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BRPI0820819B1 - formulação de anticorpos humanizados b-ly 1 e seu uso - Google Patents

formulação de anticorpos humanizados b-ly 1 e seu uso Download PDF

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BRPI0820819B1
BRPI0820819B1 BRPI0820819-0A BRPI0820819A BRPI0820819B1 BR PI0820819 B1 BRPI0820819 B1 BR PI0820819B1 BR PI0820819 A BRPI0820819 A BR PI0820819A BR PI0820819 B1 BRPI0820819 B1 BR PI0820819B1
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BR
Brazil
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antibody
histidine
following
trehalose
formulation
Prior art date
Application number
BRPI0820819-0A
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English (en)
Inventor
Michael Adler
Hanns-Christian Mahler
Christine Wurth
Original Assignee
F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by F. Hoffmann-La Roche Ag filed Critical F. Hoffmann-La Roche Ag
Publication of BRPI0820819A2 publication Critical patent/BRPI0820819A2/pt
Publication of BRPI0820819B1 publication Critical patent/BRPI0820819B1/pt

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Abstract

FORMULAÇÃO DE ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a uma formulação de anticorpos monoclonais humanos anti-CD20, um processo para a preparação e usos da mesma.

Description

FORMULAÇÃO DE ANTICORPOS
[0001] A presente invenção refere-se a uma formulação deanticorpos monoclonais anti- CD20, um processo para a preparação a referida formulação e usos da formulação.
Antecedentes da Invenção
[0002] A molécula CD20 (também denominada antígeno dediferenciação restrita a linfócitos B humanos ou Bp35) é uma proteína transmembrana hidrofóbica com um peso molecular de cerca de 35 kD localizada sobre linfócitos pré-B e linfócitos B maduros (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287; e Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717). CD20 é encontrada sobre a superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou de órgãos linfóides e é expressa durante o pré-desenvolvimento de células B precoce e permanece até diferenciação de células plasmáticas. CD20 está presente sobre tanto células B normais bem como células B malignas. Em particular, CD20 é expressa sobre mais de 90% de linfomas não Hodgkin de células B (NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 14241433)) mas não é encontrada sobre células-tronco hematopoiéticas, pró-células B, células plasmáticas normais, ou outros tecidos normais (Tedder et al. (1985) J, Immunol. 135(2): 973- 979).
[0003] A região de terminal carboxila de 85 aminoácidos daproteína CD20 está localizada dentro do citoplasma. A extensão desta região contrasta com a de outras estruturas da superfície células B- específicas tais como cadeias pesadas de IgM, IgD, e IgG ou antígenos de histocompatibilidade classe I1 cadeias a ou β, as quais têm regiões intracitoplasmáticas relativamente curtas de 3, 3, 28, 15, e 16 aminoácidos, respectivamente (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). Dos últimos 61 aminoácidos de terminal carboxila, 21 são resíduos acidíferos, ao passo que somente 2 são básicos, indicando que esta região tem uma forte carga negativa líquida. O Acesso do GenBank N° é NP-690605. Imagina-se que CD20 pode estar envolvido na regulação de uma ou mais etapas precoces no processo de ativação e diferenciação de células B (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 25 16:881-887) e pode funcionar como um canal de permuta de cálcio (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195).
[0004] Existem dois tipos diferentes de anticorpos anti-CD20diferindo significativamente em seu modo de atividades de ligação de CD20 e biológicas (Cragg, M.S., et al, Blood, 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M.S., et al, Blood, 101 (2003) 1045-1051). Anticorpos tipo I, como Rituximab, são potentes em citotoxicidade mediada pelo complemento, ao passo que anticorpos tipo II, como Tositumomab (Bexxar®, B1), 11B8 e AT80, iniciam de modo eficaz morte celular alvo através de apoptose caspase-independente com exposição de fosfatidilserina concomitante.
[0005] As características comuns de anticorpos anti-CD20 tipo I etipo II estão resumidas na tabela 1.Anticorpos anti-CD20 tipo IEpítope de CD20 tipo ILocalizam CD20 para grandes quantidades lipídicasCDC aumentada (se isótipo de IgG1) Atividade de ADCC (se isótipo de IgG1)Plena capacidade de ligaçãoAgregação homotípicaIndução de apoptose na reticulaçãoTabela 1: Propriedades de anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo IISumário da Invenção
[0006] Em um aspecto, a invenção se refere a uma formulaçãofarmacêutica compreendendo: 1 a 150 mg/mL de um anticorpo anti-CD20;1 a 100 mM de um tampão;opcionalmente 0,001 a 1% de um tensoativo; e opcionalmente 1 a 800 mM de um agente de tonicidade; em um pH na faixa de a partir de 4,5 a 7,0.
[0007] Preferencialmente, o referido anticorpo anti-CD20 é umanticorpo tipo II. Mais preferencialmente, o referido anticorpo anti- CD20 é um anticorpo B-Ly1 humanizado.
Descrição Detalhada da Invenção
[0008] O termo "anticorpo" engloba as várias formas de anticorposincluindo, mas não estando limitadas a anticorpos inteiros, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos produzidos geneticamente como anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos ou anticorpos recombinantes bem como fragmentos de semelhantes anticorpos contando que as propriedades características de acordo com a invenção sejam retidas.
[0009] "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção deum anticorpo de extensão total, geralmente no mínimo a porção de ligação antigênica ou a região variável da mesma. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem diabodies, moléculas de anticorpos de cadeia única, imunotoxinas, e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. Além disso, fragmentos de anticorpos compreendem polipeptídeos de cadeia única tendo as características de uma cadeia VH, a saber sendo capazer de montagem junto com uma cadeia VL ou de uma cadeia VL ligando ao antígeno CD20, a saber sendo capazer de montagem junto com uma cadeia VH a uma poço de ligação antigênica funcional.
[00010] "Fragmentos de anticorpos" também compreendem os fragmentos referidos os quais per se não são capazes de proporcionar funções efetoras (ADCC/CDC), mas proporcionam esta função em uma maneira de acordo com a invenção depois de serem combinados com um ou mais domínios constants de anticorpos apropriados.
[00011] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpos monoclonais" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se referem a uma preparação de moléculas de anticorpos de uma única composição de aminoácidos. Por conseguinte, o termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a anticorpos apresentando uma única especificidade de ligação os quais têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma o qual inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana fundido a uma célula imortalizada.
[00012] O termo "anticorpo quimérico" se refere a um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável, isto é, região de ligação, de uma fonte ou espécie e no mínimo uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, geralmente preparada por técnicas de DNA recombinante. Anticorpos quiméricos compreendendo uma região variável murina e uma região constante humana são especialmente preferenciais. Os anticorpos quiméricos murinos/humanos referidos são o produto de genes de imunoglobulina expressados compreendendo segmentos de DNA codificando regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de DNA codificando regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" englobados pela presente invenção são aqueles nos quais a classe ou subclasse foi modificada ou alterada a partir daquela do anticorpo original. Os anticorpos "quiméricos" referidos também são referidos como "anticorpos de classe trocada". Métodos para produzir anticorpos quiméricos envolvem e técnicas de transfecção genética e de DNA recombinante convencional atualmente de conhecimento geral na arte. Vide, por exemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; e a Patente dos Estados Unidos N° US 5.202.238 e a Patente dos Estados Unidos N° US 5.204.244.
[00013] O termo "anticorpo humanizado" se refere a anticorpos nos quais as "regiões determinantes de complementaridade" ou de estrutura (CDR) foram modificadas para compreender a CDR de uma imunoglobulina de especificidade diferente comparada com a da imunoglobulina de origem. Em uma modalidade preferencial, uma CDR murina é enxertada na região de estrutura de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado." Vide, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. CDRs particularmente preferenciais correspondem àquelas representando sequências reconhecendo os antígenos mencionados acima para anticorpos quiméricos e bifuncionais.
[00014] O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Anticorpos humanos são de conhecimento geral no estado da arte (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). Com base emsemelhante tecnologia, podem ser produzidos anticorpos humanos contra uma grande variedade de alvos. Exemplos de anticorpos humanos são, por exemplo, descritos em Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597.
[00015] O termo "anticorpo humano recombinante", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira tal como uma célula NS0 ou CHO ou de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana ou anticorpos expressados usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira. Os anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em uma forma rearranjada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos a hipermutação somática in vivo. Deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de derivadas de e relacionadas com sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.
[00016] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "ligando especificamente" ou "liga especificamente a" se refere a um anticorpo ligando especificamente ao antígeno CD20. Preferencialmente a afinidade de ligação é de valor de KD de 10-9 mol/l ou menos (por exemplo, 10-10 mol/l), preferencialmente com um valor de KD de 10-10 mol/l ou menos (por exemplo, 10-12 mol/l). A afinidade de ligação é determinada com uma prova de ligação de rotina, tal como a técnica de ressonância de plasmon superficial (Biacore®).
[00017] O termo "molécula de ácido nucleico", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo, mas preferencialmente é DNA de filamento duplo.
[00018] Os "domínios constantes" não estão envolvidos diretamente em ligação do anticorpo a um antígeno, mas estão envolvidos nas funções efetoras (ADCC, ligação de complemento, e CDC).
[00019] A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)) conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota cada uma do par de cadeias leve e pesada o qual está envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios de cadeias variáveis humanas levea e pesadaa têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FR) cujas sequências são amplamente conservadas, conectadas pelas três "regiões hipervariáveis" (ou regiões determinantes de complementaridade, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação de b-sheet e as CDRs podem formar loops conectando a estrutura de b-sheet. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam junto com as CDRs da outra cadeia o sítio de ligação antigênica. As regiões de CDR3 de cadeia pesada e leve de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto, proporcionam um objeto adicional da invenção.
[00020] Os termos "região hipervariável" ou "porção antigênica de um anticorpo" quando usados aqui, neste requerimento de patente, se referem aos resíduos aminoácidos de um anticorpo os quais são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos aminoácidos das "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". Regiões de "estrutura" ou "FR" são as regiões de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido aqui, neste requerimento de patente. Portanto, as cadeias leve e pesada de um anticorpo compreendem do N- ao C-término os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Especialmente, CDR3 da cadeia pesada é a região a qual contribui principalmente para ligação antigênica. Regiões de CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de um "loop hipervariável".
[00021] Os termos "CD20" e "antígeno CD20" são usados de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente, e incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas de CD20 humano as quais são naturalmente expressas por células ou são expressas sobre células transfectadas com o gene CD20. A ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno CD20 media a destruição de células expressando CD20 (por exemplo, uma célula tumoral) por inativação de CD20. A destruição das células expressando CD20 pode ocorrer por um ou mais dos seguintes mecanismos:
[00022] Sinônimos de CD20, conforme reconhecido na técnica, incluem antígeno CD20 de linfócitos B, antígeno superficial B1 de linfócitos B, Leu-16, Bp35, BM5, e LF5.
[00023] O termo "anticorpo anti-CD20" de acordo com a invenção é um anticorpo que liga especificamente ao antígeno CD20. Dependendo das propriedades de ligação e das atividades biológicas de anticorpos anti-CD20 ao antígeno CD20, dois tipos de anticorpos anti-CD20 (anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo II) podem ser diferenciados de acordo com Cragg, M.S., et al, Blood 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M.S., et al Blood 101 (2003) 1045-1051, vide a Tabela 2. Anticorpos anti-CD20 tipo IEpítope de CD20 tipo ILocalizam CD20 para grandes quantidades lipídicasCDC aumentada (se isótipo de IgG1) Atividade de ADCC (se isótipo de IgG1)Anticorpos anti-CD20 tipo IIEpítope de CD20 tipo IINão localizam CD20 para grandes quantidades lipídicasCDC reduzida (se isótipo de IgG1) Atividade de ADCC (se isótipo de IgG1) Anticorpos anti-CD20 tipo I Plena capacidade de ligação Agregação homotípicaIndução de apoptose na reticulaçãoAnticorpos anti-CD20 tipo II Reduzida capacidade de ligação Agregação homotípica mais forte Forte indução de morte celular sem reticulação Tabela 2: Propriedades de anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo II
[00024] Uma propriedade essencial de anticorpo anti-CD20 tipo I e tipo II é seu modo de ligação. Portanto anticorpo anti-CD20 tipo I e tipo II pode ser classificado pela proporção das capacidades de ligação a CD20 sobre células de Raji (ATCC N° CCL-86) do referido anticorpo anti-CD20 comparado com rituximab.
[00025] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente,"anticorpo anti-CD20" pode ser ou um anticorpo tipo I ou tipo II. Preferencialmente, é um anticorpo tipo II.
[00026] Os anticorpos anti-CD20 tipo I têm uma proporção das capacidades de ligação a CD20 sobre células de Raji (ATCC N° CCL- 86) do referido anticorpo anti-CD20 comparado com rituximab de 0,8 a 1,2, preferencialmente de 0,9 a 1,1. Exemplos de semelhantes anticorpos anti-CD20 tipo I incluem, por exemplo, rituximab, (patente internacional N° WO94/11026), 1F5 IgG2a (ECACC, hibridoma; Press et al., Blood 69/2:584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ECACC, hibridoma), 2C6 IgG1 (conforme revelado na patente internacional N°WO2005/103081), 2F2 IgG1 (conforme revelado e patenteinternacional N° WO 2004/035607 e patente internacional N° WO2005/103081) e 2H7 IgG1 (conforme revelado na patente internacional N° WO 2004/056312). Preferencialmente o referido anticorpo anti-CD20 tipo I é um anticorpo monoclonal que liga ao mesmo epítope que rituximab. Os anticorpos anti-CD20 tipo II têm uma proporção das capacidades de ligação a CD20 sobre células de Raji (ATCC N° CCL-86) do referido anticorpo anti-CD20 comparado com rituximab de 0,3 a 0,6, preferencialmente de 0,35 a 0,55, mais preferencialmente 0,4 a 0,5. Exemplos de semelhantes anticorpos anti- CD20 tipo II incluem, por exemplo, tositumomab (B1 IgG2a), anticorpo IgG1 B-Ly1 humanizado (um anticorpo IgG1 humanizado quimérico conforme revelado na patente internacional N° WO2005/044859), 11B8 IgG1 (conforme revelado na patente internacional N° WO 2004/035607), e AT80 IgG1. Preferencialmente o referido anticorpo anti-CD20 tipo II é um anticorpo monoclonal que liga ao mesmo epítope que o anticorpo B-Ly1 humanizado (conforme descrito na patente internacional N° WO2005/044859).
[00027] A "proporção das capacidades de ligação a CD20 sobre células de Raji (ATCC N° CCL-86) de alguns anticorpos anti-CD20 comparados com rituximab" é determinada por medição da imunofluorescência direta (é medida a intensidade de fluorescência média (MFI)) usando o referido anticorpo anti-CD20 conjugado com Cy5 e rituximab conjugado com Cy5 em um FACSArray (Becton Dickinson) com células de Raji (ATCC N° CCL-86), conforme descrito no Exemplo N° 2, e calculada como se segue:Proporção das capacidades de ligação a CD20 em células de Raji (ATCC N° CCL-86) =MFI (Cy5 - anticorpoproporção de marcação com anti - CD20)xCy5 (Cy5 - rituximab)MFI (Cy5 - rituximab)proporção de marcação com Cy5 (Cy5 - anticorpo anti - CD20)
[00028] MFI é a intensidade fluorescente média. A "proporção demarcação com Cy5" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa número de moléculas de marcação Cy5 por molécula de anticorpo.
[00029] Tipicamente o referido anticorpo anti-CD20 tipo I tem uma proporção das capacidades de ligação a CD20 sobre células de Raji (ATCC N° CCL-86) do primeiro anticorpo anti-CD20 referido comparado a rituximab de 0,8 a 1,2, preferencialmente 0,9 a 1,1.
[00030] Tipicamente o referido anticorpo anti-CD20 tipo II tem uma proporção das capacidades de ligação a CD20 sobre células de Raji (ATCC N° CCL-86) do segundo anticorpo anti-CD20 referido comparado com rituximab de 0,3 a 0,6, preferencialmente 0,35 a 0,55, mais preferencialmente 0,4 a 0,5.
[00031] Em uma modalidade preferencial o referido anticorpo anti- CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, tem aumento da citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
[00032] Por "anticorpo tendo aumento da citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)" significa um anticorpo, como o termo é definido aqui, neste requerimento de patente, tendo aumento da ADCC conforme determinado por qualquer método de conhecimento daqueles com conhecimento regular da técnica. Uma prova de ADCC aceita in vitro é como se segue:1) a prova usa células-alvo que se sabe que expressam o antígeno alvo reconhecido pela região de ligação antigênica do anticorpo;2) a prova usa células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs), isoladas do sangue de um doador saudável escolhido aleatoriamente, como células efetoras;3) a prova é realizada de acordo com o seguinte protocolo:i) as PBMCs são isoladas usando procedimentos de centrifugação de densidade de rotina e são suspensas a 5 X 106 células/ ml em meio de cultura celular RPMI;ii) as células-alvo são cultivadas por métodos de cultura tecidual de rotina, colhidas da fase de crescimento exponencial com uma viabilidade maior do que 90%, lavadas em meio de cultura celular RPMI, marcadas com 100 micro-Curies de ''CI-, lavadas duas vezes com meio de cultura celular, e ressuspensas em meio de cultura celular em uma densidade de 1 0' células/ml; iii) 100 microlitros da suspensão celular alvo final acima são transferidos para cada poço de uma lâmina de microtítulo de 96 poços;iv) o anticorpo é diluído serialmente de 4000 ng/ml para 0,04 ng/ml em meio de cultura celular e 50 microlitros das soluções de anticorpos resultantes são adicionados às células-alvo na lâmina de microtítulo de 96 poços, testando em triplicata várias concentrações de anticorpos cobrindo toda a faixa de concentração acima;v) para os controles de liberação máxima (MR), 3 poços adicionais na lâmina contendo as células-alvo marcadas, recebem 50 microlitros de uma solução aquosa a 2% (VN) de detergente não iônico (Nonidet, Sigma, St. Louis), ao invés da solução de anticorpos (ponto iv acima);vi) para os controles de liberação espontânea (SR), 3 poços adicionais na lâmina contendo as células-alvo marcadas, recebem 50 microlitros de meio de cultura celular RPMI ao invés da solução de anticorpos (ponto iv acima);vii) a lâmina de microtítulo de 96 poços é entãocentrifugada a 50 x g por 1 minuto e incubada por 1 hora a 4 C;viii) 50 microlitros da suspensão de PBMC (ponto i acima) são adicionados a cada poço para produzir uma proporção de células efetoras : alvo de 25: 1 e as lâminas são colocadas em umaincubadora sob atmosfera de 5% de CO2 a 37 C por 4 horas;ix) o sobrenadante livre de células de cada poço é colhido e a radioatividade liberada experimentalmente (ER) é quantificada usando um contador gama;x) a porcentagem de lise específica é calculada para cada concentração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, onde ER é a radioatividade média quantificada (vide o ponto ix acima) para aquela concentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (vide o ponto ix acima) para os controles de MR (vide o ponto V acima), e SR é a radioatividade média quantificada (vide o ponto ix acima) para os controles de SR (vide o ponto vi acima);4) "aumento de ADCC" é definido como ou um aumento na porcentagem máxima de lise específica observada dentro da faixa de concentração de anticorpo testada acima, e/ou uma redução na concentração de anticorpo requerida para atingir metade da porcentagem máxima de lise específica observada dentro da faixa de concentração de anticorpo testada acima. O aumento na ADCC é relativo à ADCC, medida com a prova acima, mediada pelo mesmo anticorpo, produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos de produção, purificação, formulação e armazenamento de rotina, os quais são de conhecimento daqueles versados na técnica, mas que não foi produzido por células hospedeiras projetadas para superexpressar GnTIII.
[00033] O referido "aumento de ADCC" pode ser obtido por glicoengenharia dos referidos anticorpos, o que significa reforçar as referidas funções efetoras mediadas por células naturais de anticorpos monoclonais por produção de seu componente oligossacarídico conforme descrito em Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) e na Patente dos Estados Unidos N° 6.602.684.
[00034] O termo "citotoxicidade dependente do complemento (CDC)" se refere à lise de células-alvo tumorais humanas pelo anticorpo de acordo com a invenção na presença do complemento. CDC é medida preferencialmente pelo tratamento de uma preparação de células expressando CD20 com um anticorpo anti-CD20 de acordo com a invenção na presença do complemento. CDC é encontrada se o anticorpo induzir em uma concentração de 100 nM a lise (morte celular) de 20% ou mais das células tumorais depois de 4 horas. A prova é realizada preferencialmente com células tumorais marcadas com 51Cr ou Eu e medição do 51Cr ou Eu liberado. Controles incluem a incubação das células-alvo tumorais com complemento, mas sem o anticorpo.
[00035] Tipicamente anticorpos anti-CD20 tipo I e tipo II do isótipo IgG1 apresentam propriedades de CDC características. Anticorpos anti-CD20 tipo I têm uma CDC aumentada (se isótipo de IgG1) e anticorpos anti-CD20 tipo II têm uma CDC reduzida (se isótipo de IgG1) comparados uns com os outros. Preferencialmente tanto anticorpos anti-CD20 tipo I quanto tipo II são anticorpos isótipos de IgG1.
[00036] O anticorpo "rituximab" é um domínio constante murino gama 1 humano quimérico produzido geneticamente contendo anticorpo monoclonal dirigido contra o antígeno CD20 humano. Este anticorpo quimérico contém domínios constantes gama 1 humanos e é identificado pelo nome "C2B8" na patente internacional N° WO 94/11026 (Anderson et. al.). Rituximab é aprovado para o tratamento de pacientes com linfoma não Hodgkin de células B, CD20 positivo, recidivante ou refratário de baixo grau ou folicular. Estudos do mecanismo de ação in vitro mostraram que rituximab apresenta citotoxicidade dependente do complemento humano (CDC) (Reff et. al, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Adicionalmente, apresenta importante atividade em provas que medem a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC).
[00037] O termo "anticorpo B-Ly1 humanizado" se refere a anticorpos B-Ly1 humanizados conforme descrito na patente internacional N° WO 2005/044859, os quais foram obtidos a partir do anticorpo monoclonal murino anti-CD20 B-Ly1 (região variável da cadeia pesada murina (VH): SEQ ID NO: 1; região variável da cadeia leve murina (VL): SEQ ID NO: 2- vide Poppema, S. e Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987);) por quimerização com um domínio constante humano de IgG1 e humanização seguinte (vide a patente internacional N° WO 2005/044859). Estes "anticorpos B-Ly1 humanizados" são revelados em detalhes na patente internacional N° WO 2005/ 044859.
[00038] Preferencialmente o "anticorpo B-Ly1 humanizado" tem região variável da cadeia pesada (VH) selecionada entre o grupo de SEQ ID N° 3 a SEQ ID N° 20 (B-HH2 a B-HH9 e B-HL8 a B-HL17 da patente internacional N° WO 2005/044859). Especialmente preferenciais são Seq. ID N° 3, 4, 7, 9, 11, 13 e 15 (B-HH2, BHH-3, B- HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 e B-HL13 da patente internacional N° WO 2005/044859). O mais preferencialmente, a referida VH é BHH6. Preferencialmente o "anticorpo B-Ly1 humanizado" tem região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID N° 20 (B-KV1) da patente internacional N° WO 2005/044859. Além disso, o anticorpo B-Ly1 humanizado é preferencialmente um anticorpo IgG1. Preferencialmente os anticorpos B-Ly1 humanizados referidos são produzidos por glicoengenharia (GE) na região Fc de acordo com os procedimentos descritos na patente internacional N° WO 2005/044859, na patente internacional N° WO 2004/065540, Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) e na patente internacional N° WO 99/154342. A maioria dos anticorpos B-Ly1 humanizados produzidos por glicoengenharia tem um padrão de glicosilação alterado na região Fc, preferencialmente tendo um nível reduzido de resíduos fucose. Preferencialmente no mínimo 40% ou mais (em uma modalidade entre 40% e 60%, em outra modalidade no mínimo 50%, e em ainda outra modalidade no mínimo 70% ou mais) dos oligossacarídeos da região Fc são não fucosilados. Além disso, os oligossacarídeos da região Fc são preferencialmente bisseccionados. O mais preferencialmente, o "anticorpo B-Ly1 humanizado" compreende VH B-HH6 e VL B-KV1 da patente internacional N° WO2005/044859. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o anticorpo citado também é referido como "HuMab<CD20>". Em outra modalidade mais preferencial, o referido anticorpo tem um nível reduzido de resíduos fucose conforme definido acima e/ou os oligossacarídeos da região Fc são o mais preferencialmente bisseccionados. Em ainda outra modalidade a mais preferencial, o referido anticorpo apresenta aumento da ADCC conforme definido aqui, neste requerimento de patente.
[00039] O componente oligossacarídico pode afetarsignificativamente propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteína terapêutica, incluindo estabilidade física, resistência a ataque por protease, interações com o sistema imune, farmacocinética, e atividade biológica específica. As propriedades referidas podem depender não somente da presença ou ausência, mas também das estruturas específicas, de oligossacarídeos. Podem ser feitas algumas generalizações entre a estrutura do oligossacarídeo e a função da glicoproteína. Por exemplo, algumas estruturas de oligossacarídeos mediam rápido clearance da glicoproteína da corrente sanguínea através de interações com proteínas de ligação de carboidratos específicas, ao passo que outras podem ser ligadas por anticorpos e dar origem a reações imunes indesejadas. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).
[00040] Células de mamíferos são os hospedeiros preferenciais para produção de glicoproteínas terapêuticas, devido a sua capacidade para glicosilar proteínas na forma mais compatível para aplicação humana. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Bactérias muito raramente glicosilam proteínas, e como outros tipos de hospedeiros comuns, tais como leveduras, fungos filamentosos, células de insetos e plantas, produzem padrões de glicosilação associados com rápido clareamento da corrente sanguínea, interações imunes indesejáveis, e em alguns casos específicos, atividade biológica reduzida. Entre as células de mamíferos, células de ovário de hamster chinês (CHO) têm sido usadas mais comumente durantes as duas últimas décadas. Além de proporcionar padrões de glicosilação adequados, estas células possibilitam produção consistente de linhagens de células clonais geneticamente estáveis e altamente produtivas. Elas podem ser cultivadas a altas densidades em biorreatores simples usando meios livres de soro, e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reprodutíveis. Outras células animais comumente usadas incluem células do rim de hamster bebê (BHK), células de mieloma de camundongo NSO e SP2/0. Mais recentemente, também tem sido testada a produção a partir de animais transgênicos. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-981 (1996)).
[00041] Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posições conservadas nas regiões constantes de cadeia pesada, com cada isótipo possuindo um array distinto de estruturas de carboidratos N-endcadeados, as quais afetam de modo variável a montatem de proteínas, secreção ou atividade funcional. (Wright, A., e Monison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). A estrutura do carboidrato N- encadeado anexado varia consideravelmente, dependendo do grau de processamento, e pode incluir manose superior, multiplamente ramificada bem como oligossacarídeos complexos biantennary. (Wright, A., e Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Tipicamente, há processamento heterogêneo das estruturas de oligossacarídeos de núcleo anexadas em um sítio de glicosilação em particular tal que mesmo anticorpos monoclonais existem como múltiplas glicoformas. Igualmente, foi demonstrado que ocorrem importantes diferenças na glicosilação de anticorpo entre linhagens celulares, e foram vistas diferenças ainda menores para uma dada linhagem celular line cultivada sob diferentes condições de cultura. (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22 (1995)).
[00042] Um modo de obter grandes aumentos na potência, enquanto mantendo um processo de produção simples e potencialmente evitando efeitos colaterais indesejáveis significativos, é reforçar as funções efetoras mediadas por células, naturais, de anticorpos monoclonais por engenharia de seu componente oligossacarídico conforme descrito em Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) e na Patente dos Estados Unidos N° 6.602.684. Anticorpos do tipo IgG1, os anticorpos mais comumente usados na imunoterapia do câncer, são glicoproteínas que têm um sítio de glicosilação N-encadeado conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacarídeos complexos biantennary anexados a Asn297 são enterrados entre os domínios CH2, formando extensivos contatos com a espinha dorsal do polipeptédeo, e sua presença é essencial para o anticorpo mediar funções efetoras tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. e Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)).
[00043] Foi demonstrado previamente que a superexpressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) de β(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase I11 ("GnTII17y), uma glicosiltransferase catalisando a formação de oligossacarídeos bisseccionados, aumenta significativamente a atividade de ADCC in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) produzido pelas células CHO manipuladas. (Vide Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999); e a patente internacional N° WO 99/154342, cujos conteúdos integrais são por este incorporados por meio de referência). O anticorpo chCE7 pertence a uma grande classe de anticorpos monoclonais não conjugados os quais têm elevadas afinidade e especificidade tumorais, mas têm potência baixa demais para serem clinicamente úteis quando produzidos em linhagens celulares industriais padronizadas carecendo da enzima GnTIII (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Este estudo foi o primeiro a mostrar que grandes aumentos da atividade de ADCC podem ser obtidos manipulando as células produtoras de anticorpos para expressar GnTIII, as quais também levam a um aumento na proporção de oligossacarídeos bisseccionados associados a região constante (Fc), incluindo oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados, acima dos níveis encontrados em anticorpos que ocorrem naturalmente.
[00044] O termo "expressão do antígeno CD20" pretende indicar um nível significativo de expressão do antígeno CD20 em uma célula, preferencialmente sobre a superfície celular de uma célula T ou B, mais preferencialmente uma célula B, de um tumor ou câncer, respectivamente, preferencialmente um tumor não sólido. Pacientes tendo um "câncer expressando CD20" podem ser determinados por testes de rotina conhecidos na técnica. Também é preferencial que "expressão do antígeno CD20" pretende indicar um nível significativo de expressão do antígeno CD20 em uma célula, preferencialmente sobre a superfície celular de uma célula T ou B, mais preferencialmente uma célula B, em uma doença autoimune. Por exemplo, a expressão de antígeno CD20 é medida usando detecção imuno-histoquímica (IHC), FACS ou atravées de detecção à base de PCR do RNAm correspondente.
[00045] O termo "câncer expressando CD20" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere preferencialmente a linfomas (preferencialmente linfomas Não Hodgkin de Células B (NHL)) e leucemias linfocíticas. Os linfomas e leucemias linfocíticas referidos incluem por exemplo, a) linfomas folicular, b) Linfomas de Células Não Clivadas Pequenas/linfoma de Burkitt (incluindo linfoma de Burkitt endêmico, linfoma de Burkitt esporádico e linfoma de Não Burkitt) c) linfomas da zona marginal (incluindo linfoma de células B da zona marginal extranodal (linfomas de tecido linfático associado com a mucosa, MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal e linfoma da zona marginal esplênica), d) linfoma de células do manto (MCL), e) Linfoma de Células Grandes (incluindo linfoma de células grandes difuso de células B (DLCL), Linfoma de Células Mistas Difuso, Linfoma Imunoblástico, Linfoma de Células B Mediastinal Primário, Linfoma Angiocêntrico - Linfoma de Células B Pulmonar) f) leucemia de células cabeludas, g ) linfoma linfocítico, macroglobulinemia de waldenstrom, h) leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL)/ linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia pró-linfocítica de células B, i) neoplasmas de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, mieloma múltiplo, plasmacitoma j) doença de Hodgkin.
[00046] Preferencialmente o câncer expressando CD20 é um linfoma Não Hodgkin de Células B (NHL). Especialmente o câncer expressando CD20 é um linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células grandes difuso de células B (DLCL), linfoma de Burkitt, leucemia de células cabeludas, linfoma folicular, mieloma múltiplo, linfoma da zona marginal, distúrbio linfoproliferativo pós transplante (PTLD), linfoma associado com HIV, macroglobulinemia de waldenstrom, ou linfoma do sistema nervoso central primário.
[00047] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "doença autoimune" se refere a uma doença ou distúrbio originário de e dirigido contra os próprios tecidos de um indivíduo. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não estão limitados a artrite (artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática), psoríase, dermatite, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma sistêmico e esclerose, reações associadas com doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da angústia respiratória, síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS), meningite, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas, eczema, asma, condições envolvendo infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, reações imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo ANCA), anemia aplásica, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia eritrocítica pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese leucocitária, distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central (SNC), síndrome de lesão de múltiplos órgãos, miastenia gravis, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, anti-glomerular basement membrane doença, síndrome de anticorpo anti-fosfolipídico, neurite alérgica, doença de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens Johnson, penfigóide bolhosa, pênfigo, poliendocrinopatias autoimunes, nefropatia s, polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada pore IgM, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), trombocitopenia autoimune, doença autoimune do testículo e ovário incluindo orquite e ooforite autoimune, hipotiroidismo primário; doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite autoimune, tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto), tiroidite subaguda, hipotiroidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular I), diabetes Tipo I também referido como diabetes i melito insulino-dependente (IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite linfóide intersticial (HIV), bronquiolite obliterans (não transplante) versus NSIP, síndrome de Guillain-Barre, vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e arterite de células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa), espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia de IgA), glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrose biliar primária, sprue celíaco (enteropatia de glúten), crioglobulinemia, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença das artérias coronárias e etc.
[00048] Formulações terapêuticas dos anticorpos usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando um anticorpo tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas.
[00049] O termo "tensoativo" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota um agente ativo na superfície farmaceuticamente aceitável. Na formulação da invenção, a quantidade de tensoativo é descrita uma porcentagem expressa em peso/ volume. A unidade de peso/ volume mais comumente usada é mg/mL. Tensoativos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendem, mas não estão limitados a tensoativos não iônicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Além disso, são compreendidos, mas não limitados a ésteres de ácidos graxos de sorbitano de polietileno, glicóis de polietileno-polipropileno, estearatos de polioxietileno e dodecil sulfatos de sódio. Sorbitanos de polietileno preferenciais são ésteres de sorbitano de polietileno (20) (sinônimo de polissorbato 20, vendido sob a marca registrada Tween 20™) e monooleato de sorbitano de polioxietileno(20) (sinônimo depolissorbato 80 vendido sob a marca registrada Tween 80™).Polietileno-polipropileno glicóis preferenciais são os vendidos sob os nomes Pluronic® F68 ou Poloxamer 188™. O mais preferencial é Poloxamer 188™. Polioxietileno-estearatos preferenciais são os vendidos sob a marca registrada Myrj™. Éter monolaurílico de polioxietileno preferenciais são os vendidos sob a marca registrada Brij™. Quando ésteres de polietileno-sorbitano-polietileno(20)- sorbitano (Tween 20™) e monooleato de sorbitano de polioxietileno(20) (Tween 80™) são usados eles geralmente são usados em uma quantidade de cerca de 0,001 a cerca de 1%, preferencialmente de cerca de 0,005 a cerca de 0,1% e ainda preferencialmente cerca de 0,01% a cerca de 0,04%em peso/ volume.
[00050] O termo "tampão" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota um tampão farmaceuticamente aceitável. Tampão farmaceuticamente aceitável adequado compreende, mas não estão limitados a tampões de histidina, tampões de citrato, tampões de succinato, tampões de acetato e tampões de fosfato. Tampões preferenciais compreendem L-histidina ou misturas de L-histidina com cloridreto de L-histidina com agentes de isotonicidade e potencialmente ajuste de pH com um ácido ou uma base conhecidos na técnica. O mais preferencial é L-histidina. Os tampões de histidina mencionados acima são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM,preferencialmente de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM e ainda mais preferencialmente de cerca de 20 mM. Independentemente do tampão usado, o pH será ajustado em um valor compreendendo cerca de 4,5 a cerca de 7,0 e preferencialmente cerca de 5,5 a cerca de 6,5 e ainda preferencialmente cerca de 6,0 por ajuste com um ácido ou base conhecidos na técnica ou usando misturas adequadas de componentes de tampão ou ambos.
[00051] O termo "agentes de isotonicidade" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota farmaceuticamente aceitáveis agentes de isotonicidade. Agentes de isotonicidade são usados para proporcionar uma formulação isotônica. Uma formulação isotônica é líquido ou líquido reconstituído a partir de uma forma sólida, por exemplo, uma forma liofilizada e denota uma solução tendo a mesma tonicidade que alguma outra solução com a qual é comparada, tal como solução salina fisiológica e o soro sanguíneo. Agentes de isotonicidade adequados compreendem, mas não estão limitados a sais, incluindo mas não limitados a cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio, açúcares incluindo mas não limitados a glicose, sacarose, trealose ou glicerina e qualquer componente entre o grupo de aminoácidos, açúcares, sais e combinações dos mesmos. Agentes de isotonicidade são geralmente usados em uma quantidade total de cerca de 5 mM a cerca de 350 mM.
[00052] O termo "líquido" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, em conexão com a formulação de acordo com a invenção denota uma formulação a qual é líquida em uma temperatura de no mínimo cerca de 2 a cerca de 8 °C.
[00053] O termo "liofilizada" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, em conexão com a formulação de acordo com a invenção denota uma formulação a qual é seca por congelamento da formulação e subsequentemente sublimando o gelo do conteúdo congelado por quaisquer métodos de secagem por congelamento conhecidos na técnica, por exemplo, dispositivos de secagem por congelamento disponíveis comercialmente.
[00054] O termo "sais" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota um sal em uma quantidade de cerca de 1 mM a cerca de 500 mM. Exemplos não limitantes de sais incluem sais de quaisquer combinações dos cátions sódio, potássio, cálcio ou magnésio com ânions cloreto, fosfato, citrato, succinato, sulfato ou misturas dos mesmos.
[00055] O termo "aminoácido" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota um aminoácido em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 100 mg/mL compreendendo mas não limitado a arginina, glicina, ornitina, glutamina, asparagina, lisina, histidina, ácido glutâmico, ácido asparágico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, prolina.
[00056] O termo "açúcar" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota um açúcar farmaceuticamente aceitável usado em uma quantidade de cerca de 25 mM a cerca de 500 mM. É preferencial 100 a 300 mM. É mais preferencial 220 a 260 mM. O mais preferencial é 240 mM. Açúcares adequados compreendem mas não estão limitados a monossacarídeos e disacarídeos. Exem plos não limitantes de açúcares de acordo com a invenção incluem trealose, sacarose, manitol, sorbitol, lactose, glicose, manose, maltose, galactose, frutose, sorbose, rafinose, glucosamina, N-Metilglucosamina (denominada "Meglumine"), galactosamina e ácido neuramínico e combinações dos mesmos. O mais preferencial é trealose.
[00057] O termo "estabilizante" se refere a estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, como, por exemplo, mas não limitados a aminoácidos e açúcares conforme descrito nas seções acima bem como dextranos de qualquer tipo e peso molecular disponíveis comercialmente como sabido na técnica.
[00058] O termo "antioxidante" denota um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Isto pode incluir excipientes tais como metionina, álcool benzílico ou qualquer outro excipiente usado para minimizar oxidação.
[00059] O termo "um método de tratar" ou seu equivalente, quando aplicado a, por exemplo, câncer se refere a um procedimento ou curso de ação que é designado para reduzir ou eliminar o número de células de câncer em um paciente, ou aliviar os sintomas de um câncer. "Um método de tratar" câncer ou outro distúrbio proliferativo não significa necessariamente que as células cancerígenas ou outro distúrbio serãoeliminados, de fato, que o número de células ou distúrbio, de fato, será reduzido, ou que os sintomas de um câncer ou outro distúrbio, de fato, será aliviado. Frequentemente, um método de tratar câncer será realizado mesmo com uma baixa probabilidade de sucesso, mas o qual, dado o histórico médico e expectativa de sobrevida estimada de um paciente, não obstante é considerado que induz um curso de ação benéfico global.
[00060] Em um aspecto, a invenção se refere a uma formulação de anticorpos anti-CD20 compreendendo:-cerca de 1 a cerca de 150 mg/ml de anticorpo anti-CD20,- cerca de 0,001 a cerca de 1% de no mínimo um tensoativo, e- cerca de 1 a cerca de 100 mM de um tampão,- em um pH de cerca de 4,5 a cerca de 7,0.
[00061] Em uma modalidade mais preferencial a formulação de acordo com a invenção compreende:- cerca de 1 a cerca de 150 mg/mL de anticorpo anti-CD20,- cerca de 0,005 a cerca de 0,05 % de no mínimo um tensoativo, e- cerca de 1 a cerca de 100 mM de um tampão,- em um pH de cerca de 4,5 a cerca de 7,0.
[00062] Em uma modalidade preferencial, a formulação de acordo com a invenção compreende:- cerca de 10 a cerca de 30 mg/mL de um anticorpo anti- CD20 tipo II,- 20 mM de L-histidina,- 240 mM de trealose, e- 0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume, -em um pH de cerca de 6.
[00063] Em ainda outra modalidade preferencial, a formulação de acordo com a invenção compreende:- cerca de 10 a cerca de 30 mg/mL de um anticorpo anti- CD20 tipo II,- 0,02% de Poloxamer188® em peso/ volume,- 20 mM de L-histidina, e- 240 mM de trealose,- em um pH de cerca de 6.
[00064] Preferencialmente, o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo tipo I. Mais preferencialmente, o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo tipo II. Ainda mais preferencial, o anticorpo anti-CD20 é um "anticorpo B-Ly1 humanizado" conforme revelado em detalhes na patente internacional N° WO2005/ 044859. O mais preferencialmente, oanticorpo é HuMab<CD20>. A formulação compreende 1 a cerca de 150 mg/ml do referido anticorpo, mais preferencial cerca de 5 a cerca de 100 mg/ml do referido anticorpo, ainda mais preferencial cerca de 10 a cerca de 30 mg/ml do referido anticorpo, ou selecionado entre o grupo de cerca de 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 mg/ml do referido anticorpo, e o mais preferencialmente 25 mg/ml do referido anticorpo.
[00065] A formulação de acordo com a invenção pode estar em uma forma líquida, em uma forma liofilizada ou em uma forma líquida reconstituída a partir de uma forma liofilizada.
[00066] Em uma modalidade a formulação de acordo com a invenção é uma formulação liofilizada. A formulação liofilizada de acordo com a invenção tem a vantagem de uma aprimorada estabilidade com respeito à formação de particulados e agregados de maior peso molecular que é geralmente difícil de ser obtida com formulações líquidas na mesma concentração do anticorpo anti-CD20 descrito.
[00067] A formulação de acordo com a invenção pode ser administrada por meios de administração intravenosa (i.v.), subcutânea (s.c.) ou quaisquer outros meios de administração parental tais como os conhecidos na técnica farmacêutica.
[00068] Além disso, uma formulação de acordo com a invenção pode compreender conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; agentes quelantes tais como EDTA; contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína).
[00069] Os ingredientes ativos também podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interracial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. As técnicas referidas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[00070] Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos modelados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou álcool poli(vinílico)), polilactidas (patente dos Estados Unidos N° US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamate, etileno-vinil acetato não degradáveis, copolímeros degradáveis de ácido láctico- ácido glicólico tais como o LUPRON DEPOT® (microsferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico - ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico.
[00071] As formulações a serem usadas para administração em vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[00072] Preferencialmente, a formulação da invenção compreende um ou mais agentes de isotonicidade em uma quantidade de cerca de 5 mM a cerca de 350 mM conforme definido acima.
[00073] Preferencialmente, a formulação da invenção compreende um açúcar em uma quantidade de cerca de 25 mM a cerca de 500 mM conforme definido acima.
[00074] Preferencialmente também, a formulação da invenção adicionalmente compreende um ou mais dos seguintes ingredientes: antioxidantes, ácido ascórbico, Glutathion, conservantes, por exemplo, m-cresol, fenol, álcool benzílico, metilparabeno, propilparabeno, clorbutanol, thiomersal, cloreto de benzalcônio, polietileno glicol, por exemplo, PEG 3000, 3350, 4000, 6000, albumina, albumina sérica humana (HSA), albumina sérica bovina (BSA), álcool polihídrico, glicerol, etanol, manitol, sais, sais de acetato (por exemplo, acetato de sódio), cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, trometamina, EDTA, (por exemplo, Na-EDTA).
[00075] Preferencialmente também, a formulação da invenção adicionalmente compreende um ou mais estabilizantes conforme definido acima e ingredientes também conhecidos na técnica como "lioprotetores" tais como açúcares, álcoois de açúcares, aminoácidos e dextranos conforme sabido na técnica.
[00076] Em uma determinada modalidade, a formulação da invenção compreende as seguintes formulações, quer no líquido, líquido liofilizada ou reconstituído a partir de formas liofilizadas:15 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,01% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e140 mM de cloreto de sódio,em pH 6,0; ou10 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,01% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e140 mM de cloreto de sódio,em pH 6,0; ou15 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,Opcionalmente 0,001 a 1% em peso/ volume de um tensoativo, 20 mM de L-histidina,em pH 6,0; ou10 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,02% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,01% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou 25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,1% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,02% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,1% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de Acetato, e240 mM de trealose,em pH 5,5; ou25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,1% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de Acetato, e140 mM de cloreto de sódio,em pH 5,5; ou30 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,01% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e200 mM de trealose, em pH 6,5;
[00077] Em uma modalidade preferencial da formulação de acordo com a invenção, a formulação está em uma forma liofilizada e compreende depois de reconstituição com a quantidade apropriada de água para injeção:10 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose, em pH 6,0;
[00078] Esta formulação apresenta uma boa estabilidade no armazenamento em 2 a 8°C e 25° com adequada estabilidade com respeito a desfechos físicos tais como agregação e desfechos químicos tais como fragmentação.
[00079] Em uma modalidade preferencial da formulação de acordo com a invenção, a formulação está em uma forma líquida:25 mg/mL de um anticorpo anti CD20 tipo II, preferencialmente um anticorpo B-Ly1 humanizado, o mais preferencialmente HuMab<CD20>,0,02% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose, em pH 6,0;
[00080] Em uma modalidade preferencial, a formulação é útil para prevenir ou reduzir metástase ou disseminação adicional em um paciente semelhante sofrendo de câncer expressando CD20. A formulação é útil para aumentar a duração da sobrevida de um paciente semelhante, aumentando a sobrevida livre de progressão de um paciente semelhante, aumentando a duração da resposta, resultando em uma melhora estatisticamente significativa e clinicamente significativa do paciente tratado conforme medido pela duração da sobrevida, sobrevida livre de progressão, taxa de resposta ou duração da resposta. Em uma modalidade preferencial, a formulação é útil para aumentar a taxa de resposta em um grupo de pacientes.
[00081] No contexto desta invenção, outros agentes adicional citotóxicos, quimioterápicos ou anticancerígenos, ou compostos que reforçam os efeitos de semelhantes agentes podem ser usados em combinação com a formulação de anticorpos anti-CD20 de acordo com a invenção.
[00082] Os agentes referidos incluem, por exemplo: agentes alquilantes ou agentes com uma ação alquilante, tais como ciclofosfamida (CTX; por exemplo, cytoxan®), clorambucil (CHL; por exemplo, leukeran®), cisplatina (CisP; por exemplo, platinol®) bussulfan (por exemplo, myleran®), melfalan, carmustina (BCNU),estreptozotocina, trietileno melamina (TEM), mitomicina C, e semelhantes; antimetabólitos, tais como metotrexato (MTX), etoposídeo (VP16; por exemplo, vepesid®), 6-mercaptopurina (6MP), 6-tiocguanina (6TG), citarabina (Ara-C), 5-fluorouracila (5-FU), capecitabina (por exemplo, Xeloda®), dacarbazina (DTIC), e similares; antibióticos, tais como actinomicina D, doxorubicina (DXR; por exemplo, adriamycin®), daunorubicina (daunomicina), bleomicina, mitramicina e similares; alcalóides, tais como vinca alcalóides tais como vincristina (VCR), vinblastina, e semelhantes; e outros agentes antitumorais, tais como paclitaxel (por exemplo, taxol®) e derivados de paclitaxel, os agentes citostáticos, glicocorticóides tais como dexametasona (DEX; por exemplo, decadron®) e corticosteróides tais como prednisona, inibidores enzimáticos de nucleosídeos tais como hidroxiureia, enzimas de depleção de aminoácidos tais como asparaginase, leucovorin e outros derivados do ácido fólico, e agentes antitumorais similares, diversos. Os seguintes agentes também podem ser usados como agentes adicionais: arnifostina (por exemplo, ethyol®), dactinomicina, mecloretamina (nitrogen mustard),estreptozocina, ciclofosfamida, lomustina (CCNU), lipo doxorubicina (por exemplo, doxil®), gencitabina (por exemplo, gemzar®), lipo daunorubicina (por exemplo, daunoxome®), procarbazina, mitomicina, docetaxel (por exemplo, taxotere®), aldesleucina, carboplatina, oxaliplatina, cladribina, camptotecina, CPT 11 (irinotecano), 10-hidroxi 7-etil-camptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina, ifosfamida, idarubicina, mesna, beta interferon, alfa interferon, mitoxantrona, topotecano, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotane, pegaspargase, pentostatina, pipobroman, plicamicina, tamoxifeno, teniposídeo, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vinorelbina, clorambucila. Preferencialmente o tratamento com a combinação de anticorpos anti-CD20 é usado sem os agentes adicionais referidos.
[00083] O uso dos agentes citotóxicos e anticancerígenos descritos acima bem como fármaco anticancerígeno específico de alvo antiproliferativo como inibidores de proteína quinase em regimes quimioterápticos é geralmente bem caracterizado nas técnicas de terapia de câncer, e seu uso aqui, neste requerimento de patente, é de acordo com as mesmas considerações para monitorar tolerância e eficácia e para controlar as vias de administração e dosagens, com alguns ajustes. Por exemplo, as dosagens reais dos agentes citotóxicos podem variar dependendo da cultura da reação celular do paciente determinada usando métodos de histocultura. Geralmente, a dosagem será reduzida comparada com a quantidade usada na ausência de outros agentes adicionais.
[00084] Dosagens típicas de um agente citotóxico eficaz podem estar nas faixas recomendadas pelo fabricante, e onde indicado por reações in vitro ou reações em modelos animais, podem ser reduzidas por até cerca de uma ordem de magnitude de concentração ou quantidade. Portanto, a dosagem real dependerá do critério do médico, da condição do paciente, e da eficácia do método terapêutico baseada na responsividade in vitro das células malignas cultivadas primárias ou amostra de tecido de histocultura, ou as reações observadas nos modelos animais apropriados.
[00085] No contexto desta invenção, uma quantidade eficaz de radiação ionizante pode ser carregada e/ou um radiofármaco pode ser usado além da formulação de anticorpos anti-CD20 de acordo com a invenção. A fonte de radiação pode ser quer externa ou interna ao paciente sendo tratado. Quando a fonte é externa ao paciente, a terapia é conhecida como terapia de radiação de feixe externo (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna ao paciente, o tratamento é denominado braquiterapia (BT). Átomos radioativos para uso no contexto desta invenção podem ser selecionados entre o grupo incluindo, mas não limitado a, rádio, césio-137, irídio-192, amerício- 241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo-131, e índio-111. Também é possível marcar o anticorpo com os isótopos radioativos referidos. Preferencialmente a formulação de anticorpos anti-CD20 de acordo com a invenção é usada sem a radiação ionizante referida.
[00086] Terapia de radiação é um tratamento-padrão para controlar tumores não ressectáveis ou inoperáveis e/ou metástases tumorais. Foram vistos resultados aprimorados quando terapia com radiação foi combinada com quimioterapia. Terapia de radiação se baseia no princípio de que alta dose de radiação liberada em uma área-alvo resultará na morte de células reprodutivas tanto em tecidos tumorais quanto em tecidos normais. O regime de dosagem de radiação geralmente é definido em termos de dose de radiação absorvida (Gy), tempo e fracionamento, e deve ser cuidadosamente definido pelo oncologista. A quantidade de radiação que um paciente recebe dependerá de várias considerações, mas as duas mais importantes são a localização do tumor em relação a outras estruturas cruciais ou órgãos do corpo, e a extensão na qual o tumor se expandiu. Um curso de tratamento típico para um paciente submetido a terapia de radiação será um esquema de tratamento durnate um período de 1 a 6 semanas, com uma dose total de entre 10 e 80 Gy administrada ao paciente em uma única fração diária de cerca de 1,8 a 2,0 Gy, 5 dias por semana. Em uma modalidade preferencial desta invenção há sinergia quando tumores em pacientes humanos são tratados com a formulação de acordo com a invenção e radiação. Em outras palavras, a inibição de crescimento tumoral por meio dos agentes compreendendo a combinação da invenção é reforçada quando combinada com radiação, opcionalmente com agentes quimioterápicos ou anticancerígenos adicionais. Parâmetros de terapias de radiação adjuvantes estão contidos, por exemplo, na patente internacional N° WO 99/60023.
[00087] A formulação de anticorpos é administrada a um paciente de acordo com métodos conhecidos, por administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, ou intratecal. É preferencial administração intravenosa ou subcutânea dos anticorpos.
[00088] A invenção adicionalmente compreende um kit caracterizado em compreender um recipiente, uma composição dentro do recipiente compreendendo a referida formulação do anticorpo anti- CD20, e uma bula do pacote instruindo o usuário da formulação a administrar a referida formulação do anticorpo anti-CD20 a um paciente sofrendo de câncer expressando CD20.
[00089] O termo "bula" se refere a instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, as quais podem incluir informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso de semelhantes produtos terapêuticos.
[00090] Em uma modalidade preferencial, o artigo de recipientes de fabricação pode incluir adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. O artigo de fabricação pode incluir adicionalmente um diluente estéril, o qual é preferencialmente armazenado em um recipiente adicional separado.
[00091] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um "veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluir qualquer e todo material compatível com administração farmacêutica incluindo solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e outros materiais e compostos compatíveis com administração farmacêutica. Exceto na medida que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, é contemplado o uso do mesmo nas composições da invenção. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00092] Em ainda outra modalidade da invenção, a formulação de acordo com a invenção compreende um anticorpo anti-CD20 tipo I o qual está na que é coadministrada com um anticorpo anti-CD20 tipo II de acordo com a invenção. As formulações de acordo com a invenção podem ser duas formulações separadas para cada um dos anticorpos anti-CD20. Alternativamente a formulação aqui, neste requerimento de patente, também pode conter ambos os anticorpos em uma formulação.
[00093] Em ainda outra modalidade da invenção, a formulação de acordo com a invenção compreende um anticorpo anti-CD20 em que o referido anticorpo anti-CD20 é coadministrado com um agente ativo anti-Bcl-2. O termo "Bcl-2" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à proteína Bcl-2 (Swiss Prot ID N° P10415), um membro da família de proteínas Bcl-2. O termo "agente ativo anti-Bcl- 2" compreende "nucleotídeos antissentido anti-Bcl-2" e "inibidores de Bcl-2". Os "nucleotídeos antissentido anti-Bcl-2" regulam para baixo os níveis de Bcl-2 mRNA e reduzem a expressão de proteína Bcl-2. Exemplos de semelhantes nucleotídeos antissentido anti-Bcl-2 incluem Oblimersen e SPC-2996. ABT-737 conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, significa N-[4-[4-(4'-Clorobifenil-2- ilmetil)piperazin-1-il]benzoil]-3-[3-(dimetilamino)-1(R)-(fenilsulfanil- metil)propilamino]-4-nitrobenzenossulfonamida; 4-[4-(4'-Clorobifenil-2- ilmetil)piperazin-1-il]-N-[3-[3-(dimetilamino)-1(R)-(fenilsulfanilmetil)pro- pilamino]-4-nitrofenilsulfonil]benzamida, um inibidor de Bcl-2, o qual é descrito na patente internacional N° WO 2006/099667 ou Corey, S., et al., Cancer Cell (2005) 5-6. BT-263 conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, significa um inibidor de Bcl-2, o qual é descrito na patente dos Estados Unidos N° US 2007027135.Preferencialmente o agente ativo anti-Bcl-2 é selecionado entreOblimersen, SPC-2996, TA-402, Gossypol, AT-101, mesilato deObatoclax, A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-Metoxiantimicina A3, HA-14-1, KF-67544,Purpurogallin, TP-TW-37, YC-137 e Z-24. Preferencialmente o agente ativo anti-Bcl-2 é um inibidor de ligação de proteína Bcl-2 com uma IC50 da atividade inibitória anti-Bcl-2 de 5 μM ou menos. O inibidor de ligação de proteína Bcl-2 é preferencialmente selecionado entre Gossypol, AT-101, mesilato de Obatoclax, ABT-263 e ABT-737, mais preferencialmente entre ABT-263 ou ABT-737.
[00094] Em ainda outra modalidade da invenção, a formulação de acordo com a invenção compreende um anticorpo anti-CD20 em que o referido anticorpo anti-CD20 é coadministrado com um inibidor do proteassoma. O termo "inibidor do proteassoma" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a agentes os quais inibem a atividade do proteassoma 26S. Os inibidores do proteassoma referidos incluem entre outros, por exemplo, derivados de peptídeos tais como aldeídos de peptídeos (por exemplo, MG132, MG115, CEP-1615, PSI, ou inibidor imunoproteassoma específico IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N- carbobenzilóxi-leucil-norleucinal, vide a patente dos Estados Unidos N° US 2006/0241056), boronatos de peptídeos (por exemplo, bortezomib (PS-341) ou DFLB), epoxicetonas de peptídeos (por exemplo, epoxomicina, diidroeponemicina, ou derivado de epoxomicina carfilzomib (PR-171)), ou vinil sulfonas de peptídeos (por exemplo, NLVS) e derivados não peptídicos tais como salinosporamida A (NPI- 0052), derivados de salinosporamida A, lactacistina ou derivados de lactacistina (por exemplo, clasto-lactacistina-L-lactona (omuralida) ou PS-519). Os diferentes tipos e estruturas dos referidos inibidor do proteassomas são descritos, por exemplo, em Kisselev, A.L., et al., Chem Biol (2001) 739-758, patente internacional N° WO 2004/004749 e Joazeiro, C., et al., Res 66(16) (2006) 7840-7842), Kanagasabaphy, et al., Curr Opin Investig Drugs 8 (2007)447-51, Adams, J., Nat Rev Cancer 4 (2004) 349-360 e a patente dos Estados Unidos N° US 20060241056.
[00095] Preferencialmente o inibidor do proteassoma é selecionado entre aldeídos de peptídeos (preferencialmente N-carbobenzilóxi- leucil-norleucinal (IPSI-001)), boronatos de peptídeos(preferencialmente bortezomib (PS-341)), epoxicetonas de peptídeos (preferencialmente derivado de epoxomicina carfilzomib (PR-171)), ou salinosporamida A (NPI-0052). Mais preferencialmente o inibidor do proteassoma é selecionado entre bortezomib (PS-341), carfilzomib (PR-171), salinosporamida A (NPI-0052) ou N-carbobenzilóxi-leucil- norleucinal (IPSI-001).
[00096] Em uma modalidade preferencial o inibidor do proteassoma é um derivado peptídico selecionado entre aldeídos de peptídeos (preferencialmente N-carbobenzilóxi-leucil-norleucinal (IPSI-001)), boronatos de peptídeos (preferencialmente bortezomib (PS-341)) ou epoxicetonas de peptídeos. Em outra modalidade preferencial o inibidor do proteassoma é um boronato de peptídeo (preferencialmente bortezomib (PS-341); vide, por exemplo, Adams, Cur. Opin. Chem Biol. 6 (2002) 493-500 e a patente dos Estados Unidos N°US 5.780.454)).
[00097] Preferencialmente o inibidor do proteassoma tem uma IC50 da atividade inibitória antiproteassoma de 5 μM ou menos, mais preferencialmente de 1 μM ou menos. Uma Prova Celular para identificar inibidores de proteassoma semelhantes e para a determinação da IC50 da atividade inibitória antiproteassoma (através de diluições seriais e cálculo usando um ajuste de curva não linear (software XLfit (ID Business Solution Ltd., Guilford, Surrey, Reino Unido)) é descrita em Moravec, et al., Cell Notes 15 (2006) 4-7 usando reagente de teste celular Proteasome-Glo™ Cell-Based Assay Reagent da Promega com células U266 (mieloma plasmático humano). Esta prova "add-mix-measure" mede a atividade de protease semelhante a quimotripsina associada com o proteassoma em células cultivadas.
[00098] Além de IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-carbobenzilóxi-leucil- norleucinal) também os seguintes derivados peptídicos da patente dos Estados Unidos N° US 2006/0241056 são inibidores de proteassoma preferenciais: N-carbobenzilóxi-homofenilalanil-fenilalanilal, N-carbobenzilóxi-leucil-fenilalanilal, N-carbobenzilóxi-alanil-fenilalanilal, N-carbobenzilóxi-glicil-prolil-alanil-fenilalanilal, N-carbobenzilóxi-glicil- prolil-fenilalanil-fenilalanilal, N-carbobenzilóxi-glicil-fenilalanil-fenilalanilal, ácido borônico de N-carbobenzilóxi-leucil-norleucina, ácido borônico de N-carbobenzilóxi-fenilalanil-fenilalanina, ácido borônico de N-carbobenzilóxi-homofenilalanil-fenilalanina, ácido borônico de N-carbobenzilóxi-leucil-fenilalanina, ácido borônico de N- carbobenzilóxi-glicil-prolil-alanil-fenilalanina, ácido borônico de N- carbobenzilóxi-glicil-prolil-fenilalanil-fenilalanina, ácido borônico de N- carbobenzilóxi-leucil-leucil-fenilalanina, ácido borônico de N- carbobenzilóxi-glicil-fenilalanil-fenilalanina, metil vinil sulfona de N- carbobenzilóxi-leucil-norleucina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi- fenilalanil-fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi- homofenilalanil-fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi- leucil-fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi-alanil- fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi-glicil-prolil-alanil- fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi-glicil-prolil- fenilalanil-fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi-leucil- leucil-fenilalanina, metil vinil sulfona de N-carbobenzilóxi-glicil- fenilalanil-fenilalanina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-leucil- norleucina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-fenilalanil-fenilalanina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-homofenilalanil-fenilalanina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-leucil-fenilalanina, epóxi cetona de N- carbobenzilóxi-alanil-fenilalanina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi- glicil-prolil-alanil-fenilalanina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-glicil- prolil-fenilalanil-fenilalanina, epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-leucil- leucil-fenilalanina, e epóxi cetona de N-carbobenzilóxi-glicil-fenilalanil- fenilalanina.
[00099] Os seguintes exemplos e números são proporcionados para ajudar no entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro âmbito é determinado nas reivindicações anexadas. Entende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos determinados sem se afastar do espírito da invenção.EXEMPLOSExemplo 1
[000100] Foram preparadas as seguintes formulações, quer no líquido, líquido liofilizado ou reconstituído a partir de formas liofilizadas:15 mg/mL de HuMab<CD20>,0,01% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e140 mM de cloreto de sódio,em pH 6,0;10 mg/mL de HuMab<CD20>,0,01% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e140 mM de cloreto de sódio,em pH 6,0;15 mg/mL de HuMab<CD20>,20 mM de L-histidina,em pH 6,0;10 mg/mL de HuMab<CD20>,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0;25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume, 20 mM de L-histidina, e 240 mM de trealose, em pH 6,0.
[000101] Também foi preparada uma forma liofilizada a qual compreende depois de reconstituição com a quantidade apropriada de água para injeção:10 mg/mL de HuMab<CD20>,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose, em pH 6,0;
[000102] Esta formulação mostra uma boa estabilidade em armazenamento em 2 a 8°C e 25° com adequada estabilidade com respeito a desfechos físicos tais como agregação e desfechos químicos tais como fragmentação.
[000103] Formulações de produtos de fármacos líquidos e liofilizados para administração parenteral de acordo com a invenção foram desenvolvidos como se segue:Preparação de Formulações Líquidas.
[000104] Formulações de HuMab<CD20> foram preparadas por homogenização de soluções de HuMab<CD20> no tampão de produção (por exemplo, 20 mM de tampão de histidina em pH de cerca de 6,0 ou 20 mM de tampão de histidina em pH de cerca de 6,0 contendo 140 mM de cloreto de sódio e 0,01% (em peso/ volume) de polissorbato 20). Formulações de HuMab<CD20> também podem ser preparadas ajustando a concentração de proteína à concentração desejada por diluição com tampão. Excipientes para estabilizar a proteína e para ajuste da tonicidade foram adicionados conforme requerido e podem ser adicionados em forma dissolvida ou alternativamente como sólido. Tensoativo foi adicionado às formulações como uma solução de matéria-prima conforme requerido. Todas as formulações foram filtradas estéreis através de filtros de 0,22 μm e divididas em alíquotas asseticamente para dentro de frascos de vidro estéreis e fechados com rolhas de borracha e tampas de alucrimp. Estas formulações foram armazenadas em diferentes temperaturas por diferentes intervalos de tempo e removidas para análise nos momentos indicados nos parágrafos individuais. As formulações foram analisadas 1) por espectrofotometria UV, 2) por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC), 3) para partículas visíveis e subvisíveis, 4) por cromatografia de permuta iônica (IEC) e 5) por turbidez da solução.Preparação de Formulações Liofilizadas.
[000105] Soluções de HuMab<CD20> ou foram preparadas conforme descrito acima para formulações líquidas, ou fabricadas por homogenização de soluções de HuMab<CD20> de HuMab<CD20> em 20 mM de tampão de histidina em pH de cerca de 6,0, contendo um açúcar e um tensoativo. Todas as formulações foram esterilizadas por filtração através de filtros de 0,22 μm e divididas em alíquotas asseticamente para dentro de frascos de vidro estéreis. Os frascos foram fechados parcialmente com rolhas de borracha adequadas para o uso em processos de liofilização e transferidos para a câmara de secagem do liofilizador. Pretende-se que qualquer método de liofilização conhecido na técnica esteja dentro do âmbito da invenção. Por exemplo, o processo de liofilização usado para este estudo incluiu o resfriamento da formulação a partir da temperatura ambiente até cerca de 5°C (pré-resfriamento) seguido por um congelamento a -40°C (Congelamento I) em uma taxa de ascensão de cerca de 1°C/min a 5°C/min. A primeira etapa de secagem pode ocorrer em uma taxa de ascensão de 0,3 a 0,5°C/min a partir de -40°C até -30°C e em seguida mantida a -30°C por no mínimo 50 horas em uma pressão de câmara de cerca de 75 a 80 mTorr. Uma segunda etapa de secagem pode ocorrer em uma taxa de ascensão de 0,1 a 0,3°C/min a partir de -30°C até 25°C e mantida a 25°C por no mínimo 5 horas em uma pressão de câmara de cerca de 6,67 a 10,66 Pa (50 a 80 mTorr) (o esquema de secagem aplicado é proporcionado na Tabela 1). Foi visto que a formulações de HuMab<CD20> as quais foram secas usando os processos de liofilização descritos têm tempos de reconstituição convenientemente rápidos de cerca de 2 a 3 minutos. Todas as tortas liofilizadas neste estudo tiveram um teor de água residual de cerca de 0,1 a 1,0% conforme determinado pelo método de Karl-Fischer. Os frascos liofilizados foram armazenados em diferentes temperaturas por diferentes intervalos de tempo. As formulações liofilizadas foram reconstituídas com o volume respectivo de água para injeção (WFI) antes de 1) análise por espectrofotometria UV, 2) determinação do tempo de reconstituição, 3) análise por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) 4) por cromatografia de permuta iônica (IEC), 5) determinação de partículas subvisíveis e visíveis e 6) por turbidez da solução.
[000106] Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi realizada para detectar espécies solúveis de alto peso molecular (agregados) e produtos de hidrólise de baixo peso molecular nas formulações. O método usou um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector UV (comprimento de onda de detecção de 280 nm) e uma coluna Zorbax GF-250 ( 9,4 x 250 mm, Agilent); o método usou 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0 como fase móvel.
[000107] Cromatografia de Permuta Iônica (IEC) foi realizada para detectar produtos de degradação química alterando a carga líquida de HuMab<CD20> nas formulações. O método usou um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector UV (comprimento de onda de detecção de 220 e 280nm) e uma coluna Dionex ProPac WCX-10 ( 4 mm x 250 mm). 10 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,0 em H20 e 10 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,0 + 0,75 M de NaCl foram usados como fases móveis A e B, respectivamente, com uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min.
[000108] A espectroscopia UV para determinação da concentração de proteína foi realizada sobre um espectrofotômetro UV Varian Cary Bio a 280 nm.
[000109] Para a determinação da turbidez, a opalescência foi medida em FTU (unidades de turbidez) usando um turbidímetro HACH 2100AN em temperatura ambiente.
[000110] As amostras foram analisadas para partículas subvisíveis usando um HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), e para partículas visíveis usando um instrumento de inspeção visual Seidenader V90-T. Tabela 1: Ciclo de Secagem por Congelamento
Figure img0001
[000111] Dados da estabilidade de formulações de produtos defármacos de HuMab<CD20> líquidas de acordo com esta invenção
[000112] Formulação 15 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L-histidina, pH 6,0,
Figure img0002
Figure img0003
n/d: não determinado
[000113] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000114] Formulação 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L-histidina, 240 mM de trealose, 0,02% em peso/ volume de Polissorbato20, pH 6,0,
Figure img0004
n/d = não determinado
[000115] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000116] Dados da estabilidade de formulações de produtos de fármacos de huMAb<CD20> liofilizadas de acordo com esta invenção
[000117] Formulação 10 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L-histidina, 240 mM de trealose, 0,02% em peso/ volume de Polissorbato 20, pH 6,0,
Figure img0005
n/d = não determinado
[000118] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipienteExemplo 2
[000119] Foram preparadas as seguintes formulações, quer no líquido, líquido liofilizado ou reconstituído a partir de formas liofilizadas:25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,02% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,01% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0; ou25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,1% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e 240 mM de trealose, em pH 6,0; ou25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,02% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose, em pH 6,0; ou25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,1% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de Acetato, e240 mM de trealose, em pH 5,5; ou25 mg/mL de HuMab<CD20>,0,1% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de Acetato, e140 mM de cloreto de sódio,em pH 5,5; ou30 mg/mL de HuMab<CD20>,0,01% de Poloxamer188® em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e200 mM de trealose, em pH 6,5;
[000120] Formulações de produtos de fármacos líquidos e liofilizados para administração parenteral foram preparadas como se segue: Preparação de Formulações Líquidas
[000121] Formulações de HuMab<CD20> foram preparadas por homogenização de soluções de HuMab<CD20> no tampão de produção (por exemplo, 20 mM de tampão de histidina em pH de cerca de 6,0 contendo 240 mM de trealose e 0,02% (em peso/ volume) de Poloxamer188®). Formulações de HuMab<CD20> também podem ser preparadas por diafiltração de soluções de cerca de 10 a 40 mg/ml de HuMab<CD20> no tampão de produção (por exemplo, 20 mM de tampão de histidina em pH de cerca de 6,0) por filtração de fluxo tangencial (TFF) para aumentar a concentração de proteína acima da concentração de proteína alvo e para permutar tampão. Formulações de HuMab<CD20> também podem ser preparadas ajustando a concentração de proteína para a concentração desejada por diluição com tampão. Excipientes para estabilizar a proteína e para ajuste da tonicidade podem ser adicionadas em forma dissolvida ou alternativamente como sólido. Tensoativo foi adicionado às formulações como uma solução de matéria-prima conforme requerido. Todas as formulações foram filtradas estéreis através de filtros de 0,22 μm e divididas em alíquotas asseticamente para dentro de frascos de vidro estéreis e fechados com rolhas de borracha e tampas de alucrimp. Estas formulações foram armazenadas em diferentes temperaturas por diferentes intervalos de tempo e removidas para análise nos momentos indicados nos parágrafos individuais. As formulações foram analisadas 1) por espectrofotometria UV, 2) por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC), 3) para partículas visíveis e subvisíveis, 4) por Cromatografia de permuta Iônica (IEC) e 5) por turbidez da solução.
Preparação de Formulações Liofilizadas
[000122] Soluções de <CD20> foram preparadas conforme descrito acima para formulações líquidas. Todas as formulações foram filteradas estéreis através de filtros de 0,22 μm e divididas em alíquotas asseticamente para dentro de frascos de vidro estéreis. Os frascos foram parcialmente fechados com rolhas de borracha adequadas para o uso em processos de liofilização e transferidos para a câmara de secagem do liofilizador. Pretende-se que qualquer método de liofilização conhecido na técnica esteja dentro do âmbito da invenção. Por exemplo, o processo de liofilização usado para este estudo incluiu o resfriamento da formulação a partir da temperatura ambiente até cerca de 5°C (pré-resfriamento) seguido por um congelamento a -40°C (Congelamento I) em uma taxa de ascensão de cerca de 1°C/min a 5°C/min. A primeira etapa de secagem pode ocorrer em uma taxa de ascensão de 0,3 a 0,5°C/min a partir de -40°C a -30°C e em seguida mantida a -30°C por no mínimo 50 horas em uma pressão de câmara de cerca de 75 a 80 mTorr. Uma segunda etapa de secagem pode ocorrer em uma taxa de ascensão de 0,1 a 0,3°C/min a partir de -30°C a 25°C e mantida a 25°C por no mínimo 5 horas em uma pressão de câmara de cerca de 6,67 a 10,66 Pa (50 a 80 mTorr) (o esquema de secagem aplicado é proporcionado na Tabela 1). Foi visto que as formulações de HuMab<CD20> as quais foram secas usando os processos de liofilização descritos têm um teor de água residual de cerca de 0,1 a 1,0% conforme determinado pelo método de Karl-Fischer. Os frascos liofilizados foram armazenados em diferentes temperaturas por diferentes intervalos de tempo. As formulações liofilizadas foram reconstituídas com o respectivo volume de água para injeção (WFI) antes de 1) análise por espectrofotometria UV, 2) análise por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) 3) por Cromatografia de permuta iônica (IEC), 4) determinação de partículas subvisíveis e visíveis e 5) pela turbidez da solução.
[000123] Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi realizada para detectar espécies solúveis de alto peso molecular (agregados) e produtos de hidrólise de baixo peso molecular nas formulações. O método usou um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector UV (comprimento de onda de detecção 280 nm) e ou uma coluna Zorbax GF-250 ( 9,4 x 250 mm, Agilent) ou um TSKgel G3000 SWXL (7,8x300 mm); o método usou ou 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0 ou 250 mM de cloreto de potássio em 200 mM de fosfato de potássio pH 7,0 como fase móvel.
[000124] Cromatografia de Permuta Iônica (IEC) foi realizada para detectar produtos de degradação química alterando a carga líquida de HuMab<CD20> nas formulações. O método usou um instrumento de HPLC adequado equipado com um detector de UV (comprimento de onda de detecção de 220 e 280 nm) e uma coluna Dionex ProPac WCX-10 ( 4 mm x 250 mm). 10 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,0 em H20 e 10 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,0 + 0,75 M de NaCl foram usados como fases móveis A e B, respectivamente, com uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min.
[000125] A espectroscopia UV para determinação da concentração de proteína foi armazenada sobre um Varian Cary Bio ou um espectrofotômetro Perkin Elmer UV a 280 nm.
[000126] Para a determinação da turbidez, a opalescência foi medida em FTU (unidades de turbidez) usando um turbidímetro HACH 2100AN em temperatura ambiente.
[000127] As amostras foram analisadas para partículas subvisíveis usando um HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), e para partículas visíveis usando um instrumento de inspeção visual Seidenader V90-T. Tabela 1: Ciclo de Secagem por Congelamento
Figure img0006
[000128] Dados de estabilidade de formulações de produtos defármacos de HuMab<CD20> líquidas
[000129] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L- histidina, 240 mM de trealose, 0,02% em peso/ volume dePoloxamer188®, pH 6,0,
Figure img0007
[000130] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm/ recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000131] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L- histidina, 240 mM de trealose, 0,01% em peso/ volume dePoloxamer188®, pH 6,0,
Figure img0008
n/a: não analisado
[000132] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000133] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L- histidina, 240 mM de trealose, 0,1% em peso/ volume dePoloxamer188®, pH 6,0,
Figure img0009
n/a: não analisado
[000134] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000135] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM deAcetato, 240 mM de trealose, 0,1% em peso/ volume de Polissorbato 80, pH 5,5,
Figure img0010
n/a: não analisado
[000136] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000137] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM deAcetato, 140 mM de cloreto de sódio, 0,1% em peso/ volume dePolissorbato 80, pH 5,5,
Figure img0011
n/a: não analisado
[000138] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000139] Formulação 30 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L- histidina, 200 mM de trealose, 0,01% em peso/ volume dePoloxamer188®, pH 6,5,
Figure img0012
[000140] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000141] Dados de estabilidade de formulações de produtos de fármacos de huMAb<CD20> liofilizadas
[000142] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L- histidina, 240 mM de trealose, 0,02% em peso/ volume de Poloxamer188®
Figure img0013
[000143] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm /recipiente, max 600 partículas >25 μm /recipiente
[000144] Formulação 25 mg/mL de HuMab<CD20>, 20 mM de L- histidina, 240 mM de trealose, 0,02% em peso/ volume de Polissorbato 80, pH 6,0,
Figure img0014
n/a: não analisado
[000145] Passam: livre a essencialmente livre de partículas visíveis, max 6000 partículas >10 μm/recipiente, max 600 partículas >25 μm/recipiente.

Claims (5)

1. Formulação, caracterizada pelo fato de que está em uma forma liofilizada e compreende:mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1 compreendendo VH B-HH6 com a seguinte sequênciaQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR QAPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTrrADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSeVL B-KV1com a seguinte sequênciaDTVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWY LQKPGQSPQLUYQMSNLySGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS R VF AFDVGVYYO AONT .FLPYTFGGGTK VEIKRTV ,0,02% de polissorbato 20 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0.
2. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende:25 mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1 compreendendoVH B-HH6 com a seguinte sequênciaQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR OAPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTrrADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSeV L B-KV1com a seguinte sequênciaDIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWV LOKPGQSPQLUYQMSNLySGVPDRFSGSGSGTDFαKTS R VF AEDVGVYYG A ONT .ELPYTFGGGTK VEIKRTV ,0,02% de polietileno-polipropileno glicol em peso/ volume, 20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0;ou25 mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1 compreendendoVH B-HH6com a seguinte sequênciaQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR QAPGQGLEWMGRIFPGDGDTOYNGKFKGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTL VTVSSV L B-KV1com a seguinte sequênciaDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWV LQKPGQSPQLLIYOMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS R VE A BDVGVYYC A ONT HLPYTFGGGTK VEIKRTV ,0,01% de polietileno-polipropileno glicol em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0;ou25 mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1 compreendendoVH B-HH6com a seguinte sequênciaQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR QAPGQGLEWMGRIE'PGDGDTOYNGKFKGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNWDGYWLVYWGQGTL VTVSSV L B-KV1 com a seguinte sequência DIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWV LQKPGQSPQUJYOMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS R VF AEDVGVYYC A ONT .ELPYTFGGGTK VEIKRTV ,0,1% de polietileno-polipropileno glicol em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0;ou25 mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1 compreendendoVH B-HH6com a seguinte sequênciaQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR QAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTTTAJDKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTL VTVSSV L B-KV1com a seguinte sequênciaPIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPpRFSGSGSGTDFrLKISRVEAEDVGVYYCAONLELPYTFGGGTKVEKRTV ,0,02% de Polissorbato 80 em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0;ou30 mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1 compreendendoVH B-HH6com a seguinte sequênciaOVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR QAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKfKGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYAVGQGTL VTVSS eV L B-KV1com a seguinte sequênciaDIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWY LQKPGQSPQLUYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFrLKTS RVFAF.DVGVYYCAQNT.FLPYTFGGGTKVEIKRTV ,0,01% de polietileno-polipropileno glicol em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e200 mM de trealose,em pH 6,5.
3. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que está em uma forma líquida e compreende:25 mg/mL de anticorpo humanizado B-Ly 1compreendendo VH B-HH6com a seguinte sequênciaQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR QAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNWDGYWLVYWGQGTL VTVSSeVL B-KV1com a seguinte sequênciaPIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWV LOKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDF'rLKIS R VF AEDVGVYYG A ONT ELPYTFGGGTK VEIKRTV ,0,02% de polietileno-polipropileno glicol em peso/ volume,20 mM de L-histidina, e240 mM de trealose,em pH 6,0.
4. Uso de uma formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento útil para tratamento de doenças relacionadas com CD20.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada entre o grupo consistindo em linfoma Não Hodgkin de Células B (NHL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células grandes difuso de células B (DLCL), linfoma de Burkitt, leucemia de células cabeludas, linfoma folicular, mieloma múltiplo, linfoma da zona marginal, distúrbio linfoproliferativo pós transplante (PTLD), linfoma associado com HIV, macroglobulinemia de waldenstrom, E linfoma do sistema nervoso central primário.
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