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BRPI0916326A2 - complexo polipeptídico compreendendo polímero não-peptidil com três extremidades funcionais - Google Patents

complexo polipeptídico compreendendo polímero não-peptidil com três extremidades funcionais Download PDF

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BRPI0916326A2
BRPI0916326A2 BRPI0916326-3A BRPI0916326A BRPI0916326A2 BR PI0916326 A2 BRPI0916326 A2 BR PI0916326A2 BR PI0916326 A BRPI0916326 A BR PI0916326A BR PI0916326 A2 BRPI0916326 A2 BR PI0916326A2
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BR
Brazil
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protein
immunoglobulin
fact
protein complex
domain
Prior art date
Application number
BRPI0916326-3A
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English (en)
Inventor
Dae Hae Song
Jae Hee Shin
Mi Ji Lee
Sung Hee Hong
Se Chang Kwon
Gwan Sun Lee
Original Assignee
Hanmi Holdings Co., Ltd.
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Publication date
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Abstract

COMPLEXO POLIPEPTÍDICO COMPREENDENDO POLÍMERO NÃO-PEPTIDIL COM TRÊS EXTREMIDADES FUNCIONAIS. É divulgado um complexo proteico compreendendo um polipeptídeo fisiologicamente ativo, uma proteína dimérica e um polímero não-peptidil com três extremidades funcionais (3 ramificações), com a ligação tanto do polipeptídeo fisiologicamente ativo e a proteína dimérica ao polímero não-peptidil de 3 ramificações através das respectivas ligações covalentes. O complexo proteico garante a atividade de longa duração e bioestabilidade de um polipeptídeo fisiologicamente ativo. Ter a capacidade de manter a alta bioatividade de polipeptídeos ou peptídeos fisiologicamente para melhorar significativamente a meia vida no soro dos polipeptídeos ou peptídeos, o complexo proteico pode ser aplicado ao desenvolvimento de formulações de liberação sustentada de vários fármacos de polipeptídeo fisiologicamente ativo. Além disso, utiliza matérias primas, incluindo os poIipeptídeos fisiologicamente ativos sem perda significativa, aumentando assim o rendimento da produção. Além disso, ele pode ser facilmente purificado.

Description

COMPLEXO POLIPEPTÍDICO COMPREENDENDO POLÍMERO NÃO-PEPTIDIL
COM TRÊS EXTREMIDADES FUNCIONAIS Campo Técnico A presente invenção refere-se a um complexo proteico 5 que permite a atividade de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo com uma proteína dimérica. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um complexo proteico em que um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma proteína dimérica estão ligados a um polímero não-peptidil com três extremidades funcionais (3 ramificações) através de ligação covalente respectiva, e um método para preparar o mesmo.
Têcnica Anterior Devido à baixa estabilidade, polipeptídeos são geralmente aptos a desnaturar e ser degradados por proteinases e perder a sua atividade. Por outro lado, os peptídeos são relativamente pequenos de tamanho, de modo a serem prontamente excretados pelo rim.
A fim de manter as concentrações do nível sanguíneo desejado e os títulos dos mesmos, os rrtedicamentos proteicos compreendendo polipeptídeos ou peptídeos como ingredientes ativos precisam ser administrados com frequência. No entanto, devido ao fato dos medicamentos proteicos serem, em sua maior parte, de uma forma adequada para injetáveis, a manutenção de polipeptídeos ou peptícíeos fisiologicamente ativos ern níveis sanguíneos apropriados requer injeções frequentes, causando dor significativa para o paciente.
para superar esses problemas, tentativas têm sido feitas para proporcionar o máximo do efeito medicinal, aumentando a estabilidade dos medicamentos proteicos no sangue e mantendo os níveis de rnedicamentos sanguíneos normais por um longo período de tempo. Esses agentes medicinais proteicos de longa duração são necessários não só para aumentar a estabilidade dos medicamentos proteicos corno 5 para manter títulos suficientes dos próprios medicamentos, mas também que não causem reações imunológicas em pacientes.
Convencionalmente, polímeros altamente solúveis, como o poIietilenoglicol (PEG) são quimicamente enxertados na superfície das proteínas corn o objetivo de estabilizar as proteínas, impedindo o contato de proteinases com as proteínas, e suprimindo a perda renal de peptídeos de tamanho pequeno. Enxertado em sítios específicos ou vários em proteínas, PEG é útil para a estabilização e prevenção da hidrólise de proteínas, sem criar efeitos colaterais notáveis. Além disso, o peg enxertado aumenta o peso molecular das proteínas, deste modo restringindo a perda renal de proteínas e mantendo a atividade fisiológica das proteínas.
por exemplo, WO 2006/076471 descreve o uso do peptídeo natriurético tipo B (BNP) no tratamento da insuficiência cardíaca congestiva. BNP liga-se ao receptor de peptídeo natriurético A (NPR-A) para desencadear a síntese de CGMP, dirninuindo assim a pressão sanguínea arterial. Quando PEGuilado, o BNP é descrito como prolongando a sua atividade fisiológica por um longo período de tempo. A Patente Americana n° 6.924.264 também revela um aumento do período ativo da exendina-4 pelo enxerto de PEG em um resíduo de lisina.
Para aurnentar a sua atividade fisiológica, urn
3 /40 polipeptídeo medicinal está ligado aos dois terminais do PEG para foruiar um bis-conjugado (Patente Americana n°
5.738.846). por outro lado, duas diferentes proteínas medicinais são ligadas aos respectivos terminais de PEG 5 para formar um complexo proteico que tem duas diferentes atividades fisiológicas (WO 92/16221). No entanto, não foi encontrada importância dessas drogas de proteína em termos de manutenção da atividade.
Alérn ãisso, foi relatado que urna proteína de fusão em que o G-CSF e albumina humana foram Iigados a um PEG aumentou a estabilidade {Kinstler et al, Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995). No entanto, foi descoberto que o fármaco modificado com uma estrutura de G- CSF-PEG-albumina aumenta do tempo de residência apenas em cerca de quatro vezes, em comparação com fármacos naturais sozinho, e para ser apenas levemente aumentado na meia-vida do soro. Assirn, o Eármaco modificado não é praticamente aplicado como um agente de duração.
Quando acoplado com PEG, os peptídeos tornam-se tão estável de modo a prolongar a persistência dos mesmos in vivo. No entanto, quando dados pesos rnoleculares altos, peg torna o título do peptídeo fisiologicamente ativo significativamente mais baixo e diminui a reatividade com peptídeos, resultando em um baixo rendimento.
Uma alternativa para aumentar a estabilidade de proteínas fisiologicamente ativas in vivo recorre à recombinação gênica. Um gene que codifica uma proteína altamente estável no sangue é ligado a um gene que codifiica uma proteína fisiologicamente ativa de interesse, seguido pela transforrnação em células animais que são então
¶ V .
4/40 cultivadas para produzir uma proteína de fusão.
Por exemplo, uma proteína de fusão em que a albumina, ou um fragmento seu, conhecida por ser a mais eficaz para estabilizar proteínas até o momento, é fundida a uma 5 proteína fisiologicamente ativa de interesse foi relatada (WO 93/15199 e 93/15200, publicação EP n° 413.622). Alérn disso, uma proteína de fusão do interferon alfa e albumina, produzida a partir de leveduras pela Human Genome Sciences (nome corrlercial: Albuferon) aumentou a sua meia-vida do 10 soro de 5 horas a 93 horas, mas sofre a desvantagem crítica de ter bioatividade diminuída para menos de 5% daquela do interferon ingênuo (Osborn et al, j. Phar. Exp.Ther. 303 (2):540-548, 2002).
Como para os peptídeos, as suas modificações são 15 mencionadas em WO 02/46227, que revela que q GLP-I, exendina4 e seus análogos são fundidos à albumina do soro humana ou fragmentos de imunoglobulina (Fc), utilizancío técnicas de recombinação genética e a Patente Americana No.
6.756.480, que revela proteínas de fusão de hormônio da 20 paratireóide (PTH) ou seus análogos e fragmentos de imunoglobulina (Fc). Estas abordagens podem superar o baixo rencíimento de peguilação e a não-especificidade, mas são desvantajosos pelo fato de que a meia-vida do soro não é significativamente aumentada e, em alguns casos, resulta em 25 títulos baixos. Vários ligantes de peptídeos são usados para maximizar o aumento da meia-vida de soro, mas mostram a grande possibilidade de provocar respostas imunes. Quando administrado, um peptídeo com uma ligação dissulfeto, corrio o BNP, é altamente provável de induzir o dobramento errado 30 e, portanto, é difícil de ser aplicado.
¥.
q 5/40 Outras várias proteínas de fusão também são conhecidas por serem preparadas ligando o domínio Fc da imunoglobulina ao interferon (Publicação de Patente Coreana No. 2003- 9464), receptor de interleucina-4, receptor de 5 interleucina-7 ou receptor de eritropoietina (Patente Coreana No. 249572) através da recombinação genética. A Publicação de Patente PCT n° WO 01/03737 divulga uma proteína de fusão em que uma citocina ou um fator de crescimento é ligado através de um ligante oligopeptídeo a 10 um fragmento Fc de imunoglobulina. A Patente Americana No.
5.116.964 descreve LHR (glicoproteína de superfície de célula de linfócito) ou proteína CD4, que é fundida à extremidade amino ou carbóxi de um domínio Fc de imunoglobulina usando urna técnica de recombinação genética. 15 Além disso, a Patente Americana No. 5.349.053 divulga uma proteína de fusão em que IL-2 está ligada a um domínio Fc da imunoglobulina. Muitas outras proteínas de fusão Fc construídas com técnicas de recombinação genética são reveladas, que incluem, por exemplo, uma proteína de fusão 20 de um domínio Fc da imunoglobulina corri interferon-beta ou um derivativo da mesma (Publicação de Patente PCT n° WO 00/23472), um domínio Fc de imunoglobulina com um receptor da il-5 (patente Americana n° 5.712.121), um dowínio de imunoglobulina G4 Fc corn interferon alfa (patente Americana 25 n° 5.723.125) e um domínio Fc da imunoglobulina G2 com uma proteína CD4 (Patente Americana n° 6.451.313). Por outro lado, a Patente Americana No. 5.605.690 ensina o uso cíe um domínio Fc de imunoglobulina modificada na produção de proteínas de fusão. Por exemplo, a irnunoglobulina Fc com 30 resíduos de aminoácidos modificados particularmente para
! .:6 6/40 complementar sítios de ligação ou sítios de ligação ao receptor é usado para produzir uma proteína de fusão tnfr- IgGl Fc utilizando um método de recombinação genética.
Outras proteínas de fusão do domínio Fc da imunoglobulina 5 modifícada que são produzidos através de técnicas de recombinação gênica são divulgados nas Patentes Americanas Nos. 6.277.375, 6.410.008 e 6.444.792.
Irnunoglobulinas funcionam como anticorpos, mostrando citotoxicidade celular dependente de anticorpos {ADCC) ou 10 citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e as cadeias de açúcares presentes no domínio Fc da imunoglobulina são relatadascomo desempenhando um papel importante no ADCC e CDC (Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206,1985).
Imunoglobulinas em si, quando livres das cadeias de açúcar, 15 são conhecidas por serem semelhantes na meia vida do soro em relação às imunoglobulinas com cadeias de açúcar, mas tendo uma redução de 10 a 1000 vezes na força de ligação do complemento e na força de ligação ao receptor (Waldmann H., Eur. j. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., j. 20 Immunol. 143, 2595-2601, 1989).
a patente Americana No. 6.660.843 divulga a fusão de um domínio Fc com um peptídeo de interesse através de um ligante e a produção da proteína de fusão em E. coli utilizando uma técnica de recombinação gênica. Para uso na 25 preparação de complexos, um ligante permite a seleção dos sítios de conjugação entre duas proteínas de interesse e as orientações do mesmo, e permite a produção de complexos na forma de monÔmeros, dírneros ou multímeros homogêneos ou heterogêneos. Além disso, ao utilizar este método, os 30 complexos podem ser produzidos a um custo menor do que
)""" 7/40 quando são usadas células de mamíferos. Além disso, os complexos podem ser produzidos nas forrnas livres de cadeia de açúcar. Por causa da produção concomitante de ambas as proteínas de interesse eo domínio Fc da imunoglobulina em 5 E. coli, entretanto, este método é de difícil aplicação a uma proteína-alvo, quando a forrna natural cía proteína-alvo tem uma cadeia de açúcar. Tirando vantagern dos corpos de inclusão, este método é altamente capaz de induzir o utau dobramento. Nas proteínas de fusão Fc produzidas utilizando 10 as técnicas de recombinação genética, a fusão é possível em locais específicos, ou seja, um terrninal amino ou carb6xi do domínio Fc de imunoglobulina. As proteínas de fusão Fc são expressas apenas em formas diméricas homogêneas, mas não ern forrrias monoméricas. Além disso, a fusão só é 15 possível entre proteínas glicosiladas ou entre proteínas não-glicosiladas, mas é impossível entre as proteínas glicosiladas e as proteínas não-glicosiladas. Se estiver presente, uma sequência de aminoácidos recém-formada como resultado da fusão pode induzir uma resposta imune. Além 20 disso, o ligante pode ser sensível à degradação enzimática.
No desenvolvimento de proteínas de fusão usando domínios Fc de imunoglobulina, em lugar algum é descrita uma tentativa para fornecer complexos de proteínas-alvo com Fc humano natural através de um agente reticulante ern 25 relatórios anteriores. Dornínios Fc de imunoglobulina podem ser produzidos em céiulas de maxníferos cju E. coli, utilizando técnicas de recombinação genética, mas em lugar algum é descrita uma tentativa de produzir apenas domínios Fc de irnunoglobulina natural sem proteínas-alvo com alto 30 rendimento e cíe aplicá-los às formas duradouras nos
K. k 8/40 relatórios anteriores. Além disso, não foram feitas tentativas para produzir complexos do Fc de imunoglobulina recombinante com proteínas-alvo através de reticuladores. Como tal, uma variedade de diferentes rnétodos têm sido 5 realizados para conjugar polipeptídeos fisiologicamente ativos com polímeros. Nos métodos convencionais, polipeptídeos podem ser melhorados em termos de estabilidade, mas com redução significativa na atividade, ou podem ser melhorados na atividade, independentemente de 10 estabilidade. Portanto, ainda há a necessidade de um método que pode aumentar a estabilidade dos medicamentos proteicos corn uma redução mínima na atividade induzida por modificação. Neste contexto, os presentes inventores desenvolveram 15 um complexo proteico que tem melhor meia vida no soro com alta atividade, ligando uma imunoglobulina e um polipeptídeo fisiologicarnente ativo aos terminais opostos de um ligante não-peptidil conforme divulgado nas Patentes Coreanas Nos. 10-0725315 e 10-0775343, que são incorporadas 20 aqui por referência, nas suas totalidades.
Um complexo de proteínas em que uma imunoglobulina e um polipeptídeo fisiologicamente ativo são, respectivamente, ligados ao terminais opostos de urn polímero não-peptidil é convencionalmente preparado ligando 25 um polímero não-peptidil preferencialmente com um polipeptídeo fisiologicamente ativo e, em seguida, com um dornínio Fc de imunoglobulina. No entanto, este método de preparo convencional produz grande quantidade de impurezas indesejáveis, assim resultando na perda de uma grande 30 quantidade do polipeptídeo fisiologicamente ativo. Ou seja,
o método convencional é economicamente desfavorável na sua aplicação industrial, e o cornplexo resultante deve ser purificado em uma forma de certo modo complicada. No caso de o polipeptídeo fisiologicamente ativo estar na forma de 5 um dímero, ele produz uma forma de ponte com um polímero não-peptidil ern ambos os terminais, de modo que ele não possa complexar com uma Fc de imunoglobulina ou pode complexar, mas com rendimento muito baixo. Por outro lado, quando um domínio Fc da imunoglobulina é o primeiro ligado a um polímero não-peptidil, problemas sernelhantes ocorrem da mesma forma. Devido ao fato de uma Fc da imunoglobulina ser um homodímero com dois N-terminais próximos entre si, os ligantes respectivos são Eormados entre os dois N- terminais do Fc da imunoglobulina e os terrninais opostos do polímero não-peptidil para produzir uma forma de ponte, de modo que nenhuma extremidade funcional permaneça reativa com o polipeptídeo fisiologicamente ativo. Assim, o rendimento da produção diminui significativamente.
Divulgação da Invenção problema Técnico Levando à presente invenção, a investigação intensiva e profunda em complexos proteicos, conduzida pelos presentes inventores, visando superar os problemas encontrados no estado da técnica, resultou na constatação de que a utilização de polímero não-peptidil de 3 ramificações como um ligante na preparação de um complexo proteico composto por uma proteína dimérica e um polipeptídeo fisiologicamente ativo evita a perda do polipeptídeo fisiologicamente ativo para aumentar significativarnente o rendimento de produção, perrnite que o
K, a . 10/40 . complexo seja purificado com um método simples, e fornece estabilidade para o complexo proteico prolongar a rneia-vida do soro e, ao mesmo tempo, manter a atividade biológica do mesmo. 5 Solução para o problema É, por conseguinte, um objeto da presente invenção Eornecer um complexo proteico em que um polipeptídeo fisiologicamente ativo, um polímero não-peptidil de 3 rarnificações e uma proteína dimérica estão ligados através 10 de ligações covalentes, e um rriétodo para preparar o mesmo. É outro objeto da presente invenção fornecer um agente de fármaco de proteína sustentado compreendendo um complexo proteico que prolonga a meia vida de soro de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, mantendo a atividade 15 biológica do rnesrrto.
Efeitos vantajosos da Invenção Tendo uma estrutura erri que um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma proteína dimérica estão ligadas a um polímero não-peptidil de 3 ramificações 20 através de ligações covalentes, o complexo proteico da presente invenção pode manter uma alta concentração sanguínea do polipeptídeo ativo durante um longo período de tempo produzindo efeitos medicinais estáveis.
Além disso, o método para preparar o complexo proteico 25 de acordo com a presente invenção pode reduzir consideravelmente a quantidade de polipeptídeo fisiologicamente ativo exigido pelo rriétodo convencional, usando um polímero não-peptidil de 2 ramificações e goza, em relação ao método convencionaí, a vantagem de introduzir 30 métodos de purificação mais simples e aurnentar significativamente o rendimento da produção. Especialmente, os complexos de proteína persistentes com polipeptídeos fisiologicamente ativos diméricos foram preparados de preferência utilizando o método da presente invenção. 5 Breve Descrição dos Desenhos FIG. 1 mostra a figura representativa de um complexo proteico usando um polímero não-peptidil com três extrernidades funcionais (3 ramificações).
FIG. 2 mostra as eficácias in vivo do ccmplexo Fc de lO imunoglobulina-PEG-octreotídeo(N) de 3 ramificações em gráficos (HM11760B: complexo Fc de imunoglobulina-PEG- octreotídeo(N) de 3 ramificações, Sandostatina-LAR: uma formulação de liberação sustentada de octreotido).
FIG. 3 mostra a eficácia in vivo do complexo Fc imunoglobulina-PEG-FSH(N) de 3 ramificações(HM12160A: complexo Fc da imunoglobulina- PEG-FSH(N) de 2 ramificações, HM12160B: complexo Fc da imunoglobulina-PEG- fsh (N) de 3 ramificações).
Melhor Forma para Realizar a Invenção De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção é dirigida a um complexo proteico em que um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma proteína dimérica são covalentemente ligados a um polímero não-peptidil com 3 ramificações.
Como usado aqui, o termo "complexo de proteína" ou "complexo", se refere a uma estrutura composta de pelo menos um polipeptídeo fisiologicamente ativo, pelo menos um polímero não-peptidil de 3 ramificações e pelo menos uma proteína dirnérica, com interligação, através de ligações covalentes entre eles. No intuito de diferenciar-se de um
"complexo", o termo "conjugado" é aqui utilizado para se referir a uma estrutura em que apenas pares do polipeptídeo fisiologicamente ativo, o polímero não-peptidil e a proteína dimérica estão interligados através de uma ligação 5 covalente.
O complexo de proteínas da presente invenção é um fárrnaco de proteína que é de modificado para aumentar a sua persistência in vivo e minimamente reduzir a atividade biológica do mesmo. A presente invenção apresenta o uso de 10 umpolímero não-peptidil de 3 ramificações para conectar um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma proteína dimérica através desse para formar um complexo de proteína, permitindo a aplicação de um método de preparação pelo qual a perda do polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser 15 prevenida e o complexo proteico pode ser tão estruturalmente estável quanto simplesmente purificado.
Tal como aqui utilizado, o terrno "proteína dimérica" significa uma proteína com dois N-terminais. É preferido urrí domínio Fc de imunoglobulina que pode ser usado como um 20 veículo. Homodímeros ou heterodímeros fisiologicamente ativos também estão incluídos no escopo da proteína dirnérica.
Um domínio Fc de imunoglobulina é estável o suficiente para ser utilizado como um veículo para um fármaco porque é 25 um polipeptídeo biodegradável que é metabolizada in vivo.
Além disso, graças aos pesos moleculares relativamente pequenos, a o domínio Fc da imunoglobulina tem vantagens sobre as moléculas de irnunoglobulina totais em termos de preparação, purificação e rendimento do complexo. Além 30 disso, devido ao fato de ser Iivre de Fab que é muito l diferente na sequência de aminoácidos de um anticorpo para o outro, Fc promove fortemente a homogeneidade do complexo e espera-se que reduza a indução de antigenicidade.
O termo "domínio Fc da imunoglobulina", como aqui 5 utilizado, se destina a indicar o domínio constante da cadeia pesada 2 (Ch2) e o domínio constante da cadeia pesada 3 (Ch3), que está livre dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve, domínio constante de cadeia pesada I (Ch1) e domínio constante da cadeia leve 1 (CLl) e pode compreender uma região de dobradiça. O domínio Fc da imunoglobulina da presente invenção pode ser um àomínio Fc aumentado que compreende ainda uma parte ou todo o domínio constante da cadeia pesada 1 (Ch1) e/ou o domínio constante da cadeia leve I (Cl1) e está livre da variável de domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada se garante um efeito substancialmente igual ou superior daquela da forma natural. Alternativamente, o domínio Fc pode ser uma forma truncada de Ch2 e/ou Cf3 que carece de uma parte significativa da sequência de aminoácido correspondente. Em suma, o domínio Fc da imunoglobulina da presente invenção pode ser 1) domínio Ch1, domínio Ch2, domínio CH3e dornínio Ch4, 2) domínio CHl e domínio Ch2, 3) domínio CH1e domínio Ch3, 4) domínio Ch2 e domínio Ch3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região da dobradiça de imunoglobulina (ou urna parte da dobradiça) ou 6) um dímero composto de cada domínio constante de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve.
Além cíisso, o termo "domínio Fc da imunoglobulina", como aqui utilizado, se destina a englobar não somente sequências de arninoácidos naturais, mas tarnbém seus
14 /40 mutantes. O mutante da sequência de aminoácidos significa uma sequência de aminoácidos diferente da sequência natural por eliminação, inserção, substituição não-conservadora ou conservadora de uui ou rríais resíduos de arninoácidos ou suas 5 combinações. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331 de Fc de IgG, que são conhecidos por desernpenhar um papel importante na ligação do anticorpo, podem ser modificados de modo a serem usados como sítios de ligação adequados.
Além disso, são possíveis vários mutantes que, por exemplo, não têrn um resíduo formando uma ligação dissulfeto ou vários aminoácidos N-terminais do Fc natural, ou que têm um resíduo de metionina adicional no terminal N do Fc natural.
Além disso, funções efetoras podern ser eliminadas através da remoção de uma porção de ligação ao complemento, por exemplo, porção de ligação CIq, ou uma porção ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo). Pode ser feita referência ao WO 97/34631 e WO 96/32478 relativas à preparação de mutantes das sequências de aminoácidos dos domínios Fc da imunoglobulina.
Substituições do ácido aminado que não alteram a atividade das proteínas ou peptídeos naturais como um todo são conhecidas na técnica (H. Neurath, R. l. Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 1979). A maioria das substituições típicas ocorre entre Ala/Ser, val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/val, Ala/Glu e Asp/Gly. Se necessário, qs aminoácidos podem sofrer uma modificação, tal como fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação,
T '! " 15/40 farnesilação, acetilação, amidação, etc.
Os mutantes Fc acima descritos são preferivelmente equivalentes funcionais às suas formas naturais, sendo semelhantes na atividade biológica, com uma melhoria na 5 estabilidade estrutural contra o calor e pH. O domínio Fc pode ser uma forma natural isolada de seres humanos e outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinho- da-índia, ou pode ser um recorribinante ou um derivado do 10 mesmo, obtido a partir de células anirnais transformadas ou microrganismos. No primeiro caso, a imunoglobulina total é isolada de seres humanos ou animais, seguido de tratamento com a protease. Quando tratada com papaína, a imunoglobulina total é dividida em Fab e Fc. Pepsina cliva 15 imunoglobulina total em pF'c e F(ab)2. a partir desses fragmentos, Fc ou pF'c podem ser separados por crornatografia de exclusão por tamanho. É preferido um domínio Fc da imunoglobulina recombinante derivado do domínio Fc humano em microrganismos. 20 O domínio Fc da imunoglobulina útil na presente invenção pode ter uma cadeia de açúcar inferior, igual ou maior em comprimento do que o domínio Fc natural, ou não ter cadeias de açúcar. A adição, redução ou remoção da cadeia de açúcar Fc da imunoglobulina pode ser alcançada 25 através de uma técnica típica, corno uma técnica química, uma técnica enzimática ou uma técnica de recombinação genética utilizando microrganismos. Um domínio Fc da imunoglobulina desglicosilado é significativamente reduzido na força de ligação do complemento (CIq) e tem pouca ou 30 nenhuma citotoxicidade mediada por células dependente de
-— 16/40 anticorpo, ou citotoxicidade dependente de complernento e, portanto, induz nenhuma resposta imune desnecessária. Neste contexto, domínios Fc de imunoglobulina desglicosilada ou aglicosilada prefíerencialrnente, coincidem com a função 5 pretendida como veículos de fármacos.
Tal como aqui utilizado, o termo "desglicosilação" refere-se à rernoção enzimática de uma cadeia de açúcar do Fc natural. O termo "aglicosilação" refere-se à ausência de cadeias de açúcares no domínio Fc porque elas são produzidas em eucariotos e, de preferência, erri E. coli.
O domínio Fc de imunoglobulina pode se originar de animais, incluindo seres humanos, vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos-da- índia, com uma preferência pela origem humana. Além disso, o domínio Fc da imunoglobulina útil na presente invenção pode ser derivado dentre IgG, IgA, IgD, IgE, IgM e suas combinações, ou os seus híbridos. Preferencialmente, ele é derivado de IgG e IgM, que são mais abundantes do que os outros tipos de imunoglobulina e, mais preferencialmente de IgG, que é conhecida por prolongar a meia-vida no soro de proteínas de ligação ao ligante.
Além disso, o dornínio Fc da imunoglobulina pode estar na forma de dímeros ou multímeros (combinações de Fc de imunoglobulina), cada uma compreendendo imunoglobulinas glicosiladas compostas de domínios com a mesma origem.
O termo "cornbinação", como aqui utilizado, significa que polipeptídeos que codificam fragmentos Fc de imunoglobulina de cadeia simples da rnesma origern estão ligados a um polipeptídeo cíe cadeia simples de uma origem diferente para forrriar um dímero ou multímercn Ou seja, um dímero ou um multímero podem ser preparados pela combinação de dois ou mais fragmentos selecionados entre os fragmentos Fc de Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD e Fc IgE.
O termo "híbrido", como aqui utilizado, significa que 5 as sequências que codificam dois ou mais fragmentos Fc da imunoglobulina de diferentes origens estão presentes em um fragmento Fc de imunoglobulina de cadeia simples. Na presente invenção, diversas formas híbridas são possíveis.
Por exemplo, o domínio Fc é composto por um a quatro domínios diferentes selecionados a partir de CHl, Ch2, Ch3 e C,,4 de Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE e Fc IgD e pode incluir uma região da dobradiça.
IgG tarribém é ainda dividida em subclasses de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 e suas combinações ou híbridos são permitidos na presente invenção. Preferível é urri domínio Fc de IgG2 ou IgG4, com a maior preferência sendo dada a um domínio Fc de IgG4 sem funções efetoras,tal como a citotoxicidade dependente de cornplemento (CDC).
Deste modo, um domínio Fc não-glicosilado de IgG4 humana é o veículo de fármaco mais preferido. O dornínio Fc de origem humana é vantajoso em relação ao de origem não- humana, pois este pode atuar como um antígeno no corpo, induzindo a proãução de anticorpos para o mesmo.
A presente invenção apresenta a ligação de um fárrnaco proteico a uma proteína dirnérica através de um polímero não-peptidil.
Na presente invenção, o polímero não-peptidil significa um polímero biocompatível composto por duas ou mais unidades de repetição, que são ligadas entre si através de uma ligação covalente que não seja uma ligação peptídica.
Os ligantes peptidil convencionais utilizados nas proteínas de fusão preparados através de fusão na estrutura sofrem a desvantagem de serem facilmente clivados por 5 proteases in vivo para falhar na garantia da meia-vida no soro do fármaco ativo, contanto que esperado quando o veículo permanece intacto. Ao contrário, o polímero da presente invenção é resistente à degradação enzimática, mantendo a rneia-vida no soro do fármaco, contanto que isto garanta quando o veículo permanece intacto. Enquanto ele age como mencionado acirna, ou seja, é resistente às proteinases in vivo, qualquer polímero pode ser utilizado na presente invenção, sem Iimitações conferidas aos mesmos.
O polímero não-peptidil útil na presente invenção varia de peso molecular de 1 a 100 Koa, e de preferência de 1 a 20 KOa. O polímero não-peptidil da presente invenção que é conjugado com um domínio Fc de imunoglobulina pode ser um polímero ou uma combinação de diferentes polímeros.
Exemplos do polímero não-peptidil úteis na presente invenção incluem polímeros biodegradáveis, tais como polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol e propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrana, éter poliviniletílico, polímeros biodegradáveis, tais como PLA (ácido polilático) e plga (ácido polilático-glicólico), lipopolímeros, quitinas, ácido hialurônico e suas combinações, corn preferência pelo polietileno glicol. Além disso, seus derivados que são conhecidos na técnica, ou que podem ser prontamente preparados com a técnica típica estão dentro do escopo da presente invenção.
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N
E . 19/40 Os polímeros não-peptidil utilizados na presente invenção têm grupos funcionais a que o domínio Fc da imunoglobulina e o fármaco da proteína podem se ligar.
Ao contrário do método anterior para preparar 5 complexos proteicos usando um polímero não-peptidil tendo duas extremidades funcionais (2-ramificações) (Patente Coreana Ncn 10-0725315), a presente invenção emprega um polímero não-peptidil de 3 ramificações. Diferente do polímero não-peptidil convencional que tem uma extremidade 10 funcional e se ramifica de uma molécula central, o polímero não-peptidil útil na presente invenção tem três extremidades funcionais, em que duas são responsáveis pela formação de ligações covalentes com uma proteína dimérica, enquanto a outra é uma covalentemente ligada a um 15 polipeptídeo fisiologicamente ativo.
Em mais detalhes, devido ao fato de uma imunoglobulina Fc ser um homodímero com dois N-terminais em estreita proximidade entre si, os Iigantes respectivos são formados entre os dois N-terminais do Fc da imunoglobulina e os 20 terminais opostos do polírnero não-peptidil. Assim, quando o polímero nãQ-peptidil de 2 ramificações forma primeiro ligações covalentes com o domínio Fc da imunoglobulina, não há extremidades funcionais disponíveis que possam reagir com o polipeptídeo fisiologicamente ativo, resultando em 25 uma diminuição significativa no rendimento da produção.
Assim, o polipeptídeo fisiologicamente ativo, antes do polírriero não-peptidil de 2-rami£icações, reage com o domínio Fc da imunoglobulina. No entanto, quando o polipeptídeo fisiologicamente ativo reage com antecedência, 30 várias impurezas indesejáveis são produzidas, gerando assirn à perda do polipeptídeo fisiologicamente ativo. Em contrapartida, é possível reagir o polímero não-peptidil com 3 ramificações com o domínio Fc da imunoglobulina antes da reação com o polipeptídeo fisiologicamente ativo, porque 5 duas das suas três extremidades funcionais são responsáveis por dois N-terminais do Fc da imunoglobulina, enquanto a outra extremidade funcional sua podem cobrir o polipeptídeo fisiologicamente ativo. Assim, o complexo de proteína pode ser produzido com alto rendimento. Na prática, foi descoberto que o rendimento da produção aumenta de duas a - nove vezes mais do que quando polírneros não-peptidil de 2 rarriificações são usados.
Os três grupos funcionais terminais do polímero não- peptidil podem se ligar aos resíduos de lisina, histidina ou cisteína livres N-terminais do douíínio Fc da imunoglobulina e o polipeptídeo fiisiologicamente ativo.
De preferência, os três grupos funcionais terminais do polímero não-peptidil são selecionados dentre os grupos aldeído, os grupos propionaldeído, os grupos butil aldeído, os grupos de maleimida e derivados de succinimida. Exemplos de derivativos succinimida úteis na presente invenção incluem propionato de succinimidila, hidroxissuccinimidila, succinimidilcarboximetila e succinimidilcarbonato. São preferidos os grupos aldeído. Quando presentes nos três terminais do polímero não-peptidil, grupos aldeído reativos podem minimizar reações não-específicas e são eficazes na formação de ligações tanto com polipeptídeos fisiologicamente ativos quanto com a proteína dimérica.
Além disso, o produto final formado por alquilação redutiva com o aldeído é muito mais estável do que o produto forrnado por ligações amida. Geralmente, os grupos aldeído funcionais seletivamente reagem com extremidades amino em um pH baixo, enquanto formam uma ligação covalente com um resíduo de lisina em pH alto, por exemplo, pH 9,0. Os três 5 grupos funcionais terminais do polímero não-peptidil podem ser iguais ou diferentes entre si.
De acordo com a presente invenção, o conjugado de proteína dimérica com o polímero não-peptidil está ligado a um polipeptídeo fisiologicamente ativo para formar um cornplexo proteico.
Aqui, o termo "polipeptídeo fisiologicamente ativo", "proteína fisiologicamente ativa", "proteína ativa", "polipeptídeo ativo" ou "fármacos de proteína" significa um polipeptídeo, um peptídeo ou uma proteína que tem algum tipo de atividade antagonista para um evento fisiológico in vivo e esses termos podem ser usados intercambiavelrnente.
Os polipeptídeos fisiologicamente ativos aplicável ao complexo proteico da presente invenção podem ser exernplificados pelos hormÔnios, citocinas, interleucinas, proteínas de ligação interleucina, enzimas, anticorpos, fatores de crescimento, fatores de transcrição, fatores sanguíneos, vacinas, proteínas estruturais, proteínas ligantes, receptores, antígenos de superfície celular, antagonistas do receptor e derivados ou análogos dos mesmos.
Exemplos concretos dos polipeptídeos fisiologicamente ativos úteis na presente invenção incluem hormônios de crescimento humano, hormônios de liberação do hormônio do crescimento, peptídeos de liberação do hormônio de crescimento, interferons e receptores de interferon (por exemplo, interferon-oLf V e Yt receptores de interferon tipo I solúveis), fatores estimuladores de colônia,
peptídeos tipo glucagon (GLP-I, etc.), peptídeos exendina-
4, ANP, BNP, CNP, DNP, receptores acoplados à proteína G, 5 interleucinas (por exemplo, a interleucina- 1, -2, -3, -4,
-5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17,
-18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29,
-30) e receptores de interleucina (por exemplo, receptor cía
IL-I, receptor da IL-4, etc.), enzimas (por exemplo,
glicocerebrosidase, iduronato-2-sulfatase, aÁgalactosidase
A, cL-L-iduronidase, butirilcolinesterase, quitinase,
glutamato descarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase,
acetilidrolase do fator de ativação plaquetário,
endopeptidase neutra, mieloperoxidase, etc.), proteínas de ligação à interleucina e citocina {por exemplo, 1L-18pb,
proteína de ligação ao TNF, etc.), fatores de ativação de macrófagos, peptídeos de macrófagos, fatores de células B,
fatores de células T, proteína A, inibidores da alergia,
glicoproteínas de necrose celular, imunotoxinas,
linfotoxinas, fator de necrose tumoral, supressores tumorais, fator de crescimento transformante, alfa-l-
antitripsina, albumina, cL-lactalbumina, apolipoproteína-E,
eritropoietina, eritropoietina glicosilada, angiopoeitinas,
hemoglobina, trombina, peptídeos ativadores dos receptores de trombina, trombomodulina, fator sanguíneo VII, VIla,
VIII, TX e XIII, ativadores de plasminogênio, peptídeos de ligação à fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina,
proteína C, proteína C-reativa, inibidor da renina,
inibidor da colagenase, supertSxido dismutase, leptina,
fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de
.. SP.
crescimento angiostatina, epitelial, angiotensina, fator /40 de fator crescimento de crescimento epidérmico, ósseo, j proteína estimuladora de osso, calcitonina, insulina, somatostatina, octreotido (agonista de somatostatina), 5 atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor da via do fator tecidual, o hormônio folículo-estimulante, hormÔnio luteinizante, hormônio de liberação do hormÔnio luteinizante, fatores de crescimento nervoso (por exemplo, 10 fator de crescimento neural, fator neurotrõfico ciliar, fator de axogênese 1, peptídeos tipo glucagon (GLP-I), peptídeos de exendina-4, o peptídeo natriurético cerebral, fator neurotrófico derivado da glia, netrina, fator inibidor de neutrófilo, neurturina, etc.), o hormÔnio da 15 paratireóide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento tipo insulina, hormônio adrenocortical, glucagon, colecistoquinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo liberador de gastrina, fator de liberação de corticotropina, hormônio estimulante da tireóicíe, 20 autotaxina, lactoferrina, utiostatina, os receptores (por exemplo, TNFR(P75), TNFR(P55), receptor da IL-I, receptor de VEGF, receptor ativador de células B, etc.), antagonistas do receptor (por exemplo, ILI-Ra, etc.), os antígenos de superfície celular (por exemplo, o CD 2, 3, 4, 25 5, 7, lla, llb, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.), anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, SCFv, Fab, Fab' F(ab1)2 e Fd), e antígenos de vacinas derivadas de vírus. Preferencialmente, o polipeptídeo fisiologicamente ativo é 30 selecionado dentre os hormônios de crescimento hurnanos,
. » 24/40 interferon-alfa, interferon-beta, fator estimulante de colÔnias de granulócitos, eritropoietina, exendina-4, imidazol acetil exendina-4 peptídeo (agonista da exendina- 4), calcitonina, octreotido (agonista da somatostatina), 5 BNP e Fab'. Desvantajosamente, esses fármacos proteicos não podem manter suas atividades biológicas in vivo durante um longo tempo, porque eles são altamente susceptíveis a desnaturar ou são prontamente degradados com proteases. No entanto, o 10 complexo da presente invenção em que uma proteína dimérica e um polipeptídeo são conjugados através de um polímero não-peptidil aumenta tanto a estabilidade estrutural quanto a metade do tempo de depuração do Eármaco. A redução da atividade biológica do polipeptídeo por causa da conjugação 15 com a proteína dimérica é muito insignificante, em comparação corn aquela gerada em complexos convencionais.
Portanto, o complexo do polipeptídeo e o domínio Fc da imunoglobulina de acordo com a presente invenção é caracterizado por possuir uma biodisponibilidade 20 significativamente melhorada, comparado com o de agentes farrnacológicos de polipeptídeo convencionais.
De acordo com outro aspecto seu, a presente invenção pertence a um método para preparar um complexo proteico em que uma proteína dimérica é conjugada com um polipeptídeo 25 fisiologicamente ativo através de urn polímero não- peptidilde 3 ramificações, compreendendo: (1) ligar covalentemente dois ramificações do polírríero não-peptidil de 3 ramificações aos grupos amino N-terminais opostos da proteína dimêrica para formar um conjugado (2) isolando-o 30 da mistura reacional da etapa (1) o conjugado no qual a proteína dimérica está covalentemente ligada ao N-terminal seu com o polímero não-peptidil e {3) covalentemente ligando o polipeptídeo fisiologicamente ativo a um ramificação livre do polímero não-peptidil do conjugado 5 isolado.
Em uma rnodalidade preferida, a proteína dimérica da etapa (1) é um domínio Fc de imunoglobulina. Ern outra modalidade preferida, os três ramificações do polímero não- peptidil da etapa (1) têm grupos funcionais aldeído respectivos nos seus terminais. Mais preferivelmente, o polímero não-peptidil é ligado ao grupo amino N-terminal do polipeptídeo fisiologicamente ativo em pH 6,0.
Na etapa (1), a proteína dimérica reage em uma razão molar de 1:2 a 1:5 com o polímero não-peptidil. Na etapa (3), a razão molar do conjugado isolado pela etapa {2): o polipeptídeo fisiologicamente ativo de preferência varia de 1:0,5 a 1:0,05.
As reações nas etapas (1) e {3) dependem dos três grupos terminais do polímero não-peptidil. Se necessário, as reações podem ser realizadas na presença de um agente redutor. Exemplos preferidos do agente redutor incluem cianoboroidreto de sódio (NaCNBHj, boroidreto de sódio, borato de dimetilamina e borato de piridina.
A ligação entre o domínio Fc da imunoglobulina e o polipeptídeo fisiologicamente ativo não é alcançada por meio de fusão com base na recouibinação genética, rnas através de uma ligação covalente.
De acordo corri um aspecto seu, a presente invenção pertence a uma cornposição farmacêutica compreendendo o complexo proteico da pFesente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável, que dernonstra uma melhoria da sustentabilidade in vivo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
Através de uma via adequada, a cornposição farmacêutica 5 da presente invenção deve ser introduzida em um tecido ou órgão de interesse. Assim, desde que seja entregue ao tecido alvo, qualquer via pode ser usada para a administração da composição farmacêutica da presente invenção. Por exemplo, a administração pode ser realizada por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérrnica, oral, local, intranasal, intrapulmonar e retal, mas não está limitada a estas. De preferência, a composição farmacêutica ãa presente invenção é administrada em uma forma injetável. Além disso, a composição farmacêutica pode ser administracía com o auxílio de um dispositivo através do qual o material ativo é entregue às células-alvo.
A corríposição farmacêutica com base no complexo da presente invenção pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Para o uso como um veículo farmaceuticamente aceitável em formas de dosagem oral, um aglutinante, um lubrificante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizante, urn dispersante, urri estabilizador, um agente de suspensão, um corante e/ou um fragmento são selecionados. Quando a composição farmacêutica da presente invenção é formulada em injeções, um tampão, um conservante, um agente para aliviar a dor, um solubilizante, um isotÔnico e um estabilizador podem ser usados sozinhos ou em combinação. para aplicação local, uma base, um excipiente, um lubrificante e um conservante podem u. ? è 27/40 ser usados. Para uso prático, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em combinação com o veículo farmaceuticamente aceitável eut diversas formas de dosagem. Para formas de dosagem, por exemplo, ela pode ser 5 formulada em comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, etc. Como injeções, elas podern estar na forma de ampola de dose única ou doses múltiplas.
Outras formas disponíveis incluem soluções, suspensões, pílulas, pós, cápsulas e agentes de liberação sustentada. 10 Exemplos de veículos, excipientes e diluentes úteis na formulação incluem lactose, d lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, arnido, goma acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose 15 amorfa, polivinilpirrolidona, água, metilidroxibenzoato, propilidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. Além disso, urn enchimento, um agente anti- aglomerante, um lubrificante, uma fragrância, um emulsificante e um conservante são úteis. 20 A quantidade farmaceuticamente eficaz do cornplexo de proteína da presente invenção varia dependendo do tipo de doenças a serem tratadas, da via e frequência de administração, da idade, gênero e peso do paciente e da severidade da doença, assirn como do tipo de polipeptídeos 25 fisiologicamente ativos. A superioridade do complexo proteico na persistência in vivo e no título torna possível reduzir a dose e frequência de administração da composição farmacêutica da presente invenção.
Conforme divulgado nas Patentes Coreanas Nos. 10- 30 0725315 e 10-0775343 e, um complexo de proteínas é fornecido em que um domínio constante de imunoglobulina e um polipeptídeo fisiologicamente ativo são, respectivamente, ligados aos terminais opostos de um polímero não-peptidil. Este complexo proteico é preparado 5 através da ligação do polímero não-peptidil com o polipeptídeo fisiologicamente ativo para formar um conjugado e depois com a imunogolublina Fc. O processo'de preparação é prejudicial na medida em que o polipeptídeo fisiologicarnente ativo é perdido em grande quantidade ãurante a preparação. Ao contrário, o uso de um polímero não-peptidil de 3 rarniticações na preparação de um complexo proteico pode reduzir excepcionalmente a perda do polipeptídeo fisiologicamente ativo. Além disso, o complexo proteico pocíe ser isolado usando um método de purificação simples.
Uma melhor ccmpreensão da presente invenção pode ser obtida através dos exemplos seguintes, que são estabelecidos para ilustrar, mas não devem ser interpretados como Iimitantes da presente invenção.
Modo para a Invenção EXEMPLO 1: Preparação do Complexo Fc de Imunoglobulina-PEG-Octreotido (N) de 3 ramificações Para a peguilação de um Fc de imunoglobulina em seu N- terminal, lO mg/mL de imunoglobulina Fc reagiu a uma razão molar de 1:2 com 5K PropionALD (3) PEG (PEG com três grupos propionaldeído, NOF, japão) a 4 "cpor 4,5 horas. A reação foi realizada em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 6,0, na presença de SCB 20 rrtM (NaCNBH,) como agente redutor.
Usando SOURCE Q (16 mL XK, GE Healthcare), Fc de imunoglobulina monopeguilada foi purificada a partir da
£ 2 29/40 mistura reacional. A seguir octreotido reagiu a uma razão molar de 1:2 com o conjugado de Fc de imunoglobulina-5k PEG a4 °C por 20 horas, com concentração de proteína total fixado em 25mg/mL. Esta reação de acoplamento foi realizada 5 em fosfato de potássio lOOmM, pH 6,0, na presença do agente redutor SCB 20mM. A mistura reacional de acoplamento foi purificada através de uma coluna de purificação SP hp.
Usando tampão de fosfato de sódio lO mM (pH 5,4) como um tampão de ligação, o conjugado Fc de imunoglobulina-5K PEG 10 que não sofreu a reação de acoplamento não estava ligado a uma coluna SP HP (16 mL XK, GE Healthcare), mas foi separado carregando através da coluna, enquanto a imunoglobulina-PEG-Octreotido (HM11760B) foi levemente fixado à coluna e a seguir eluiu com um gradiente salino de 15 NaCl IM.
Coluna: SP HP (16 mL XK, GE Healthcare) Taxa de fluxo: 2,0 mL/min Gradiente: a 0 ~ 20% de B errt 60 min (A: 10 mM de NaP, pH5,4, B: A + NaCl IM) 20 Exemplo 2: Preparação do Complexo de Fc de Imunoglobulina-PEG de três ramificaçõe8-Calcitonina {N) Imunoglobulina-Fc reagiu no seu N-terminal com 5K PropionALD (3) PEG da mesma forma como no Exemplo 1, após o que sornente a imunoglobulina monopeguilada Fc foi 25 puriticada e juntamente com a calcitonina. Neste sentido, a calcitonina reagiu ern uma razão molar de 1:2 com o conjugado Fc de imunoglobulina-5k PEG A 4 °c por 20 horas, com concentração de proteína total fixada erri 25mg/rríl. Para uso como um meio Nesta reação de acoplamento, tampão 30 fosfato de potássio 100 Mrn, pH 6,0, Eoi suplementado com o
JL. ? . 30/40 agente redutor de SCB 20 rriM {NaCNBHj. A mistura reacional de acoplamento foi purificada através de uma coluna de purificação SP HP. Primeiro, uma coluna SP HP (16mL XK, GE Healthcare) foi usada para remover o conjugado de Fc de 5 imunoglobulina-5k PEG que permaneceu desacoplado com a calcitonina. Usando um tampão de fosfato de sódio 10 rnM (pH 5,4) como um tampão de ligação, o conjugado Fc de irnunoglobulina-5k PEG que não sofreu a reação de acoplamento não estava ligado a uma coluna SP HP (16 mL XK, 10 GE Healthcare), mas foi separado carregando através da coluna, enquanto a imunoglobulina-PEG-calcitonina foi fixada levemente à coluna e então eluiu com urri gradiente salino de NaCl im.
Coluna: SP HP (XKl6mL, GE Healthcare) 15 Taxa de fluxo: 2,Ci mL/min Gradiente: A 0 -> 20% de B em 60 min (A: Na-p 10 mM em pH5,4, B: A + NaCl IM) Exemplo 3: Comparação de rendimento de produção e simplicidade do prQce88o de purificação entre o complexo 20 PEG de três rajnificaçõe8(EXEMPLO 1 e 2) e q complexo PEG de 2 ramificações O rendimento da produção do complexo PEG de 3 ramificações e do complexo PEG de 2 ramificações Eoram comparados usando o complexo Fc de imunoglobulina-PEG de 3 25 ramificações-octreotido(N) e o complexo de Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-calcitonina (N) preparado pelo EXEMPLO 1 e 2, respectivamente (Tabela 1).
O cornplexo PEG de 2 ramificações como um grupo cíe controle foi preparado ligando Octreotido ou calcitonina 30 corno um, poIipeptídeo fisiologicamente ativo na região Fc q. h 31/40 de imunoglobulinas através de PEG de 2 raruificações (PEG com dois grupos propionaldeído, IDB, Coréia do Sul) como ligante. particularmente, um PEG de 2ramificações foi acoplado com Octreotido ou Calcitonina, e então com um 5 domínio Fc de imunoglobulina através de uma ligação covalente (KR1O-0725315).
Tabela 1 [Tabela 1] [Tabela] Ingrediente Forma PEG Rendimento da Farmacêutico Ativo Produção (Base (API) API) Octreotido 2 ramificações 9% 3 ramíficações 33% Calcitonina 2 ramificações 18% 3 ramificaçiSes 30% 10 Os processos de purificação do complexo a partir da mistura de reação de acoplamento foram analisados pela simplicidade e tamanho da coluna principal e os resultados são resumidos na Tabela 2, abaixo.
Tabela 2 15 [Tabela 2] [Tabela] API Forma PEG Processo dej Tamanho da purificação ) Coluna Primária Octreotido 2 ramificações Source Q ->1 5 Source ISO 3 ramificações SP HP )1 Calcitonina 2 ramificações Source Q ->1 4
Source ISSO 3 ramificações SP hp Ao utilizar o complexo PEG de 2 ramificações, todos os Fc de imunoglobulina que permaneceram desacoplados foram unidos à coluna de modo a separar-se de Fc de imunoglobulina-PEG de 2 ramificações-Octreotido ou de Fc de 5 imunoglobulina-PEG de 2 ramificações-Calcitonina. Em contrapartida, quando se utiliza o complexo PEG de 3 ramificações, a separação entre o conjugado Fc de imuinoglobulina-5k PEG que permaneceu desacoplado com o poIipeptídeo fisiologicamente ativo e a Fc de lO imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-Octreotido ou Fc de imunoglobulina-pEG de 3 ramificações-Calcitonina foi alcançado de tal forma que o conjugado Fc da imunoglobulina-5k PEG foi removido pelo carregarnento através da coluna, enquanto o Fc da imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-Octreotido ou Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-Calcitonina foram ligados à coluna. Assim, não só o processo de purificação foi reduzido de duas etapas para urria, rrías também a coluna foí reduzida a 1/5 de tamanho.
Exemplo 4: Preparação de Complexo Fc de Imnnoglobu1ina-PEG de 3 ramificações-FSH(N) Fc de Imunoglobulinareagiu no seu N-terminal com 5K PropionALD (3) PEG da mesma forma como no Exemplo 1, após o qual somente a Fc de imunoglobulina monopeguilada foi purificada e acoplada com FSH. Sob esse aspecto, FSH reagiu erri uma razão molar de 1:15 com o conjugado Fc da imunoglobulina-5k PEG a 4 °C por 20 horas, com concentração de proteína total fixada em 40 mg/mL. Para o uso como urn meio nesta reação de acoplamento, tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 6,0, foi suplementado com o agente redutor de SCB 20 mM. A mistura de reação de acoplamento foi purificada através de duas colunas de purificação. 5 Primeiro, uma coluna Blue HP (Hitrap 5mL, GE Healthcare) foi usada para rernover o conjugado Fc de irnunoglobulina-5k PEG que permaneceu desacoplado corn FSH. Posteriormente, multipolímeros em que dois ou mais conjugados Fc de imunoglobulina-5k PEG foram acoplados com FSH foram removidos através de Resource Iso (1 ml, GE Healthcare), corri base de hidrofobicidade.
Coluna: Blue hp (5mL de Hitrap, GE Healthcare) Taxa cíe fluxo: 3,0 mL/min Gradiente: A 0 -> 100% de B em 20 rnin A: Gly-NaOH 50 mM + KCl 0,2 M B: Gly-NaOH 50 mM + KCl 2,5 M Coluna: Resource ISSO (lrnL, GE Healthcare) A 0 -> 100% de B em 90min (A: Tris 20mM, pH 7,5, b: A + a.s. 1,3M) EXEMPLO 5: Elaboração do Complexo Fc de Imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-lnsulina (N) Para peguilação de uma Fc de imunoglobulina em seu N- terminal, 10 mg/mL de Fc de imunoglobulina reagiu a uma razão molar de 1:2 com 5K PEG PropionALD (3) PEG (PEG com três grupos propionaldeído, NOF, japão) a 4 °C por 4,5 horas. A reação foi realizada em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 6,0, na presença de SCB (NaCNBH,) 20 rriM como agente redutor. Usando SOURCE Q (LRC25 85 mL, GE Healthcare), Fc de imunoglobulina monopeguilada foi purificado a partir da mistura reacional. Então, insulina
L ? 34/40 reagiu a uma razão molar de 1:4 com o conjugado Fc de imunoglobulina-5k PG a 4 °C por 19,5 h. Para uso como um meio para essa reação de acoplamento, tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 6,0, foi suplementado com o agente 5 redutor SCB 20 mM. A mistura de reação de acoplamento foi purificada através de duas colunas de purificação.
Primeiro, uma coluna SOURCE Q {85 mL LRC25, GE Healthcare) foi usada para remover o conjugado Fc de imunoglobulina-5k peg que permaneceu desacoplado com insulina. Um gradiente 10 salino de NaCl 1 M em Tris 20 rnM (pH 7,5) permitiu que Fc de imunoglobulina-5K PEG fosse eluído primeiro devido à força de ligação relativamente fraca, imediatamente seguido pela eluição da Fc da imunoglobulina-PEG-insulina. Através desta purificação primária, o conjugado Fc da 15 imunoglobulina-5K PEG foi removido, mas multipolímeros de FC-5K PEG e insulina não foram completamente separados. A purificação secundária foi então conduzicía com base na diferença de peso rnolecular entre o cornplexo e o multipolímero usando a coluna Sephacryl S-300 (GE 20 Healthcare). Ao mesmo tempo, o complexo Fc de imunoglobulina-PEG-insulina foi formulado. Multipolímeros de alto peso molecular de Fc de imunoglobulina-5k PEG e insulina foram eluídos primeiro, seguido pelo complexo Fc de imunoglobulina-PEG-insulina. 25 Coluna: SOURCE Q (85mL de LRC25, GE Healthcare) Taxa de fluxo: 8,OmL/min Gradiente: A 0 -> 25% de B ern 100 min {A: Tris pH 7,5 20mM, B: A + NaCl IM) Coluna: Sephacryl S-300 (120rnL de HiPrep, GE 30 Healthcare)
Taxa de fluxo: 0,6mL/min EXEMPLO 6: Comparação de rendimento de produção entre o complexos PEG de 3 ramificações (EXEMPLO 4 e 5) e o complexo PEG de 2 ramificações 5 O rendimento da produção do complexo PEG de 3 ramificação e o complexo peg de 2 ramificações foi comparado usando o complexo Fc da imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-FSH(N) e o complexo Fc da imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-insulina (N), preparado pelos EXEMPLOS 4 e 5, respectivamente (tabela 3).
Ao utilizar o processo de preparo convencional usando PEG de 2 ramiticações, os polipeptídeos fisiologicamente ativos diméricos, tais como FSH (Pm. Ca. 40.000 Da) e insulina (Pm. 5.807), ocuparam ambos os terminais do polímero não-peptidil de modo que o polímero não pôde formar uma ligação covalente com o domínio Fc da imunoglobulina que forneceu persistência in vivo. Este fenômeno foi mais evidente com urn polipeptídeo fisiologicamente ativo dimérico de peso molecular pequeno, como insulina.
Deste modo, os complexos de proteína persistentes com polipeptídeos fisiologicamente ativos diméricos foram preparados, de preferência utilizando o PEG de 3ramificações.
As diferenças no rendimento de produção de FSH e insulina de acordo com o processo de preparação, usando PEG de 2 ramificações e PEG de 3 ramificações são resurnidos na Tabela 3, abaixo.
Tabela 3 [Tabela 3]
[Tabela]
Ingrediente Forma PEG Rendimento de
Farmacêutico Ativo produção (Base
(API) API)
FSH PEG de 2 10%
ramificações peg de 3 I 32%
ramificações
Insulina PEG de 2 3%
ramificações
PEG de 3 27%
ramificações
EXEMPLO 7:Preparação Do Complexo Fc de Imunoglobulina-
PEG-FacVIIa (N)
Para peguilação de um Fc de imunoglobulina em seu N- 5 terminal, 6 mg/mL de Fc de imunoglobulina reagiu com uma razão molar de 1:2 com 5K PropionALD (3) PEG (PEG com três grupos propionaldeído, NOF, japão) a 4 °Cpor 4,5 horas.
A reação foi realizada em tampão fosfato de potássio 100 mM,
pH 6,0, na presença de SCB 20 mM (NaCNBH,) como agente redutor.
Usando SOURCE Q (LRC25 85 mL, GE Healthcare), Fc de imunoglobulina monopeguilada foi purificada a partir da mistura reacional.
A seguir, FVlla reagiu em uma proporção molar de 1:9 com o conjugado Fc de imunoglobulina-5K PEG a
4 °C durante 18 horas, com a concentração de proteína total fixada em 20 mg/mL.
Para uso como um meio para essa reação de acoplamento, um tampão de fosfato de potássio 100 rnM, pH
6,0, foí supíementado corn o agente redutor SCB a 20 rriM.
A mistura reacional de acoplamento foi purificada através de duas colunas de purificação.
Primeiro, uma coluna SOURCE Q
Lp K. g 37/40 (LRC25 85 ml, ge Healthcare) foi usada para remover o conjugado Fc de imunoglobulina-5k PEG que permaneceu desacoplado com Fvlla. Um gradiente salino de NaCl 1 M em Tris 20 mM (pH 7,5) permitiu que o conjugado Fc da 5 imunoglobulina-5K PEG fosse eluído primeiro devido à força de ligação relativamente fraca, imediatamente após a eluição da Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações- FVlla. posteriormente, a purificação secundária foi conduzida para separar Fc de imunoglobulina-PEG de 3 10 ramificações-Wlla das impurezas cío multímero FVII com uma coluna RESOURCE ISO (GE Healthcare). O Fc da imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-FVIla foi eluído primeiro, seguido pelas impurezas do multímero FVlla.
Coluna: Source Q (85 mjj de LRC25, GE Healthcare) 15 Taxa de fluxo: 4 mL/min Gradiente: A 0 3 7% de B em 1 rrtin, 7% 37% de B em 80 min (A: Tris 20mM pH 7,5, B: a + NaCl IM) Coluna: RESOURCE ISO (pré-ernpacotada de lrnl, GE Healthcare) 20 Taxa de fluxo: 2 mL/min Gradiente: B% 100 0% de A ern 60 min (A: Tris 20 rnM pH 7,5, B: A + 1,6Í'I (NH,),SO,) Tabela 4 [Tabela 4] 25 [Tabela) Ingrediente Forma PEG )Rendimento dej Farmacêutico Ativo i Produção (base| (API) )API) Facvlla PEG de 2jNão preparado ramificações
PEG de 3 Aproximadamente ramificações acirna de 3%
EXEMPLO 8: Ensaio in vivo do complexo Fc de imunoglobulina-pg de 3 ramificações-Octreotido(N)
O Fc de imunoglobulina-pEg de 3 ramificações-
Octreotido(N) foi avaliado para verificar os efeitos no 5 peso corporal eo nível de IGF-I em ratos SD administrados por via subcutânea corn isto.
O octreotido é um potente inibidor do hormônio de crescirnento, e é aplicado principalmente para o tratamento da acromegalia.
É comercialmente disponível a partir de Novatis em duas formas: Sandostatina, uma versão de curta duração; e
Sandostatin-LAR, uma versão de ação prolongada.
Atualmente,
a acromegalia é uma síndrome que resulta em urria superprodução do hormônio de crescimento humano (hGH). Em testes in vivo de octreotido, os ratos que são administrados por via subcutânea com isso são monitorados em relação ao peso corporal eo nível de IGF-I para examinar os seus efeitos sobre a inibição da secreção de GH.
Da mesma forma, q Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-
Octreotido (N) Eoi analisado in vivo por mudanças de peso corporal e nível de IGF-I em ratos.
O Fc de imunoglobulina-
PEG de 3 ramificações-Octreotido(N) foi administrado em doses únicas de 0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg, enquanto
Sandostatina-LAR como controle foi administrado em doses únicas de 1,0 e 2,0 mg/Kg, após o que os ratos foram monitorados em relação ao peso corporal eo nível de IGF-I por duas semanas.
Ambos qs materiais de teste foram
. administrada por via subcutânea.
Em comparação com um grupo administrado corn veículo,
<. y 39/40 observou-se que os grupos de Sandostatina-LAR reduziram o peso corporal em cerca de 3,7% quando administracío com uma dose de 1,0 mg/Kg e de cerca de 8,9% quando administrado com uma dose de 2,0 mg/Kg. Por outro lado, osgrupos Fc de 5 imunoglobulina-PEG com 3 ramificações-Octreotido(N) diminuíram no peso corporal em cerca de 44,3% na administração de 0,5 mg/Kg de administração, em cerca de 40,1% na administração de 1,0 mg/kg e em cerca de 55,1% na adrninistração de 2,0 mg/Kg. 10 A análise quantitativa das alterações de IGF-I nos ratos utilizou o Kit ELISA IGF-I. Comparado com o veículo, foi observado que o nível de IGF-I sanguíneo diminuiu em cerca de 15°, com Sandostatina 1,0 mg/kg e cerca de 11% com Sandostatina 2,0 mg/kg com base da AUC do nível de IGF-I 15 sanguíneo. Por outro lado, os grupos de Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-Octreotido(N) diminuíram no nível de IGF-I sanguíneo por cerca de 23% com urna dosagem de 0,5 mg/kg, por cerca de 18% com uma dosagem de 1,0 mg/Kg, e por cerca de 25% com uma dosagem de 2,0 20 mg/Kg [FIG. 2] .
Os dados do teste in vivo dernonstram que a Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-Octreotido {N) é mais potente na atividade de Sandostatina-LAR, uma formulação sustentada de octreotido. 25 EXEMPLO 9: Ensaio in vivo do Complexo Fc de imunoglobu1ina-PEG de 3 ramificações-FSH (N) Ensaio in vivo da Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-FSH(N) foi realizado de acordo com o método de Steelman-Pohley (Endocrinology 53, 504-616).. Ratas 30 imaturas SD (21 dias de idade) forarn utilizadas para o ensaio in vivo do Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-FSH(N). A Fc de imunoglobulina-PEG de 3 ramificações-FSH(N) foi administrada em doses únicas de 0,018, 0,075 e 0,3 µg/rato, enquanto Follitrope, uma forma 5 comercialmente disponível natural de FSH, foi utilizada como controle nas doses de 4, 2 e i Ul/rato uma vez por dia durante três dias. Um veículo e os rnateriais de teste foram administrados em combinação com hCG (gonadotrofina coriônica humana) ern 13,3 U/rato. Cada material de teste foi administrado por via subcutânea, em uma quantidaãe de 0,25 Kg/mlj. 72 horas após a primeira administração dos materiais do teste, os animais foram submetidos à eutanásia e tiveram uma ovariotomia. Os ovários retirados forarn pesados.
Tal como descrito na FIG. 3, a Fc de imunoglobulina- PEG de 3 ramificações-FSH(N) apresentou atividade in vivo de uma forma dose-dependente, com igualdade para o Fc da imunoglobulina-PEG de 2 ramificações-FSH(N)-

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES
1. Complexo proteico, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um polipeptídeo fisiologicamente ativo, uma proteína dimérica e um polímero não-peptidil com três 5 extremidades funcionais, ccm a ligação do polipeptídeo Eisiologicamente ativo e da proteína dimérica ao polímero não-peptidil através de respectivas ligações covalentes.
2. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína dimérica é um domínio Fc de imunoglobulina.
3. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc da imunoglobulina é não-glicolado.
4, Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dornínio Fc da imunoglobulina é composto por um a quatro domínios diferentes selecionados dentre Ch1, Ch2, Ch3 e Ch4.
5. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc de imunoglobulina compreende ainda uma região de dobradiça.
6. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc de irnunoglobulina é selecionado a partir de um grupo composto de domínios Fc de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM e combinações e híbridos dos mesmos.
7. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc da irnunoglobulina é selecionado de um grupo composto de domínios Fc da IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e combinações e híbridos dos rnesrrios.
2/7 j
8. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc da imunoglobulina está na forma de dímeros ou multímeros {combinações de Fc de imunoglobulina), cada uma 5 compreendendo imunoglobulinas glicosiladas compostas de domínios com a mesma origem.
9. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc da imunoglobulina é um domínio Fc de IgG4.
10. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio Fc da imunoglobulina é um domínio IgG4 não-glicosilaào humano.
11. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação i, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero não-peptidil é selecionado de um grupo composto de polietilenoglicol, propilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol e propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrana, éter poliviniletílico, polímeros biodegradáveis, tais como PLA (ácido polilático) e PLGA (ácido polilático-glicólico), polímeros biodegradáveis, lipopolímeros, quitinas, ácido hialurônico e suas combinações.
12. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero não-peptidil é um polietilenoglicol.
13. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de qjue o polírnero não-peptidil tem um grupo terminal funcional selecionado dentre os grupos aldeído, os grupos propionaldeído, grupos butiraldeído, grupos maleimida e derivados de succinimida.
' 3. t 3/7
14. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero não-peptidil teuí três grupos aldeído funcionais nos seus respectivos terminais. 5
15. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as três extremidades funcionais do polímero não-peptidil se ligam ao N-terminal, grupos funcionais do domínio Fc da imunoglobulina e o polipeptídeo fisiologicamente ativo, o dito N-terminal, 10 grupos funcionais sendo selecionados a partir de um grupo consistindo de resíduos de lisina, histidina, cisteína e combinações dos mesmos.
16. Cornplexo proteico, de acordo com a Reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo 15 fisiologicamente ativo é selecionado a partir de um grupo composto de hormônios, citocinas, interleucinas, proteínasde ligação à interleucina, enzimas, anticorpos, fatores de crescimento, fatores de transcrição, fatores sanguíneos, vacinas, proteínas estruturais, proteínas 20 ligantes,' receptores, antígenos de superfície celular, antagonistas do receptor e derivados ou análogos cíos me smos .
17. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo . fato de que o polipeptídeo 25 fisiologicamente ativo é selecionado de um grupo'cornposto de hormônios de crescimento humano, hormôniosde liberação do hormÔnio do crescimento, peptídeos de liberação do hormÔnio do crescimento, interferons e receptóres de interferon, fatores estimuladores de colônia, peptídeos 30 tipo glucagon, peptídeos de exendina 4, ANP, BNP, CNP, DNP,
).. . receptores acoplados à 4/7 proteína receptores de interleucina, enzimas, proteínas de ligação à G, interleucinas e interleucina, proteínas de ligação às citocinas, fatores de ativação de macrófagos, peptídeos de macrófagos, fatores de 5 células B, fatores de células T, Proteína A, inibidores da alergia, glicoproteínas de necrose celular, imunotoxinas,
linfotoxinas, fator de necrose turnoral, supressores de tumor, fator de crescimento transformante, antitripsina alfa-l, alburnina, a-lactalbumina, apolipoproteína-E, 10 eritropoietina, eritropoietina altamente glicosilada,
angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeos de ativação do receptor de trombina, trombornodulina, fator sanguíneo VII, VIla, VIII, IX e XIII, ativadores de plasrninogênio, peptídeos de ligação à fibrina, uroquinase, 15 estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína C-reativa,
inibidor da renina, inibidor da colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescirnento epitelial, fator de crescirnento epidérrnico, angiostatina, angiotensina, fator 20 de crescirnento ósseo, proteína estirnulante Óssea,
calcitonina, insulina, somatostatina, octreotido (agonista cía somatostatina), atriopeptina, tator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor da via do fator tecidual, hormônio 25 folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio liberador do hormônio luteinizante, fatores de crescimento do nervo, hormÔnio ãa paratireóide, relaxina, secretina,
somatomedina, fator de crescimento tipo insulina, hormônio adrenocortical, glucagon, colecistoquinina, polipeptídeo 30 pancreático, peptídeo liberador de gastrina, fator de t ..#
G 5/7 liberação de corticotropina, horrnônio estimulante da tireóide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores, antagonistas cío receptor, antígenos de superfície celular, antígenos de vacinas derivados de vírus anticorpos 5 monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de ant icorpo .
18. Complexo proteico, de acordo com a Reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é selecionado de um grupo composto 10 de hormônios de crescimento humano, interferon-alfa, interferon-beta, fator estimulante de colônias de granulócitos, eritropoietina, exendina-4, peptídeo imidazolacetileendina-4 (agonista de exendina-4), calcitonina, octreotido (agonista da somatostatina), BNP e 15 fragmento Fab'.
19. Método para preparar um complexo proteico composto por um polipeptídeo fisiologicamente ativo, urna proteína àimérica e um polímero não-peptidil com três extremidades funcionais, com a ligação tanto do 20 polipeptídeo fisiologicamente ativo quanto da proteína dimérica ao polímero não-peptidil via ligações covalentes respectivas, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (1) ligar covalentemente duas extremidades funcionais do polímero não-peptidil aos grupos amino N-terminais 25 opostos da proteína cíimérica para formar um conjugado (2) isoíar da místura reacional da etapa (1) o conjugado em que a proteína dimérica é covalentemente ligadaaos N-terminais seus com o polímero não-peptidil e (3) ligar covalentemente o polipeptídeo 30 fisiologicamente ativo a uma extremidade livre funcional do t K 6/7 - polímero não-peptidil do conjugado isolado.
20. Método, de acordo com a Reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína cíimérica é um domínio Fc da imunoglobulina. 5
21. Método, de acorào com a Reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero não-peptidil tem três grupos aldeído funcionaisnos seus respectivos terrninais.
22. Método, de acordo com a Reivindicação 19, 10 CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína dimérica reage com uma razão molar de 1:2 a 1:5 com o polímero não- peptidil na etapa (1).
23. Método, de acordo com a Reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado reage em uma 15 proporção molar de 1:0,5 a 1:0,05 com o polipeptídeo fisiologicamente ativo na etapa {3).
24. Método, de acordo com a Reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que as reações em auibas as etapas (1) e (3) são conduzidas na presença de um agente 20 redutor.
25. Método, de acordo com a Reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente redutor é selecionado a partir de um grupo composto de cianoboroidreto de s6dio (NaCNBH,), boroidreto de sódio, 25 borato de dimetilamina e borato de piridina.
26. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de compreender o cornplexo proteico de qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 e, opcionalmente, um veículo 30 farmaceuticamente aceitável.
K ,b ¶ ·E 7/7
27. Complexo proteico, CARACTERIZADO pelo fato de ser preparado usando o método de qualquer uma das Reivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25.
~ 1/2 [Fig. 1]
4..· /H ..-. "{' /' 'TÇ ' S"' ' " "" "' "' '"! >a ·:.- · ^t·&-m. ..d,-Z » . , - (L )á2EPAdj " '" " ' ,", :' ..t: ' ' ¢'" 'i+"4 . · "—'" <· 'm. ...4 :..- ' Ysz" " '.' """;"¥,"Tbt7:'"" p" Àlúí)tli ' Y J '—Y—) ' Y ) Um Polipeptídeo Um pdimero Uma Proteina Dimérica Fisiologicamente Ativo nãü-peptidil de 3 ramificações [Fig. 2) ¶ tI 1 L
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[Fig. 3] NS (cada grupo de dQse) 100 { NS (cada grupo de dose) 4h* á kk
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