clones se seleccionaron en medio LB de agar que contiene ampicilina. El ADNp de unos pocos clones resistentes a la ampicilina fue purificado y analizado por restricción con las enzimas BamHI y EcoRI, mostradas en la figura 2. En la figura 2 se muestran los resultados de la clonación Sm14-MV en pPIC9K; los clones se seleccionaron como se muestra abajo: M.- escalera de ADN de 1 Kb + phiX174/Haelll 1. - pPIC9K/BamHI + EcoRI 2. - pCR21-Sm14-MV/BamHI + EcoRI 3 a 1 1.- Clones pPIC9K-Sm14-MV/ BamHI + EcoRI.

En la figura 2 las flechas marcan la posición del inserto y el vector de clonación.

Los clones que mostraron bandas que corresponden a insertos adiciones se seleccionaron y secuenciados con el iniciador AOX5' para confirmar la clonación exitosa y la fidelidad de la secuencia. Por tanto, la secuencia sintética para la expresión de Sm14 permaneció bajo control del promotor fuerte de alcohol oxidasa 1 (AOX1), que se induce por metanol (Cregg et al., 1993). 1.3 Transformación de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV y selección de clones recombinantes con múltiples copias Para producir la proteína, la cepa GS115 (h¡s4) de P. pastoris se transformó con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV. El último fue purificado con el kit Maxiprep (Qiagen). El ADN del plásmido DNA se digirió por separado con las enzimas Bglll y Sacl (New England Biolabs), usando 20 pg de ADN para cada reacción. Las reacciones de digestión se separaron por electroforesis con gel de agarosa y las bandas con fragmentos de ADN que contienen el gen sintético de Sm14-MV se escindieron del gel y el ADN se purificó.

Las células adecuadas para la electroporación para la cepa GS115 se prepararon y transformaron por separado con ADN purificado a partir de reacciones de restricción para Bglll y SacI (10 µg de ADN por transformación). La digestión con enzima Bglll guía la recombinación de la cassette de expresión del gen AOX1 , en el genoma de P. pastorís, mientras que la digestión con SacI puede integrarse en otras regiones.

Después de la transformación, las células fueron esparcidas en medio RD (medio libre de histidina, que contiene: 1 M sorbitol; 2% dextrosa; 1.34% YNB; 4x10"5% biotina y 0.005% de cada aminoácido: L-glutamato, L-metionina, L-lisina, L-leucina y L-isoleucina para la selección de cepas transformadas por el marcador de auxotrofía his4. Los clones que lograron crecer en el medio libre de histidina fueron sometidos a la selección con el antibiótico G418, en concentraciones: 0.5; 1 ; 2; y 4 mg/ml, en un cultivo YPD (1% de extracto de levadura, 2% peptona; 2% dextrosa) a 30°C en placas de microcultivo. Sólo clones transformados con plásmido pPIC9K-Sm14-MV digeridos con la enzima SacI lograron crecer con G418 en 4 mg/ml; esto caracteriza la inserción de múltiples copias del cassette de expresión en el genoma de P. pistorís.

Para confirmar si los clones seleccionados tuvieron el cassette de expresión del gen sintético, se purificó el ADN genómico de 17 y se utilizó en reacciones de PCR con los iniciadores AOX5 y AOX3'. El plásmido pPIC9K-Sm14-MV se utilizó como control positivo. La figura 3 muestra el análisis PCR de los clones GS115 de P. pastorís transoformados con pPIC9K-Sm14-MV y seleccionados con 4mg/ml de G418.

M. - phiX174/Haelll 1 a 17. - Clones GS115/pPIC9K-Sm14-MV 18. - Control positivo: plásmido pPIC9K-Sm14-MV.

Como se muestra en la figura 3, todos los clones seleccionados con 4 mg/ml de G418 presentaron la secuencia sintética Sm14-MV.

Para probar la expresión de la proteína Sm14, los clones crecieron en un medio BMG (medio de glicerol mínimo regulado, que contiene: 1.34% de YNB; 0.04% de biotina, 0.1 M de fosfato de potasio pH 6.0; y 1 % de glicerol) durante 48 horas y entonces fueron transferidos a un medio BMM (medio de metanol mínimo regulado, que contiene los mismos componentes que el medio BMG, menos glicerol que fue reemplazado con 0.5% de metanol y EDTA adicional para la concentración final de 1mM), para la inducción de expresión de la proteína recombinante. Después de 72 horas, agregando 0.5% de metanol cada 24 horas, las proteínas totales de cada clon se analizaron por SDS-PAGE (figura 4). La figura 4 muestra los resultados de la inducción de la expresión de Sm14 en los clones de P. pastorís GS1 15/pPIC9K-Sm14-MV.

M.- Marcador de peso molecular bajo 1. - proteína sin fusión de E. coli purificada con Sm14 de control positivo 2 a 18 - proteína total de clones 1- 7 GS115/pPIC9K-Sm14-MV después de la inducción con metanol. 1.4 Inducción de la expresión recombínante de Sm14 en GS 15 / pPIC9K-Sm14- V de P. pastorís La figura 5 muestra la inducción de la expresión de Sm14 en P. pastorís GS1 15/pPIC9K-Sm14-MV, en donde: M.- Marcador de peso molecular bajo 1.- muestra no inducida, en medio BMG 2 a 7.- Inducción de expresión para 0, 24, 48, 72 y 91 horas, respectivamente, en medio BMM 8- proteína no fusionada de E. coli purificada con Sm14 de control positivo Fue posible observar una banda de mayoría en todos los clones seleccionados que coincide con el tamaño de la proteína Sm14 no fusionada de E. coli purificada.

Para confirmar si la proteína fue inducida por metanol, el clon No. 1 creció en un medio BMG durante 48 horas (figura 5, carril 1) a 250 rpm, a 30°C; fue transferido luego a un medio BMM (0.5% de metanol). Recogimos muestras a diferentes intervalos (figura 5, carriles 2 a 7). El metanol se añadió al cultivo cada 24 horas, para lograr una concentración final de 0.5%.

Como lo muestra la figura 5, en el medio BMG no se obtuvo la expresión de proteína inducida con metanol (figura 5, carril 1), y ninguno en tiempo cero con medio de inducción BMM (figura 5, carril 2). La inducción fue visible después de 24 horas del cultivo en medio BMM y permaneció estable durante el crecimiento de las células, hasta 91 horas que fue la ventana de tiempo del experimento.

Por lo tanto, se ha verificado la inducción específica de la proteína recombinante que corresponde a Sm14 en P. pasto s.

En el experimento, utilizando sólo medio BMM y metanol al 0.5%, fue posible lograr 26 gramos de masa celular húmeda por litro de cultivo, manteniendo un nivel bueno de expresión de la proteína Sm14, que es la proteína principal de las células después de la inducción de metanol. Además de utilizar un fermentador y medios más adecuados para producir proteínas recombinantes en P. pastorís, es posible obtener una mayor masa celular y mayor expresión de expresión de Sm14. 2. Purificación de la proteína recombinante de SM14 expresada en la cepa de P. pastorís qs1 15 / ppic9k-Sm14-MV El protocolo de purificación para Sm14 recombinante del citoplasma de P. pastorís se basó en la metodología desarrollada en el Laboratorio de esquistosomiasis experimental fdel Instituto Oswaldo Cruz (IOC) para la purificación de Sm14 sin fusión en el sistema de E. coli.

Lisis: La purificación de proteínas recombinantes empieza con la lisis de células de P. pastorís. Para ese fin, las células se resuspenden en 30mM Tris-HCI 30mM pH 9.5 y lisado en prensa francesa. El lisado se aclara por centrifugado (figura 6, carril 2).

Captura: El lisado aclarado se carga en el Q-Sepharose XL de resina (GE Healthcare), equilibrado con regulador de pH A (30 mM Tris-HCI pH 9.5). Toda la proteína Sm14 del lisado es absorbida por la resina, ya que no hay proteína Sm1 en el material que no sea absorbida en la resina (Figura 6, carril 3). Después de cargada la proteína, la columna es lavada con regulador de pH A. La proteína se eluye con regulador de pH de B (30 mM Tris-HCI pH 8.0) en el sistema de AKTA-fplc (GE Healthcare) (figura 6, las carriles 4-6).

Pulido: La proteína eluída de Q-sepharose XL de resina presenta pocas proteínas contaminantes. Para separar esas proteínas de Sm14 se utilizó filtración de gel. Para hacer esto, se recopilaron fracciones de la cromatografía de intercambio iónico que contienen Sm14 y se concentraron en la membrana el Centriprep YM-10 (Millipore) y el material se aplicó a la columna Sephacryl S100 HR 26/60 (GE Healthcare) utilizando PBS pH 7.4 como la fase móvil. El pico cromatográfico (figura 6, carril 8) presentó el mismo volumen de retención que las proteínas no fusionadas producidas en E. coli (figura 7).

La figura 6 muestra los resultados de la purificación de Sm14, donde M.- Marcador de peso molecular bajo 1- proteína sin fusión de E. coli purificada con Sm14 de control positivo 2.- Lisado aclarado, 2.- Proteínas no absorbidas en Q-sepharose XL de resina 3 - 6.- Fracciones eluidas de Q-sepharose XL de resina 7.- Reserva de fracciones cromatográficas de intercambio iónico 8.- Pico de filtración de gel en la columna de sephacryl S-100 HR 26/60 La figura 7 muestra los resultados del cromatograma con filtración de gel de la proteína Sm14-MV producida en P. pastoris. 4 - Análisis de Sm14 recombinante producido en Pichia pastoris La proteína recombinante de P. pastoris se purificó mediante las mismas características físicas y químicas que la proteína no fusionada Sm14-MV expresada en E. coli. La proteína purificada de esta forma de P. pastoris corresponde en tamaño a la proteína inducida específicamente por metanol. Ya que se cuenta con el gen sintético del promotor de Sm14-MV bajo el control del promotor AOX1 en el cassette de expresión, se deduce que la proteína expresada y purificada de P. pastoris es Sm14-MV.

Para confirmar esta declaración, la proteína purificada de P. pastoris fue analizada por Western blot, utilizando suero anti-Sm14 de conejo (figura 8). La figura 8 muestra el análisis Western blot de la proteína purificada de P. pastoris. 1 y 2.- proteína purificada Sm14-MV de P. pastoris 3- proteína sin fusión de E. coli purificada con Sm14 de control positivo En este experimento se pudo observar que los anticuerpos anti-Sm14 reconocieron específicamente la proteína purificada de P. pastoris (el suero de conejo no reconoce las proteínas endógenas de P. pastoris , no se muestran los datos), lo que confirma su identidad.

Por último, fue necesario identificar si la proteína purificada de P. pastoris tiene una estructura que corresponde al doblado beta, que es típico de proteínas de la familia de proteínas de unión a ácidos grasos, a la cual pertenece Sm14. Para hacer esto, se analizaron muestras de proteína por dicroísmo circular, utilizando un fotopolarímetro espectral J-8 5 (JASCO) (figura 9). La figura 9 muestra el espectro de dicroísmo circular de la proteína purificada Sm14 de P. pastoris.

Como puede verse en la figura 9, el espectro corresponde a una proteína de estructura beta. Este espectro fue semejante a los espectros de dicroísmo circular de los lotes de proteína Sm14 de E. coli purificados anteriormente en el Laboratorio de esquistosomiasis experimental.

Así, con base en el reporte anterior se puede concluir que esta invención permitirá: diseñar y sintetizar un gen sintético para la expresión superior de Sm 14-MV en Pichia pastoris; construir un plásmido de expresión de pPIC9K-Sm14-MV que contiene la secuencia de gen sintético bajo el control del promotor AOX1 ; obtener una cepa de P. pastorís que produce Sm 4 y; purificar Sm14 en dos etapas cromatográficas, cuya programación para la producción industrial es posible.

Por lo tanto, la invención descrita aquí muestra que la proteína Sm14 protege contra infecciones causadas por Schistosoma mansoni en ratones, en plataformas de E. coli y P. pastorís.

Referencias (1) Cregg, J.M., Vedvick, T.S. y Raschke, W.C.. Recent advances ¡n the expression of foreign genes in Pichia pastoris. BioTechnology v. 11 , p. 905-910, 1993. (2) Faber, K.N., Harder, W., y Veenhuis, M. Review: Methylotropic Yeasts as Factories for the Production of Foreign Proteins. Yeast. v. 1 1 , p. 1331-1344, 1995. (3) Ramos, C.R., Spisni, A., Oyama, S.Jr., Sforca, M.L, Ramos, H.R, Vilar, M.M., Alves, A.C., Figueredo, R.C., Tendler, M., Zanchin, N.I., Pertinhez, T.A., Ho, P.L. Stability improvement of the fatty acid binding protein Sm14 from S. mansoni by Cys replacement: structural and functional characterization of a vaccine candidate. Biochim Biophys Acta. v. 1794, p. 655 - 662, 2009. (4) Ramos, C.R., Vilar, M.M., Nascimento, A.L, Ho, P.L., Thaumaturgo, N., Edelenyi, R.( Almeida, M., Dias, W.O., Diogo, C.M., Tendler, M. r-Sm14 - pRSETA efficacy in experimental animáis. Mem Inst Oswaldo Cruz.v. 96, p.131 - 135, 2001. (5) Roymondal, U.D. y Sahoo, S.S. Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application to Escheríchia coli genome. DNA Res. v. 16, p. 13 - 30, 2009. (6) Tendler, M., Brito, C.A., Vilar, M.M., Serra-Freire, N., Diogo, C.M., Almeida, M.S., Delbem, A.C., Da Silva, J.F., Savino, W., Garratt, R.C., Katz, N., Simpson, A.S. A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual-purpose anti-helminth vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A. v. 93, p. 269 - 273, 1996.

Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un gen sintético que comprende la SEQ ID NO:3.

2. - Un proceso de producción de la proteína Sm14 en Pichia pastoris que consiste en: (a) la síntesis del gen definido por SEQ ID NO:3, (b) la clonación del gen sintetizado en el vector pPIC9K por el sitio BamHI y reconstituir la secuencia de Kozak del gen AOX1 antes del codón de inicio de la proteína Sm14, para la expresión de Sm14 en su forma intracelular; (c) la transformación de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV y selección de los clones recombinantes con múltiples copias.

3. - Un proceso de purificación de la proteína recombinante expresada en Pichia pastoris que consiste en las siguientes etapas: (a) realizar la lisis de células de P. pastoris, (b) aclarar el lisado obtenido en la etapa (a), (c) cargar el lisado aclarado en la resina de intercambio aniónico y después de cargar la proteína, la proteína se eluye por los cambios de pH en la columna; (d) separar las proteínas contaminantes de la proteína mediante filtración de gel.

4.- El proceso de purificación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende la aplicación en la purificación de las proteínas de unión de ácidos grasos de otros parásitos con propiedades físicas y químicas que son similares a la proteína Sm14, como es el caso de la proteína FABP tipo 3 de Fasciola hepática.

5. - Una proteína expresada en Pichia pastorís de conformidad con el proceso de la reivindicación 2 o una proteína purificada con el proceso de conformidad con la reivindicación 4, para usarse como un agente terapéutico de inmunización y diagnóstico.

6. - El uso de una proteína de conformidad con la reivindicación 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones causadas por helmintos, especialmente contra esquistosomiasis, fasciolosis, equinococosis y otras enfermedades de helmintos de relevancia para humanos y veterinaria.