BRPI0818154A2 - composições de peptídeo de hpv de multitipo e métodos para o tratamento ou prevenção de infecção por papilomavírus humano - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES DE PEPTÍDEO DE HPV DE MULTITIPO E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO As modalidades da invenção são direcionadas a métodos e composições de polipeptídeos de HPV de multitipo.

Description

. 1/108 i COMPOSIÇÕES DE PEPTÍDEO DE HPV DE MULTITIPO E MÉTODOS PARA

O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS

HUMANO . Este pedido reivindica a prioridade de Pedido de Patente Provisória U.S. Nº de Série 61/001.630 e 61/001.629 depositados em 2 de novembro de 2007, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência. Esta foi feita com o auxílio do governo sob a concessão número P50 CA098252 outorgada pelo “National Institutes of Health" (NIH). O governo tem certos direitos na invenção. Fundamento da invenção TI. Campo da invenção | As modalidades dessa invenção são direcionadas de modo geral a biologia e medicina. Em certas modalidades a o invenção é direcionada a composições e método de uso de polipeptídeos de HPV de multitipo. II. Fundamento Infecções humanas por Papilomavírus (HPV) trópico genital são consideradas a infecção sexualmente transmitida mais comum nos Estados Unidos (“CDC Report to Congress, Prevenção de Genital Human Infecção por papilomavírus”, Janeiro de 2004). As principais manifestações de HPV anogenital incluem verrugas genitais (condiloma acuminato) e neoplasia intraepitelial da vulva, cérvix, ânus, ou pênis. Uma pequena fração de infecções persistentes por HPV de alto risco, se deixadas não tratadas, progride para câncer. (por exemplo, câncer cervical, às vezes câncer da cabeça e pescoço, e alguns tipos de câncer de pele não melanoma). A presença de DNA de HPV foi relatada em 99,7%

. 2/108 de carcinomas cervicais por todo o mundo, sugerindo que a infecção por HPV é uma causa essencial desse câncer e que | essa doença pode ser prevenida por vacinação profilática | . para HPV (Walboomers e cols., 1999). Além das verrugas genitais, a infecção por HPV pode | resultar em verrugas comuns, verrugas plantares, OU verrugas planas. As verrugas podem existir em diferentes formas dependendo do tipo de HPV responsável e do epitélio envolvido. As verrugas comuns (verruca vulgaris) ocorrem comumente nas mãos, como pápulas cor de carne a marrom, | exofíticas, e hiperceratóticas. As verrugas plantares (verruca plantaris) ocorrem nas solas dos pés e podem ser bastante dolorosas. Elas podem ser diferenciadas dos calos por remoção da camada superficial que revela capilares trombosados. As verrugas chatas ou planas (verruca plana) são mais comuns entre as crianças e podem ocorrer na face, pescoço, tronco e superfícies flexoras dos antebraços e pernas.

Aproximadamente 35 dos mais de 100 subtipos de HPV são específicos para o epitélio anogenital e têm potenciais variáveis por transformação maligna (Munoz e cols., 2003). Dos 15 tipos de HPV genital oncogênicos, HPVI6 é O mais comum, seguido por HPVI8 e HPV45 (que contribuem com aproximadamente 50%, aproximadamente 20% e aproximadamente 10% dos casos de câncer cervical, respectivamente). A despeito de sucessos de esforços da saúde pública para reduzir a incidência e mortalidade de câncer cervical com a implementação de programas de análise de citologia cervical, as mulheres que não se submetem a análises regulares respondem pela maioria das pacientes com cânceres

. 3/108 invasivos (Hoffman e Cavanagh, 1995) e o câncer cervical permanece a segunda causa mais comum de morte po câncer ao redor do mundo e o câncer mais prevalente em mulheres da . África sub-Saara, América Central, Ásia central-sul e Melanésia (uma subregião da Oceania que se estende do lado ] ocidental do Pacífico Oeste ao mar de Arafura, norte e nordeste da Austrália; o termo foi primeiramente usado para denotar um grupo étnico e geográfico de ilhas distintas da Polinésia e Micronésia) (Parkin, 2001). Aproximadamente

471.000 casos de carcinoma cervical invasivo são diagnosticados anualmente (Parkin, 2001).

O genoma do HPV é circundado por um capsídeo icosaédrico de 60 nm, não envelopado (Baker e cols., 1991) que contém as duas proteínas de capsídeo principais geneticamente não relacionadas, Ll1 e a proteína de capsídeo menor L2. L1 recombinante auto-monta em partículas vírus- like (VLPs) que são morfologicamente e imunologicamente similares aos vírions nativos (Kirnbauer e cols., 1992). Vacinas baseadas em VLP de L1 são altamente protetoras contra a infecção que corresponde ao tipo de papilomavírus usado para derivar O imunógeno (vacina homóloga), mas são ineficazes contra todos os outros tipos de tipos de HPV intimamente relacionados (Roden e cols., 2000). As vacinas licenciadas para HPV transpuseran esse obstáculo ao desenhar preparações de vacina multivalente; CERVARIX”"" contém VLP de L1 derivado de HPVlI6 e HPVI8, enquanto GARDASIL"" também contém VLPs de L1 de HPV6 e HPV11 para a prevenção de verrugas genitais benignas. Infelizmente, o custo e a necessidade por refrigeração dessas vacinas de VLP de Ll as tornam atualmente impraticáveis para uso em

. 4/108 | áreas de poucos recursos e remotas em que elas são mais necessárias.

Além disso, pelo fato de essas vacinas serem | ineficazes contra uma significativa fração de tipos - oncogênicos de HPV, os programas dispendiosos de análise | citológica permanecem necessários.

Para perceber o | potencial total da prevenção de HPV globalmente, a vacina deve ser segura e eficaz, estável em temperatura ambiente para facilitar a liberação em localizações remotas, de | produção barata, e administrada sem agulhas, preferivelmente disponível em uma formulação de dose única.

A carga da doença que resulta do excesso de tipos de HPV sugere que é necessária uma vacina amplamente protetora.

Portanto, há uma necessidade por vacinas de neutralização cruzada de HPV adicionais.

Sumário da invenção As modalidades da presente invenção são direcionadas a composições de peptídeo de multitipo.

Outras modalidades da invenção são direcionadas ao uso dessas composições de peptídeo de multitipo como imunógenos ou vacinas.

Uma composição de peptídeo de multitipo da invenção inclui dois ou mais peptídeos (peptídeos imunogênicos, ou seja, peptídeos que induzem uma resposta imune em um indivíduo) que representa isótipos ou tipos de um organismo patogênico ou peptídeos imunogênicos distintos de um organismo.

Os organismos podem ser tipos ou variantes de um organismo alvo, um gênero de organismos, ou uma família de organismos.

Em outros aspectos, os peptídeos podem ser de organismos patogênicos distintos (por exemplo, HPV e HSV). Em alguns aspectos os organismos patogênicos distintos são relacionados por métodos de transmissão (por exemplo,

- 5/108 doenças sexualmente transmitidas (DSTs)), ou órgão ou sistema — de órgão infectado (por exemplo, sistema reprodutivo, pele ou outros). Em um aspecto, a composição . de peptídeo de multitipo pode compreender inúmeros peptídeos derivados de várias variantes ou tipos de um organismo, que conferem uma ampla resposta imune de neutralização cruzada. A neutralização cruzada de tipos de HPV seria um exemplo de tal composição de peptídeo de multitipo e neutralização cruzada. Em outros aspectos, a composição de peptídeo de multitipo pode incluir peptídeos derivados de vários patógenos, como vírus, bactérias, ou fungos sexualmente transmitidos, que incluem, sem limitação, papilomavírus (PV), HPV, citomegalovírus (CMV), herpes vírus, Hepatite B, Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV/AIDS), herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV8), cancróide (Haemophilus ducreyi), donovanose (Granuloma inguinal ou Calymmatobacterium granulomatis), Gonorréia (Neisseria gonorrhoeae), Linfogranuloma venéreo (LGV) (Chlamydia trachomatis), uretrite não gonocócica (NGU) (Ureaplasma urealyticun ou Mycoplasma hominis), Staphylococcus aureus, sífilis (Treponema pallidum) e outros.

HPV é um exemplo de um organismo que podem ser visado pelo uso da composição de peptídeo de multitipo aqui descrita. A infecção por HPV causa 5% dos cânceres humanos por todo o mundo. A análise citológica (Pap) identifica as lesões precursoras de câncer cervical que podem ser removidas. A prevenção da infecção por HPV eliminará os cânceres associados ao HPV e seus precursores, como foi descrito para as vacinas licenciadas GARDASIL"" (Merck) e

- 6/108 CERVARIX"" (GSK). No entanto, as vacinas licenciadas são derivadas da proteína de capsídeo Ll1 e visam apenas um subconjunto dos tipos oncogênicos de HPV (portanto, os . programas de análise de Pap são ainda necessários). Os inventores descrevem composições e métodos para prevenir | amplamente a infecção benigna e a oncogênica por HPVs e suas seqúelas baseada na administração de uma composição de peptídeo de L2 de HPV de multitipo.

A composição de peptídeo de L2 de HPV de multitipo compreenderá uma pluralidade de segmentos de polipeptídeo derivados de dois ou mais tipos de HPV.

Os segmentos ou peptídeos podem ser de regiões correspondentes de polipeptídeos homólogos (ou seja, um polipeptídeo de outro tipo ou organismo variante que é Oo equivalente funcional de um primeiro polipeptídeo) ou podem ser de um diferente segmento de um polipeptídeo homólogo ou podem ser de um diferente polipeptídeo de um | tipo diferente.

Os segmentos (ou peptídeos) do polipeptídeo | são configurados como uma composição de peptídeo de ! multitipo por conjugação ou produção como uma proteína de fusão, lipossomo, nanopartícula, polímero, ou dendrímero de peptídeo (polipeptídeo ramificado). Em certas modalidades uma composição de polipeptídeo isolado compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, ou mais peptídeos imunogênicos de polipeptídeos correspondentes ou homólogos de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80,. 90, 100, 200, ou mais isolados distintos ou tipos ou organismos

| | | - 7/108 | infecciosos, em que um primeiro peptídeo imunogênico que compreende uma sequência de aminoácidos de um primeiro peptídeo de um primeiro polipeptídeo é operacionalmente . ligada a um segundo peptídeo imunogênico correspondente ou homólogo de um segundo polipeptídeo. "“Operacionalmente i ligado” refere-se à ligação de um peptídeo diretamente ou indiretamente com um segundo peptídeo.

Por exemplo, é possível para um grupo funcional que ele seja diretamente ligado a um primeiro peptídeo ou uma superfície por uma porção do grupo funcional que é também ligado a um segundo polipeptídeo (por exemplo, uma ligação de peptídeo). Alternativamente, é possível que o grupo funcional seja ligado ao peptídeo ou superfície por meio de um componente intermediário que liga o grupo funcional com o peptídeo ou superfície.

Tais componentes intermediários são frequentemente referidos como encadeadores.

Encadeadores são moléculas bifuncionais que podem ter uma porção que se liga quimicamente a um primeiro peptídeo e uma segunda porção que se liga quimicamente a um grupo funcional.

Qualquer número de componentes intermediários é englobado pela presente invenção, e são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Em uma modalidade, os inventores descreveram uma composição de peptídeo de PV de multitipo para a prevenção de infecção por vários tipos de PV.

Em certos aspectos, a composição de peptídeo de PV de multitipo é um polipeptídeo de ocorrência não natural que compreende dois ou mais segmentos de proteína de PV ou peptídeos imunogênicos de diferentes tipos de PV configurados como estruturas de polipeptídeo linear (concatâmero) ou ramificado, um

NA MN | - 8/108 | | polipeptídeo de L2 de PV de multitipo.

O peptídeo de L2 de PV pode compreender toda ou parte da sequência de aminoácidos de uma proteína L2 de um vírus na família - papovavírus; poliomavírus; papilomavírus; e/ou um papilomavírus dentro de um gênero, ou os gêneros Bb, y, ô, | e, GG, n, 8, 1 K, A, uu, v, É, 0, mM (veja de Villiers e cols., Classification of papillomavírus.

Virology. 2004 Jun 20;324(1):17-27); e/ou papilomavírus humanos: HPVl, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPVl4, HPV15, HPV1I6, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV3S5, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPVS1, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPVS9, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPVT7S, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV9l, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100, HPV101, HPV102, HPV1I03, HPV1I04, HPV1O5, HPV106, HPV107, HPV108, HPV109, HPV110, HPV111; e/ou papilomavírus animal: papilomavírus tipo 1 bovino (BPVl1), papilomavírus tipo 2 bovino (BPV2), papilomavírus tipo 4 bovino (BPV4), papilomavírus do coelho cottontail (CRPV), papilomavírus de veado (DPV), papilomavírus de alce europeu (EEPV), papilomavírus oral canino (COPY), papilomavírus de macaco resus (RhPV) e papilomavírus oral de coelho (ROPV). Um antígeno de PV ou epitopo ou peptídeo ou segmento de polipeptídeo da invenção pode compreende 5, 6, 7, 8, 9,

. 9/108 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos contíguos, - que incluem todos os valores e faixas entre eles, de um polipeptídeo a L2 de papilomavírus (por exemplo, Id. de Í Seq. Nos: 1-70).

Em um aspecto adicional um segmento de polipeptídeo pode compreender no máximo, pelo menos, ou cerca de posição de aminoácido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 189, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 289, 280,

i NS RESSDO MSN

. 10/108 | 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, - 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 389, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 489, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490 ou mais para posição de aminoácido 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 89, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166,

. 11/108 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 189, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, - 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 289, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 389, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, | 20 393, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, | 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 489, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 ou mais de um polipeptídeo L2 (por exemplo, Id. de Seq.

Nos: 1-70).

NEN) Na

Í . 12/108 | Ainda em um aspecto adicional, um peptídeo L2 inclui um segmento de polipeptídeo que inclui no máximo, pelo menos, ou cerca de aminoácidos 17-36, 13-45, 11-88, ou 11- . 200 de um polipeptídeo L2 revelado em Id. de Seq. Nº: 1 nessa ou a região correspondente de Id. de Seq. Nº: 2-70, ou uma sequência de consenso dessa. Cada uma das posições pode ser posições de aminoácidos aproximadas e pode variar em +1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de aminoácido. As posições de aminoácido identificadas são baseadas na numeração da proteína L2 de HPVl16 (Id. de Seq. Nº: 1). Posições de aminoácido de proteínas L2 de outros tipos de HPV podem variar, mas uma pessoa habilitada na técnica deve ser capaz de alinhar qualquer sequência de aminoácidos de L2 com HPVlI6 e identificar a sequência de peptídeos que corresponde com as posições de aminoácido de L2 de HPV16.

Em certas modalidades, o peptídeo L2 é um segmento de uma proteína L2 de HPV16 (Id. de Seq. Nº: 1), uma proteína L2 de HPVI18 (Id. de Seq. Nº: 2), uma proteína L2 de HPV45 (Id. de Seq. Nº: 3), uma proteína L2 de HPV6 (Id. de Seq. Nº: 9), uma proteína L2 de HPV1 (Id. de Seq. Nº: 4), uma proteína L2 de HPV2 (Id. de Seq. Nº: 5), uma proteína L2 de HPV63 (Id. de Seq. Nº: 62), uma proteína L2 de HPV5 (Id. de Seq. Nº: 8), uma proteína L2 de HPV8 (Id. de Seq. Nº: 11), uma proteína L2 de HPV11 (Id. de Seq. Nº: 14), uma proteína L2 de HPV31 (Id. de Seq. Nº: 32), uma proteína L2 de HPV33 (Id. de Seq. Nº: 34), uma proteína L2 de HPV35 (Id. de Seq. Nº: 36), uma proteína L2 de HPV39 (Id. de Seq. Nº: 40), uma proteína L2 de HPV51 (Id. de Seq. Nº: 50), uma proteína L2 de HPV52 (Id. de Seq. Nº: 51), uma proteína L2 de HPV56

. 13/108 (Id. de Seq.

Nº: 55), uma proteína L2 de HPV58 (Id. de Seq.

Nº: 57), uma proteína L2 de HPV59 uma proteína L2 de (Id. de Seq.

Nº: 58), uma proteína L2 de HPV68 (Id. de Seq.

Nº: - 66), uma proteína L2 de HPV73 (Id. de Seq.

Nº: 69), e/ou uma proteína L2 de HPV82 (Id. de Seq.

Nº: 70). o Em certos aspectos um polipeptídeo de multitipo tem uma fórmula geral de: | [epitopo X (a)-L- epitopo X+1 (b)-L- epitopo X+ n(c)] (d), em que a e/ou b e/ou c e/ou d são independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25; e n é independentemente 1 a 98; e peptídeo X, peptídeo X + 1, peptídeo X + n, são epitopos imunogênicos “distintos selecionados de um ou mais organismos sexualmente transmitidos; e (L) pode representar um encadeador, uma ligação química, uma ligação de peptídeo.

Os peptídeos da fórmula podem ser derivados da mesma proteína ou uma proteína diferente do mesmo organismo | ou patógeno, ou esses peptídeos podem ser derivados de uma proteína homóloga ou a heteróloga de um diferente organismo patogênico.

Em uma modalidade peptídeo X é um polipeptídeo de HPV; e peptídeo X + 1 é um diferente peptídeo de HPV ou um peptídeo de outro organismo patogênico, e peptídeo X + n é um ou mais de outro peptídeo distinto de qualquer tipo de HPV ou outro organismo patogênico.

O “-L-” representa um encadeador, um encadeador químico, encadeador de peptídeo, um ligação química, ou uma ligação de peptídeo no caso de uma fusão de polipeptídeo, ou outras formas de ligação ou conexão de peptídeos um peptídeos ou peptídeos a substratos que são conhecidos na técnica.

Modalidades da invenção incluem no máximo, pelo menos,

- 14/108 ou cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500 ou mais de duas ou mais sequências de peptídeos de - Id. de Seq. Nº: 71-92, 94-106, e/ou 110-112. Em outros aspectos os peptídeos da invenção include sequências | i correspondentes de Td. de Seq. Nº: 1-70 e outros | Polipeptídeos de L2 de HPV. Em certos aspectos, segmento do polipeptídeo L2 é pelo menos ou mais do que 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntico ao Id. de Seq. Nº: 71-92, 94-106, 110-112, e/ou sequências correspondentes de Id. de Seq. Nº: 1-70, e/ou segmentos de Id. de Seq. Nº: 1-70, e/ou outros polipeptídeos de L2 de PV ou segmentos desses.

Um ou mais dos polipeptídeos podem ser úteis como uma composição de vacina para a profilaxia, tratamento, Ou prevenção de infecção por papilomavírus. Em certos aspectos a composição pode ser combinada com um veículo farmacêutico. A composição de vacina é administrada a um indivíduo antes da exposição ao papilomavírus para minimizar ou prevenir a infecção por papilomavírus, ou é administrada depois de o paciente ter sido infectado para Reduzir a severidade da infecção e retardar/impedir a progressão da doença, ou para prevenir a transmissão de um papilomavírus do hospedeiro infectado para outro indivíduo que não tem à infecção por papilomavírus.

Como aqui usado, o termo “antígeno” ou "“peptídeo imunogênico” é uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo ou receptor de célula T. Um antígeno é adicionalmente capaz de induzir uma resposta imune humoral e/ou resposta imune celular que levam à produção de

. 15/108 linfócitos B e/ou T. O aspecto estrutural de um antígeno que desperta uma resposta biológica é aqui referido como um “determinante antigênico”. Linfócitos B respondem a - determinantes antigênicos estranhos por meio de produção de anticorpo, enquanto os linfócitos T o mediador da imunidade celular. Assim, determinantes antigênicos ou epitopos são aquelas partes de um antígeno que são reconhecidas por anticorpos, ou no contexto de um MHC, por receptores de célula T. Tipicamente, um antígeno será um peptídeo derivado de uma proteína expressa por um organismo patogênico (por exemplo, HPV). Um determinante antigênico | não precisa ser uma sequência contígua ou segmento da | proteína e pode incluir várias sequências que não são | imediatamente adjacentes uma a outra. Em certos aspectos um determinante antigênico é um segmento de polipeptídeo de PV, peptídeo de PV.

Com relação a uma sequência de aminoácidos em | particular, um “epitopo” é um conjunto de resíduos de ! aminoácido que está envolvido no reconhecimento por uma imunoglobulina particular, ou no contexto de célula T, aqueles resíduos necessários para reconhecimento por proteínas receptoras de célula T e/ou receptores de complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Os resíduos de aminoácido de um epitopo não precisam ser contíguos. Em um ambiente de sistema imune, in vivo ou in vitro, um epitopo representa as características coletivas da molécula, como estrutura de peptídeo primária, secundária e terciária, e carga, que juntos formam um sítio reconhecido por uma imunoglobulina, receptor de célula T, ou molécula HLA. Por toda essa revelação, "“epitopo” e

. 16/108 “peptídeo” são frequentemente usados de modo intercambiável.

Como aqui usado, “epitopo de célula B” ou “epitopo - alvo” refere-se a uma característica de um peptídeo ou proteína que é reconhecida por um receptor de célula B na i resposta imunogênica ao peptídeo que compreende aquele antígeno (por exemplo, um segmento de L2 de HPV ou sub região desse). Como aqui usado, “HPV” e “papilonmavírus humano” referem-se aos membros do gênero Papillomavirus (PV) que são capazes de infectar humanos.

Há dois grupos principais de HPVs (grupos genital e cutâneo), cada um contém múltiplos “tipos” ou “cepas” de vírus, por exemplo, HPV16, HPV18, HPV31, HPV 32 etc.

De interesse particular na presente invenção são os tipos de HPV que são associados a infecção genital e malignidade.

O termo “vacina” refere-se a uma formulação que contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Ou mais composições de peptídeo de HPV de multitipo da presente invenção.

As composições de peptídeo de HPV de multitipo tipicamente estarão em uma forma que é capaz de ser administrada a um indivíduo e induz uma resposta imune protetora Ou terapêutica suficiente para induzir imunidade para prevenir e/ou melhorar uma infecção e/ou para reduzir pelo menos um sintoma de uma infecção e/ou para melhorar a eficácia de outra terapia anti-HPV e/ou para atenuar a infecção por HPV e/ou atenuar a transmissibilidade de HPV.

Tipicamente, a vacina compreende uma solução salina convencional ou meio de solução aquosa tamponada em que a composição da presente invenção é suspensa ou dissolvida.

Em outros aspectos a

| aaa | o 17/108 : | vacina pode ser um sólido (por exemplo, formulação em pó ou liofilizada). A composição da presente invenção pode ser usada convenientemente para prevenir, melhorar, ou tratar | - uma infecção.

Depois da introdução em um hospedeiro, a composição é capaz de provocar uma resposta imune que inclui, sem limitação, a produção de anticorpos e/ou citocinas e/ou a ativação de células T citotóxicas, células que apresentam antígenos, células T helper, células dendríticas e/ou outras respostas celulares.

Como aqui usado, vacinas ou composições “profiláticas” e “preventivas” são composições desenhadas e administradas para prevenir infecção, doença, e/ou quaisquer sequelas relacionadas causadas ou associadas a um organismo patogênico, particularmente HPV.

Como aqui usado, vacinas ou composições “terapêuticas” são composições desenhadas e administradas aos pacientes já infectados com um organismo patogênico como pelo menos uma cepa de HPV.

As vacinas terapêuticas (por exemplo, vacinas terapêuticas para HPV) são usadas para prevenir e/ou tratar o desenvolvimento de tumores benignos ou malignos nesses indivíduos infectados.

Os termos “inibição”, “redução”, ou “prevenção” ou qualquer variação desses termos, quando usados nas reivindicações e/ou na especificação incluem qualquer diminuição mensurável ou inibição completa para atingir um resultado desejado.

O uso da palavra “um” ou “uma” quando usado junto com o termo “que compreende” nas reivindicações e/ou na especificação podem significar “umº, mas também são consistentes com o significado de “um ou mais”, “pelo menos

. 18/108 um” e “um ou mais que um”.

Por todo esse pedido, o termo “cerca de” é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão de erro para o - dispositivo ou método sendo aplicado para determinar oO valor.

O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para significar “e/ou” a menos que explicitamente indicado para se referir apenas às alternativas ou às alternativas que são mutuamente exclusivas, embora a revelação sustente uma | definição que se refere apenas a alternativas e “e/ou”. É ! | também contemplado que qualquer coisa listada com o uso do | termo “ou” também pode ser especificamente excluída.

Como usado nessa especificação e reivindicações, as palavras “que compreende” (e qualquer forma de “que compreendem”, como “compreende” e “compreendem”), “tem” (e qualquer forma de ter, como “tem” e “têm”), “que inclui” (e qualquer forma de incluindo, como “inciui” e “incluem”) ou “que contém” (e qualquer forma de “que contém”, como “contém” e “contêm”) são inclusivas e não excluem elementos adicionais não citados ou etapas de método.

É contemplado que um ou mais membros de uma lista aqui fornecida podem ser especificamente excluídos ou incluídos na invenção reivindicada.

Outras modalidades da invenção são discutidas por todo este pedido. Qualquer modalidade discutida com relação a um aspecto da invenção aplica-se a outros aspectos da invenção também e vice versa. As modalidades na seção de Exemplos são modalidades da invenção que são aplicáveis a todos os aspectos da invenção. Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da

Na " | . 19/108 descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades específicas da - invenção, são dados como ilustração apenas, já que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da | invenção serão aparentes para aqueles habilitados na técnica a partir dessa descrição detalhada. Descrição dos desenhos Os desenhos a seguir são parte da presente especificação e são incluídos para também demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem | compreendida em referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas aqui apresentadas.

FIG. 1. Vacinação de camundongos com vacinas de L2 de | multitipo induz anticorpos de neutralização cruzada mais amplamente que vacinas monoméricas de L2 ou Ll1 VLP. Os camundongos BALB/c foram vacinados s.c. nos dias 0, 15, 30 com PBS ou 25 ug de diferentes construções monoméricas e de multitipo de L2 em adjuvante GPI-0100 (50 ug) ou HPVl16 L1 VLP ou HPV45 L1 VLP sem adjuvante. Ensaios de neutralização in vitro foram realizados com o uso de pseudovírus HPV para os genótipos indicados nas diluições de duas vezes do anti- soro coletado dos camundongos duas semanas depois da imunização final. Os títulos finais que atingiram 50% de neutralização são esquematizados.

FIG. 2. Proteína L2 de multitipo isolada é imunogênica e nenhum adjuvante particular é necessário para uma resposta de anticorpo de neutralização ampla. Camundongos BALB/c foram vacinados nos dias 0, 15 e 30 s.c. com Alume

| MN | o 20/108 | apenas (1,3 mg), ou ISS1I018 apenas (10 ug/camundongo), ou PBS, ou 25 ug 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) apenas, ou | formulado com alume (1,3 mg), ou com TISS1018 (10 - pg/camundongo), ou com GPI-0100 (a 50 ug/camundongo ou 200 | 5 ug/camundongo), ou com GPI-0100 (50 ug/camundongo) + Tween | | i 40 (1 mg/camundongo), ou com alume e TISS1018 (10 | ug/camundongo). Títulos de neutralização in vitro foram realizados com duas diluições do anti-soro de camundongos | coletados duas semanas depois da imunização final com o uso | de pseudovírus HPV para os genótipos indicados.

Os títulos | finais que atingiram 50% de neutralização são esquematizados.

FIG. 3. Dose com pseudovírus HPVlI6 in vivo de camundongos quatro meses depois de vacinação com L2 11- 200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) em diferentes combinações de adjuvante.

Os camundongos foram vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com PBS ou 25 ug de L2 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) em diferentes adjuvantes ou adjuvante apenas.

Grupos individuais foram como listados abaixo da esquerda para a direita: PBS apenas, Alume apenas (1,3 mg), ISS1018 apenas (10 1ug/camundongo), 11-200x3 (Id. de Seg.

Nº: 113) apenas, 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) + ISS1018 (10 ug/camundongo), 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) + Alume (1,3 mg), 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) + GPI-0100 (50 ug/camundongo), 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) + GPI-0100 (200 ug/camundongo), 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) + GPI- 0100 (50 ug/camundongo) + Tween 40 (1 mg/camundongo), 11- 200x3 (Id. de Seg.

Nº: 113) + Alume + 1018 (10 unug/camundongo) . Aproximadamente 4 meses depois da imunização uma área na barriga de cada camundongo BALB/c

” 21/108 anestesiado foi raspada com uma lâmina elétrica sem traumatizar o epitélio.

Os camundongos receberam então 3 x 10º pseudovírions de HPVlI6 (100 ng) em 10 4pl de 0,6% - carboximetilcelulose que carrega uma construção de repórter de luciferase.

Três dias depois, os camundongos foram anestesiados e injetados com luciferina e as imagens foram adquiridas por 10 minutos com um Xenogen IVIS 200. Áreas de mesmo tamanho que englobam o local da inoculação foram | analisadas com o uso do programa Living Image 2.20 e as Í unidades de luminescência relativa foram esquematizadas em | | relação aos camundongos vacinados com L1 de HPV16 antes da | dose. | FIG. 4. Vacinação de camundongos com L2 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) ou 11-88x5 (Id. de Seq.

Nº: 108) induz | 15 menos anticorpos de neutralização cruzada, mas mais amplos quando comparados com GARDASIL". Os camundongos foram vacinados três vezes nos dias 0, 15, e 30 com GARDASIL”" em um quinto da dose humana ou com 25 ug de L2 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) ou 11-88x5 (Id. de Seq.

Nº: 108) em adjuvante GPI-0100 (50 ug). Os ensaios de neutralização in vitro foram realizados com uma série de diluições de duas vezes do anti-soro de camundongos coletadas duas semanas depois da imunização final com o uso de pseudovírus dos genótipos indicados de HPV.

Os títulos finais que atingiram 50% de neutralização são esquematizados.

Descrição detalhada da invenção O alto custo e a proteção restrita ao tipo pelas vacinas de primeira geração de partículas vírus-like L1 de HPV tornam necessários o desenvolvimento de composições e vacinas adicionais de proteção mais ampla de segunda

. 22/108 geração.

A proteína L2 de capsídeo menor protege os animais de dose com papilomavírus pela indução de anticorpos de neutralização.

Embora L2 induza anticorpos que neutralizam de modo cruzado diversos tipos de papilomavírus, os inventores observam que os anticorpos específicos para L2 i tipicamente neutralizam tipos relacionados de modo mais eficaz que tipos menos evolutivamente relacionados.

Para melhorar a proteção cruzada, as proteínas de fusão L2 foram desenhadas consistindo em epitopos de neutralização cruzada conhecidos de tipos divergentes de HPV.

Vacinação com Polipeptídeos L2 de HPVl6 que compreendem resíduos 17-36, 1-88 ou 11-200, foi comparada com três proteínas de fusão

L2 de multitipo; 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) tipos (HPV6, 16, 18), 11-88x5 (Id. de Seq.

Nº: 108) tipos (HPV 1,

5, 6, 16, 18), 17-36x22 tipos (5 cutâneos, 2 de mucosa de baixo risco e 15 tipos oncogênicos). Os camundongos foram vacinados três vezes por via subcutânea com 25 de antígeno em adjuvante GPI-0100. Entre todos os polipeptídeos de monotipo, 11-200 gerou o mais alto título de neutralização de HPVI6. No entanto, 11-200x3 induziu o mais alto título de neutralização contra HPV45 e HPVS58 bem como com HPV16, HPV18, HPV6 quando comparado a outras proteínas de fusão de multitipo e monotipo.

Os camundongos imunizados foram desafiados com pseudovírus HPV16 que expressa luciferase.

A vacinação com 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) protegeu os camundongos contra o desafio com HPVlI6 bem como VLP de HPV16 Ll.

A indução de anticorpos de neutralização de HPV após vacinação com 25 utg de 11-200x3 (Id. de Seq.

Nº: 113) proteína apenas ou com alume ou 50 1ug ou 200 ug de GPI-

0100, ou 50 ug GPI-0100 com Tween-40 foi comparado.

A

RAR | - 23/108 | presença de um adjuvante reforçou de significativamente a resposta humoral a 11-200x3, mas não houve diferença | significativa entre os adjuvantes.

Os inventores concluem - que a vacinação com uma proteína de fusão única que compreende HPV6 L2 11-200 (Id. de Seq.

Nº: 96), HPV16 L2 11-200 (Id. de Seq.

Nº: 100), e HPVI8 L2 11-200 (Id. de Seq.

Nº: 101) produzida em E. coli e formulada com um adjuvante é protetora e induz anticorpos de neutralização cruzada ampla.

É também contemplado que tais composições de HPV de | multitipo podem ser usadas junto com ou como um modelo para | outros organismos patogênicos, particularmente aqueles associados a doenças comunicadas d mesmo modo que o HPV, por exemplo, doenças sexualmente transmitidas.

Portanto, os ensinamentos desse pedido em relação ao HPV podem ser estendidos a outro organismo patogênico apenas ou junto com peptídeos L2 de HPV de multitipo.

I.

Composições terapêuticas e profiláticas Modalidades da invenção incluem Composições de peptídeo de HPV que compreendem dois ou mais Segmentos de polipeptídeo de HPV de dois ou mais tipos de HPV.

Em certos aspectos, os tipos de HPV incluem todos ou alguns dos tipos de HPV que são patogênicos a um organismo particular ou animal ou ser humano sendo administrado com a composição.

Em certas modalidades, o polipeptídeo de HPV compreende pelo menos dois epitopos L2 ou peptídeos.

Ainda em outro aspecto, o polipeptídeo de HPV compreende um epitopo L2 de pelo menos dois tipos de HPV.

Segmentos de polipeptídeo de HPV são descritos em detalhes nessa.

Os métodos da presente invenção incluem o tratamento

. 24/108 para uma doença Ou condição causada ou relacionada a infecção por papilomavírus (por exemplo, infecção por HPV). As composições imunogênicas de peptídeo de HPV de multitipo ' e/ou anticorpos que se ligam a ele, podem ser dadas para induzir ou fornecer uma resposta terapêutica em uma pessoa infectada, ou suspeita de estar exposta, ou em risco de ser infectada ou exposta ao HPV. Podem ser empregados métodos | com relação aos indivíduos que testaram positivos para | exposição ao HPV ou outras doenças sexualmente | | 10 transmitidas, ou que se considera que estão em risco de | infecção com base em possível exposição ou exposição futura. Em particular, a invenção engloba métodos de tratamento para infecção por HPV.

Em algumas modalidades, O tratamento é administrado na presença de adjuvantes ou veículos ou outros antígenos, antígenos de HPV ou antígenos de outros patógenos que têm um risco de exposição que é relacionado ou coincidente com o risco de exposição ao HPV. Além disso, em alguns exemplos, o tratamento compreende a administração de outros agentes comumente usados contra infecção viral, como um ou mais antivirais.

Em certos aspectos da invenção, os peptídeos da invenção são configurados de modo que múltiplos peptídeos são apresentados para complementar o sistema imune em proximidade um ao outro. Cada peptídeo pode estimular múltiplos componentes do sistema imune (duas ou mais células efetoras) ou um componente único do sistema imune (uma célula efetora com uma propensão de reconhecer múltiplos tipos ou variantes de um peptídeo). Os peptídeos podem ser configurados como concatâmero linear, como um |

- 25/108 concatâmero ramificado (dendrímero), como projeções de um suporte ou base (por exemplo, nanopartícula, lipossomo, polímero etc.). O número de sítios de reconhecimento ou - peptídeos que apresentaram uma entidade e seu espaço determinarão o grau de oligomerização dos peptídeos.

Por | exemplo, uma entidade tetravalente como estreptavidina resultará em um tetrâmero.

Valências muito maiores são possíveis, no entanto.

Preferivelmente o número de peptídeos estará na faixa de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 10, 20, 25, 50 ou mais incluindo todas as faixas entre eles.

Ê Em certas modalidades a composição de peptídeo de multitipo é um polímero natural ou um derivado desse como uma proteína, um polipeptídeo ramificado (dendrímero), uma | 15 proteína multimérica, ou um ácido nucleico que codifica os | mesmos.

Vários peptídeos “podem ser ligados a um | polissacarídeo, como dextrana, amido, celulose, ácido hialurônico, quitina, ou ácido algínico ou um derivado desses polissacarídeos; um polímero sintético — como polipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG); uma membrana | fosfolipídica, como uma vesícula ou um lipossomo, €e uma ! partícula inorgânica como poliestireno ou glóbulos acrílicos ou glóbulos magnéticos.

Em certos aspectos um polipeptídeo de multitipo é um dendrímero.

Esses dendrímeros podem, por exemplo, ser feitos de acordo com o protocolo como revelado em “Chemoselective and orthogonal ligation techniques” no capítulo 11 de Weng e Peter, White Eds., “Fmoc solid phase peptide synthesis, A Practical Approach” Oxford University Press (2000), e Publicação de Patente U.S. 20080207485, que

. 26/108 é aqui incorporada por referência.

Vários outros métodos para a síntese de polipeptídeos ramificados serão bem conhecidos pelo profissional habilitado na técnica.

Um - polipeptídeo ramificado tem peptídeos incorporados em locais predeterminados em dois ou mais de suas ramificações.

Cada ramificação do peptídeo pode ter um comprimento desejado.

Preferivelmente cada ramificação tem menos que 24 aminoácidos de comprimento.

A ramificação do peptídeo pode ser efetuada por ramificação do peptídeo durante a síntese em resíduos de Lys por métodos conhecidos.

Desse modo o peptídeo é ramificado em um primeiro resíduo de lisina em duas ramificações e também ramificado em resíduos de lisina adicionais para formar uma entidade tetravalente.

Outras valências, como octâmeros, | podem ser efetuadas por inclusão de mais ou menos etapas de | | ramificação.

Valências ímpares também são atingidas por ramificações parciais do peptídeo sintético. | Em certas modalidades um ou mais terminais do polipeptídeo é anexado a um suporte ou base, por exemplo, em um aspecto, pela formação de alças de polipeptídeo que se estendem a partir de um suporte.

Os peptídeos da invenção podem ser compreendidos em vários veículos de liberação ou formas, como partículas vírus-like (VLPs) ou lipossomos, ou na superfície de partícula biodegradável, ou na superfície de glóbulos ou micropartículas ou nanopartículas.

A, Agentes infecciosos Uma “infecção” ou “doença infecciosa”, como aqui usada, refere-se a um distúrbio que surge da invasão de um hospedeiro, superficialmente, localmente, ou

- 27/108 sistemicamente, por um organismo infeccioso.

Organismos infecciosos incluem bactérias, vírus, parasitas, fungos e protozoários. - Bactérias incluem bactérias gram-negativas e gram- positivas.

Exemplos de bactérias gram-positivas incluem, sem limitação, espécies de Pasteurella, espécies de Staphylococcus que incluem Staphylococcus aureus; espécies de Streptococcus, incluindo Streptococcus pyogenes grupo A, Streptococcus viridans grupo, Streptococcus agalactiae grupo B, Streptococcus bovis, espécies anaeróbicas de Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, e Streptococcus faecalis; espécies de Bacillus incluindo Bacillus anthracis; espécies de Corynebacterium incluindo | Corynebacterium diphtheriae, espécies aeróbicas de ! Corynebacterium, e espécies anaeróbicas de Corynebacterium; ! espécies de Difteroides; espécies de Listeria que incluem | Listeria monocytogenes; espécies de Erysipelothrix que incluem Erysipelothrix rhusiopathiae; espécies de Clostridium que incluem Clostridium perfringens, Clostridium tetani, e Clostridium difficile.

Bactérias —“gram-negativas incluem, sem limitação, espécies de Neisseria que incluem Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis; espécies de Branhamella que incluem Branhamella catarrhalis; espécies de Escherichia que incluem Escherichia coli; espécies de Enterobacter; espécies de Proteus que incluem Proteus mirabilis; espécies de Pseudomonas que incluem Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mallei, e Pseudomonas pseudomallei; espécies de Klebsiella que incluem Klebsiella pneumoniae; espécies de Salmonella; espécies de Shigella; espécies de Serratia;

. 28/108 espécies de Acinetobacter; espécies de Haemophilus que incluem Haemophilus influenzae e Haemophilus ducreyi; espécies de Brucella; espécies de Yersinia que incluem . Yersinia pestis e Yersinia enterocolitica; espécies de Francisella que incluem Francisella tularensis; espécies de Pasturella que incluem Pasteurella multocida; Vibrio cholerae; espécies de Flavobacterium; meningosepticum; espécies de Campylobacter que incluem Campylobacter jejuni; espécies de Bacteroides (oral, faríngea) que incluem Bacteroides fragilis; espécies de Fusobacterium que incluem Fusobacterium nucleatum; Calymmatobacterium granulomatis; espécies de Streptobacillus que incluem Streptobacillus moniliformis; espécies de Legionella que incluem Legionella pneumophila.

Outros tipos de bactérias incluem bacilos ácido- resistentes, espiroquetas, e actinomicetos. Exemplos de bacilos ácido-resistentes incluem espécies de Mycobacterium | que incluem Mycobacterium tuborculosis e Mycobacterium | leprae. Exemplos de espiroquetas incluem espécies de Treponema que incluem Treponema pallidum, Treponema pertenue, espécies de Borrelia que incluem Borrelia burgdorferi (doença de Lyme), e Borrelia recurrentis, e espécies de Leptospira. Exemplos de actinomicetos incluem: espécies de Actinomyces que incluem Actinomyces israelii, e espécies de Nocardia que incluem Nocardia asteroides.

Exemplos de vírus incluem, sem limitação: Retrovírus, vírus da imunodeficiência humana que incluem HIV-l1, HDTV- III, LAVE, HTLV-111/LAV, HIV-III, HIV- LP, Citomegalovírus (CMV), Picornavírus, polio vírus, hepatite A vírus, enterovírus, vírus Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus,

mm 29/108 | Calcivírus, Togavírus, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola, Flavírus, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela, Coronavírus, Rhabdovírus, vírus da es estomatite vesicular, vírus da raiva, Filovírus, vírus | 5 ebola, Paramixovírus, vírus parainfluenza, vírus da | i caxumba, vírus do sarampo, virus sincicial respiratório (RSV), Ortomixovírus, vírus influenza, Bungavírus, vírus Hantaan, flebovírus e Nairo vírus, Arena vírus, vírus da febre hemorrágica, reovírus, orbivírus, rotavírus, Bimavírus, Hepadnavírus, vírus da Hepatite B, parvovírus, Papovaviridae, papiloma vírus, polioma vírus, Adenovírus, Herpesvírus que incluem vírus herpes simples 1 e 2, varicela zoster vírus, Poxvírus, vírus da varíola, vaccínia | vírus, Irido vírus, vírus da febre suína africana, vírus da hepatite delta, vírus da hepatite não A, não B, Hepatite C, vírus Norwalk, astrovírus, e vírus não classificados.

Exempios de fungos incluem, sem limitação: espécies de Cryptococcus que incluem Crytococcus neoformans; espécies de Histoplasma que incluem Histoplasma capsulatum; espécies de Coccidioides que incluem Coccidiodes immitis; espécies de Paracoccidioides que incluem Paracoccidioides brasiliensis; espécies — de Blastomyces que incluem Blastomyces dermatitidis; espécies de Chlamydia que incluem Chlamydia trachomatis; espécies de Candida que incluem Candida albicans; espécies de Sporothrix que incluem Sporothrix schenckii; espécies de Aspergillus, e fungos de mucormicose.

Outros “organismos infecciosos incluem parasitas.

Parasitas incluem espécies de Plasmodium, que incluem Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium

- 30/108 ovale, e Plasmodium vivax e Toxoplasma gondii. Parsitas do sangue e/ou tecidos incluem espécies de Plasmodium, espécies de Babesia que incluem Babesia microti e Babesia - divergens, espécies de Leishmania que incluem Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani; espécies de Trypanosoma que incluem Trypanosoma gambiense, Trypanosoma —rhodesiense (doença do sono africana), e Trypanosoma cruzi (doença de Chagas). Outros “microorganismos relevantes foram descritos extensivamente na literatura, por exemplo, veja Thomas, “Medical Microbiology”, Bailliere Tindall, Great Britain 1983 e Murray, “Medical Microbiology" (ISBN 0323033032), 2005, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

B. Vacinas de HPV A presente invenção inclui composições para a prevenção ou melhoria das infecções por HPV. Como tal, a invenção contempla vacinas para uso em modalidades de | imunização ativa e passiva. As composições imunogênicas propostas para serem adequadas para uso como uma vacina podem ser preparadas a partir de polipeptídeos de HPV de multitipo que compreendem segmentos de proteína L2 de HPV. Em outras modalidades, polipeptídeos de L2 de HPV de multitipo podem ser usados em combinação com outras proteínas de HPV ou segmentos dessas, como El, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, e/ou proteína Ll. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 7.425.438, 7.416.846, 7.416.732, 7.407.807,

7.374.767, 7.201.908, 7.189.513, e 7.288.258, cada um desses é aqui incorporado em sua totalidade por referência. Tipicamente, as vacinas são administradas em uma maneira compatível com a formulação da vacina, e em uma

. 31/108 quantidade que seja terapeuticamente eficaz e/ou imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, que inclui a capacidade do sistema BR imune do indivíduo de sintetizar anticorpos e do grau de proteção desejado. Quantidades precisas de ingrediente | ' ativo necessárias para serem administradas dependem do julgamento do profissional. Tipicamente, 0,1, 1, 5, 10, 20, | 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, a 100 ng, ug, ou mg podem ser administradas por vacinação ou administração. Regimes adequados para administração inicial e dose de reforço são | também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida por inoculações subsequentes Ou outras administrações.

1. Polipeptídeos de HPV e segmentos de polipeptídeo Em certos aspectos da invenção vários segmentos de polipeptídeos de HPV são usados como um componente de peptídeo de HPV de uma vacina de polipeptídeos de HPV de multitipo. Em certos aspectos, o polipeptídeo de HPV é um polipeptídeo L2. Em um aspecto adicional o polipeptídeo L2 é um HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPVl1, HPV12, HPVl3, HPVlI4, HPVI5S, HPV16, HPV17, HPV18, HPVl19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPVS57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPVB81l, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPVB89,

A A9 o ih it otãõóõãõãrtett" . 32/108 HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100 Ou mais (See Id. de Seq. Nº: 1-70); e papilomavírus animal: papilomavírus bovino tipo 1 (BPV1), - papilomavírus bovino tipo 2 (BPV2), papilomavírus bovino tipo 4 (BPV4), papilomavírus do coelho cottontail (CRPV), papilomavírus de veado (DPV), papilomavírus de alce europeu (EEPV), papilomavírus oral canino (COPY), papilomavírus de macaco resus (RhPV) ou papilomavírus oral de coelho (ROPV) epitopo de peptídeo L2. O “Human Papillomavirus Compendium On Line” coleta publica dados moleculares relevantes em relação ao papilomavírus humano (HPV) e papilomavírus animal relacionado. O compêndio é acessado na internet em (hpv-web.lanl .gov/stdgen/viras/hpv/compendium/ htdocs/HTML FILES/HPVcompintro4.html), que é incorporado por referência como a data de prioridade e de depósito desse pedido.

Exemplos de polipeptídeos L2 podem ser encontrados nas bases de dados de proteína públicas disponíveis como GenBank (gb), SwissPro (sp), EMBL, e outros. Entradas da base de dados representativas, listadas por tipo de HPV com número de acesso em parênteses, incluem, sem limitação: HPV2 (gb/AAY86489, gb/ABN49461, gb/ABN49469, gb/ABO14925, gb/NP 077121); HPV3 (sp/P36744); HPV7 (gb/NP 041858.1); HPV10 (gb/NP 041745); HPV16 (gb/AAO8S414, gb/AAOL15703, gb/AA015711, gb/AAQ1I0726, gb/AAV91650); HPVI18 (gb/AAFLI4009, gb/ABP99710, gb/ABP99718, gb/ABP99726, gb/ABP99742, gb/ABP99766, gb/ABP99774, gb/ABP99782, gb/ABP99790, gb/ABP99798, gb/ABP99806, gb/NP 040316); HPV26 (gb/NP

041786.1); HPV27 (dbj/BAE1l6268, sp/P36755); HPV28 (sp/P50799); HPV29 (sp/P50800); HPV30 (sp/P36756); HPV33

- 33/108 (sp/P06418); HPV39 (gb/AAA47O55); HPV40 (sp/P36760); HPV43 (sp/Q705H5); HPV45 (gb/AAY86493); HPV45 (gb/ABP99814, gb/ABP99854, gb/ABP99862, gb/ABP99870, gb/ABP99878, - gb/ABP99894, gb/ABP99902, sp/P36761); HPV51 (sp/P26539); HPV52 (sp/P36763); HPV53 (gb/ABU5S4103, gb/ABUS4117, gb/ABU5S4131, gb/ABU5S4152, gb/ABUS4159, gb/ABUS4173, gb/NP 041847); HPV56 (gb/ABO76808, gb/ABO76815, gb/ABO76822, gb/ABO76829, sp/P36765); HPV57 (dbj/BAF8O0485, sp/P22164); HPV58 (sp/P26538); HPV59 (emb/CAAS4855) ; HPV61 (ref/NP 043449); HPV62 (sp/Q676U7); HPV66 (gb/ABO76836, gb/ABO76843, gb/ABO76857, gb/ABO076864, gb/ABO76885, gb/ABO76892, gb/ABO76899, sp/Q80960); HPV68a (gb/AAZ39497); HPV69 (sp/Q9JIH45); HPV70 (gb/AACS4856); HPV71 (gb/AAQ95182, gb/AAQ95189, gb/AAQ95203, ref/NP 597937); HPV72 (emb/CAA63878); HPV77 (emb/CAA75467); HPV81 (emb/CAFO5697); HPV82 (gb/AAK28455, sp/Q9IR53); HPV83 (gb/AAD38973); HPV84 (gb/AAKOS276); HPV85S (gb/AAD24187); HPV86 (gb/AALO6740); HPV87 (emb/CAC17717); HPV89 (gb/AAM92156); HPV90 (ref/NP 671508); HPV91 (gb/AAMB9135); HPV94 (dbj/BAD89178, emb/CAFO5714); HPV97 (gb/AAZ39505, gb/ABO27082); HPV102 (gb/AAZ39525); ou HPV1O06 (gb/AAZ39518). Cada sequência de aminoácidos representada pelo número de acesso é aqui incorporada por referência como a data de depósito desse pedido.

Em certos aspectos pelo menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais peptídeos L2 de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou mais tipos de HPV são ligados para formar um polipeptídeos de HPV de multitipo (veja o Id. de Seq.

Nº: 94, 108, 109, e 113). A ligação dos segmentos pode ser por expressão ou síntese de uma proteína de fusão, Ou por

- 34/108 conjugação química dos peptídeos ou conjugação química dos peptídeos a um substrato ou polímero comum.

Um peptídeo da invenção pode incluir 10, 15, 20, 25, - 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, i 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 43, 440, 450, 460, 470, 480, ou 490 aminoácidos consecutivos, que incluem todos os valores e faixas entre esses, iniciando do aminoácido 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 43, 440, 450, 460, 470, 480, ou 490, que incluem todos os valores entre esses, de um polipeptídeo L2 de HPV.

Em certas modalidades um polipeptídeo L2 de HPV inclui, sem limitação, Id. de Seg.

Nº: 1 a Id. de Seq.

Nº: 70. Em certos aspectos os polipeptídeos de HPV de multitipo compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,4 25, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 70, 80, 90, 100, 200, ou mais de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Ou mais dos peptídeos selecionados de L2 de HPV 17-36 - DIYPSCKISNTCPPDIQNKI (Id. de Seq.

Nº: 72), L2 de HPV 17-36 - DLYRTCKOAGTCPPDIIPRV (Id. de Seq.

Nº: 73), L2 de HPV 17-36 - DIYPACKVANNCPPDIQONKI (Id. de Seq.

Nº: 74), L2 de HPV 17-36 - HIVYQOTCKOAGTCPPDVINKV (Id. de Seq.

Nº: 75), L2 de HPV 17-36- HIYOTCKOAGTCPPDVINKV (Id. de Seq.

Nº: 76), HPV L2 17-36 -QLYQOTCKLTGTCPPDVIPKV

- 35/108 (Id. de Seq. Nº: 77), L2 de HPV 17-36 - QLYQTCKATGTCPPDVIPKV (Id. de Seq. Nº: 78), L2 de HPV 17-36 - QLYKTCKOAGTCPPDIIPKV (Id. de Seq. Nº: 71), L2 . de HPV 17-36 -DLYKTCKOSGTCPPDVVPKV (Id. de Seq. Nº: 79), L2 de HPV 17-36 -QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI (Id. de Seq.

i Nº: 80), L2 de HPV 17-36 -QLYOTCKATGTCPPDVIPKV (Id. de Seq. Nº: 81), L2 de HPV 17-36- QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV (1d.

de Seq. Nº: 82), L2 de HPV 17-36 - DLYRTCKQOSGTCPPDVVDKV (Id. de Seq. Nº: 83), L2 de HPV 17-36 - DLYRTCKO SGTCPPDVINKV (Id. de Seq. Nº: 84), L2 de HPV 17-36 - QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV (Id. de Seq. Nº: 85), L2 de HPV 17-36 - QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (Id. de Seg. Nº: 86), L2 de HPV 17-36 - QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI (Id. de Seq. Nº: 87), L2 de HPV 17-36 - QLYOTCKASGTCPPDVIPKV (Id. de Seq.

Nº: 88), L2 de HPV 17-36 - DLYKTCKOAGTCP SDVINKV (Id. de Seq. Nº: 89), L2 de HPV 17-36 - DLYKTCKOSGTCP SDVINKV (Id. de Seq. Nº: 90), L2 de HPV 17-36 - QLYKTCKOAGTCPPDVIPKV (Id. de Seq. Nº: 91), e/ou QLYSTCKAAGTCPPDVIPKV (Id. de Seq. Nº: 92).

Em um aspecto adicional, os polipeptídeos de HPV de multitipo compreendem uma sequência de aminoácidos de [12 de HPV 17-36Xx22 -

DIYPSCKISNTCPPDIQNKIDLYRTCKQAGTCPPDIIPRVDIYPACKVANNCPPDIQNK IHIY QTCKQAGTCPPDVINKVHIYQTCKQOAGTCPPDVINKVOLYQOTCKLTGTCPPDVIPKVQOL YQTCKATGTCPPDVIPKVOLYKTCKQAGTCPPDIIPKVDLYKTCKOSGTCPPDVVPKVQ LYQTCKAAGTCP SDVIPKIQLYQTCKATGTCPPDVIPKVOQLYRTCKAAGTCPPDVIPKVD LYRTCKQSGTCPPDVVDKVDLYRTCKOSGTCPPDVINKVQOLYSTCKAAGTCPPDVVNK VQLYQTCKASGTCPPDVIPKVQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIQLYQTCKASGTCPPDVIP

- 36/108

K

VDLYKTCKQAGTCPSDVINKVDLYKTCKQSGTCPSDVINKVOLYKTCKQAGTCPPDVIP KVOLYSTCKAAGTCPPDVIPKV (Id. de Seq. Nº: 93) . Ainda em outro aspecto os polipeptídeos de HPV de multitipo conpreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, | 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,4 25, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 70, 80, 90, 100, 200, ou mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Ou mais dos peptídeos selecionado de L2 de HPV 11-88 -

KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGR T GYIPLGTRPPTATDTLAP (Id. de Seg. Nº: 94), L2 de HPV 11-88 - KRASVTDLYKTCKOS GTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWS SLGIFLGGLGIGTGSGTGGRT GYIPLGGRSNTVVDVGPT (Id. de Seq. Nº: 95), L2 de HPV 11-88 -

KRAAPKDIYPSCKISNTCPPDIQNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGR IGY TPLGEGGGVRVATRPT (Id. de Seq. Nº: 96), L2 de HPV11-88 -

KRDSVTHIYQTCKOAGTCPPDVINKVEQTTVADNILKYGSAGVFFGGLGISTGRGTGGA TGYVPLGEGPGVRVGGTPT (Id. de Seq. Nº: 97), L2 de HPV 11-88 - —KRASATQOLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGR T GYVPLGTSAKPSITSGPM (Id. de Seg. Nº: 98) L2 de HPV 11-88

SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGY V PLOTSAKPSITSGPMAKRA (Id. de Seq. Nº: 99), L2 de HPV 11-88

SATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGY IP LGTRPPTATDTLAPRA (Id. de Seq. Nº: 100), L2 de HPV 11-88

SVTDLYKTCKOSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWS SLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYI PLGGRSNTVVDVGPTRKRA (Id. de Seq. Nº: 101), L2 de HPV 11-88

SATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGY VPLSTRPSTVSEASIPRA (Id. de Seq. Nº: 102), L2 de HPV 11-88

| - 37/108 | SATDLYRTCKQOSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGY I PLGGRPNTVVDVSPARRA (Id. de Seq. Nº: 103), L2 de HPV 11-88

SVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGY . TI PLGGGGRPGVVDIAPARA (Id. de Seq. Nº: 104), L2 de HPV 11-88

SATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGY Á VPLGSRPSTIVDVTPARKKRA (Id. de Seq. Nº: 105), e/ou L2 de HPV 11-88 -

SATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGY VP LSTGTPSKPVEIP (Id. de Seq. Nº: 106).

Em certas modalidades um polipeptídeos de HPV de multitipo compreende um aminoácido de L2 de HPV 11 -88x5 —

KRASATQOLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGR TGYIPLGTRPPTATDTLAPKRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSS LGFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTKRAAPKDIYPSCKISNTCPPDI QNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGRIGYTPLGEGGGVRVATRPTKRD SVTHIYQTCKQAGTCPPDVINKVEQTTVADNILKYGSAGVFFGGLGISTGRGTGGATGY

VPLGEGPGVRVGGTPTKRASATQOLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQOILKWGSLGV FFGGL GIGTGSGTGGRTGVPLGTSAKPSITSGPM (Id. de Seq. Nº: 107).

Ainda em uma modalidade adicional um polipeptídeos de HPV de multitipo compreende um aminoácido de L2 de HPV 11- 88x8

SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGY Á PLQTSAKPSITSGPMAKRASATQOLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGV F FGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRASVTDLYKTCKQOSGTCPPDVVPKV E GTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRASATQ L —YQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLST

. 38/108

RP STVSEASIPRASATDLYRTCKOSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIG T . GTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLA DKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARASATOLYKTCK L SGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIV

DVTPARKKRASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGS G SGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP (Id. de Seq. Nº: 108). Em outra modalidade adicional um polipeptídeos de HPV de multitipo compreende regiões homólogas de L2s de HPV6b, HPV16, HPVI8, HPV31, HPV39, HPV51, HPV56 e HPV73. O aminoácido de L2 de HPV 11-88x8 é

MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADOQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRT GYVPLQTSAKPSITSGPMAKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQOYGS M GVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVV P KVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRAS A TOLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADOILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVP L STRPSTVSEASIPRASATDLYRTCKOSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGG L GIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTOLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGT TLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARASATQOLYK

T CKLSGTCPEDV' VNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRP Ss

TIVDVTPARKKRASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLG

: 39/108 IGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP (Id. de Seq. Nº: 109). Ainda em outra modalidade adicional um polipeptídeo de HPV de multitipo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,4 25, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 70, 80, 90, 100, 200, ou mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 8, 9, 10 Ou mais dos peptídeos selecionados de L2 de HPV11 - 200

KRASATQLYQTCKASGTCPPDIIAKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGR T GYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIVSLVEDSTIINSAASDFVPPIREG FEIST SETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEPSIVOQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSH

SVED IPLDT (Id. de Seq. Nº: 110), L2 de HPV 11 -200 -

KRASATQOLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGR 7 i | GYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVP | SIPPDVSGF

SITTSTDTTPAILDINNTVFTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTH

NYEE IPMDT (Id. de Seq. Nº: 111), e/ou £L2 de HPV 11 -200-

KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWS SLGIFLGGLGIGTGSGTGGRT GYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFTGTSGF IDIT

SAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTNFTNPAFSDP SIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLOT (Id. de Seq. Nº: 112). Em certas modalidades um polipeptídeo de HPV de multitipo compreende a sequência de aminoácidos L2 de HPV 11 -200x3

KRASATQLYQTCKASGTCPPDIIAKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGR

NA | . 40/108

T GYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIV SLVEDSTIINSAASDFVPPIREGFEIST - SETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEPSIVQOSQP SVEASGHVLTSTYTSTISSHSVED

IPLDTKMSATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGIADQILQOYGSMGVFFGGLGIGTGSGTG c Í

RTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIP PDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDP SVLQPPTPAETGGHFTLSS STISTHNYE EIPMDTKRASVTDLYKTCKQOSGTCPPDVVPKVEGTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGS G TGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFT

GTSGFDITSAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTNFTNPAFSDPSIIEVPQTGEVAGNVFV GTPTSGTHGYEEIPLQOT (Id. de Seq. Nº: 113). Em certas modalidades um polipeptídeo de multitipo, “FurinDKILKx15" compreende sequências de proteína L2 de HPV6b, HPV11, HPVl16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV73. A sequência de aminoácidos de FurinDKILKx 15 é

MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKASATQLYQTCKATGTCPPDVIPK V EHTTIADQILKASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQASVTDLYKTCKQOS GT CPPDVVPKVEGTTLADKILQASATQLYQTCKAAGTCP SDVIPKIEHTTIADQILRASATOL YQTCKATGTCPPDVIPKVEGSTIADQILKASATQLYRTCKAAGTCPPDVIPKVEGNTVA D QILKASATDLYRTCKQOSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQASATDLYRTCKQSGTCPPDV

I e | - 41/108 NKVEGTTLADKILQASVTQOLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQASATOLYQTC | KASGTCPPDVIPKVEGTTIADQLLKASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKIL | | Q - ASATQLYQTCKASGTCPPDVIPKVEGTTIADQILRASATDLYKTCKOAGTCPSDVINKV E GTTLADKILQOASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILK (Id. de Seq. Nº: 114). Peptídeos da invenção são tipicamente sintetizados com o uso de métodos de síntese de peptídeo conhecidos por aqueles habilitados na técnica e/ou são ligados com o uso de química de peptídeo conhecida por aqueles habilitados na técnica. Em outros aspectos, os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser expressos e purificados com o uso de técnicas recombinantes conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

2. Encadeador São englobados pela invenção oligômeros ou proteínas de fusão que contêm inúmeros peptídeos. Tais oligômeros podem estar na forma de multímeros covalentemente ligados ou não covalentemente ligados, que incluem dímeros, trímeros, ou oligômeros superiores. Em um aspecto da invenção, os oligômeros mantêm a capacidade de estimular uma resposta imune. Uma modalidade da invenção é direcionada a oligôneros que compreendem múltiplos peptídeos ligados por meio de encadeadores covalentes ou não covalentes entre os peptídeos. Tais encadeadores podem ser encadeadores de peptídeo (espaçadores), ou peptídeos que têm a propriedade de promover oligomerização. Zíperes de leucina e certos polipeptídeos derivados de anticorpos estão entre os peptídeos que podem promover a oligomerização dos peptídeos anexados a eles. Entre os

. 42/108 encadeadores de peptídeo adequados estão aqueles descritos nas Patentes U.S. 4.751.180 e 4.935.233, que são aqui incorporadas por referência. Em certas modalidades os - peptídeos da invenção são ligados por ligações de peptídeo sem encadeador discernível entre os peptídeos. i 3. Veículos de liberação As formulações conhecidas para vacinas empregaram vários veículos de liberação para apresentação de tais antígenos ao sistema imune do mamífero, de modo a promover uma resposta imune protetora ou terapêutica contra um patógeno. Tais “veículos de liberação” incluíram como um agente de vírus inteiro inativado por calor ou quimicamente inativado, partículas de proteína do vírus inteiro, vetores virais, como adenovírus e vaccínia, entre outros, e vetores com base em DNA ou plasmídeos.

Partículas vírus Like As partículas vírus like (VLPs) foram investigadas como agentes de vacina. Em geral, vírus com capsídeo incluem uma proteína de revestimento Ou “capsídeo” que é montado para conter o ácido nucleico viral. Vários vírus têm capsídeos que podem ser “automontados” das proteínas de capsídeo individualmente expressas para formar VLPs, na célula em que o capsídeo é expresso (“montagem in vivo”) e fora da célula depois de isolação e purificação (“montagem in vitro").

As partículas vírus-like imitam a estrutura geral de uma partícula viral sem a necessidade de conter material infeccioso. VLPs podem ser desprovidas de um genoma de DNA ou RNA viral, mas retêm a estrutura tridimensional de um vírus autêntico. VLPs têm a capacidade de estimular respostas mediadas por células B, respostas proliferativas

- 43/108 de CD4 e respostas de linfócitos T citotóxicos. Veja, Schirmbeck e cols. (1996) InterVirology 39, 111-119; Paliard e cols. (2000) AIDS Res. Hum. Retroviruses 16, 273- - 282; Murata e cols. (2000) PNAS USA 100, 6753-6758. veja também a Publicação de Patente U.S. 20070041999, que é i incorporada em sua totalidade por referência. VLPs foram produzidas para mais de 30 diferentes vírus que infectam humanos e outros animais, que incluem Norwalk, Hepatite B e C, Papilomavírus, Parvovírus e Influenza A. As partículas vírus-like também podem ser manipuladas para agirem como moléculas carreadoras para a liberação de epitopos de outras agentes patogênicos. Veja, Noad e cols. (2003) Trends in Microbiology 11(9), 438-444; Sadeyen e cols. (2003) Virology 309:32-40; publicação PCT WO 2005/005614; Publicação de Patente U.S. s 2004/0033585 e | 2005/0048082; Patentes U.S. 6.448.070; 6.110.466; !

6.171.591; Brinkman e cols. (2004) Lett. Drug Des. & Disc. ! 1:137-147. Uma proteína de capsídeo pode ser modificada i para conter um peptídeo antigênico, geração de uma fusão de proteína de capsídeo viral-peptídeo antigênico recombinante. Esse produto da fusão de proteína de capsídeo-peptídeo antigênico pode ser então expresso em uma célula hospedeira, montado in vivo ou in vitro para formar partículas virais recombinantes ou vírus-like, e administrados a um hospedeiro para despertar uma resposta imune. Nanopartículas - Em um aspecto, o peptídeo pode ser ligado a materiais não protéicos como, por exemplo, nanopartículas e outros substratos. As nanopartículas têm tipicamente cerca de 1 nm a 200 nm de diâmetro e podem ser

. 44/108 usadas para fornecer a liberação de peptídeos imunogênicos a um indivíduo. Um ou mais peptídeos podem ser anexados a uma nanopartícula por interações químicas covalentes ou não - covalentes. As interações químicas não covalentes podem incluir afinidade (por exemplo, avidina/biotina, antígeno/anticorpo, receptor/ligante), interação iônica, e/ou interação hidrofóbica. Os métodos para a anexação de peptídeos a suportes sólidos como nanopartículas são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente U.S.

2004/0258698. As nanopartículas que têm um diâmetro de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm podem ser liberadas sistemicamente. Como aqui usado, Oo termo “nanopartícula” significa uma esfera de polímero ou esferóide que pode ser formulada para ter uma superfície ordenada regular de moléculas definidas, atadas na escala de nanômetro (cerca de 1 nm a 500 nm). Preferivelmente, os monômeros de automontagem são utilizados para formar as nanopartículas. Além disso, o termo nanopartícula engloba o uso de | lipossomos polimerizados e não polimerizados, bicelas e ij micelas bem como estruturas de capsídeo viral. Embora as nanopartículas sejam preferidas para as composições e métodos da presente invenção, outras estruturas, scaffolds e outras “apresentações” como dendrímeros podem ser usados como estará dentro do conhecimento de pessoa habilitada na técnica como sendo adequado para apresentar ligantes de acordo com a presente invenção. Polivalent nanoparticles Publicação U.S. 20030223938.

Os peptídeos da invenção podem ser administrados em uma composição lipossômica. O lipossomo da presente invenção pode ser vesícula multilamelar (MLV). O lipossomo

. 45/108 | compreende lipídeos formadores de lipossomo que têm uma porção de ponta hidrofílica e uma porção polar ou quimicamente reativa que por sua vez compreende um ácido, - álcool, aldeído, amina ou éster.

Os lipossomos podem ser também caracterizados por cadeias de hidrocarboneto ou i grupo de ponta esteróide e um grupo de cabeça polar.

Os lipídeos formadores de lipossomo compreendem um fosfolipídeo.

Exemplos de fosfolipídeos adequados incluem, sem limitação, ácido fosfatídico, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil glicerol, fosfatidilinositol e esfingomielina.

As substancias que podem ser encapsuladas ou ligadas aos lipossomos da presente invenção incluem proteínas e peptídeos.

Em algumas modalidades, a substância compreende mais de um composto.

Os peptídeos da invenção podem | compreender ou ser conjugadas a uma porção lipofílica que | localiza os peptídeos à superfície do lipídeo.

Os peptídeos de multitipo podem ser localizados na superfície do lipossomo.

Veja a Publicação de Patente U.S. 20060035853. C.

Adjuvantes e outros componentes imunoestimulantes ou de intensificação A imunogenicidade do polipeptídeo ou peptídeo ou composições de peptídeo de HPV de multitipo pode ser aumentada pelo uso de estimuladores adicionais não específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes.

Adjuvantes adequados incluem todos os compostos imunoestimulantes aceitáveis, como citocinas, toxinas, ou composições sintéticas.

Inúmeros adjuvantes podem ser usados para aumentar uma resposta de anticorpo contra um polipeptídeo de HPV de o NO NS O A MS SO MS p 46/108 ] | multitipo ou qualquer outra composição aqui descrita. Os | adjuvantes podem ser usados para (1) aprisionar o antígeno no corpo para causar uma liberação retardada; (2) atrair . células envolvidas na resposta imune ao local de administração; (3) induzir a proliferação ou ativação de ' células do sistema imune; ou (4) melhorar a disseminação do antígeno por todo o corpo do indivíduo. As formulações de adjuvante incluem, sem limitação, emulsões óleo-em-água, emulsões água-em-óleo, sais minerais, polinucleotídeos, e substâncias naturais.

Adjuvantes específicos que podem ser usados incluem IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, 7-interferon, GMCSP, BCG, sais de alumínio, como hidróxido de alumínio ou ouro composto de alumínio, compostos de MDP, como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídeo A, e monofosforil lipídeo A (MPL). RIBI, que contém três componentes extraído de bactéria, MPL, trehalose dimicolato (TDM), e esqueleto de parede celular (CWS) em um emulsão a 2% esqualeno/Tween 80, CpGl1018, e/ou GPI-0100, que incluem várias combinações desses. Em certos aspectos, um adjuvante é um CpG1018 ou GPI- 0100 combinado com um ou mais de TWEEN"" ou alume ou combinações desses antígenos MHC podem ser também usados. Outros adjuvantes ou métodos são exemplificados nas Patentes U.S. 6.814.971,

5.084.269, 6.656.462, cada uma dessas é aqui incorporada por referência. Vários métodos de atingir um efeito adjuvante para vacina incluem o uso de agentes como hidróxido ou fosfato de alumínio (alume), comumente usados como uma solução a cerca de 0,05 a cerca de 0,1% em solução salina tamponada por fosfato, misturado com polímeros sintéticos de açúcares

Na NA | - 47/108 (CARBOPOLº) usados como uma solução a cerca de 0,25%, | agregação da proteína em um vacina por tratamento com calor | em temperaturas que variam entre cerca de 70º a cerca de i - 101ºC por um período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente.

A agregação por reativação com anticorpos i tratados com pepsina (Fab) para albumina; mistura com células bacterianas (por exemplo, C. parvum), endotoxinas ou componentes lipopolissacarídeos de bactérias gram- negativas; emulsão em veículos oleosos fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, manida monooleato (Aracel A)); ou emulsão com uma solução a 20% de um perfluorcarbono (FLUOSOL-DAº) usado como um substituto em bloco e também pode ser empregado para produzir um efeito adjuvante.

Um adjuvante típico é adjuvante completo de Freund (que contém Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes incompletos de Freund, e hidróxido de alumínio.

Além de adjuvantes, pode ser desejável co-administrar modificadores de resposta biológica (BRM) para melhorar as respostas imunes.

BRMs supra-regulam à imunidade de célula T ou infra-regulan a atividade supressora celular.

Tais BRMs incluem, sem limitação, Cimetidina (CIM; 1.200 mg/d) (Smith/Kline, PA); ou Ciclofosfamida de baixa dose (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NI) e citocinas como 7- interferon, IL-2, ou IL-12 ou genes que codificam proteínas envolvidas nas funções imunes helper, como B-7. Epitopos T helper - Dois tipos de linfócitos T principais foram descritos, linfócitos citotóxicos CD8+ (CTLsS) e células helper CD4 (células Th). As células T CD8+ são células efetoras que, por meio do receptor de célula T (TCR), reconhece antígenos estranhos apresentados por

- 48/108 moléculas MHC classe I em, por exemplo, células infectadas por vírus ou bactérias.

Após reconhecimento dos antígenos estranhos, as células CD8+ sofrem um processo de ativação, - maturação e proliferação.

Esse processo de diferenciação resulta em clones de CTL que têm a capacidade de destruição i das células alvo que apresentam antígenos estranhos.

As células T helper, por outro lado, estão envolvidas em formas humorais e mediadas por célula de respostas imunes efetoras.

Com relação à resposta imune humoral, ou de anticorpo, os anticorpos são produzidos por linfócitos B através de interações com células Th.

Especificamente, antígenos extracelulares, como micróbios circulantes, são retidos por células que apresentam antígeno especializadas (APCsS), processados, e apresentados em associação com moléculas do complexo de histocompatibilidade principal classe IT (MHC) para células CD4+ Th.

Essas células Th por sua vez ativam os linfócitos B, resultando na produção de anticorpo.

A resposta imune mediada por célula, ou celular, em contraste, funciona para neutralizar micróbios que habitam localizações intracelulares, como depois de infecção bem sucedida de uma célula alvo.

Antígenos estranhos, como por exemplo, antígenos microbianos, são sintetizados nas células infectadas e apresentados na superfície de tais células em associação com moléculas MHC ij Classe IT.

A apresentação de tais epitopos leva à estimulação acima descrita de CD8+ CTLS, um processo que | também é estimulado por células CD4+ Th.

As células Th são | compostas de pelo menos duas subpopulações distintas, denominadas células Thl e Th2. Os subtipos Thl e Th2 representam populações polarizadas de células Th que se ])

- 49/108 diferenciam de precursores comuns depois da exposição ao antígeno.

Em alguns aspectos, um polipeptídeo de HPV de . multitipo também pode compreender um indutor preferencial de um tipo de resposta Thl ou a Th2. Altos níveis de citocinas tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula a um dado antígeno, enquanto altos níveis de citocinas tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.

A distinção entre resposta imune tipo Thl1 e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo sustentará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2. No entanto, é frequentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquelas descritas em clones de células T CD4+ de murídeo por Mosmann e Coffman (Mosmann e Coffman, 1989).

Tradicionalmente, as respostas tipo Thl são associadas à produção de INF-y e citocinas IL-2 por linfócitos T. Outras citocinas frequentemente associadas diretamente à indução de respostas imunes tipo Th1 não são produzidas por células T, como IL-l12. em contraste, as respostas tipo Th2 são associadas à secreção de IL- 4, IL-5, IL-6, IL-10.

Em certos aspectos, epitopos Th incluem, sem limitação, epitopos de célula T derivados de proteínas e toxinas bacterianas, como toxinas tetânica e diftérica. Por exemplo, os epitopos P2 e P30 da toxinas tetânica, antígeno de núcleo de Hepatite B, tuberculose, Mycobacterium tuberculosis RAl2 (uma subsequência (aminoácidos 192 a 323) de MTB32A (Skeiky e cols. 1999)), proteína p25 de morbillivrus/vírus da cinomose canina: KLIPNASLIENCTKAEL (Id. de Seq. Nº: 117) PV (poliovírus) sequência 103-115: KLFAVWKITYKDT (Id. de Seq. Nº: 118) M5: NKLIAYPAVEALS (Id.

- de Seq. Nº: 119), TT (toxina ."tetânica) 830-844: QYIKANSKFIGITEL (Id. de Seq. Nº: 120), PADRE: aKXVMWTLKAAa (a=D-Ala, X=L-cyclohexyl-Ala) (Id. de Seq. Nº: 121), E7 p20-29 TDLYCYEQLN (Id. de Seg. Nº: 122), E7 p45-54: AEPDRAHYNI (1d. de Seq. Nº: 123), E7 p60-79: KCDSTLRLCVQOSTHVIRTL (Id. de Seq. Nº: 124), E7 p85-94: GTLGIVGPIC (Id. de Seq. Nº: 125), ras p5-17: KLVVVGARGVGKS (Id. de Seq. Nº: 126), neu p42-56: HLDMLRHLYQGGQVV (Id. de Seq. Nº: 127), neu p783-797, SRLLGICLTSTVQLV (Id. de Seq. Nº: 128), e MAGE-3121.134: LLKYRAREPVTKAE (Id. de Seq. Nº: 129)).

Agonista de Receptor Toll-like - é agora amplamente reconhecido que a geração de imunidade protetora depende não apenas da exposição ao antígeno, mas também do contexto em que o antígeno é encontrado. Existem numerosos exemplos em que a introdução de um novo antígeno em um hospedeiro em um contexto inflamatório gera tolerância imunológica em vez de imunidade de longa duração enquanto a exposição ao antígeno na presença de um agente inflamatório (adjuvante) induz imunidade. (Mondino e cols., 1996; Pulendran e cols., 1998; Jenkins e cols., 1994; e Keamey e cols., Immunity 1: 327, 1994). Uma vez que ele pode significar a diferença entre tolerância e imunidade, têm sido feitos esforços para a descoberta dos “adjuvantes” presentes nos agentes infecciosos que estimulam as vias moleculares envolvidas na criação do contexto imunogênico adequado de apresentação de antígeno. É agora conhecido que uma boa parte da atividade

. 51/108 do adjuvante é devida a interações de produtos microbianos e virais com diferentes membros dos Receptores Toll Like (TLRs) expressos em células imunes (Beutler e cols., 2004; . Kaisho, 2002; Akira e cols., 2003; e Takeda e Akira, 2004). Os TLRs são denominados por sua homologia a uma molécula na Drosophila, chamada Toll, que age no desenvolvimento dessa e está envolvida na imunidade antimicrobiana (Lernaitre e cols., 1996; e Hashimoto e cols., 1988). Trabalho prévio mostrou que os homólogos de mamífero para Toll e moléculas da via Toll eram críticos para a capacidade das células do sistema imune inato de responder a desafios microbianos e subprodutos microbianos (Medzhitov e cols., 1997; Medzhitov e cols., 1998; Medzhitov e cols., 2000; Medzhitov e cols., 2000; e Janeway e cols., 2002). | 15 Desde a identificação de LPS como um agonista de TLR4 (Poltorok e cols., 1998) numerosos outros agonistas de TLR foram descritos como tri-acil polipeptídeos de HPV de multitipo (TLRI), peptidoglicano, ácido lipoteicoico e Pam3Cys (TLR2), dsRNA (TLM), flagelina (TLRS), diacil polipeptídeos de HPV de multitipo como Malp-2 (TLR6), imidazoquinolinas e RNA de filamento único (TLR7,8), DNA bacteriano, sequências de DNA de CpG não metilado, e até mesmo complexos de anticorpo de DNA genômico humano (TLR9) ( Takeuchi e cols., 2001; Edwards e cols., 2002; Hayashi e cols., 2003; Nagase e cols., 2003).

Em certos aspectos, ligantes de TLR2 incluem, sem limitação, ácido lipoteicóico, ácidos manurônicos, peptidoglicanos, LPS atípico, MALP-2 e MALP-404 (lipoproteínas), OspaA, Porin, LcrV, lipomanana, âncora de GPI, lisofosfatidilserina, lipofosfoglicano (LPG),

. 52/108 glicofosfatidilinositol (GPI), zimosana, hemaglutinina e | análogos ou derivados desses.

Em um aspecto adicional, o agonista de TLR2 inclui lipopeptídeo bacteriano de M . tuborculosis, B. burgdorferi, T. pallidum; peptidoglicanos de espécies que incluem Staphylococcus aureus; Neisseria porins, fimbrias bacterianas, fatores de virulência de Yersina, vírions de CMV, hemaglutinina de sarampo e zimosana de levedura.

Em certos aspectos, o agonista de TLR é uma porção lipídica.

As porções lipídicas incluem, sem limitação, ácidos graxos como grupos palmitoil, miristoil, estearoil e decanoil ou, mais geralmente, qualquer grupo acil graxo saturado, monoinsaturado, ou poliinsaturado C2 a C30. Em certos aspectos a porção lipídica é uma porção Pam2Cys [S- [2,3-bis (palmitoiloxi)propil]cisteína] ou Pam3Cys [N- palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)propil]cisteína]. Pam3Cys ou Pam3CysOH (Wiesmuller e cols., 1983), é uma versão sintética da porção N-terminal da lipoproteína de Braun que atravessa as membranas interna e externa de bactérias Gram negativas (Patente U.S. 5.700.910 por exemplo, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência). Agonistas de TLR adicionais são descritos na Publicação de Patente U.S. 20080145375, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência.

D.

Componentes e porções lipídicos Em certas modalidades, a presente invenção relaciona- se a composições que compreendem um ou mais lipídeos não covalentemente associados a um peptídeo de HPV de multitipo.

Um lipídeo é uma substância que é insolúvel em água e extraível com um solvente orgânico.

Compostos diferentes daqueles especificamente aqui descritos são conhecidos por pessoa habilitada na técnica como lipídeos, e são englobados pelas composições e métodos da presente invenção.

i 5 Um lipídeo podem ser um lipídeo de ocorrência natural ' ou um lipídeo sintético. No entanto, um lipídeo é comumente uma substância biológica. Os lipídeos biológicos são bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, gorduras neutras, fosfolipídeos, fosfoglicerídeos, esteróides, terpenos, lisolipídeos, glicosfingolipídeos, glicolipídeos, sulfatidas, lipídeos com ácidos graxos ligados a éter e éster e lipídeos polimerizáveis e combinações desses. Um peptídeo de HPV de multitipo associado a um lipídeo pode ser disperso em uma solução que contém um lipídeo, dissolvido com um lipídeo, emulsificado com um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinada com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo ou associado a um lipídeo. Uma composição associada a lipídeo da presente invenção não é limitada a qualquer estrutura em particular. Por exemplo, eles também podem ser simplesmente dispersos em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou formato. Em outro exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura “colapsada”. Em outro exemplo não limitante, uma lipofectamina (Gibco BRL) ou complexo Superfect (Qiagen) é também contemplado. Em certas modalidades, a composição pode compreender cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4% cerca de | 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, Í cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, |

Do PAR . 54/108 cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, | cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, ! cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, . cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, | cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% em peso de lipídeo, ou qualquer faixa ou valor entre esses, de um lipídeo particular, tipo de lipídeo, ou componente não lipídico como um adjuvante, açúcar, ácido nucleico ou outro material aqui revelado ou conhecido por pessoa habilitada na técnica.

Portanto, é contemplado que as composições da presente invenção podem compreender qualquer um dos lipídeos, tipos de lipídeo, ou outros componentes em qualquer combinação ou faixa de percentagem.

. 55/108 II. Produção de polipeptídeos e fragmentos desses A. Síntese de polipeptídeo e/ou conjugação Em certos aspectos os polipeptídeos podem ser - sintetizados com o uso de métodos convencionais como modificados para as sequências de aminoácidos particulares. Tais técnicas incluem, sem limitação, métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica de síntese de | peptídeo, por exemplo, síntese de fase de solução (veja, Finn e Hoffman, 1976), ou síntese de fase sólida (veja Barany e Merrifield, 1979), ou síntese de fase sólida escalonada como relatado por Merrifield (1963), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Outras referências a técnicas de síntese de peptídeos incluem peptídeos sintetizados pelo modo de Fmoc-poliamida de síntese de peptídeo de fase sólida como revelado por lu e cols. (1981), peptídeos sintetizados com o uso de um procedimento de Fmoc/tBu (Atherton e Sheppard, 1989). Os | aminoácidos Fmoc podem ser obtidos a partir de vários | fornecedores, por exemplo, Chem-Impex International (Wood Dale, Ill., USA), Merck Biosciences (Nottingham, UK), e Bachem UK Ltd. (St. Helens, UK).

Depois ou durante a síntese, um peptídeo pode ser conjugado a um espaçador, um aminoácido, um polímero ou um lipídeo. Em certos aspectos, o grupo de cadeia lateral terminal de uma lisina ou um análogo de lisina (por exemplo, grupo amino épsilon da lisina interna) é protegido por um de inúmero de grupos de proteção. Os grupos de bloqueio ou grupos de proteção ou grupos de mascaramento são usados para proteger o grupo amino do aminoácido que tem um grupo carboxil ativado que está envolvido na reação

. 56/108 de ligação, ou para proteger o grupo carboxil do aminoácido que tem um grupo amino acilado que está envolvido na reação de ligação.

Para que ocorra ligação, um grupo de bloqueio . deve ser removido sem romper uma ligação de peptídeo, ou : 5 qualquer grupo de proteção anexado a outra parte do peptídeo.

Os peptídeos podem ser lipidados por métodos bem conhecidos na técnica.

Reações padrão de condensação, adição, substituição ou oxidação (por exemplo, formação de ponte de dissulfeto ou formação de ligação de amida entre um grupo amino terminal na lisina interna ou análogo de lisina no grupo carboxi terminal de um aminoácido ou peptídeo ou lipoaminoácido) resultam na adição de lipídeo : ao peptídeo. | B.

Sistemas de expressão | 215 Expressão, isolação e purificação dos polipeptídeos e fragmentos da invenção podem ser realizados por qualquer técnica adequada.

A presente invenção também fornece vetores de clonagem e expressão recombinantes que contêm DNA, bem como célula hospedeira que contêm os vetores recombinantes.

Vetores de expressão que compreendem DNA podem ser usados para preparar os polipeptídeos ou fragmentos da invenção codificados pelo DNA.

Um método para a produção de polipeptídeos compreende a cultura de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão recombinante que codifica o polipeptídeo, sob condições que promovem a expressão do polipeptídeo, então recuperação dos polipeptídeos expressos da cultura.

O profissional habilitado reconhecerá que o procedimento para purificação dos polipeptídeos expressos irá variar de acordo com tais

: 57/108 fatores como o tipo de células hospedeiras empregada, e se o polipeptídeo é ligado a membrana ou uma forma solúvel que é secretada a partir da célula hospedeira. Os polipeptídeos - da invenção podem incluir várias sequências líderes que direcionam o tráfego ou ajudam na purificação.

i Qualquer sistema de expressão adequado pode ser empregado. Os vetores incluem um DNA que codifica um polipeptídeo ou fragmento da invenção, operacionalmente ligado a sequências de nucleotídeos reguladoras de transcrição ou tradução adequadas, como aquelas derivadas de um gene de mamífero, microbiano, viral, ou de inseto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores de transcrição, operadores, ou intensificadores, um sítio de ligação ribossômica de mRNA, e sequências adequadas que controlam o início e término da transcrição e tradução. As sequências de nucleotídeos são operacionalmente ligadas | quando a sequência reguladora relaciona-se funcionalmente à | sequência de DNA. Portanto, uma sequência de nucleotídeos ! promotora é operacionalmente ligada a uma sequência de DNA de a sequência de nucleotídeos promotora controla a transcrição da sequência de DNA. Uma origem de replicação que confere a capacidade de replicar nas células hospedeiras desejadas e um gene de seleção pelo qual os transformantes são identificados são geralmente incorporados no vetor de expressão.

Em adição, a sequência que codifica um peptídeo de sinal adequado (nativo ou heterólogo) pode ser incorporada em vetores de expressão. Uma sequência de DNA para um peptídeo de sinal (líder secretora) pode ser fundida em estrutura à sequência de ácidos nucleicos da invenção de

| ma | | 58/108 | | modo que o DNA é inicialmente transcrito, e o mRNA traduzido, em uma proteína de fusão que compreendem o | peptídeo de sinal. Um peptídeo de sinal que é funcional nas | . células hospedeiras pretendidas — promove a secreção extracelular do polipeptídeo. O peptídeo de sinal é clivado do polipeptídeo após secreção de polipeptídeo da célula. O profissional habilitado também reconhecerá que as posições em que o peptídeo de sinal é clivado podem diferir daquelas previstas por programa de computador, e podem variar de acordo com tais fatores como o tipo de células hospedeiras empregadas na expressão de um polipeptídeo recombinante. A preparação de proteína pode incluir uma mistura de moléculas de proteína que têm diferentes aminoácidos N-terminais, que resultan da clivagem do peptídeo de sinal em mais de um local. células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos incluem células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores. Células de mamífero ou inseto são geralmente preferidas para uso como células hospedeiras. A clonagem adequada e vetores de expressão para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamíferos são descritos, por exemplo, em Pouwels e cols. (1985). Os sistemas de tradução livres de células também podem ser empregados para produzir polipeptídeos com o uso de RNASs derivados de construções de DNA aqui reveladas.

1. Sistemas Procarióticos Procariontes “incluem organismos gram-negativos Ou gram-positivos. Células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies

| a SS - 59/108 nos gêneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Em uma célula hospedeira procariótica,y como E. coli, um polipeptídeo pode incluir um resíduo de metionina N- . terminal para facilitar a expressão do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira procariótica. A Met N- terminal pode ser clivada do polipeptídeo recombinante expresso.

Vetores de expressão para uso nas células hospedeiras procarióticas geralmente compreendem um ou mais genes fenotípicos de marcador selecionável. Um gene fenotípico de marcador selecionável é, por exemplo, um gene que codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos ou que supre uma necessidade autotrófica. Exemplos de vetores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas incluem aqueles derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis como o vetor de clonagem pBR322 (ATCC 37017).

pPBR322 contém genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e assim fornece meio simples para a identificação de células transformadas. Um promotor adequado e a sequência de DNA são inseridos no vetor pBR322. Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) e pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., USA).

As sequências promotoras comumente usadas para vetores de expressão de células hospedeiras procarióticas recombinantes incluem fB-lactamase (penicilinase), sistema promotor de lactose (Chang e cols., 1978; e Goeddel e cols., 1979), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel e cols., 1980; e EP-A-36776) e promotor tac (Maniatis, 1982). Um sistema de expressão de célula hospedeira

| Ú 60/108 | procariótica particularmente útil emprega um promotor de fago XPL e uma sequência repressora termolábil cl857ts. Vetores de plasmídeo disponíveis pela “American Type . Culture Collection” que incorporam derivados do promotor XPL incluem plasmídeo pHUB2 (residente na cepa de E. coli JMB9, ATCC 37092) e pPLc28 (residente em E. coli RRl, ATCC 53082).

2. Sistemas de levedura Alternativamente, os polipeptídeos podem ser expressos em células hospedeiras de levedura, preferivelmente do gênero Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae). Outros gêneros de leveduras, como Pichia ou Kluyveromyces, também podem ser empregados. Os vetores de levedura frequentemente conterão uma sequência de origem de replicação de um plasmídeo de levedura 24, uma sequência autonomicamente replicante (ARS), uma região promotora, sequências para poliadenilação, sequências para terminação de transcrição, e um gene de marcador selecionável. Sequências promotoras adequadas para vetores de levedura incluem, entre outros, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman e cols., 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess e cols., 1968; e Holland e cols., 1978), como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfo-glicose isomerase, e glicoquinase. Outros vetores e promotores adequados para uso na expressão de levedura são também descritos no pedido de patente européia 73.657. Outra alternativa é o promotor ADH2 repressível de glicose

Na | - 61/108 | i | descrito por Russell e cols. (1982) e Beier e cols. (1982). | Vetores shuttle replicáveis em levedura e em E. coli podem | ser construídos por inserção de sequências de DNA de pBR322 | . para seleção e replicação em E. coli (Ampr gene e origem de replicação) nos vetores de levedura acima descritos. A sequência líder de fator a de levedura pode ser empregada para direcionar a secreção do polipeptídeo. A sequência líder de fator a é frequentemente inserida entre a sequência promotora e a sequência de gene estrutural. Veja, por exemplo, Kurjan e cols., 1982 e Bitter e cols.,

1984. Outras sequências líderes adequadas para facilitar a secreção de polipeptídeos recombinantes de hospedeiros de levedura são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Uma segúência líder pode ser modificada próximo a sua extremidade 3' para conter um ou mais sítios de restrição. Isso facilitará a fusão da seqúência líder ao gene estrutural. Protocolos de transformação de levedura são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Tal protocolo é descrito por Hinnen e cols., 1978. O protocolo de Hinnen e cols. seleciona por transformantes Trp+ em um meio seletivo, em que o meio seletivo consiste em 0,67% base de nitrogênio de levedura, 0,5% casamino ácidos, 2% glicose, 10 mg/ml adenina e 20 mg/ml uracil. As células hospedeiras de levedura transformadas por vetores que contêm uma sequência promotora ADH2 podem crescer para indução da expressão em um meio “rico”. Um exemplo de um meio rico é um que consiste em 1% extrato de levedura, 2% peptona, e 1% glicose suplementado com 80 mg/ml adenina e 80 mg/ml uracil. A desrepressão do promotor

- 62/108 ADH2 ocorre quando a glicose é esgotada do meio.

3. Sistemas de mamífero ou inseto Sistemas de cultura de célula hospedeira de mamífero . ou inseto também podem ser empregados para expressar polipeptídeo recombinantes. Sistemas de Baculovírus para a i produção de proteínas heterólogas em células de inseto são revistos por Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Linhagens de células estabelecidas de origem em mamífero tambén podem ser empregadas. Exemplos de linhagens adequadas de célula hospedeira de mamífero incluem a | linhagem COS-7 de células de rim de macaco (ATCC CRL 1651) | (Gluzman e cols., 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster da china (CHO), células HeLa, e linhagens de células BHK (ATCC CRL 10), e a linhagem de células CV1/EBNA derivada da linhagem de células de rim de macaco verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan e cols. (1991). Os métodos estabelecidos para a introdução de DNA em células de mamífero foram descritos (Kaufman, 1990). Protocolos adicionais que usam reagentes comercialmente disponíveis, como reagente lipídico de Lipofectamina (Gibco/BRL) ou reagente lipídico Lipofectamina-Plus, podem ser usados para transfectar as células (Feigner e cols., 1987). Em adição, eletroporação pode ser usada para transfectar células de mamífero com o uso de procedimentos convencionais, como aqueles em Sambrook e cols. (1989). A seleção de transformantes estáveis pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, resistência a fármacos citotóxicos. Kaufman e cols., 1990, descrevem vários esquemas de seleção, como resistência a

Do o eci õDácÔcÔcçcõcâÓtcâihççr o ocrâó »àÔ]õcoõooeójiÓcÓrcMOo AT ADE - 63/108 diidrofolato redutase (DHFR). Uma cepa hospedeira adequada para selcao de DHFR pode ser cepa DX-Bll de CHO, que é deficiente de DHFR (Urlaub e Chasin, 1980). Um plasmídeo - que expressa o cDNA de DHFR pode ser introduzido na cepa DX-Bll, e apenas as células que contêm o plasmídeo podem crescer no meio seletivo adequado.

Outros exemplos de marcadores selecionáveis que podem ser incorporados em um vetor de expressão incluem cDNAS que conferem resistência a antibióticos, como G418 e higromicina B.

As células que abrigan o vetor podem ser selecionadas com base na resistência a esses compostos.

As sequências de controle de transcrição e tradução para vetores de expressão de célula hospedeira de mamífero podem ser retirados dos genomas virais.

Sequências promotoras comumente usadas e sequências intensificadoras são derivadas de polioma vírus, adenovírus 2, vírus símio 40 (SV40), e citomegalovírus humano.

As sequências de DNA | derivadas do genoma viral de SV40, por exemplo, origem de | SV40, promotor precoce e tardio, intensificador, de junção, ! e sítios de poliadenilação podem ser usadas para fornecer outros elementos genéticos para a expressão de uma sequência de gene estrutural em uma célula hospedeira de mamífero.

Os promotores virais precoces e tardios são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos a partir de um genoma viral como um fragmento, que também pode conter uma origem viral de replicação (Fiers e cols., 1978; Kaufman, 1990). As sequências de controle adicionais que melhoram a expressão de genes heterólogos de vetores de expressão de mamífero incluem tais elementos como o elemento de

. | . 64/108 sequência de aumento de expressão (EASE) derivado de células CHO (Morris e cols., Animal Cell Technology, 1997, Pp. 529-534 e Pedido PCT WO 97/25420) e o líder de . tripartite (TPL) e RNAs de gene VA de Adenovírus 2 | (Gingeras e cols., J.

Biol.

Chem. 257:13.475-13.491, 1982). | | As sequências de sítio de entrada de ribossomo interno | (IRES) de origem viral permitem que sejam traduzidos mRNAS | bi-cistrônicos de modo eficiente (Oh e Sarnow, 1993; Ramesh ! e cols., 1996). A expressão de um cDNA heterólogo como parte de um mMRNA bi-cistrônico seguida pelo gene para um marcador selecionável (por exemplo, DHFR) mostrou melhorar a transfectabilidade do hospedeiro e expressão do cDNA heterólogo (Kaufman, 1990). Exemplos de vetores de expressão que empregam mRNAsS bi-cistrônicos são pTRDC/GFP descrito por Mosser e cols. (1997), e p2A5I descrito por Morris e cols. (1997). Um vetor de alta expressão útil, pCAVNOT, foi descrito por Mosley e cols. (1989). Outros vetores de expressão para uso em células hospedeiras de mamífero podem ser construídos como revelado por Okayama e Berg (1983). Um sistema útil para expressão estável de alto nível de cDNAs de mamífero em células epiteliais mamárias Cl127 de murídeo pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman e cols. (1986). Um vetor de alta expressão útil, PMLSV N1I/N4, descrito por Cosman e cols. (1984), foi depositado como ATCC 39890. Vetores de expressão de mamífero úteis adicionais são descritos em EP-A-0367566, e em WO 91/18982, aqui incorporados por referência.

Ainda como alternativa, os vetores podem ser derivados de retrovírus.

. 65/108 Vetores de expressão úteis adicionais, pFLAGº e pDC311, também podem ser usados.

A tecnologia FLAGº é centrada na fusão de um peptídeo marcador de baixo peso . molecular (1 KkD), hidrofílico, FLAGº para o N-terminal de uma proteína recombinante expressa por vetores de expressão i PpFLAGº. pDC3l1l é outro vetor especializado usado para expressão de proteínas em células CHO. pDC311 é caracterizado pela sequência bi-cistrônica que contém o gene de interesse e um gene de diidrofolato redutase (DHFR) com um sítio de ligação de ribossomo interno para tradução de DHFR, um elemento de sequência de aumento de expressão (EASE), oO promotor CMV humano, uma sequência líder tripartite, e um sítio de poliadenilação.

Com relação aos peptídeos de sinal que podem ser empregados, o peptídeo de sinal nativo pode ser substituído por um peptídeo de sinal heterólogo ou sequência líder, se desejado.

A escolha do peptídeo de sinal ou líder pode depender de fatores como o tipo de células hospedeiras em que o polipeptídeo recombinante será produzido.

Para ilustrar, exemplos de peptídeos de sinal heterólogos que são funcionais em células hospedeiras de mamífero incluem a sequência de sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente U.S. 4.965.195; a seqúência de sinal para receptor de interleucina-2 descrita em Cosman e cols., Nature 312:768 (1984); O peptídeo de sinal de receptor de interleucina-4 descrito em EP 367.566; o peptídeo de sinal de receptor de interleucina-l1 tipo I descrito na Patente U.S. 4.968.607; e oO peptídeo de sinal de receptor de interleucina-l1 tipo II descrito em EP 460,846. C.

Isolação e purificação

. 66/108 A invenção também inclui métodos de isolação e purificação dos polipeptídeos e fragmentos desses.

Em uma modalidade, a purificação de polipeptídeos - recombinantes ou fragmentos pode ser realizada com o uso de fusões de polipeptídeos ou fragmentos da invenção a outro i polipeptídeo para ajudar na purificação de polipeptídeos ou fragmentos da invenção. Tais parceiros de fusão podem incluir poli-His ou outros peptídeos de identificação antigênicos acima descritos bem como porções Fc.

Com relação a qualquer tipo de célula hospedeira, como é conhecido pelo profissional habilitado, os procedimentos para a purificação de um polipeptídeo recombinante ou fragmento irão variar de acordo com tais fatores como o tipo de células hospedeiras empregadas e se o polipeptídeo recombinante ou fragmento é secretado ou não no meio de cultura.

Em geral, o polipeptídeo recombinante ou fragmento | pode ser isolado de células hospedeiras se não secretado, | ou do meio ou sobrenadante se solúvel e secretado, seguido por uma ou mais etapas de concentração, retirada de sal, troca iônica, interação hidrofóbica, purificação por afinidade ou cromatografia de exclusão por tamanho. Com relação a formas específicas de realizar essas etapas, oO meio de cultura primeiro pode ser concentrado com o uso de um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado à uma matriz de purificação como um meio de filtração a gel. Alternativamente, uma resina de troca aniônica pode ser empregada, por exemplo,

ANNA | - 67/108 uma matriz ou substrato que tem grupos dietilaminoetil (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrana, celulose ou outros tipos comumente - empregados na purificação de proteína. Alternativamente, uma etapa de troca catiônica pode ser empregada. Agentes de troca catiônica adequados incluem várias matrizes | insolúveis que compreendem grupos sulfopropil ou | carboximetil. Além disso, uma etapa de cromatofoco pode ser empregada. Alternativamente, uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica pode ser empregada. Matrizes adequadas podem ser porções fenil ou octil ligadas a resinas. Em adição, a cromatografia por afinidade com uma matriz que liga seletivamente a proteína recombinante pode ser empregada. Exemplos de tais resinas empregadas são colunas de lectina, colunas de corante, e colunas de quelação de metal. Finalmente, uma Ou mais etapas de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) que empregam meio hidrofóbico de RP-HPLC, (por exemplo, sílica gel ou resina polimérica que têm grupos pendentes metil, octil, octildecil Ou outros grupos alifáticos) podem ser empregadas para também purificar os polipeptídeos. Algumas ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, são bem conhecidas e podem ser empregadas para fornecer uma proteína recombinante isolada e purificada.

Também é possível utilizar uma coluna de afinidade que compreende uma proteína de ligação de polipeptídeo, como um anticorpo monoclonal gerado contra os polipeptídeos da invenção, para purificar por afinidade os polipeptídeos expressos. Esses polipeptídeos podem ser removidos de uma

Po RS Ma mo 68/108 coluna de afinidade com o uso de técnicas convencionais, por exemplo, em um tampão de eluição de sal superior e então dialisados em um tampão de sal inferior para uso ou por modificação do pH ou outros componentes dependendo da | 5 matriz de afinidade utilizada, ou serem competitivamente | ' removidos com o uso do substrato de ocorrência natural da | porção de afinidade, como um polipeptídeo derivado da | invenção. | Nesse aspecto da invenção, proteínas de ligação de | 10 polipeptídeo, como os anticorpos anti-polipeptídeo da | invenção ou outras proteínas que podem interagir com o polipeptídeo da invenção, podem estar ligadas a um suporte | de fase sólida como uma matriz de cromatografia em coluna ou um substrato similar adequado para a identificação, | 15 separação ou purificação de células que expressam polipeptídeos da invenção em sua superfície. A aderência das proteínas de ligação de polipeptídeo da invenção a uma superfície de contato da fase sólida pode ser obtida por qualquer meio. Métodos de liberação de células positivamente selecionadas da fase sólida são conhecidos na técnica e englobam, por exemplo, o uso de enzimas. Estas enzimas são preferivelmente atóxicas e não prejudiciais às células e são preferivelmente dirigidas à clivagem da região de ligação da superfície celular.

O grau de pureza desejado depende do uso destinado da proteína. Um relativamente grau de pureza elevado é desejado quando o polipeptídeo tiver que ser administrado in vivo, por exemplo. Nesse caso, os polipeptídeos são purificados de tal forma que nenhuma banda de proteína que | 30 corresponda a outras proteínas seja detectável com análise

. 69/108 por SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Será reconhecido por aqueles habilitados no campo pertinente que múltiplas bandas que correspondem ao . polipeptídeo podem ser visualizadas por SDS-PAGE, em função da glicosilação diferencial, processamento pós-tradução diferencial, e semelhantes. Mais preferivelmente, o polipeptídeo da invenção é purificado até a homogeneidade substancial, como indicado por uma única banda de proteína mediante análise por SDS- PAGE. A banda de proteína pode ser visualizada por coloração com prata, coloração com azul Coomassie ou (se a proteína for marcada radioativamente) por auto-radiografia. ! III. FORMULAÇÃO E ADMINISTRAÇÃO O modo de administração das composições aqui descritas pode variar. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina é aplicável. Acredita-se que esses incluam aplicação oral em uma base sólida fisiologicamente aceitável ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, parenteralmente por injeção, inalação de um pó, por meio de um emplastro transcutâneo, por meio de instilação vaginal e semelhantes. A dosagem de uma vacina dependerá da via de administração e irá variar de acordo com o tamanho e a saúde do indivíduo. A preparação de vacinas que contêm seqúuência(s) de polipeptídeos ou peptídeos como ingredientes ativos é geralmente bem compreendida na técnica, como exemplificado pelas Patentes U.S. 4.608.251, 4.601.903, 4.599.231,

4.599.230, 4.596.792, e 4.578.770, todos aqui incorporados por referência. Tipicamente, essas vacinas são preparadas como injetáveis como soluções ou suspensões líquidas;

Da AI EE A AA EEE A ÃO A o Ad RR RE ooo oiii A o | | 70/108 formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada. O ingrediente . ativo imunogênico é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e ' compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados | são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, | etanol, ou semelhantes, e combinações desses. Além disso, | se desejado, a vacina pode conter quantidades de substâncias auxiliares como agentes umidificantes Ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH, ou adjuvantes que aumentam a eficácia das vacinas. Em modalidades específicas, as vacinas são formuladas com uma combinação de substâncias, como descrito nas Patentes U.S.

6.793.923 e 6.733.754, que são aqui incorporadas por referência. | Vacinas podem ser administradas por inalação. Em | certas modalidades, uma vacina pode ser administrada como | um aerossol. Como aqui usado, O termo "“aerossol” ou “composição aerossolizada” refere-se a uma suspensão de partículas sólidas ou líquidas em um gás. Os termos podem ser usados geralmente para se referir a uma composição que foi vaporizada, nebulizada ou de algum outro modo convertida de uma forma sólida ou líquida em uma forma inalável que inclui partículas suspensas sólidas Ou líquidas de fármaco. Esses aerossóis podem ser usados para liberar uma vacina através do sistema respiratório. Como aqui usado, “sistema respiratório” refere-se ao sistema de órgãos no corpo responsável pela entrada de oxigênio e à expiração de dióxido de carbono. O sistema geralmente

EN | . 71/108 inclui todas as passagens de ar do nariz aos alvéolos pulmonares. Em mamíferos, considera-se geralmente que inclua os pulmões, brônquios, bronquíolos, traquéia, . passagens nasais e diafragma. Para as finalidades da presente revelação, a liberação de uma vacina ao sistema respiratório indica um fármaco é liberado a uma ou mais das | passagens de ar do sistema respiratório, em particular aos | pulmões.

Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios (para aplicação anal ou vaginal) e, em alguns casos, formulações orais. Para supositórios, ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; esses supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10%, preferivelmente cerca de 1% a cerca de 2%. Formulações orais incluem include excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Essas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações ou pós de liberação sustentada e contêm cerca de 10% à cerca de 95% de ingrediente ativo, preferivelmente cerca de 25% a cerca de 70%.

As composições de polipeptídeo, peptídeo, e lipopeptídeo podem ser formuladas em uma vacina como formas neutras ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres do peptídeo) e aqueles que são formados com

| o Po | . 72/108 ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes.

Os . sais formados os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos, | e com bases orgânicas como, por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e semelhantes.

Em muitos casos, será desejável ter múltiplas administrações da vacina, normalmente, no máximo, pelo menos, ou que não excedam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais vacinações que incluem todos os valores entre estes.

As vacinações normalmente serão em intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, to 12 semanas/meses/anos, que incluem todos os valores e faixas entre esses, mais normalmente em intervalos de três a cinco semanas.

Tipicamente, reforços periódicos em intervalos de 1-15 anos, normalmente dez anos, serão desejáveis para manter níveis protetores dos anticorpos.

A evolução da imunização pode ser acompanhada por ensaios para anticorpos contra os antígenos, como descrito supra, Patentes U.S. 3.791.932, 4.174.384 e 3.949.064, que são ilustrativas desses tipos de ensaios.

A.

Terapia combinada As composições e métodos relacionados da presente invenção, particularmente a administração de um epitopo de HPV, que incluem um polipeptídeo ou peptídeo de uma proteína L2 de HPV, a um paciente/indivíduo, também podem ser usados em combinação com a administração de vacinas

TER A TITE A A A | PESE E E EEE E ooo A id E EEE E AD o ooo o 3 o Aa ooo Ai ooo o 3 oo E E ooo Ad o | i 73/108 para triagem de HPV e/ou outras vacinas, que incluem, sem limitação, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, esfregaços Pap, PCR, Southern blotting, administração de . vacinas para HPV CERVARIX", GARDASIL", ou para outros agentes infecciosos, terapia ablativa de lesões de HPV, ou semelhantes.

Em um aspecto, contempla-se que uma composição e/ou terapia de peptídeo de HPV é usada em conjunto com rastreamento de HPV e/ou outro tratamento. | Alternativamente, a terapia pode preceder ou se seguir a | outro tratamento por intervalos que variam de minutos a semanas. Em modalidades nas quais os outros agentes são administrados separadamente, deve-se geralmente assegurar que um período de tempo significativo não decorreu entre o tempo de cada liberação, de tal forma que oO agente e a composição antigênica ainda fossem capazes de exercer um efeito vantajosamente combinado sobre o indivíduo. Nesses casos, contempla-se que é possível administrar ambas as modalidades em até cerca de 12-24 h entre elas e, mais | 20 preferivelmente, em até cerca de 6-12 h entre elas. Em | algumas situações, no entanto, pode ser desejável prolongar | o período de tempo para administração significativamente, em que vários (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a vários meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) ou anos (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) são decorridos entre as respectivas administrações.

Várias combinações podem ser empregadas, por exemplo, um peptídeo de HPV de terapia multitipo é “A” e outra vacina ou anticorpo ou tratamento administrado como terapia, é “B”:

PA A A AD a o õOI3JocçoOâ TA Po A a - 74/108 A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A - B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A administração das composições imunogênicas da presente invenção a um paciente/indivíduo seguirá protocolos gerais para a administração destes compostos, Í levando-se em conta a toxicidade, se houver, da composição | de polipeptídeo de HPV de multitipo, ou da composição de qualquer antígeno ou combinação de antígenos aqui descrita.

Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos da forma necessária.

Contempla-se também que várias terapias padronizadas como, por exemplo, hidratação, podem ser aplicadas em combinação com a terapia descrita.

B.

Métodos preventivos e/ou terapêuticos Em algumas modalidades, composições farmacêuticas são administradas a um indivíduo.

Diferentes aspectos da presente invenção envolvem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo.

Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de peptídeo de HPV de multitipo são administradas ao paciente para proteger contra ou tratar infecção por pelo menos um ou mais patógenos de HPV.

Estas composições geralmente estarão dissolvidas ou dispersas em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável.

Como aqui usado, o termo “farmaceuticamente aceitável” ou “farmacologicamente aceitável” referem-se —* àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem

; 75/108 que estão dentro do escopo de uma avaliação médica sólida, adequadas para contacto com os tecidos de seres humanos e animais, sem toxicidade excessiva, irritação, resposta . alérgica, ou outras complicações problemáticas que proporcionan uma proporção risco/benefício razoável. O ' termo “veículo farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação, envolvido no transporte de um agente químico. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, e semelhantes. O uso desses meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto quando qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os ingredientes ativos, seu uso em composições imunogênicas e terapêuticas é contemplado.

Os compostos ativos da presente invenção podem ser formulados para administração parenteral, por exemplo, formulados para injeção pela via intravenosa, intramuscular, subcutânea ou até mesmo intraperitoneal. Em adição aos compostos formulados para administração por aerossol ou parenteral como, por exemplo, aqueles para injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; cápsulas de liberação temporizada.

Soluções dos compostos ativos como base livre ou sais

. 76/108 farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo como, por exemplo, hidroxipropilcelulose.

Dispersões também podem ser . preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas destes, e em óleos.

Sob condições usuais de estocagem e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações que incluem óleo de gergelim, óleo de amendoim, ou propileno glicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões | injetáveis estéreis.

Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida ao ponto de poder ser injetada facilmente.

Ela também deve ser estável sob as condições de fabricação e estocagem, e deve ser preservada contra a ação | contaminante de microorganismos, como bactérias e fungos. | As composições de polipeptídeos de HPV de multitipo podem ser formuladas em uma forma neutra ou de sal.

Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou como ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes.

Sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e com bases orgânicas como, por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.

- 77/108 O veículo também pode ser um solvente ou meio de dispersão que contêm, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno . glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas ! destes, e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser | mantida, por exemplo, com o uso de um revestimento como, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersão, e pelo uso de | tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ! | 10 feita por meio de vários agentes antibacterianos e ! antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ! ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser efetuada com oO uso nas composições de agentes de retardo da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários ingredientes enumerados acima, como necessário, seguida por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e técnicas de liofilização, que geram um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente desejado adicional de ima solução previamente

Do A o ooo oo Pi - 78/108 esterilizada por filtração deste.

A administração das composições de acordo com a presente invenção tipicamente será por meio de qualquer via . comum. Isso inclui, sem limitação, a administração oral, nasal ou bucal. Alternativamente, a administração pode ser Í por administração ortotópica, intradérmica, subcutânea, ! intramuscular, intraperitoneal, por supositório anal, intravaginal, respiratória ou intravenosa. Em certas modalidades, uma composição de vacina pode ser inalada (por exemplo, Patente U.S. 6.651.655, que é aqui especificamente incorporada por referência). Estas composições normalmente seriam administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis que incluem veículos, tampões Ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal., A esse respeito, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica à luz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em solução isotônica de NaCl e adicionada ao líquido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (veja, por exemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 1990). Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá, dependendo da condição do indivíduo. A pessoa responsável pela administração, em qualquer caso, irá determinar a dose apropriada para o paciente individual.

Uma quantidade eficaz da composição terapêutica Ou profilática é determinada com base no objetivo visado. O termo “dose unitária” ou “dosagem” refere-se às unidades fisicamente distintas adequadas para uso em um indivíduo, ' cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de uma composição calculada para produzir as respostas desejadas discutidas acima em associação com sua administração, ou seja, a via e o regime apropriados. A quantidade a ser administrada, tanto de acordo com número de tratamentos quanto com a dose unitária, depende da proteção desejada.

As quantidades precisas de uma composição também dependem da avaliação do profissional responsável e são peculiares para cada individual. Fatores que afetam a dose | incluem o estado físico e clínico do indivíduo, a via de | administração, o objetivo visado do tratamento (alívio de sintomas — versus cura), e potência, estabilidade e toxicidade da composição em particular.

Com à formulação, as soluções serão administradas em uma forma compatível com a formulação da dosagem e em tal quantidade que sejam terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em diversas formas de dosagem como, por exemplo, o tipo de soluções injetáveis descrido acima.

1. Administração in vitro, ex vivo ou in vivo Como aqui usado, o termo “administração in vitro” refere-se às manipulações realizadas em células removidas ou fora de um animal, que incluem, sem limitação, células em cultura. O termo “administração ex vivo" refere-se às células que foram manipuladas in vitro, e são

- 80/108 subsequentemente administradas e um animal vivo. O termo “administração in vivo” inclui todas as manipulações realizadas dentro de um animal. : Em certos aspectos da presente invenção, as composições podem ser administradas in vitro, ex vivo ou in vivo. Em certas modalidades in vitro, linhagens celulares autólogas de linfócitos B ou células dendríticas são incubadas com uma composição de HPV de multitipo. As células ativadas podem então serem usadas para análise in vitro ou, alternativamente, para administração ex vivo.

2. Anticorpos e imunização passiva Outro aspecto da invenção é um método de preparação de | uma imunoglobulina para uso na prevenção ou tratamento de infecção por HPV que compreendem as etapas de imunização de um receptor com uma vacina da invenção e o isolamento da imunoglobulina ou de anticorpos do receptor e/ou a produção de forma recombinante destas imunoglobulinas ou fragmentos destas. Uma imunoglobulina preparada por esse método é um aspecto adicional da invenção. Uma composição farmacêutica | 20 que compreende a imunoglobulina da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável é um aspecto adicional da invenção que poderia ser usado na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção por HPV. Um método para tratamento ou prevenção de infecção por HPV que compreende uma etapa de administração a um paciente de uma quantidade eficaz da preparação farmacêutica da invenção é um aspecto adicional da invenção. Os inóculos para a produção de anticorpo policlonal são tipicamente preparados por dispersão da composição antigênica em um diluente fisiologicamente tolerável como,

- 81/108 por exemplo, solução salina ou outros adjuvantes adequados para uso humano para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunoestimulante de inóculo é administrada a um - mamífero, por exemplo, um ser humano, e o indivíduo | 5 inoculado é então mantido por um tempo suficiente para que a composição antigênica induza anticorpos protetores. Os anticorpos podem ser isolados até o grau desejado por técnicas bem conhecidas como, por exemplo, cromatografia por afinidade (Harlow e Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual” 1988).

Os anticorpos podem incluir preparações de anti-soro a partir de vários animais comumente usados, por exemplo, cabras, primatas, burros, suínos, cavalos, porquinhos da Índia, ratos, ou humanos. O sangue dos animais é retirado e | 15 O soro é recuperado.

Uma imunoglobulina produzida de acordo com a presente invenção pode incluir anticorpos totais, fragmentos de anticorpo ou subfragmentos. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas totais de qualquer classe, por exemplo, IgG, IAM, Iga, Igo ou IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com dupla especificidade para dois ou mais antígenos da invenção. Eles também podem ser fragmentos, por exemplo, F(ab'),, Fab', Fab, Fv e semelhantes que incluem fragmentos híbridos. Uma imunoglobulina também pode incluir proteínas naturais, Sintéticas, ou geneticamente construídas que agem como um anticorpo por ligação a antígenos específicos para formar um complexo.

Uma composição ou vacina de HPV da presente invenção pode ser administrada a um receptor que age então como uma

Pp DI cd : 82/108 fonte de imunoglobulina, produzida em resposta à dose da composição de HPV.

Um indivíduo assim tratado pode doar plasma do qual a globulina hiperimune seria obtidas por . meio de metodologia de convencional de fracionamento de plasma.

A globulina hiperimune seria administrada a outro ' indivíduo para transmitir resistência contra ou tratar infecção por HPV.

As globulinas hiperimunes da invenção são particularmente úteis para o tratamento ou prevenção de infecção por HPV em bebês, indivíduos imunocomprometidos ou quando o tratamento é necessário e não há mais tempo para que o indivíduo produza anticorpos em resposta à vacinação.

Um aspecto adicional da invenção é uma composição farmacêutica que compreenten um ou mais anticorpos monoclonais (ou fragmentos desses; preferivelmente humanos ou humanizados) reativos contra constituintes da composição imunogênica da invenção, que podem ser usados para tratar ou prevenir infecção por múltiplos tipos de HPV.

Os métodos de confecção de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Kohler e Milstein, 1975; Harlow e Lane, 1988). Alternativamente, os fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos por rastreamento de uma biblioteca de apresentação de fago adequada (Vaughan e cols., 1998). Os anticorpos monoclonais podem ser humanos, humanizados, ou parcialmente humanizados por métodos conhecidos.

IV.

KITS Outro aspecto da invenção é um kit para a vacinação ou | tratamento de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade, Oo kit compreende um frasco e opcionalmente uma

. 83/108 inserção com instruções para administração, o frasco compreende uma composição de polipeptídeo de HPV de multitipo ou vacina para administração de acordo com os .: métodos da presente invenção.

Qualquer uma das composições aqui descritas pode ser i compreendida em um kit. Em um exemplo não limitante, os reagentes para a preparação de polipeptídeo de HPV de multitipo, formulação de um polipeptídeo de HPV de multitipo, e/ou administração de um polipeptídeo de HPV de multitipo podem ser incluídos em um kit. O kit também pode incluir reagentes para avaliação da atividade do lipopetídeo in vitro e in vivo. Os kits compreenderão, portanto, em meio recipiente adequado, uma composição de polipeptídeo de HPV de multitipo. Em certos aspectos, o kit pode incluir reagentes e/ou dispositivos para ' administração, por exemplo, inalador ou nebulizador. Eles | . também podem incluir um ou mais tampões, compostos, ou | | dispositivos para a preparação de uma composição para | administração.

Os componentes dos kits podem ser embalados em meio aquoso ou em forma liofilizada. O meio recipiente dos kits incluirá geralmente pelo menos um frasco, tubo de teste, frasco, garrafa, seringa ou outro recipiente, em que um componente pode ser colocado, e preferivelmente, adequadamente dividido. Quando há mais de um componente no kit, o kit também conterá geralmente um segundo, terceiro ou outro recipiente adicionado em que os componentes adicionais podem ser separadamente colocados. No entanto, várias combinações de componentes podem ser compreendidas em um frasco. Os kits da presente invenção também incluirão tipicamente um meio para conter os recipientes agrupados para venda comercial. Tais recipientes podem incluir injeção ou recipientes de plástico moldados por sopro em que os frascos desejados são retidos.

Quando os componentes do kit são fornecidos em uma e/ou mais soluções líquidas, a solução líquida é uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril sendo particularmente preferida. No entanto, os componentes do Í kit podem ser fornecidos como pó(s) seco(s). Quando os reagentes e/ou componentes são fornecidos como um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. Prevê-se que o solvente também pode ser fornecido em outro meio recipiente.

Em outros aspectos, um kit ou dispositivo pode incluir anticorpos policlonais ou monoclonais dirigidos aos | polipeptídeos da invenção. Um kit ou dispositivo desse tipo | pode ser usado para detectar ou identificar ou purificar vírus em diversas amostras e/ou pacientes.

Um kit também incluirá instruções para o emprego dos componentes do kit, bem como para O uso de qualquer outro reagente não incluído no kit. As instruções podem incluir variações que podem ser implementadas.

Contempla-se que estes reagentes são modalidades de kits da invenção. Esses kits, no entanto, não se limitam aos itens específicos identificados acima e podem incluir qualquer reagente usado para a preparação e/ou administração de uma vacina de polipeptídeo de HPV de multitipo.

V. EXEMPLOS Os exemplos seguintes são apresentados com a ae . 85/108 . finalidade de ilustrar várias modalidades da invenção, e . não têm à intenção de limitár a presente invenção de forma ' alguma.

Aqueles habilitados na técnica observarão que a 2 presente invenção é bem adaptada para atingir os objetivos e para obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem i como aqueles objetivos, finalidades e vantagens inerentes.

Os presentes exemplos, juntamente com os métodos aqui descritos, são atualmente representativos de modalidades preferidas, são exemplares, e são não constituem limitações do escopo da invenção.

As alterações aqui apresentadas e outros usos que estão enqglobados dentro do espírito da invenção, como definida pelo escopo das reivindicações, ocorrerão àqueles habilitados na técnica.

A.

RESULTADOS As vacinas de L2 que compreendem os resíduos 11-200 e : 1-88 usadas em estudos anteriores foram selecionadas com - base em sítios de restrição convenientes, e não em considerações de imunogenicidade (Campo e Jarrett, 1994; Roden e cols., 1994). Portanto, elas podem não conter todos os epitopos neutralizantes relevantes, ou possuir imunogenicidade e estabilidade ótimas.

No entanto, esses estudos indicam que a presença de anticorpos neutralizantes L2-específicos é suficiente para imunidade protetora | (Embers e cols., 2002; Gambhira e cols., 2007). Na verdade, a vacinação com L2 11-200 induz anticorpos com neutralização cruzada e proteção nos modelos de ataque BPV4, CRPV e ROPV (Gambhira e cols., 2007; Campo e Jarrett, 1994). A vacinação com o peptídeo L2 1-88 também foi protetora, mas foi sugerido de que a neutralização cruzada e a proteção cruzada talvez não sejam tão eficazes em

TD RE ooo o 3 o a nto DTD Pa Na - 86/108 comparação com animais vacinados com L2 11-200 (Gambhira e cols., 2007). Consistente com essa noção, a vacinação com peptídeos L2 de 94-112 e 107-122 foi protetora contra : ataque homólogo (Embers e cols., 2002). Portanto, para avaliar os benefícios da inclusão dessas regiões dentro de uma vacina de L2, geramos polipeptídeos L2 do terminal N que terminam em 88, 107 ou 200 para estudos de vacina (Tabela 1). Tabela 1: Respostas de anticorpo de coelhos vacinados com polipeptídeos L2 moméricos ou multiméricos de diferentes tamanhos.

Os coelhos foram vacinados quatro vezes com 300 ug dos polipeptídeos L2 de HPVI6 (A) ou construção polimérica de L2 (B) com o uso de CFA/IFA como | um adjuvante.

Soros hiperimunes foram coletados um mês | depois da imunização final e testados para anticorpo ' específico para L2 por ensaio imunoabsorvente ligado a . enzima (ELISA) com placas de microtítulo revestidas com L2 de HPV16 de comprimento total (16L2 ELISA) ou pseudovírions L2/L2 de HPVlI6 (HPVI6 ELISA). Os soros foram também testados para títulos de neutralização in vitro (IVN) para os tipos de pseudovírion de HPV indicados.

Os títulos de neutralização não foram detectados nos soros pré-imunes. * proteína exibiu significativa degradação em EF. coli. “Rb” | coelho individual. “nenhum” corresponde à menos que 50% de neutralização na menor diluição testada de 1:50. “-” não testado.

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- 89/108

L2 é necessário para a infecção (Roden e cols., 2001), e pode ter várias funções distintas (Richards e cols., 2006; Bossis e cols., 2005; Kamper e cols., 2006). Durante E a infecção, L2 tem que ser clivado por furina para remover os resíduos 1-13 (Richards e cols., 2006) e isso torna o | epitopo neutralizante conservado (entre os resíduos 17-36) mais acessível ao anticorpo monoclonal RG-1 (Day e cols., 2008). Além disso, o anti-soro para polipeptídeos L2 1-88 ou 11-200 neutraliza de forma cruzada tipos cutâneos e mucosos de papilomavírus (Pastrana e cols., 2005). Portanto, geramos polipeptídeos L2 do terminal N que se iniciam nos resíduos 1, 11, 13 ou 89 para estudos de vacina

(Tabela 1). | Respostas em coelhos vacinados com polipeptídeos L2 monoméricos e de multitipo: Para mapear epitopos de ' neutralização cruzada, sete polipeptídeos L2 de HPV1l6 - (Tabela 1) foram expressos em E. coli com 6-His tags e purificado por afinidade para estudos de vacinação.

Embora todos os polipeptídeos tenham sido purificados rapidamente, L2 13-88 e 89-200 de HPVI6 eram instáveis durante a estocagem.

Os coelhos foram imunizados cinco vezes com 300 pg de cada polipeptídeo, inicialmente em CFA, e em IFA para as imunizações de reforço.

O sucesso de cada imunização foi inicialmente verificado por teste dos soros hiperimunes em um ELISA de L2 de HPVlI6 de comprimento total e um ELISA de pseudovírion de Ll1 /L2 de HPVl16. Titulações elevadas de anticorpos séricos foram despertadas para cada polipeptídeo L2 de HPVl6, embora as titulações contra pseudovírions de HPVl16 tenham sido menores para o anti-soro para os dois antígenos instáveis, L2 13-88 e 89-200. As titulações neutralizantes de HPVI6 e titulações de neutralização cruzada de HPV6, HPV18, HPV31, HPV45 e HPV58 foram então determinadas para cada anti-soro de coelho induzido pelos polipeptídeos L2. Consistente com estudos anteriores ' 5 (Gambhira e cols., 2007), os peptídeos L2 11-200 e 1-88 de ' HPV16 induziram titulações robustas de anticorpos neutralizantes de HPVl16. Similarmente, titulações robustas de anticorpo neutralizante de HPV1I6 foram observadas para o anti-soro para L2 de HPVl6 1213-200, 1-107, 13-107. A | vacinação com L2 89-200 de HPVI6 produziu respostas | neutralizantes consideravelmente mais fracas, embora tenha induzido anticorpos com titulações de L2 de ELISA elevadas em um de dois coelhos.

O anti-soro L2-específico induzido pelos vários peptídeos L2 de HPVI6 neutralizou não apenas HPVI6, mas a gama diversa de tipos de papilomavírus . heterólogos, que incluem os tipos oncogênicos HPV18, HPV31, HPV45 e HPV58, que foram testados (Tabela 2). No entanto, as titulações de anticorpo neutralizante contra HPV16 foram significativamente maiores do que contra outros tipos, embora não tenha havido um relacionamento nítido entre as titulações e a distância evolucionária do HPV16. Tabela 2: Um resumo das construções de L2 de multitipo Resíduos L2 Peso Tipos de HPV (em ordem do x número de molecular terminal N ao C) tipos de HPV *+

. 91/108 17-36 x 22 49 KkDa 1, 2, 63, 5, 8 (Cutâneo) 6, 11 (Mucoso de baixo risco) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, . É 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 (Mucoso de alto risco) e e E 11-88 x 8 69 kDa 56, 73 * as designações de resíduos são baseadas na numeração de aminoácidos de HPVI6; a numeração real dos resíduos para peptídeos homólogos pode variar, mas pode ser determinada por alinhamento de sequência com peptídeos de HPV1l6. Como nenhum dos peptídeos L2 de HPVI6 alternativos aumentou substancialmente as titulações neutralizantes para | o vírus heterólogo, examinamos — proteínas de fusão | f concatenadas, que consistem em vários peptídeos L2 . homóiogos “derivados de diferentes genótipos de HPV medicamente significativos.

Com base nos resultados desses e de estudos prévios, os polipeptídeos L2 que correspondem ao L2 de HPVI6 1736, 11-88 e 11-200 foram escolhidos para construções de fusão, Na medida em que proteínas recombinantes com tamanho maior são frequentemente produzidas menos eficientemente em bactérias, testamos construções multitipo que compreendem 3 cópias de 11-200 (denominadas 11-200x3), 5 cópias de 11-88 (denominadas 11- 88x5) e 22 cópias de 17-36 (denominadas 17-36x22) e, como mostrado na Tabela 2, cada uma sendo derivada de genótipos de HPV medicamente relevantes e diversos (de Villiers e cols., 2004). As proteínas foram expressas em £E£. coli, purificadas por afinidade sob condições desnaturantes e

Na - 92/108 usadas para imunizar coelhos, como descrito para os polipeptídeos L2 de HPVl16. A vacinação de coelhos com cada uma das proteínas de fusão L2 de multitipo (11200x3, 11- " 88x5 e 17-36x22) em adjuvante CFA/IFA induziu titulações mais robustas de neutralização cruzada (Tabela 1B), quando Í comparada com peptídeos L2 de monotipo (Tabela 1A), sem comprometer as titulações neutralizantes de HPVl6. Em particular, a 11-88x5 induziu titulações acentuadamente elevadas de anticorpos neutralizantes para todos os tipos de HPV de teste, que incluem três (HPV31, 45, e 58) que não foram usados para derivar essa proteína de fusão. | Respostas in coelhos vacinados com GARDASIL": A | vacinação com VLPs de Ll pode induzir anticorpos que neutralizam de forma cruzada tipos papilomavírus muito intimamente relacionados, por exemplo, HPV18 e HPV45 (Smith Í e cols., 2007; Lin e cols., 1992; Richards e cols., 2006). - Portanto, procuramos comparar os níveis de anticorpos com a neutralização cruzada gerada por vacinação com GARDASIL”" (que é formulada em alume) com o uso de duas concentrações diferentes versus proteínas L2 de multitipo formuladas em | CFA/IFA (Tabela 3). A vacinação com GARDASIL”" produziu titulações elevadas de anticorpo neutralizante para os tipos de HPV oncogênicos incluídos na vacina, HPVl6 e HPV18. Embora titulações para HPVlI6 e HPVI8 maiores tenham sido geradas com a proteína de fusão L2, isso ocorreu com uma dose maior de antígeno e com o uso de um adjuvante mais potente.

Os soros de coelhos vacinados com GARDASIL”" continham consistentemente níveis significativos de anticorpo neutralizante de HPV45, ocasionalmente anticorpo neutralizante de HPV31, mas nenhuma titulação de anticorpo

A a . 93/108 neutralizante para HPVS58 detectável. Dessa forma, as titulações de anticorpo neutralizante para os tipos de HPV não incluídos na vacina são bem menores ou esporádicas ou . indetectáveis após vacinação com GARDASIL”", Tabela 3: Respostas de anticorpo de coelhos vacinados com | | GARDASIL"". - Os coelhos foram vacinados três vezes com 300 ug das construções poliméricas L2 11-88x5 com o uso de adjuvante CFA/IFA ou com 30 ug ou 12 ug de GARDASIL”". Soros hiperimunes foram coletados um mês depois da imunização final e testados para títulos de neutralização in vitro (IVT) para os tipos indicados de pseudovírions de HPV. . Os títulos de neutralização não foram detectados nos soros pré-imunes.

“Rb” coelho individual. “Nenhum” corresponde a menos que 50% de neutralização na menor diluição testada de: 50. “-” ' não testado.

: nHPV31 | HPVas | nePVS6 Antígeno (ug) IVN IVN IVN IVN IVN GARDASIL”" a 51200 |51200 |50 100 Nenhum (30 ug) b 25600 |51200 |Nenhum |/100 Nenhum c 25600 |/25600 |Nenhum | 800 Nenhum d 51200 |102400|50 800 Nenhum GARDASIL"" a 12800 |25600 |Nenhum |Nenhum |Nenhum (12 ug) b 51200 |25600 [200 1600 Nenhum c 51200 |25600 |Nenhum |800 Nenhum ad 102400 51200 |50 400 Nenhum eee ng) Respostas de camundongos vacinados com polipeptídeos L2 monoméricos e de multitipo: Os camundongos podem ser desafiados com pseudovírions de HPV e a infecção quantificada por liberação de um repórter como luciferase (Gambhira e cols., 2007; Roberts e cols., 2007). Os camundongos foram vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com polipeptídeos L2 de HPVl16 que compreendem : os resíduos 17-36, 1-88 ou 11-200, ou uma das três proteínas de fusão L2de multitipo concatenadas, 11-200x3, 11-88x5, ou 17-36x22, com o uso do adjuvante GPI-0100 baseado em saponina (Marciani e cols., 2000). Duas semanas depois seu soro foi coletado e as titulações de neutralização in vitro foram determinadas para HPV16, HPV18, HPV45, HPV58 (quatro tipos oncogênicos comuns de HPV) e HPV6 (o tipo mais comum encontrado em verrugas genitais benignas). Como observado em coelhos, a vacinação com L2 de HPVI6 1-88 ou L2 de HPV1I6 11-200 induziu significativas titulações de anticorpos neutralizantes : contra o vírus homólogo tipo HPVl16. No entanto, a vacinação com um peptídeo sintético que compreendem resíduos Le2 de HPVl6 17-36 não induziu anticorpos neutralizantes, Ou anticorpos específicos para L2 (não mostrado), provavelmente porque ele é desprovido de um epitopo T helper para essa cepa do camundongo (Alphs e cols., 2008).

O controle positivo, vacinação com VLPs de Ll de HPVI6 na ausência de adjuvante, induziu titulações ainda maiores que as construções de L2 de HPVI6. Em contraste, a vacinação com VLPs de L1l de HPV45 falou em induzir anticorpos neutralizantes de HPVl6, consistente com a resposta restrita ao tipo para vacinas de VLP de L1 (FIG. 1). As construções de L2 11-88x5 geraram titulações aumentadas de anticorpo neutralizante de HPVI6 como o peptídeo L2 de

| . 95/108 HPVl16 1-88, mas isso não foi observado para 11-200x3 versus L2 de HPV16 11-200. O 17-36x22 foi ainda menos eficaz (FIG. 1), possivelmente um resultado de T helper fraco (Alphs e | . cols., 2008). Surpreendentemente, as respostas cruzadas de | anticorpo neutralizante observadas em camundongos vacinados | com polipeptídeo L2 de HPVI6 foram menos robustas que ! aquelas geradas em coelhos que recebem as mesmas vacinas. ; No entanto, quando as construções de L2 de multitipo versus L2 de HPV16 11-200 e 1-88 são comparadas, a imunização com 211-200x3 e 11-88x5 foi muito mais eficaz na indução de | anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV18, HPV45, e HPV58 (FIG. 1). Notavelmente os polipeptídeos 11200x3 e 11- 88x5 não contêm sequências de HPV45 ou HPV58 e foi ainda obsevada significativa neutralização cruzada.

Polipeptídeos L2 de multitipo adjuvante: Vários ' adjuvantes que são potencialmente mais eficazes, Ou . complementares a alume se mostraram promissores em experimentos clínicos de vacina, por exemplo, a sequência imunoestimulante (ISS) 1018, um oligonucleotídeo que ativa receptor toll-like 9 (Halperin e cols., 2005; Halperin e cols., 2003), e o adjuvante baseado em saponina GPI-0100 (Marciani e cols., 2003; Slovin e cols., 2005). Para controlar se um adjuvante particular foi mais eficaz na indução de anticorpos de neutralização de HPV quando formulados com uma vacina de L2 de multitipo, nós compramos as respostas imunes a 25 ug 11-200x3 formulado em vários adjuvantes, e combinações desses.

Soros foram obtidos a partir de camundongos duas semanas depois da terceira imunização e as titulações para neutralização in vitro de HPVlI6, HPVI8, HPV45 e HPV58 (FIG. 2) foram medidas.

As

MN | . 96/108 titulações de neutralização in vitro foram acentuadamente similares em cada grupo de adjuvante e nenhum foi notavelmente superior para a formulação de 11-200x3 em . alume nesse ponto de tempo.

Em adição às titulações de pico, os adjuvantes podem ' aumentar a longevidade das respostas de anticorpo.

Para | avaliar a possibilidade de que as diferenças entre | adjuvantes possam seriam mais claras à medida que as | respostas humorais diminuíam, os camundongos foram desafiados com pseudovírions de HPVl16 em 4 meses depois da vacinação.

A infecção cutânea foi detectada como um sinal bioluminescente 3 dias depois da administração de pseudovírions de HPVI6 que carregam um repórter de luciferase e a injeção dos camundongos desafiados com seu substrato, luciferina.

A análise de variância de uma via 7 (ANOVA com comparações de Bonferroni) indica que a proteção . de infecção por HPV16 com 11-200x3 apenas e imunizações de controle de PBS foram significativamente diferentes (P<0,05; FIG. 4). A vacinação com 11-200x3 em qualquer um dos adjuvantes testados e imunizações de controle de PBS foram mais significativamente diferentes (P<0,001; FIG. 4). Em particular, a formulação de 11-200x3 com alume + ISS1018 foi mais eficaz que 11-200x3 apenas (P<0,01). As formulações de GPI-0100 testadas com 11-200x3 foram mais efeicazes que 11-200x3 apenas (P<0,001) ou 11-200x3 em combinação com alume (P<0,01). Nenhuma diferença estatisticamente significativa na proteção foi observada quando do uso de alume apenas ou ISS1018 apenas com 11- 200x3 quando comparado à proteína apenas.

A vacinação com VLP L1 de HPVI16 apenas, mas não VLP Ll

: 97/108 de HPV45, também gerou um nível similar de proteção que a vacinação com 11-200xX3 com alume+ISS1018 ou GPI-0100 (P<0,001;não mostrado). Portanto procuramos comparar as . titulações de anticorpo neutralizante in vitro induzidas por vacinação de camundongos com GARDASIL"" com aquelas induzidas por vacinação de camundongos com 11-200x3 ou 11- 88x5 no adjuvante GPI-0100. As titulações de neutralização in vitro geradas contra HPVl16 e HPV18, para os quais VLPs L1 são incluídos em GARDASIL”"", foram significativamente maiores no soro de camundongos vacinados com GARDASIL”"" quando comparadas àqueles vacinados com construção de L2 de multitipo. No entanto, nenhum anticorpo neutralizante de |

Í HPV45 ou HPV58 foi detectado no soro de camundongos vacinados com GARDASIL”" (FIG. 4). Em contraste, titulações robustas de anticorpos neutralizantes foram detectadas no Á soro de camundongos vacinados com 11-200x3 ou 11-88x5 g embora nenhuma construção contenha sequências de L2 derivadas de HPV45 ou HPV58. Vários adjuvantes foram testados em experimentos clínicos e se mostraram eficazes e seguros, que incluem alume, GPI-0100, alume e sequência imunoestimulante 1018 (um oligonucleotídeo CpG que ativa receptor toll-like 9). Para avaliar se as vacinas de L2 poliméricas requeriam um adjuvante particular, e a extensão em que os adjuvantes reforçaram a resposta de anticorpo neutralizante geradas pelas vacinas de L2 poliméricas, vários adjuvantes foram comparados um a um. Assim, os camundongos vacinados com 2514 de L2 11-200x3 em diferentes adjuvantes ou adjuvante apenas. Os grupos individuais foram: (1) Alume apenas (1,3 mg/camundongo, hidróxido de alumínio, Sigma A-8222), (2)

| . 98/108 CpG 1018 apenas (10 ug/camundongo), (3) PBS, (4) 11-200x3 apenas, (5) 11-200x3 + Alume (caldo a 50%), (6) 11-200x3 + CcpG1l018 (10 ug/camundongo, Dynavax, Berkley, CA), (7) 11- | À 200x3 + GPI-0100 (50 ug/ camundongo, Hawaii Biotech, Maui, | HI), (8) 11-200x3 + GPI-0100 (200 u|ug/ camundongo), (9) 11200x3 + GPI-0100 (50 ung/camundongo)+ Tween 40 (1 mg/camundongo, Sigma P-1504), (10) 11200xX3 + Alume + CcpG1I018 (10 ug/camundongo). Os soros foram obtidos duas depois da imunização final e testados para neutralização in vitro de HPV6, HPV16, e HPVI8. As titulações de neutralização in vitro foram acentuadamente similares em cada grupo de adjuvante quando comparadas a proteína apenas, sugerindo que a proteína L2 polimérica apenas é imunogênica e que nenhum adjuvante em particular é necessário para uma resposta de anticorpo neutralizante ' ampla imediatamente depois da vacinação. . Tabela 4. Análise de ANOVA de grupos de adjuvantes.

Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni P PBS vs 11-200x3 apenas P<0,05

- 99/108 Alume (1,3 mg) vs 11-200x3 + Alume (1,3 mg) P> 0,05 Alume (1,3 mg) vs I 1-200x3 + Alume + 1018 IP < 0,001] Alume (1,3 mg) vs 11-200x3 + GPI (50 fig) +Tween IP < 0,001 " Alume (1,3 mg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (200 ug) IP < 0,001 Alume (1,3 mg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 ug) IP < 0,001) 1018 apenas (10 ug/camundongo) vs 11-200x3 apenas /P> 0,05 1018 apenas (10 pg/camundongo) vs 11-200x3 + IP> 0,05 CpG1018 (10 ug) 1018 apenas (10 ug/camundongo) vs 11-200x3 + Alume IP > 0,05 (1,3mg) | 1018 apenas (10 ug/camundongo) vs 11-200x3 + Alume | P < 0,001 | + 1018 1018 apenas (10 pg/camundongo) vs 11-200x3 + GPI IP < 0,001) (50 gg) +Tween 1018 apenas (10 ug/camundongo) vs 11-200x3 + GPI- | P < 0,001 0100 (200 ug) o o eçe— ' 1018 apenas (10 pg/camundongo) vs 11-200x3 + GPI- P < 0,001] 0100 (50 ug) B.

MÉTODOS Preparação de antígeno: As construções de expressão de | polipeptídeo L2 de HPVI6 foram geradas por PCR como | descrito previamente (Pastrana e cols., 2005). As construções de L2 de multitipo foram otimizadas por códon para expressão em E. coli por cálculo de energia liver mais baixa e sintetizadas by Blue Heron Inc. com sítios 5' BamHI e 3' XhoI para facilitar a clonagem.

Os genes de L2 foram subclonados no vetor pET28a (Novagen), e nos polipeptídeos recombinantes resultantes rotulados com hexahistidina (6His) expressos em E. coli BL21 (Rosetta cells, Novagen) (Pastrana e cols., 2005). Os polipeptídeos recombinantes L2

AA a . 100/108 foram purificados por afinidade por ligação a uma coluna de ácido níquel-nitrilo-triacético (NÍi-NTA) (Qiagen) em 8M de uréia (com o do protocolo de purificação padrão QiaExpressionist para condições desnaturantes) e então dialisado em cassetes (Pierce) contra solução salina tamponada por fosfato de Dulbecco (PBS). A pureza foi monitorada por SDS-PAGE e a concentração da proteína determinada por teste de ácido bicinconínico (Pierce) com o uso de um padrão de albumina bovina sérica.

Ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISAs)e placas Immobilon (Nunc) foram revestidas de um dia para o outro a 4ºC com 100 ng/cavidade de 6His-HPV16 L2 preparados | em E. coli ou pseudovírions L1/L2 de HPVI6 produzidos em | células 293TT e diluídos em PBS.

As cavidades foram então bloqueadas com 1% albumina bovina sérica (BSA)-PBS por 1 : hora em temperatura ambiente, e incubadas com diluições de - duas vezes do anti-soro por 1 hora em temperatura ambiente.

Após a etapa de lavagem com PBS-0,01 % (v/v) Tween 20, IgG anti-coelho de cabra rotulada com peroxidase (KPL Inc, Gaithersburg, MD) diluída a 1:5.000 em 1% BSA-PBS foram adicionados por 1 hora.

As placas foram então lavada novamente e desenvolvidas com solução de ácido 2,2'-azino- bis (3-etilbenztiazolina-6-sulfônico (Roche) por 10 minutos (Viscidi e cols., 2005). A absorvência foi medida a 405 nm (A405) em um leitor de placa de ELISA (Bio-rad, Benchmark Plus). Ensaios de neutralização: Os ensaios de neutralização in vitro de pseudovírion de papilomavírus foram realizados como descrito anteriormente (Pastrana e cols., 2004) e a atividade de fosfatase alcalina secretada no sobrenadante

Na | | . 101/108 clarificado foi determinado com o uso de p-Nitrofenil fosfato (Sigma, St. Louis, MO) dissolvido em dietanolamina ] e a absorvência medida a 405 nm. As construções e ! protocolos detalhados para a preparação dos pseudovírions podem ser encontrados internet em home.ccr.cancer.gov/lco/. As titulações foram definidas como a recíproca da diluição mais alta que causou uma redução de 50% em A.'s, €& uma titulação <50 não foi considerada significativa. Estudos animais: Foram realizados estudos de acordo comas políticas institucionais e com a aprovação do “Johns Hopkins Animal Care and Use Committee and Institutional Animal Ethics Committee” (IAEC, Inida). Camundongos Balb/c (NCI Frederick) foram vacinados em grupos de 5 animais, três vezes em intervalos de duas semanas, s.c., com 25 ug de antígeno (ou peptídeo L2 17-36 de HPVI6 preparado por ' síntese química (Sigma)) nos adjuvantes indicados. Amostras - de sangue foram obtidas por sangramentos da veia da cauda duas semanas após a imunização final. Os coelhos foram vacinados nos dias 1, 28, 42, 60 e 76 com 300 ug polipeptídeo L2 em adjuvante completo de Freund inicialmente e adjuvante incompleto de Freund posteriormente. A vacinação com 12 ou 30 ug de GARDASIL”"" foi feita nos dias 1, 21, 35 e 56. Os coelhos foram sangrados uma semana após o reforço final.

Ataque cutâneo de HPV: Um pedaço da pele do torso ventral de camundongos BALB/c anestesiados foi tricotomizado com um barbeador elétrico, tendo cuidado para não traumatizar o epitélio. O ataque foi realizado por aplicação de 3 x 10º partículas de pseudovírion (100 ng) que contêm pyYLUC em 10 ul de carboximetilcelulose 0,6%

. 102/108 (CMC, Sigma) aos pedaços da pele tricotomizada. Três dias mais tarde, os camundongos foram novamente anestesiados, injetados com luciferina (100 pl a 7 mg/ml) e sua imagem adquirida por 10 min com um sistema de imagem bioluminescente IVIS 200 (Xenogen, Cranbury, NJ ). Áreas iguais que englobam o local de inoculação do vírus foram analisadas com o uso do programa de computador “Living Image” 2.20 (Xenogen), e a bioluminescência de fundo foi determinada por ataque com pseudovírions não infeccioso de HPV desprovido de L2.

Métodos estatísticos: Comparações entre grupos quanto às titulações e níveis de infecção no modelo de camundongo foram feitas por um ANOVA de uma via com comparações Boneferroni (GraphPad Prism, versão 4).

REFERÊNCIAS ' As seguintes referências, na extensão em que elas . fornecem procedimentos de exemplo ou ouros detalhes suplementares para aqueles aqui apresentados, são especificamente aqui incorporadas por referência. Patente U.S. 3.791.932 Patente U.S. 4.174.384 Patente U.S. 3.949.064 Patente U.S. 4.608.251 Patente U.S. 4.601.903 Patente U.S. 4.599.231 Patente U.S. 4.599.230 Patente U.S. 4.596.792 Patente U.S. 4.578.770 Patente U.S. 4.751.180 Patente U.S. 4.935.233

. 103/108 Patente U.S. 4.965.195 Patente U.S. 4.968.607 Patente U.S. 5.700.910 Patente U.S. 6.448.070 Patente U.S. 6.110.466 Patente U.S. 6.171.591 Patente U.S. 6.651.655 Patente U.S. 6.814.971 Patente U.S. 5.084.269 Patente U.S. 6.656.462 Patente U.S. 7.425.438 Patente U.S. 7.416.846 Patente U.S. 7.416.732 Patente U.S. 7.407.807 | 15 Patente U.S. 7.374.767 Ú Patente U.S. 7.201.908 - Patente U.S. 7.189.513 Patente U.S. 7.288.258 Public. de Patente U.S. 2003/0223938 Public. de Patente U.S. 2004/0033585 Public. de Patente U.S. 2004/0258698 Public. de Patente U.S. 2005/0048082 Public. de Patente U.S. 2006/0035853 Public. de Patente U.S. 2007/0041999 Public. de Patente U.S. 2008/0145375 Alphs e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(15):5850-5

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Claims (54)

. 1/8 REIVINDICAÇÕES

1. Composição de polipeptídeo isolado caracterizada pelo fato de compreender pelo menos dois peptídeos imunogênicos homólogos a partir de pelo menos dois isolados de um organismo infeccioso em que um primeiro peptídeo imunogênico é operacionalmente ligado a um segundo peptídeo imunogênico homólogo a partir de um segundo isolado de um organismo infeccioso.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são configurados em um arranjo linear.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são operacionalmente ligados através de uma porção encadeadora.

' 4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, - caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma proteína de fusão.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão contém um encadeador de peptídeo que liga peptídeos imunogênicos.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo infeccioso é um organismo sexualmente transmitido.

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 6&, caracterizado pelo fato de que Oo organismo sexualmente transmitido é selecionado de papilomavírus (PV), citomegalovírus (CMV), herpes vírus, Hepatite B, vírus da imunodeficiência humana (HIV/AIDS), herpesvírus associado ao sarcona de Kaposi (KSHV/HHV8), Haemophilus ducreyi,

y 2/8 Granulonma inguinal ou Calymmatobacterium granulomatis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Staphylococcus aureus ou Í Treponema pallidum.

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo infeccioso é um papilomavírus.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o papilomavírus é um membro do gênero papilomavírus selecionado de fB, y, ô, &, 6, n, O, 1, X, A, 1, v, 6, 0 OU TT papilomavírus.

10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o organismo infeccioso é um papilomavírus humano (HPV).

11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, ' caracterizado pelo fato de que o HPV é um HPV cutâneo.

- 12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o HPV é um HPV mucoso de alto risco.

13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são peptídeos imunogênicos de HPV selecionados de um ou mais de polipeptídeo HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV 10, HPVl1, HPV12, HPV13, HPVl4, HPV15, HPVl6, HPV17, HPV1I8, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62,

| o EA O o CAT o O o 3/8 ' HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99 ou HPV 100.

14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são selecionados de um ou mais de polipeptídeo HPVl, HPV2, HPV5, HPV6, HPV8, HPVl11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, ou HPV82.

15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são selecionados de um ou mais de polipeptídeo HPV6, HPV16, HPV18, HPV31, HPV39, HPV51, HPV56, e/ou HPV73.

- 16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são selecionados de polipeptídeo HPV1, HPV5, HPV6, HPV16, e/ou HPV18.

17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos imunogênicos são selecionados de um ou mais de peptídeo HPV6, HPVl6, ou HPV18.

18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os imunogênicos peptídeos de HPV são segmentos de polipeptídeo L2 de HPV.

19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os segmentos de peptídeo L2 de HPV correspondem às posições de aminoácido 13-45, 17-36, 1-88, 11-88, Ou 11-200 de Id. de Seq. Nº: 1.

- 4/8

20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV16.

21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV18.

22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV6.

23. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV45.

24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou | mais peptídeos imunogênicos. | -

25. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender pelo menos três peptídeos imunogênicos.

26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender pelo menos cinco peptídeos imunogênicos.

27. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender pelo menos vinte peptídeos imunogênicos.

28. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de pelo menos um peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV16.

29. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de

| - 5/8 HPV é um peptídeo L2 de HPV18.

30. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV6. |

31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, | caracterizado pelo fato de que pelo menos um peptídeo L2 de ! HPV é um peptídeo L2 de HPV45.

32. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que um primeiro Peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPVl16 e um segundo peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV 18.

33. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que um primeiro peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV16 e um segundo peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV6. |

34. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, - caracterizado pelo fato de que um primeiro peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV 18 e um segundo peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV6.

35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que um primeiro Peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV16, um segundo peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV 18 e um terceiro peptídeo L2 de HPV é um peptídeo L2 de HPV6.

36. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que um o peptídeo L2 de HPV tem uma sequência de aminoácidos selecionada de Id. de Seq. Nos: 71-92, e/ou Id. de Seq. Nos: 94-106 e/ou Id. de Seq. Nos: 110- 112.

37. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,

| 6/8 ' caracterizado pelo fato de que um O peptídeo L2 de HPV compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à sequência de aminoácidos de Id. de Seq. Nº: 93 ou Id. de Seq. Nº: 107 ou Id. de Seq. Nº: 108 ou Id. de Seg. Nº: 109 ou Id. de Seq. Nº: 113 Ou Id. de Seq. Nº: 114.

38. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, | caracterizado pelo fato de que o peptídeo L2 de HPV | compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos | 70% idêntica à sequência de aminoácidos de Id. de Seq. Nº: | 93 ou Id. de Seg. Nº: 107 ou Id. de Seq. Nº: 108 ou Id. de | Seq. Nº: 109 ou Id. de Seg. Nº: 113 ou Id. de Seg. Nº: 114. |

39. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, | caracterizado pelo fato de que o peptídeo L2 de HPV | compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de Id. de Seq. Nº: . 93 ou Id. de Seq. Nº: 107 ou Id. de Seq. Nº: 108 ou Id. de Seq. Nº: 109 ou Td. de Seq. Nº: 113 Ou Id, de Seq. Nº: 114.

40. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Peptídeo L2 de HPV compreende uma sequência de aminoácidos de Id. de Seq. Nº: 93 ou Id. de Seg. Nº: 107 ou Id. de Seq. Nº: 108 ou Id. de Seg. Nº: 109 ou Id. de Seq. Nº: 113 ou Id. de Seq. Nº: 114.

41. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por também compreender um Peptídeo não-L2 de HPV.

42. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o Peptídeo não-L2 de HPV é um peptídeo L1 de HPV ou proteína L1 de HPV.

43. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o Peptídeo não-L2 de HPV é

| . 7/8 um epitopo de ativação de Th, uma proteína carreadora, ou um adjuvante.

44. Kit caracterizado por compreender um Polipeptídeo da reivindicação 1.

45. Ácido nucleico caracterizado por codificar um Polipeptídeo da reivindicação 1.

46. Partícula da composição caracterizada por compreender um Polipeptídeo da reivindicação 1.

47. Partícula da composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma partícula viral. |

48. Partícula da composição, de acordo com a ! reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma partícula semelhante a vírus.

49. Partícula da composição da reivindicação 46, : caracterizada pelo fato de que a partícula é um capsídeo . viral.

50. Método de indução de uma resposta imune a um papilomavírus caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo isolado da reivindicação 8.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é uma resposta imune humoral.

52. Método de prevenção de uma infecção por papilomavírus caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um Polipeptídeo da reivindicação 8.

53. Kit caracterizado por compreender uma composição de multitipo da reivindicação 1.

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54. Kit caracterizado por compreender um anticorpo que se liga a uma composição da reivindicação 1. i |

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