BRPI0903187A2 - marcadores prognósticos de resposta clinica de pacientes infectados com vìrus da dengue - Google Patents

Abstract

MARCADOPES PROGNóSTICOS DE PESPOSTA CLìNICA DE PACIENTES INFECTADOS COM VìRUS DA DENGUE A invenção se refere a um método para fornecer o prognóstico de resposta clínica de pacientes infectados com o vírus da dengue conduzido através da análise da expressão de um grupo de genes, bem como polimorfismo alélico e níveis de proteínas codificadas por eles através do seguintes métodos: microarranjos de DNA, nortbern blot, PCR, PCR quantitativa, western blot, ELISA e citometria de fluxo, O uso de qualquer dos métodos acima referidos, ou outros relacionados, é a base para desenvolvimento de kíts preditores de resposta clínica, desta forma facilitando o manejo clínico.

Description

MARCADORES PROGNOSTICOS DE RESPOSTA CLINICA DE PACIENTES INFECTADOS COM VÍRUS DA DENGUE

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a prognósticos para a resposta clinica de pacientes infectados pelo virus da dengue, baseados no nivel de expressão dos genes listados nas Tabelas 2-7, ou em suas proteínas codificadas, bem como polimorfismo alélico, em amostras biológicas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O vírus da dengue é um membro da família Flaviviridae, gênero flavivírus com quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1 a DENV-4). A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública mundial, com uma incidência estimada em 50-100 milhões de casos de febre do dengue (FD ou dengue clássica), resultando em 500.000 casos clínicos de febre hemorrágica do dengue com risco de vida (FHD ou dengue hemorrágica) e 24.000 mortes por ano (Green e Rothman 2006). A FHD é caracterizada por vasculopatia, o que leva a um extravasamento plasmático súbito que reduz o volume sangüíneo e pode resultar em choque hipovolêmico, o que é conhecido como Síndrome de Choque do Dengue (SCD). Não há nenhuma terapia antiviral para o tratamento da infecção por dengue nem meios para impedir o desenvolvimento da FHD.

Durante a fase aguda da infecção, os pacientes com FD e FHD têm quadros clínicos muito similares. No entanto, a defervescência (depois de 2 a 7 dias do início dos sintomas) é acompanhada por sinais de perturbações circulatórias em pacientes com FHD (OMS 1999). Por isso, acreditamos que a assinatura genética diferenciando as duas diferentes formas clínicas de dengue poderia ser uma ferramenta poderosa a ser usada em áreas endêmicas para prever a resposta do paciente, facilitando o manejo clinico.

O conceito atualmente aceito como subjacente à imunopatologia da FHD se apóia na seqüência de infecção e indução de anticorpos não-neutralizantes (Endy, Nisalak et al. 2004; Pangf Cardosa et al. 2007), bem como na ativação de clones de célula T reativa-cruzada (MANGADA, Endy et al. 2002; Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al. 2003; MANGADA Rothman e 2005; Mongkolsapaya, Duangchinda et al. 2006) ambos adquiridos após a infecção primária. Alguns dos "marcadores" de gravidade encontrados no sangue periférico, que foram correlacionados com o extravasamento plasmático na FHD incluem citocinas inflamatórias, quimiocinas e moléculas de aderência expressas em níveis elevados (Green, Vaughn et al. 1999; Juffrie, van der Meer et al. 2000; Mustafa, Elbishbishi et al. 2001; Suharti, van Gorp et al. 2002; Hatfield, Hung et al. 2003; Nguyen, Lei et al. 2004; Cardier, Marino et al. 2005; Tseng, Lo et al. 2005), a ativação de complemento (Avirutnan, Punyadee et al. 2006), além de aumentar a freqüência das células ativadas (Green, Vaughn et al. 1999; Azeredo, De Oliveira-Pinto et al. 2006) e ocorrência de apoptose (Mongkolsapaya, et al Dejnirattisai. 2003; Myint, Endy et al. 2006). Estas descobertas contribuíram para o avanço da compreensão dos mecanismos imunológicos envolvidos no desenvolvimento da FHD, mas não foi provado que nenhuma delas seja confiável ou útil como marcador biológico para uso clínico. O microarranjo de DNA tem sido utilizado como uma ferramenta para localizar "assinaturas genéticas" e prever com sucesso a resposta clinica do paciente com câncer (van de Vijver, He et al. 2002; Chen, Yu et al. 2007), bem como para infecções bacterianas e virais (Ramilo, Allman et al. 2007; Scherer, Magness et al. 2007). Van de Vijver et al (2002) relataram o uso de perfil prognóstico de 70 genes, previamente associado com o risco de metástase distante precoce em pacientes jovens com câncer de mama cujos linfonodos foram negativos para a presença de células cancerosas, como um instrumento de orientação para a terapia adjuvante nesses doentes (van de Vijver, He et al. 2002). Desta forma, melhora-se a seleção de pacientes que iriam se beneficiar com o tratamento adjuvante sistêmico, reduzindo as taxas tanto de tratamento excessivo como de subtratamento.

No modelo de infecção de dengue, o padrão de expressão gênica foi caracterizado junto com a fase de infecção em pessoas acometidas com a forma mais grave da doença, em duas diferentes coortes de dengue: Simmons et al. (2007) mostraram uma assinatura molecular em Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs), representando as fases aguda e convalescente da Sindrome de Choque do Dengue e eles relataram que os transcritos gênicos para 24 genes estimulados por IFN foram menos abundantes em adultos (6 pacientes) com sindrome de choque do dengue do que em 8 pacientes com dengue sem SCD, enquanto que genes envolvidos em apoptose estavam expressos em maior quantidade (Simmons, Popper et al. 2007). Recentemente Ubol et al (2008) em uma coorte de crianças da Tailândia confirmaram conceitualmente os resultados mostrados neste relatório e no estudo vietnamita, associando a diminuição da resposta imune inata e o aumento da apoptose com o desenvolvimento de FHD (übol, Masrinoul et al. 2008), mas o padrão genético difere do que mostramos aqui. Uma possível razão pode ser a faixa etária utilizada, na medida em que sabe-se que fenotipicamente o repertório da resposta imune é diferente durante os primeiros anos, onde predomina a resposta inata, comparativamente aos adultos (Pettiford, Jason et al. 2002). Em contraste, Kruif et al. (2008) relataram uma associação geral da gravidade do dengue e maior quantidade de expressão dos genes envolvidos na resposta imune inata (de Kruif, Setiati et al. 2008).

Vários exames laboratoriais de dengue baseados em sorologia ou detecção viral estão disponíveis e são capazes de confirmar o diagnóstico de infecção de dengue. Quando utilizados separadamente, cada um desses exames têm limitações, porém, quando utilizados nas combinações corretas, é possível confirmar ou afastar com segurança o diagnóstico de infecção pelo vírus da dengue. No entanto, a maior limitação no manejo clínico de casos de dengue é a capacidade do clínico avaliar o risco de um determinado paciente infectado de dengue desenvolver os seus sintomas fatais e a sua real necessidade de ser hospitalizado. A incidência de FHD é de aproximadamente 1% e é fatal se não for tratada rapidamente. Mesmo sob assistência médica a taxa de mortalidade devido a FHD pode atingir 10 a 20%. Infelizmente a maior parte dessas mortes poderiam ser evitadas com os cuidados médicos adequados. Um dos principais culpados da falta de assistência adequada é o caos causado pelos grandes surtos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu critérios clínicos para definir os casos de FHD, mas as dificuldades tanto para preencher esses critérios como para identificar precocemente os casos graves, fazem com que o manejo clínico das formas graves da doença se torne um desafio até mesmo maior (Bandyopadhyay, Lum et al. 2006; Deen, Harris et al. 2006). Por isso, a busca de novas ferramentas para prever a resposta clínica do paciente é essencial para facilitar a avaliação da necessidade de intervenções médicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção consiste num método de avaliar a resposta clínica do paciente infectado com o vírus da dengue durante a fase aguda da infecção e antes de surgirem os sinais de vasculopatia. O método consiste na análise dos níveis de expressão de um grupo de genes (Tabelas 2-7), ou proteínas codificadas por eles, assim como polimorfismos alélicos.

Num aspecto da invenção, a predição da resposta clínica dos pacientes infectados com o vírus da dengue é baseada na análise de expressão dos 73 genes mostrados na Tabela 6, originados pela combinação dos melhores 200 genes mais significativos (menor valor p) e 200 maiores diferenças na expressão (magnitude fold change) entre dengue clássica e dengue hemorrágica.

Num outro aspecto da invenção, os genes na Tabela 2 são usados para caracterização e diferenciação da expressão gênica em pessoas infectadas com vírus da dengue (FD + FHD) de outras causas de doenças febris (não dengue ou ND). Ainda um aspecto da invenção, diz respeito ao uso da Análise de Discriminação Linear, como regra de classificação, e resubstituição potencializada (bolstered resubstitution), como estimador de erro, de genes na forma isolada, dupla, trio ou mais genes para predizer resposta clinica de pacientes infectados com virus da dengue.

Em outro aspecto da invenção, a expressão de duplas de genes baseados na lista de 1981 genes (Tabela 7) é usada como classificador para predizer resposta clinica de pacientes infectados com virus da dengue.

Em outro aspecto da invenção, a expressão de trio de genes baseados na lista de 1981 genes (Tabela 7) é usada como classificador para predizer resposta clinica de pacientes infectados com virus da dengue.

Em outro aspecto da invenção, a expressão de quarteto de genes baseados na lista de 1981 genes (Tabela 7) é usada como classificador para predizer resposta clinica de pacientes infectados com virus da dengue.

Em ainda um outro aspecto da invenção, a avaliação da expressão gênica pode ser realizada por qualquer das técnicas destinadas a detectar RNA, cDNA, cRNA (PCR, RT-PCR, PCR quantitativa, microarranjo de DNA, Northern blotting e outros).

Em ainda um outro aspecto da invenção, a avaliação dos níveis dos produtos proteicos codificados pelos genes mostrados na Tabela 7 pode ser realizada por qualquer técnica destinada a detectar formas desnaturadas e nativas das proteínas (ELISA, Western blotting, dot-blotting, citometria de fluxo e outros). BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1 mostra medidas de ruído e eficiência. A seta indica o único arranjo, no grupo não dengue, que mostrou reduzida tanto a relação sinal/ruído quanto percentagem de chamadas presentes.

FIG. 2 é um gráfico de degradação de RNA.

FIG. 3 mostra a análise exploratória dos dados baseados nos 1981 genes selecionados. (A) dendrograma de agrupamento hierárquico. (B) Gráfico MDS 2-D. (C) Gráfico MDS 3-D. A elipse em (B) representa os dois maiores grupos de amostras.

FIG. 4 mostra os 40 melhores genes diferencialmente expressos entre amostras FD e FHD. (A) Mapa de expressão com anotação do GeneBank. (B) Dendograma de agrupamento hierárquico (apenas os 40 melhores genes). (C) Gráfico MDS 3- D (apenas os 40 melhores genes).

FIG. 5 mostra o classificador para o par de genes PSMB9 e MT2A, na discriminação de FD contra FHD. Menor expressão de ambos os genes é característica de FHD, enquanto maior expressão de ambos os genes é característica de FD. A probabilidade estimada de erro para este classif icador é de apenas 5.38%.

FIG. 6 mostra níveis de expressão de genes para discriminação entre pacientes FD e FHD. (A) para todos os genes testados, os ensaios de pPCR foram realizados usando uma mistura de 8 pacientes FD e 8 FHD usados no ensaio de microarranjos. (B) Para todos os genes, os ensaios de qPCR foram realizados para um grupo de 8 amostras FD e 8 FHD usados no ensaio de microarranjo (coluna branca), ou um grupo de 8 amostras FD e 8 FHD independentes (coluna cinza). 0 experimento foi realizado duas vez e cada grupo foi analisado em triplicata.

FIG. 7 fornece gráficos Vulcões mostrando os valores ρ correlacionados com a magnitude de diferença de expressão (fold change) em pacientes FD versus FHD e casos de dengue (FD+FHD) versus não dengue. Os genes destacados em vermelho e azul representam os 40 melhores genes de acordo com os valores ρ e magnitude de diferença de expressão respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A tecnologia de microarranjos de DNA é uma importante ferramenta para estudar a expressão de RNAm simultaneamente de todos os genes num genoma. Esta tecnologia consiste de milhares de diferentes seqüências de DNA representando diferentes genes adsorvidos em regiões conhecidas de uma matriz sólida, tais como lâmina de vidro. As lâminas podem ser hibridizadas com sondas derivadas de RNAm de células ou tecidos. Arranjos de oligonucleotidios (composto por DNA de 25-mers) se baseia na estratégia do pareamento perfeito/despareamento (match/mismatch) da sonda no chip de DNA, onde são usadas sondas que pareiam perfeitamente (match) e sondas que diferem da primeira por uma base em seu centro (mismatch) e que por isso não hibridizam ao chip de DNA. Neste tipo de microarranjo, apenas um fluorocromo é usado para marcação do RNA complementar (RNAc) e o sinal é detectado usando um equipamento de escaneamento óptico. A quantificação da sonda hibridizada é realizada comparando os sinais dos oligos "mismatch" (hibridização não especifica) e os oligos que pareiam perfeitamente (match). Microarranjos de DNA tem sido usado como ferramenta para achar "assinaturas gênicas" e predizer com sucesso a resposta clinica de pacientes com câncer (van de Vijver, He et al. 2002; Chen, Yu et al. 2007) assim como para infecções bacterianas e virais (Ramilo, Allman et al. 2007; Scherer, Magness et al. 2007). van de Vijver et al (2002) relataram o uso de perfil prognóstico usando 70 genes como ferramenta para guiar a terapia adjuvante nesses pacientes através da seleção daqueles pacientes que realmente se beneficiariam desse tratamento adjuvante sistêmico e reduzindo tanto a taxa de tratamento excessivo ou subtratamento. Os 70 genes utilizados por esses autores foram previamente associados com risco de metástase distante em pacientes jovens com câncer de mama e cujo linfonodos foram negativos para a presença de células cancerosas (van de Vijver, He et al. 2002).

Há muitas evidências que fatores genéticos, envolvidos em susceptibilidade/resistência à doenças infecciosas,

influenciam a resposta imune em humanos. Esses fatores são complexos e geneticamente controlados e não seguem um perfil de herança Mendeliana (Clementi and Di Gianantonio 2006) . Alguns desses fatores identificados por microarranjos de DNA são envolvidos com alteração da regulação gênica e algumas vezes devido a polimorfismos que interferem com a expressão gênica de várias formas, seja diretamente se ligando ao promotor, seja interferindo na cascata de sinais que interfere com a ativação gênica. Polimorfismo genético do hospedeiro relacionado com resposta imune tem sido mostrado estar correlacionado com expressão gênica alterada e susceptibilidade a desenvolver FHD, tais como o alelo TNF-308, associado com elevados níveis de TNFa, tem sido correlacionado com aumentado risco de desenvolver a forma mais grave da doença (Fernandez-Mestre, Gendzekhadze et al. 2004; Soundravally and Hoti 2007). Uma associação tem sido recentemente relatada entre o genótipo selvagem AA MBL2, altos níveis de MBL e alto risco de desenvolver trombocitopenia associado com infecção pelo vírus da dengue (Acioli-Santos, Segat et al. 2008). Por outro lado, polimorfismo no promotor de CD209 (Sakuntabhai, Turbpaiboon et al. 2005), foi associado com reduzida expressão de DC-SIGN e, possivelmente, reduzida susceptibilidade de células dendriticas a infecção pelo vírus da dengue. Portanto, a procura por alteração na expressão gênica entre diferentes quadros clínicos de dengue usando microarranjos de DNA pode elucidar em alta escala os fatores genéticos e mecanismos imunopatológicos relacionados com gravidade da dengue.

Usando essa tecnologia, o perfil de expressão gênica foi caracterizado em pessoas que desenvolveram FHD em duas diferentes coortes: Simmons at al. (2007) mostraram uma assinatura molecular em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) representando as fases aguda e convalescente de pacientes que desenvolveram a síndrome de choque de dengue (SCD). Neste trabalho eles relataram que transcritos gênicos para 24 genes estimulados por interferon estavam menos abundante em adultos (6 pacientes) com SCD do que e 8 pacientes com pacientes FHD que não desenvolveram choque, enquanto aqueles genes envolvidos em apoptose estavam expressos em maior quantidade Recentemente Ubol et al (2008) numa coorte de crianças Tailandesas também observaram redução na expressão de genes da imunidade inata e aumento da expressão de genes envolvidos em apoptose com gravidade da infecção pelo vírus da dengue (Ubol, Masrinoul et al. 2008).

Durante a fase aguda da infecção, pacientes afetados com a forma benigna (FD) e maligna (FHD) da doença desenvolvem o mesmo quadro clínico. No entanto, durante o período de defervescência (4 a 7 dias do início dos sintomas) é acompanhado pelos distúrbios circulatórios, cuja magnitude é diretamente proporcional a gravidade da doença (WHO 1999). Com isso, os eventos que precedem a defervescência são determinantes para resposta clínica do paciente.

A presente invenção fornece o uso da expressão diferencial de um grupo de genes como ferramenta prognostica para predizer resposta clínica de pacientes infectados com dengue baseado nos dados de expressão gênica obtida, antes de começarem os sintomas circulatórios, usando microarranjos de oligonucleotidios. Amostras de sangue heparinizado (também pode ser utilizado citrato de sódio ou EDTA como anticoagulante) coletados de pacientes (Tabela 1), cuja infecção pelo vírus da dengue foi confirmada por sorologia para IgM assim como isolamento viral ou detecção de RNA viral através de RT-PCR; foram usados. Isolamento de PBMC usando gradiente de densidade pode ser usado para minimizar o "ruído" causado pelos granulócitos. Consequentemente, moderada a pequena mudanças na expressão gênica entre as diferentes manifestações clínicas de dengue pode ser prontamente detectada. Uma vez obtidas as amostras contendo as células, o RNA mensageiro ou total pode ser extraído e amplificado para avaliação da expressão gênica. 0 RNA amplificado é então marcado para que este possa ser hibridizado num microarranjo de DNA, que por sua vez, é escaneado e os dados obtidos são processados para a obtenção dos dados de perfil de expressão gênica.

A qualidade dos dados do microarranjo de DNA é avaliada usando vários critérios: inspeção visual,

medida da relação ruido/eficiência, genes controles embutidos (spiked in) de amplificação (dap, thr, phe, lys) e hibridização (bioB, bioC, bioD, cre), expressão de genes constitutivos (GAPDH - gliceraldeido- 3-fosfatase desidrogenase humano- e beta actina), e gráficos de degradação de RNA.

Inspeção visual baseada em arquivos de alta definição DAT não deve revelar sinais de arranhões ou manchas e as sondas oligos B2 devem ser visíveis (perfil de tabuleiro de xadrez bem como o nome do arranjo).

Medida da relação ruído/eficiência é feita pelo programa MAS 5.0. Fator Q de ruído, background, fator de escalonamento e percentagem de sondas presentes devem ser similar entre os microarranj os.

A seleção dos genes preditores de resposta clínica de pacientes infectados com vírus da dengue, bem como aqueles característicos de infecção pelo vírus da dengue independente da manifestação clínica [comparação entre casos de dengue (FD + FHD) e grupo não dengue ou ND, cuja etiologia da doença febril foi desconhecida mas que foi descartada a possibilidade de ser pelo vírus da dengue], foi baseado em 26 microarranjos de oligonucleotidios distribuídos como se segue: 7 oriundos de pacientes com FD, 10 de pacientes FHD e 8 de pacientes ND. Esses microarranjos foram analisados através do programa Affymetrix MAS 5.0 (Hubbell, Liu et al. 2002) para normatizar os dados e produzir sinal e detectar as sondas presentes dentre os 54.675 transcritos gênicos em cada microarranjo. Desses, 12.299 transcritos foram considerados presentes (p<0.04) em todas os microarranjos, enquanto 20.365 transcritos foram considerados ausentes em qualquer dos microarranjos. Para manter apenas os genes mais promissores para futuras análises, foram empregados dois filtros inespecificos: (i) filtro de detecção para eliminar genes não expressos, o que manteve apenas os genes considerados presentes em pelo menos 24 dos 26 microarranjos, resultando num total de 15.848 genes. Desta forma, foram tolerados 3.549 genes (15.848 - 12.299 = 3.549) que foram considerados ausentes em um ou dois microarranjos; (ii) filtro de variância para eliminar genes de expressão constitutiva, o que manteve os maiores 1/8 dos 15.848 genes previamente citados, resultando em 1981 genes com potencial prognóstico (Tabela 7). Esses genes foram confirmados como potenciais prognósticos quando foram realizados agrupamento hierárquico e escalonamento multidimensional em 2D e 3-D (Figure 3), revelando a formação de dois grandes grupos, um grupo contendo amostras ND e metade das amostras FD; e outro grupo contendo pacientes FHD, duas amostras ND e a outra metade dos pacientes FD. A medida de dissimilaridade usada foi 1 - r, onde r é correlação de Pearson dos valores transformados em log. Os microrranjos foram coloridos de acordo com a classe diagnostica. Nota-se que as amostras FHD constituem um grupo mais coeso do que o grupo ND, representado por pacientes com doenças febris de etiologia desconhecida. Enquanto as amostras FD podem ser divididas em dois grupos, um similar e outro diferente das amostras FHD, este último estando mais próximo das amostras ND. 0 pequeno valor de estresse (13.52% no Gráfico 2-D e 7.32% no Gráfico 3-D), particularmente no Gráfico 3-D significa que a estrutura que os dados representam é intrinsecamente de baixa dimensão, o que indica que um pequeno número de assinaturas gênicas pode representar o conteúdo discriminatório dos dados.

Em seguida foi realizado um teste estatístico entre as médias (Welch two-sample t-tests) para achar os genes que foram diferencialmente expressos entre os diferentes grupos analisados. Duas comparações foram consideradas: FD verso FHD e Dengue (FD+FHD) verso ND. Gráficos de vulcão na Figura 4 mostram que os valores ρ foram bem correlacionados com magnitude de diferença de expressão (fold change) em ambas as comparações. A lista de genes com maiores "fold-change" mostrados nos gráficos vulcão são mostrados nas Tabelas 2 e 3

Δ Figura 5 mostra o mapa de expressão para os 40 mais significativos (menores valores p) genes que discriminam os grupos FD de FHD de acordo com o critério do teste Welch t, assim como o agrupamento hierárquico e gráficos MDS para os mesmos 40 genes.

Entre os 200 mais significativos genes diferencialmente expressos entre FD e FHD de acordo com o Welch two-sample t- tests foi comparado com 200 genes com maiores "fold-change" da média de expressão dos níveis de RNAm, há 7 3 genes em comum (Tabela 6) , o que representa os melhores genes mais significativos e com maior diferença na magnitude de expressão (fold-change) entre FD e FHD.

Dentre os genes diferencialmente expressos entre FD e FHD, 19 fazem parte da categoria de resposta imune, incluindo HLA-ϋΡαβ genes, complement factor D, CX3CR, MyD88, TNFSFl7 (BCMA), TNFSF13 (APRIL). Sete genes foram incluídos no grupo de resposta a defesa, entre eles temos o gene de Resistência a mixovírus (Mx), 2', 5'-oligoadenilato sintetase (0AS1 and 0AS2) e fatores estimulados por IFN. Estes foram expressos em menor magnitude em pessoas que depois desenvolveram FHD. Este genes tem sido implicados em resposta imune inata, confirmando que esse braço da resposta imune pode ser crucial para a resposta clínica de pacientes infectados com o vírus da dengue. Alem disso, 6 genes (PDCD4, PACAP, Tumor protein D52, MAGEDl, pro- apoptotic caspase adaptor protein and TNF ligand super family) associados com apoptose estão expressos em maior quantidade em pacientes FHD. Além disso, CD53, uma tetraspanina produzida por monócitos e linfócitos B e previne essas células de sofrerem apoptose (Yunta and Lazo 2003) estava expressa em menor quantidade no grupo FHD, reforçando a premissa de que aumento de células que sofre apoptose está associado com desenvolvimento da forma mais severa da doença.

Comparando com o estudo conduzido por Simmons et al (2007) (Simmons, Popper et al. 2007), existe uma consistência nos genes propostos como sendo prognósticos para desenvolvimento de FHD. Neste estudo, alguns genes estimulados por IFN, cuja expressão estava reduzida em pacientes desenvolvendo SCD, tais como as MX, IFIT, and OAS, bem como níveis elevados de "pro-apoptotic caspase adaptor protein" e PDCD5 (programmed cell death 5) fazem parte da nossa lista de genes prognósticos.

Desta forma, com base nos 1981 genes identificados foram selecionados grupos de genes marcadores de FHD para serem utilizados em ensaios mais simples, tais como PCR quantitativa. Para isso, foi realizada uma seleção exaustiva com todas as possíveis combinações de genes isolados ou combinados em forma de dupla ou trio, através análise discriminante linear como método de classificação, implementado pela estimativa direta das médias das amostras e matrizes de covariância para cada classe diagnostica (Braga-Neto 2005); e precisão de classificação estimada pelo método de resubstituição potencializada (bolstead resubstitution, Braga-Neto 2004), que é ideal para seleção de grupo de genes numa situação com número menor de amostra (Sima, Attoor et al. 2005; Sima, Braga-Neto et al. 2005).

A Tabela 5 mostra os melhores genes na forma isolada (40) ou combinada [dupla (40) ou trio (100)], ranqueados pelo erro estimado. Há 37 únicos genes entre os melhores 40 pares, enquanto há 86 únicos genes em os melhores 100 trios. A lista de trios é dominada pelos genes PSMB9, MT2A e LOC400368. A média do erro estimado para os melhores classificadores contendo 1 gene (40) = 0.1639 ± 0.0286, 2 genes (40) = 0.0686 ± 0.0096, 3 genes (100) = 0.0395 ±0.0040, o que indica que a classificação usando pares de genes é mais precisa que 1 gene, enquanto a classificação utilizando 3 genes é mais precisa do que 2 genes (a margem de erro acima se refere a um intervalo de confidência de 95%). O método de seleção acima descrito com 2 ou 3 genes tem um potencial de "selecionar" genes que não são possíveis de serem encontrados usando métodos univariados, tais como t-test. Isto pode ser visto na lista com os melhores duplas de classificadores. Por exemplo, o gene HLA-F (cuja expressão é reduzida in FHD em relação a FD).

A Figura 6 mostra o gráfico contendo um dos genes classificadores baseado na dupla de genes PSMB9 e MT2A. A probabilidade de erro em futuros dados para este classificador é de 5.38%. Neste caso, reduzida expressão de ambos os genes é característica de FHD, enquanto aumento de expressão é característica de FD. Para confirmar a potencialidade desses genes como preditores de gravidade de dengue, selecionamos alguns (PSMB9, MT2A, HLA-F and C3aRl) para desenvolver ensaios de RT-PCR quantitativo com amostras FD e FHD. Os genes foram amplificados e detectados usando o ensaio de expressão gênica TaqMan® com iniciadores (primers) e sondas comercialmente disponíveis (Applied Biosystems). O RNA foi extraído com auxilio do kit RNeasy (Qiagen). O RNA total foi reversamente transcrito usando o sistema de síntese da primeira fita SuperScript III para PCR quantitativo usando iniciadores aleatórios (random primers) e a PCR quantitativa foi realizada no ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems). Beta actina foi usado como controle endógeno e todos os dados foram normalizados baseados neste gene constitutivo. As amostras usadas neste ensaio são descritas na Tabela 1 (amostras de pacientes ND, bem como os pacientes FHD 105 e 112 não foram usados). Os resultados de RT-PCR quantitativa foram comparáveis com aqueles obtidos nos ensaios de microarranjos (Figura 7). Além disso, usando um grupo de amostras independentes daquelas amostras usadas nos ensaios de microarranjos, os níveis de expressão dos genes citados acima também foram confirmados (Figura 7). Desta forma, os resultados do ensaio de PCR quantitativa confirmaram a expressão dos genes selecionados em amostras coletadas na primeira visita médica de um paciente infectado com vírus da dengue, podendo predizer se uma pessoa infectada pelo vírus da dengue pode desenvolver ou não FHD. Portanto, o objeto desta invenção representa um meio útil de guiar o manejo clínico de pacientes com dengue.

Métodos de escolha para estabelecer níveis de expressão gênica para predição de resposta clínica de pacientes com dengue incluem microarranjos de DNA, RT-PCR, northern blot, RT-PCR competitiva, RT-PCR em tempo real, diferential display RT-PCR. Enquanto é possível conduzir essas técnicas usando reações de PCR individuais, é melhor amplificar o DNA complementar (cDNA) e analisá-lo via PCR quantitativa e então normalizar os resultados usando a expressão de algum gene constitutivo. Em seguida, as análises poderão ser feitas usando quantificação tanto absoluta quanto relativa para que o perfil de expressão gênica possa ser determinado.

Níveis de proteínas codificadas pelos genes preditivos de gravidade da dengue, quantificados de qualquer fluido corpóreo (sangue, plasma, soro, exudados) podem ser usadas para prognóstico de gravidade da dengue. No entanto, amostras de plasma são preferidas. Para estes tipos de amostras, qualquer ensaio imunológico (ELISA, imunofluorescência, western blot, dot blot etc) pode ser empregado. Além do mais, níveis de proteínas podem ser indiretamente avaliados através da análise da freqüência de células (PBMC, por exemplo) expressando uma dada proteína em qualquer compartimento de células por citometria de fluxo.

O uso de qualquer dos métodos acima mencionados e outros relacionados constitui uma fonte para desenvolvimento de kits preditores de gravidade da dengue durante a fase aguda da infecção e antes que o extravasamento plasmático ocorra em pacientes FHD.

A invenção é ilustrada pelo seguintes exemplos a seguir os quais não devem ser considerados como limitantes do escopo de proteção.

EXEMPLOS

Os genes analisados de acordo com esta invenção são tipicamente relacionados a completa seqüência de ácidos nucléicos que codificam para produção de uma proteína ou peptídeo. No entanto, a identificação da seqüência completa não é necessária do ponto de vista analítico. Isto é, porções da seqüência ou ESTs podem ser selecionadas de acordo com os princípios bem conhecidos para as quais as sondas podem ser desenhadas para avaliar a expressão gênica para o correspondente gene.

Exemplo 1 - Desenho da coorte de dengue e estratégia para estudos de genômica funcional

Uma coorte de casos febris de casos suspeitos de infecção pelo vírus da dengue atendidos em 3 hospitais da cidade de Recife, Pernambuco, Brasil, foi estabelecido e descrito (Cordeiro, Schatzmayr et al. 2007; Cordeiro, Silva et al. 2007). Brevemente, apenas a completa explicação dos objetivos do estudo, a cada participante desta coorte (ou responsável) foi solicitado a assinatura do termo de consentimento e foi pedido uma doação seqüencial de sangue dentro de um período de 30 dias apos o inicio dos sintomas. Soro, plasma e PBMC foram separados e criopreservados. 0 diagnóstico de dengue foi realizado através de isolamento viral em células C6/36 (Igarashi 1978) e RT-PCR (Lanciotti, Calisher et al. 1992) nas amostras coletadas no dia da admissão (primeira amostra) assim como através de sorologia para identificação de IgM (Bio-Manguinhos, Fundação Oswaldo Cruz, Brasil ou PanBio, Pty., Ltd., Brisbane, Austrália) e IgG (PanBio, Pty., Ltd., Brisbane, Austrália) anti-dengue na primeira e subsequentes amostras. 0 tipo de infecção foi caracterizado baseado na cinética de produção de IgM/IgG e títulos de anticorpos em ensaio de inibição de hemaglutinação (HI) (Clarke and Casais 1958).

Os casos de dengue (confirmados por sorologia, RT-PCR ou isolamento viral) foram clinicamente classificados de acordo com o critério da Organização Mundial de Saúde em duas classes: febre de dengue (FD ou dengue clássica) e febre hemorrágica do dengue (FHD) (OPAS 1995). Os casos de FD foram caracterizados por febre (39°C to 40°C) durando até 7 dias acompanhado por pelo menos 2 dos sintomas, tais com odor de cabeça, dor retrorbital, mialgia, artralgia e rash. Os casos de FHD foram definidos com a mesma sintomatologia encontrada em FD, mas com evidência de hemorragia, trombocitopenia (plaquetas <1000.000/mm3) e extravasamento plasmático seguindo a defervescência.

Este estudo foi revisado e aprovado pelo comitê de ética do Ministério da Saúde Brasileiro CONEP : 4909; Processo n° 25000.119007/2002-03; CEP: 68/02. Além disso, o comitê de revisão institucional da Universidade Johns Hopkins (EUA) também revisou e aprovou este estudo como protocolo JHM-IRB-3: 03-08-27-01.

Os estudos de genômica funcional foram realizados com amostras de PBMC coletadas no momento da primeira visita médica. Amostras provenientes de 18 casos confirmados de dengue (RT-PCR, isolamento viral e/ou IgH positivos) , genótipo III, e 8 amostras controles provenientes de casos febris que foram negativos para dengue em todos os testes realizados em 3 ou mais amostras (aqui chamados de não dengue ou ND) foram usados nessa avaliação. As amostras foram divididas em três grupos: FD, FHD e ND. As amostras referentes a esses três grupos foram selecionadas para evitar diferença significante em relação a idade, gênero, histórico de infecção pelo virus da dengue e dias de sintomas. Nenhum dos pacientes apresentaram sintomas de FHD no momento que as amostras usadas nessa avaliação foram coletadas. No momento da coleta das amostras, os pacientes relataram que tiveram sintomas por menos de 8 dias (media de 5.3 dias). Entre os casos confirmados de dengue, 8 foram caracterizados como FD e 10 foram classificados como FHD (Tabela 1) . Em negrito na Tabela 1 estão indicadas as amostras usadas exclusivamente nos ensaios de qPCR. FD: febre do dengue; FHD: febre hemorrágica do dengue; ND: Non-Dengue; M: macho; F: fêmea; Pos: positivo; Neg: negativo; -: sem informação.

Exemplo 2 - Processamento das amostras para hibridização nos chips. gênicos

Amostras de sangue coletados dos pacientes cadastrados nesta avaliação foram coletadas em tubos vacutainers heparinizados (BD Vacutainer) e dentro 2 horas da coleta, as amostras PBMC foram separadas por gradiente de densidade usando Ficoll-Paque (Amersham Biosciences) e criopreservadas em 10% (v/v) de dimetil sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) em soro fetal bovino inativado (FBS; Hyclone). Quatro milhões de células foram descongelados e imediatamente lisadas com Trizol (Invitrogen) para extração de RNA total com clorofórmio e precipitação com álcool isopropilico de acordo com as instruções do fabricante [a expressão usando amostras frescas ou congeladas foram comparadas e se mostraram ser similares, razão pela qual células congeladas foram escolhidas para estudos de genômica funcional (dados não mostrados)].

O RNA total foi, então, purificado usando o kit RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante e quantificado por espectrofotometria a 260nm e 280nm (espectro ultravioleta). RNA total foi usado para a síntese de RNA complementar (cRNA) através do kit de marcação do alvo em dois ciclos (Affymetrix). Brevemente, RNA isolado de PBMC foi marcado com biotina e hibridizado a microarranjos de oligonucleotideos (Affymetrix) usando um método de síntese de cDNA em dois ciclos. No primeiro ciclo, a primeira fita de c DNA foi preparada usando um iniciador T7-(dT) e a transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen) a partir de 10-100ng de RNA celular. A síntese da segunda fita foi realizada usando DNA polimerase I de Escherichia coli e cDNA de dupla fita foi usado no ensaio de transcrição in vitro (IVT) para amplificação de cRNA usando o kit Megascript T7 (Ambion). O produto deste primeiro ciclo de reações foi usado para transcrição reversa de cDNA como descrito para o primeiro ciclo. Este cDNA foi usado para IVT para síntese de cRNA marcado com biotina, que foi fragmentado e enviado para o Microarray Core Facility na Universidade Johns Hopkins para hibridização do cRNA ao chip de DNA humano U133 Plus 2.0 (Affymetrix), marcação e escaneamento.

Exemplo 3 - Controle de qualidade dos microarranjos

A qualidade dos dados dos microarranjos foi avaliada usando os seguintes critérios: inspeção visual, medidas da relação ruído/eficiência, controles embutidos, expressão de genes constitutivos, e gráficos de degradação de RNA. Inspeção visual baseada em arquivos de alta resolução DAT não revelaram arranhões ou manchas, e as sondas B2-oligo (num formato de tabuleiro de xadrez e o nome do microarranjo) foram também visíveis. Medidas de ruído/eficiência foram feitas pelo programa Affymetrix MAS 5.0 que pode ser usado para avaliar a qualidade dos microarranjos (Figure 1). Fatores Q de ruído, background, fatores de escalonamento e percentagem de genes presentes foram similares em todas os microarranjos. Os valores médios de background foram abaixo de 100 para 20 dos 26 microarranjos; os fatores de escalonamento foram dentro da ordem de 3x para 25 dos 26 microarranjos; e a percentagem de genes presentes foi em torno de 40% ou mais para 25 dos 26 microarranjos. Nenhum dos 6 microarranjos que apresentaram alto background tiveram uma taxa de genes presentes significantemente abaixo de 40%. Todos as sondas 3' e as sondas da parte intermediária para todos os genes controles embutidos (dap, thr, phe, lys) estavam presentes em todos os microarranjos, assim como para o grupo de genes procarióticos usados para o controle da hibridização (bioB, bioC, bioD, cre) e genes constitutivos GAPDH (gliceraldeido-3-fosfatase desidrogenase humano) e beta-actina.Além do mais, o gráfico de degradação de RNA mostrando a intensidade média das sondas na mesma posição numérica em todos os grupos de sondas (para todos os genes) demonstra uma consistente tendência de aumento na intensidade de sinal a partir do final 5' para o final 3' , o que é esperado devido a decréscimo na eficiência na síntese de cDNA (Figura 2).

Exemplo 5 - Validação dos dados de Microarranjo de DNA através de PCR em tempo real quantitativo

Quatro genes diferencialmente expressos entre DF e FHD (MT2A, PSMB9, C3aRl e HLA-F) foram selecionados para quantificação por PCR em tempo real quantitativo (qPCR). Os genes foram amplificados e detectados usando ensaios de expressão gênica TaqMan® com iniciadores e sondas comercialmente disponíveis (Applied Biosystems). Extração de RNA foi realizada usando o kit RNease (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. RNA total foi reversamente transcrito a cDNA usando o sistema de síntese de primeira fita Superscript III (Invitrogen) para qPCR usando iniciadores aleatórios (radom primers) de acordo com a sugestão do fabricante. qPCR foi realizado no aparelho ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems). 0 gene para beta actina foi selecionado como um controle endógeno e todos os dados foram normalizados contra este. A reação foi realizada em triplicata e incluiu 2 μΐ de cDNA, iniciadores (20 μΜ cada) e 6.25 μΜ da sonda especifica ou comercialmente pré-desenhada mistura para ensaio de expressão gênica (Applied Biosystems), beta-actina humana (Applied Biosystems), mistura universal para PCR TaqMan (Applied Biosystems) e água adicionados para um volume final de 25 μl. Triplicatas de controles não templates (NTC) foram incluídos cada vez que qPCR foi realizada. Os ciclos de reações foram: após incubação de 2- min a 50°C e 10 minutos a 95°C, as amostras passaram por 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por Imin. A linha de base e o "threshold" utilizados para a determinação do "Cycle threshold" foram ajustados manualmente através do programa Sequence Detection Software, versão 1.4 (Applied Biosystems). A eficiência de amplificação (E) da molécula-alvo foi calculada a partir da fórmula (E= 10Λ (-1/Slope) - 1) onde "slope" é inclinação da reta gerada pelos Cts obtidos de curva padrão, dado automaticamente pelo programa. Para os cálculos de quantificação relativa, foi utilizado o método baseado nos valores de Delta Ct [ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System and AppliedBiosystems 7500 Real-Time PCR System - User Bulletin, Applied Biosystems] uma vez que os ensaios apresentam eficiência de amplificação de 100% ± 10% [Application Note 127AP05-02]. As amostras usadas nos ensaios de qPCR são descritas na Tabela 1 (amostras de pacientes ND e pacientes FHD número 105 e 112 não foram usados).

Exemplo 6 - Análise Estatística

Controle de qualidade dos dados dos pacientes, análise estatística e gráficos foram realizados usando o programa Affymetrix MAS 5.0 (Hubbell, Liu et al. 2002) e o pacote estatístico R de acesso aberto, versão 2.5.0 (Ihaka 1996) e biblioteca adicional, em particular a biblioteca BioConductor, versão 1.16 (Gentleman, Carey et al. 2004). Dendogramas e gráficos MDS foram produzidos com as funções R "hclust" e "isoMDS", respectivamente, enquanto os mapas de expressão (heatmaps) foram obtidos com as funções "hset.emap" e "heatmap". Os valores ρ correspondentes a two-tailed Welch's two-sample t test foram obtidos com a função "t-test". Análise de categoria funcional foi realizada com o programa EASE (Expression Analysis Systematic Explorer) no website DAVID Bioinformatic (http://david.abcc.ncifcrf.gov) (Dennis, Sherman et al. 2003). O método de classificação usou análise discriminante linear implementado pela direta estimativa da média das amostras e matrizes de covariância para cada classe diagnostica (Braga-Neto 2005). A precisão da classificação foi estimada pelo método de resubstituição potencializada (bolsted resubstitution, Braga-Neto 2004), que é adequado para seleção de grupo de genes quando o número de amostra é baixo (Sima, Attoor et al. 2005; Sima, Braga-Neto et al. 2005).

Exemplo 7 - Processamento dos dados de Microarranjos de DNA Programa Affymetrix MAS 5.0 foi usado para escalonar os dados e produzir sinal e "detection calls" para os 54.675 genes em cada dos 26 microarranjos. Destes, 12.2999 foram considerados presentes (p<0.04) em todas os microarranjos, enquanto 20.365 não estavam presentes em nenhum dos microarranjos. Para manter apenas os genes promissores para futuras análises, foram empregados dois filtros não específicos: (i) filtro de detecção para eliminar genes não expressos, o que manteve apenas os genes considerados presentes em pelo menos 24 dos 2 6 microarranjos, resultando num total de 15.848 genes. Desta forma, foram tolerados 3.549 genes (15.848 - 12.299 = 3.549) que foram considerados ausentes em um ou dois microarranjos; (ii) filtro de variância para eliminar genes de expressão constitutiva, o que manteve os maiores 1/8 dos 15.848 genes previamente citados, resultando em 1981 genes com potencial prognóstico (Tabela 7).

Exemplo 8 - Análise exploratória

A Figura 3A mostra o dendograma para o agrupamento hierárquico dos 26 microarranjos de acordo com a expressão dos 1981 genes selecionados no estágio de pré-processamento. Foram empregados "Average linkage" e correlação de Pearson dos valores de expressão transformados em log. Foi observado que as amostras caíram em dois grandes grupos: o da direita contendo amostras ND e metade das amostras FD; enquanto o grupo da esquerda contem todas as amostras FHD, duas amostras ND (incluindo o outlier ND_199) e a outra metade dos pacientes FD. Este fato está de acordo com a intuição de que ND e FHD são os grupos mais diferentes e amostras FD formando um grupo intermediário. Isto é confirmado pelos gráficos de escalonamento multidimensional (MDS) em 2-D e 3-D para os 1981 genes, mostrados na Figura 3B e C. A medida de dissimilaridade usada foi 1 - r, onde r é a correlação de Pearson dos valores transformados em log. Microarranjos foram coloridos de acordo com a classe diagnostica. Pode-se observar que as amostras FHD constituem um grupo mais coeso do que as amostras ND, como esperado já que o grupo ND foi obtido de indivíduos com doença febril de etiologia desconhecida, enquanto as amostras FD podem ser divididas em dois grupos, um similar e um outro diferente de FHD, sendo este último mais próximo do grupo ND (esses são os dois grupos marcados na Figura 5). 0 baixo valor de stress (13.52% no gráfico 2-D e 7.32% no caso 3-D), particularmente no gráfico 3-D, significa que a estrutura delineante dos dados é intrinsecamente de baixa dimensão, o que indica que o pequeno número de assinaturas gênicas é capaz de representar o conteúdo discriminatório no dados.

Exemplo 9 - Análise de expressão diferencial

Foram realizados os testes estatísticos das diferenças entre as médias (Welch two-sample t-tests) para encontrar genes diferencialmente expressos entre os diferentes grupos diagnósticos. Foram consideradas duas principais comparações: FD versus FHD e dengue (FD + FHD) versus ND. A primeira comparação corresponde as 18 amostras oriundas dos pacientes comprovadamente infectados com vírus da dengue e é a mais importante comparação para a presente invenção, pois esta discrimina entre a forma benigna (FD) e maligna (FHD) da doença. Importantes genes usados para caracterizar estas duas manifestações clínicas assim como aqueles específicos para infecção pelo vírus da dengue são mostrados nas Tabelas 2 e 3. Gráfico de vulcão na Figura 4 e a correspondente lista de genes (Tabelas 2 e 3) mostram que os valores ρ correlacionam bem com magnitude de diferença de expressão (fold-change) em ambas as situações analisadas.

A Figura 5 mostra o mapa de expressão (heatmap) para os melhores 40 genes que discriminam as amostras FD de FHD, de acordo com critério de Welch t-test, assim como o agrupamento hierárquico e gráficos MDS para os 40 melhores genes discriminatórios entre FD e FHD. Δ Tabela 4 mostra os resultados da análise da representação de categoria funcional da lista dos melhores 40 genes discriminatórios entre FD e FHD com o programa EASE como descrito no Exemplo 6. A análise indicou o enriquecimento de certas categorias de genes. Cinco categorias apresentaram scores significantes (p<0.05) após a correção de Benferroni para múltiplos testes, incluindo aqueles envolvidos na resposta imune e defesa, resposta a estímulos bióticos, ligação a cobre/cádmio e homeostase do ion cobre (Tabela 4).

Exemplo 10 - Identificação dos genes classificadores

Além da seleção univariada realizada por testes t, foi realizada a seleção exaustiva (todas as possíveis combinações) de genes isolados, bem como duplas e trios a partir dos 10981 genes, usando análise de discriminação linear e resubstituição potencializada. A Tabela 5 mostra os classificadores baseados em 1, 2 ou 3 genes, ranqueados pelo erro de classificação estimado. Há 37 únicos genes entre os melhores 40 pares, enquanto há 87 únicos genes entre os melhores 100 trios classificadores. A lista dos trios de genes é dominada pelos genes PSMB9, MT2A, e LOC400368. Na verdade, apenas um trio não contém qualquer desses três, este é SFRS5, PDCD4, MKNK2, cujo erro estimado é de 0.0383. As médias para o erro estimado dos melhores classificadores são: classificador com 1 gene (40) = 0.1639 ± 0.0286, classificador com 2 genes (40) = 0.0686 ± 0.0096, classificador com 3 genes (100) = 0.0395 ± 0.0040, o que indica que a classificação com pares de genes é mais acurado do que genes individuais, enquanto a classificação com tripla de genes é mais precisa do que com pares (a margem de erro acima se refere ao intervalo de confidência de 95%). A seleção com dois e três genes têm o potencial de recuperar genes que usando métodos univariados (tais como test-t) não é possível recuperar. Isto é possível se perceber na lista dos melhores classificadores com 2 genes, por exemplo, o gene HLA-F (que é menos expresso em FHD do que FD) . A Figura 6 mostra o gráfico para o classificador com 2 genes PSMB9 e MT2A. A probabilidade estimada de erro em futuros dados é de 5.38%. Neste caso, a menor expressão de ambos os genes é assinatura de FHD, enquanto maior expressão de ambos os genes é característico de FD.

Exemplo 11 - Validação dos dados de microrranjos usando PCR em tempo real quantitativo

Ensaios de PCR em tempo real quantitativo (qPCR) foram realizados para validar os resultados obtidos nos ensaios de microarranjos. Foram selecionados os seguintes genes: PSMB9, MT2A, HLA-F and C3aRl, cuja expressão foi predominante em amostras FD comparado às amostras FHD. qPCRs dos genes acima citados foram realizados usando oito amostras FD e oito FHD obtidas dos mesmos pacientes testados nos ensaios de microarranjos. De acordo com a Figura 7A, a quantificação por qPCR mostrou uma boa correlação com os dados dos microarranjos. Além disso, qPCR foi também realizado num grupo de amostra independentes das amostras utilizadas nos ensaios de microarranjos, coletadas dentro de 11 dias do inicio dos sintomas e antes do inicio dos sintomas de vasculopatia. Os resultados de qPCR também indicaram que os níveis de expressão dos genes selecionados foram mais reduzidos em FHD do que em FD, corroborando com os resultados obtidos com o modelo 2D mostrado na Figura 3. Com isso, cada um dos quatro genes foram expressos em menor quantidade em FHD e eles foram corretamente classificados nas amostras analisadas (Figura 7B). REFERÊNCIAS

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Yunta, M. and P. A. Lazo (2003). "Apoptosis protection and survival signal by the CD53 tetraspanin antigen." Oncogene 22(8): 1219-1224. Tabela 1. Pacientes selecionados para estudo de genômica functional. <table>table see original document page 40</column></row><table> Tctbela 2. Lista de genes mostrados no "gráfico vulcão" Dengue (FD+FHD) vs. ND de acordo com "fold change" e valor p.

<table>table see original document page 41</column></row><table> <table>table see original document page 42</column></row><table> <table>table see original document page 43</column></row><table> Tabela 3. Lista de genes mostrados no "gráfico vulcão" FD vs. FHD de acordo com "fold change" e valor p.

<table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table> Tabela 4. Análise EASE da abundância funcional da lista dos 40 mais significantes genes discriminatótios entre FD e FHD. Categorias funcionais estatisticamente significantes (p<0.05) snóq correção para ririiJiltirvIici^ade -f- ^ σ ή o

<table>table see original document page 47</column></row><table> Tabela 5. Classificadores baseados em genes individuais, duplas ou trios ranqueados pelo erro estimado.

<table>table see original document page 48</column></row><table> <table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table> Tabela 6. Lista dos 73 genes diferencialmente expressos entre casos de FD e FHD que foram comuns entre aqueles 200 mais significantes genes de acordo com o teste Welch's t-test e os 200 genes com maiores "fold-change" da média de expressão dos níveis de RNAm.

<table>table see original document page 52</column></row><table> <table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table> <table>table see original document page 55</column></row><table> Tabela 7. Lista dos 1981 genes após o processamento dos dados de microarranjo.

<table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table> <table>table see original document page 58</column></row><table> <table>table see original document page 59</column></row><table> <table>table see original document page 60</column></row><table> <table>table see original document page 61</column></row><table> <table>table see original document page 62</column></row><table> <table>table see original document page 63</column></row><table> <table>table see original document page 64</column></row><table> <table>table see original document page 65</column></row><table> <table>table see original document page 66</column></row><table> <table>table see original document page 67</column></row><table> <table>table see original document page 68</column></row><table> <table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 0</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table> <table>table see original document page 73</column></row><table> <table>table see original document page 74</column></row><table> <table>table see original document page 75</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table> <table>table see original document page 77</column></row><table> <table>table see original document page 78</column></row><table> <table>table see original document page 79</column></row><table> <table>table see original document page 80</column></row><table> <table>table see original document page 81</column></row><table> <table>table see original document page 82</column></row><table> <table>table see original document page 83</column></row><table> <table>table see original document page 84</column></row><table> <table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table> <table>table see original document page 87</column></row><table> <table>table see original document page 88</column></row><table> <table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table> <table>table see original document page 91</column></row><table> <table>table see original document page 92</column></row><table> <table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table> <table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table> <table>table see original document page 97</column></row><table> <table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>

Claims (50)

1. Método de predição da resposta clínica do paciente infectado pelo virus da dengue durante os primeiros dias após o início dos sintomas, caracterizado pela identificação da expressão diferencial de genes selecionados a partir de um grupo de 1981 genes listados na Tabela 7, ou polimorfismo alélico, bem como sua proteína codificada.

2. Método de diagnóstico de infecção pelo vírus da dengue, diferenciando de outras doenças febris, durante os primeiros dias após o início dos sintomas, caracterizado pela identificação da expressão diferencial de genes selecionados a partir de um grupo de 1981 genes listados na Tabela 7, ou polimorfismo alélico, bem como sua proteína codificada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da identificação compreender seqüências de ácidos nucléicos isolados, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou produto codificado de um gene isolado.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da identificação compreender seqüências de ácidos nucléicos isolados, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou produtos codificados de genes em dupla.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da identificação compreender seqüências de ácidos nucléicos isolados, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou proteínas codificadas de genes em trio.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da identificação compreender seqüências de ácidos nucléicos isolados, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou proteínas codificadas de genes em quarteto ou grupos maiores.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser conduzido em ácidos nucléicos extraídos de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC), bem como qualquer dos seus conteúdos celulares selecionados dentre células B, células T, Monócitos, Macrófagos, células NK e dendríticas.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caradterizado pelo fato de ser conduzido em qualquer compartimento celular, bem como qualquer líquido corporal, tal como sangue, plasma, soro, exudado e outros.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, catáòterizado pelo fato de utilizar a Análise de Discriminação Linear como regra de classificação, e a resubstituição potencializada (bolstered resubstitution) como estimador de erro, para seleção exaustiva de grupos de genes preditores da resposta clínica de pacientes infectados com vírus da dengue, usando-se um, dois ou três ou mais genes expressados diferencialmente.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do grupo de genes incluir os 73 genes listados na Tabela 6.

11. Método de acordo com a reivindicação. 1, caracterizado pelo fato do grupo de genes incluir os classificadores listados na Tabela 5. -12. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do grupo de genes incluir os genes listados na Tabela 2. -11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do valor ρ indicando modulação diferencial ser menor que 0,05.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de haver pelo menos uma diferença de 2 vezes na expressão dos genes modulados.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos sorotipos infecciosos do virus de dengue serem DENVl, DENV2, DENV3 ou DENV4, bem como infecções múltiplas com qualquer combinação deles.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender pacientes acometidos por infecção primária.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender pacientes acometidos por infecção secundária.

16. Marcadores de prognóstico caracterizado por conter células isoladas, seqüências de ácidos nucléicos, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou proteína codificada por eles, de um gene ou combinação de genes selecionados a partir da lista de 1981 transcritos.

17. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes individualmente.

18. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes em duplas.

19. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes em trios.

20. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes em quartetos ou mais.

21. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender o prognóstico de duas possíveis respostas clínicas do paciente: dengue clássica e dengue hemorrágica/Síndrome de Choque do Dengue.

22. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender o diagnóstico de infecção com dengue.

23. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer em uma matriz apropriada para identificar a expressão diferencial dos genes ou polimorfismo alélico, bem como a proteína codificada nela contida.

24. Marcadores de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato da dita matriz ser empregada em um microarranjo.

25. Marcadores de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato do dito microarranjo ser de cDNA.

26. Marcadores de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato do dito microarranjo ser de oligonucleotideo.

27. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer em uma reação de PCR quantitativa para identificar a expressão diferencial dos genes nela contidos.

28. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer em uma reação de RT-PCR para identificar a expressão diferencial dos genes nela contidos.

29. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer em uma reação de Northern blotting para identificar a expressão diferencial dos genes nela contidos.

30. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caraütéirizado por ocorrer em uma reação de PCR para identificar a expressão diferencial do polimorfismo alélico de genes nela contidos.

31. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, tíáracterizado por ocorrer no teste de ELISA para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes.

32. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer no teste de Western blotting para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes.

33. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer no teste de Dot blotting para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes.

34. Marcadores de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ocorrer no teste de citometria de fluxo para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes em qualquer compartimento celular.

35. Kit para determinar o prognóstico da resposta clínica do paciente infectado de dengue, caracterizado por materiais para detectar células isoladas, seqüências de ácidos nucléicos, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou proteína codificada por eles, de um gene ou combinação de genes serem selecionados a partir da lista de -1981 transcritos.

36. Kit para diagnóstico de dengue, caracterizado por materiais para detectar células isoladas, seqüência de ácidos nucléicos, seus complementos, partes, polimorfismo alélico ou proteína codificada por eles, de um gene ou combinação de genes serem selecionados a partir da lista de -1981 transcritos.

37. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes individualmente.

38. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes em duplas.

39. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes em trios.

40. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado pelo fato da combinação incluir todos os genes em quartetos ou mais.

41. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em uma matriz de microarranjo para identificar a expressão diferencial dos genes.

42. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em uma reação de PCR quantitativa para identificar a expressão diferencial dos genes.

43. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em uma reação de RT-PCR para identificar a expressão diferencial dos genes.

44. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em uma reação de Northern blotting para identificar a expressão diferencial dos genes.

45. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em uma reação de PCR para identificar a expressão diferencial do polimorfismo alélico dos genes.

46. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em teste de ELISA para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes.

47. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em teste de Western blotting para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes.

48. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em teste de Dot-blotting para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes.

49. Kit de acordo com as reivindicações 35 e 36, caracterizado por ocorrer em teste de citometria de fluxo para identificar a produção diferencial de proteína codificada pelos genes ou qualquer compartimento celular.

50. Método de tratar paciente infectado de dengue, caracterizado por identificar o paciente como de alto risco de desenvolver dengue hemorrágica/Síndrome de Choque do Dengue, baseado na expressão de um, dois, três, quatro ou mais dos 1981 genes, e prontamente realizar a manutenção do volume de líquido circulante.