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BRPI0903089A2 - peptìdeos recombinantes e motivos proteicos miméticos a antìgenos de leishmania e suas aplicações - Google Patents

peptìdeos recombinantes e motivos proteicos miméticos a antìgenos de leishmania e suas aplicações Download PDF

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BRPI0903089A2
BRPI0903089A2 BRPI0903089-1A BRPI0903089A BRPI0903089A2 BR PI0903089 A2 BRPI0903089 A2 BR PI0903089A2 BR PI0903089 A BRPI0903089 A BR PI0903089A BR PI0903089 A2 BRPI0903089 A2 BR PI0903089A2
Authority
BR
Brazil
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seq
sequence
thr
topology
wing
Prior art date
Application number
BRPI0903089-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Luiz Ricardo Goulart Jr
Juliana Franco Almeida
Flavia Figueira Messias
Fausto Emilio Capparelli
Ana Graci Brito Madurro
Joao Marcos Madurro
Carlos Roberto Prudencio
Souza Guilherme Rocha Lino De
Ana Paula Peres Freschi
Rone Cardoso
Original Assignee
Univ Fed De Uberlandia
Fundacao De Amparo A Pesquisa
Imunoscan Engenharia Molecular Ltda Me
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Publication date
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Publication of BRPI0903089A2 publication Critical patent/BRPI0903089A2/pt
Publication of BRPI0903089B1 publication Critical patent/BRPI0903089B1/pt
Publication of BRPI0903089B8 publication Critical patent/BRPI0903089B8/pt

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

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Abstract

PEPTìDEOS RECOMBINANTES E MOTIVOS PROTEICOS MIMéTICOS A ANTìGENOS DE LEISHMANIA E SUAS APLICAçõES. A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes, suas sequências reversas e motivos proteicos que mimetizam regiões antigênicas parciais de proteínas de Leíshmania e antígenos de interesse diagnóstico e vacinal para as doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania. Os peptideos objetos desta invenção foram selecionados por "Phage Display" e são alvos para utilização em imunodiagnósticos e em composições vacinais para o controle dos diferentes tipos de doença provocados pelos parasitos do gênero acima citado por serem especificamente imunorreativos com o soro de indivíduos infectados.

Description

"PEPTÍDEOS RECOMBINANTES E MOTIVOS PROTEICOS MIMÉTICOS AANTÍGENOS DE LEISHMANIA E SUAS APLICAÇÕES"
A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização depeptídeos recombinantes, suas seqüências reversas e motivos proteicos quemimetizam regiões antigênicas parciais de proteínas de Leishmania eantígenos de interesse diagnóstico e vacinai para as doenças causadas porparasitos do gênero Leishmania. Os peptídeos objetos desta invenção sãoalvos a serem utilizados em imunodiagnósticos e em composições vacinaispara o controle dos diferentes tipos de doença provocados pelos parasitos dogênero acima citado:
Apesar do progresso no diagnóstico e no tratamento, as Ieishmaniosescontinuam sendo um problema de saúde pública, particularmente nos paísesem desenvolvimento. O impacto das Ieishmanioses na saúde humana foigrosseiramente subestimado por muitos anos, sendo esta doença hoje15 classificada como uma das principais doenças negligenciadas pelaOrganização Mundial de Saúde (Zimmermann S. et al., Protist:, 160:151-8,2009).
O agente causador das Leishmanioses, Leishmania, é um parasitotripanossomatídeo intracelular obrigatório, que tem um ciclo de vida bifásicoconsistindo de um estágio promastigoto uniflagelado, que reside dentro do tratodigestivo do vetor e um estágio amastigoto, que se multiplica dentro dosfagolissomos de macrófafos de células de mamíferos (Wong A. K. C. Biochem.Cell Biol.; 73:235-40, 1984). Existem 30 espécies de Leishmania das quais 10ocorrem no Velho Mundo e 20 no Novo Mundo. Todas as espécies do VelhoMundo pertencem ao subgênero Leishmania e sete são conhecidas por infectaro homem. Existem também 11 espécies do mesmo subgênero no Novo Mundo,das quais cinco não são encontradas no homem. Parasitos do subgêneroViannia ocorrem somente no Novo Mundo e das nove espécies conhecidas,oito infectam o homem (Shaw J. J. Mem. inst. Oswaldo Cruz; 89:471-8, 1994). Parasitos do gênero Leishmania são transmitidos por picadas demosquitos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomya no NovoMundo (Desjeux P. H., Clin. Dermatol.; 80:271-4, 1996, Grimaldi G. Tesh R. B.,Clin. Microbiol. Rev.; 6:230-50, 1993).
Dependendo da espécie do parasito e da condição imunológica dohospedeiro, as manifestações podem variar de lesões cutâneas crônicas àforma letal da infecção (Murray H. W. et ai., Lancei, 366:1561-1567, 2005),apresentando o seguinte espectro de manifestações clínicas: a Ieishmaniosetegumentar que varia da forma cutânea à mucocutânea (LC e LMC),representando o pólo responsivo para a Ieishmaniose cutânea difusa (LCD) ea Ieishmaniose visceral (LV) que abrange a forma subclínica e a doença fatal(Oliveira C. I. et al., Drug. Discov. Today: Dis. Models; 1:81-6, 2004).
A Leishmaniose é um problema de saúde pública e afeta 88 países,sendo 72 classificados como países em desenvolvimento, incluindo 13 dospaíses menos desenvolvidos. Dos casos de LV, 90% ocorrem em apenas cincopaíses - Bangladesh, índia, Nepal e Brasil; 90% dos casos de LC ocorrem emapenas sete países - Afeganistão, Algeria, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita eSíria. A incidência anual das Ieishmanioses é de 1,5 a 2 milhões de casos,sendo 1-1,5 milhão para Ieishmaniose cutânea e 500.000 para a forma visceral;tendo a urbanização como um fator crucial para a incidência (WHO.Tfte WeeklyEpidemiological Record, 77:365-72, 2002 e www.who.int/tdr/diseases/leish).
A Ieishmaniose brasileira comportava-se como uma antropozoonoserural, mas, após a década de 80, observou-se sua expansão também para asregiões periurbanas de grandes cidades. Mudanças ambientais causadas peloshumanos têm modificado o perfil epidemiológico das Ieishmanioses em áreasonde é relacionada com a vida selvagem, assim como em áreas onde atransmissão dá-se em áreas rurais periurbanas ou vizinhança urbana e áreasem volta das casas. Em cada área, a transmissão depende da adaptação dasespécies de mosquito (potenciais vetores) a estes ambientes e envolve animaisdomésticos (L. chagasi, causando a forma visceral da leishmaniose, e L.braziliensis, causando a forma cutânea e mucosa) (Tolezano J. E. et al., Rev.Inst. Adolfo Lutz; 40:49-54, 1980; Marzochi M. C. A. J. Bras. Med.; 63:82-104,1992; Marzochi Μ. C. Α. et al., Cad. Saude Publica; 10:359-75, 1994).
Várias espécies de mamíferos têm sido reportadas como naturalmenteinfectadas por Leishmania spp., em áreas endêmicas os cães sãoconsiderados os maiores reservatórios da Leishmaniose Visceral Humana(Palatinik-de-Souza, C. B. et al, Am. J. Trop. Med. Hyg.; 65:510-517, 2001 eWHO, Report of the Second WHO Meeting on Emerging infectious Diseases,1995).
O diagnóstico da LV não pode ser baseado somente nos sintomasclínicos porque esta compartilha seus sintomas com outras doenças como amalária, febre tifóide e tuberculose, ocorrendo comumente na mesma área dasIeishmanioses (Goto Y. et al, lnfect. Immun.] 74:3939-45, 2006). Para a LVzoonótica, um diagnóstico rápido e seguro é ferramenta necessária em funçãoda grande variabilidade de sintomas clínicos e da presença de cãesassintomáticos, porém infectivos (Dye C et al., Epidemiol Infect.] 103:647-56,1993). O número de pessoas infectadas assintomáticas é mais alto que onúmero de pessoas infectadas que apresentam sintomas da doença. Por estarazão, é importante saber como pessoas infectadas vão desenvolver a doençae como elas podem ser diagnosticadas antes de mostrarem as manifestaçõesclínicas (Singh S. et al., J. Parasitol.; 81:1000-3, 1995).
A escolha dos antígenos é importante, pois o uso de antígenos totais ouparasitas inteiros, freqüentemente resultam em uma baixa especificidade nadetecção de anticorpos específicos para a doença (Reed S. G. et al., JImmunol.] 138:1596-601, 1987).
Nos últimos anos, vários antígenos têm sido caracterizados com afinalidade de melhorar o potencial vacinai e o diagnóstico da Ieishmaniosehumana e canina. O desenvolvimento da reação em cadeia de polimerase eimunoensaios baseados em antígenos recombinantes são destinados amelhorar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico da LeishmanioseVisceral e diminuir a reatividade cruzada mostrada por antígenos totais (GomesΥ. M. et al., Vet. J.] 175:45-52, 2008).
O medicamento mais comumente usado, desde a década de 50, é oantimoniato N-metil Glucamina (Glucantime®) e permanece como método deescolha para o tratamento inicial, que apresenta resistência em 10% dos casos.Nessa circunstância, utiliza-se a Anfotericina B, que foi recentementeassociada a partículas de Iipossomos (partículas lipídicas artificiais), reduzindoos efeitos sistêmicos provocados pelo tratamento (Berman J. D. Clin. Infect.Dis.; 24:684-703, 1997 e Lee Μ. B. et al., Infect. Med.; 16:34-45, 1999).
Na situação atual, a quimioterapia não tem sido suficiente para ocontrole zoonótico da Ieishmaniose visceral e a vacinação necessita serconsiderada; o entendimento dos mecanismos imunológicos envolvidos naresistência e susceptibilidade a infecção por Leishmania é fundamental para odesenvolvimento de ferramentas imunoprofiláticas (Rosa R. et al., Vaccine\25:4525-32, 2007).
Nos últimos anos, a clonagem de DNA e a caracterização de antígenose proteínas recombinantes derivadas de Leishmania têm sido realizadas,levando a um grande avanço nos métodos diagnósticos e na busca de umavacina eficaz para a profilaxia das leishmanioses. Alguns desses antígenos sãodescritos abaixo.
Moléculas como Glicosilfosfatidilinositol (GPI), Glicosilfosfolipídios(GIPL), Lipofosfoglicanos (LPG), Fosfoglicanos (FG), Proteofosfoglicanos(PPG), Leishmaniolisina (gp63) e Cisteína Proteases (CPs), são discriminadascomo cruciais para a infecção por Leishmania, mas não produzem nenhumapatologia no hospedeiro (Chang Κ. P. et al., Kinetoplast. Biol. Dis.; 1:1, 2002).
As Proteínas de Superfície de Promastigotos (PSP), também conhecidascomo gp63, são glicoproteínas de superfície de membrana que possuematividade proteolítica, esta proteína é altamente imunogênica, apresentandoreatividade cruzada entre as diferentes espécies de Leishmania, embora osanticorpos produzidos por essa molécula não sejam efetores no controle dainfecção (Mood S. F. Acta Trop.; 53:185-204, 1993 e Wright Ε. P. et al.,Biochem. Cell Biol.; 525-36, 1989). A expressão diferencial dos genes gp63resulta em diferentes quantidades da proteína gp63 no desenvolvimento in vitrodas formas promastigotas para a forma infecciosa (Ramamoorthy R. et al., J.Biol. Chem.; 267:1888-95, 1992).
Glicoconjugados Iigantes de Fucose-Manose (FML) constituem umcomplexo de proteínas antigênicas de formas promastigostas de L. (L.)donovani que são utilizados em testes sorológicos para diagnóstico, avaliaçãodo prognóstico e controle do calazar humano, além de serem propostos emtriagens de doadores de sangue de regiões endêmicas de caiazar (Otero A. C.S. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 62:128-131, 2000 e Palatinik de Souza C. B.et al., Trans. R. Soe. Trop. Med. Hyg.; 89:390-3, 1995).
O principal componente imunoprotetor da FML é a fração glicoprotéicadesignada GP36 (Paraguai de Souza E. et al., Vaccine, 19:3014-15, 2001),reconhecido unicamente por soros de pacientes com calazar humano (Palatinikde Souza C. B. et al., Rev. Soe. Bras. Med. Trop.; 29:153-63, 1996). O genecodificante da nucleosídio hidrolase de L. (L.) donovani, que é um componentedo antígeno GP36, foi isolado demonstrando que LdNH recombinante é útil nodiagnóstico de calazar em cães uma vez que reage preferencialmente com IgGsubtipo 1 de imunoglobulina que é aumentado em cães susceptíveis ao calazare na doença avançada. (Santana D. M. et al., Mol. Biochem. Parasitol.;120:315-9, 2002).
A clonagem molecular, caracterização e expressão dos antígenos K9 eK26 (Bathia A. et al., Mol. Biochem. Parasito.; 102:249-261, 1999), demonstrouque a K26 (proteína hidrofílica de 247 aminoácidos, contendo 11 repetições de14 aminoácidos, 64% da proteína total) é um marcador diagnóstico altamenteespecífico para avaliar a infecção no soro de indivíduos com Ieishmaniosevisceral.
O antígeno denominado KMP-11 (principal determinante protéico demembrana de protozoários kinetoplastídeos) parece ser antigênico e mostrauma resposta de anticorpos relativamente forte durante o curso natural dasIeishmanioses e doença de Chagas. A observação de reação imunológicacruzada em infecções causadas por Leishmania e T.cruzi é particularmenteimportante, contradizendo estudos que relataram a alta sensibilidade dadetecção destes anticorpos em pacientes com leishmaniose. O mapeamentode determinantes antigênicos em KMP-11 utilizando peptídeos sintéticosrevelou a existência predominante de epítopos conformacionais nas infecçõesde Leishmania (Trujillo C. et al., Immunol. Lett.; 70:203-9, 1999).
Um antígeno de Leishmania chagasi - LcKin1 com homologia àsuperfamília de proteínas motoras (kinesinas), denominado K39, foidemonstrado como predominante em amastigotos, e contém um domíniorepetitivo extenso altamente relacionado entre as espécies de L. chagasi e L.donovani. Altos títulos de anticorpos foram encontrados para o antígeno rK39,que contem várias repetições de 39 aminoácidos, demonstrando aconservação da região repetitiva entre as espécies mencionadas (Burns J. M.et al., Proc. Natl. Ac. Sci.; 90:775-9, 1993). Com a descoberta deste antígeno,muitos pesquisadores têm testado a sua viabilidade em diferentes testesdiagnósticos para a Leishmaniose Visceral, a maioria deles mostrandoresultados altamente promissores, na tentativa de utilização de métodosdiagnósticos menos invasivos e economicamente viáveis para a população. Adetecção de anticorpos IgG para este antígeno tem sido extremamentesensível e específica no diagnóstico da Leishmaniose Visceral, embora sejadifícil apontar alguma função protetora para estes anticorpos específicos(Carvalho S. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:231-324, 2003 e Chang KP etal. Kinetoplasti. Bioi. Dis.; 1:1, 2002).
Vários autores apontam a viabilidade de testes diagnósticos utilizando oantígeno rk39 em diferentes metodologias. A especificidade e sensibilidade sãona maioria dos casos muito promissoras. Foram testados 228 casosparasitologicamente confirmados utilizando rK39 em ELISA para captura deIgG e teste imunocromatrográfico ("dipstick test"), os resultados apontaram100% de sensibilidade e especificidade para ambos os casos (Singh S. et al.,Ciin. Diag. Lab. Immunol.; 9:568-72, 2002); resultados similares foram obtidosmostrando a sensibilidade do antígeno rK39 "strip test" e ELISA de 90% e 89%,respectivamente, enquanto a especificidade foi de 100% e 98%respectivamente (Carvalho S. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:231-324,2003). Foi também analisada a eficácia do antígeno rK39 em Testes deAglutinação Direta - DAT (100% de sensibilidade e especificidade) e "dipsticktest" com 85,7% de sensibilidade e 82% de especificidade (Schallig H. D.; etal., Mymensingh Med. J.; 12:93-7, 2002).
Análises semelhantes foram feitas para os testes de ELISA (Salotra S. etal., Methods Enzymol.; 217:228-57, 2003; Maalej I. A. et al., Am. J. Trop. Med.Hyg.; 68:312-20, 2003; Sreenivas G. et al., Br. J. Biomea. Sc/'.; 59:218-22,2002; Braz R. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 67:244-348, 2002; Singh et al.,J. Parasitol.; 81:1000-3, 1995; Qu J. Q. et al., Trans. R. Soe. Trop. Med. Hyg.;88:543-5, 1994; Kumar R. et al., Clin.Diag. Lab. Immunol.; 8:1220-4, 2001;Ozensoy S. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 59:363-9, 1998; Zijlstra Ε. E. et al.;Clin. Diagn. Lab. Immunol.; 5:717-20, 1998; Medrano F. J. et al., Am. J. Trop.Med. Hyg.; 59:155-62,1998; Badaró R et al., J. Infect. Dis.-, 173:758-61, 1996).
Muitos autores avaliaram o uso do rK39 utilizando testesimunocromatrográficos (Sarker C.B. et al., Mymensingh Med. J.; 12:93-7, 2003;Carvalho S. F. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 68:231-324, 2003; Boelaert M. etal., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 70:72-7, 2004; Chappuis F. et al., Trop. Med. Int.Health.; 8:277-285, 2003; Veeken H et al. Trop. Med. Int. Health.; 8:164-7,2003; Qu J. Q. et al., Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong BingZa Zhi 18:155-8, 2000; Delgado O. et al., Parasite; 8:355-7, 2001; Berm C. etal., Am. J. Trop. Med. Hyg.; 63:153-7, 2000 e Zijlstra Ε. E. et al., Trop. Med. Int.Health; 6:108-3, 2001).
Embora o antígeno tenha sido reportado como satisfatório, resultadosvariam consideravelmente em diferentes áreas endêmicas, por razões queainda não são claras, pacientes sudaneses desenvolvem títulos mais baixos deanticorpos anti-rK39 que pacientes indianos, apesar de que o formato do testepossa ser o fator, pois outras marcas de testes imunocromatrográficosfuncionam melhor nesta região (Sudar S. et al., Trop. Med. Int. Health; 12:284-9, 2007 e Titmeijer k. et al., Am. J. Trop. Med. Hyg.\ 12:74-76, 2006).
Um antígeno de L. major, designado LACK (Leishmania homologue ofreceptor for activated C kinase), foi identificado a partir da busca por antígenosreconhecidos por um clone Th1 protetor derivado do baço de camundongoBALB/c infectado com um extrato solúvel de promastigotos de L. major. Aseqüência de aminoácidos deduzidas deste antígeno tem homologiasubstancial com os receptores intracelulares para Kinase C ativada (RACKs) eapresenta alta homologia entre L major e L. chagasi (Mougneau E. et al.,Science; 268:245-52, 1995). Tem sido sugerido que a proteína LACK contémum epítopo imunodominante que representa o aivo da resposta imune inicial(Requena J. M. et al., Parasitol. Today; 16:246-50, 2000). O antígeno LACK éuma proteína de 36 KDa bem conservada presente em todas as espécies eestágios de desenvolvimento da Leishmania e é um dos antígenos maisimunogênicos (Mougneau E. et al., Science; 268:245-52, 1995). Este antígenotem sido usado para avaliar a utilização de vacinas de DNA codificando este eoutros antígenos (ex: LmSTM e TSA). A combinação desses antígenos temconferido proteção durável e completa contra o desenvolvimento de lesõescutâneas (Méndez S. et al., Vaccine; 31:3702-4, 2002).
Alguns dos antígenos anteriormente descritos são objetos de estudo nabusca de vacinas, quimioterápicos ou imunodiagnósticos eficazes dasLeishmanioses, sendo objetos das patentes abaixo descritas:
A patente FR2844511 demonstrou o uso de peptídeos de 16aminoácidos e suas variações para tratamento da Ieishmaniose e indução daresposta imune Th1 em mamíferos, descreve também a utilização de um kit dediagnóstico contendo um desses peptídeos ou seus derivados ligados amoléculas de biotina ou polilisina acoplados a nitrocelulose ou outros polímeroscomo membranas, látex ou outros materiais.
A patente W09711180 e W00179276 descrevem composições emétodos para prevenção, tratamento e diagnóstico das leishmanioses eestímulo da resposta imune em pacientes utilizando porções imunogênicas dosantígenos M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-210 e LbelF4A, Lmspla, Lmso9A e MAPS-1 de Leishmania ou porções destes e suas variações. Para o mesmo fim, apatente W02007121184 descreve a utilização de polipeptídeos e proteínas defusão contendo ao menos uma porção imunogênica de um ou mais antígenosde Leishmania e variantes por meio da seleção de regiões protéicas em"tandem".
A patente CA2503932 demonstra novas proteínas de Leishmania major,as quais compreendem polipeptídeos e polinucleotídeos secretados ouexcretados e seus fragmentos funcionais e a utilização destes peptídeos comovacinas e terapêuticos, além da utilização de anticorpos gerados a partir dosmesmos.
A patente W02007142695 descreve a utilização de um kit dediagnóstico rápido para detecção de formas amastigotas, promastigotas ouproteínas secretadas ou excretadas de Leishmania, que pode ser usado nocampo levando ao tratamento mais rápido da Ieishmaniose cutânea, utilizandoanticorpos anti- antígeno TSA (Thiol Specific Antigen).
A patente PI0605889-2 demonstra a utilização de antígeno solúvel nodiagnóstico da Ieishmaniose visceral canina através da reaçãoimunoenzimática de ELISA.
A patente US5965142 descreve composições e métodos para odiagnóstico de Leishmania tropica utilizando um ou mais epítopos da proteínaLt-210, com potencial uso em vários tipos de imunoensaios pra a detecçãodeste parasito, podendo tais peptídeos serem utilizados também emcomposições vacinais.
A patente US2007292847 descreve novas seqüências de aminoácidos eácidos nucléicos de Leishmania major (LmPDE - fosfodiesterases) e anticorposIigantes a estas seqüências para formação de complexos no diagnóstico etratamento das desordens relacionadas com as doenças causadas por esteparasito.
A patente W09633414 descreve um método de prevenção e dediagnóstico sorológico da infecção por Leishmania, por meio de um ou maispolipeptídeos em métodos e kits de diagnóstico para avaliação de amostrasindividuais de sangue e identificação de indivíduos assintomáticos. Estespolipeptídeos compreendem um epítopo de LcPO (Leishmnia chagasi homologof eukariotic acid ribossomal P-protein family) e variantes deste que diferemsomente em substituições ou modificações conservativas.A patente W02005063803 descreve a utilização de compostos emétodos para a detecção de anticorpos em indivíduos suspeitos de infecçãopor parasitos do gênero Leishmania, principalmente cepas indianas oucorrelacionadas e a utilização de um kit de diagnóstico relacionado;demonstrando o isolamento, caracterização e uso da região imunogênica dogene relacionado a kinesina, isolado da cepa de Leishmania donovaiMHOM/IN/DD8 e MHOM/IN/KE16/1998 e correlação das seqüências dosácidos nucléicos isolados de cepas indianas e L. chagasi.
A patente US7008774 propõe um imunoensaio para detecção deanticorpos do tipo IgM e IgG e detecção de antígenos circulantes em amostrasde indivíduos com Ieishmaniose visceral, cutânea ou canina. Relata também autilização de um imunoensaio de imuno-captura para detecção de antígenosliberados pelos parasitos.
A patente ES2133236 descreve a utilização de um antígenorecombinante para diagnóstico sorológico da Ieishmaniose canina utilizando umgene quimérico que codifica antígenos específicos de L. infantum (LiP2a,LiP2b, LÍPH2A, LiPO); para tal fim, os fragmentos de DNA dos genes destasproteínas foram adicionados seqüencialmente na região 5' do vetor gerandoum polipeptídeo com massa molecular de 38K e ponto isoelétrico de 7.37.
A patente W09639524 descreve métodos e compostos relacionados aosantígenos LbelF4A ou LmelF4A de Leishmania, analisando a resposta imunetanto para a proteína como para o antígeno codificado por vacina de DNA.
A patente DE10156679 demonstra a utilização do antígeno p36-LACKna construção de um cassete de expressão para tratamento e composiçãovacinai para infecções por leishmanias. Da mesma forma, a patenteUS2004235772 descreve a expressão de DNA utilizando o antígeno p36 LACKpara tratamentos de infecções por Leishmania assim como vacinacorrespondente e a patente W02005039633 demonstra a expressão de DNApara geração de resposta imune utilizando os antígenos p36-LACK, TSA, Kmp-11 e o antígeno gp63 de Leishmania infantum ou seus derivados com funçãocorrespondente.A patente W00181388 relata o uso de poliptídeos, proteínas e ácidosnucléicos que contenham no mínimo uma porção da proteína Lip2a (acidicribosomal protein from Leishmania infantum) ou variantes desta para gerarresposta imune em indivíduos ou grupos celulares ou serem utilizadas comoagentes terapêuticos para Leishmania e como adjuvante para outros parasitos.
A patente W02007144903 utiliza o antígeno KMP-11 como uma vacinacelular híbrida contra leishmanioses, enquanto a patente US2008145385descreve métodos pra imunizar mamíferos infectados com cepas virulentas deLeishmania pela administração de uma vacina de DNA do antígeno KMP-11(Kinetoplastid Membrane Protein-11).
A patente US2008026467 apresenta seqüências de DNA capazes decodificar PSAs (Promastigote Surface Antigens) de formas promastigotas eamastigotas de Leishmania para serem utilizadas em composições vacinaiscontra Leishmania.
A patente US2004170636 descreve a produção de uma vacina de DNAque estimula resposta imune contra infecções por Leishmania utilizando o geneA2 de Leishmania donovani. A utilização deste antígeno é também base dapatente PI0603490-0 que ressalta a sua utilização em vacinas garantindo adiferenciação de animais naturalmente infectados daqueles vacinados. Apatente PI0601225-6 também descreve a utilização de antígenos vacinais deespécies diferentes, visando esta discriminação.
A patente W02006122382 (BRPI0503187) descreve a obtenção decomposições vacinais bloqueadoras da transmissão de Ieishmaniose emhumanos e animais a partir de frações de Leishmania (Ligante de Fucose-Manose - FML de amastigotas ou promastigotas de L. donovani).
A patente W02006110915 descreve a utilização de uma vacinacompreendendo um ou mais antígenos selecionados a partir de um grupo dehomólogos de Leishmania chagasi ou proteínas hipotéticas de L. infantum eproteína do grupo K-39 de L. infantum.
A patente W002072792 demonstra que a utilização das proteínas deLeishmania TSA ou MAPS (Leishmania thiol-specific thiol-specificantioxidant),LeIF (L braziliensis gene homologous to the eukaryotic ribosomal proteinelF4A, também chamada de "LbelF4A"), M15 (L. major stress-inducible 1 ouLmSTII) e 6H (L. braziliensis gene homologous to the gene for the eukaryotic83-kDa heat shock protein, também chamada de "Lbhsp83") quandofusionadas a seqüências polinucleotídicas heterólogas são capazes deaumentar a expressão de polinucleotídeos heterólogos em céluias eucarióticas.Estes polipeptídeos de fusão de Leishmania isolados ou purificados podem serutilizados para tratamento ou prevenção de infecções por Leishmania ou outrosorganismos como M. Tuberculosis. A patente FR2862313 descreve a construção e isolamento de ácidosnucléicos que codificam uma região imonogênica de formas amastigotas epromastigotas de Leishmania, podendo ser utilizadas em composições vacinaisou para gerar anticorpos e serem utilizados no diagnóstico.
A patente FR2826018 descreve o isolamento do gene codificante daproteína LmPDI, que possuiu duas regiões com seqüências idênticas (Cys-Gly-His-Cys) reconhecidas como alvo terapêutico para o desenvolvimento demedicamentos e um novo elemento para composição de vacinas contraLeishmania para humanos e animais.
A tecnologia de "Phage Display" ou exposição de biomoléculas em fagostem apresentado uma utilização cada vez mais crescente em diversas áreasdas ciências desde que descrita no ano de 1985 (Smith G. P. Science228:1315-17, 1985). Este autor foi o pioneiro a conseguir a expressão daenzima de restrição Eco Rl como uma fusão da proteína três (plll) do capsídeoviral.
Bacteriófagos, ou simplesmente fagos, são vírus que infectam umavariedade de bactérias Gram-negativas usando o pilus sexual como receptor.As partículas de fagos filamentosos (linhagens M13, f1 e fd), que infectam E.coli via pilus F consiste de um DNA de fita simples incluso em uma cápsulaprotéica. Um fago viável expressa aproximadamente 2.700 cópias da proteínagene 8 (g8 ou pVIII, uma proteína de 50 resíduos de aminoácidos) e 3 a 5cópias do gene Ill (p3p ou plll) proteína de 406 aminoácidos (Russel M., Mol.Microbiol.; 5:1607-13, 1991).
Em sistemas onde todas as plll ou pVIII são utilizadas, o tamanho daproteína inserida no vetor é limitado, pois grandes proteínas interferem nasfunções das proteínas do capsídeo, tornando o fago pouco infectivo. Estesistema "Phage display" foi criado para a exposição de bibliotecas de pequenospeptídeos (no máximo 30 aminoácidos) (Phizicky E.M. Fieids S., MicrobioLRev.\ 59:94-123, 1995).
A exposição em fagos filamentosos é baseada na clonagem defragmentos de DNA codificantes de milhões de variantes de certos Iigantes(Benhar I. Biotechnol. Adv.; 19:1-33, 2001), como proteínas, incluindoanticorpos, ou peptídeos. As seqüências de DNA de interesse são inseridas emuma localização no genoma de bacteriófagos filamentosos, de modo que aproteína codificada é expressa na superfície do fago filamentoso como umproduto de fusão a uma das proteínas da superfície do fago (Azzay Η. Μ. E. etal. Clin. Biochem.; 35:425-45, 2002).
A conexão entre genótipo e fenótipo, permite o enriquecimento de fagosespecíficos, como por exemplo, utilizando a seleção em um alvo imobilizado(Benhar I. Biotchno. Adv.; 19:1-33, 2001).
O "Biopanning" ou procedimento de seleção é feito pela incubação dabiblioteca de peptídeos expostos em fagos contra o alvo. Na maioria das vezes,o alvo é retido em placas de ELISA, mas também se utiliza "beads", resinas emembranas. Os fagos não Iigantes ao alvo são eliminados por lavagenssucessivas, e os fagos específicos permanecem ligados para posterior eluição.O "pool" de fagos específicos é amplificado para os ciclos posteriores deseleção biológica ou "biopanning" (ciclos de ligação, eluição e amplificação)para o enriquecimento do conjunto de fagos com seqüências específicas contrao alvo. Após três ou quatro passagens, os clones individuais sãocaracterizados por sequenciamento de DNA, "Western Blot" ou ELISA (SmithG. P. Science; 228:1315-17, 1985).
Como alternativa ao "panning" contra um alvo imobilizado em umasuperfície, a biblioteca pode reagir com um alvo em solução, dada pelaafinidade de captura do complexo alvo-fago em uma matriz de afinidade("bead") específica para a proteína alvo. O experimento requersubstancialmente menos alvo por experimento que o "panning" em superfície,podendo resultar em uma maior acessibilidade do sítio Iigante para ospeptídeos expressos nos fagos, assim como evitar a desnaturação parcial doalvo na superfície plástica (Barbas, C. et al., Cold Spr. Har. Lab. Press, NY;2001).
Oligonucleotídeos sintéticos com um comprimento constante, mas comcódons não especificados, randomizados por mutagênese sítio-dirigida, usandodeoxinucleotídeos degenerados, são clonados como fusão a uma dasproteínas do capsídeo de fagos M13, onde são expressos como proteínas defusão ligadas ao capsídeo. Peptídeos ligados aos fagos exibem um grandepotencial mimético a epítopos lineares, conformacionais ou não protéicos(Smith G. P. Curr. Opin. Biotechnol.; 2:668-73, 1991; Smith G. P. et al., Gene,128:37-42, 1993).
Bibliotecas de peptídeos fusionadas em fagos têm sido muito utilizadasno estudo das interações entre antígenos e anticorpos (Cortese R. et al.,Trends Biotechnol.; 12:262-7, 1994; Birch-Marchin I. et al., J. Viroi Methods;88:89-104, 2000; Christopher G. et al. Infect. Mmunol.; 67:4679-88, 1999),estes trabalhos demonstram a obtenção de peptídeos específicos pela seleçãodas bibliotecas de fagos com anticorpos monoclonais e policlonais, epítoposlineares, tanto quanto mimetopos, os que imitam antígenos lineares,descontínuos, conformacionais e até mesmo epítopos não peptídicos deantígenos.
Peptídeos selecionados contra um alvo particular que tem seqüênciasimilar têm um papel na identificação do motivo necessário para ligação(Stephen C. W. et al., J. Moi Biol.; 225:577-83, 1992). Nos casos em que ospeptídeos selecionados se assemelham ao peptídeo Iigante natural, sãodenominados mimetopos (Geysen Η. M. et al., Moi Immunol.; 23:709-715,1986; Salotra Smith G. P. et al., Methods Enzymoi; 217:228-57, 1993).Seqüências peptídicas identificadas por "Phage Display" têm sido mostradascomo agonistas ou antagonistas de receptores (Doobar J. Winter G. J., MoLS/o/.; 244:361-9, 1994).
Peptídeos que neutralizam imunoglobulinas podem ser empregadoscomo reagentes diagnósticos ou usados como agentes terapêuticoscontrolando doenças autoimunes (Blank M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.;96:5164-68, 1999). Bibliotecas de peptídeos randômicos podem ser usadaspara mapear epítopos de anticorpos policlonais e monoclonais, identificandopeptídeos ligantes, e desenvolvendo fagos que definem sítios para diferentesenzimas (Mattheus D. J. et al., Science, 260:1113-7, 1993; Ohkubo et al.,Comb. Chem. High Throughput Screen.; 4:573-83, 2001).
Fagos que expressam epítopos ou mimetopos podem emergir comouma ferramenta útil para o desenvolvimento de vacinas efetivas ou podemservir como veículos de entrega de vacinas por si próprios (Benhar I.Biotechnol. Adv.: 19:1-33, 2001).
A apresentação de pequenos peptídeos na superfície de partículas viraispode aumentar sua imunogenicidade e consequentemente seu potencial comocandidatos a vacinas. A resposta imunogênica a fagos M13 é dependente decélulas T e não requer adjuvante (Azzay Η. Μ. E. et al., Clin. Biochem.;35:425-45, 2002).
Até o presente momento, não existem evidências na literatura revelandoexperimentos utilizando a técnica de "Phage Display" no estudo das interaçõesantígeno-anticorpo com o protozoário Leishmania. Entretanto, vários autoresrelatam a utilização desta técnica no entendimento de doenças provocadas porvírus, bactérias, protozoários e a interação entre seus antígenos e a respostaimune do hospedeiro, buscando o mapeamento de epítopos oudesenvolvimento de vacinas para: Plamodium falciparum (de Ia Cruz V. F. etal., J. Biol. Chem.; 263:4318-22, 1988; Willis A. E. et al., Gene, 128:79-83,1993), Taenia solium (Gazarian K. G. et al., Immunol. Lett.; 42:191-5, 2000),Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (Cui X. et al., J. Viroi Methods; 109:75-83, 2003), Eimeria tenelia (Abi-Ghanem D. et al., Vet. Immunol. Immunophatol.;121:58-67, 2008), Echinococcus granulosus (Read A. J. et al., J. Chromatogr.Β; 877:1516-22) e neurocisticercose humana (Hell R. C. R. et al., Clin.Immunol.; 13:129-38, 2009) dentre outros.
Várias patentes demonstram a utilização da tecnologia de "PhageDisplay" no estudo de doenças parasitárias tais como as patentes:US2007281302 (peptídeos Iigantes às bactérias: B. anthracis, B. subitilis e B.cereus e uso destes para detecção de esporos de B. antrhracis);US2007141076 (identificação de fragmentos antigênicos de proteínas deToxiplasma gondii e seu uso no diagnóstico e como agente imunogênico);CN101015691 (desenvolvimento de uma vacina universal em microesferascontra o tipo B do vírus Infuenza por meio da inserção a região M2 do vírus nobacteriófago T7); W02006071896 (vacina para a síndrome respiratória agudagrave (SARS)1 compreendendo epítopos antigênicos do vírus) eUS2006094017 (descoberta de mimetopos específicos para a proteína gp120do vírus HIV e utilização destes como conjugados imunológicos na vacinaçãocontra o vírus e também como ferramentas de diagnóstico).
Dada a viabilidade da tecnologia acima descrita, torna-se importanteressaltar que essa técnica complementa a atual tendência dos projetosgenômicos, na qual se gera um grande volume de informação, mas com poucadescrição fenotípica. Com a técnica de apresentação em fagos, podemosagora testar genes de interesse em grande escala, na busca de um conjunto deproteínas que interagem, e que vem sendo chamado de "interatoma". A buscadesses "interatomas" promete expandir os limites criados com os projetosgenômicos e permite inferir como esses genes se relacionam, explicando oindivíduo fenotipicamente (Brígido Μ. M. Biotecnologia Ciência eDesenvolvimento; 26:44-51, 2002).
Metodologias para o uso desta técnica na expressão de polipeptídeosrecombinantes e aprimoramento da tecnologia foram descritas nas patentes:KR20070041966 (método para exposição de anticorpos fusionados a proteínaplll na superfície de fago recombinante com maior estabilidade epraticabilidade); US2009105090 (uso de proteína plll mutante com inserção deaminoácido para promover uma mudança na conformação do peptídeo);W09958655 (utilização de bacteriófago que expressa polipeptídeosheterólogos portadores de um sítio de clivagem dentro do peptídeo expressoque possibilita a propagação da proteína de fusão intacta); W02009024591(alternativa de exposição em fagos utilizando a proteína pVII e kit decomercialização do mesmo); US7083945 (expressão de proteínas em formasolúvel para interação com Iigantes marcados), US2006068421 (vetores deexpressão e novos métodos de expressão que permitem a eficiente seleção eseleção de polipeptídeos), US2005202512 (métodos para a seleção depopulação de polipeptíedeos funcionais), GB2408332 (métodos de ligaçãoespecíficos para antígenos de superfície celular), US2003104604 (propõe oaumento da eficiência da técnica, por meio de expressão em bactérias),EP1452599 (bibliotecas que expressam fagos com vários peptídeos ouproteínas mutantes capazes de se ligarem a materiais de interesse) eUS2006035223 (peptídeos com capacidade de ligação a materiais inorgânicoscomo sílica, cobalto, ferro ou óxidos) nas quais são propostas metodologiasque aperfeiçoam a técnica.
A presente invenção utilizou a tecnologia de "Phage Display" para aidentificação e seleção de peptídeos específicos e motivos proteicosrelacionados aos parasitos de gênero Leishmania, determinando epítoposfuncionais de proteínas envolvidas na resposta imune contra o parasito para ouso em plataformas para um diagnóstico mais preciso e composições vacinaispreventivas e/ou terapêuticas contra as Ieishmanioses buscando maiorespecificidade devido a utilização de sítios específicos dos antígenos.
Os exemplos a seguir mostram uma descrição detalhada dos resultadosexperimentais obtidos possibilitando a melhor compreensão da presenteinvenção. Os procedimentos experimentais envolvidos serão detalhados nofinal desse relatório descritivo. A metodologia empregada para a seleção,caracterização e utilização de peptídeos recombinantes e motivos protéicosque mimetizam regiões antigênicas de Leishmania poderá ser aplicada a outrosprotozoários.
A invenção poderá ser melhor compreendida por meio da descriçãodetalhada, em consonância com as Figuras em anexo, onde:
A FIGURA 1 apresenta o ensaio de "dot-blot" realizado para ospeptídeos recombinantes selecionados nas eluições específicas frenteanticorpos de pacientes portadores de Leishmaniose Visceral (V) e também deLeisnmaniose Tegumentar (T) e controles saudáveis (N).
A FIGURA 2 apresenta o ensaio de "dot-blot" competitivo para os clonesde maior relevância na seleção específica para Leishmaniose Visceral, osanticorpos de pacientes acometidos pela doença foram pré-incubados comantígeno total de Leishmania chagasi, podendo assim mostrar a que ospeptídeos recombinantes e o antígeno natural competem pelos mesmos sítiosde ligação nos anticorpos.
Exemplo 1:
Este exemplo se refere à seleção e caracterização dos peptídeosrecombinantes miméticos seus motivos protéicos e seqüências inversasobjetos desta invenção que foram selecionados a partir de anticorpos depacientes acometidos pela Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar,independentemente. Foram realizadas seleções abrangentes e específicaspara cada uma das patologias acima relacionadas.
A TABELA 1 apresenta a identidade das seqüências objetos destainvenção, designadas por Seq. ID N2 1 a Seq. ID N- 56 (seqüências normais) eSeq. ID N- 57 a Seq. ID Ns 112 (seqüências invertidas) que referem-se aosexperimentos realizados frente a anticorpos de pacientes com LeishmanioseVisceral e as freqüências observadas para cada uma destas seqüências emcada um dos processos de seleção.
Três tipos de eluição foram utilizados para a seleção destes peptídeosrecombinantes, visando uma seleção abrangente (eluição ácida) e duas maisespecíficas (antígeno recombinante ou antígeno total), todas tendo como alvoIigantes anticorpos do tipo IgG de pacientes acometidos pela LeishmanioseVisceral, sendo tais eluições:
A Eluição Ácida (Seleção Tipo 1), representada pelas seqüências Seq.ID N2 1 a Seq. ID N2 24 e seus correspondentes invertidos Seq. ID N2 57 aSeq. ID N2 80; a seleção apresentou um número total de 28 clones, sendo 24deles distintos entre si, o clone representado pelas seqüências Seq. ID N2 14 -Seq. ID N2 70 apresentou a maior freqüência nesta seleção (10,71%), seguidopelos clones de seqüências representados por Seq. ID N2 3 - Seq. ID Ns 59 eSeq. ID N2 19 - Seq. ID N2 75 com representatividade intermediária (7,14%), asdemais seqüências foram únicas na população aqui apresentada.
A Eluição Específica frente ao antígeno recombinante rK39 (SeleçãoTipo 2), representada pelas seqüências Seq. ID N2 25 a Seq. ID N2 42 e seuscorrespondentes invertidos Seq. ID Ns 81 a Seq. ID N2 98; a seleçãoapresentou um total de 30 clones, 18 deles distintos entre si, o clonerepresentado pelas seqüências Seq. ID N2 34 - Seq. ID N2 90 mostrou a maiorfreqüência na população (20,0%), seguido pelos clones Seq. ID N2 25 - Seq. IDN2 81 (16,67%), Seq. ID N2 31 - Seq. ID N2 87 (10,0%) e Seq. ID N2 28 - Seq.ID N2 84 (6,67%).
A Eluição Específica realizada frente a antígenos totais de Leishmaniachagasi (Seleção Tipo 3), tendo como representantes as seqüênciasenumeradas Seq. ID N2 43 a Seq. ID N2 56 com seus correspondentesinvertidos designados de Seq. ID N2 100 a Seq. ID Ns 112. A população érepresentada por 29 clones, tendo 15 deles seqüências distintas entre si. Oclone mais freqüente nesta população é o representado pelas seqüências Seq.ID N2 43 - Seq. ID N2 99 (31,03%), seguido pelos de seqüências Seq. ID N2 52- Seq. ID N2 118 (20,69%) e Seq. ID N2 4 - Seq. ID N2 60 (6,90%). As demaisseqüências obtidas nesta seleção tiveram uma freqüência de 3,45% dosclones.
<table>table see original document page 20</column></row><table>Continuação da Tabela 1
<table>table see original document page 21</column></row><table>Continuação da Tabela 1
<table>table see original document page 22</column></row><table>
O alinhamento das seqüências apresentadas na Seleção Tipo 1 mostroua existência de 3 motivos particulares repetidos dentre os clones (consensos),podendo representar epítopos que são representados pelas seguintesseqüências e suas respectivas seqüências invertidas: Seq. ID № 165 (Seq. ID№ 166), Seq. ID № 167 (Seq. ID № 168) e Seq. ID № 169 (Seq. ID № 170).
Em virtude da representação conservada em determinadas regiões aolongo dos peptídeos, os motivos podem apontar importantes epítoposcontínuos ou descontínuos dos antígenos, como exemplificado na TABELA 2,que apresenta o alinhamento dos clones e as seqüências consenso obtidasnos diferentes tipos de seleções realizadas contra anticorpos de pacientes comLeishmaniose Visceral, onde: A: Eluição Ácida, B: Eluição específica com oantígeno rK39 e C: Eluição específica com antígeno total de L. chagasi. Emdestaque, as seqüências consenso identificadas entre os clones.TABELA 2
<table>table see original document page 23</column></row><table>Continuação da Tabela 1_
<table>table see original document page 24</column></row><table>
O alinhamento destes consensos com proteínas restritas de Leishmaniachagasi em banco do GeneBank (BLAST - Basic Local Alignment Search Tool -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) mostrou homologia parcial com proteínasrelevantes de Leishmania tais como K39, GP63, GP46 e o antígeno LACKdentre outras, o que é demonstrado na TABELA 3, que apresenta asseqüências consenso e as proteínas a que se relacionam com seus númerosde acesso, bem como a similaridade dada pelos aminoácidos representativosdo alinhamento, sua posição na proteína original e números de "Score" e"EValue" para o alinhamento em questão.
Os experimentos com Eluições Específicas (Seleção Tipo 2 e 3)puderam confirmar a relevância do consenso representado pela seqüênciaSeq. ID N- 167 (Seq. ID N2 168); mesmo com o aumento da especificidade daeluição, estes peptídeos consenso mantiveram uma freqüência considerável napopulação de clones seqüenciados. A presença de motivos protéicos pode serrelacionada com a seleção a favor do ligante, pela indicação de que estesaminoácidos poderiam ser cruciais para o reconhecimento dos peptídeos peloparatopo.
Apresentam similaridades com a seqüência consenso identificada comoSeq. ID Ns 165 (Seq. ID N- 166) as seqüências de peptídeos seguintes e suasrespectivas seqüências invertidas: Seq. ID N- 12 (Seq. ID N- 68), Seq. ID N- 13(Seq. ID Ne 69) e Seq. ID N2 14 (Seq. ID N2 70).
TABELA 3
<table>table see original document page 25</column></row><table>
A principal proteína a qual esta seqüência consenso se relacionaquando em posição normal é a K39 de Leishmania chagasi relacionada àsuperfamília Kinesina de proteínas motoras; a proteína recombinante rK39aponta altos títulos de anticorpos em pacientes com Leishmaniose Visceral, oque pode justificar o sucesso da seleção realizada. O resíduo de aminoácidosaqui apontado encontra-se em região distinta à do antígeno recombinante,podendo apontar um novo epítopo e ser ferramenta útil no desenvolvimento denovas tecnologias de imunodiagnóstico e profilaxia. Outra proteína derelevância relacionada ao consenso em duas posições é a GP46 - glicoproteínade 46 KDa presente na superfície das formas promastigotas da maioria dasespécies de Leishmania - que apresenta elevados níveis de RNA mensageironas formas promastigotas infecciosas, a presença desta seqüência consensorelacionada a esta proteína pode ser um indício da participação da proteína naresposta imunológica do hospedeiro contra o parasito e possuir também grandevalor diagnóstico. Quando invertida, esta seqüência consenso relaciona-se comas seguintes proteínas de Leishmania\ Proteína gp63, dhfr-ts (Leishmaniadonovani chagasi), Molécula tipo kinesina de Leishmania major e GP46 -Antígeno de superfície de membrana (Leishmania donovani chagasi).
Apresentam similaridade com a seqüência consenso identificada pelasseqüências Seq. ID N- 167 e sua respectiva seqüência invertida Seq. ID N-168, com homologia total ou parcial ao consenso as seguintes seqüências paraa Seleção Tipo 1: Seq. ID N2 4 (Seq. ID N2 60), Seq. ID N2 5 (Seq. ID N2 61),Seq. ID N2 6 (Seq. ID Ns 62), Seq. ID N2 7 (Seq. ID N2 63), Seq. ID N2 8 (Seq.ID N2 64), Seq. ID N2 9 (Seq. ID N2 65), Seq. ID N2 10 (Seq. ID N2 66), Seq. IDN2 12 (Seq. ID N2 68), Seq. ID N2 20 (Seq. ID N2 76) e Seq. ID N2 23 (Seq. IDN2 79) e Seq. ID N2 29 (Seq. ID N2 85); para a Seleção Tipo 2: Seq. ID N2 31(Seq. ID N2 87), Seq. ID N2 32 (Seq. ID N2 88), Seq. ID N2 33 (Seq. ID N2 89),Seq. ID N2 34 (Seq. ID N2 90) e Seq. ID N2 35 (Seq. ID N2 90) e para a SeleçãoTipo 3: Seq. ID N2 37 (Seq. ID N2 93), Seq. ID N2 42 (Seq. ID N2 98), Seq. IDN2 38 (Seq. ID N2 94), Seq. ID N2 43 (Seq. ID N2 99), Seq. ID N2 44 (Seq. ID N2100) e Seq. ID N2 48 (Seq. ID N2 104).
Esta seqüência consenso quando em posição normal se relacionacom o antígeno LACK com homologia parcial, este antígeno é uma proteína de36 KDa bem conservada presente em todas as espécies e estágios dedesenvolvimento de Leishmania sendo um dos antígenos mais imunogênicos.A presença desta seqüência em muitos dos clones objetos desta invenção levaa designação de um epítopo dentro desta proteína com valor no diagnóstico eprofilaxia das doenças tanto no homem como em animais. Quando em posiçãoinvertida esta seqüência consenso não mostra homologia com as proteínasdepositadas em banco de dados.
A seqüência consenso identificada pela seqüência Seq. ID N2 169(Seq. ID N- 170) tem as seqüências Seq. ID N2 3 (Seq. ID N2 59), Seq. ID N222 (Seq. ID N2 78), Seq. ID N2 16 (Seq. ID N2 72), Seq. ID N2 19 (Seq. ID N275), Seq. ID N2 18 (Seq. ID N2 74) como representantes portadoras doconsenso e não apresentaram homologia nos alinhamentos realizados embancos de dados.
A TABELA 4 apresenta as seqüências identificadas por Seq. ID N2 113 aSeq. ID N2 138 (seqüências normais) e Seq. ID N2 139 a Seq. ID N2 164(seqüências invertidas) que referem-se às seleções realizadas frente aanticorpos de pacientes com Leishmaniose Tegumentar, mostrando também afreqüência observada de cada seqüência peptídica para cada um dosprocessos de seleção.
Para anticorpos de pacientes com Leishmaniose Tegumentarforam realizados dois processos de seleção sendo eles:
- Eluição Ácida (Seleção Tipo 1) representada pelos clones deseqüências Seq. ID N2 113 a Seq. ID N2 124 e seus correspondentes invertidosSeq. ID N2 139 a Seq. ID N2 150 com um total de 12 clones cada umrepresentando 8,33% da população.
- Eluição Específica (Seleção Tipo 2) realizada frente a antígenos totais
de Leishmania amazonensis, representados pelas seqüências Seq. ID N2 125 aSeq. ID N2 138 e seus correspondentes invertidos Seq. ID N2 151 a Seq. ID N2164, com um total de 14 novos clones. O clone mais freqüente dentre eles é orepresentado pelas seqüências identificadas por Seq. ID N2 119 - Seq. ID N2145 (16,67%), seguido pelos clones de seqüências Seq. ID N2 114 - Seq. ID N2140, Seq. ID N2 118 - Seq. ID N2 144 e Seq. ID N2 129 - Seq. ID N2 155(8,33%), Seq. ID N2 124 - Seq. ID N2 150, Seq. ID N2 125 - Seq. ID N2 151,Seq. ID N2 126 - Seq. ID N2 152 e Seq. ID N2 137 - Seq. ID N2 163 (5,56%) eos demais com 2,78%.
TABELA 4
<table>table see original document page 28</column></row><table>Os clones selecionados na seleção acima descrita, quando alinhadosentre si não mostraram definição clara de seqüências consenso, comomostrado na TABELA 5 que apresenta o alinhamento entre os clones dosdiferentes tipos de eluição frente anticorpos de pacientes com LeishmanioseTegumentar1 onde A: Eluição ácida e B: Eluição Específica. Em contrapartida,observou-se entre as seleções a presença de clones repetidos nos doisdiferentes tipos de seleção (Seq. ID Ne 114 - Seq. ID N2 140, Seq. ID N2 118 -Seq. ID N2 Seq. ID N2 144, Seq. ID N2 119 - Seq. ID N2 145, Seq. ID N2 121 -Seq. ID N2 147, Seq. ID N2 122 - Seq. ID N2 148, Seq. ID N2 124 - Seq. ID N2150) por apresentarem alta e comum reatividade aos alvos utilizados nasseleções, além de mostrarem alinhamentos em diversas seqüências hipotéticasde várias espécies de Leishmania merecem atenção particular como alvos aserem utilizados no diagnóstico e profilaxia da Leishmaniose Tegumentar.
TABELA 5
<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>
Exempio 2:
Este exemplo refere-se à confirmação da reatividade dos peptídeosselecionados a partir das Eluições Específicas para Leishmaniose Visceralobjetos desta invenção.
Foram analisados por meio de "dot-blot" os clones obtidos a partir dasSeleções Específicas Tipo 2 e 3 mencionadas anteriormente identificados pelasseqüências Seq. ID N2 25 a Seq. ID Ns 56 e suas correspondentes invertidasSeq. ID Ne 81 a Seq. ID N2 112.
Todos os clones representantes de cada uma das seqüências foramtestados contra soros de pacientes com Leishmaniose Visceral (V),Leishmaniose Tegumentar (T) e Controles Negativos (N). Nenhuma respostacruzada foi verificada, mostrando que os clones foram positivamenteselecionados pelo alvo específico como pode ser visto na FIGURA 1.
Dentre os clones selecionados contra o antígeno recombinante rK39apresentaram positividade os identificados pelas seguintes seqüências e suascorrespondentes invertidas: Seq. ID Ns 25 (Seq. ID N2 81), Seq. ID N2 26 (Seq.ID N2 82), Seq. ID N2 31 (Seq. ID N2 87), Seq. ID N2 32 (Seq. ID N2 88), Seq. IDN2 34 (Seq. ID N2 90), Seq. ID N2 37 (Seq. ID N2 93), Seq. ID N2 41 (Seq. ID N297) e Seq. ID N2 42 (Seq. ID N2 98).
Para os clones selecionados contra antígeno total de Leishmaniachagasi as seguintes seqüências e suas correspondentes invertidasapresentaram positividade: Seq. ID N2 43 (Seq. ID N2 99), Seq. ID N2 44 (Seq.ID N2 60), Seq. ID N2 50 (Seq. ID N2 106), Seq. ID N2 52 (Seq. ID N2 108), Seq.ID N2 53 (Seq. ID N2 109) e Seq. ID N2 54 (Seq. ID N2 110). A TABELA 6mostra a positividade dos clones neste ensaio relacionado à presença deregião consenso na molécula (indicados por sinal +), o que evidencia que hárelação da presença consenso com a reatividade diferencial dos peptídeosrecombinantes.
TABELA 6
<table>table see original document page 31</column></row><table>Os clones positivos no ensaio de "dot blot" acima relacionados foramsubmetidos a um ensaio de "dot-blot" competitivo, no qual os anticorpos do tipoIgG de pacientes com a doença em questão foram incubados com antígenototal de Leishmania chagasi com as seguintes concentrações: 1- controle semantígeno, 2 - 0,5 pg/mL, 3-1,3 pg/mL, 4 - 4,9 pg/mL, 5 - 14,8 pg/mL, 6 - 44,4pg/mL, 7 - 133,3 pg/mL e 8 - 400 pg/mL, como mostrado na FIGURA 2. Areação prévia dos anticorpos com o antígeno total, antes de reagirem com ospeptídeos recombinantes expressos na superfície de fagos, teve o intuito debloquear sítios Iigantes comuns entre estes diferentes antígenos.
Dentre os clones selecionados contra o antígeno recombinante rK39,tiveram reatividade inibida frente ao antígeno de Leishmania, os identificadospelas seqüências abaixo citadas e suas respectivas seqüências invertidas:Seq. ID N2 31 (Seq. ID N2 87), Seq. ID Ns 32 (Seq. ID N2 88), Seq. ID N2 34(Seq. ID N2 90) e Seq. ID Na 42 (Seq. ID N2 98).
Para os clones selecionados contra antígeno total de Leishmaniachagasi, tiveram reatividade inibida frente ao antígeno de Leishmania, asseguintes seqüências e suas seqüências invertidas correspondentes: Seq. IDN2 43 (Seq. ID N2 99), Seq. ID N2 4 (Seq. ID N2 60), Seq. ID N2 50 (Seq. ID N2106) e Seq. IDN2 54 (Seq. ID N2 110).
A descrição detalhada dos procedimentos experimentais adotadospoderá levar a melhor compreensão dos exemplos acima citados.
A purificação de imunoglobulinas foi realizada por imunocromatrografia apartir de um "pool" destes soros, utilizando coluna de proteína A sepharose. Acoluna foi equilibrada com 10 volumes de tampão fosfato (0,1 M, pH 8,0). Asamostras de soro diluídas em tampão fosfato (vol/vol) foram acrescentadas àresina e incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação,a coluna foi lavada com tampão fosfato, sendo a absorbância a 280 nmmonitorada em espectrofotômetro (Ultrospec 1100 pro - AmershamBiosciences) até igualar-se a zero. Cada amostra foi eluída com tampão glicina(0,1 M pH 2,7), sendo coletada frações de 1 mL que foram tambémmonitoradas por leitura espectrofotométrica. As frações com maiores leiturasforam agrupadas e o pH neutralizado com NaOH 0,1 M. Assim, foramtransferidas para membrana de diálise, concentradas em açúcar comercial (1h,4°C) e em seguida dialisadas em 3L de tampão fosfato durante toda a noite emcâmara fria a 4°C. A quantificação deu-se por leitura direta emespectrofotômetro a 280 nm.
Para a seleção dos peptídeos recombinantes (peptídeosrecombinantes expressos na proteína plll de fagos filamentosos) foi utilizadauma biblioteca comercial de 12 aminoácidos (Ph.D. - 12™ mer - New EnglandBiolabs). Os procedimentos experimentais foram baseados no protocolodisponibilizado pelo fabricante, com adequações para a melhor seleção declones específicos.
Para os experimentos designados do tipo Eluição Ácida, tanto paraos de Leishmaniose Visceral como para os de Leishmaniose Tegumentar, osprocedimentos para a seleção de peptídeos recombinantes foram realizadosem fase aquosa.
Como substrato para a realização deste processo, foram utilizados50 μl de proteína G agarose em 50% de solução aquosa (recombinat ProteinG Agarose - Invitrogen™), que foram lavados por ressuspensão em microtubocom 1mL de TBS-T (Tris-HCI 50 mM - pH 7.5, NaCI 150 mM - Tween 200,1%), o sobrenadante foi retirado cuidadosamente após centrifugação à 4.000rpm por 30 segundos em centrífuga refrigerada. Em seguida, a resina foibloqueada por uma hora com tampão de bloqueio (NaHCO3 0,1M, pH 8,6; BSA5mg/mL; NaN3 0,02%) a 4°C, sendo misturada de 15 em 15 minutos. Após aincubação, a mesma foi lavada por quatro vezes, conforme descritoanteriormente, para então receber a mistura de 300 ng de anticorpo purificado,juntamente com 1,5 χ 1011 partículas virais em um volume final de 200 μί deTBS-T 0,1%, previamente incubados à temperatura ambiente por 20 minutos.
A mistura resina - anticorpo - fago foi invertida suavemente por trêsvezes durante os 15 minutos de incubação a temperatura ambiente e emseguida lavada por mais 10 vezes com um mL de TBS-T 0,1%, preparando-apara a eluição dos fagos Iigantes feita com um mL de tampão de eluição(Glicina-HCI 0,2 Μ, ρΗ 2,2; 1mg/mL de BSA) por 10 minutos à temperaturaambiente. Esta mistura foi centrifugada por 1 minuto a 4.000 rpm, o eluato foitransferido para um novo tubo e imediatamente neutralizado com 150 μι. deTris-HCI (1 M, pH 9,1).
Uma pequena amostra deste eluato (10 μΙ_) foi titulada e o restante foiutilizado para reamplificação, realizada em 20 ml_ de cultura de E. coli (ER2738) em fase inicial de crescimento (OD6oo^ 0,3) contendo tetraciclina eincubada por 4,5 horas em agitador com temperatura controlada a 37°C, antesdo procedimento de precipitação dos fagos e posterior titulação.
Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foramutilizados em um segundo ciclo (2,0 χ 1011 ufc) e assim subseqüentemente porum total de quatro ciclos, sendo que a partir do segundo ciclo a estringência dotampão de lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5%, utilizando-se então,0,5% de Tween-20 em todas as lavagens. Após o término das seleções osfagos contendo os peptídeos recombinantes foram isolados e sequenciados (osprocedimentos serão descritos posteriormente).
Para os experimentos descritos como Eluições Específicas comantígenos de parasitas, tanto para Leishmaniose Visceral como paraLeishmaniose Tegumentar os procedimentos foram realizados em fase sólida.
No primeiro ciclo de seleção, um poço de uma placa de microtitulação(Corning Incorporated Costar®) foi sensibilizado com 150pL de anticorpos dotipo IgG de um "pool" de soros de pacientes com Leishmaniose Visceral(purificados por imunocromatrografia, concentrados, dialisados e quantificadospor leitura espectrofotométrica direta), numa concentração de 100 pg/mL emtampão carbonato (NaHCO3 0,1 M, pH 8,6). A incubação ocorreu por toda anoite à temperatura de 4°G, sob agitação em ambiente umidificado.
Após o descarte da solução e secagem da placa, esta foi bloqueada com300 pL de solução de bloqueio (NaHCO3 0.1 M, pH 8,6, 5 mg/mL BSA) por 1hora a 4°C. A solução foi descartada e a placa lavada por 6 vezes com TBST(TBS - Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, água, 0,1% volume/volume deTween 20) para então acrescentar 4 χ 1010 partículas virais (10 pL da bibliotecacomercial original) diluídas em 100 μι. de TBST, sendo a placa mantida sobagitação por uma hora em temperatura ambiente. Os fagos não Iigantes aosanticorpos foram retirados e a placa lavada por 10 vezes com TBST para aadição de 100 μΐ_ de uma solução 100 pg/mL de anticorpos do tipo IgG depacientes controle saudáveis purificados para a eluição dos fagos Iigantes aesses tipos de anticorpos, chamada então de eiuição negativa. Esta mistura foiincubada por uma hora em temperatura ambiente, sob agitação. Os fagoscontidos no sobrenadante foram descartados e a placa lavada por mais 10vezes com TBST. Uma segunda eluição foi realizada, utilizando o antígenorecombianante rK39 na concentração de 100 pg/mL em um volume de 100 pL,com incubação de uma hora a temperatura ambiente. Os fagos contidos nosobrenadante, Iigantes ao rK39, foram coletados para posterior amplificação ea placa foi novamente lavada por mais 10 vezes para realização da terceiraeluição com 100 pL de uma solução (100 pg/mL) de antígeno total de L.chagasi, a incubação foi de uma hora a temperatura ambiente, e os fagos emsobrenadante foram também coletados para posterior amplificação. Os fagosprovenientes das eluições com os antígenos foram utilizados nos ciclosposteriores da seleção. Uma pequena alíquota (1 pL) de ambos eluatos foramtitulados para mensurar o número de partículas virais por titulação e o restantefoi amplificado para serem utilizados nos ciclos posteriores.
A partir do segundo ciclo de seleção, dois poços foram sensibilizadoscom anticorpos purificados de pacientes positivos para Leishmaniose comoanteriormente descrito. Para cada um destes poços foi feita a eluição negativae específica, um para rK39 (Seleção Específica do Tipo 2) e outro paraantígeno total de L.chagasi (Seleção Específica Tipo 3). Todos osprocedimentos de bloqueio e lavagem foram semelhantes ao descritoanteriormente, exceto a concentração do tampão de lavagem que passou a serTBST que passo a 0,5% (TBS (Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, água,0,5% volume/volume de Tween 20) no segundo e demais ciclos.
Desta forma foram realizados um total de quatro ciclos, e então o eluatonão amplificado foi titulado e as colônias azuis, foram colocadasindividualmente em poços de placas "Deep WeN" com 1,2 mL meio de culturaLB (20 pg/mL de tetraciclina) contendo bactérias ER2738 em fase inicial decrescimento. A cultura foi incubada sob agitação vigorosa (250 rpm/min)durante 5 horas. Após este período foram feitas alíquotas para "back-up" e asplacas com a cultura restante permaneceram em incubação durante toda anoite para extração de DNA individual dos clones.
Para todos os processos de reamplificação e precipitação dos fagosrecombinantes o procedimento foi o seguinte: A cultura foi transferida para umtubo de centrífuga e centrifugada (10 min, 4.000 rpm). As células residuaisforam descartadas e o sobrenadante transferido para um novo tubo e re-centrifugado. Foi pipetado 80% do sobrenadante superior para um tubo limpo,onde foi adicionado 20% do volume de PEG-NaCI (20% peso/volume depolietileno glicol-8000; NaCI 2,5 M) e a mistura permaneceu em repousodurante toda a noite a 4°C. No dia seguinte, o produto da precipitação foicentrifugado por 15 min a 10.000 rpm e 4°C. O sobrenadante foi descartado e otubo foi novamente centrifugado, nas mesmas condições anteriores por mais 5minutos para que o sobrenadante residual pudesse ser removido. O "pellet" defagos foi ressuspendido em 1 mL de TBS 1X, que foi transferido para ummicrotubo e centrifugado (5 min, 10.000 rpm, 5 min) para retirada das célulasresiduais. O sobrenadante foi transferido para novo microtubo, para a adiçãode PEG-NaCI (1/6 do volume). A mistura foi incubada por 1 hora em gelo eentão centrifugada (15 min, 14.000 rpm, 4°C). O sobrenadante foi descartado eo tubo re-centrifugado por mais 5 minutos para retirada do sobrenadanteresidual. O "pellet" foi ressuspendido em 200 μί de TBS 1X, estando prontospara a titulação.
O procedimento de titulação foi o seguinte tanto para os eluatosamplificados como para os não amplificados: foram realizadas diluições seriaisde 10"1 a 10"4 e de 10~8 a 10"11, respectivamente. A nove pL de cada diluiçãoforam adicionados 200 pL de bactérias ER2738 (OD6oo> 0,5) incubando amistura por 5 minutos antes que fosse plaqueada em meio LB (Tetracilina: 20pg/mL, IPTG: 0,5 mM e X-gal 40 pg/mL), juntamente com 3 mL de Agarose Top(10 g de Bacto-Triptona, 5g de extrato de levedura, 5g de NaCI1 1 g de MgCI2 .6H20 / litro). As placas foram incubadas a 37°C por toda noite, e as colôniasazuis representantes das colônias infectadas por fagos foram contadas paraobtenção do número de partículas infectantes (pfus) para entrada nos ciclosposteriores.
Para a extração de DNA dos fagos recombinaníes, as colôniasprovenientes dos ciclos de seleção foram isoladas em placas "deep well"contendo 1 mL de meio de cultura com Bactérias ER2738 (Οθ6οο> 0,3) eincubadas sob agitação a 37°C por 24 horas. Após o período de cultura asplacas foram centrifugadas por 10 minutos a 3.700 rpm a 4°C, e 800 μΙ_ dosobrenadante foram transferidos para uma nova placa, onde foi acrescentado350 pL de PEG-NaCI e incubou-se por 10 minutos a temperatura ambiente. Amistura foi centrifugada por 40 minutos a 3.700 rpm, a 20°C. O sobrenadantefoi descartado e a placa foi invertida sobre papel absorvente para retirar oexcesso de meio de cultura. O precipitado foi ressuspendido em 100 pl_ detampão iodeto (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, Nal 4 M) e foi adicionado 250 pLde Etanol Absoluto, incubando a mistura por mais 10 minutos a temperaturaambiente antes de submetê-la novamente a centrifugação por 40 minutos a20°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 150 pL deEtanol 70%, e centrifugado por mais 15 minutos a 20°C. Todas ascentrifugações ocorreram com rotação de 3.700 rpm. O DNA foi solubilizadoem 20 pL de água ultrapura estéril e qualificado por eletroforese em gel deAgarose 0,8%, comparando-o com padrão de DNA de fago M13 disponibilizadopelo fabricante da biblioteca.
As amostras isoladas foram submetidas a sequenciamento automáticoutilizando o Kit Big Dye Terminator (GE Healthcare) e sequenciador automáticoMegaBace 1000 (GE Healthcare). Na reação de sequenciamento, utilizou-seaproximadamente 3 pL de DNA (dependendo da quantificação média dada porleitura espectrofotométrica), 4pL de premix e 10 pmoles do primer - 96 M13 -(5'-hoCCCTCATAGTTAGCGTAACG -3'- GE Healthcare), que amplifica aregião dos aminoácidos codificantes dos peptídeos randômicos fusionados nosfagos Μ13 recombinantes, sendo o volume da reação completado para 10 μL.A reação ocorreu em termociclador (Mastercicler, Eppendorf) por 35 ciclos,com desnaturação de 30 segundos a 95°C, anelamento dos primers por 30segundos a 50°C e extensão por 30 segundos a 60°C.
O processamento das seqüências foi feito pelo "software" doequipamento (Sequence Analyser1 BASE CALLER, Cimarron 3.12, Phred 15).Com posse das seqüências de DNA, estas foram traduzidas pelo programaDNA2PRO (http://relic.bio.anl.gov/proqrams.aspx). gerando as seqüências de12 peptídeos esperadas.
Os alinhamentos entre as seqüências distintas foram feitos peloprograma ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) para delinear prováveisconsensos. Os alinhamentos das seqüências com proteínas de Leishmaniaforam realizados pelo programa BLAST - Basic Local Alignment Search Tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Os fagos mais freqüentes nas populações das seleções específicas(Seleção Tipo 2 e Seleção Tipo 3) para Leishmaniose Visceral e os controles(fago selvagem e antígeno recombinante rK39) foram submetidos a ensaios dedot-blot competitivo com antígeno total de L. chagasi e fago selvagem.
Os 33 clones com seqüências distintas foram testados em ensaio de dot-blot contra anticorpos purificados de pacientes com Leishmaniose Visceral,Tegumentar e Controle saudável, juntamente com os seguintes controles: Fagoselvagem, Fago irrelevante (selecionado a partir de outra seleção) e antígenorecombinante rK39.
As membranas de nitrocelulose foram sensibilizadas com fagos (5,Ox109 partículas virais diluídas em dois pL de TBS), deixando que secassem por2 minutos a temperatura ambiente. Cada membrana foi bloqueada com um mLde solução de bloqueio (TBS-M Molico 5%), incubada sob agitação por duashoras e posteriormente lavada por três vezes com tampão de lavagem (TBST -0,5% de Tween 20). Foram adicionados a cada membrana, 500 pL dorespectivo anticorpo purificado (Visceral, Tegumentar, Negativo) naconcentração de 25 pg/mL diluído em bloqueio, e em seguida, incubou-se poruma hora. Após a incubação, as membranas foram novamente lavadas porseis vezes com tampão de lavagem e incubadas com 500 μΙ_ de anticorposecundário anti-lgG marcado com Fosfatase Alcalina diluído em bloqueio eincubadas por uma hora e em seguida, lavadas por mais 6 vezes, reveladascom solução de NBT/BCIP e lavadas com água antes de serem secas para adigitalização das imagens. Todas as incubações foram realizadas atemperatura ambiente e sob agitação lenta.
Os clones com maior reatividade no ensaio anterior foram submetidos aum novo ensaio competitivo (14 clones) juntamente com os controles (FagoSelvagem, Fago Irrelevante, Antígeno total de L.chagasi e antígenorecombinante rK39).
Os antígenos (fagos e controles) foram adicionados sobre as tiras demembrana de nitrocelulose, deixando em repouso para secagem por doisminutos e em seguida foi acrescentado um mL de bloqueio (TBS-M - Molico5%) que agiu por duas horas. Durante este período, a solução de anticorpopurificado de pacientes com Leishmaniose Visceral foi incubada com antígenototal de L. chagasi diluído serialmente (de 400 pg/mL a 0,5 pg/mL incluindocontrole sem anticorpo). Após o período de bloqueio, as membranas foramlavadas por três vezes com tampão de lavagem (TBS-T - 0,5% de Tween 20) efoi então adicionada a mistura pré-incubada de anticorpos e antígenos, quepermaneceram em contato com a membrana por uma hora. As membranasforam lavadas por mais seis vezes com o tampão de lavagem e adicionou-se500 pL de anticorpo secundário anti- IgG marcado com Fosfatase Alcalina(1:5000 em bloqueio) e incubou-se por uma hora. Foram feitas seis lavagenscomo as acima descritas e posteriormente, procedeu-se a revelação com ummL de solução reveladora (NBT/BCIP). As membranas foram lavadas comágua e secadas para digitalização das imagens. Todas as incubações citadasocorreram à temperatura ambiente, sob agitação lenta,LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS BIOLÓGICAS
(1) Informações gerais do Pedido de Patente
(i) Dados do Requerente:
a) Nome: Universidade Federal de Uberlândia
b) Endereço: Av. João Naves de Ávila, 2121 - Bloco 5L, Bairro Santa Mônica,CEP: 38400-902 - Uberlândia, MG.
(ii) Título da invenção: "PEPTÍDEOS RECOMBINANTES E MOTIVOSPROTÉICOS MIMÉTICOS A ANTÍGENOS DE LEISHMANIA E SUASAPLICAÇÕES"
(iii) Número de seqüências constantes do pedido: 170 (cento e setenta)
(iv) Formato para leitura no computador: Microsoft Word; Windows XP;computador tipo PC.
(2) Informações gerais das seqüências
Características das moléculas seqüenciadas:
a) Tipo: PROTEÍNA
b) Nome da Proteína: Proteínas recombinantes miméticas a proteínas deLeishmania
c) Identidade das Seqüências: Seq. ID № 1 a Seq ID № 170.
d) Fonte original das moléculas: GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/)3- Informações para Seq. ID № 1
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 1:
Ala Phe Thr Asp Lys Ala Ser Ala Arg Pro Lys Ala1 5 10
3- Informações para Seq. ID № 2
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidosb) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 2:
Ala Thr Glu Ala His Pro Thr Thr Leu Ala Arg Lys1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 3
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 3:
Ala Thr Leu Arg Asn Trp Ile Pro Pro Ser Ser Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 4
a Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 4:
Ala Thr Pro Asp Arg Ser Arg Ile Glu Ser Arg Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 5
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 5:
Ala Thr Pro Arg Ser His Met Leu Ala Ser Ser Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 6Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 6:
Aía Thr Pro Arg Ser Leu Ser Thr Val Ile Ser Ile1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 7
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 7:
Ala Thr Pro Arg Ser Met His Pro Leu Pro Asp Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 8
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 8:
Ala Thr Pro Arg Ser Met Ile Ala Pro Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 9
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 9:
Ala Thr Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gln Ser Gln Ile1 5 10 123- Informações para Seq. ID N2 10
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 10:
Ala Thr Pro Arg Ser Val His Ser Thr Ala Gln Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 11
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 11:
Phe Ala Leu Lys Glu Asp Ala Gln Ser Ser Leu Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 12
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 12:
Gly Leu His Lys Leu Ala Gly Leu Asn Leu Arg Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 13
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 13:His Lys Leu Ala Gly Leu Asn Leu Arg Asp His Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 14
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 14:
His Lys Leu Ala Gly Leu Asn Leu Arg Asp Gln Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 15
Características da seqüência:
a) Tamanho: 7 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 15:
Leu Pro Met His Glu Ser Pro Lys Arg Asp Gln Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 16
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 16:
Pro Asn Ala Ala Thr Leu Arg Thr Leu Lys Gln Ile1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 17
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 17:
Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro1 5 10 12
3-Informações para Seq. ID N-18
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 18:
Thr Pro Ser Ser Ala Ser Ser Val Ala Thr Leu Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 19
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 19:
Thr Ser Ala Ala Thr Met Arg Leu Leu Lys Ser Asp1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 20Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 20:
Thr Thr Pro Arg Ser Glu Ile Pro Tyr Pro Ile Ile1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 21
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 21:
Val Cys Phe Cys Gly Tyr Glu Thr Glu Ser Gln Glu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 22
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 22:
Val Gln Ser Ala Thr Leu Arg Asn Trp Ile Ala Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 23
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 23:
Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ser His Leu Thr Glu Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 24
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 24:
Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ser His Leu Thr Gly Pro1 5 10 123- Informações para Seq. ID N2 25
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 25:
Leu Thr Gln Lys Phe Ser Gly Ile Asp Ile Lys Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 26
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID N2 26:
Glu Lys Ser Ser Gly Thr Ser Leu His Gly Val Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 27
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 27:
Val Val Thr Arg Tyr Asn Asp Asn Ile Arg His Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 28
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 28:Ile Gly Thr Ala Pro Met Leu Phe Ala Gly Tyr Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 29
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 29:
Thr Thr Thr Leu Thr Arg Ser Leu Pro Leu Ile His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 30
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 30:
Asn Leu Asp Thr Arg Thr Trp Leu Ser Leu Tyr Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 31
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 31:
Gly Thr Pro Arg Ser Gln Ile Gln Tyr Ala Ala Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 32
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 32:
Val Thr Pro Arg Ser Leu Asn Val Asp Pro Ser Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 33
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID Ns 33:
Ile Thr Pro Arg Ser Asn Gln Ala Thr Tyr Leu Leu
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 34
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 34:
Ala Thr Pro Gln Arg Asn Ser Ile Leu Val Gln Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 35
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 35:
Tyr Ala Ser Ala Asn Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 36
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 36:
His His Phe Thr His Ile Ser Leu Pro Leu Val Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 37
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 37:
Ala Thr Gln Arg Asn Ala Tyr Pro Ser Gly Pro His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 38
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 38:
Ile Asn His Ser Thr Ala Glu Ser Arg Tyr Phe Met1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 39Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 39:
Ser Phe His Leu Pro Arg Glu Trp His Ala Ser Pro1 5 10 123- Informações para Seq. ID N2 40
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. iD N- 40:
Met Asn Ala Gly Ser Asn Ala Phe Ser Cys Leu Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 41
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 41:
Ile Asn Pro Ser Tyr His Pro Phe Arg Met Pro Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 42
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
b. Descrição da seqüência: Seq. ID N2 42:
Ala Ser Pro Arg Ser Ser Phe Leu Leu Glu Lys Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 43
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 43:Ala Thr Pro Arg Ser Ile His Asp Ser Glu Thr Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 44
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 44:
Leu Ser Pro His Ala Leu Glu Lys Asp Arg Phe Val1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 45
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 45:
His Met Ser His Gln Asp Pro Asp Val Arg Leu Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 46
Características da seqüência:
a) Tamanho; 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 46:
Ser Asp Trp Thr Thr Met Arg Ala Phe Arg Ile Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 47Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 47:
Ser Leu Leu Asn Leu Phe Val Thr Ser Pro Ala Val1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 48
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 48:
Ala Thr Ile Arg Asn Ile Gln Thr Phe Pro Met Val1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 49
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 49:
Ser Ala Thr Val Thr Ile Lys Arg Leu Gln Tyr Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 50
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 50:
Ala Thr Pro Arg Arg Phe Met Ile Leu Arg Pro Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 51
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 51:
Thr Pro Phe Met Lys Thr Val Leu Leu Thr Ser Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 52
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 52:
Tyr Pro Thr Lys Ala Ser Gly Asn Asp Leu Arg Gly1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 53
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 53:
Tyr Asp Leu Asn Val His Tyr Leu Pro Pro Lys Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 54
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 54:
Ala Thr Pro Arg Ser Ile His Gly Phe Trp Arg Arg1 5 10 123- Informações para Seq. ID N2 55
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linearDescrição cia seqüência: Seq. ID N2 55:
Gly Lys Ala Pro Thr Ile Thr Ala Leu Pro Gln Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 56
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 56:
Gly Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gln Val Pro Leu His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 57
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 57:
Ala Lys Pro Arg Ala Ser Ala Lys Asp Thr Phe Ala1 5 7 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 58
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 58:Lys Arg Ala Leu Thr Thr Pro His Ala Glu Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 59
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 59:
Thr Ser Ser Pro Pro Ile Trp Asn Arg Leu Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 60
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 60:
Leu Arg Ser Glu Ile Arg Ser Arg Asp Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 61
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 61:
Ser Ser Ser Ala Leu Met His Ser Arg Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 62
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 62:
Ile Ser Ile Val Thr Ser Leu Ser Arg Pro Thr Ala
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 63
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 63:
Leu Asp Pro Leu Pro His Met Ser Arg Pro Thr Ala
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 64
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 64:
Ala Thr Pro Pro Ala Ile Met Ser Arg Pro Thr Ala
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 65
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 65:
Ile Gln Ser Gln Pro Leu Ser Ser Arg Pro Thr Ala
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 66
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 66:
Pro Gln Ala Thr Ser His Val Ser Arg Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 67
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 67:
Ser Leu Ser Ser Gln Ala Asp Glu Lys Leu Ala Phe1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 68
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 68:
Ser Arg Leu Asn Leu Gly Ala Leu Lys His Leu Gly1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 69
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 69:
Leu His Asp Arg Leu Asn Leu Gly Ala Leu Lys His1 5 10 123- Informações para Seq. ID Ns 70
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. iD N2 70:
Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu Gly Ala Leu Lys His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 71
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 71:
Pro Gln Asp Arg Lys Pro Ser Glu His Met Pro Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 72
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 72:
Ile Gln Lys Leu Thr Arg Leu Thr Ala Ala Asn Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 73
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 73:Pro Arg Pro Ser Pro Lys Met Gly Val Ser Val Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 74
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 74:
Arg Leu Thr Ala Val Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 75
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 75:
Asp Ser Lys Leu Leu Arg Met Thr Ala Ala Ser Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 76
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 76:
Ile Ile Pro Tyr Pro Ile Glu Ser Arg Pro Thr Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 77
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidosb) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 77:
Glu Gln Ser Glu Thr Glu Tyr Gly Cys Phe Cys Val
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 78
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 78:
Ser Ala Ile Trp Asn Arg Leu Thr Ala Ser Gln Val
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 79
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 79:
Leu Glu Thr Leu His Ser Arg Pro Thr Ala Ala Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 80
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 80:
Pro Gly Thr Leu His Ser Arg Pro Thr Ala Ala Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 81
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 81:
Arg Lys Ile Asp Ile Gly Ser Phe Lys Gln Thr Leu
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 82
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 82:
Pro Val Gly His Leu Ser Thr Gly Ser Ser Lys Glu
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 83
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 83:
Ser His Arg Ile Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Val Val
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 84
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 84:
Arg Tyr Gly Ala Phe Leu Met Pro Ala Thr Gly Ile
1 5 10 123- Informações para Seq. ID N- 85
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 85:
His Ile Leu Pro Leu Ser Arg Thr LeuThr Thr Thr
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 86
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 86:
Thr Tyr Leu Ser Leu Thr Trp Arg Thr Asp Leu Asn
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 87
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 87:
Pro Ala Ala Tyr Gln Ile Gln Ser Arg Pro Thr Gly
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 88
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 88:Arg Ser Pro Asp Val Asn Leu Ser Arg Pro Thr Val
1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 89
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 89:
Leu Leu Tyr Thr Ala Gln Asn Ser Arg Pro Thr Ile1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 90
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 90:
Ser Gln Val Leu Ile Ser Asn Arg Gln Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 91
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 91:
Thr Tyr Ile Thr Arg Ser Thr Asn Ala Ser Ala Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 92
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 92:
Arg Val Leu Pro Leu Ser Ile His Thr Phe His His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 93
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 93:
His Pro Gly Ser Pro Tyr Ala Asn Arg Gln Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 94Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 94:
Met Phe Tyr Arg Ser Glu Ala Thr Ser His Asn Ile1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 95
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 95:
Pro Ser Ala His Trp Glu Arg Pro Leu His Phe Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 96
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 96:
Thr Leu Cys Ser Phe Ala Asn Ser Gly Ala Asn Met1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 97
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 97:
Ala Pro Met Arg Phe Pro His Tyr Ser Pro Asn Ile1 2 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 98
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
20 Descrição da seqüência: Seq. ID N2 98:
Ala Lys Glu Leu Leu Phe Ser Ser Arg Pro Ser Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 99
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 99:
Leu Thr Glu Ser Asp His Ile Ser Arg Pro Thr Ala1 5 10 123- Informações para Seq. ID № 100Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ÍD N- 100:
Val Phe Arg Asp Lys Glu Leu Ala His Pro Ser Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 101
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 101:
Gln Leu Arg Val Asp Pro Asp Gln His Ser Met His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 102
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 102:
Thr Ile Arg Phe Ala Arg Met Thr Thr Trp Asp Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 103
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 103:Val Ala Pro Ser Thr Val Phe Leu Asn Leu Leu Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 104
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 104:
Val Met Pro Phe Thr Gln Ile Asn Arg Ile Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 105
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 105:
Thr Tyr Gln Leu Arg Lys Ile Thr Val Thr Ala Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 106
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 106:
Leu Pro Arg Leu Ile Met Phe Arg Arg Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2107
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 107:
Ala Ser Thr Leu Leu Val Thr Lys Met Phe Pro Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 108
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 108:
Gly Arg Leu Asp Asn Gly Ser Ala Lys Thr Pro Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 109
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 109:
Pro Lys Pro Pro Leu Tyr His Val Asn Leu Asp Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 110
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 110:
Arg Arg Trp Phe Gly His Ile Ser Arg Pro Thr Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 111
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 111:
Ala Gln Pro Leu Ala Thr Ile Thr Pro Ala Lys Gly1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 112
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 112:
His Leu Pro Val Gln Ala Asn Arg Ile Ala Thr Gly1 5 10 12
3-Informações para Seq. ID N-113
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 113:
Asp Leu Ile Gln Thr Val Met Thr Arg Thr Ala Gly1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 114
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 114:
Ser Ser Pro Tyr Ser Met Arg Leu Ala Lys Leu Glu1 5 10 123- Informações para Seq. ID № 115
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 115:
Leu Arg Leu Ile Asp Glu Val Pro Ala Glu Leu Val1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 116
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 116:
Ile Pro Ser Thr Thr Glu Pro Ile Ile Leu Gly Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 117
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 117:
Asp Gln Thr Leu Phe Ser Met Thr Arg Thr Pro Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 118
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 118:Ser Ser Ala Leu His Ala Ala Thr Gln Ala Pro Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 119
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 119:
Ser Ser Ala Leu Ser Ala Ala Thr Thr Ala His Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 120
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 120:
Lys Ile Glu Ser Ser Trp Leu Leu Ser Asp Lys Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 121
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 121:
Gln Pro Asp Met Asn Ile Leu Ala Met Ser Arg Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 122
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 122:
Gln Thr Ala Asn Asn Val Ile Ala Ser Met Thr Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 123
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 123:
Gln Asn Lys Val Ile Asp Ala Met SerArg His Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 124
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 124:
Met Arg Ala Ile Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Ser Val1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 125
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 125:
Thr Pro Ser Gly Ala Gln Leu Trp Asp Ile Leu His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2126
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 126:
Met Ala Pro Asp Gly Ala Gln Trp Trp Glu Ala Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 127
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 127:
Thr Pro Ser Gly Ala Gln Leu Trp Asn Asn Leu His1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 128
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2128:
Thr Met Lys Thr Glu Leu Tyr Asn Leu Gln Leu Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2129
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 129:
Tyr Ser Met Lys Thr Gln Gly Trp Leu Ser Ala Leu1 5 10 123- Informações para Seq. ID N- 130
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 130:
Tyr Lys Leu Asp Ser Ser His Leu Leu Arg Gly Lys1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 131
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 131:
Met Arg Ala Ile Asp Glu His Gly Ile Arg Pro Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 132
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 132:
Gln Thr Leu Leu Ile Asn Ile Gln Gly Ala Thr Lys1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 133
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 133:Leu Lys Gln Asp Leu Val Ile Ser Tyr Met Ala Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 134
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 134:
Asp Leu Ile Thr Met Ser Met Ser Arg Ser Pro Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 135
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 135:
Gln Arg Met Ile Asp Ser Val Pro Val Pro Ser Ala1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 136
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID Ns 136:
Asp Pro Val Ile Leu Ser Ile ThrArg Leu Leu Lys1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 137
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 137:
Ser Pro Phe Asp Gln Val Leu Ser Ser Met Thr Arg1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 138
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 138:
Asp Pro Leu Ile Thr Met Met Thr Arg Thr Phe Pro1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 139
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 139:
Gly Ala Thr Arg Thr Met Val Thr Gln Ile Leu Asp1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 140
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 140:
Glu Leu Lys Ala Leu Arg Met Ser Tyr Pro Ser Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N-141
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 141:
Val Leu Glu Ala Pro Val Glu Asp Ile Leu Arg Leu1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 142
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 142:
Leu Gly Leu Ile Ile Pro Glu Thr Thr Ser Pro Ile1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 143
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 143:
Pro Pro Thr Arg Thr Met Ser Phe Leu Thr Gln Asp1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID № 144
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID № 144:
Ser Ser Ala Leu His Ala Ala Thr Gln Ala Pro Gln1 5 10 123- Informações para Seq. ID N2 145
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 145:
Arg His Ala Thr Thr Ala Ala Ser Leu Ala Ser Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 146
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 146:
Arg Lys Asp Ser Leu Leu Trp Ser Ser Glu Ile Lys1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 147
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 147:
Pro Arg Ser Met Ala Leu Ile Asn Met Asp Pro Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID Ns 148
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 148:Arg Thr Met Ser Ala Ile Val Asn Asn Ala Thr Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 149
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 149:
Pro His Arg Ser Met Ala Asp Ile Val Lys Asn Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 150
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 150:
Val Ser Pro Glu Pro Tyr Ser Asp Ile Ala Arg Met1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 151
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 151:
His Leu Ile Asp Trp Leu Gln Ala Gly Ser Pro Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2152
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 152:
Arg Ala Glu Trp Trp Gln Ala Gly Asp Pro Ala Met1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 153
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 153:
His Leu Asn Asn Trp Leu Gln Ala Gly Ser Pro Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 154
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 154:
Leu Leu Gln Leu Asn Tyr Leu Glu Thr Lys Met Thr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 155
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 155:
Leu Ala Ser Leu Trp Gly Gln Thr Lys Met Ser Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 156
Características da seqüência:a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 156:
Lys Gly Arg Leu Leu His Ser Ser Asp Leu Lys Tyr1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 157
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 157:
Pro Pro Arg Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Arg Met1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 158
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 158:
Lys Thr Ala Gly Gln Ile Asn Ile Leu Leu Thr Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 159
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 159:
Arg Ala Met Tyr Ser Ile Val Leu Asp Gln Lys Leu1 5 10 123- Informações para Seq. ID N2160
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 160:
Arg Pro Ser Arg Ser Met Ser Met Thr Ile Leu Asp1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 161
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 161:
Ala Ser Pro Val Pro Val Ser Asp Ile Met Arg Gln1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N2 162
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 162:
Lys Leu Leu Arg Thr Ile Ser Leu Ile Val Pro Asp1 5 10 12
3-Informações para Seq. ID N2 163
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 163:Arg Thr Met Ser Ser Leu Val Gln Asp Pro Phe Ser1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 164
Características da seqüência:
a) Tamanho: 12 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 164:
Pro Phe Thr Arg Thr Met Met Thr Ile Leu Pro Asp1 5 10 12
3- Informações para Seq. ID N- 165
Características da seqüência:
a) Tamanho: 9 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 165:
His Lys Leu Ala Gly Lys Asn Leu Arg1 5 9
3- Informações para Seq. ID N2 166
Características da seqüência:
a) Tamanho: 9 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 166:
Arg Leu Asn Lys Gly Ala Leu Lys His1 5 9
3- Informações para Seq. ID N2 167
Características da seqüência:
a) Tamanho: 5 aminoácidos
b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N-167:
Ala Thr Pro Arg Ser1 5
3- Informações para Seq. ID N- 168
Características da seqüência:
a) Tamanho: 5 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 168:
Ser Arg Pro Thr Ala1 5
3- Informações para Seq. ID N- 169
Características da seqüência:
a) Tamanho: 4 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N2 169:
Ala Thr Leu Ala1 4
3- Informações para Seq. ID N- 170
Características da seqüência:
a) Tamanho: 4 aminoácidos
b) Tipo: aminoácido
c) Topologia: linear
Descrição da seqüência: Seq. ID N- 170:
Ala Leu ThrAIa1 4

Claims (6)

1. - PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS A ANTÍGENOS DELEISHMANIA SEUS MOTIVOS PROTEICOS E SEQÜÊNCIAS REVERSAS,caracterizadas por compreender as seqüências Seq ID N- 1 a Seq ID Ns 170.
2. - MOTIVOS PROTEICOS DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA, conforme areivindicação 1, caracterizadas por compreender as seqüências Seq ID N2 165a Seq ID N2 170.
3. - PEPTÍDEOS, SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS E MOTIVOS PROTEICOSde acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por serem usadas nodiagnóstico das leishmanioses, como sondas para detecção "in vitro" dapresença de anticorpos circulantes ou outras moléculas Iigantes contraparasitos do gênero Leishmania.
4. - PEPTÍDEOS, SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS E MOTIVOS PROTEICOSsintéticos ou recombinantes de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3,caracterizados pela detecção de anticorpos circulantes ou moléculascirculantes a serem detectados por ensaios imunológicos, como por exemplotestes imunoenzimáticos (tais como ELISA, "Western Blot", imunofluorescência,imunohistoquímica, EIA, e outros), testes por imunoaglutinação, sensoreseletroquímicos, "Quantum dots", IFL (imunoensaio de fluxo lateral) ou outrasformas de detecção relacionadas direta ou indiretamente em amostras defluídos corporais, como saliva, urina e sangue.
5. - PEPTÍDEOS, SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS E MOTIVOS PROTEICOSconforme a reivindicações 1 ou 2, caracterizados por serem utilizados napreparação de composições vacinais, para estimular o sistema imune humanoou animal contra parasitos do gênero Leishmania.
6. - PEPTÍDEOS, SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS E MOTIVOS PROTEICOSde acordo com as reivindicações 3 e 4, caracterizados pelo uso das seqüênciasidentificadas por Seq. ID Na-I a Seq. ID N2 112 e Seq. ID N2 165 a Seq. ID N2- 170 ser preferencialmente para diagnóstico diferencial da forma Visceral daleishmaniose e as Seq. ID N2 113 a 164 preferencialmente para diagnósticodiferencial da forma Tegumentar da leishmaniose.
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WO2018037343A1 (pt) * 2016-08-23 2018-03-01 Universidade Federal De Minas Gerais Composições vacinais para proteção contra a leishmaniose visceral, peptídeos sintéticos e usos
WO2018051291A1 (pt) * 2016-09-16 2018-03-22 Universidade Federal De Minas Gerais Composição vacinal para proteção contra a leishmaniose tegumentar

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018037343A1 (pt) * 2016-08-23 2018-03-01 Universidade Federal De Minas Gerais Composições vacinais para proteção contra a leishmaniose visceral, peptídeos sintéticos e usos
WO2018051291A1 (pt) * 2016-09-16 2018-03-22 Universidade Federal De Minas Gerais Composição vacinal para proteção contra a leishmaniose tegumentar

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