BRPI1005033A2 - peptÍdeos recombinantes, mÉtodo e kit para teste imunodiagnàstico de leishmaniose visceral - Google Patents

Abstract

Peptídeos Recombinantes, Método e Kit para Teste Imunodiagnástico de Leishmaniose Visceral. A presente invenção descreve um método e kit para diagnosticar Leishmaniose visceral. Mais particularmente, a invenção trata da associação dos antígenos recombinantes definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, peptídeos 47, 17, 18 e 19, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior especificidade, otimizando, assim, a reatividade dos testes sorológicos.

Description

Peptídeos Recombinantes, Método e Kit para Teste Imunodiagnóstico

de Leishmaniose Visceral

A presente invenção descreve um método e kit para diagnosticar Leishmaniose visceral. Mais particularmente, a invenção trata da associação dos antígenos recombinantes definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, peptídeos 47, 17, 18 e 19, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior especificidade, otimizando, assim, a reatividade dos testes sorológicos.

Espécies do gênero Leishmania são agentes etiológicos das diferentes formas clínicas da Ieishmaniose (visceral, cutânea, mucocutânea e difusa) que, por sua vez, apresentam distribuição geográfica e prevalências distintas. Dentre os 88 países em que é registrada a ocorrência de leishmaniose, 72 são países em desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos do mundo. Cerca de 90% dos casos de leishmaniose visceral (LV) ocorrem no Brasil, Bangladesh, índia, Nepal e Sudão e 90% dos casos de leishmaniose cutânea (LC) ocorrem no Brasil, Afeganistão, Argélia, Iran, Peru, Arábia Saudita e Síria (World Health Organization. 2002. Leishmaniasis Strategic Direction. "http://www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.htm"; Murray, H. W. J. D. Berman. 2005. "Advances in leishmaniasis." Lancet 366(9496): 1561-77). Cabe aqui ressaltar que a LV1 quando não tratada, é normalmente fatal.

Em diferentes regiões geográficas, o ciclo de transmissão da doença se estabelece quando se encontram próximos, em um ambiente favorável, os vetores (fêmeas de flebotomíneos dos gêneros Lutzomiya e Phlebotomus) infectados por formas promastigotas de alguma das várias espécies de Leishmania e o hospedeiro definitivo (mamíferos, sendo o homem hospedeiro acidental). Formas promastigotas, após terem sido introduzidas na pele dos hospedeiros definitivos, são fagocitadas e se transformam em formas amastigotas, que permanecem em contato com o sistema imune do hospedeiro durante a infecção ativa. O cão é considerado o principal reservatório doméstico da LV em nosso meio (Matlashewski, G. 2001. Leishmania infection and virulence: Med Microbiol. Immunol., 190: 37-42). O controle da Ieishmaniose visceral (LV) no Brasil se faz por meio da eliminação dos reservatórios domésticos da doença (cães infectados), controle das populações de vetor e, quando possível, pela prevenção do contato com vetores infectados. Cães infectados, sintomáticos ou não, podem transmitir os parasitas ao inseto vetor (Courtenay, O., R. J. Quinnell, L. M. Garcez, J. J. Shaw, and C. Dye. 2002. infectiousness in a cohort of Brazilian dogs: why culling fails to control visceral Ieishmaniasis in areas of high transmission. J. Infect. Dis. 186:1314-1320). Assim, a prevalência e incidência da infecção canina são parâmetros fundamentais para o controle da transmissão. No entanto, a estimativa das mesmas depende de métodos confiáveis de identificação dos cães infectados (Dye, C., E. Vidor, and J. Deneure. 1993. Serological diagnosis of leishmaniasis: on detecting infection as poço as disease. Epidemiol. Infect. 103:647-656; Dye, C., R. Killick-Kendrick, Μ. M. Vitutia, R. Walton, M. Killick-Kendrick, A. E. Harith, M. W. Guy, M.-C. Canãvate and G. Hasibeder. 1992. Epidemiology of canine leishmaniasis: prevalence, incidence and basic reproduction number calculated from a cross-sectional serological survey on the island of Gozo, Malta. Parasitology 105:35-41; Quinnell, R. J., O. Courtenay, L. Garcez, and C. Dye. 1997. The epidemiology of canine leishmaniasis: transmission rates estimated from a cohort study in Amazonian Brazil. Parasitology 115:143-156). Estudos baseados em modelagem matemática indicam, porém, que medidas de controle baseadas na detecção sorológica dos cães falham devido à alta incidência da infecção em cães, à alta infectividade dos parasitas, à falta de sensibilidade dos testes de diagnóstico sorológico e à demora entre diagnóstico e eliminação dos cães positivos, entre outros aspectos (Courtenay et al. 2002).

A aplicação das medidas de controle da LV no Brasil é extremamente complexa e onerosa, devido ao complexo ciclo de transmissão da doença, que envolve reservatórios domésticos,silvestres e insetos vetores, à precária condição sócio-econômica da população em muitas regiões do país e à urbanização e expansão da doença para áreas onde, até recentemente, ela não era registrada. Outros aspectos referem-se às diferenças ecoepidemiológicas da doença em diferentes regiões do país, à baixa sensibilidade dos testes de diagnóstico sorológicos convencionais, especialmente para a detecção de cães que se encontram nos estágios iniciais da doença, e à demora entre o diagnóstico e a eliminação dos cães infectados. Recentemente, a introdução de uma vacina no mercado contra a LV canina (Leishmune® - FordDodge), constituída de complexo antigênico FML purificado de formas promastigotas, tem dificultado a adoção dessas medidas de controle, uma vez que cães vacinados se tornam soropositivos nos testes convencionais, que empregam antígenos de formas promastigotas dos parasitas. Esse aspecto relaciona-se à presença dos mesmos antígenos na vacina e nos testes de diagnóstico sorológico que empregam formas promastigotas do parasita. Essa dificuldade poderia ser contornada empregando-se vacinas que não induzem soroconversão dos cães nos testes de diagnóstico empregando antígenos de formas promastigotas ou empregando-se nos testes sorológicos antígenos distintos daquelas presentes nas vacinas. Independentemente das características específicas de cada vacina, em um cenário complexo como esse, a introdução de novas ferramentas de controle pressupõe a não interferência com as demais medidas de controle vigentes.

O diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é conduzido por meio de testes sorológicos e parasitológicos em aspirados de baço, medula óssea, biópsia das lesões e Iinfonodos (WHO, 2002; Tavares CA, Fernandes AP, Melo MN. 2003. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Expert Rev Mol Diagn. 3(5):657-67). Devido às limitações dos métodos de diagnóstico direto, tais como microscopia, cultura, inoculação em hamsters de amostras de biopsia, a presença de anticorpos contra os parasitas por meio de reação de imunofluorescência ou ELISA empregando antígenos de formas promastigotas de Leishmania sp. é pesquisada rotineiramente como marcador de infecção (Dye et al., 1993; Grimaldi, G., Jr., and R. B. Tesh. 1993. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6:230-250; Tavares et al., 2003).

Vários tipos de testes sorológicos e antígenos têm sido avaliados, mas a sorologia é, em geral, menos específica do que a detecção de parasitas em amostras de biópsia, devido à reatividade cruzada com outros agentes como Erlichia canis e riquetsias. Os testes sorológicos disponíveis para o diagnóstico indireto incluem a reação de imunofluorêscencia (IFAT), ELISAs, dot-ELISA, teste de aglutinação direta, Western blotting, e teste imunocromatográfico (Mancianti, F. and N. Meciani. 1988. Specific serodiagnosis of canine Ieishmaniasis by indirect immunofluorescence, indirect hemagglutination, and counter-immunoelectrophoresis. Am. J. Vet. Res. 49:1409-1411; Badaró, R., D. Benson1 M. C. Eulálio, M. Freire, S. Cunha, Ε. M. Neto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, J. M. Burns, R. L. Houghton, J. R. David, and S. G. Reed. 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. J. Infect. Dis. 173:758-761; Vercammen, F., D. Berkvens, J. Brandt, and W. Vansteenkiste. 1998. A sensitive and specific 30-min Dot-ELISA for the detection of anti-leishmania antibodies in the dog. Vet. Parasitol. 79:221-228; Harith, Α., A. H. Kolk, P. A. Kager, J. Leeuwenburg, R. Muigai, S. Kiugu, and J. J. Laarman. 1986. A simple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of visceral leishmaniasis.Trans. R. Soe. Trop. Med. Hyg. 80:583-587; Aisa, M. J., S. Castillejo, M. Gallego, R. Fisa, M. C. Riera, M. De Colmenares, S. Torras, X. Roura, J. Sentis, and M. Portus. 1998. Diagnostic potential of Western blot analysis of sera from dogs with leishmaniasis in endemic areas and significance of the pattern. Am. J. Trop. Med. Hyg.; 58:154-159; Teodoro da Costa, R., J. C. Franca, W. Mayrink, E. Nascimento, O. Genaro, and A. Campos-Neto. 2003. Standardization of a rapid immunochromatographic test with the recombinant antigens K39 and K26 for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. R. Soe. Trop. Med. Hyg. 97:678-682). A avaliação destes testes indica que, em geral, eles apresentam sensibilidade adequada para o sorodiagnóstico da LVC, em cães sintomáticos. Além dos testes sorológicos, testes imunocitoquímicos e moleculares, baseados em reações de PCR, também foram desenvolvidos para detecção de DNA de Leishmania em amostras humanas e de cães (Quinnell, R. J., O. Courtenay, S. Davidson, L. Garcez, B. Lambson, P. Ramos, J. J. Shaw1 M. A. Shaw, and C. Dye. 2001. Detection of Leishmania infantum by PCR, serology and immune response in a cohort study of Brazilian dogs. Parasitology 122:253-261; Reithinger, R., R. J. Quinnell, Β. Alexander1 and C. R. Davies. 2002. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbentassay, and PCR. J. Clin. Microbiol.

40:2352-2356). Entretanto, estes testes são laboriosos e de custo elevado, pois requerem equipamentos especializados e corpo técnico treinado, o que inviabiliza a sua aplicação em muitos casos. Estudos sugerem que a PCR é mais útil para detectar infecção ativa enquanto a sorologia pode ser mais sensível para detecção de todos os animais infectados (Quinnell et al., 2001). O diagnóstico sorológico da LVC por ELISA empregando extrato de

promastigotas ou Reação de Imunofluorescência ainda possui limitações relacionadas ao preparo e padronização dos antígenos de formas promastigotas e também pelo fato de requerer pessoal treinado e equipamentos especializados, dificultando sua aplicação rápida. Testes mais rápidos, como a imunocromatografia utilizando antígenos de proteínas recombinantes de L infantum como o K39 (rK39) e rK26, têm auxiliado no diagnóstico de casos de LVC sintomáticos. Notam-se, no entanto, limitações para diferenciar cães assintomáticos de sintomáticos. Outro teste foi introduzido no mercado recentemente pela empresa Biogene, contendo o antígeno recombinante HSP70, denominado S7. No entanto, detecta-se uma escassez de dados da literatura em relação à avaliação de sensibilidade e especificidade e validação desse teste. Resultados preliminares obtidos pelo nosso grupo indicam elevada discordância em relação ao testes convencionais no diagnóstico de cães assintomáticos e sintomáticos. Outro aspecto que deve ser ressaltado refere-se ao fato de que o

Ministério da Saúde investiu na implantação e capacitação de laboratórios em todo o país para o diagnóstico sorológico da LVC e que esse esforço não deve ser desperdiçado, mas sim aprimorado. Testes de diagnóstico moleculares se apresentam como alternativas devido a sua alta sensibilidade, mas são ainda laboriosos e onerosos. Desta forma, o aprimoramento de testes de diagnóstico sorológico que possam se valer da infra-estrutura e capacitação instaladas tem óbvias vantagens para a aplicação no SUS. O antígeno A2, expresso pelas formas amastigotas de espécies viscerotrópicas, pertence a uma família de proteínas que possui um número variável de repetições de uma unidade de 10 aminoácidos, sendo considerado o primeiro fator de virulência amastigota específico descrito (Charest, H. and G.

Matlashewski. 1994. "Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene." Mol Cell Biol 14(5): 2975-84; Zhang, W. W. and G. Matlashewski. 1997. Loss of virulence in Leishmania donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2. Proc Natl Acad Sci U S A 94(16): 8807-11). A2 se mostrou reativo em 60 e 82% dos pacientes soropositivos com o kala-azar da índia e do Sudão, respectivamente, no teste de ELISA (Ghedin, E., W. W. Zhang, H. Charest, S. Sundar, R. T. Kenney, and G. Matlashewski. 1997. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clin. Diagn.Lab. Immunol. 4:530-535). No Brasil, os anticorpos anti-A2 foram detectados por ELISA em 77% dos soros dos pacientes com LV sintomático e em 87% dos soros dos cães positivos pela IFAT para Leishmania ou na avaliação parasitológica (Carvalho, F. Α. Α., H. Charest, C. A. P. Tavares, G. Matlashewski, Ε. P. Valente, A. Rabello, R. T. Gazinelli, and A. P. Fernandes. 2002. Diagnosis of American visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani AZ antigen. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43:289-295). Em um estudo recente, foram avaliados comparativamente antígenos recombinantes parasita-específicos rK39, rK26, e rA2 e o antígeno solúvel (CSA) em testes de ELISA (Porrozzi, R., Μ. V. S. Costa, A. Teva, A., Campos-Neto, A., Fernandes, A.P., Gazzinelli, RT., Grimaldi, G. Jr. 2007. Comparative evaluation of enzime-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant Ieishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clinicai and Vaccine Immunology 14:544-548). Os resultados mostraram que estes marcadores apresentam sensibilidade elevada para o diagnóstico da LVC em caes sintomáticos, que apresentam em geral elevados títulos de anticorpos. No entanto, quando foi calculada a razão entre casos sintomáticos e assintomáticos que foram identificados por cada antígeno, A2 foi o antígeno que apresentou o mais alto índice, seguido por K39, K26 e CSA1 sugerindo associação entre resposta a A2 e imunidade protetora. Além disso, a especificidade do teste empregando A2 foi de 96%, enquanto para os outros antígenos variou entre 85 a 90% (Porrozzi et al. 2007). Esses dados sugerem que esses marcadores podem se complementar aumentando a sensibilidade total dos testes de detecção de anticorpos em cães sintomáticos e assintomáticos infectados por espécies de Ieishmania que causam a LVC.

Embora os dados apresentados por Porrozzi et al. (2007) demonstrem uma considerável melhoria na sensibilidade e especificidade de testes com antígenos recombinantes em comparação com testes empregando extrato antigênico, observa-se que ainda existem limitações em relação a uma menor sensibilidade dos testes empregando os antígenos K39, K26 e extrato antigênico em relação ao diagnóstico de cães assintomáticos. Esses animais tendem em geral a apresentar títulos de anticorpos mais baixos, menores que 1:640. No entanto, animais assintomáticos podem apresentar os parasitos na pele e representar uma importante fonte de transmissão dos mesmos para os vetores, resultando na manutenção da transmissão da infecção e sendo um dos fatores importantes para a falência das medidas de controle. Assim, testes mais sensíveis e específicos, capazes de detectar cães assintomáticos e/ou com baixos títulos de anticorpos, se fazem ainda necessários. Considerando que a detecção e o sacrifício de cães com sorologia positiva ainda é adotado no Brasil como medida de controle e que animais com baixos títulos de anticorpos e assintomáticos podem transmitir a infecção, o emprego de testes de diagnóstico com maior sensibilidade para esse tipo de animal pode apresentar impacto favorável sobre as medidas de controle da Ieishmaniose visceral no Brasil.

A associação de antígenos definidos é uma estratégia importante para o aprimoramento dos métodos de diagnóstico sorológico, uma vez que antígenos recombinantes, tais como rK39, rK26, e rA2, apesar de apresentarem elevada especificidade, quando empregados isoladamente podem apresentar menor sensibilidade (Carvalho et al. 2002; Porrozi et al., 2007). No entanto, estes marcadores apresentam o potencial de se complementarem, aumentando a sensibilidade total nos testes sorológicos de cães sintomáticos (Porrozzi et al., 2007). Assim, combinações de antígenos podem ser mais sensíveis do que uma única proteína ou epítopo, considerando a heterogeneidade genética das populações caninas. Antígenos recombinantes também podem apresentar especificidade reduzida se epítopos presentes em sua seqüência são também compartilhados por moléculas ortólogas presentes em outros organismos. Usando métodos moleculares, esses problemas podem ser contornados com a remoção destas seqüências, resultando em moléculas otimizadas tanto para sensibilidade quanto especificidade. Instrumentos disponíveis on Iine podem ser úteis para predição de epítopos de células Β. A partir de um antígeno com seqüência conhecida e que tenha apresentado reatividade com soros de cães e pacientes com Ieishmaniose visceral, pode-se identificar as porções da molécula com maior afinidade por anticorpos e sintetizar os peptídeos correspondentes, otimizando em cada molécula a reatividade em testes sorológicos.

Tal abordagem foi empregada no presente estudo, selecionando-se, a partir das seqüências dos antígenos A2, NH e LACK, peptídeos correspondentes a regiões com características ótimas para reatividade como epítopos para células B. Assim, a presente invenção descreve um método e Kit para diagnosticar Leishmaniose através da associação dos antígenos definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior sensibilidade, otimizando, dessa forma, a

reatividade dos testes sorológicos.

Já se encontram patentes que descrevem o uso de antígenos de Ieishmania e a combinação destes no diagnóstico da Leishmaniose. Dentre os quais podemos citar:

O documento US20100136046- RECOMBINANT POLYPROTEIN VACCINES FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF LEISHMANIASIS- descreve composições e métodos para prevenir, tratar e detectar leishmaniose. As composições geralmente incluem polipeptídeos de fusão compreendendo múltiplos antígenos de Leishmania, em particular, A2 KMPII, SMT, e /ou CBP, ou porções imunogênicas ou variantes das mesmas, bem como polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos de fusão.

O documento US20060211056- LEISHMANIA ANTIGENS SUITABLE FOR A DIAGNOSTIC KIT OF LEISHMANIA- descreve a obtenção de polipeptídeos de 10 aminoácidos consecutivos purificados a partir de Leishmania infantum. E, ainda, o uso desses polipeptídeos para diagnosticar LV Mediterrânea..

O documento US7740859- POLYPEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF LEISHANANIASIS- descreve compostos e métodos para a detecção de anticorpos anti-leishmania em indivíduos suspeitos de infecção com o parasita protozoário do gênero Leishmania, onde o agente infeccioso é uma cepa indiana, semelhante ou muito relacionada à cepa de Leishmania indiana.

O documento PI9405713-3- DIAGNOSE DA LEISHMANIOSE- descreve um método para o diagnóstico da Ieishmaniose que compreende: (a) obter uma amostra a partir de um paciente sob suspeita de estar infectado com o parasita Leishmania contendo anticorpos do paciente e (b) determinar a presença de anticorpos que se ligam a uma unidade repetitiva do antígeno K39.

O documento W02010020028- PEPTÍDEOS SINTÉTICOS E POLÍMERO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A LEISHMANIOSE- descreve dois peptídeos antigênicos sintéticos (epítopos ou mimotopos) selecionados e o método de conjugação desses peptídeos para formar um polímero. O polímero antigênico formado por esses peptídeos produz imunização contra Ieishmaniose visceral e será usado em método e kit imunodiagnóstico específico para detectar a doença.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 - Reatividade do peptídeo 47 (1 pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640). Observa-se que nessas condições o peptídeo foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade e especificidade do peptídeo 47 com soros de cães com altos títulos de anticorpos. Figura 2 - Reatividade do peptideo 47 (1pg/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Observa-se que, nessas condições, o peptideo 47 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensiblidade apresentada quando a proteína A2 recombinante foi testada frente aos mesmos soros, como descrito por Porrozzi et. al. (2007). Figura 3 - Reatividade do peptideo 17 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640).

Figura 4 - Reatividade do peptideo 17 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos.

Figura 5 - Reatividade do peptideo 18 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640).

Figura 6 - Reatividade do peptideo 18 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Figura 7 - Reatividade do peptideo 19 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640).

Figura 8 - Reatividade do peptideo 19 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos.

Figura 9 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 17 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.

Figura 10 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 18 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.

Figura 11 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.

Figura 12 - Reatividade de combinações dos peptídeos 17 e 18 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 13 - Reatividade de combinações dos peptídeos 17 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.

Figura 14 - Reatividade de combinações dos peptídeos 18 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.

Figura 15 - Dados das reações de ELISA, utilizando-se soro humano, em que os peptídeos foram testados isoladamente na quantidade de 4pg/poço. Figura 16 - Dados das reações de ELISA, utilizando-se soro humano, em que os peptídeos foram testados em associação.

Descrição Detalhada da Invenção

Na presente invenção foi feita uma combinação de peptídeos correspondentes a regiões com características ótimas para reatividade como epítopos para células B, selecionados a partir das seqüências dos antígenos A2, NH e LACK de leishmania, empregando os critérios descritos na tabela 1. Tais peptídeos foram então testados, isoladamente ou em combinação, frente a soros de cães sintomáticos, assintomáticos e com baixos (< 1:320) e médios (1:320 > 1:640) títulos de anticorpos. Cabe ressaltar que foram empregados nessa análise os mesmos soros categorizados como provenientes de cães sintomáticos e assintomáticos testados previamente por Porrozzi et al. (2007), permitindo a comparação com os mesmos antígenos sob a forma de proteínas recombinantes. Os peptídeos foram testados também frente a soros humanos de pacientes diagnosticados com Ieishmaniose visceral e soros controle de indivíduos hígidos.

As seqüências das proteínas A2 e LACK e NH foram submetidas a

análise com programas disponíveis online no site http://www.expasv.org/tools/protscale.html· Os programas aos quais as sequencias foram submetidas geram gráficos e valores de scores que são considerados de acordo com as características ideais para a presença de epítopos de células Β. A seleção das seqüências sintetizadas como peptídeos com características de epítopos de células B obedeceu os seguintes critérios: Tabela 1- Critérios utilizados para seleção das seqüências sintetizadas

Característica Referência Valores de Scores Regiões com estrutura Folha beta de acordo com Chou & Fasman deve ser baixo Regiões com estrutura Alfa-hélice / Deleage & Roux deve ser alto Hidrofobicidade / Hopp & Woods deve ser alta Regiões com estrutura Alfa-hélice Chou & Fasman deve ser alto Regiões com estrutura Beta-turn Chou & Fasman deve ser alto Coil Deleage & Roux deve ser baixo Porcentagem de resíduos acessíveis deve ser alta

Com base nesses critérios, foram selecionadas as seguintes seqüências: SVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSC, correspondendo ao Peptídeo 47(SEQ ID N°1), derivado do antígeno A2, STPAVQKRVKEVGTKPC e

STTWGNQTLEKVTC, correspondendo ao Peptídeo 17 e 18 (SEQ ID N°2 e N°3), respectivamente, derivados do antígeno nucleosídeo hidrolase e SWSTSRDGTAISWKC, correspondendo ao peptídeo 19(SEQ ID N°4), derivado do antígeno LACK.

A presente invenção será melhor descrita através dos exemplos a seguir. Ressalta-se que esses exemplos não possuem a intenção de limitar a natureza da invenção, mas, ao contrário, ilustram e ajudam na compreensão da tecnologia. Ainda, o teste para imunodiagnóstico de Ieishmaniose pode ser selecionado do grupo compreedendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão e imunocromatografia. Nos exemplos que se seguem foi utilizado o teste de ELISA.

Exemplo 1

Para testar a reatividade do peptídeo 47 como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, de acordo com o protocolo descrito a seguir.

Placas de 96 poços (Flexible PVC Microplates, flat-bottom, BD Biosciences) foram sensibilizadas com o peptídeo sintético 47, derivado do antígeno A2, diluído em água. Foram testadas variações nas quantidades de peptídeo por poço, dependendo do ensaio (4 ou 1pg/poço ou ainda 0,5 ou 0,250 pg/poço). As placas foram mantidas em estufa até a secagem e depois na geladeira por 18 horas a 4 0C. As placas foram bloqueadas com PBS-2% caseína a 37 0C por 1 hora e incubadas com soros de cães na diluição de 1:100 por 1 hora a 37 0C. Anticorpos marcados com Peroxidase específicos para IgG canina (Sigma, USA) foram diluídos 1:5000 e adicionados aos poços por 1 hora a 37 0C. Após a lavagem das placas, foi adicionado o substrato cromogênico 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) em tampão citrato contendo peróxido de hidrogênio. As reações foram interrompidas pela adição de H2SO4 2N. A densidade ótica foi determinada a 450 nm em leitor de ELISA (BioRad, Model 2550, CA, USA).

Através da figura 1 pode-se observar que o peptídeo foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos (>1:640), apresentando a alta sensibilidade e especificidade do peptídeo 47 frente soros de cães com altos títulos de anticorpos.

Exemplo 2

Observada a elevada reatividade do peptídeo 47 (4 pg/poço) com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640), verificou-se também a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).

Na figura 2 observa-se que o peptídeo 47 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade apresentada quando a proteína A2 recombinante foi testada frente aos mesmos soros, como descrito por Porrozzi et. al. (2007).

Exemplo 3

Para testar a reatividade do peptídeo 17, derivado do antígeno

nucleosídeo hidrolase (NH), como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4Mg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 17 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos.

Na figura 3 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo foi capaz de detectar 80% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 17 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.

Exemplo 4

Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando o peptídeo 17, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).

Na figura 4 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 17 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade por outros testes de diagnóstico que com freqüência não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos.

Exemplo 5

Para testar a reatividade do peptideo 18, derivado do antígeno

nucleosídeo hidrolase (NH)1 como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito no exemplo 1. Inicialmente o peptideo 18 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos

Na figura 5 observa-se que, nas condições testadas, o peptideo 18 foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptideo 18 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.

Exemplo 6

Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando-se o peptideo 18, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros

utilizados por Porrozzi et. al. (2007).

Na figura 6 observa-se que, nas condições testadas, o peptideo 18 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade apresentada por outros testes de diagnóstico que, com freqüência, não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos. Exemplo 7

Para testar a reatividade do peptídeo 19, derivado do antígeno LACK1 como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito, no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 18 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos.

Na figura 7 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo foi capaz de detectar 80% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 19 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.

Exemplo 8

Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando-se o peptídeo 19, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et al. (2007). Na figura 8 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 19 foi

capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade por outros testes de diagnóstico que com freqüência não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos.

Exemplo 9

Considerando que a detecção da infecção em cães com baixos títulos de anticorpos também é uma limitação de testes de diagnóstico que empregam os antígenos K39 e K26, como demonstrado por Porrozzi et al. (2007), os peptídeos 47 (derivado de A2), 17 e 18 (derivados de NH) e 19 (derivados de LACK) foram testados isoladamente ou em associação, com o intuito de aumentar a sensibilidade para soros de cães com títulos de anticorpos baixos ou médios. Esses soros são provenientes de animais com exame parasitológico positivo, mas com títulos de anticorpos baixos ou médios, como detectado na reação de imunofluorescência ou em ELISA com extrato antigênico de formas promastigotas do parasita, testes considerados convencionais para o diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina. Ressalta-se mais uma vez que, nessa faixa de detecção, os testes sorológicos empregando antígenos definidos como o K39 ou K26 têm limitações de sensibilidade.

Nas figuras 9, 10,11, 12, 13 e 14 comparam-se os resultados dos testes realizados com os peptídeos 47, 17, 18 e 19 isoladamente ou associados 2 a 2. Cabe mencionar que associações desses peptídeos 3 a 3 não resultaram em dados expressivos, uma vez que quando associados 2 a 2 o limite máximo de

sensibilidade do teste foi atingido.

A figura 9 compara a reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 17 (500 ng/poço) frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Esses soros são provenientes de animais com exame parasitológico positivo, mas com títulos de anticorpos baixos ou médios, como detectado na reação de imunofluorescência ou em ELISA com extrato antigênico de formas promastigotas do parasita, testes considerados convencionais para o diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina. Ressalta-se mais uma vez que, nessa faixa de detecção, os testes sorológicos empregando antígenos definidos como o K39 ou K26 têm limitações de sensibilidade. Observa-se que, nessas condições, a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 17 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.

Na figura 10 observa-se que a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 18 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.

Na figura 11 observa-se que, a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.

Na figura 12 observa-se que, a associação do peptídeo 17 com o peptídeo 18 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.

Na figura 13 observa-se que, a associação do peptídeo 17 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.

Na figura 14 observa-se que, a associação do peptídeo 18 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.

Exemplo 10

Os peptídeos 47, 17, 18 e 19 foram empregados também em reações de ELISA com soros humanos de pacientes com diagnóstico de Ieishmaniose visceral, tendo como controles soros de indivíduos hígidos. Na figura 15, são apresentados os dados das reações de ELISA em que os peptídeos foram testados isoladamente na quantidade de 4pg/poço. Isoladamente, os peptídeos 17, 18, 19 e 47 apresentaram sensibilidade de 86,6%, 96,6%, 100% e 90%, respectivamente. Esses valores são próximos ou superiores à sensibilidade relatada para testes de diagnóstico da LV humana, tais como as técnicas RIFI (imunofluorescência indireta) (88%), ELISA L. (L.) chagasi 92%, empregando antígenos de formas promastigotas do parasita ou a ELISA empregando o antígeno recombinante rK39 (97%) ou para o teste imunocromatográfico rápido IT-LEISH® (DiaMed IT-LEISH®) (93%) que também emprega o K39 (Machado

de Assis et. al., 2008)

Na figura 16, são apresentados os dados das reações de ELISA em que os peptídeos foram testados em associação. Observa-se aumento de sensibilidade quando o peptídeo 19 foi associado aos peptídeos 47 e 18, alcançando um valor de 100%. Embora o valor de 100% de sensibilidade tenha sido alcançado nos testes em que o peptídeo 19 foi avaliado isoladamente, a sua associação melhorou a sensibilidade do testes empregando os peptídeos 47 e 18, os quais, isoladamente, apresentaram 90 e 96,6% de sensibilidade.

Para as outras associações não foram observadas alterações significativas. Considerando a heterogeneidade da condição clínica dos pacientes e da resposta imune humoral dos mesmos, a associação de peptídeos pode ser uma alternativa para o aprimoramento de testes de diagnóstico, uma vez que epítopos adicionais são acrescentados aos testes sorológicos. Esses resultados demonstram a capacidade dos peptídeos testados de otimizar a sensibilidade dos testes para detecção de Ieishmaniose visceral humana.

Claims (20)

1. Peptídeos recombinantes de Leishmania caracterizados por consistir das seqüências SEQ ID Nos 1, 2, 3 e 4.

2. Peptídeos recombinantes de Leishmania, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por poderem ser modificados em suas extremidades.

3. Método para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose caracterizado por compreender: a) ligação de anticorpos Ieishmaniais de uma amostra a um ou mais polipeptídios, ligados a um suporte sólido ou um carreador, consistindo das seqüências de aminoácidos SEQ ID Nos 1, 2, 3 e 4 ou consistindo das proteínas recombinantes definidas associadas rA2, rNH e rLACK, SEQ ID Nos 5, 6 e 7 respectivamente. b) contactar os anticorpos do passo (a) com um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se ligam aos anticorpos do passo (a) c) detectar os anticorpos antileshmaniais na amostra supracitada pela detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados ao dito anticorpo anti-leishmanial.

4. Método para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos polipeptídeos SEQ ID Nos 1, 2, 3 e 4 poderem ser modificados em suas extremidades.

5. Método para teste Imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelas amostras serem selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e outro fluído corporal.

6. Método para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado de um grupo de materiais consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e poliestireno.

7. Método para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo carreador ser uma partícula de ouro.

8. Método para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado de um grupo consistindo de IgG1 IgM1 IgA1 IgE e subclasses deles.

9. Método para teste imunodiagnostico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proteína ser selecionada de um grupo consistindo de Proteína A e Proteína G.

10. Método para teste Imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo consistindo de fosfatase alcalina, peroxidase, β- galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.

11. Método para teste Imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

12. Método para teste Imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo passo de detecção do anticorpo anti Ieshmanial ser selecionado do grupo consistindo de detecção de fluorescência, de imunoluminescência, de absorbância ou de radioisótopos.

13. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, caracterizado por compreender: - os peptídeos consistindo das seqüências SEQ ID Nos 1, 2, 3 e 4 associados ou isolados ou as proteínas recombinantes definidas rA2, rNH e rLACK associadas representadas pelas SEQ ID Nos 5, 6 e 7 respectivamente; - Um anticorpo secundário ou uma proteína, onde o anticorpo secundário ou a proteína está conjugado a um enzima ou marcador, e um reagente para detectar a dita enzima ou marcador.

14. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelas proteínas recombinantes ou os peptídeos estarem ligados a uma suporte sólido ou carreador.

15. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose,de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de material consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e polistireno.

16. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo carreador consistir de partículas de ouro.

17. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado do grupo consistindo de IgG, IgM, IgA, IgE e subclasses deles.

18. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela proteína ser selecionada do grupo consistindo de proteína A e proteína G.

19. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose,de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo dito marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, redioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

20. Kit para teste imunodiagnóstico de Leishmaniose,de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase, uréase, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.