BRPI0900896B1 - cepa de bcg pasteur auxotrófico recombinante - Google Patents

Abstract

CEPA DE BCG PASTEUR AUXOTRÓFICO RECOMBINANTE E SEU USO NO CONTROLE DE INFECÇÕES HUMANAS CAUSADAS POR PARASITAS. A presente invenção se refere a uma cepa vacinal de Mycobacterium bovis BCG recombinante expressando o antígeno Sm14 de Schistosoma mansoni (BCGr Pasteur (delta)LeuD/p(delta)K410-hsp60*-Sm14). A cepa vacinal da presente invenção é empregada para o controle de infecções causadas por parasitas, especialmente Schistosoma mansoni. A cepa vacinal é uma cepa auxotrófica para o aminoácido leucina derivada da subcepa BCG Pasteur complementada para leucina após transformação genética com a construção p(delta)K410-hsp60*-Sm14. A eficácia da cepa BCGr Pasteur (delta)LeuD/p(delta)K410-hsp60*-Sm14 para o controle da infecção com Schistosorna mansoni com base na expressão do antígeno Sm14 recombinante in vivo é demonstrada na presente invenção.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere a uma cepa vacinal de Mycobacterium bovis BCG recombinante expressando o antígeno Sm14 de Schistosoma mansoni. A cepa vacinal da presente invenção é empregada para o controle de infecções causadas por parasitas, especialmente Schistosoma mansoni. A cepa vacinal é uma cepa de BCG auxotrófica para leucina obtida a partir da subcepa BCG Pasteur.

Fundamentos da Invenção

[002] É estimado que pelo menos 200 milhões de pessoas estejam infectadas com uma das cinco espécies de Schistosoma que afetam o ser humano. Além disso, existem outros 600 milhões de pessoas com risco de ser infectadas por esse parasita.

[003] A quimioterapia com droga anti-helmíntica Praziquantel é o principal método de controle atualmente usado, todavia, a taxa de re-infecção é alta [Al-Sherbiny M, Osman A, Barakat R, El Morshedy H, Bergquist R & Olds R (2003). In vitro cellular and humoral responses to Schistosoma mansoni vaccine candidate antigens. Acta Trop. 88: 117-130; e, Capron A, Riveau GJ, Bartley PB & McManus DP (2002). Prospects for a schistosome vaccine. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2: 281-290].

[004] Dessa forma, o desenvolvimento de uma vacina efetiva usada em combinação com quimioterapia adequada poderia representar uma estratégia efetiva em longo prazo [Pearce EJ (2003) Progress towards a vaccine for schistosomiasis. Acta Trop. 86: 309-313; e, Bergquist (2002) Schistosomiasis: from risk assessment to control. Trends Parasitol. 18: 309314.].

[005] A Organização Mundial da Saúde (OMS) selecionou a proteína de 14 kDa do Schistosoma mansoni que se liga a ácido graxo (Sm14) e a proteína glutathione S-transferase de 28-kDA (Sh28-GST) do S. haematobium, como moléculas prioritárias para testes clínicos em humanos como vacinas candidatas contra a esquistossomose [Bergquist, Feb 2004, http://who.int/tdr/publication/tdrnews/news71/schisto.html; Bergquist R, Al- Sherbiny M, Barakat R & Olds R. (2002) Blueprint for schistosomiasis vaccine development. Acta Trop. 82: 183-192; e, Bergquist NR (1998) Schistosomiasis vaccine development: progress and prospects. Mem Inst Oswaldo Cruz. 93 Suppl 1: 95-101.]. A seleção do antígeno Sm14 baseou-se na observação de que a proteína recombinante Sm14, produzida em Escherichia coli, induziu imunidade protetora contra S. mansoni (35 a 60%) e contra Fasciola hepatica, como determinado pela redução na carga parasitária após desafio em modelos com roedores [Vilar, M. M.; Barrientos, F.; Almeida, M.; Garrat, R.; Tendler, M. An Experimental Bivalent Peptide Vaccine against schistosomiasis and Fascioliasis with r-Sm14 peptides. Vaccine, v. 22, p. 137-144, 2003; e, Tendler M, Brito CA, Vilar MM, Serra- Freire N, Diogo CM, Almeida MS, et al. (1996) A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual-purpose antihelminth vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A. 93: 269-273.] e com caprinos [Almeida MS, Torloni H, Lee-Ho P, Vilar MM, Thaumaturgo N, Simpson AJ & Tendler M (2003) Vaccination against Fasciola hepatica infection using a Schistosoma mansoni defined recombinant antigen, Sm14. Parasite Immunol. 25: 135-137]. Além disso, a imunogenicidade protetora da proteína Sm14 foi confirmada quando o gene codificador dessa proteína foi administrado no contexto de uma vacina de DNA [Nascimento E, Leão IC, Pereira V R, Gomes YM, Chikhlikar P, August T, et al (2002) Protective immunity of single and multi-antigen DNA vaccines against schistosomiasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 97 Suppl 1: 105-109.] ou vetorizado por uma bactéria viva atenuada recombinante como Salmonella entérica var. Typhimurium [Pacheco LG, Zucconi E, Mati VL, Garcia RM, Miyoshi A, Oliveira SC, et al (2005) Oral administration of a live Aro attenuated Salmonella vaccine strain expressing 14-kDa Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein induced partial protection against experimental schistosomiasis. Acta Trop. 95: 132142.] ou como o BCG recombinante (BCGr) obtido a partir da transformação da cepa BCG de Mycobacterium bovis (Bacilo de Calmette e Guerin) utilizada mundialmente como vacina contra a tuberculose [Varaldo PB, Leite LC, Dias WO, Miyaji EN, Torres FI, Gebara VC, et al (2004) Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the Sm14 antigen of Schistosoma mansoni protects mice from cercarial challenge. Infect Immun. 72: 33363343; e Varaldo, Leite, L.C.C., Dias, W.O., Miyaj, E. N., Armôa, G.R.G., Campos, A. S., Vilar, M. M.; McFadden, J., Almeida, M.S., Tendler, M and McIntosh, D. (2006). Mycobacterial codon optimization of the gene encoding the Sm14 antigen of Schistosoma mansoni in recombinant Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin enhances protein expression but not protection against cercarial challenge in mice. FEMS Medical Microbiology and Immunology, 48, 132-139.].

[006] Existem diversas vantagens associadas ao uso de BCGr como um sistema de apresentação de antígenos heterólogos [Ohara N & Yamada T (2001) Recombinant BCG vaccines. Vaccine. 19: 4089-4098.]. Nesse contexto, Varaldo et al (2004) relataram que a imunização com uma única dose de uma cepa BCGr que expressa a proteína Sm14 fusionada a β- lactamase de Mycobacterium fortuitum (BCGr/PL73-Sm14), conferiu proteção contra o desafio com cercárias de S. mansoni equivalente aquele obtido usando três doses de Sm14r (Varaldo et al., 2004) . O nível total de expressão de Sm14 obtido com essa construção foi relativamente baixo quando comparado com o nível registrado para outros antígenos que usaram o mesmo vetor de expressão ou vetores similares [Mederle I, Bourguin I, Ensergueix D, Badell E, Moniz-Peireira J, Gicquel B & Winter N (2002) Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70: 303-314.]. No entanto, deve ser entendido que não existe um consenso com relação ao nível mínimo de produção de antígeno requerido para uma cepa de BCGr induzir imunidade protetora, embora a expressão de antígeno em baixos níveis seja considerada um fator potencialmente limitante [Kanekiyo M, Matsuo K, Hamatake M, Hamano T, Ohsu T, Matsumoto S, et al (2005) Mycobacterial codon optimization enhances antigen expression and virus-specific immune responses in recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin expressing human immunodeficiency vírus type 1 Gag. J Virol. 79: 8716-8723; e, Kawahara M, Matsuo K, Nakasone T, Hiroi T, Kiyono H, Matsumoto S, et al (2002). Combined intrarectal/intradermal inoculation of recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) induces enhanced immune responses against the inserted HIV-1 V3 antigen. Vaccine. 21: 158-166].

[007] Para enfrentar esse problema foram desenvolvidas duas novas construções de BCGr capazes de expressar níveis mais elevados do antígeno alvo [Tese de Mestrado para Construção do M. bovis BCG recombinante rSm14 e avaliação da sua capacidade contra esquistossomose no modelo murino. A. P. C. Argondizzo em 2005, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil). Essas construções foram feitas com dois vetores plasmidiais, o pUS977 e o pAU5.

[008] O vetor pAU5 foi desenvolvido durante a preparação da Tese de Mestrado sobre Avaliação da estabilidade estrutural e funcional de vetores plasmidiais recombinantes bifuncionais(Escherichia coli - Mycobacterium) em Mycobacterium bovis BCG, J. P.S Santos em 2002, Fundação Oswaldo Cruz,Rio de Janeiro, orientada pelo Dr. Douglas Mclntosh, pesquisador visitante da FIOCRUZ e Prof. Walter Martim R. Oelemann, docente da Universidade Federal de Rio de Janeiro. O vetor pAU5 é urna variação do plasmídeo pUS973 [Medeiros, M., Dellagostin, O. A., Armoa, G. R. G., Degrave, Mendonça-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J. F. Mcfadden, J. G. M. B., and Mclntosh, D. (2002) Comparative evaluation of Mycobacteriun vaccae as a surrogate cloning host for use in the study of mycobacterial genetics. Microbiology 148,1999-2009]. Esse plasmídeo (pAU5) demonstrou estabilidade aumentada quando comparado ao pUS973 do qual é derivado devido a uma deleção de quatro pares de base imediatamente acima da região promotora em combinação com a perda do primeiro par de bases da sequência do promotor hsp60.

[009] A capacidade dessas construções de BCGr de conferir proteção em camundongos Swiss contra o desafio com cercárias de S. mansoni foi confirmada em dois experimentos independentes [Tese de Mestrado de A. P. C. Argondizzo em 2005]. Nesse estudo foi observado que o nível aumentado de expressão da Sm14 (aproximadamente 32 vezes maior do que aquele obtido com PL73-Sm14, no caso da construção de BCGr transformada com o vetor pAU5) não conduziu a um aumento no nível de proteção quando comparado aquele registrado com a construção BCGr/PL73-Sm14. Além disso, importante observar que as cepas de BCGr/pAU5-Sm14 e BCGr/PUS977-Sm14 também apresentaram diferenças em relação a cepa BCGr/PL73-Sm14 em termos da localização subcelular da proteína Sm14 recombinante. Especificamente, a proteína foi produzida dentro do citoplasma da bactéria no caso da cepa de BCGr/pAU5-Sm14 ao invés de uma proteína de fusão associada a membrana, como no caso do BCGr/PL73-Sm14.

[0010] De uma maneira geral, esses dados fundamentam a hipótese de que a Sm14 recombinante produzida no citoplasma do BCGr, com a expressão dirigida pelo promotor hsp60 modificado presente na construção pAU5-Sm14, tem potencial como um meio de profilaxia contra a esquistossomose (BCGr/pAU5-Sm14).

[0011] Todas as construções plasmidiais desenvolvidas até o momento foram construídas com base em uma molécula de DNA plasmidial, extracromossomial e circular, contendo um gene de resistência ao antibiótico aminoglicosídico canamicina. O gene da canamicina está presente nessas construções para proporcionar um mecanismo de seleção positiva de bactérias transformadas (transformantes) após introdução do plasmídeo no BCG. Uma segunda função desse gene é assegurar a manutenção do plasmídeo durante o crescimento da bactéria nas culturas líquidas contendo canamicina, usadas para a produção de vacinas experimentais.

[0012] Entretanto, a presença do gene codificador de resistência a antibiótico não proporciona seleção para a manutenção do plasmídeo in vivo. Além disso, o uso de um BCG recombinante veiculando um plasmídeo contendo uma sequência codificadora de resistência a antibiótico em vacinação humana desperta preocupações com relação à segurança [Burlein JE, Stover CK, Offcut S & Hanson, M. S. (1994) Expression of foreign genes in mycobacteria. Washington DC: ASM Press.].

[0013] Evidentemente, seria desejável o desenvolvimento de vetores plasmidiais mais estáveis para expressão de antígenos heterólogos em BCG que não carregassem marcadores de resistência a antibióticos.

Sumário da Invenção

[0014] A presente invenção se refere a uma cepa vacinal recombinante de Mycobacterium bovis BCG expressando o antígeno Sm14 de Schistosoma mansoni. A cepa vacinal da presente invenção é empregada para controle de infecções causadas por parasitas, especialmente Schistosoma mansoni. A cepa vacinal é uma cepa auxotrófica complementada para leucina derivada por modificação genética da subcepa BCG Pasteur.

Breve Descrição das Figuras

[0015] A Figura 1 é uma representação esquemática do desenvolvimento do vetor de complementação pUP410.

[0016] A Figura 2 mostra o resultado da PCR para a amplificação do cassete de expressão hsp60*-Sm14 usando a construção pAU5-Sm14 como DNA molde.

Descrição Detalhada da Invenção

[0017] A presente invenção se refere ao uso da cepa BCG Δleu D e do vetor de complementação pUP410 para a obtenção de uma cepa vacinal para controle de infecções com Schistosoma mansoni e parasitas relacionados, com base na expressão do antígeno Sm14 de S. mansoni in vivo.

[0018] O objetivo principal da presente invenção é possível através da construção de um sistema de expressão do antígeno Sm14 em BCG empregando complementação auxotrófica como marcador de seleção. O sistema de expressão usado na presente invenção foi desenvolvido pelos grupos do Dr. Johnjoe Mcfadden, School of Biological Sciences, University of Surrey, UK e Dr Odir Dellagostin, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Brasil, para o projeto Development of recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant parasitic and epizootic disease of runinants in Latin America.

[0019] Os componentes e características desse sistema de expressão ern BCG empregando complementação auxotrófica são uma cepa de BCG Pasteur que é auxotrófica para o amino ácido leucina (BCG Δ leu D) e uma família de vetores plasmidiais que codificam o produto da sequência LeuD que, como tal, são capazes de complementar a auxotrofia do BCG para leucina. A cepa de BCG auxotrófica que é incapaz de crescer em meios de cultura sem leucina, foi obtida pela substituição de gene LeuD presente no genoma do BCG Pasteur, empregando os métodos descritos por Parish, T. & Stoker, N. G. (2000). [Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 146: 1969-1975]. Os vetores de complementação são derivados do vetor pUS77 [Medeiros, M., Dellagostin, O. A., Armoa, G. R. G., Degrave, W. M., Mendonça-Lima, L., Lopes, M.Q. , Costa, J. F., Mcfadden, J.G. M.B., and Mclntosh, D. (2002) Comparative evaluation of Mycobacterium vaccae as a surrogate cloning host for use in the study of mycobacterial genetics. Microbiology 148, 1999-2009.] e contém o gene LeuD que atua como complementador da deficiência nutricional (auxotrofia) e como marcador de seleção, com a expressão sob controle do promotor pAN. Adicionalmente, esses vetores possuem sítios únicos para endonucleases de restrição que permitem clonagem de cassetes de expressão de antígenos no vetor e possuem ainda um gene de resistência à canamicina, necessário para a seleção em E. coli, que pode ser subsequentemente removido por digestão da enzima de restrição e posterior religação antes da transformação do BCG. A ausência de leucina tanto in vitro (meio de crescimento Middlebrook 7H9 broth ou 7 H10 agar) como in vivo proporciona pressão seletiva constante que força o BCGr a manter o plasmídeo de complementação. Detalhes dos métodos usados para produzir a cepa BCG Δ leu D e uma série de vetores de complementação foram descritos por Borsuk, S., et al. em Auxotrophic complementation as a selectable marker for stable expression of foreign antigens in Mycobacterium bovis BCG, Tuberculosis, Vol. 87, Revista 6, pp 474-480, publicado online em 24 de setembro de 2007. As etapas envolvidas no desenvolvimento do vetor de complementação pUP410 que é derivado da família dos vetores de complementação estão representadas na Figura 1.

[0020] De acordo com o representado na Figura 1, as etapas para a obtenção do vetor pUP410 são: obtenção da sequência que codifica o gene leuD por PCR usando os iniciadores leuDI (5' -AAT CTA GAA CAG CTA GGG GAT C3'), e leuDII (5'TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A-3' ) e DNA de Mycobacterium bovis BCG P 3 (Isogen) como molde; digestão do fragmento amplificado (617 bp) com as enzimas XbaI e PstI; e, subsequente clonagem no plasmídeo pUS977 (Medeiros et al. 2002) originando o vetor denominado pUP400.

[0021] O gene hyg R (1, 575 bp) foi obtido a partir do vetor PGOAL19 por digestão com a enzima KpnI [Parish, T. & Stoker, N. G. (2000). Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 14: 1969-1975] e ligado ao vetor pU400 digerido com a mesma enzima. Esse procedimento resultou no vetor pU401. Para remoção do gene de resistência à canamicina por digestão com HindIII seguido de religação, foi sintetizado um adaptador contendo o sítio HindIII e extremidade compatível com a enzima PacI. Um micrograma das sequências Adap F (5 'GAT ATC RAG CTT AAG ACG CGT TAA3') e Adap R (5' TAA CGC GTC T TA AGC T TG ATA TCT A 3') foram hibridizadas por 1 min a 100°C e posteriormente incubadas por 3 h a temperatura ambiente. A seguir, 500 nanogramas (ng) dos oligonucleotídeos foram usados numa reação de ligação com 200 ng do vetor pU401 digerido com PacI. O produto de ligação foi aquecido a 70°C por 10 min, submetido imediatamente à eletroforese em gel de agarose 1% e excisado e eluído do gel. Foi feita uma adição de tampão de hibridização (10 mM Tris-HCI, pH 8, 5; 100 mM NaC1; 1 mM EDTA) ao DNA eluído e aquecido a 80°C por 5 minutos. Posteriormente, o DNA foi deixado resfriar a temperatura ambiente por 3 h e cinco microlitros foram utilizados para transformar a cepa de E. coli TOP10. Os clones recombinantes de E. coli foram identificados por digestão com HindIII e por sequenciamento de DNA. A construção resultante foi denominada de pU402. Finalmente, o gene hyg R foi removido por digestão com a enzima KpnI resultando na criação do vetor pUP410.

[0022] A invenção será agora descrita com referência a exemplos, os quais não devem ser considerados como limitativos da presente invenção. A. Construção de BCGr Pasteur auxotrófico complementado para leucina (BCGr Pasteur ΔleuD/pΔKan-hsp60*-Sm14)

[0023] Os iniciadores PSm14F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC) e PSm14R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT 5 TAT A) foram desenhados para permitir a amplificação por PCR do promotor hsp60* modificado e o cassete de expressão de Sm14 usando o vetor pAU5-Sm14 como molde. O amplicon resultante de 816 bp obtido pela PCR (Figura 2) foi digerido com a enzima NarI e em seguida clonado no vetor pU410 digerido com a mesma enzima. A análise da sequência de DNA confirmou que o cassete de expressão foi inserido na localização desejada. Na Figura 2 a Linha 1 = Marcador ΦX174RF/HaeIII e a Linha 2 = amplicon hsp60*-Sm14.

[0024] A capacidade da construção pUP410-hsp60*-Sm14 de expressar o antígeno Sm14 foi avaliada em hospedeiro alternativo de clonagem (Mycobacterium vaccae). Assim, cinco transformantes individuais selecionados em placas contendo canamicina foram usados para produzir culturas líquidas que foram processadas para análise de expressão por immunoblotting conforme descrito por Medeiros et al (2002). A expressão do antígeno foi detectada usando um anti-soro policlonal de camundongo anti- Sm14 com IgG anti-camundongo conjugada à fosfatase alcalina como anticorpo secundário. Foi verificado que todas as cinco colônias expressaram a proteína Sm14 em níveis equivalentes aqueles vistos em M. vaccae transformado com pAU5-Sm14 (controle positivo de expressão).

[0025] A seguir, o gene de resistência a canamicina foi removido do pUP410-hsp60*-Sm14 por digestão com endonuclease de restrição HindIII, e o vetor foi re-circularizado usando T4 ligase dando origem à construção pΔK410-hsp60*-Sm14 que foi utilizada para transformar a cepa auxotrófica de BCG Pasteur (BCG ΔleuD). Os transformantes obtidos foram selecionados em placas de Agar Middlebrook 7H10 (sem leucina) e foram testados quanto a capacidade de crescer na presença de canamicina. Em seguida, a estabilidade in vitro em termos da capacidade de expressar a proteína Sm14 de três transformantes individuais sensíveis à canamicina, foi avaliada após 60 gerações em Caldo Middlebrook 7 H 9 (sem leucina) , e após 10 dias no interior de monócitos murinos e humanos infectados, usando métodos previamente descritos [Varaldo et al (2002 )].

[0026] Para isso, monócitos murinos ou humanos foram infectados com dois clones de BCG estáveis in vitro transformados com a construção pΔK410-hsp60*-Sm14. Os macrófagos (5 x 105por poço) foram previamente cultivados em placas de 24 poços, utilizando como meio de cultura o RPMI 1640 suplementado com HEPES 10 mM; L-glutamina 2 mM; e 1 % de soro fetal bovino. Posteriormente as monocamadas de células foram expostas a níveis equivalentes de cada BCG recombinante para obter uma multiplicidade de infecção (MOI: "multiplicity of infection") de aproximadamente 10 células bacterianas por macrófago.

[0027] Os inóculos micobacterianos foram preparados por diluição de culturas em fase logarítmica até a concentração desejada, baseado na contagem direta por microscopia ótica. Amostras (seis poços por cultura) foram coletadas 4 h, 24 h, 5 dias e 10 dias após exposição dos macrófagos ao BCG recombinante. A coleta após lise das monocamadas com 0,1% de Tween 80 em água destilada (200 μL por poço) era seguida por diluições seriadas do lisado, e subsequente inoculação de placas de ágar 7H10 ou no mesmo meio suplementado com canamicina.

[0028] Os níveis de crescimento micobacteriano, verificados a partir da análise das amostras coletadas após 4h de exposição, foram utilizados para calcular a capacidade infectante relativa. Os valores obtidos a partir da contagem de unidades formadoras de colônias de outros pontos foram utilizados para calcular o grau de persistência intracelular. A estabilidade funcional (expressão do antígeno Sm14) foi analisada por immunoblotting conforme protocolo descrito anteriormente (Medeiros 2002).

[0029] Em todos os casos, foi verificado que os transformantes expressam a proteína Sm14 em níveis equivalentes àqueles vistos em M. bovis BCG transformado com pAU5-Sm14 (controle positivo de expressão). A estabilidade do sistema de expressão, portanto, foi confirmada tanto em meio acelular como em cultura de células murinas e humanas. B. O BCGr Pasteur pΔLeuD/ΔK410-hsp60*-Sm14 em proteger camundongos contra desafio com cercárias de S. MANSONI.

[0030] A capacidade do BCGr Pasteur pΔLeuD/ΔK410-hsp60*-Sm14 em proteger camundongos contra cercárias vivas de S. mansoni foi avaliada em dois experimentos separados. Cada experimento empregou 6 grupos experimentais (Tabela 1), cada grupo contendo 10 fêmeas de camundongos Swiss com idade de 4 semanas. A eficácia da vacinação com uma única dose administrada de forma intranasal (1 x 10 6 = cfu dose padrão; ou 1 x 102 cfu=dose baixa) de BCGr ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 foi comparada aquela alcançada pela administração de doses únicas similares de BCGr/pAU5-Sm14 ou 3 doses da proteína Sm14r (10μg em hidróxido de alumínio) na pata conforme descrito previamente por Varaldo et al., (2004). A dose final de proteína recombinante foi administrada no mesmo dia como as doses únicas da vacina baseadas no BCGr. Para ensaios de proteção, os camundongos foram desafiados subcutaneamente (sc) com 100 cercárias de S. mansoni em 30 dias (experimento 1) ou em 60 dias (experimento 2) após as imunizações iniciais e perfundido 45 dias após o desafio. As cargas parasitárias e níveis de proteção em diferentes grupos de desafio foram calculadas conforme descrito previamente em Tendler et al., 1996. A importância estatística foi avaliada pelo teste T de Student. Tabela 1 - Protocolo de imunização utilizado para examinar a capacidade do BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 de conferir proteção contra desafio com cercárias de S. mansoni.

a= dose padrão, b = dose baixa, c = hidróxido de alumínio, como relatado anteriormente (Varaldo et al. 2004).

[0031] Os resultados dos desafios estão representados na Tabela 2. Pode ser observado que todos os grupos vacinados mostraram uma diminuição significativa na carga parasitária em relação aos animais controle (grupo salina). Esse efeito foi aparente em ambos após o trigésimo (30°) e sexagésimo (60°) dia após a vacinação. Em geral, esses dados demonstram claramente que o BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 é capaz de induzir uma resposta imune protetora em 30 dias e que essa resposta ainda é efetiva 60 dias após a imunização. Além disso, a nova cepa vacinal foi tão protetora quanto a cepa BCGr/pAU5-Sm14 conforme descrito acima no estado da arte. Finalmente, o nível de proteção alcançado através de uma única dose administrada pela via intranasal (tanto 1 x 106 UFC = dose padrão; como 1 x 10 2 UFC = dose baixa) do BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*- Sm14 foi capaz de proporcionar um nível de proteção equivalente aquele obtido como 3 doses da proteína Sm14 recombinante formulada com hidróxido de alumínio como adjuvante. Tabela 2 Avaliação da proteção medida em termos de redução da carga parasitária em comparação com controles de PBS (salina) em camundongos Swiss desafiados aos 30 e 60 dias após a vacinação.

A = dose padrão, b = dose baixa, c = como anteriormente relatado (Varaldo et al., 2004).

[0032] A partir do descrito e exemplificado acima, o depositante confirma a eficácia da cepa BCG Pasteur Δ leu D e do vetor de complementação pΔK410-hsp60*-Sm14 na obtenção da cepa vacinal para controle de infecções com Schistosoma mansoni e parasitas relacionados com base na expressão do antígeno Sm14 nativo.

[0033] A invenção aqui descrita e os aspectos abordados devem ser considerados como possíveis concretizações. Deve, entretanto, ficar claro que a invenção não está limitada a essas concretizações e, aqueles com habilidade na técnica irão perceber que qualquer característica particular nela introduzida, deve ser entendida apenas como algo que foi descrito para facilitar a compreensão da invenção.

Claims (4)

1. Cepa de BCG Pasteur vacinal auxotrófico recombinante complementado para o amino ácido leucina expressando a proteína Sm14 de Schistossoma mansoni, i.e., BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14, caracterizado por ser obtida de acordo com as seguintes etapas: (a) amplificação por PCR de um fragmento contendo um cassete de expressão da Sm14 contendo um promotor hsp60* modificado, utilizando um vetor pAU5-Sm14 como molde, dito vetor tendo uma sequência hsp60 modificada que tem uma deleção de 4 pares de bases imediatamente a montante da região promotora em combinação com a perda do primeiro par de bases da sequência de promotor hsp60 e é designado como hsp60*;e iniciadores PSm14F, i.e., TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC, SEQ ID NO: 3 e PSm14R, i.e., CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A, SEQ ID NO: 4; (b) digestão com uma enzima Nar1 de um amplicon de 816 pb (hsp60*- Sm14) obtido pela etapa de amplificação por PCR da etapa (a), provendo um amplicon hsp60*-Sm14; (c) clonagem do amplicon hsp60*-Sm14 obtido na etapa (b) em um vetor pUP410 digerido com a enzima Narl, gerando a construção pUP410- hsp60*-Sm14; (d) avaliação da capacidade da construção pUP410- hsp60*- Sm14 de expressar a proteína Sm14 em Mycobacterium vaccae; (e) remoção do gene codificante de resistência a canamicina da construção pUP410-hsp60*-Sm14 por digestão com uma endonuclease de restrição HindIII, e (f) re-circularização da construção pUP410-hsp60*-Sm14 digerida sem o gene codificador de resistência à canamicina usando T4 ligase para produzir a construção pΔK410-hsp60*-Sm14 digerida, que é usada para transformar a cepa auxotrófica de BCG Pasteur (BCG ΔleuD) , para produzir cepa de BCG Pasteur auxotrófico recombinante complementado para o amino ácido leucina expressando a proteína Sm14 de Schistossoma mansoni (BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14).

2. Cepa BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para controle de infecções humanas causadas por parasitas, preferivelmente Schistosoma mansoni.

3. Cepa BCGr Pasteur ΔLeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para o controle de infecções animais causadas por Fasciola hepatica.

4. Cepa BCGr Pasteur LeuD/pΔK410-hsp60*-Sm14 conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para o controle da infecção por Mycobacterium tuberculosis.

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