MX2010004850A

MX2010004850A - Composiciones de peptidos de hpv de tipos multiples y metodos para tratamiento o prevencion de infeccion de virus de papiloma humano.

Info

Publication number: MX2010004850A
Application number: MX2010004850A
Authority: MX
Inventors: Richard B S Roden
Original assignee: Univ Johns Hopkins
Priority date: 2007-11-02
Filing date: 2008-11-03
Publication date: 2010-12-07
Also published as: EA201000735A1; CA2704455A1; CN113559253A; AU2008318320B2; AP2010005284A0; ZA201105713B; CN113559253B; EP2211899B1; WO2009059325A2; EP2211899A4; US20100297144A1; ZA201105712B; KR101618885B1; KR20100098617A; BRPI0818154A2; ZA201301825B; WO2009059325A3; EA019836B1; US9149517B2; JP5623910B2

Abstract

Las modalidades de la invención están dirigidas a métodos y composiciones de polipéptidos HPV de tipos múltiples.

Description

COMPOSICIONES DE PEPTIDOS DE HPV DE TIPOS MULTIPLES Y METODOS PARA TRATAMIENTO O PREVENCION DE INFECCION DE VIRUS DE PAPILOMA HUMANO Esta solicitud reivindica la prioridad de las Solicitudes Provisionales de Patente Número de Serie 61/001,630 y 61/004,629 presentadas el 2 de Noviembre de 2007, las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Esta invención se hizo con soporte del gobierno bajo el número de subsidio P50 CA098252 otorgado por el National Institutes of Health (NIH). El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la Invención I. Campo de la Invención Las modalidades de esta invención están dirigidas generalmente a la biología y la medicina. En ciertas modalidades la invención está dirigida a composiciones y método para usar polipéptidos de HPV de tipos múltiples.

II. Antecedentes Las infecciones de virus de papiloma humano (HPV) genitales-trópico son consideradas las infecciones transmitidas sexualmente más comunes en los Estados Unidos (Reporte CDC al Congreso, Prevención de Infección de Virus de Papiloma Genital Humano, Enero de 2004). Las principales manifestaciones de HPV ano-genital incluyen verrugas genitales (condyloma acuminatum) y neoplasia intraepitelial de la vulva, cerviz, ano ó pene. Una pequeña fracción de infecciones de HPV de alto riesgo persistentes, si se dejan sin tratar, progresan a cáncer (por ejemplo, cáncer cervical, en ocasiones cáncer de cabeza y cuello, y algunos tipos de cáncer de piel no melanoma). La presencia de ADN de HPV ha sido reportada en el 99.7% de carcinomas cervicales en todo el mundo, lo que sugiere que la infección de HPV es una causa necesaria de este cáncer y que esta enfermedad puede ser evitada mediante vacunación profiláctica contra HPV (Walboomers et al, 1999).

Además de las verrugas genitales, la infección de HPV puede resultar en verrugas comunes, verrugas plantares, o verrugas planas. Las verrugas pueden existir en diferentes formas dependiendo del tipo de HPV responsable y el epitelio involucrado. Las verrugas comunes (verruca vulgaris) ocurren usualmente en las manos, como color carne a café, exofítica y pápulas hiperqueratóticas. Las verrugas plantares (verruca plantaris) ocurren en las plantas de los pies y pueden ser muy dolorosas. Pueden diferenciarse de los callos removiendo la capa superficial para revelar capilares trombosados. Las verrugas planas o planares (verruca plana) son más comunes entre niños y pueden ocurrir en la cara, cuello, pecho y superficies del flexor de los antebrazos y las piernas.

Aproximadamente 35 de los más de 100 subtipos de HPV son específicos para el epitelio anogenital y tienen potenciales variantes para transformación maligna (Muñoz et al., 2003). De los 15 tipos de HPV oncogénico genital, el HPV 16 es el más común, seguido por el HPV 18 y HPV 45 (que contribuyen -50%, -20% y -10% de casos de cáncer cervical, respectivamente). A pesar del éxito de los esfuerzos de salud pública para reducir la incidencia y mortalidad del cáncer cervical con la implementación de programas de aislamiento de citología cervical, las mujeres quienes no se someten examen regular constituyen la mayoría de los pacientes con cánceres invasivos (Hoffman y Cavanagh, 1995) y el cáncer cervical permanece como la segunda causa más común de muertes por cáncer en mujeres a nivel mundial y en cáncer más importante en mujeres en Africa sub-sahara, Centroamérica, sur y centro de Asia y Melanesia (una subregión de Oceanía que se extiende desde el lado occidental del Pacífico occidental hasta el mar de Arafura, norte y noreste de Australia; el término fue usado por primera vez para indicar un agrupamiento étnico y geográfico de islas distintas a la Polinesia y Micronesia) (Parkín, 2001). Aproximadamente se diagnostican anualmente 471,000 casos de carcinoma cervical invasivo (Parkin, 2001).

El genoma del HPV está rodeado por un cápsido icosahédríco no envuelto de 60 nm (Baker et al.. 1991) el cual contiene las dos proteína L1 de cápsido principal y la proteína L2 de cápsido menor genéticamente no relacionadas. La L1 recombinante se auto-ensambla en partículas como virus (VLPs) que son morfológica e inmunológicamente similares a viríones nativos (Kimbauer et al., 1992). Las vacunas con base en VLP de L1 son altamente protectoras contra la infección que corresponde al virus del papiloma del tipo usado para derivar el inmunógeno (vacuna homóloga), pero no son efectivas contra todas, sino solo los tipos de HPV más estrechamente relacionados (Roden et al., 2000). Las vacunas de L1 licitadas han eludido este obstáculo mediante el diseño de preparaciones de vacunas multivalentes; CERVARIX contiene VLP de L1 derivadas de HPV16 y HPV18, mientras que el GARDASIL™ contiene también VLPs de L1 HPV6 y HPV11 para prevenir verrugas genitales benignas. Desafortunadamente, el gasto y la necesidad de refrigeración de estas vacunas de VLO de L1 normalmente las hacen imprácticas para uso en áreas lejanas y de bajos recursos donde son más necesitadas. Además, debido a que estas vacunas no son efectivas contra una fracción significativa de tipos de HPV oncogénicos, siguen siendo necesarios los programas costosos de aislamiento citológico. Para desarrollar el potencial completo de prevención contra HPV a nivel global, la vacuna debe ser segura y efectiva, establa a temperatura ambiente para facilitar la entrega en lugares remotos, económica en su elaboración y administrada sin agujas, de preferencia disponible en una formulación de dosis única. La carga de enfermedad resultante de la multitud de tipos de HPV sugiere que es necesaria una vacuna ampliamente protectora. Así, existe una necesidad de vacunas para HPV de neutralización cruzada adicionales.

Breve Descripción de la Invención Las modalidades de la presente invención están dirigidas a composiciones de péptidos de tipos múltiples. Otras modalidades de la invención están dirigidas al uso de estas composiciones de péptidos de múltiples tipos como inmunógenos o vacunas. Una composición de péptidos de tipos múltiples de la invención incluye dos o más péptidos (péptidos inmunogénicos, es decir, péptidos que inducen una respuesta inmune en un sujeto) que representan isotipos o tipos de organismo(s) patógeno(s) o distintos péptidos inmunogénicos de un organismo. Los organismos pueden ser tipos o variantes de un organismo objetivo, un género de organismos o una familia de organismos. En otros aspectos, los péptidos pueden ser de distintos organismos patogénicos (por ejemplo, HPV y HSV). En algunos aspectos, los organismos patogénicos distintos se relacionan mediante métodos de transmisión (por ejemplo, enfermedades transmitidas sexualmente (STDs)), u órgano o sistema de órgano infectado (por ejemplo, sistema reproductor, piel o los similares). En un aspecto, la composición de péptidos de múltiples tipos puede estar constituida por un número de péptidos derivados de varias variantes o tipos de un organismo, que confieren una amplia respuesta inmune de neutralización cruzada. La neutralización cruzada de tipos de HPV sería un ejemplo de tal composición de péptidos de múltiples tipos de neutralización cruzada. En otros aspectos, una composición de péptidos de múltiples tipos puede incluir péptidos derivados de varios patógenos, tales como virus transmitidos sexualmente, bacterias u hongos, incluyendo, pero no limitados a, virus de papiloma (PV), HPV, citomegalovirus (CNV), virus de herpes, hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana (HIV/SIDA), virus de herpes asociado con sarcoma de Karposi (KSHV/HHV8), chancroide (Haemophilus ducrevi), donovanosis (Granuloma inguinale o Calymmatobacterium granulomatis), gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), Lymphogranuloma venereum (LGV) (Chlamydia trachomatis), uretritis no gonocóccica (NGU) (Ureaplasma urealyticum o Mycoplasma hominis), Staphylococcus aureus, sífilis (Treponema pallidum) y los similares.

El HPV es un ejemplo de un organismo que puede ser apuntado como meta usando una composición de múltiples péptidos descrita en la presente. La infección con HPV causa el 5% de los cánceres humanos a nivel mundial. La selección citológica (Pap) identifica las lesiones precursoras de cáncer cervical que pueden ser eliminadas. La prevención de la infección con HPV eliminará los cánceres asociados con HPV y sus precursores, como se ha descrito para las vacunas licitadas GARDASIL™ (Merk) y CERVARIX™ (GSK). Sin embargo, la vacunas licitadas se derivan de proteína L1 de la cápsida y solamente apunta a un subconjunto de los tipos de HPV oncogénicos (por lo tanto, los programas de selección Pap son necesarios aun). Los inventores describen composiciones y métodos para evitar ampliamente infecciones benignas y oncogénicas con HPV y sus secuelas con base en la administración de una composición de péptidos L2 de HPV de tipos múltiples. La composición de péptidos L2 de HPV de tipos múltiples comprenderá una pluralidad de segmentos de polipéptidos derivados de dos o más tipo de HPV. Los segmentos o péptidos pueden ser de regiones correspondientes de polipéptidos homólogos (es decir, un polipéptido de otro tipo u organismo variante que es el equivalente funcional de un primer polipéptido) o puede ser de un segmento diferente de un polipéptido homólogo o puede ser de un polipéptido diferente de un tipo diferente. Los segmentos de polipéptidos (o péptidos) se configuran como una composición de péptidos de tipos múltiples mediante conjugación o producción como una proteína de fusión, liposoma, nanopartícula, polímero o péptido dendrímero (polipéptido ramificado).

En ciertas modalidades, una composición de polipéptidos aislados comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 o más péptidos inmunogénicos de polipéptidos correspondientes u homólogos de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 o más aislados distintos o tipos u organismos infecciosos, en donde un primer péptido inmunogénico que comprende una secuencia de aminoácidos de un primer péptido de un primer polipéptido está acoplado operativamente a un segundo péptido inmunogénico correspondiente u homólogo de un segundo polipéptido. "Acoplado operativamente" se refiere a la unión de un péptido directa o indirectamente con un segundo péptido. Por ejemplo, es posible que un grupo funcional se una directamente a un primer péptido o a una superficie mediante una porción del grupo funcional que está unido también a un segundo polipéptido (por ejemplo, un enlace de polipéptido). Alternativamente, es posible que el grupo funcional se una al péptido o superficie vía un componente intermedio que acopla el grupo funcional con el péptido o la superficie. Tales componentes intermedios se aluden con frecuencia como vinculadores. Los vinculadores son moléculas bifuncionales que pueden tener una porción que se une químicamente a un primer péptido y una segunda 'porción que se une químicamente a un grupo funcional. Cualquier cantidad de componentes intermedios están abarcados por la presente invención y son conocidos por aquellos expertos en la técnica.

En una modalidad, los inventores describen una composición de péptidos de PV de tipos múltiples para la prevención de varios tipos de PV. En ciertos aspectos, una composición de péptidos de PV de tipos múltiples es un polipéptido que no ocurre naturalmente que comprende dos o más segmentos de proteína de PV o péptidos inmunogénicos de tipos diferentes de PV configurados como una estructura de polipéptidos lineal (concatámero) o ramificada, un polipéptido de L2 de PV de tipos múltiples. El péptido L2 de PV puede comprender toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína L2 de uh virus en la familia papovavirus; poliomavirus; virus de papiloma; y/o un virus de papiloma en el género a, o los géneros ß, ?, d, e, ?, ?, ?, ?, ?, ?, µ, ?, ?, ?, p (ver de Villiers et al., Clasificación de Virus de Papiloma, Virología, 20 de Junio 2004; 324(1): 17-27); y/o virus de papiloma humano: HPVI, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19. HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100, HPV101, HPV102, HPV103, HPV104, HPV105, HPV106, HPV107, HPV108, HPV109, HPV110, HPV111; y/o virus de papiloma animal: virus de papiloma de bovino tipo 4 (BPV4), virus de papiloma de conejo cola de algodón (CRPV), virus de papiloma de venado (DPV), virus de papiloma de alce europeo (EEPV), virus de papiloma oral canino (COPV), virus de papiloma de mono Rhesus (RhPV) y virus de papiloma oral de conejo (ROPV).

Un segmento de antígeno o epitope o péptido o polipéptido deiPV de la invención puede comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos contiguos, incluyendo todos los valores y rangos entre ellos, de un polipéptido L2 de virus de papiloma (por ejemplo, SEQ ID Nos: 1 - 70).

En un aspecto más, un segmento de polipéptido puede comprender cuando mucho, por lo menos, o aproximadamente la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ,47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 189, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 289, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346 , 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 389, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 4395 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 489, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490 de aminoácido o más para la posición 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ,47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 89, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 189, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 289, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346 , 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 389, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 489, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 de aminoácido o más de un polipéptido L2 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1 a 70).

En todavía un aspecto más, un péptido L2 incluye un segmento de polipéptido que incluye cuando mucho, por lo menos, o aproximadamente 17 a 36, 13 a 45, 11 a 88 u 11 a 200 aminoácidos de un polipéptido L2 descrito en SEQ ID NO: 1 en la presente o la región correspondiente de SEQ ID NO: 2 a 70, o una secuencia de consenso de la misma. Cada una de las posiciones puede ser posiciones de aminoácido aproximadas y pueden variar + 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más posiciones de aminoácido. Las posiciones de aminoácidos identificadas se basan en la numeración de la proteína L2 del HPV 16 (SEQ ID NO: 1). Las posiciones de aminoácidos de proteínas L2 de otros tipos de HPV pueden variar, pero alguien experto en la técnica sería capaz de alinear cualquier secuencia de aminoácidos L2 con HPV 16 e identificar la secuencia de péptidos que corresponde con las posiciones de aminoácidos de L2 de HPV 16.

En ciertas modalidades, el péptido L2 es un segmento de una proteína L2 de HPV16 (SEQ ID NO: 9), una proteína L2 de HPV18 (SEQ ID NO: 2), una proteína L2 de HPV45 (SEQ ID NO: 3), una proteína L2 de HPV6 (SEQ ID NO: 9), una proteína L2 de HPV1 (SEQ ID NO: 4), una proteína L2 de HPV2 (SEQ ID NO: 5), una proteína L2 de HPV63 (SEQ ID NO: 62), una proteína L2 de HPV5 (SEQ ID NO:8), una proteína L2 de HPV8 (SEQ ID NO: 11), una proteína L2 de HPV11 (SEQ ID NO: 14), una proteína L2 de HPV31 (SEQ ID NO: 32), una proteína L2 de HPV33 (SEQ ID NO: 34), una proteína L2 de HPV35 (SEQ ID NO: 36), una proteína L2 de HPV39 (SEQ ID NO: 40), una proteína L2 de HPV51 (SEQ ID NO: 50), una proteína L2 de HPV52 (SEQ ID NO: 51), una proteína L2 de HPV56 (SEQ ID NO: 55), una proteína L2 de HPV58 (SEQ ID NO: 57), una proteína L2 de HPV59 (SEQ ID NO: 58), una proteína L2 de HPV68 (SEQ ID NO: 66), una proteína L2 de HPV73 (SEQ ID NO: 69), y/o una proteína L2 de HPV82 (SEQ ID NO: 70).

En ciertos aspectos, un polipéptido de tipos múltiples tiene una fórmula general de: [epitope X (a)-L-epitope X+1 (b)-L-epitope X + n (c)] (d), en donde a y/o b y/o c y/o d son, independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25; y n es, independientemente, de 1 a 98; y péptido X, péptido X + 1, péptido X + n, son, independientemente epitopes inmunogénicos seleccionados de uno o más organismos transmitidos sexualmente; y (L) puede representar un enlazador, un acoplamiento químico, un enlace de péptido. Los péptidos de la fórmula pueden ser derivados de la misma proteína o una proteína diferente del mismo organismo o patógeno, o estos péptidos pueden ser derivados de una proteína homologa o heteróloga de un organismo patogénico diferente. En una modalidad, el péptido X es un polipéptido de HPV; y el péptido X + 1 es un péptido de HPV diferente o un péptido de otro organismo patogénico, y el péptido X + n es uno o más de otro péptido distinto de cualquier tipo de HPV u otro organismo patogénico. La -L- representa un enlazador, un acoplamiento químico o un enlace de péptido en el caso de una fusión de polipéptido u otras maneras de acoplar o conectar péptidos con péptidos o péptidos con sustratos que se conocen en la técnica.

Las modalidades de la invención incluyen cuando mucho, por lo menos o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500 o más de dos o más secuencias de péptidos de SEQ ID NO: 71 a 92, 94 a 106 y/o 110 a 112. En otros aspectos, los péptidos de la invención incluyen secuencias correspondientes de SEQ ID NO: 1 a 70 y otros péptidos L2 de HPV. En ciertos aspectos, el segmento de polipéptido L2 es por lo menos o más de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a SEQ ID NO: 71 a 92, 94 a 106, 110 a 112 y/o secuencias correspondientes de SEQ ID NO: 1 a 70, y/o segmentos de SEQ ID NO: 1 a 70, y/u otros polipéptidos L2 de HPV o segmentos de los mismos.

Uno o más de los polipéptidos puede ser útil como una composición de vacuna para la profilaxis, tratamiento o prevención de infecciones de virus de papiloma. En ciertos aspectos, la composición puede combinarse con un portador farmacéutico. La composición de vacuna se administra a un individuo antes de la exposición al virus de papiloma para minimizar o evitar la infección con virus de papiloma, o se administra después de que un paciente ha sido infectado para reducir la severidad de la infección y retrasar/detener la progresión de la enfermedad, o para prevenir la transmisión del virus de papiloma del huésped infectado a otro individuo quien no tiene una infección con virus de papiloma.

Como se usa en la presente, el término "antígeno" o "péptido inmunogénico" es una molécula capaz de ser unido por un receptor de anticuerpo o célula T. Un antígeno es capaz adicionalmente de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la producción de linfocitos B y/o T. El aspecto estructural de un antígeno que da origen a una respuesta biológica se alude en la presente como un "antígeno determinante". Los linfocitos B responden a determinantes antigénicos extraños vía la producción de anticuerpos, mientras que los linfocitos T son el mediador de la inmunidad celular. Así, Iso determinantes antigénicos o epitopes son aquellas partes de un antigeno que son reconocidas por los anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por receptores de células T. Típicamente, un antígeno será un péptido derivado de una proteína expresada por un organismo patogénico (por ejemplo, HPV). Un determinante antigénico no necesita ser una secuencia o segmento de proteína contiguo y puede incluir varias secuencias que no están inmediatamente adyacentes una con otra. En ciertos aspectos, un determinante antigénico es un segmento de polipéptido PV, péptido PV.

Con respecto a una secuencia de aminoácidos en particular, un "epitope" es un grupo de residuos de aminoácidos que está involucrado en el reconocimiento mediante una ¡nmunoglobulina particular, o en el contexto de células T, aquellos residuos necesarios para el reconocimiento de proteínas de receptor de células T y/o receptores de Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC). Los residuos de aminoácidos de un epitope no necesitan ser contiguos. En un sistema inmune establecer, in vivo o in vitro, un epitope es los aspectos colectivos de una molécula, tal como estructura primaria, secundaria y terciaria de péptido, y carga, que juntos forman un sitio reconocible por una ¡nmunoglobulina, receptor de célula T o molécula de HLA. En toda esta descripción, "epitope" y "péptido" se usan frecuentemente de manera intercambiable.

Como se usa en la presente, "epitope de célula B" o "epitope diana" se refiere a un aspecto de un péptido o proteína que es reconocido por un receptor de célula B en la respuesta inmunogénica para el péptido que comprende ese antígeno (por ejemplo, un segmentó de L2 de HPV o subregión del mismo).

Como se usa en la presente, "HPV" y "virus de papiloma humano" se refiere a los miembros del género de virus de papiloma (PV) que son capaces de infectar humanos. Hay dos grupos principales de HPVs (grupos genital y cutáneo), cada uno de los cuales contiene múltiples "tipos" o "cepas" de virus (por ejemplo, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 32, etc.)- De interés particular en la presente invención son los tipos de HPV que están asociados con infección y malignidad genital.

El término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más composiciones de péptidos de HPV de tipos múltiples de la presente invención. Las composiciones de péptidos de HPV de tipos múltiples típicamente estarán en una forma que es capaz de ser administrada a un sujeto e inducir una respuesta inmune protectora o terapéutica suficiente para inducir inmunidad para prevenir y/o mejorar una infección y/o reducir por lo menos un síntoma de una infección y/o aumentar la eficacia de otra terapia anti-HPV y/o atenuar la infección con HPV y/o atenuar la transmisibilidad de HPV. Típicamente, la vacuna comprende un medio en solución salina o acuosa amortiguada convencional en el cual está suspendida o disuelta la composición de la presente invención. En otros aspectos, la vacuna puede ser un sólido (por ejemplo, formulación pulverizada o liofilizada). La composición de la presente invención puede usarse convenientemente para prevenir, mejorar o tratar de otra forma una infección. Por introducción a un huésped, la composición es capaz de provocar una respuesta inmune que incluye, pero no está limitada a, la producción de anticuerpos y/o citoquinas y/o activación de células T citotóxicas, células que presentan antígenos, células T ayudadoras, células dendríticas y/u otras respuestas celulares.

Como se usa en la presente, vacunas o composiciones "profilácticas" y "preventivas" son composiciones diseñadas y administradas para prevenir infección, enfermedad y/o cualquier secuela relacionada causada por o asociada con un organismo patogénico, particularmente HPV.

Como se usa en la presente, vacunas o composiciones "terapéuticas" son composiciones diseñadas y administradas para pacientes ya infectados con un organismo patogénico tal como por lo menos una cepa de HPV. Las vacunas terapéuticas (por ejemplo, vacunas terapéuticas contra HPV) se usan para prevenir y/o tratar el desarrollo de tumores benignos o malignos en estos individuos infectados.

Los términos "inhibición", "reducción" o "prevención" o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o la especificación incluyen cualquier disminución o inhibición completa mensurable para lograr un resultado deseado.

El uso de la palabra "uno/a" o "unos/as" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno/a", pero es consistente también con el significado de "uno/a o más", "por lo menos uno/a" y "uno o más de uno".

En toda esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar de error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción soporta una definición que se refiere a solamente alternativas e "y/o". También está contemplado que cualquier cosa enlistada usando el término "o" puede ser excluido específicamente.

Como se usa en esta especificación y reivindicación(es), las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o de terminación abierta y no excluyen elementos o pasos del método adicionales no mencionados.

Está contemplado que uno o más miembros de una lista proporcionada en la presente pueden ser excluidos específicamente de o incluidos en una invención reivindicada.

Otras modalidades de la invención se discuten en el curso de toda la solicitud. Cualquier modalidad discutida con respecto a un aspecto de la invención se aplica o otros aspectos de la invención también y viceversa. Se entiende que las modalidades en la sección de Ejemplos son modalidades de la invención que son aplicables a todos los aspectos de la invención. Otros objetivos, aspectos y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades específicas de la invención, se dan a manera de ilustración solamente, puesto que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Descripción de los Dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y están incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas aquí.

Figura 1. Vacunación de ratones con vacunas de L2 de tipos múltiples induce anticuerpos neutralizantes más ampliamente que las vacunas L2 monoméricas o VLP de L1. Se vacunaron ratones BALB/c s. c. en los días 0, 15, 30 con PBS o 25 pg de diferentes constructos monoméricos y de tipos múltiples de L2 en adyuvante GPI-0100 (50 pg) o cualquiera VLP L1 de HPV 16 o VLP L1 de HPV 45 sin un adyuvante. Se realizaron ensayos de neutralización in vitro usando pseudovirus de HPV para los genotipos indicados en diluciones de dos veces del antisuero recogido de los ratones dos semanas después de la inmunización final. Los títulos en el punto final que alcanzan 50% están graficados.

Figura 2. La proteína L2 de tipos múltiples sola es inmunogénica y esa no requiere adyuvante en particular para respuesta de anticuerpos de neutralización ampliamente. Se vacunaron ratones BALB/c en los días 0, 15, 30 s. c. con Alum solo (1.3 mg) o ISS1018 solo (10 pg/ratón) o PBS, o 25 pg 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) solo, o formulado con alum (1.3 mg) o con 1SS1018 (10 pg/ratón) o con GPI-0100 (en cualquiera 50 pg/ratón o 200 pg/ratón) o con GPI-010Ó (50pg/ratón) + Tween 40 (1 mg/ratón) o con alum e ISS1018 (10 pg/ratón). Se realizaron titulaciones de neutralización in vitro con dos diluciones del antisuero de ratón recolectado dos semanas después de la inmunización final usando pseudovirus de HPV para los genotipos indicados. Los títulos de punto final para neutralización de 50% están graficados.

Figura 3. Reto de pseudovirus de HPV 16 in vivo de ratones cuatro meses después de vacunación con L2 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) en diferentes combinaciones adyuvantes. Se vacunaron ratones tres veces en intervalos de dos semanas con PBS o 25 pg de L2 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) en diferentes adyuvantes o adyuvante solo. Los grupos individuales estuvieron como se enlistan más delante de izquierda a derecha: PBS solo, Alum solo (1.3 mg), ISS1018 solo (10 pg/ratón), 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) solo, 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) + ISS1018 (10 pg/ratón), 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) + Alum (1.3 mg), 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) + GPI-0100 (50 pg/ratón), 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) + GPI-0100 (200 pg/ratón), 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) + GPI-0100 (50 pg/ratón) + Tween 40 (1 mg/ratón), 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) + Alum + 1018 (10 pg/ratón). Aproximadamente cuatro meses después se rasuró el parche de inmunización en el vientre de cada ratón BALB/c anestesiado con una rasuradora eléctrica sin traumatizar el epitelio. Los ratones se sujetaron a reto entonces con 3x109 de pseudoviriones de HPV 16 (100 ng) en 10 µ? de carboximetilcelulosa 0.6% que lleva un constructo reportero de luciferasa. Tres días después, los ratones se anestesiaron y se inyectaron con luciferina y se adquirieron imágenes durante 10 minutos con un software Xenogen I VI S 200. Las áreas dimensionadas igualmente que abarcan el sitio de inoculación se analizaron usando software Living Image 2.20 y las unidades de luminiscencia relativa se graficaron con relación a ratones vacunados con L1 de HPV 16 antes del reto.

Figura 4. Vacunación de ratones con L2 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) o 11-88x5 (SEQ ID NO: 108) induce menos anticuerpos de neutralización cruzada, pero más ampliamente en comparación con GARDASIL™. Se vacunaron ratones tres veces en los días 0, 15 y 30 con GARDASIL™ a un quinto de una dosis humana o con 25 pg de L2 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) o 11-88x5 (SEQ ID NO: 108) en adyuvante de GPI-0100 (50 pg). se realizaron ensayos de neutralización in vitro con una serie de dilución de dos veces del antisuero de ratones recolectado dos semanas después de la inmunización final usando pseudovirus de los genotipos de HPV indicados. Los títulos de punto final para neutralización de 50% están graficados.

Descripción Detallada de la Invención La protección de alto costo y de tipo restringido mediante vacunas de partículas como virus de L1 de HPV de primera generación necesita el desarrollo de composiciones y vacunas de segunda generación ampliamente protectoras. La proteína L2 de cápsida menor protege animales del reto de virus de papiloma mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes. Aunque la L2 induce anticuerpos que neutralizan transversalmente diversos tipos de virus de papiloma, los inventores observan que anticuerpos de L2 específicos neutraliizan típicamente tipos relacionados más efectivamente que tipos relacionados menos evolucionados. Para aumentar la fusión de L2 de protección cruzada se diseñaron proteínas que consisten de dos epitopes de neutralización cruzada conocidos de tipos de HPV divergentes. La vacunación con polipéptidos L2 de HPV 16 que comprende residuos 17 a 36, 1 a 88 u 11 a 200, se comparó con tres proteínas de fusión L2 de tipos múltiples; 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) tipos (HPV 6, 16, 18), 11-88x5 (SEQ ID NO: 108) tipos (HPV 1, 5, 6, 16, 18), 17-36x22 tipos (5 cutáneos, 2 mucosales de bajo riesgo y 15 tipos oncogénicos). Se vacunaron ratones tres veces subcutáneamente con 25 pg de antígeno en adyuvante GPI-0 00. Entre todos los polipéptidos monotipo, 11 a 200 generaron el título de neutralización de HPV 16 más alto. Sin embargo, 11-200x3 indujeron el título de neutralización más alto contra HPV 45 y HPV 58 así como también con HPV 16, HPV 18, HPV 6 en comparación con otras proteínas de fusión multitipo y monotipo. Los ratones inmunizados se sujetaron a reto con pseudovirus HPV 16 que expresa luciferasa. La vacunación con 11-200x3 (SEQ ID NO: 113) protegió ratones contra reto de HPV 16 así como también VLP L1 de HPV 16. Se comparó la inducción de anticuerpos neutralizantes de HPV por vacunación con 25 pg de proteína sola 11-200x3 (SEQID NO: 113) o con alum o 50 pg o 200 pg de GPI-0100 con Tween 40. La presencia de un adyuvante reforzó significativamente la respuesta humoral para 11-200x3, pero no hubo diferencia significativa entre adyuvantes. Los inventores concluyen que la vacunación con una sola proteína de fusión que comprende L2 de HPV 6 11-200 (SEQ ID NO: 96), L2 de HPV 16 (SEQ ID NO: 100) y L2 de HPV 18 11-200 (SEQ ID NO: 101) producida en E. coli y formulada con un adyuvante es protectora e induce anticuerpos de neutralización cruzada ampliamente.

También está contemplado que tales composiciones se puedan usar en conjunto con o como un modelo para otros organismos patogénicos, particularmente aquellos asociados con enfermedades comunicadas en la misma manera que el HPV, por ejemplo, enfermedades transmitidas sexualmente. Así, las enseñanzas de esta solicitud con respecto al HPV pueden ser extensivas a otros organismos patogénicos ya sea solos o en conjunto con péptidos L2 de HPV de tipos múltiples.

I. Composiciones Terapéuticas y Profilácticas Las modalidades de la invención incluyen composiciones de péptidos de HPV que comprenden dos o más segmentos de polipéptidos de HPV de dos o más tipos de HPV. En ciertos aspectos, los tipos de HPV incluyen todos o algunos de los tipos de HPV que son patogénicos para un organismo o animal o sujeto humano en particular a quien se administra la composición. En ciertas modalidades, el polipéptido de HPV comprende por lo menos dos epitopes o péptidos L2. en todavía un aspecto más, el polipéptido de HPV comprende un epitope L2 de por lo menos dos tipos de HPV. En la presente se describen en detalle segmentos de polipéptidos de HPV.

Los métodos de la presente invención incluyen el tratamiento de una enfermedad o condición causada por o relacionada con infección con virus de papiloma (por ejemplo, infección con HPV). Unas composiciones de péptidos de HPV de múltiples tipos y/o anticuerpos inmunogénicos que se unen a los mismos, pueden ser dados para inducir o proporcionar una respuesta terapéutica en una persona infectada con, o sospechosa de haber sido expuesta a, o en riesgo de ser infectada con o expuesta a HPV. Los métodos pueden emplearse con respecto a individuos quienes han dado positivo en pruebas de exposición a HPV u otras enfermedades de transmitidas sexualmente, o quienes son considerados que están en riesgo de infección con base en posible exposición o exposición futura. En particular, la invención abarca métodos de tratamiento para infección con HPV.

En algunas modalidades, el tratamiento se administra en la presencia de adyuvantes o portadores u otros antígenos, ya sea antígenos de HPV o antígenos de otros patógenos que tienen un riesgo de exposición que está relacionado o es coincidente con el riesgo de exposición a HPV. Además, en algunos ejemplos, el tatamiento comprende la administración de otros agentes usados comúnmente contra infección viral, tal como uno o más antivirales.

En ciertos aspectos de la invención, los péptidos de la invención están configurados de manera que múltiples péptidos están presentes en componentes del sistema inmune en estrecha proximidad entre ellos. Cada péptido puede estimular múltiples componentes del sistema inmune (dos o más células efectoras) o un solo componente del sistema inmune (una célula efectora con una propensión para reconocer múltiples tipos o variantes de un péptido). Los péptidos pueden estar configurados como un concatámero lineal, como un concatámero ramificado (dendrímero), como proyecciones de un soporte o base (por ejemplo, nanopartícula, liposoma, polímero, etc.). el número de sitios o péptidos de reconocimiento presentaron una entidad y su separación determinará el grado de oligomerización de los péptidos. Por ejemplo, una entidad tetravalente tal como estreptavidina resultará en un tetrámero. Sin embargo son posibles valencias mucho más altas. De preferencia el número de péptidos estará en el rango de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 10, 20, 25, 50 o más incluyendo todos los rangos intermedios.

En ciertas modalidades, una composición de múltiples péptidos es un polímero natural o un derivado del mismo, tal como una proteína, un polipéptido ramificado (dendrímero), una proteína multimérica, o un ácido nucleico que codifica el mismo. Una pluralidad de péptidos puede estar unida a un polisacárido, tal como dextrán, almidón, celulosa, ácido hialurónico, quitin, o ácido algínico o un derivado de estos polisacáridos; un polímero sintético tal como polipropilenglicol, polietilenglicol (PEG); una membrana de fosfolípido, tal como una vesícula o un liposoma, y una partícula inorgánica tal como perlas de poliestireno o acrílico o perlas magnéticas.

En ciertos aspectos, un polipéptido de múltiples tipos es un dendrímero. Estos dendrímeros pueden hacerse, por ejemplo, de acuerdo con el protocolo que se describe en "Técnicas de Ligación Quimioselectivas y Ortogonales" en el Capítulo 11 de Weng y Peter, White Eds., "Síntesis de Péptidos en Fase Sólida Con Fmoc, Un Enfoque Práctico" Oxford University Press (2000), y la Publicación de Patente de E. U. No. 20080207485, la cual se incorpora en la presente por referencia. Varios otros métodos para sintetizar polipéptidos ramificados son bien conocidos por el experto en la técnica. Un polipéptido ramificado tiene péptidos incorporados en sitios predeterminados en dos o más de sus ramas. Cada rama del péptido puede tener una longitud deseada. De preferencia, cada rama es menor que 24 aminoácidos de longitud. La ramificación del pépitido puede efectuarse ramificando el péptido durante la síntesis en residuos Lys mediante métodos conocidos. De esta manera, el péptido se ramifica en un primer residuo de lisina en dos ramas y ramificado adicional en más residuos de lisina para formar una entidad tetravalente posteriormente. Se pueden afectar otras valencias, tales como octámeros, incluyendo más o menos pasos de ramificación. También son posibles valencias impares mediante ramificado solamente parcial del péptido sintético.

En ciertas modalidades, uno o más de los términos del polipéptido está unido a un soporte o base, por ejemplo, en un aspecto que forma rizos de polipéptido que se extienden desde un soporte. Los péptidos de la invención pueden estar comprendidos en varios vehículos o formas de entrega, tales como partículas como virus (VLPs) o liposomas, o en la superficie de partículas biodegradables o en la superficie de perlas o micropartículas o nanopartículas.

A. Agentes Infecciosos Una "infección" o "enfermedad infecciosa", como se usa en la presente, se refieren a un desorden que surge de la invasión de un huésped, superficial, local o sistemáticamente, por un organismo infeccioso. Organismos infecciosos incluyen bacterias, virus, parásitos, hongos y protozoarios.

Las bacterias incluyen bacterias gram-negativas y gram-positivas. Ejemplos de bacterias gram-positivas incluyen, pero no están limitadas a, especie Pasteurella, especie Estafilococo incluyendo Staphylococcus aureus; especie Estreptococos incluyendo especies Streptococcus pyogenes grupo A, grupo Streptococcus viridans, Streptococcus agalactiae grupo B, Streptococcus bovis, Streptococcus anaerobio, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus faecalis; especie Baciilus incluyendo Baciilus anthracis; especie Corynebacterium incluyendo Corynebacterium diphtheriae, especie Corynebacterium aeróbica y especie Corynebacterium anaeróbica; especie Diphtheroids; especie Listeria incluyendo Listeria monocytogenes; especie Erysipelothrix incluyendo Erysipelothrix rhusiopathiae; especie Ciostridium incluyendo Ciostridium perfringens, Ciostridium tetani, y Ciostridium difficile.

Las bacterias gram-negativas incluyen, pero no están limitadas a, especie Neisseria incluyendo Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis; especie Branhamella incluyendo Branhamella catarrhalis; especie Escherichia incluyendo Escherichia coli; especie Enterobacter; especie Proteus incluyendo Proteus mirabilis; especie Pseudomo.nas incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mallei, y Pseudomonas pseudomallei; especie Klebsiella incluyendo Klebsiella pneumoniae; especie Salmonella; especie Shigella; especie Serratia; especie Acinetobacter; especie Haemophilus incluyendo Haemophilus influenzae y Haemophilus ducreyi; especie Brucella; especie Yersinia incluyendo Yersinia pestis y Yersinia enterocolitica; especie Francisella incluyendo Francisella tularensis; especie Pasturella incluyendo Pasteurella multocida; Vibrio cholerae; especie Flavobacterium; meningosepticum; especie Campylobacter incluyendo Campylobacter jejuni; especie Bacteroides (oral, faríngeo) incluyendo Bacteroides fragilis; especie Fusobacterium incluyendo Fusobacterium nucleatum; Calymmatobacterium granulomatis; especie Streptobacillus incluyendo Streptobacillus moniliformis; especie Legionella incluyendo Legionella pneumophila.

Otros tipos de bacterias incluyen bacilos acidorresistentes o resistentes al alcohol ácido, espiroquetas y actinomicetos. Ejemplos de bacilos acidorresistentes incluyen especie Mycobacterium que incluye Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. Ejemplos de espiroquetas incluyen especie Treponema incluyendo Treponema pallidum, Treponema pertenue, especie Borrelia que incluye Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme) y Borrelia recurrentis y especie Leptospira. Ejemplos de actinomicetos incluyen: especie Actinomyces incluyendo Actinomyces israelii, y especie Nocardia incluyendo Nocardia asteroides.

Ejemplos de virus incluyen, pero no están limitados a: Retrovirus, virus de inmunodeficiencia humana incluyendo HIV-I, HDTV-III, LAVE, HTLV-III/LAV, HIV-lll, HIV-LP, Citomegalovirus (CMV), Picornavirus, virus de polio, virus de hepatitis A, enterovirus, virus de Coxsaqkie humana, rinovirus, echovirus, Calcivirus, Togavirus, virus de encefalitis equina, virus de rubella, Flavirus, virus del dengue, virus de encefalitis, virus de fiebre amarilla, Coronavirus, Rhabdovirus, virus de estomatitis vesicular, virus de rabia, Filovirus, virus de ébola, Paramixovirus, virus de parainfluenza, virus de parotiditis, virus de sarampión, virus sincitial respiratorio (RSV), Ortomixovirus, virus de influenza, Bungavirus, virus Hantaan, flebovirus y virus de Nairo, virus Arena, virus de fiebre hemorrágica, reovirus, orbivirus, rotavirus, Bimavirus, Hepadnavirus, virus de Hepatitis B, parvovirus, Papovaviridae, virus de papiloma, virus de polioma, Adenovirus, virus de Herpes incluyendo virus de herpes simplex 1 y 2, virus de varicela zóster, Poxvirus, virus varióla, virus vaccinia, virus Irido, virus de fiebre porcina Africana, virus de hepatitis delta, virus de hepatitis no A no B, Hepatitis C, virus Norwalk, astrovirus, y virus no clasificados.

Ejemplos de hongos incluyen, pero no están limitados a: especie Cryptococcus incluyendo Crytococcus neoformans; especie Histoplasma incluyendo Histoplasma capsulatum; especie Coccidioides incluyendo Coccidiodes immitis; especie Paracoccidioides incluyendo Paracoccidioides brasiliensis; especie Blastomyces incluyendo Blastomyces dermatitidis; especie Chlamydia incluyendo Chlarnydia trachomatis; especie Candida incluyendo Candida albicans; especie Sporothrix incluyendo Sporothrix schenckii; especie Aspergillus, y hongos de mucormicosis.

Otros organismos infecciosos incluyen parásitos. Los parásütos incluyen la especie Plasmodium, tal como especies Plasmodium incluyendo Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Parásitos de la sangre y/o tejidos incluyen la especie Plasmodium, especie Babesia incluyendo Babesia microti y Babesia divergens, especie Leishmania incluyendo Leishmania trópica, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani; especie Trypanosoma incluyendo Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense (enfermedad Africana del sueño), y Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas).

Otros microorganismos médicamente relevantes se han descrito extensivamente en la literatura, por ejemplo, ver Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindal, Gran Bretaña 1983 y Murray, Medical Microbiology (ISBN 0323033032), 2005, cuyo contenido completo se incorpora en la presente por referencia.

B. Vacunas HPV La presente invención incluye composiciones para prevenir o mejorar infecciones de HPV. Como tal, la invención contempla vacunas para uso en modalidades de inmunización tanto activa como pasiva. La composición inmunogénica, propuesta para ser adecuada para uso como una vacuna, puede prepararse a partir de polipéptido(s) de HPV de múltiples tipos que comprenden segmentos de proteína L2 de HPV. En otras modalidades, los polipéptidos de L2 de HPV se pueden usar en combinación con otras proteínas de HPV o segmentos de las mismas, tales como E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, y/o proteíha L1. Ver por ejemplo las Patentes de E. U. 7,425,438, 7,416,846, 7,416,732, 7,407,807, 7,374,767, 7,201,908, 7,189,513 y 7,288,258, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad por referencia.

Típicamente, las vacunas se administran en una manera compatible con una formulación de vacuna, y en tal cantidad que será efectiva terapéuticamente y/o inmunogénica. La cantidad a ser administrada depende del sujeto a ser tratado, incluyendo la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administradas depende del juicio del facultativo. Típicamente, se pueden administrar por vacunación o administración 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, a 100 ng, pg, o mg. Los regímenes adecuados para la administración inicial e inyecciones de refuerzo son variables también, pero están tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones u otras administraciones subsiguientes. 1. Polipéptidos y Segmentos de Polipéptidos de HPV En ciertos aspectos de la invención se usan varios segmentos de polipéptidos de HPV como un componente de péptido de HPV de una vacuna de polipéptidos de HPV de múltiples tipos. En ciertos aspectos, el polipéptido de HPV es un polipéptido L2. En un aspecto más, el polipéptido L2 es un HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51 , HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100 o más (ver SEQ ID NO: 1-70); y virus de papiloma de animal: virus de papiloma de bovino tipo 1 (BPV1), virus de papiloma de bovino tipo 2 (BPV2), virus de papiloma de bovino tipo 4 (BPV4), virus de papiloma de conejo cola de algodón (CRPV), virus de papiloma de venado (DPV), virus de papiloma de alce Europeo (EEPV), virus de papiloma oral de canino (COPV), virus de papiloma de mono Rhesus (RhPV) o epitope de péptido L2 de virus de papiloma oral de conejo (ROPV). El Compendio de Virus de Papiloma Humano En Línea compila y publica información molecular relevante relativa al virus de papiloma humano (HPV) y virus relativos de papiloma de animal. Se puede acceder al compendio en la Internet en (hpv-web.lanl.gov/stdgen/viras/hpv/compendium/htdocs/HTML_FILES/HPVco mpintro4.html), el cual se incorpora por referencia como la fecha de prioridad y fecha de presentación de esta solicitud.

Se pueden encontrar ejemplos de polipéptidos L2 en bases de datos de proteínas disponibles públicamente tal como GenBank (gb), SwissPro (sp), EMBL, y los similares. Las entradas de la base de datos representativas, enlistadas por tipo de HPV con número de acceso en paréntesis, incluyen, pero no están limitadas a: HPV2 (gb/AAY86489, gb/ABN49461, gb/ABN49469, gb/AB014925, gb/NP_077121); HPV3 (sp/P36744); HPV7 (gb/NP_041858.1 ); HPV10 (gb/NP_041745); HPV16 (gb/AA085414, gb/AAO15703, gb/AA015711, gb/AAQ10726, gb/AAV91650); HPV18 (gb/AAF14009, gb/ABP99710, gb/ABP99718, gb/ABP99726, gb/ABP99742, gb/ABP99766, gb/ABP99774, gb/ABP99782, gb/ABP99790, gb/ABP99798, gb/ABP99806, gb/NP_040316); HPV26 (gb/NP_041786.1 ); HPV27 (dbj/BAE 16268, sp/P36755); HPV28 (sp/P50799); HPV29 (sp/P508Ó0); HPV30 (sp/P36756); HPV33 (sp/P06418); HPV39 (gb/AAA47055); HPV40 (sp/P36760); HPV43 (sp/Q705H5); HPV45 (gb/AAY86493); HPV45 (gb/ABP99814, gb/ABP99854, gb/ABP99862, gb/ABP99870, gb/ABP99878, gb/ABP99894, gb/ABP99902, sp/P36761); HPV 51 (sp/P26539); HPV52 (sp/P36763); HPV53 (gb/ABU54103, gb/ABU54117, gb/ABU54131, gb/ABU54152, gb/ABU54159, gb/ABU54173, gb/NP_041847); HPV56 (gb/ABO76808, gb/AB076815, gb/AB076822, gb/AB076829, sp/P36765); HPV57 (dbj/BAF80485, sp/P22164); HPV58 (sp/P26538); HPV59 (emb/CAA54855); HPV61 (ref/NP_043449); HPV62 (sp/Q676U7); HPV66 (gb/AB076836, gb/AB076843, gb/AB076857, gb/AB076864, gb/AB076885, gb/AB076892, gb/AB076899, sp/Q80960); HPV68a (gb/AAZ39497); HPV69 (sp/Q9JH45); HPV70 (gb/AAC54856); HPV71 (gb/AAQ95182, gb/AAQ95189, gb/AAQ95203, ref/NP_597937); HPV72 (emb/CAA63878); HPV77 (emb/CAA75467); HPV81 (emb/CAF05697); HPV82 (gb/AAK28455, sp/Q9IR53); HPV83 (gb/AAD3'8973); HPV84 (gb/AAK09276); HPV85 (gb/AAD24187); HPV86 (gb/AAL06740); HPV87 (emb/CAC17717); HPV89 (gb/AAM92156); HPV90 (ref/NP_671508); HPV91 (gb/AAM89135); HPV94 (dbj/BAD89178, emb/CAF05714); HPV97 (gb/AAZ39505, gb/ABO27082); HPV102 (gb/AAZ39525); o HPV106 (gb/AAZ39518). Cada secuencia de aminoácidos representada por el número de acceso se incorpora en la presente por referencia como el de la fecha de presentación de esta solicitud. En ciertos aspectos, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos L2 de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o más tipos de HPV se acoplan conjuntamente para formar un polipéptido de HPV de múltiples tipos (ver SEQ ID NO: 94, 108, 109 y 113). El acoplamiento de los segmentos puede ser mediante expresión o síntesis de una proteína de fusión o mediante conjugación química de los péptidos uno con otro o conjugación química de los péptidos con un sustrato o polímero común.

Un péptido de la invención puede incluir 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, o 490 aminoácidos consecutivos, incluyendo todos los valores y rangos entre los mismos, empezando del aminoácido 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 43, 440, 450, 460, 470, 480, o 490, incluyendo todos los valores entre los mismos, de un polipéptido L2 de HPV. En ciertas modalidades, un polipéptido L2 de HPV incluye, pero no está limitado a, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 70.

En ciertos aspectos, el polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,4 25, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 70, 80, 90, 100, 200, o más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de los péptidos seleccionados de L2 de HPV 17-36-DIYPSCKISNTCPPDIQNKI (SEQ ID NO:72), L2 de HPV 17- 36- DLYRTCKQAGTCPPDIIPRV (SEQ ID NO:73), HPV L2 17- 36- DIYPACKVANNCPPDIQNKI (SEQ ID NO:74), HPV L2 17-•36- HIYQTCKQAGTCPPDVINKV (SEQ ID NO:75), HPV L2 17-¦36- HIYQTCKQAGTCPPDVINKV (SEQ ID NO:76), HPV L2 17- 36- QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO:77), HPV L2 17-¦36- QLYQTCKATGTCPPDVI PKV (SEQ ID NO:78), HPV L2 17-•36- QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO:71), HPV L2 17-¦36- DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV (SEQ ID NO:79), HPV L2 17- -36- QLYQTCKAAGTCPSDVI PKI (SEQ ID NO: 80), HPV L2 17-¦36- QLYQTCKATGTCPPDVI PKV (SEQ ID NO:81), HPV L2 17- -36- QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO:82), HPV L2 17· -36- DLYRTCKQSGTCPPDVVDKV (SEQ ID NO:83), HPV L2 17- -36- DLYRTCKQSGTCPPDVINKV (SEQ ID NO:84), HPV L2 17- -36- QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV (SEQ ID NO:85), HPV L2 17-36-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO:86), HPV L2 17-36-QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI (SEQ ID NO: 87), HPV L2 17-36-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO:88), HPV L2 17-36-DLYKTCKQAGTCPSDVINKV (SEQ ID NO:89), HPV L2 17-36-DLYKTCKQSGTCPSDVINKV (SEQ ID NO:90), HPV L2 17-36-QLYKTCKQAGTCPPDVI PKV (SEQ ID NO:91), y/o QLYSTCKAAGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO:92).

En todavía un aspecto más, el polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende una secuencia de amino de L2 de HPV 17-36x22 DIYPSCKISNTCPPDIQNKIDLYRTCKQAGTCPPDIIPRVDIYPACKVANNC PPDIQNKIHIYQTCKQAGTCPPDVINKVHIYQTCKQAGTCPPDVINKVQLY QTCKLTGTCPPDVIPKVQLYQTCKATGTCPPDVIPKVQLYKTCKQAGTCP PDIIPKVDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVQLYQTC AAGTCPSDVIPKIQLYQ TCKATGTCPPDVI PKVQLYRTCKAAGTCPPDVI PKVDLYRTCKQSGTCPP DVVDKVDLYRTCKQSGTCPPDVINKVQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVQLY QTCKASGTCPPDVIPKVQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIQLYQTCKASGTCP PDVI PKVDLYKTCKQAGTCPSDVI KVDLYKTCKQSGTCPSDVI NKVQLYK TCKQAGTCPPDVIPKVQLYSTCKAAGTCPPDVlPKV (SEQ ID NO:93) En todavía otro aspecto, el polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,4 25, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 70, 80, 90, 100, 200, o más de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de los péptidos seleccionados de HPV L2 11-88 KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGL GIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAP (SEQ ID NO:94), HPV L2 11-88 KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGL GIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPT (SEQ ID NO:95), HPV L2 11-88 KRAAPKDIYPSCKISNTCPPDIQNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGL GIGTARGSGGRIGYTPLGEGGGVRVATRPT (SEQ ID NO:96), HPV L2 11-88 KRDSVTHIYQTCKQAGTCPPDVIN VEQTTV ADNILKYGSAGVFF GGLGISTGRGTGGATGYVPLGEGPGVRVGGTPT (SEQ ID NO:97), HPV L2 11-88 KRASATQLYQTCKLTGTCPPDVI PKVEHNTI ADQI LKWGSLGVF FGGLGIGTGSGTGGRT GYVPLGTSAKPSITSGPM (SEQ ID NO:98) HPV L2 11-88 SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGG LGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAKRA (SEQ ID NO:99), HPV L2 11-88 SATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVF FGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRA (SEQ ID NO:100), HPV L2 11-88 SVTDLYKTCKQSGTCPPD.VVPKVEGTTLADKILQWSSLGI FLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRA (SEQ ID NO:101), HPV L2 11-88 SATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTI ADQILRY GSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPSTVSEASIPRA (SEQ ID NO. 102), HPV L2 11-88 SATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKI L QWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYI PLGGRPNTVVDVSPARRA (SEQ ID NO:103), HPV L2 11-88 SVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADK I LQWSGLGI FLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDI APARA (SEQ ID NO: 104), HPV L2 11-88 SATQL YKTCKLSGTCPEDVVNKIEQK TWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIVDVTPAR KKRA (SEQ ID NO:105), y/o HPV L2 11-88 SATQLYKTCKQAGTCPPDV IPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKP VEIP (SEQ ID NO: 106).

En ciertas modalidades, el polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende un aminoácido de HPV L2 11-88x5 KRASATQLYKTCKQAG TCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGT J RPPTATDTLAPKRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKI LQWS SLGFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTKRAAPKDIYPSC KIS TCPPDIQNKI EHTTI ADKI LQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGRIGYTP LGEGGGVRVATRPTKRDSVTHIYQTCKQAGTCPPDVINKVEQTTVADNIL KYGSAGVFFGGLGISTGRGTGGATGYVPLGEGPGVRVGGTPTKRASAT QLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGT GGRTGVPLGTSAKPSITSGPM (SEQ ID NO: 107).

En todavía una modalidad más, un polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende un aminoácido de HPV L2 11-88x8 SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGS GTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAKRASATQLYKTCKQAGTCPPDI IPK VEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTL APRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGI GTGSGTGGRTGYI PLGGRSNTVVDVGPTRKRASATQLYQTCKAAGTCPS DVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPST VSEASIPRASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFL GGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTQLYSTCKAAGT CPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGG GGRPGVVDI APARAS ATQLYKTCKLSGTC PE DVVNKIEQKTWADKILQWG SLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTI VDVTPARKKRASATQLY KTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRT GYVPLSTGTPSKPVEIP (SEQ ID NO: 108).

En todavía una modalidad más, un polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende regiones homologas de L2s de HPV6b, HPV16, HPV18, HPV31, HPV39, HPV51, HPV56 y HPV73. El aminoácido de L2 de HPV 11-88x8 es MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGT GSGTGGRTGYVPLQTSAKPSiTSGPM AKRASATQLYKTCKQAGTCPPDII PKVEGKTI ADQI LQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYI PLGTRPPTAT DTLAPRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLG GLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRASATQLYQTCKAAG TCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLST RPSTVSEASIPRASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTS LGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTQLYSTC KAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGY IPLGGGGRPGVVDI APARAS ATQLYKTCKLSGTCPEDVV KIEQKTWADKI LQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIVDVTPARKKRASA TQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGS GGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP (SEQ ID NO: 109).

En todavía una modalidad más, un polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,425, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 70, 80, 90, 100, 200, o más de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 8, 9, 10 o más de los péptidos seleccionados de L2 de HPV 11-200 KRASATQLYQTCKASGTCPPDII AKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIG TGSGTGGRTGYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIVSLVEDS TIINSAASDFVPPIREGFEISTSETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEP SIVQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSHSVEDIPLDT (SEQ ID NO: 110), HPV L2 11 -200 KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIG TGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEET SFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVFTTVTTHNNPTFT DPSVLQPPTP AETGGHFTLSSSTISTHN YEEIPMDT (SEQ ID NO: 111), y/o HPV L2 11 -200 KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIG TGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSS VTSGAPRPTFTGTSGFI DITSAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTN FTN AF SDPSIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLQT (SEQ ID NO:112). En ciertas modalidades, un polipéptido de HPV de múltiples tipos comprende la secuencia de aminoácidos de L2 de HPV 11-200x3 KRASATQLYQTCKASGTCPPDII AKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIG TGSGTGGRTGYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSI VSLVEDS TIINSAASDFVPPIREGFEISTSETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEP SI VQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSHSVEDIPLDTKMSATQLYKTCKQAG TCPPDIIPKVEGIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRP PTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVS GFSITTSTDTTPAI LDI NNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTL SSSTISTHNYEEIPMDTKRASVTDLYKTC QSGTCPPDVVPKVEGTLADKI LQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIE PVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFTGTSGFDITSAGTTTPAVLDITPS STSVSISTTNFTNPAFSDPSIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLQ ? (SEQ ID NO: 113).

En ciertas modalidades, un polipéptido de múltiples tipos, "FurinDKILKxl 5" comprende secuencias de proteína L2 de HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV73. La secuencia de aminoácidos de FurinDKILKxl 5 es MASATQLYQTCKLTGTCP DVI KVEHNTI ADQILKASATQLYQTCKATGT CPPDVIPKVEHTTIADQILKASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQI LQASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQASATQLYQTCKAA GTCPSDVIPKIEHTTIADQILRASATQLYQTCKATGTCPPDVIPKVEGSTIA DQILKASATQLYRTCKAAGTCPPDVIPKVEGNTVADQILKASATDLYRTCK QSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQASATDLYRTCKQSGTCPPDVINKVEG TTLADKILQASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQASATQLY QTCKASGTCPPDVIPKVEGTTIADQLLKASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNK IEQKTWADKILQAS ATQLYQTCKASGTCPPDVI PKVEGTTI ADQI LRASATD LYKTCKQAGTCPSDVINKVEGTTLADKILQASATQLYKTCKQAGTCPPDVI PKVEGSTIADNILK (SEQ ID NO: 114).

Los péptidos de la invención se sintetizan típicamente usando métodos de síntesis de péptidos conocidos por aquellos expertos en la técnica y/o se acoplan usando química de péptidos conocida por aquellos expertos en la técnica. En otros aspectos, los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden expresar y purificar usando técnicas recombinantes conocidas por aquellos expertos en la técnica. 2. Enlazador En la invención están incluidos los oligómeros o proteínas de fusión que contienen un número de péptidos. Tales oligómeros pueden estar en la forma de multímeros enlazados covalentemente o enlazados no covalentemente, que incluyen dimeros, trímeros u oligómeros superiores. En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la habilidad de estimular una respuesta inmune. Una modalidad de la invención está dirigida a oligómeros que comprenden múltiples péptidos unidos vía eniazadores covalentes o no covalentes entre péptidos. Tales eniazadores pueden ser eniazadores de péptidos (separadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los cierres (zippers) de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los péptidos unidos a los mismos. Entre los eniazadores de péptidos adecuados están aquellos descritos en las Patentes de E. U. Nos. 4,751,180 y 4,935,233, las cuales se incorporan en la presente por referencia. En ciertas modalidades, los péptidos de la invención son enlazados mediante enlaces de péptido sin enlazador discernible entre los péptidos. 3. Vehículos de Entrega Las formulaciones conocidas de vacunas han empleado una variedad de vehículos de entrega para presentar tales antígenos al sistema inmune del mamífero, para invocar una respuesta inmune protectora o terapéutica contra un patógeno. Tales "vehículos de entrega" han incluido como un agente de la vacuna virus enteros inactivados por calor o químicamente, partículas de proteína del virus entero, vectores de virus, tales como adenovirus y vaccinia, entre otros, y vectores o plásmidos con base en ADN.

Las partículas como virus (VLPs) han sido investigadas como agentes de vacuna. En general, los virus encapsidados incluyen una cubierta de proteínas o "cápsida" que está ensamblada para contener el ácido nucleico viral. Muchos virus tienen cápsidas que pueden ser "auto-ensambladas" a partir de las proteínas de la cápsida expresadas individualmente para formar VLPs, tanto dentro de la célula donde se expresa la cápsida dentro ("ensamble in vivo") y fuera de la célula después de aislamiento y purificación ("ensamble in vitro").

Las partículas como virus mimetizan la estructura global de una partícula de virus sin el requerimiento de contener material infeccioso. Las VLPs pueden carecer de un genoma de ADN o ARN viral, pero retienen la estructura tridimensional de un virus auténtico. Las VLPs tienen la habilidad de estimular respuestas mediadas por células B, respuestas proliferantes CD4 y respuestas citotóxicas de linfocitos T. Ver, Schirmbeck et al. (1996) Intervirology 39, 111-119; Paliard et al. (2000) AIDS Res. Hum. Retroviruses 16, 273-282; Murata et al. (2000) PNAS USA 100, 6753-6758. ver también la publicación de Patente de E. U. 20070041999, la cual se incorpora por referencia en su totalidad.

Las VLPs se han producido para más de 30 diferentes virus que infectan humanos y otros animales, incluyendo Norwaik, Hepatitis B y C, virus de papiloma humano, Parvovirus e influenza A.

Las partículas como virus pueden ser manipuladas también para actuar como moléculas portadoras para la entrega de epitopes de otros agentes patogénicos. Ver Noad et al., (2003) Tendencias en Microbiología 11(9), 438-444; Sadeyed et al., (2003) Virología 309: 32-40; publicación de PCT WO2005/0056 4; publicaciones de Patente de E. U. 2004/0033585 y 2005/0048082; las Patentes de E. U. 6,448,070; 6,110,466; 6,171,591; Brinkman et al., (2004) Lett. Drug. Des. & Disc. 1:137-147. Una proteína de cápsida puede modificarse para contener un péptido antigénico, que genera una fusión de péptidos de proteína antigénica, viral recombinante. Este producto de péptido de proteína antigénica de cápsida de fusión puede expresarse entonces en una célula huésped, ensamblada in vivo o in vitro para formar partículas virales o como virus recombinantes, y administrados a un huésped con el fin de ¡licitar una respuesta inmune.

Nanopartículas - En un aspecto, se puede acoplar péptido a materiales no proteínicos tales como, por ejemplo, nanopartículas y otros sustratos. Las nanopartículas son típicamente de 1 nm a 200 nm de diámetro, pueden usarse para proporcionar entrega de péptidos inmunogénicos a un sujeto. Uno o más péptidos se pueden unir a una nanopartícula mediante interacciones químicas covalentes o no covalentes. Las interacciones químicas no covalentes pueden incluir afinidad (por ejemplo, avidita/biotina, antígeno/anticuerpo, receptor/ligando), interacción iónica y/o interacción hidrofóbica. Métodos para unir péptidos a soportes sólidos, tales como nanopartículas, se describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente de E. U. 2004/0258698. Las nanopartículas que tienen un diámetro desde aproximadamente 50 nm hasta aproximadamente 200 nm pueden ser entregadas sistemáticamente. Como se usa en la presente, el término "nanopartícula" significa una esfera o esferoide de polímero que puede formularse para tener una superficie regular arreglada de moléculas encadenadas, definidas en el rango de de tamaño de nanómetros (aproximadamente de 1 nm a 50 nm). De preferencia, se utilizan monómeros de auto-ensamblado para formar las nanoparticulas. Además, el término nanopartículas abarca el uso de liposomas, bicelas y micelas tanto polimerizadas como no polimerizadas, asi como también estructuras virales de cápsida. Aunque se prefieren las nanopartículas para las composiciones y métodos de la presente invención, se pueden usar otros marcos, andamiajes y otros "presentadores", tales como dendrímeros, se pueden usar como es bien sabido por aquellos expertos en la técnica como la forma apropiada de presentar ligandos de acuerdo con la presente invención. Nanopartículas polivalentes, Publicación de E. U. 20030223938.

Los péptidos de la invención se pueden administrar en una composición liposomal. El liposoma de la presente invención puede ser vesícula multilamellar (MLV). El liposoma comprende lípídos formadores de liposomas que tienen una porción de hidrofílica de cola y una porción polar o químicamente reactiva la cual, a su vez, comprende un ácido, un alcohol, un aldehido, una amina o un éster. Los liposomas pueden estar caracterizados además por cadenas de hidrocarburos o un grupo esteroide de cola y un grupo polar de cabeza. Los lípidos formadores de liposomas comprenden un fosfolípido. Ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen, pero no están limitados a, ácido fosfatidílico, fosfatidil colina, fosfatidil étanolamina, fosfatidil glicerol, fosfatidil inositol y esfingomielina.

Las sustancias que pueden ser encapsuladas en o acopladas a los liposomas de la presente invención incluyen proteínas y péptidos. En algunas modalidades, la sustancia comprende más de un compuesto. Los péptidos de la invención pueden comprender o estar conjugados con una porción lipofílica que localiza los péptidos en la superficie del lípido. Los péptidos de múltiples tipos pueden ser localizados en la superficie del liposoma. Ver la publicación de Patente de E. U. 20060035853.

C. Adyuvantes y otros componentes inumunoestimuladores o aumentadores La inmunogenicidad de composiciones de polipéptidos, péptidos o péptidos de múltiples tipos de HPV puede ser aumentada mediante el uso de estimuladores no específicos no adicionales de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen todos los compuestos inmunoestimuladores aceptables, tales como citoquinas, toxinas o composiciones sintéticas.

Se puede usar un número de adyuvantes para aumentar una respuesta de anticuerpos contra un polipéptido de HPV de múltiples tipos a cualquier otra composición descrita en la presente. los adyuvantes se pueden usar para (1) atrapar el antígeno en el cuerpo para causar una liberación lenta; (2) atraer células involucradas en la respuesta inmune al sitio de administración; (3) inducir la proliferación o activación de células del sistema inmune; o (4) mejorar la difusión del antígeno en todo el cuerpo del sujeto.

Las formulaciones de adyuvantes incluyen, pero no están limitadas a, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, sales minerales, polinucleótidos y sustancias naturales. Los adyuvantes específicos que pueden usarse incluyen IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, ?-interferón, GMCSP, BCG, sales de aluminio, tales como hidróxido de aluminio u otro compuesto de aluminio, compuestos MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP ( TP-PE), lípido A y monofosforil lípido A (MPL). RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS) en una emulsión de escaleno 2%/Tween 80, CpG1018, y/o GPI0100, incluyendo varias combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, un adyuvante es un CpG1018 o G.PI-0100 combinado con uno o más de Tween™ o alum o combinaciones de los mismos. Los antígenos de MHC pueden aun ser usados. Otros adyuvantes o métodos se ejemplifican en las Patentes de E. U. 6,814,971, 5,084,269, 6,656,462, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.

Varios métodos de lograr afectar el adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato (alum) de aluminio, usados comúnmente de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.1% en solución en salina amortiguada con fosfato, en mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (CARBOPOL®) usados como una solución de aproximadamente 0.25%, agregación de una proteína en la vacuna mediante tratamiento con calor con temperaturas que fluctúan entre aproximadamente 70° a aproximadamente 101° C durante un periodo de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. La agregación mediante la activación anticuerpos tratados con pepsina (Fab) para albúmina; mezcla con células bacterianas (por ejemplo, C. parvum), endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias Gram negativas; emulsión en vehículos de aceite fisiológicamente aceptables (por ejemplo, monooleato de manida (Aracel A)); o emulsión con una solución al 20% de un perfluorocarbono (FLUOSOL-DA®) usada como un sustituto de bloque se puede emplear también para producir un efecto de adyuvante. Un adyuvante típico es el adyuvante de Freund completo (que contiene tuberculosis de icobacteria muerta), adyuvante de Freund incompleta e hidróxido de aluminio.

Además de los adyuvantes, puede se deseable co-administrar modificadores de respuesta biológica (B M) para aumentar las respuestas inmunes. Los BRMs han mostrado que expresan o favorecen la expresión de inmunidad de células T o reducen la expresión de actividad supresora. Tales BRMs incluyen, pero no están limitados a, Cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); Ciclofosfamida de baja dosis (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ) y citoquinas tales como ?-interferón, IL-2 o IL-12 o genes que codifican proteínas involucradas en funciones de ayudadoras inmunes, tal como B-7.

Epitopes T ayudadores - Se han descrito dos tipos de linfocitos T principales, linfocitos citotóxicos CD8+ (CTLs) y células ayudadoras CD4 (células Th). Las células T CD8+ son células efectoras que, vía el receptor de células T (TCR), reconocen antígenos extraños presentados por moléculas MHC clase I, por ejemplo, en células infectadas viral o bacterianamente. Por el reconocimiento de antígenos extraños, las células CD8+ experimentan un proceso de activación, maduración y proliferación. Este proceso de diferenciación resulta en clones CTL los cuales tienen la capacidad de destruir las células objetivo que exhiben antigenos extraños. Las células T ayudadoras, por otra parte, están involucradas en ambas formas humoral y mediadas por células de respuestas efectoras inmunes. Con respecto a la respuesta humoral o inmune de anticuerpo, los anticuerpos son producidos por linfocitos B a través de interacciones con células Th. Específicamente, los antígenos extracelulares, tales como microbios circulantes, son tomados por células especializadas que presentan antígeno (APCs), procesados y presentados en asociación con moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase II para células Th CD4+. Estas células Th, a su vez, activan linfocitos B, lo que resulta en producción de anticuerpos. La respuesta mediada por células o inmune celular, en contraste, funciona para neutralizar microbios que habitan en locaciones intracelulares, tal como después de infección exitosa de una célula objetivo. Los antígenos extraños, tales como, por ejemplo, antígenos microbianos, se sintetizan dentro de células infectadas y presentadas en las superficies de tales células en asociación con moléculas MHC clase I. La presentación de tales epitopes conduce a la estimulación antes descrita de CTLs CD8 + , un proceso que, a su vez, es estimulado también por células Th CD4+.

Las células están compuestas, de por lo menos dos subpoblaciones distintas, denominadas células Th1 y Th2. Los subtipos Th1 y Th2 representan poblaciones polarizadas de células Th que se diferencian de precursores comunes después de la exposición al antígeno.

En algunos aspectos, un polipéptido de HPV de múltiples tiipos puede comprender también un inductor de un tipo ya sea de Th1 o Th 2 de respuesta. Los altos niveles de citoquinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas mediadas por células para un antígeno dado, mientras que los altos niveles de citoquinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas humorales inmunes para el antígeno.

La distinción entre respuesta inmune tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como que es predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, es conveniente con frecuencia considerar las familias de citoquinas en términos de esa descrita en clones de células CD4+ de murino por Mosmann y Coffman (Mosmann y Coffman, 1989). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th1 están asociadas con la producción de citoquinas INF-? y IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas con frecuencia asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1 no son producidas por células T, tal como IL-12. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10.

En ciertos aspectos, los epitopes Th incluyen, pero no están limitados a, epitopes de células T derivados de proteínas y toxinas bacterianas, tales como toxinas de tétanos y difteria. Por ejemplo, los epitopes P2 y P30 de la toxina de tétanos, antígeno de núcleo de hepatitis B, tuberculosis, tuberculosis de micobacteria RA12 (una subsecuencia (de aminoácidos 192 a 323) de MTB32A (Skeiky et al., 1999)), proteína p25 de morbillivirus/virus distemper canino: KLIPNASLIENCTKAEL (SEQ ID NO: 1 17) PV (poliovirus) sequence 103-115: KLF A VWKITY DT (SEQ ID NO:118) M5: NKLI AYPAVEALS (SEQ ID NO: 119), TT (tetanus toxin) 830-844: QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 120), PADRE: aKXVMWTLKAAa (a = D-Ala, X = L-cyclohexyl-Ala) (SEQ ID NO: 121), E7 p20-29 TDLYCYEQLN (SEQ ID NO: 122), E7 p45-54: AEPDRAHYNI (SEQ ID NO: 123), E7 p60-79: KCDSTLRLCVQSTHVIRTL (SEQ ID NO: 124), E7 p85-94: GTLGIVGPIC (SEQ ID NO: 125), ras p5-17: KLVVVGARGVGKS (SEQ ID NO: 126), neu p42-56: HLDMLRHLYQGGQVV (SEQ ID NO: 127), neu p783-797, SRLLGICLTSTVQLV (SEQ ID NO: 128), and AGE-3121 -134: LLKYRAREPVTKAE (SEQ ID NO: 129)).

Agonista de Receptor Tipo Toll - Se reconoce ampliamente que la generación de inmunidad protectora depende de no solamente de la exposición al antígeno, sino también en contexto en el cual se encuentra el antígeno. Existen numerosos ejemplos de en los cuales la introducción de un antígeno novedoso en un huésped en un contexto inflamatorio genera tolerancia inmunológica en lugar de a largo plazo mientras que la exposición al antígeno en la presencia de un agente inflamatorio (adyuvante) induce inmunidad. (Mondino et al., 1996; Pulendran et al., 1998; Jenkins et al., 1994; y Kearney et al., Inmunidad 1: 327, 1994). Puesto que puede significar la diferencia entre tolerancia e inmunidad, se ha invertido mucho esfuerzo en descubrir los "adyuvantes" presentes en agentes infecciosos que estimulan las trayectorias moleculares involucradas en la creación del contexto inmunogénico apropiado de presentación de antígenos. Se sabe ahora que una parte de la actividad del adyuvante se debe a interacciones de productos microbianos y virales con miembros diferentes de los Receptores Tipo Toll (TLRs) expresados en células inmunes (Beutler et al., 2004; Kaisho, 2002; Akira et al., 2003; y Takeda y Akira, 2004). Los TLRs se nombran por su homología con una molécula en la Drosophila, llamada Toll, que funciona en el desarrollo de la misma y está involucrada en inmunidad antimicrobiana (Lemaitre et al., 1996; y Hashimoto et al., 1988).

Trabajos anteriores mostraron que los homólogos de Toll de mamíferos y moléculas de trayectoria de Toll eran críticos para la habilidad de las células del sistema inmune innato para responder a retos microbianos y subproductos microbianos ( edzhitov et al., 1997; Medzhitov et al., 1998; Medzhitov et al., 2000; Medzhitov et al., 2000; y Janeway et al., 2002). Desde la identificación de LPS como un -agonista TLR4 (Poltorok et al., 1998) se han descrito numerosos otros agonistas TLR tales como triacil polipéptidos de HPV de tipos múltiples (TLR1 ), peptidoglican, ácido lipoteicoico y Pam3Cys (TLR2), dsRNA (TLM), flagellin (TLRS), diacil polipéptidos de HPV de tipos múltiples tal como Malp-2 (TLR6), imidazoquinolinas y ARN de hebra sencilla (TLR7,8), ADN bacterial, secuencias de ADN CpG sin metilar, y aun complejos de anticuerpo de ADN genómico humano (TLR9). Takeuchi et al, 2001; Edwards et al, 2002; Hayashi et al, 2003; Nagase et al, 2003).

En ciertos análogos, los ligandos TLR2 incluyen, pero no. están limitados a, ácido lipoteicoico, ácidos manurónicos, peptidoglicanos, LPS, ALP-2 y MALP-404 atípicos (lipoproteínas), OspA, Porin, LcrV, lipomannan, ancla GPI, lisofbsfatidilserina, lipofosfoglican (LPG), glicofosfatidilinositol (GPI), zimosan, hemaglutinina, y análogos o derivados de los mismos. En aspecto más, el agonista TLR2 incluye el polipéptido bacterial de M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. pallidum; peptidoglicanos de especies que incluyen Staphylococcus aureus; Neisseria porins, fimbriae bacterial, factores Yersina virulence, viriones CMV, haemagglutinin de sarampión, y zimosan de levadura.

En ciertos aspectos, el agonista de TLR es una porción de lípido. Las porciones de lípido incluyen, pero no están limitadas a, ácidos grasos tales como grupos palmitoilo, miristoilo, y decanoilo o, más generalmente, cualquier grupo acilo graso de 2 átomos de carbono a 30 átomos de carbono saturado, monoinsaturado o poliinsaturado. En ciertos aspectos, la porción de lípido es una porción de Pam2Cis[S-[2,3-bis (palmitoiloxi)propil] cisteína] o Parleys [N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)prop¡l]cisteína. Pam3Cis o Pam3Cis-OH (Wiesmuller et al., 1983) es una versión sintética de la porción N terminal de lipoproteína de Braun que abarca las membranas interna y externa de bacterias Gram negativas (Patente de E. U. No.5, 700, 910 por ejemplo, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad).

Agonistas de TLR adicionales se describen en la Publicación de Patente de E. U. 200080145375, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

D. Componentes y Porciones de Lipidos En ciertas modalidades, la presente invención comprende composiciones concernientes que comprenden uno o más lipidos asociados de manera no covalente con un péptido de HPV de tipos múltiples. Un lípido es una sustancia que es insoluble en agua y se puede extraer con un solvente orgánico. Compuestos diferentes a esos descritos específicamente en la presente deben ser entendidos como lipidos por aquellos expertos en la técnica, y están abarcados por las composiciones y métodos de la presente invención.

Un lípido puede ser un lípido que ocurre naturalmente o un lípido sintético. Sin embargo, un lípido es usualmente una sustancia biológica. Los lipidos biológicos son bien conocidos en la técnica y incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glicosfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lipidos éter y éster vinculados con ácidos grasos y lipidos polimerizables y combinaciones de los mismos.

Un péptido de HPV de tipos múltiples asociado con un lípido puede ser dispersado en una solución que contiene un lípido, disuelto con un lípido, emulsificado con un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lipido, contenido como una suspensión en un lípido o asociado de otra forma con un lípido. Una composición asociada con un lípido de la presente invención no está limitada a ninguna estructura en particular. Por ejemplo, también pueden ser simplemente intercalados en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño o forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de dos capas, como micelas, o con una estructura "colapsada". En otro ejemplo no limitante, está contemplado también un complejo de lipofectamina (Gibco BRL) o Superfect (Qiagen).

En ciertas modalidades, una composición puede comprender aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4% aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, aproximadamente 25%, aproximadamente 26%, aproximadamente 27%, aproximadamente 28%, aproximadamente 29%, aproximadamente 30%, aproximadamente 31%, aproximadamente 32%, aproximadamente 33%, aproximadamente 34%, aproximadamente 35%, aproximadamente 36%, aproximadamente 37%, aproximadamente 38%, aproximadamente 39%, aproximadamente 40%, aproximadamente 41%, aproximadamente 42%, aproximadamente 43%, aproximadamente 44%, aproximadamente 45%, aproximadamente 46%, aproximadamente 47%, aproximadamente 48%, aproximadamente 49%, aproximadamente 50%, aproximadamente 51%, aproximadamente 52%, aproximadamente 53%, aproximadamente 54%, aproximadamente 55%, aproximadamente 56%, aproximadamente 57%, aproximadamente 58%, aproximadamente 59%, aproximadamente 60%, aproximadamente 61%, aproximadamente 62%, aproximadamente 63%, aproximadamente 64%, aproximadamente 65%, aproximadamente 66%, aproximadamente 67%, aproximadamente 68%, aproximadamente 69%, aproximadamente 70%, aproximadamente 71%, aproximadamente 72%, aproximadamente 73%, aproximadamente 74%, aproximadamente 75%, aproximadamente 76%, aproximadamente 77%, aproximadamente 78%, aproximadamente 79%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% por ciento en peso de lípido, o cualquier rango o valor intermedio, de un lípido, tipo de lípido o componente no lípido en particular, tal como un adyuvante, azúcar, ácido nucleico u otro material descrito en la presente o como sería conocido por alguien experto en la técnica. Así, está contemplado que las composiciones de la presente invención pueden comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos u otros componentes en cualquier combinación o rango de porcentaje.

II. Producción de Polipéptidos y Fragmentos de los Mismos A. Síntesis v/o Conjugación de Polipéptidos En ciertos aspectos, los polipéptidos pueden ser sintetizados usando métodos convencionales modificados para la secuencias de aminoácidos particulares. Tales técnicas incluye, pero no están limitadas a, métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de síntesis de péptidos, por ejemplo, síntesis en fase de solución (ver Finn y Hoffman, 1976), o síntesis en fase sólida (ver Barany y errifield, 1979), o síntesis gradual en fase sólida como se reporta por Merrifield (1963), cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia. Otras referencias a técnicas de síntesis de péptidos incluyen péptidos sintetizados mediante el modo de Fmoc-poliamida de síntesis de péptidos en fase sólida como lo describe Lu et al, (1981), péptidos sintetizados usando un procedimiento Fmoc/tBu (Atherton y Sheppard, 1989). Los aminoácidos de Fmoc puede ser obtenidos de varios vendedores, por ejemplo, Chem-lmpex International (Wood Dale, III, EUA), Merck Biosciences (Nottingham, RU) y Bachem UK Ltd. (St. Helens, RU).

Después o durante la síntesis, un péptido se puede conjugar con un espaciador, un aminoácido, un polímero o un lípido. En ciertos aspectos, el grupo de cadena lateral terminal de una lisina o un análogo de lisina (por ejemplo, grupo amino épsilon de la lisina interna) es protegido por uno de un número de grupos protectores. Grupos bloqueadores, grupos protectores o grupos enmascaradores se usan proteger el grupo amina del aminoácido que tiene un grupo carboxilo activado que está involucrado en la reacción de acoplamiento, o para proteger el grupo carboxilo del aminoácido que tiene un grupo amino acilado que está involucrado en la reacción de acoplamiento. Para que ocurra el acoplamiento, se debe remover un grupo bloqueador sin perturbar un enlace de péptido, o cualquier grupo protector unido a otra parte del péptido. Los péptidos pueden lipidarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las reacciones de condensación, adición, sustitución u oxidación normales (por ejemplo, formación de puente de disulfuro o formación de enlace de amida entre un grupo' amino terminal en la lisina interna o análogo de Usina con el grupo terminal carboxi de un aminoácido o péptido o lipoaminoácido entrante) resultan en la adición de lípido al péptido.

B. Sistemas de Expresión Expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención se pueden realizar mediante cualquier técnica adecuada.

La presente invención proporciona también vectores de clonación y expresión recombinantes que contienen ADN, así como también células huésped que contienen los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden ADN se pueden usar para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el ADN. Un método para producir polipéptidos comprende cultivar células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifica el polipéptido, bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido, después recuperar los polipéptidos expresados del cultivo. El técnico experimentado reconocerá que el procedimiento para purificar los polipéptidos expresados variarán de acuerdo con tales factores como el tipo de células huésped empleadas, y ya sea que el polipéptido está unido a la membrana o una forma soluble que es secretada de la célula huésped. Los polipéptidos de la invención pueden incluir varias secuencias líderes que dirigen el tráfico o ayudan en la purificación.

Se puede emplear cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen un ADN que codifica un polipéptido o un fragmento de la invención, enlazado operativamente a secuencias de nucleótido regulatorias transcripcionales. o translacionales, tales como aquellas derivadas de un gen de mamífero, de microbio, viral o de insecto. Ejemplos de secuencias regulatorias incluyen promotores, operadores o aumentadores de transcripción, un sitio de unión de ARNm ribosomaí y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la transcripción y la translación. Las secuencias de nucleótidos se enlazan operativamente cuando la secuencia regulatoria se relaciona funcionalmente con la secuencia del ADN. Así, una secuencia de nucleótidos promotora se enlaza operativamente a una secuencia de ADN si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN. En el vector de expresión están incorporados generalmente un origen de replicación, que confiere la habilidad de replicar en las células huésped deseadas, y un gen de selección mediante el cual se identifican los transformantes.

Además, se puede incorporar una secuencia que codifica un péptido de señal apropiado (nativo o heterólogo) en los vectores de expresión. Una secuencia de ADN para un péptido de señal (líder secretorio) puede fusionarse en marco con la secuencia de ácido nucleico de la invención de manera que el ADN se transcribe inicialmente y se traslada el ARNm, a una proteína de fusión que comprende el péptido de señal. Un péptido de señal que es funcional en las células huésped pretendidas promueve la secreción extracelular del polipéptido. El péptido de señal es escindido del polipéptido por secreción de polipéptido desde la célula. ' El técnico experto reconocerá también que la(s) posición(es) en las cuales se escinde el péptido de señal puede(n) diferir de la predicha por un programa de computadora y puede variar de acuerdo con tales factores como el tipo de células huésped empleadas en la expresión de un polipéptido recombinante. La preparación de una proteína puede incluir una mezcla de moléculas de proteínas que tienen diferentes aminoácidos N terminales, que resulta de la escisión del péptido de señal en más de un sitio.

Células huésped adecuadas para expresión de polipéptidos incluyen células procariotas, levadura o eucariotas superiores. Las células de mamíferos o de insectos son generalmente preferidas para uso células huésped. Los vectores apropiados de clonación y expresión para uso con huéspedes celulares de bacterias, hongos, levadura y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels et al, (1985). Se podrían emplear también sistemas de traslación libres de células para producir polipéptidos usando ARNs derivados de constructos de ADN descritos en la presente. 1. Sistemas Procarióticos Las procariotas incluyen organismos gram-negativos o gram positivos. Las células procarióticas huéspedes para transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias otras especies dentro de género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula procariótica huésped, tal como E. coli, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina N terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula procariótica huésped. La Met N terminal puede ser escindida del polipéptido recombinante expresado.

Los vectores de expresión para uso en células procarióticas huésped comprenden generalmente uno o más genes marcadores fenotípicamente seleccionares. Un gen marcador fenotípicamente seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles para células procarióticas huésped incluyen esos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tal como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y proporciona así medios simples para identificar células transformadas. Un promotor apropiado y una secuencia de ADN se insertan en el vector pBR322. Otros vectores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMI (Promega Biotec, Madison, Wis., EUA).

Las secuencias promotoras usadas comúnmente para vectores de expresión de células procarióticas recombinantes huéspedes incluyen ß-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Cheng et al, 1978; y Goeddel et al, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al, 1980; y EP-A-36776) y promotor tac ( aniatis, 1982). Un sistema de expresión de células procarióticas huéspedes particularmente útil emplea un promotor de fago ??^ y una secuencia represora termolábil c1857ts. Los vectores de plásmido disponibles de American Type Culture Collection que incorpora derivados del promotor XPL incluyen plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RRI, ATCC 53082). 2. Sistemas de Levadura Alternativamente, los péptidos pueden ser expresados en células huésped de levadura, de preferencia del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Se pueden emplear también otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura contienen con frecuencia un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2 µ, una secuencia de replicación autónomamente (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al, 1968; y Holland et al, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfo-glucosa ¡somerasa y glucocinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en expresión de levadura se describen adicionalmente en la solicitud de patente europea 73,657. Otra alternativa es el promotor ADH2 glucosa-represible descrito por Russell et al, (1982) y Beier et al, (1982). Vectores shuttle replicables tanto en levadura como en E. coli pueden construirse mediante la inserción de secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura antes descritos.

La secuencia líder de factor a de levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido. La secuencia líder de factor a está insertada con frecuencia entre la secuencia promotora y la secuencia de gen estructural. Ver, por ejemplo, Kurjan et al, 1982 y Bitter et al, 1984. Otras secuencias líderes adecuadas para facilitar la secreción de péptidos recombinantes de huéspedes de levadura son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Uno de tales protocolos se describe por Hinnen et al, 1978. El protocolo de Hinnen et al selecciona los transformantes Tpr+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de base de nitrógeno de levadura, 0.5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 mg/ml de adenina y 20 mg/ml de uracilo.

Las células huéspedes de levadura transformadas mediante vectores que contienen una secuencia promotora ADH2 pueden cultivarse para inducir expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de extracto de levadura 1%, peptona 2% y glucosa 1% suplementado con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracilo. La derepresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio. 3. Sistemas de Mamíferos o Insectos Se pueden emplear también sistemas de cultivo de células huéspedes de mamíferos o insectos para expresar polipéptidos recombinantes. Sistemas de baculovirus para producción de proteínas heterólogas en células de insectos se revisan por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Se pueden emplear también líneas celulares establecidas de origen de mamífero. Ejemplos de líneas de células huéspedes de mamífero adecuadas incluyen la linea COS-7 de células de hígado de moho (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al, 1981, células L, células C 127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas de células BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea de células de hígado de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como se describe por maman et al, (1991).

Se han descrito métodos establecidos para introducir ADN en células de mamíferos (Kaufman, 1990). Se pueden usar protocolos adicionales que usan reactivos disponibles comercialmente, tales como reactivo de lípido Lipofectamine (Gibco/BRL) o reactivo de lípido Lipofectamine Plus (Gibco/BRL), para transfectar células (Feigner et al, 1987). Además, se puede usar electroporación para transfectar células de mamífero usando procedimientos convencionales, tales como aquellos en Sambrook et al, 1989). Se puede realizar la selección de transformantes estables usando métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al, 1990, describe varios esquemas de selección, tal como la resistencia a dihidrofolato "reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para selección de DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, 1980). Un plásmido que expresa el ADNc de DHFR puede ser introducido en la cepa DX-B11 y solamente células que contienen el plásmido pueden crecer en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores selectivos que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen cADNs que confieren resistencia a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que abrigan el vector pueden ser seleccionadas sobre la base de la resistencia a estos compuestos.

Las secuencias de control transcripcional y traslacional para vectores de expresión de células huéspedes de mamífero pueden ser extirpadas de genomas virales. Secuencias promotoras y secuencias de aumento usadas comúnmente se derivan del virus de polioma, adenovirus 2, virus de simian 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano y tardío, aumentador, empalme y sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tempranero y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento, el cual puede contener también un origen viral de replicación (Fiers et al, 1978; Kaufman, 1990).

Las secuencias de control adicionales mostradas para mejorar la expresión de genes heterologos de vectores de expresión de mamíferos incluyen tales elementos como el elemento de secuencia de aumento de expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris et al, Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534 y solicitud de PCT WO 97/25420 y el líder tripartita (TPL) y ARNs de gen de VA de adenovirus 2 (Gingeras et al, Biol. Chem. 257: 13475-13491, 1992). Las secuencias del sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) de origen viral permiten a los mARNs bi-cistrónico ser trasladados eficientemente (Oh y Samow, 1993; Ramesh et al, 1996). La expresión de un cADN heterólogo como parte de un mARN bi-cistrónico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo, DHFR) ha mostrado que mejora la transfectabilidad del huésped y la expresión del cADN heterólogo (Kaufman, 1990). Vectores de expresión de ejemplo que emplean mARNs bi-cistrónicos son pTR-DC/GFP descrito por Mosser et al, (1997) y p2A51 descrito por Morris et al, (1997).

Un vector de alta expresión útil, pC AVNOT, ha sido descrito por Mosley et al, (1989). Otros vectores de expresión para uso en células huésped de mamíferos pueden ser construidos como se describe por Okayama y Berg (1983). Un sistema útil para expresión estable de alto nivel de cADNs de mamíferos en células epiteliales de mamífero de murino C 127 puede ser construido sustancialmente como se describe por Cosman et al, (1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al, (1984), se ha depositado como ATCC 39890. Vectores adicionales de expresión útiles de mamíferos se describen en EP-A-0367566 y en WO 91/18982, incorporados por referencia en la presente. En todavía otra alternativa, los vectores pueden derivarse a partir de retrovirus.

Se pueden usar también los vectores adicionales de expresión útiles, pFLAG® y pDC311. La tecnología de FLAG® está centrada en la fusión de un péptido marcador FLAG®, hidrofílico, de bajo peso molecular (1 kD) con el término N de una proteína recombinante expresada por vectores de expresión pFLAG®. El pDC311 es otro vector especializado usado para expresar proteínas en células de CHO. El pDC311 se caracteriza por una secuencia bi-cistrónica que contiene el gen de interés y un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) con un sitio de unión de ribosoma interno para traslación de DHFR, un elemento de secuencia de aumento de expresión (EASE), el promotor C V humano, una secuencia líder tripartita y un sitio de poliadenilación.

Con respecto a los péptidos de señal que pueden emplearse, el péptido nativo de señal puede ser reemplazado por un péptido de señal heterólogo o una secuencia líder, si se desea. La selección del péptido de señal o líder puede depender de factores tales como el tipo de células huéspedes en las cuales se va a producir el polipéptido recombinante. Para ilustrar, ejemplos de péptidos de señal heterólogos que son funcionales en células huéspedes de mamíferos incluyen la secuencia de señal para interleucin-7(lL-7) descrita en la Patente de E. U. 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor de interleucin-2 descrita en Cosman et al, Nature 312: 768 (1984); el péptido de señal de receptor de interleucin-4 descrito en EP 367,566;· el péptido de señal de receptor de interleucin-1 tipo 1 descrito en la Patente de E. U. 4,968,607; y el péptido de señal de receptor de interleucin-1 tipo II descrito en EP 460,846.

C. Aislamiento y Purificación La invención incluye además métodos de aislamiento y purificación de los polipéptidos y sus fragmentos.

En una modalidad, la purificación de polipéptidos recombinante o fragmentos se puede realizar usando fusiones de polipéptidos o fragmentos de la invención con otro polipéptido para ayudar en la purificación de los polipéptidos o fragmentos de la invención. Tales socios de fusión pueden incluir el poli-His u otros péptidos de identificación antes descritos así como porciones Fe.

Con respecto a cualquier tipo de célula huésped, como lo sabe el técnico experto, los procedimientos para purificar un polipéptido recombinante o fragmento variarán de acuerdo con tañes factores como el tipo de células huéspedes empleadas y si el polipéptido recombinante o fragmento es secretado o no en el medio de cultivo.

En general, el polipéptido recombinante o fragmento puede ser aislado de las células huéspedes si no es secretado, o del medio o sobrenadante si es soluble y es secretado, seguido por uno o más pasos de concentración, desalado, intercambio de iones, interacción hidrofóbica, cromatografía de purificación por afinidad o exclusión de tamaños. Como maneras específicas de realizar estos pasos, primero el medio de cultivo se puede concentrar usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultra-filtración Amicon o Millipore Pellicon. Siguiendo al paso de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos de dietilaminoetil (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrán, celulosa u otros tipos de empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear un paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Además, se puede emplear un paso de cromatoenfoque. Alternativamente, se puede emplear un paso de cromatografía de interacción hidrofóbica. Las matrices adecuadas pueden ser porciones de fenilo u octilo unidas a resinas. Además, se puede emplear cromatografía por afinidad con una matriz que une selectivamente a la proteina recombinante. Ejemplos de tales resinas empleadas son columnas de lectinas, columnas de colorantes y columnas de quelantes de metal. Finalmente, se puede emplear uno o más pasos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplea medio hidrofóbico de RP-HPLC (por ejemplo, gel de sílice resina de polímero que tiene metilo, octilo, octildecilo u otros grupos alifáticos pendientes) para purificar adicionalmente los polipéptidos. Algunos o todos los pasos de purificación precedentes, en varias combinaciones, son bien conocidos y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y purificada.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de aglutinación de polípéptido, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos de la invención, para polipéptidos expresados purificados por afinidad. Estos polipéptidos pueden ser removidos de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un búfer de elución alto en sal y después dializados en búfer bajo en sal para uso o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o ser removidos competitivamente usando el sustrato que ocurre naturalmente de la porción de afinidad, tal como un polípéptido derivado de la invención.

En este aspecto de la invención, proteínas de aglutinación de polípéptido, tales como anticuerpos anti-polipéptido de la invención u otras proteínas que pueden interactuar con el polípéptido de la invención, pueden unirse a un soporte en fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar o purificar células que expresan los polipéptidos de la invención en su superficie. La adherencia de proteínas de aglutinación de polipéptidos de la invención a una superficie de contacto en fase sólida puede realizarse mediante cualquier medio. Los métodos de liberación de células positivamente seleccionadas de la fase sólida son conocidos en la técnica y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son, de preferencia, no tóxicas y no ofensivas para las células y están dirigidas, de preferencia, a abrir o partir la región de aglutinación de la superficie de la célula.

El grado deseado de pureza depende del uso de destino de la proteína. Se desea un grado relativamente alto de pureza cuando el polipéptido se va a administrar in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de manera que bandas de proteínas que corresponden a otras proteínas no son detectables por análisis mediante electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Se reconocerá por alguien experto en el campo pertinente que bandas múltiples que corresponden al polipéptido pueden ser visualizadas mediante SDS-PAGE, debido a glicosilación diferencial, procesamiento postraslacional diferencial y los similares. Más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica hasta homogeneidad sustancial, como se indica mediante una banda sencilla de proteína por análisis por SDS-PAGE. La banda de proteína puede ser visualizada por teñido con plata, teñido con azul Coomasie o (si la proteina está radio-etiquetada) autorradiografía.

III. Formulación y Administración La manera de administración de las composiciones descritas en la presente puede variar. Cualquiera de los métodos convencionales para administración de una vacuna es aplicable. Se cree que éstos incluyen aplicación oral en una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente mediante inyección, inhalación de un polvo, vía parche transcutáneo, vía instilación vaginal y los similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la ruta de administración y variará de acuerdo con la talla y la salud del sujeto.

La preparación de vacunas que contienen secuencia(s) de polipéptidos o péptidos como ingredientes activos generalmente está bien entendida en la técnica, como se ejemplifica en las Patentes de E. U. 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; y 4,578,770, todas las cuales se incorporan en la presente por referencia. Típicamente, tales vacunas se preparan como inyectables ya sea en soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en líquido antes de inyección. La preparación puede ser emulsificada también. El ingrediente inmunogénico activo se mezcla con frecuencia con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados con, por ejemplo, agua, salina, dextrosa, glicerol, etanol o los similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes de amortiguación de pH o auxiliares que aumentan la efectividad de las vacunas. En modalidades específicas, las vacunas se formulan con una combinación de sustancias, como se describe en las Patentes de E. U. 6,793,923 y 6,733,754, las cuales .se incorporan en la presente por referencia.

Las vacunas se pueden administrar por inhalación. En ciertas modalidades, una vacuna se puede administrar como un aerosol. Como se usa en la presente, el término "aerosol" o "composición en aerosol" se refiere a una suspensión de partículas sólidas o líquidas en un gas. Los términos se pueden usar generalmente para referirse a una composición que ha sido vaporizada, nebulizada o convertida de alguna manera de una forma sólida o líquida a una forma que se puede inhalar incluyendo partículas de fármaco sólidas o líquidas suspendidas. Tales aerosoles se pueden usar para entregar una vacuna vía el sistema respiratorio. Como se usa en la presente, "sistema respiratorio" se refiere al sistema de órganos en el cuerpo responsable de la toma de oxígeno y la expiración de dióxido de carbono. El sistema incluye generalmente todos los pasajes de aire desde la nariz hasta los alvéolos pulmonares. En los mamíferos se considera generalmente que incluye los pulmones, bronquios, traquea, pasajes nasales y diafragma. Para propósitos de la presente descripción, la entrega de una vacuna al sistema respiratorio indica que un fármaco es entregado a uno o más de los pasajes de aire del sistema respiratorio, en particular a los pulmones.

Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios (para aplicación anal o vaginal) y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcalén glicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el rango desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 10%, de preferencia de aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, celulosa, carbonato de magnesio y los similares. Estas composiciones tienen la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación sostenida y contienen de aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.

Las composiciones de polipéptidos, péptidos y lipopéptidos pueden formularse enana vacuna como formas neutras o de sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y aquellas que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico y fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y los similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y los similares.

En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, usualmente cuando mucho, por lo menos o sin exceder de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más vacunaciones incluyendo todos los rangos intermedios. Las vacunaciones serán normalmente en intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a 12 semanas/meses/años, incluyendo todos los valores y rangos intermedios, más usualmente intervalos de tres a cinco semanas. Típicamente, serán deseables reforzadores periódicos en intervalos de 1 a 15 años, usualmente diez años, para mantener niveles de protección contra los antígenos, como se describe supra, Patentes de E. U. 3,791,932; 4,174,384 y 3,949,064, las cuales son ilustrativas de estos tipos de ensayos.

A. Terapia en Combinación La composición y métodos relacionados de la presente invención, particularmente la administración de un epitope de HPV, incluyendo un polipéptido o péptido de una proteína L2 de HPV a un paciente/sujeto, se pueden usar también en combinación con la administración vacunas tradicionales de protección de HPV y/u otras, incluyendo, pero no limitadas a, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, frotis cervical Pap, PCR, hibridación Southern, administración de CERV ARK™, GARDASIL™, vacunas para HPV u otros agentes infecciosos, terapia ablativa de lesiones de HPV, o los similares.

En un aspecto, está contemplado que una composición de péptido de HPV y/o terapia se usa en conjunto con tratamiento de protección de HPV y/u otros. Alternativamente, la terapia puede preceder o seguir al otro tratamiento en intervalos que fluctúan desde minutos hasta semanas. En modalidades donde los otros agentes se administran separadamente, se podría asegurar generalmente que un periodo de tiempo significativo no terminó entre el tiempo de cada entrega, de manera que la composición de agente y antigénico sería aun capaz de ejercer enefecto combinado ventajosamente en el sujeto. En tales casos, está contemplado que se pueden administrar ambas modalidades dentro de aproximadamente 12 a 24 horas entre cada una y, más preferiblemente, dentro de aproximadamente las 6 y 12 horas entre cada una. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para administración de manera significativa, sin embargo, cuando pasan varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12), o años (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) entre las administraciones respectivas.

Se pueden emplear varias combinaciones, por ejemplo una terapia de péptidos de HPV de tipos múltiples es "A" y otra vacuna o anticuerpo o tratamiento dados como una terapia "B".

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A La administración de las composiciones inmunogénicas de la presente invención a un paciente/sujeto seguirá protocolos generales para la administración de tales compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si existe alguna, de la composición de polipéptidos de HPV de tipos múltiples, o composición de cualquier otro antígeno o combinación de antígenos descritos en la presente. Se espera que los ciclos de tratamiento sean repetidos según se necesite. También está contemplado que se pueden aplicar varias terapias normales, tal como hidración, en combinación con la terapia descrita.

B. Métodos Preventivos y/o Terapéuticos En algunas modalidades, se administran composiciones farmacéuticas a un sujeto. Diferentes aspectos de la presente invención involucran administrar una cantidad efectiva de una composición a un sujeto. En algunas modalidades de la presente invención, se administran composiciones de péptidos de HPV de tipos múltiples al paciente a proteger contra o para tratar la infección mediante por lo menos uno o más patógenos de HPV. Tales composiciones están disueltas o dispersas generalmente en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en la presente, el término "farmacéuticamenté aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación los cuales, dentro del alcance y juicio médico formal, son adecuados para contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesiva u otras complicaciones del problema conmensurados con una relación riesgo/beneficio razonable. El término "portador farmacéuticamente aceptable", significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulado, liquido o sólido, involucrado en llevar o transportar un agente químico. El portador farmacéuticamente aceptable incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso isotónico y de absorción y los similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos, su uso está contemplado en composiciones inmunogénicas y terapéuticas.

Los compuestos activos de la presente invención se pueden formular para administración parenteral, por ejemplo, formulados para inyección vía las rutas intravenosa, intramuscular, subcutánea o aun intraperitoneal. Además de los compuestos formulados para administración en aerosol o parenteral, tales como aquellos para inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, tabletas u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación con el tiempo.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacéuticamente aceptables pueden ser preparadas en agua adecuadamente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones normales, de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de ajonjolí, aceite de cacahuate propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. En todo caso, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que pueda ser inyectada fácilmente. También debe ser estable bajo condiciones de elaboración y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción de contaminación de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las composiciones de polipéptidos de HPV de tipos múltiples pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y los similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden ser derivadas también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y las similares.

El portador puede ser también un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y los similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede ser llevada por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y los similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónieos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones estériles inyectables se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los ingredientes antes enumerados, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los varios ingredientes esterilizados activos en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos antes enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación, las cuales dan un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución del mismo previamente filtrado estéril.

La administración de las composiciones de acuerdo con la presente invención será típicamente vía cualquier ruta común. Ésta incluye, pero no está limitada a, administración oral, nasal o bucal.

Alternativamente, la administración puede ser mediante administración ortotópica, intradermal, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, de supositorio anal, intravaginal, respiratoria o intravenosa. En ciertas modalidades, una composición de vacuna puede ser inhalada (por ejemplo, la Patente de E. U. 6,651,655, la cual se incorpora específicamente por referencia). Tales composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen portadores, amortiguadores u otros excipientes fisiológicamente aceptables.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser amortiguada adecuadamente, si es necesario, y el diluyente líquido volverse primero isotónico con suficiente salina o glucosa. Estas soluciones acuosas en particular son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este respecto, el medio acuoso estéril que se puede emplear será conocido por aquellos expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, se podría disolver una dosificación en solución isotónica de NaCI y agregarse a fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (ver por ejemplo, Remington's Pharmaceuticals Sciences, 1990). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la composición del sujeto. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosificación apropiada para el sujeto individual.

Una cantidad efectiva de composición terapéutica o profiláctica se determina con base en la meta pretendida. El término "dosificación unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para uso en un sujeto, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas antes discutidas en relación con su administración, es decir, la ruta y el régimen apropiados. La cantidad a ser administrada, tanto de acuerdo con el número de tratamientos como de la dosis unitaria, depende de la protección deseada.

Las cantidades precisas de la composición dependen también del juicio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Los factores que afectan la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la ruta de administración, la meta pretendida del tratamiento (alivio de síntomas versus curación) y potencia, estabilidad y toxicidad de la composición particular.

Al formularse, la soluciones serán administradas en una manera compatible con la formulación de la dosificación y en tal cantidad para que sea terapéutica y profilácticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables antes descritas. 1. Administración In Vitro. Ex Vivo o In Vivo Como se usa en la presente, el término administración in vitro se refiere a manipulaciones realizadas en células removidas de o fuera de un animal, incluyendo, pero no limitado a, células en cultivo. El término administración ex vivo se refiere a células que han sido manipuladas in vitro y subsiguientemente se administran a un animal vivo. El término administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizados dentro de un animal.

En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones pueden ser administradas in vitro, ex vivo o in vivo. En ciertas modalidades in vitro, se incuban líneas de células de linfocito B o células dendríticas con una composición de HPV de tipos múltiples. Las células activadas pueden usarse entonces para análisis in vitro, o alternativamente para administración ex vivo. 2. Anticuerpos e Inmunización Pasiva Otro aspecto de la invención es un método para preparar una inmunoglobulina para uso en la prevención o tratamiento de infección de HPV que comprende los pasos de inmunizar un recipiente con una vacuna de la invención y aislar inmunoglobulina o anticuerpos del recipiente y/o producir de manera recombinante tales inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Una inmunoglobulina preparada por este método es un aspecto más de la invención. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable es un aspecto más de la invención la cual se puede usar en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de infección de HPV. Un método para el tratamiento o prevención de infección de HPV que comprende un paso de administrar a un paciente una cantidad efectiva de la preparación farmacéutica de la invención es un aspecto más de la invención.

Las inoculaciones para producción de anticuerpos policlonales se preparan típicamente mediante la dispersión de la composición antigénica en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como salina u otros adyuvantes para uso humano para formar una composición acuosa. Una cantidad inmunoestimulante de inoculum se administra a un mamífero, por ejemplo, un ser humano, y el sujeto inoculado se mantiene entonces durante un tiempo suficiente para que la composición antigénica induzca anticuerpos protectores. Los anticuerpos pueden ser aislados hasta el grado deseado mediante técnicas bien conocidas tales como cromatografía por afinidad (Harlow y Lañe, Anticuerpos: A Laboratory Manual 1988).

Los anticuerpos pueden incluir preparaciones antisuero de una variedad de animales usados comúnmente, por ejemplo, cabras, primates, burros, cerdos, caballos, conejillos de indias, ratas o seres humanos. Los animales se desangran y se recupera el suero.

Una inmunoglobulina producida de acuerdo con la presente invención puede incluir anticuerpos totales, fragmentos o sub-fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas enteras de cualquier clase, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad dual para dos o más antígenos de la invención. También pueden ser fragmentos, por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv y los similares incluyendo fragmentos híbridos. Una inmunoglobulina puede incluir también proteínas naturales, sintéticas o manipuladas genéticamente que actúan como un anticuerpo para aglutinarse a antígenos específicos para formar un complejo.

Una composición o vacuna de HPV de la presente invención puede ser administrada a un recipiente quien actúa entonces como una fuente de inmunoglobulina, producida en respuesta a un reto de la composición de HPV. Un sujeto tratado así podría donar plasma a partir de la cual se podría obtener globulina hiperinmune vía una metodología convencional de fraccionamiento de plasma. La globulina hiperinmune podría ser administrada a otro sujeto con el fin de impartir resistencia contra o tratar una infección de HPV. Las globulinas hiperinmunes de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o la prevención de infección de HPV en infantes, individuos con inmunidad comprometida o donde se requiere tratamiento y no hay tiempo para que el individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación.

Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos monoclonaies (o fragmentos de los mismos; de preferencia humanos o humanizados) reactivos contra constituyentes de la composición inmunogénica de la invención, los cuales podrían usarse para tratar o prevenir la infección de múltiples tipos de HPV.

Los métodos para hacer anticuerpos monoclonaies son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohler y Milstein, 1975; Harlow y Lañe, 1988). Alternativamente, los fragmentos monoclonaies pueden obtenerse mediante examen de una biblioteca adecuada de despliegue de fagos (Vaughan et al, 1998). Los anticuerpos monoclonaies pueden ser humanos, humanizados o parcialmente humanizados mediante métodos conocidos.

IV. Paquetes Otro aspecto de la invención es un paquete para vacunación o tratamiento de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, el paquete comprende un frasco y opcionalmente un encarte o material impreso en el paquete con las instrucciones de administración, el frasco comprende una composición o vacuna de polipéptidos de HPV de tipos múltiples para administración de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Cualquiera de las composiciones descritas en la presente puede estar comprendida en un paquete. En un ejemplo no limitativo, se pueden incluir, en un paquete, reactivos para preparar un polipéptido de HPV de tipos múltiples, formular un polipéptido de HPV de tipos múltiples y/o administrar un polipéptido de HPV de tipos múltiples. El paquete puede incluir además reactivos para evaluar la actividad del lipopéptido tanto in vitro como in vivo. Los paquetes comprenderán entonces, en un medio de contenedor adecuado, una composición de polipéptido de HPV de tipos múltiples. En ciertos aspectos, el paquete puede incluir reactivos y/o dispositivos para su administración. Por ejemplo, un inhalador o nebulizador. También puede incluir uno o más amortiguadores, compuestos o dispositivos para preparar la composición para administración.

Los componentes de los paquetes pueden ser empacados ya sea en medio acuoso o en forma liofilizada. El medio contenedor de los paquetes incluirá generalmente por lo menos un frasco, tubo de ensaye, matraz, botella, jeringa u otro medio contenedor, en el cual se puede colocar un componente y, de preferencia, adecuadamente en alícuotas. Cuando hay más de un componente en el paquete, el paquete contendrá también generalmente un segundo, tercero u otro contenedor adicional en el cual se pueden colocar por separado los componentes adicionales. Sin embargo, pueden estar comprendidas en un frasco varias combinaciones de componentes. Los paquetes de la presente invención típicamente incluirán también un medio para contener los contenedores en confinamiento cerrado para venta comercial. Tales contenedores pueden incluir contenedores de plástico moldeados por inyección o soplado en los cuales se retienen los frascos deseados.

Cuando se proporcionan los componentes del paquete en una y/o más soluciones líquidas, la solución líquida es una solución acuosa, particularmente preferida una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del paquete pueden proporcionarse como polvo(s) seco(s). Cuando se proporcionan reactivos y/o componentes como un polvo seco, el polvo puede ser reconstituido mediante adición de un solvente adecuado. Se concibe que el solvente se puede proporcionar también en otro medio contenedor.

En otros aspectos, un paquete o dispositivo puede incluir anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos a polipéptidos de la invención. Tal paquete o dispositivo puede usarse para detectar o identificar o purificar virus en una variedad de muestras y/o pacientes.

Un paquete incluirá también instrucciones para emplear los componentes del paquete así como el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el paquete. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden ser implementadas.

Está contemplado que tales reactivos son modalidades de la invención. Tales paquetes, sin embargo, no están limitados a los artículos en particular antes identificados y pueden incluir cualquier reactivo usado para la preparación y/o administración de una vacuna de polipéptidos de HPV de tipos múltiples.

V. Ejemplos Los siguientes ejemplos se dan para el propósito de ilustración de varias modalidades de la invención y no significan que limitan a la presente invención en cualquier modo. Alguien experto en la técnica apreciará rápidamente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellos objetivos, fines y ventajas inherentes en la presente. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente son realmente representativos de modalidades preferidas, son ejemplos, y no se pretenden como limitaciones del alcance de la invención. Cambios en la presente y otros usos que están abarcados dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones se les ocurrirán a aquellos expertos en la técnica.

A. Resultados Las vacunas de L2 que comprenden los residuos 11 a 200 y 1 a 18 usados en estudios anteriores fueron seleccionados con base en sitios de restricción convenientes en lugar de consideraciones inmunológicas (Campo y Jarrett, 1994; Roden et al, 1994). Por lo tanto, no pueden contener todos los epitopes relevantes de neutralización o tener inmunogenicidad y estabilidad óptimas. Sin embargo, estos estudios indican que la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos de L2 es suficiente para inmunidad protectora (Embers et al, 2002; Gambhira et al, 2007). De hecho la vacunación con L2 11 a 200 induce anticuerpos de neutralización cruzada y protección en los modelos de reto BP V4, CRPV y ROPV (Gambhira et al, 2007; Campo y Jarrett, 1994). La vacunación con el péptido de L2 de 1 a 88 fue protectora también, pero hubo alguna sugerencia de que la neutralización cruzada y la protección cruzada podrían no ser tan efectivas en comparación con animales vacunados con L2 11 a 200 (Bambhira eta al, 2007). Consistente con esta noción, la vacunación con péptidos de L2 de 94 a 112 y 107 a 122 fue protectora contra reto homólogo (Embers et al, 2002). Por lo tanto, para evaluar los beneficios de incluir estas regiones dentro de una vacuna de L2, generamos polipéptidos de L2 N terminales que terminan en 88, 107 o 200 para estudios de vacunas (Tabla 1).

Tabla 1. en en en L2 es necesaria par la infección (Roden et al, 2001) y puede tener múltiples funciones distintas (Richards et al, 2006; Bossis et al, 2005; Kamper et al, 2006). Durante la infección, L2 debe ser eliminada mediante furin para remover residuos 1 a 13 (Richards et al, 2006) y esto hace a un epitope neutralizante conservado (entre los residuos 17 a 36) más accesibles al anticuerpo monoclonal RG-I (Day et al, 2008). Además, los antisueros para polipéptidos 1 a 88 u 11 a 200 de L2 neutraliza cruzadamente tipos de virus de papiloma cutáneo como también mucosal (Pastrana et al, 2005). Por lo tanto, generamos polipéptidos de L2 N-terminal que inician en los residuos 1, 11, 13 u 89 para estudios de vacunas (Tabla 1).

Respuestas en conejos vacunados con polipéptidos de L2 monoméricos y de tipos múltiples: para mapear epitopes de neutralización cruzada, se expresaron siete polipéptidos de L2 de HPV (Tabla 1) en E. coli con etiquetas 6-His y se purificaron por afinidad para estudios de vacunación. Aunque todos los polipéptidos se purificaron fácilmente, 13 a 88 y 89 a 200 de L2 de HPV, fueron instables durante almacenamiento. Los conejos se inmunizaron cinco veces con 300 ig de cada polipéptido, inicialmente en CFA y en IFA para las inmunizaciones de refuerzo. El éxito de cada inmunización se verificó primero ensayando los sueros hiper-inmunes en un ELISA de longitud completa de L2 de HPV y un ELISA de seudovirión de L1/L2 de HPV. Altos títulos de anticuerpos en suero se elevaron para cada polipéptido de L2 de HPV, aunque los títulos contra seudoviriones de HPV16 fueron menores para los antisueros para los dos antígenos inestables, 13 a 88 y 89 a 200 de L2. Los títulos de neutralización de HPV16 y los títulos de neutralización cruzada de HPV6, HPV18, HPV31, HPV45 y HPV58 se determinaron entonces para cada antisúero de conejo inducido por los polipéptidos de L2. Consistentemente con estudios anteriores (Gambhira et al, 2007), los péptidos 11 a 200 y 1 a 88 de L2 de HPV16 indujeron títulos robustos de anticuerpos de neutralización de HPV16. Se observó similitud de los títulos robustos de anticuerpos de neutralización de HPV16 para los antisueros para 13 a 200, 1 a 107, 13 a 107 de L2 de HPV16. La vacunación con HPV 16 89-200 produjo respuestas de neutralización considerablemente más débiles, aunque indujo anticuerpos con títulos con títulos altos de ELISA de L2 en uno de dos conejos. Los antisueros de L2 específicos inducidos mediante los varios péptidos de L2 de HPV16 no solamente neutralizaron HPV16 sino también el rango diverso de tipos heterólogos de virus de papiloma, incluyendo los tipos oncogénicos HPV18, HPV31, HPV45 y HPV58, los cuales fueron ensayados (Tabla 2). Sin embargo, los títulos de anticuerpos de neutralización contra HPV16 fueron significativamente más altos que contra otros tipos, aunque no hubo una relación clara entre títulos y distancia evolutiva de HPV16.

Tabla 2: Un resumen de constructos de L2 de tipos múltiples 11-88 x 5 43 kDa 1, 5, 6, 16, 18 17-36 x 22 49 kDa 1 , 2, 63, 5, 8 (cutáneo) 6, 11 (mucosal bajo riesgo) 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 (mucosal alto riesgo) 11-88 x 8 69 kDa 6, 16, 18, 31, 39, 51, 73 * Las designaciones de residuos se basan en la numeración de aminoácidos de HPV16, la numeración de residuos real puede variar para péptidos homólogos, pero pueden determinarse mediante alineación de secuencias con péptidos de HPV16.

Debido a que ninguno de los péptidos de L2 de HPV16 alternativos incrementaron sustancialmente los títulos de neutralizacüón para virus heterologos, examinamos proteínas de fusión concatenadas, que consisten de varios péptidos de L2 homólogos derivados de diferentes genotipos de HPV médicamente significativos. Con base en los resultados de éste y estudios anteriores, se seleccionaron polipéptidos de L2 que corresponden a 17 a 36, 11 a 88 y 11 a 200 de L2 de HPV16 para constructos de fusión. Puesto que las proteínas recombinantes de tamaño más grande con frecuencia se producen menos eficientemente en bacterias, ensayamos constructos de tipos múltiples que comprenden tres copias de 11 a 200 (denominados 11-200 x 3), 5 copias de 11 a 88 (denominados 11-88 x 5) y 22 copias de 17 a 36 (denominados 17-36 x 22) y, como se muestra en la Tabla 2, cada uno que se deriva de genotipos médicamente relevantes y diversos (de Villiers et al, 204). Las proteínas se expresaron en E. coli, se purificaron por afinidad bajo condiciones desnaturalizantes y se usaron para inmunizar conejos como se describe para los polipéptidos de L2 de HPV16. La vacunación de conejos con cada una de las proteínas de fusión de L2 de HPV16 de tipos múltiples (11-200 x 3, 11-88 x 5 y 17-36 x 22) en adyuvante CFA/IFA indujo títulos más robustos de neutralización cruzada (Tabla 1B) en comparación con péptidos de L2 de monotipo (Tabla 1A) sin comprometer los títulos de neutralización de HPV16. En particular, el 11-88 x 5 indujo títulos marcadamente altos de anticuerpos de neutralización para todos los tipos de HPV de prueba, incluyendo tres (HPC31, 45 y 58) que no se usaron para derivar esta proteína de fusión.

Respuestas en conejos vacunados con GARDASIL™: La vacunación con VLPs de L1 puede inducir anticuerpos que neutralizan cruzadamente tipos de virus de papiloma relacionados muy estrechamente, por ejemplo, HPV18 y HPV45 (Smith et al , 2007; Lin et al, 1992; Richards et al, 2006). Por lo tanto buscamos comparar los niveles de anticuerpos de neutralización cruzada generados mediante vacunación con GARDASIL™ (el cual está formulado en alum) usando dos concentraciones diferentes versus proteínas L2 de tipos múltiples formuladas en CFA/IFA (Tabla 3). La vacunación con GARDASIL™ produjo títulos elevados de anticuerpo de neutralización para los tipos oncogénicos de HPV incluidos en la vacuna, HPV16 y HPV18. Aunque los títulos más altos de HPV16 y HPV18 fueron generados con la proteína de fusión L2, esto ocurrió con una dosis mayor de antígeno y usando un adyuvante más potente. Los sueros de conejos vacunados con GARADSIL™ contuvieron consistentemente niveles significativos de títulos de anticuerpos de neutralización de HPV45, ocasionalmente anticuerpos de neutralización de HPV31, pero de anticuerpos de neutralización de HPV58 no detectables. Así, los títulos de anticuerpos de neutralización para tipos de HPV no incluidos en la vacuna son mucho menores o esporádicos o indetectables después de la vacunación con GARDASIL™.

Tabla 3: Respuestas de anticuerpos de conejos vacunados con GARDASIL™: Se vacunaron conejos tres veces con 300 pg de los constructos de L2 poliméricos 11-88 x 5 usando adyuvante CFA/IFA o con cualquiera de 30 pg o 12 pg de GARDASIL™. Se recolectaron sueros hiper-inmunes a un mes después de la inmunización final y se ensayaron para títulos de neutralización in vitro (IVT) para los tipos de seudovirión de HPV indicados. No se detectaron títulos de neutralización en los sueros preinmunes. "Rb" conejo individual. "Ninguna" corresponde a menos de 50% de neutralización en la dilución más baja ensayada de 1:50. "-" no ensayada.

Respuestas de ratones vacunados con polipéptidos monomérico y de tipos múltiples: Los ratones pueden se retados con seudoviriones de HPV y la infección cuantificada mediante entrega de" un reportero tal como luciferasa (Gambhira et al, 2007; Roberts et al, 2007). Los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con polipéptidos de L2 de HPV2 que comprenden residuos 17 a 36, 1 a 88 u 11 a 200, o una de las tres proteínas de fusión de L2 de tipos múltiples concatenada, 11-200 x 3, 11-88 x 3 o 17-36 x 22, usando el adyuvante GPI-0 00 con base en saponina (Marciani et al, 2000). Dos semanas más tarde, se cosecharon sus sueros y se determinaron los títulos de neutralización in vitro para HPV16, HPV18, HPV45, HPV58 (cuatro tipos de HPV comunes oncogénicos) y HPV6 (el tipo más común encontrado en verrugas genitales benignas). Como se observó en conejos, la vacunación con L2 de HPV16 1 a 88 o L2 de HPV 11 a 200 indujo títulos significativos de anticuerpos de neutralización contra el tipo de virus homólogo, HPV16. Sin embargo, la vacunación con un péptido sintético que comprende residuos 17 a 36 de L2 de HPV16 no indujo anticuerpos de neutralización, o anticuerpos específicos de L2 (no mostrados), probablemente porque carece de un epitope ayudador T para esta cepa de ratón (Alphs et al, 2008). El control positivo, vacunación con VLPs de L1 de HPV en la ausencia de auxiliar, indujo títulos aun más altos que los constructos de L2 de HPV16. En contraste, la vacunación con VLPs de L1 de HPV 45 falló para inducir anticuerpos de neutralización de HPV16, consistente con la respuesta tipo restringida a vacunas de VLP de L1 (Figura 1). Los constructos 11-88 x 5 de L2 generaron títulos incrementados de anticuerpos de neutralización de HPV16 como el péptido 1-88 de L2 de HPV16, pero esto no se vio para 11-200 x 3 versus 11-200 de L2 de HPV16. El 17-36 x 22 fue aun menos efectivo (Figura 1), posiblemente como resultado de débil ayuda T (Alphs et al, 2008). De manera sorprendente, las respuestas de anticuerpos de neutralización cruzada observadas en ratones vacunados con polipéptido de L2 de HPV16 fueron menos robustas que aquellas generadas en conejos que recibieron las mismas vacunas. Sin embargo, cuando se comparan L2 de tipos múltiples versus los constructos 11-200 y 1-88 de L2 de HPV16, la inmunización con 11-200 x 3 y 11-88 x 5 fue mucho más efectiva en la inducción de anticuerpos de neutralización contra HPV6, HPV18, HPV45 y HPV58 (Figura 1). De manera notable, los polipéptidos 11-200 x 3 y 11-88 x 5 no contienen secuencias de ninguno HPV 45 o HPV58 y aun se observó neutralización cruzada significativa.

Polipéptidos de L2 de tipos múltiples coadyuvados: Varios adyuvantes que son potencialmente más efectivos que, o complementarios a alum, han mostrado ser promisorios en pruebas clínicas de vacunas, por ejemplo, la secuencia inmunoestimuladora (SS) 1018, un oligonucleótido que activa el receptor 9 como toll (Halperin et al, 2005; Halperin et al, 2003) y el adyuvante GPI-0100 con base en saponina (Marciani et al, 2003; Slovin et al, 2005). Para tratar si un adyuvante en particular fue más efectivo para inducir anticuerpos neutralizantes de HPV cuando se formulan con una vacuna de L2 de tipos múltiples, comparamos respuestas inmunes para 25 pg de 11-200 x 3 formulado en una variedad de adyuvantes y combinaciones de los mismos, frente a frente. Se obtuvieron sueros de ratones dos semanas-después de su tercera inmunización y se midieron los títulos para neutralización in vitro de HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 (Figura 2). Los títulos de neutralización in vitro fueron marcadamente similares a través de cada grupo de adyuvantes y ninguno fue notablemente superior a la formulación de 11-200 x 3 en alum en este momento.

Además de los títulos pico, los adyuvantes pueden incrementar la longevidad de las respuestas de anticuerpos. Para evaluar la posibilidad de que las diferencias entre adyuvantes fuera más clara conforme disminuyen las respuestas humorales, los ratones fueron retados con seudoviriones de HPV16 a los cuatro meses de la vacunación. Se detectó infección cutánea como una señal bioluminescente después de 3 días de la administración de seudoviriones de HPV16 que llevan un reportero de luciferasa e inyección de los ratones retados con su sustrato, luciferina. Un modo de análisis de variancia (ANOVA con comparaciones de Bonferroni) indica que la protección contra infección con HPV16 con 11-200x3 solo e inmunizaciones de control de PBS fueron significativamente diferentes (P<0.05; Figura 4). En particular, la formulación de 11-200x3 con alum + ISS1018 fue más efectiva que 11-200x3 solo (P<0.01). Las formulaciones de GPI0100 ensayadas con 11-200x3 fueron más efectivas que 11-200x3 solo (P<0.001) o 11-200x3 en combinación con alum (P<0.01). No se observó diferencia estadísticamente significativa en la protección cuando se usa alum ó solo ISS1018 con 11-200x3 en comparación con la proteína sola.

La vacunación con VLP de L1 de HPV16 solo, pero no VLP de L1 de HPV45, dio también un nivel similar de protección que la vacunación con 11-200x3 con alum + ISS1018 o GPI-0100 (P<0.001; no mostrado). Por lo tanto, buscamos comparar los títulos de anticuerpos de neutralización in vitro inducidos mediante vacunación de ratones con GARDASIL™ con aquellos inducidos mediante vacunación de ratones con cualquiera 11-200x3 o 11-88x5 en el adyuvante GPI-0100. Los títulos de neutralización in vitro generados contra HPV16 y HPV18, para los cuales están incluidos VLPs de L1 en GARDASIL™, fueron significativamente mayores en los sueros de ratones vacunados con GARDASIL™ en comparación con aquellos vacunados con cualquier constructo de L2 de tipos múltiples. Sin embargo, no se detectó anticuerpo neutralizante de HPV45 o HPV58 en los sueros de ratones vacunados con GARDASIL™ (Figura 4). En contraste, se detectaron títulos robustos de anticuerpos neutralizantes en los sueros de ratones vacunados con cualquiera 11-200x3 u 11-88x5 aun cuando ningún constructo contiene secuencias de L2 derivadas de HPV45 o HPV58.

Se han ensayado varios adyuvantes en pruebas clínicas y han mostrado que son efectivos y seguros, incluyendo alum, GPI-0100, alum y la secuencia 1018 inmunoestimuladora (un oligonucleotido CpG que activa el receptor 9 como to II). Para tratar si las vacunas poliméricas requieren un adyuvante en particular, y el grado en el cual los adyuvantes reforzaron la respuesta de anticuerpos neutralizantes generada por las vacunas poliméricas de L2 se compararon varios adyuvantes frente a frente. Así, los ratones vacunados con 2514 de L2 11-200x3 en diferentes adyuvantes o adyuvante solo. Los grupos individuales fueron: (1) alum solo (1.3 mg/ratón de hidróxido dé aluminio, Sigma A-8222), (2) CpG 1018 solo (10 pg/ratón), (3) PBS, (4) 11-200x3 solo, (5) 11-200x3 + alum (pasta al 50%), (6) 11-200x3 + CpG1018 (10 pg/ratón, Dynavax, Berkley, CA), (7) 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg/ratón, Hawaii Biotech, Maui, Hl), (8) 11-200x3 + GPI-0100 (200 pg/ratón), (9) 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg/ratón) + Tween 40 (1 mg/ratón, Sigma P-1504), (10) 11-200x3 + alum + CpG1018 (10 pg/ratón). ¦ Los sueros se obtuvieron dos semanas después de la inmunización final y se ensayaron para neutralización in vitro de HPV6, HPV16 y HPV18. Los títulos de neutralización in vitro fueron notablemente similares a través de cada grupo de adyuvantes cuando se compararon con proteína sola, lo que sugiere que la proteína polimérica de L2 sola es inmunogénica y que no se requiere adyuvante particular para una respuesta de anticuerpos neutralizantes ampliamente inmediatamente después de la vacunación.

Tabla 4. Análisis de ANOVA de grupos de adyuvantes.

PBS vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P<0.001 Alum (1.3 mg) vs 1018 solo (10 pg/ratón) P>0.05 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 solo P>0.05 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + CpG1018 (10 pg) P>0.05 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + Alum (1.3 mg) P>0.05 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + Alum + 1018 P<0.001 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 GPI (50 pg) + Tween P<0.001 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (200 pg) P<0.001 Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P<0.001 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 solo P>0.05 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 + CpG1018 (10 pg) P>0.05 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 + Alum (1.3 mg) P>0.05 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 + Alum + 1018 P<0.001 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 GPI (50 pg)+Tween P<0.001 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 +GPI-0100 (200 pg) P<0.001 1018 solo (10 pg/ratón) vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P<0.001 11-200x3 solo vs 11-200x3 + CpG1018 (10 pg) P>0.05 11-200x3 solo vs 11-200x3 + Alum (1.3 mg) P>0.05 11-200x3 solo vs 11-200x3 + Alum + 1018 P<0.001 11-200x3 solo vs 11-200x3 + GPI (50pg) + Tween P<0.001 11-200x3 solo vs 11-200x3 + GPI-0100 (200 pg) P<0.001 11-200x3 solo vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P<0.001 11-200x3 + CpGÍ018 (10pg) vs 11 -200x3+Alum (1.3 mg) P>0.05 11-200x3 + CpG1018 (10pg) vs 11-200x3 + Alum + 1018 P>0.05 11-200x3 + CpG1018 (10pg) vs 11-200x3 + GPI(50pg) + Tween P<0.01 11-200x3 + CpG1018 (10pg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (200 pg) P<0.05 11-200x3 + CpG1018 (10pg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P<0.01 1 -200x3 + Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + Alum + 1018 P>0.05 11-200x3 + Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + GPI (50 mg) + Tween P<0.001 11-200x3 + Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (200 pg) P<0.05 11-200x3 + Alum (1.3 mg) vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P>0.05 11 -200x3 + Alum + 1018 vs 11 -200x3 + GPI (50 pg) + Tween P>0.05 11 -200x3 + Alum + 1018 vs 11 -200x3 + GPI-0100 (200 pg) P>0.05 11-200x3 + Alum + 1018 vs 11-200x3 + GPI-0100 (50 pg) P>0.05 11-200x3 + GPI (50 pg) + Tween vs 11-200x3 + GPI-0100 (200pg) P>0.05 11-200x3 + GPI (50 pg) + Tween vs 11-200x3 + GPI-0100 (50pg) P>0.05 11 -200x3 + GPI-0100 (200 pg) vs 11 -200x3 + GPI-0100 (50pg) P>0.05 B. Métodos Preparación de antígeno: se generaron constructos de expresión de polipéptidos de L2 de HPV16 mediante PCR como se describió previamente (Pastrana et al, 2005). Los constructos de L2 de tipos múltiples fueron optimizados por codon para expresión de E. coli mediante cálculo de energía libre más baja y sintetizados mediante Blue Heron Inc. con sitios 5' BamHI y 3' Xhol para facilitar la clonación. Los genes L2 fueron subclonados en el vector pET28a (Novagen) y los polipéptidos recombinantes etiquetados (6His) de hexahistidina resultantes expresados en E. coli BL21 (células Rosetta, Novagen) (Pastrana et al, 2005). Los polipéptidos de L2 recombinantes fueron purificados por afinidad por aglutinación a una columna de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen) en urea 8M (usando el protocolo de purificación estándar de QiaExpressionist para condiciones desnaturalizantes) y después dializados en casetes (Pierce) contra salina amortiguada de fosfato de Dulbecco (PBS). La pureza se monitoreó mediante SDS-PAGE y se determinó la concentración de proteína mediante ensayo de ácido bicinconínico (Pierce) usando una albúmina de bovino estándar.

Ensayos inmunosorbentes vinculados con enzima (ELISAs): Placas de Immobilon (Nunc) se recubrieron durante una noche a 4°C con 100 ng/pozo de L2 de HPV16-6His preparada en E. coli o seudoviriones de L1/L2 de HPV16 producidos en células 293TT y diluidos en PBS. Los pozos se bloquearon entonces con albúmina de suero de bovino 1% (BSA)-PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, y se incubaron con diluciones de 2 veces de antisuero durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado con PBS-0.01% (v/v) Tween 20, se agregó anti-conejo IgG de cabra etiquetado con peroxidada (KPL Inc, Gaithersburg, MD) diluido 1:5,000 en BSA-PBS 1% durante 1 hora. Las placas se lavaron después otra vez y se desarrollaron con solución de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfónico (Roche) durante 10 minutos (Viscidi et al, 2005). La absorbancia se midió a 405 nm (A405) en un lector de placas de ELISA (Bio-rad, Benchmark Plus).

Ensayos de neutralización: Los ensayos de neutralización in vitro de seudovirión de virus de papiloma se realizaron como se describe antes (Pastrana et al, 2004) y se determinó la actividad de la fosfatasa alcalina secretada en el sobrenadante clarificado usando fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, St. Louis, O) disuelto en dietanolamina y la absorbancia medida a 405 nm. Los constructos y protocolos detallados para la preparación de los seudoviriones se pueden encontrar en la Internet en home.ccr.cancer.gov/lco/. Los títulos se definieron como el recíproco de la dilución más elevada que cuasó una reducción de 50% en A405, y un título <50 no fue considerado significativo.

Estudios en Animales: Se realizaron estudios de acuerdo con políticas institucionales y con la aprobación de Johns Hopkins Animal Care and Use Commitee e Institutional Animal Ethics Commitee (IAEC, Inida). Ratones Balb/c (NCI Frederick) se vacunaron en grupos de 5 animales tres veces en intervalos de dos semanas s.c. con 25 pg de antígeno (o péptidos 17-36 de L2 de HPV16 preparados mediante síntesis química (Sigma)) en los adyuvantes indicados. Se obtuvieron muestras de sangre mediante sangrados de la vena de cola dos semanas después de la inmunización final. Los conejos se vacunaron en los días 1, 28, 42, 60 y 76 con 300 pg de polipéptidos de L2 en adyuvante de Freund completo inicialmente y después adyuvante de Freund incompleto. La vacunación con 12 o 30 µg de GARDASIL™ se hizo en los días 1, 21, 35 y 56. Los conejos se desangraron una semana después del refuerzo final.

Reto con HPV Cutáneo: Se rasuró un parche de piel en el torso ventral de ratones Balb/c anestesiados con una rasuradota eléctrica, teniendo cuidado de no traumatizar el epitelio. El reto se realizó mediante aplicación de 3x109 partículas de seudoviriones (100 ng) conteniendo Piluca en 10 µ? de carboximetilcelulosa 0.6% (CMC, Sigma) a los parches de piel rasurada. Tres días después, los ratones se anestesiaron otra vez, se inyectaron con luciferina (100 µ? a 7 mg/ml) y se adquirió su imagen durante 10 minutos con un sistema de imagenología bioluminiscente I VI S 200 (Xenogen, Cranbury, NJ). Se analizaron áreas iguales que abarcan el sitio de inoculación de virus usando software Living Image 2.20 (Xenogen), y se determinó la bioluminiscencia de fondo mediante reto con L2 que carece de seudoviriones de HPV no infecciosa.

Métodos estadísticos: Se hicieron comparaciones entre grupos para títulos y niveles de infección en el modelo de ratón mediante ANOVA de un sentido con comparaciones de Boneferroni (GraphPad Prism, versión 4).

Referencias Las siguientes referencias, hasta el punto que proporcionen detalles de procedimiento u otros de ejemplo suplementarios a aqüellos expuestos en la presente, se incorporan específicamente en la presente por referencia.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de polipéptidos aislados que comprende por lo menos dos péptidos inmunogénicos homólogos de por lo menos dos aislados de un organismo infeccioso, en donde un primer péptido inmunogénico está acoplado operativamente a un segundo péptido inmunogénico homólogo de un segundo aislado de un organismo infeccioso.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde los péptidos inmunogénicos están configurados en un arreglo lineal.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde los péptidos inmunogénicos están acoplados operativamente a través de una porción vinculadora.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es una proteína de fusión.

5. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde la proteina de fusión contiene un péptido enlazador que acopla péptidos inmunogénicos.

' 6. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el organismo infeccioso es un organismo transmitido sexualmente.

7. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde el organismo transmitido sexualmente se selecciona de virus de papiloma (PV), citomegalovirus (CMV), virus de herpes, hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana (HIV/SIDA), virus de herpes asociado con sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV8), haemophilus ducreyi, granuloma inguinale, Calymmatobacterium granulomatis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Staphylococcus aureus, o Treponema pallidum.

8. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el organismo infeccioso es un virus de papiloma.

9. El polipéptido de la reivindicación 8, en donde el virus de papiloma es un miembro de un género de virus de papiloma seleccionado de virus de papiloma a, ß, ?, d, e, ?, ?, ?, ?, ?, ?, µ, ?, ?, o, o p.

10. El polipéptido de la reivindicación 8, en donde el organismo infeccioso es un virus de papiloma humano (HPV).

11. El polipéptido de la reivindicación 10, en donde el HPV es un HPV cutáneo.

12. El polipéptido de la reivindicación 10, en donde el HPV es un HPV mucosal de alto riesgo.

13. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde los péptidos inmunogénicos son un péptido inmunogénico de HPV seleccionado de uno o más de polipéptido de HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91 , HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99 o HPV100.

14. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde unos péptidos inmunogénicos se seleccionan de uno o más de polipéptido de HPV1, HPV2, HPV5, HPV6, HPV8, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 , HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 o HPV82.

15. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde unos péptidos inmunogénicos se seleccionan de uno o más de polipéptido de HPV6, HPV16, HPV18, HPV31, HPV39, HPV51, HPV56, y/o HPV73.

16. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde unos péptidos inmunogénicos se seleccionan de uno o más de polipéptido de HPV1, HPV5, HPV6, HPV16, y/o HPV18.

17. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde péptidos inmunogénicos se seleccionan de uno o más de péptido de HPV6, HPV16 o HPV18.

18. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde los péptidos inmunogénicos de HPV son segmentos de polipéptido de L2 de HPV.

19. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde los segmentos de péptido de L2 de HPV corresponden a la posición de aminoácido 13-45, 17-36, 1-88, 11-88 o 11-200 de SEQ ID NO:1.

20. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV16.

21. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV18.

22. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV6.

23. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV45.

24. El polipéptido de la reivindicación 8, que comprende por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o más péptidos inmunogénicos.

25. El polipéptido de la reivindicación 18, que comprende por lo menos tres péptidos inmunogénicos.

26. El polipéptido de la reivindicación 18, que comprende por lo menos cinco péptidos inmunogénicos.

27. El polipéptido de la reivindicación 18, que comprende por lo menos veinte péptidos inmunogénicos.

28. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV16.

29. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV18.

30. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV6.

31. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde por lo menos un péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV45.

32. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde un primer péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV16 y un segundo péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV18.

33. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde un primer péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV16 y un segundo péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV6.

34. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde un primer péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV18 y un segundo péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV6.

35. El polipéptido de la reivindicación 25, en donde un primer péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV16, un segundo péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV18 y un tercer péptido de L2 de HPV es un péptido de L2 de HPV6.

36. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde el péptido de L2 de HPV tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:71-92, y/o SEQ ID NOs:94-106 y/o SEQ ID NOs: 110-112.

37. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido de L2 de HPV comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO:107 o SEQ ID NO:108 o SEQ ID NO:109 o SEQ ID NO:113 o SEQ ID NO: 114.

38. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido de L2 de HPV comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO:107 o SEQ ID NO:108 o SEQ ID NO:109 o SEQ ID NO:113 o SEQ ID NO:114.

39. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido de L2 de HPV comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93 o SEQ ID NO:107 o SEQ ID NO:108 o SEQ ID NO:109 o SEQ ID NO:113 o SEQ ID NO: 114.

40. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido de L2 de HPV comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93 o SEQ ID NO:107 o SEQ ID NO:108 o SEQ ID NO:109 o SEQ ID NO:113 o SEQ ID NO: 114.

41. El polipéptido de la reivindicación 18, que comprende además un péptido de L2 no de HPV.

42. El polipéptido de la reivindicación 41, en donde el péptido de L2 no de HPV es un péptido de L1 de HPV o proteína de L1 de HPV.

43. El polipéptido de la reivindicación 41, en donde el péptido de L2 no de HPV es un epitope de activación de Th, una proteína portadora o un adyuvante.

44. Un paquete que comprende un polipéptido de la reivindicación 1.

45. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 1.

46. Una composición de partículas que comprende un polipéptido de la reivindicación 1.

47. La composición de partículas de la reivindicación 46, en donde la partícula es una partícula viral.

48. La partícula de la composición de la reivindicación 46, e donde la partícula es una partícula como virus.

49. La partícula de la composición de la reivindicación 46, en donde la partícula es una cápsida viral.

50. Un método de inducción de una respuesta inmune para un virus de papiloma, que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido aislado de la reivindicación 8.

51. El método de la reivindicación 50, en donde la respuesta inmune es una respuesta humoral inmune.

52. Un método para prevenir infección con virus de papiloma, que comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de la reivindicación 8.

53. Un paquete de una composición de tipo múltiple de la reivindicación 1.

54. Un paquete que comprende un anticuerpo que aglutina una composición de la reivindicación 1.