BRPI0900896A2 - cepa de bcg pasteur auxotrófico recombinante e seu uso no controle de infecções humanas causadas por parasitas - Google Patents
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Abstract
CEPA DE BCG PASTEUR AUXOTRóFICO RECOMBINANTE E SEU USO NO CONTROLE DE INFECçõES HUMANAS CAUSADAS POR PARASITAS. A presente invenção se refere a uma cepa vacinal de Mycobacterium bovis BCG recombinante expressando o antígeno Sm14 de Schistosoma mansoni (BCGr Pasteur <30>LeuD/p<30>K410-hsp60*-Sm14). A cepa vacinal da presente invenção é empregada para o controle de infecções causadas por parasitas, especialmente Schistosoma mansoni. A cepa vacinal é uma cepa auxotrófica para o aminoácido leucina derivada da subcepa BCG Pasteur complementada para leucina após transformação genética com a construção p<30>K410-hsp60*-Sm14.. A eficácia da cepa BCGr Pasteur <30>LeuD/p<30>K410-hsp60*-Sm14 para o controle da infecção com Schistosorna mansoni com base na expressão do antígeno Sm14 recombinante in vivo é demonstrada na presente invenção.
Description
CEPA DE BCG PASTEUR AUXOTRÓFICO RECOMBINANTE E SEU USO NOCONTROLE DE INFECÇÒES HUMANAS CAUSADAS POR PARASITAS
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a uma cepa vacinai deMycobacterium bovis BCG recombinante expressando o antigenoSml4 de Schístosoma mansoni. A cepa vacinai da presenteinvenção é empregada para o controle de infecções causadaspor parasitas, especialmente Schístosoma mansoni. A cepavacinai é uma cepa de BCG auxotrófica para leucina obtida apartir da subcepa BCG Pasteur.
Fundamentos da Invenção
É estimado que pelo menos 200 milhões de pessoasestejam infectadas com uma das cinco espécies deSchístosoma que afetam o ser humano. Além disso, existemoutros 600 milhões de pessoas com risco de ser infectadaspor esse parasita.
A quimioterapia com a droga anti-helminticaPraziquantel é o principal método de controle atualmenteusado, todavia, a taxa de re-infecção é alta [Al-SherbinyM, Osman A, Barakat R, El Morshedy H, Bergquist R & Olds R(2003). In vitro cellular and humoral responses toSchístosoma mansoni vaccine candidate antigens. Acta Trop.88: 117-130; e, Capron A, Riveau GJ, Bartley PB & McManusDP (2002). Prospects for a schistosome vaccine. Curr DrugTargets Immune Endocr Metabol Disord. 2: 281-290.].
Dessa forma, o desenvolvimento de uma vacina efetivausada em combinação com quimioterapia adequada poderiarepresentar uma estratégia efetiva em longo prazo [PearceEJ (2003) Progress towards a vaccine for schistosomiasis.Acta Trop. 86: 309-313; e, Bergquist NR (2002)Schistosomiasis: from risk assessment to control. TrendsParasitol. 18: 309-314.].
A Organização Mundial da Saúde (OMS) selecionou aproteína de 14 kDa do Schistosoma mansoni que se liga aácido graxo (Sml4) e a proteína glutathione S-transferasede 28-kDA (Sh28-GST) do " S. haematobium, como moléculasprioritárias para testes clínicos em humanos como vacinascandidatas contra a esquistossomose [Bergquist, Feb 2004,http://who.int/tdr/publication/tdrnews/news71/schisto.html;Bergquist R, Al-Sherbiny M, Barakat R & Olds R. (2002)Blueprint for schistosomiasis vaccine development. ActaTrop. 82: 183-192; e, Bergquist NR (1998) Schistosomiasisvaccine development: progress and prospects. Mem Inst15 Oswaldo Cruz. 93 Suppl 1: 95-101.]. A seleção do antígenoSml 4 baseou-se na observação de que a proteína recombinanteSml 4, produzida em Escherichia coli, induziu imunidadeprotetora contra S. mansoni (35 a 60%) e contra Fasciolahepática, como determinado pela redução na cargaparasitária após desafio em modelos com roedores [Vilar, M.M.; Barrientos, F.; Almeida, M.; Garrat, R.; Tendler, M. AnExperimental Bivalent Peptide Vaccine againstschistosomiasis and Fascioliasis with r-Sml4 peptides.Vaccine, v. 22, p. 137-144, 2003; e, Tendler M, Brito CA,Vilar MM, Serra-Freire N, Diogo CM, Almeida MS, et al(1996) A Sehistosoma mansoni fatty acid-binding protein,Sml 4, is the potential basis of a dual-purpose anti-helminth vaccine. Proe Natl Acad Sei USA. 93: 2 69-27 3.] ecom caprinos [Almeida MS, Torloni H, Lee-Ho P, Vilar MM,Thaumaturgo Ν, Simpson AJ & Tendler M (2003) Vaccinationagainst Fasciola hepatica infection using a Schistosomamansoni defined recombinant antigen, Sml4. ParasiteImmunol. 25: 135-137]. Além disso, a imunogenicidadeprotetora da proteína Sml4 foi confirmada qüando o genecodificador dessa proteína foi administrado no contexto deuma vacina de DNA [Nascimento E, Leão IC, Pereira VR, GomesYM, Chikhlikar P, August T r et al (2002) Protectiveimmunity of single and multi-antigen DNA vaccines againstschistosomiasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 97 Suppl 1: 105-109.] ou vetorizado por uma bactéria viva atenuadarecombinante como Salmonella entérica var. Typhimurium[Pacheco LG, Zucconi E, Mati VL, Garcia RM, Miyoshi A,Oliveira SC, et al (2005) Oral administration of a Iive Aroattenuated Salmonella vaccine strain expressing 14-kDaSchistosoma mansoni fatty acid-binding protein inducedpartial protection against experimental schistosomiasis.Acta Trop. 95: 132-142.] ou como o BCG recombinante (BCGr)obtido a partir da transformação da cepa BCG deMyeobaeterium bovis (Bacilo de Calmette e Guerin) utilizadamundialmente como vacina contra a tuberculose [Varaldo PB,Leite LC, Dias WO, Miyaji EN, Torres FI, Gebara VC, et al(2004) Recombinant Myeobaeterium bovis BCG expressing theSml4 antigen of Sehistosoma mansoni protects mice fromcercarial challenge. Infeet Immun. 72: 3336-3343; e,Varaldo, P.B., Leite, L.C.C., Dias, W.O., Miyaj, E.N.,Armôa, G. R.G., Campos, A. S., Vilar, M.M., McFadden, J.,Almeida, M.S., Tendler, M and Mclntosh, D. (2006).Mycobacterial codon optimization of the gene encoding theSml4 antigen of Schistosoma mansoni in recombinantMycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin enhancesprotéin expression but not protection against cercarialchallenge in mice. FEMS Medicai Microbiology andImmunologyf 48, 132-139.]
Existem diversas vantagens associadas ao uso de BCGrcomo um sistema de apresentação de antigenos heterólogos[Ohara N & Yamada T (2001) Recombinant BCG vaccines.Vaccine. 19: 4089-4098.]. Nesse contexto, Varaldo et al(2004) relataram que a imunização com uma única dose de umacepa BCGr que expressa a proteína Sml4 fusionada a β-lactamase de Mycobaeterium fortuitum (BCGr/PL73-Sml4),conferiu proteção contra o desafio com cercárias de S.mansoni equivalente aquele obtido usando três doses deSml4r (Varaldo et al., 2004). O nivel total de expressão deSml4 obtido com essa construção foi relativamente baixoquando comparado com o nivel registrado para outrosantigenos que usaram o mesmo vetor de expressão ou vetoressimilares [Mederle I, Bourguin I, Ensergueix D, Badell E,Moniz-Peireira J, Gicquel B & Winter N (2002) Plasmidicversus insertional cloning of heterologous genes inMyeobaeterium bovis BCG: impact on in vivo antigenpersistence and immune responses. Infeet Immun. 70: 303-314.]. No entanto, deve ser entendido que não existe umconsenso com relação ao nivel mínimo de produção deantígeno requerido para uma cepa de BCGr induzir imunidadeprotetora, embora a expressão de antígeno em baixos níveisseja considerada um fator potencialmente limitante[Kanekiyo M, Matsuo K, Hamatake M, Hamano T, Ohsu T,Matsumoto S, et al (2005) Mycobacterial codon optimizationenhances antigen expression and virus-specific immuneresponses in recombinant Mycobacterium bovis bacilleCalmette-Guerin expressing human immunodeficiency virustype 1 Gag. J Virol. 79: 8716-8723; e, Kawahara M, MatsuoK, Nakasone T, Hiroi T, Kiyono H, Matsumoto Sy- et al (2002)Combined intrarectal/intradermal inoculation of recombinantMycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) inducesenhanced immune responses against the inserted HIV-I V3antigen. Vaccine. 21: 158-166].
Para enfrentar esse problema foram desenvolvidos duasnovas construções de BCGr capazes de expressar níveis maiselevados do antigeno alvo [Tese de Mestrado para Construçãodo M. bovis BCG recombinante rSml4 e avaliação da suacapacidade contra esquistossomose no modelo murino.A.P.C. Argondizzo em 2005, Fundação Oswaldo Cruz, Rio deJaneiro, Brasil). Essas construções foram feitas com doisvetores plasmidiais, o pUS977 e o pAU5.
0 vetor pAU5 foi desenvolvido durante a preparação daTese de Mestrado sobre Avaliação da estabilidade estruturale funcional de vetores plasmidiais recombinantesbifuncionais (Escherichia coli - Mycobacterium) emMycobacterium bovis BCGr J.P.S Santos em 2002, FundaçãoOswaldo Cruz, Rio de Janeiro, orientada pelo Dr. DouglasMclntosh, pesquisador visitante da FIOCRUZ e Prof. WalterMartim R. Oelemann, docente da Universidade Federal de Riode Janeiro. 0 vetor pAU5 é uma variação do plasmideo pUS973[Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa, G.R.G., Degrave,W.M., Mendonça-Lima, L., Lopes, M.Q., Costa, J.F.,Mcfadden, J. G.M.B., and Mclntosh, D. (2002) Comparativeevaluation of Mycobacteriumvaccae as a surrogate cloninghost for use in the study of mycobacterial genetics.Microbiology 148, 1999-2009]. Esse plasmídeo (pAU5)demonstrou estabilidade aumentada quando comparado aopUS97 3 do qual é derivado devido a uma deleção de quatropares de base imediatamente acima da região promotora emcombinação com a perda do primeiro par de bases daseqüência do promotor hsp60.
A capacidade dessas construções de BCGr de conferirproteção em camundongos Swiss contra o desafio comcercárias de S. mansoni foi confirmada em dois experimentosindependentes [Tese de Mestrado de A.P.C. Argondizzo em2005]. Nesse estudo foi observado que o nivel aumentado deexpressão da Sml4 (aproximadamente 32 vezes maior do queaquele obtido com PL73-Sml4, no caso da construção de BCGrtransformada com o vetor pAU5) não conduziu a um aumento nonivel de proteção quando comparado aquele registrado com aconstrução BCGr/PL73-Sml4. Além disso, é importanteobservar que as cepas de BCGr/pAU5-Sml4 e BCGr/PUS977-Sml4também apresentaram diferenças em relação a cepa BCGr/PL73-Sml4 em termos da localização subcelular da proteína Sml4recombinante. Especificamente, a proteína foi produzidadentro do citoplasma da bactéria no caso da cepa deBCGr/pAU5-Sml4 ao invés de uma proteína de fusão associadaa membrana, como no caso do BCGr/PL73-Sml4.
De uma maneira geral, esses dados fundamentam ahipótese de que a Sml4 recombinante produzida no citoplasmado BCGr, com a expressão dirigida pelo promotor hsp60modificado presente na construção pAU5-Sml4, tem potencialcomo um meio de profilaxia contra a esquistossomose(BCGr/pAU5-Sml4).
Todas as construções plasmidiais desenvolvidas até omomento foram construídas com base em uma molécula de DNAplasmidial, extracromossomial e circular, contendo um genede resistência ao antibiótico aminoglicosídico canamicina.
0 gene da canamicina está presente nessas construções paraproporcionar um mecanismo de seleção positiva de bactériastransformadas (transformantes) após a introdução doplasmídeo no BCG. Uma segunda função desse gene é assegurara manutenção do plasmídeo durante o crescimento da bactérianas culturas líquidas contendo canamicina, usadas para aprodução de vacinas experimentais.
Entretanto, a presença do gene codificador deresistência a antibiótico não proporciona seleção para amanutenção do plasmídeo in vivo. Além disso, o uso de umBCG recombinante veiculando um plasmídeo contendo umaseqüência codificadora de resistência a antibiótico emvacinação humana desperta preocupações com relação àsegurança [Burlein JE, Stover CK, Offcut S & Hanson, M.S.
(1994) Expression of foreign genes in mycobacteria.Washington DC: ASM Press.].
Evidentemente, seria desejável o desenvolvimento devetores plasmidiais mais estáveis para expressão deantígenos heterólogos em BCG que não carregassem marcadoresde resistência a antibióticos.
Sumário da Invenção
A presente invenção se refere a uma cepa vacinairecombinante de Mycobacterium bovis BCG expressando oantigeno Sml4 de Schistosoma mansoni. A cepa vacinai dapresente invenção é empregada para controle de infecçõescausadas por parasitas, especialmente Schistosoma mansoni.
A cepa vacinai é uma cepa auxotrófica complementada paraleucina derivada por modificação genética da subcepa BCGPasteur.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 é uma representação esquemática dodesenvolvimento do vetor de complementação pUP410.
A Figura 2 mostra o resultado da PCR para aamplificação do cassete de expressão hsp60*-Sml4 usando aconstrução pAU5-Sml4 como DNA molde.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção se refere ao uso da cepa BCG AleuOe do vetor de complementação pUP410 para a obtenção de umacepa vacinai para controle de infecções com Schistosomamansoni e parasitas relacionados, com base na expressão doantigeno Sml4 de S. mansoni in vivo.
0 objetivo principal da presente invenção é possívelatravés da construção de um sistema de expressão doantigeno Sml4 em BCG empregando complementação auxotróficacomo marcador de seleção. O sistema de expressão usado napresente invenção foi desenvolvido pelos grupos do Dr.Johnjoe Mcfadden, School of Biological Sciences, Universityof Surrey, UK e Dr Odir Dellagostin, Centro deBiotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Brasil,para o projeto Development of recombinant BCG multivaccineand complementary diagnostics for predominant parasitic andepizootic disease of ruminante in Latin America.
Os componentes e características desse sistema deexpressão em BCG empregando complementação auxotrófica sãouma cepa de BCG Pasteur que é auxotrófica para o aminoácido leucina (BCG AleuO) e uma família de vetoresplasmidiais que codificam o produto da seqüência LeuD que,como tal, são capazes de complementar a auxotrofia do BCGpara leucina. A cepa de BCG auxotrófica que é incapaz decrescer em meios de cultura sem leucina, foi obtida pelasubstituição de gene LeuD presente no genoma do BCGPasteur, empregando os métodos descritos por Parish, T. &Stoker, N. G. (2000) . [Use of a flexible cassette method togenerate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyAplcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 146: 1969- 1975] . Os vetores de complementação são derivados dovetor pUS77 [Medeiros, M., Dellagostin, O.A., Armoa,G.R.G., Degrave, W.M., Mendonça-Lima, L., Lopes, M.Q.,Costa, J.F., Mcfadden, J. G.M.B., and Mclntosh, D. (2002)Comparative evaluation of Mycobacterium vaccae as asurrogate cloning host for use in the study ofmycobacterial genetics. Microbiology 148, 1999-2009.] econtém o gene LeuD que atua como complementador dadeficiência nutricional (auxotrofia) e como marcador deseleção, com a expressão sob controle do promotor ρ AN.
Adicionalmente, esses vetores possuem sítios únicos paraendonucleases de restrição que permitem clonagem decassetes de expressão de antígenos no vetor e possuem aindaum gene de resistência à canamicina, necessário para aseleção em E. coli, que pode ser subseqüentemente removidopor digestão da enzima de restrição e posterior religaçãoantes da transformação do BCG. A ausência de leucina tantoin vitro (meio de crescimento Middlebrook 7H9 broth ou 7H10agar) como in vivo proporciona pressão seletiva constanteque força o BCGr a manter o plasmideo de complementação.
Detalhes dos métodos usados para produzir a cepa BCG AleuDe uma série de vetores de complementação foram descritospor Borsuk, S., et al. em Auxotrophic complementation as aselectable marker for stable expression of foreign antigensin Mycobacterium bovis BCG, Tuberculosis, Vol. 87, Revista6, pp 474-480, publicado online em 24 de setembro de 2007.
As etapas envolvidas no desenvolvimento do vetor decomplementação pUP410 que é derivado da família dos vetoresde complementação estão representadas na Figura 1.
De acordo com o representado na Figura 1, as etapaspara a obtenção do vetor pUP410 são:
obtenção da seqüência que codifica o gene IeuD por PCRusando os iniciadores IeuDI ( 5'-AAT CTA GAA CAG CTA GGG GATC-3') , e IeuDII (5'TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A-3') e DNA deMycobacterium bovis BCG P3 (Isogen) como molde;
digestão do fragmento amplificado (617 bp) com asenzimas XbaI e PstI; e,
subseqüente clonagem no plasmideo pUS977 (Medeiros etal., 2002) originando o vetor denominado pUP400.
0 gene hyg R (1,575 bp) foi obtido a partir do vetorPGOAL19 por digestão com a enzima KpnI [Parish, T. &Stoker, N. G. (2000). Use of a flexible cassette method togenerate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyAplcABC mutant by gene replacement. Microbiology. 14 6: 1969- 1975] e ligado ao vetor pU400 digerido com a mesmaenzima. Esse procedimento resultou no vetor pU401. Pararemoção do gene de resistência à canamicina por digestãoçom HindIII seguido de religação, foi sintetizado umadaptador contendo o sitio HindIII e extremidade compatívelcom a enzima PacI. Um micrograma das seqüências Adap F(5'GAT ATC AAG CTT AAG ACG CGT TAA3' ) e Adap R (5'TAA CGCGTC TTA AGC TTG ATA TCT A 3') foram hibridizadas por 1 mina 100°C e posteriormente incubadas por 3 h a temperaturaambiente. A seguir, 500 nanogramas (ng) dosoligonucleotídeos foram usados numa reação de ligação com200 ng do vetor pU401 digerido com PacI. O produto deligação foi aquecido a 70 °C por 10 min, submetidoimediatamente à eletroforese em gel de agarose 1% eexcisado e eluido do gel. Foi feita uma adição de tampão dehibridização (10 mM Tris-HCl, pH 8,5;100 mM NaCl; 1 mMEDTA) ao DNA eluido e aquecido a 80°C por 5 minutos.Posteriormente, o DNA foi deixado resfriar a temperaturaambiente por 3 h. e cinco microlitros foram utilizados paratransformar a cepa de E. coli TOPlO. Os clonesrecombinantes de E. coli foram identificados por digestãocom HindIII e por seqüenciamento de DNA. A construçãoresultante foi denominada de pU402. Finalmente, o gene hygR foi removido por digestão com a enzima Kpnl resultando nacriação do vetor pUP410.
A invenção será agora descrita com referência aexemplos, os quais não devem ser considerados comolimitativos da presente invenção.A. Construção de BCGr Pasteur auxotrófico complementadopara leucina (BCGr Pasteur AleuD/pAKan-hsp60*-Sml4)
Os iniciadores PSml4F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCACAA CGA CGC GC) e PSml4R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTTTAT A) foram desenhados para permitir a amplificação porPCR do promotor hsp60* modificado e o cassete de expressãode Sml4 usando o vetor pAU5-Sml4 como molde. 0 ampliconresultante de 816 bp obtido pela PCR (Figura 2) foidigerido com a enzima Narl e em seguida clonado no vetorpU410 digerido com a mesma enzima. A análise da seqüênciade DNA confirmou que o cassete de expressão foi inserido nalocalização desejada. Na Figura 2 a Linha 1 = Marcador<j)X174RF/HaeIII e a Linha 2 = amplicon hsp60*-Sml4.
A capacidade da construção pUP410-hsp60*-Sml4 deexpressar o antigeno Sml4 foi avaliada em hospedeiroalternativo de clonagem (Mycobacterium vaccae). Assim,cinco transformantes individuais selecionados em placascontendo canamicina foram usados para produzir culturaslíquidas que foram processadas para análise de expressãopor immunoblotting conforme descrito por Medeiros et al(2002). A expressão do antigeno foi detectada usando umanti-soro policlonal de camundongo anti-Sml4 com IgG anti-camundongo conjugada à fosfatase alcalina como anticorposecundário. Foi verificado que todas as cinco colôniasexpressaram a proteína Sml4 em níveis equivalentes aquelesvistos em M. vaccae transformado com pAU5-Sml4 (controlepositivo de expressão).
A seguir, o gene de resistência a canamicina foiremovido do pUP410-hsp60*-Sml4 por digestão comendonuclease de restrição HindIIIr e o vetor foi re-circularizado usando T4 ligase dando origem à construçãoρΔΚ410-hsp60*-Sml4 que foi utilizada para transformar acepa auxotrófica de BCG Pasteur (BCG AleuD) . Ostransformantes obtidos foram selecionados em placas de AgarMiddlebrook 7H10 (sem leucina) e foram testados quanto acapacidade de crescer na presença de canamicina. Emseguida, a estabilidade in vitro em termos da capacidade deexpressar a proteina Sml4 de três transformantesindividuais sensíveis à canamicina, foi avaliada após 60gerações em Caldo Middlebrook 7H9 (sem leucina), e após 10dias no interior de monócitos murinos e humanos infectados,usando métodos previamente descritos [Varaldo et al(2002)].
Para isso monócitos murinos ou humanos foraminfectados com dois clones de BCG estáveis in vitrotransformados com a construção pAK410-hsp60*-Sml4. Osmacrófagos (5 χ 10° por poço) foram previamente cultivadosem placas de 24 poços, utilizando como meio de cultura oRPMI 1640 suplementado com HEPES 10 mM; L-glutamina 2 mM; e1 % de soro fetal bovino. Posteriormente as monocamadas decélulas foram expostas a níveis equivalentes de cada BCGrecombinante para obter uma multiplicidade de infecção(MOI: "multiplicity of infection") de aproximadamente 10células bacterianas por macrófago.
Os inóculos micobacterianos foram preparados pordiluição de culturas em fase logarítmica até a concentraçãodesejada, baseado na contagem direta por microscopia óticaAmostras (seis poços por cultura) foram coletadas 4 h, 24h, 5 dias e 10 dias após exposição dos macrófagos ao BCGrecombinante. A coleta após Iise das monocamadas com 0,1 %de Tween 80 em água destilada (200 por poço) era seguidapor diluições seriadas do lisado, e subseqüente inoculaçãode placas de ágar 7H10 ou no mesmo meio suplementado comcanamicina.
Os níveis de crescimento micobacteriano, verificados apartir da análise das amostras coletadas após 4h deexposição, foram utilizados para calcular a capacidadeinfectante relativa. Os valores obtidos a partir dacontagem de unidades formadoras de colônias de outrospontos foram utilizados para calcular o grau depersistência intracelular. A estabilidade funcional(expressão do antígeno Sml4) foi analisada porimmunoblotting conforme protocolo descrito anteriormente(Medeiros 2002)
Em todos os casos, foi verificado que ostransformantes expressam a proteína Sml4 em níveisequivalentes àqueles vistos em M. bovis BCG transformadocom pAU5-Sml4 (controle positivo de expressão). Aestabilidade do sistema de expressão, portanto, foiconfirmada tanto em meio acelular como em cultura decélulas murinas e humanas.
Β. O BCGr Pasteur ALeuD /pAK410-hsp60*-Sml4 protegecamundongos contra desafio com cercarias de S. mansonl.
A capacidade do BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4
em proteger camundongos contra cercarias vivas de S.mansoni foi avaliada em dois experimentos separados. Cadaexperimento empregou 6 grupos experimentais (Tabela 1) ,cada grupo contendo 10 fêmeas de camundongos Swiss comidade de 4 semanas. A eficácia da vacinação com uma únicadose administrada de forma intranasal (1 χ IOb cfu = dosepadrão; ou 1 χ IO2 cfu = dose baixa) de BCGr ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4 foi comparada aquela alcançada pelaadministração de doses únicas similares de BCGr/pAU5-Sml4ou 3 doses da proteína Sml4r (ΙΟμς em hidróxido dealumínio) na pata conforme descrito previamente por Varaldoet al., (2004). Ά dose final de proteína recombinante foiadministrada no mesmo dia como as doses únicas da vacinabaseadas no BCGr. Para ensaios de proteção, os camundongosforam desafiados subcutaneamente (sc) com 100 cercárias deS. mansoni em 30 dias (experimento 1) ou em 60 dias(experimento 2) após as imunizações iniciais e perfundidos45 dias após o desafio. As cargas parasitárias e níveis deproteção em diferentes grupos de desafio foram calculadasconforme descrito previamente em Tendler et al., 1996. Aimportância estatística foi avaliada pelo teste T deStudent.
Tabela 1 - Protocolo de imunização utilizado para examinara capacidade do BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4 deconferir proteção contra desafio com cercarias de S.mansoni.
<table>table see original document page 16</column></row><table><table>table see original document page 17</column></row><table>
a = dose padrão, b = dose baixa, c = hidróxido de alumínio,como relatado anteriormente (Varaldo et al., 2004).
Os resultados dos desafios estão representados naTabela 2. Pode ser observado que todos os grupos vacinadosmostraram uma diminuição significativa na carga parasitáriaem relação aos animais controle (grupo salina). Esse efeitofoi aparente em ambos após o trigésimo (30°) e sexagésimo(60°) dia após a vacinação. Em geral, esses dadosdemonstram claramente que o BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4 é capaz de induzir uma resposta imune protetoraem 30 dias e que essa resposta ainda é efetiva 60 dias apósa imunização. Além disso, a nova cepa vacinai foi tãoprotetora quanto a cepa BCGr/pAU5-Sml4 conforme descritoacima no estado da arte. Finalmente, o nível de proteçãoalcançado através de uma única dose administrada pela viaintranasal (tanto 1 χ IO6 UFC = dose padrão; como 1 χ IO2UFC = dose baixa) do BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4foi capaz de proporcionar um nível de proteção equivalenteaquele obtido como 3 doses da proteína Sml4 recombinanteformulada com hidróxido de alumínio como adjuvante.Tabela 2 - Avaliação da proteção medida em termos deredução da carga parasitária em comparação com controles dePBS (salina) em camundongos Swiss desafiados aos 30 e 60dias após a vacinação.
<table>table see original document page 18</column></row><table>
a = dose padrão, b = dose baixa, c = como anteriormenterelatado (Varaldo et al., 2004).
A partir do descrito e exemplificado acima, odepositante confirma a eficácia da cepa BCG Pasteur AleuD edo vetor de complementação pAK410-hsp60*-Sml4 na obtençãoda cepa vacinai para controle de infecções com Schistosomamansoni e parasitas relacionados com base na expressão doantigeno Sml4 nativo.
A invenção aqui descrita e os aspectos abordados devemser considerados como possíveis concretizações. Deve,entretanto ficar claro que a invenção não está limitada aessas concretizações e, aqueles com habilidade na técnicairão perceber que qualquer característica particular nelaintroduzida, deve ser entendida apenas como algo que foidescrito para facilitar a compreensão da invenção.
Claims (5)
1. Cepa de BCG Pasteur auxotrófico recombinantecomplementado para o amino ácido leucina expressando aproteína Sml4 de Schistossoma mansoni (BCGr PasteurALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4) caracterizado por ser obtida deacordo com as seguintes etapas:(a) amplificação por PCR do fragmento contendo ocassete de expressão da Sml4 contendo o promotor hsp60*modificado, utilizando o vetor pAU5-Sml4 como molde e osiniciadores PSml4F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGACGC GC) e PSml4R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A);(b) digestão do amplicon resultante de 816 pb (hsp60*-SmlA) obtido por PCR com a enzima Narl;(c) clonagem do amplicon hsp60*-Sml4 no vetor pUP410digerido com a enzima Nar1 para gerar a construção pUP410-hsp60*-Sml4;(d) Avaliação da capacidade da construção pUP410-hsp60*-Sml4 de expressar a proteína Sml4 em Mycobacteriumvaccae;(e) remoção do gene de resistência a canamicina dopUP410-hsp60*-Sml4 por digestão com a endonuclease derestrição iTindlII,(f) re-circularização da construção pUP410-hsp60*-Sml4sem o gene codificador da canamicina para produzir aconstrução pAK410-hsp60*-Sml4, usada para transformar acepa auxotrófica de BCG Pasteur (BCG AleuO), para produzira cepa de BCG Pasteur auxotrófico recombinantecomplementado para o amino ácido leucina expressando aproteína Sml4 de Schistossoma mansoni (BCGr PasteurALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4).
2. Uso da cepa BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4conforme definida na reivindicação 1 no controle deinfecções humanas causadas por parasitas, preferivelmenteSchistosoma mansoni.
3. Uso da cepa BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4conforme definida na reivindicação 1 no controle deinfecções animais causadas por Fasciola hepatica.
4. Uso da cepa BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4conforme definida na reivindicação 1 no controle dainfecção por Mycobacterium tuberculosis.
5. Uso da cepa BCGr Pasteur ALeuD/pAK410-hsp60*-Sml4conforme definida na reivindicação 1 no controle deneoplasias.
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