BRPI0816478B1 - Processos de fermentação para a produção de uma mistura de celulases e de hidrólise de um substrato de celulose e uso de mistura de celulases em processo de fermentação - Google Patents
Processos de fermentação para a produção de uma mistura de celulases e de hidrólise de um substrato de celulose e uso de mistura de celulases em processo de fermentação Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0816478B1 BRPI0816478B1 BRPI0816478-9A BRPI0816478A BRPI0816478B1 BR PI0816478 B1 BRPI0816478 B1 BR PI0816478B1 BR PI0816478 A BRPI0816478 A BR PI0816478A BR PI0816478 B1 BRPI0816478 B1 BR PI0816478B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- fermentation process
- cellulose
- cellulases
- cellulase
- fact
- Prior art date
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims description 127
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims description 127
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 63
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 title claims description 58
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 title claims description 58
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 31
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims description 18
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims description 18
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 121
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 85
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 79
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 67
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 67
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 50
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 claims description 49
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 37
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 34
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 34
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 claims description 28
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 28
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 claims description 25
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 15
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- -1 xylobiosis Chemical compound 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 25
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 12
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 11
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 6
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 6
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 6
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 4
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 150000004823 xylans Chemical group 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 3
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 2
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 2
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108050007200 Alpha-L-arabinofuranosidases Proteins 0.000 description 1
- 101100509468 Arabidopsis thaliana JASON gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N Carbendazim Natural products C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000000214 D-xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000228138 Emericella Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- 101100429194 Hypocrea jecorina (strain QM6a) xyn2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 101100161696 Myxine glutinosa ache gene Proteins 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 101100329389 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cre-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001502335 Orpinomyces Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 241000035977 Phaner Species 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000355691 Trichoderma reesei QM9414 Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 108010093941 acetylxylan esterase Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 101150100570 bglA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- JNPZQRQPIHJYNM-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=C[CH]C2=NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 JNPZQRQPIHJYNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006013 carbendazim Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 108010080434 cephalosporin-C deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 108010038658 exo-1,4-beta-D-xylosidase Proteins 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 description 1
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N ferulic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 101150100654 pacC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N trans-isoferulic acid Natural products COC1=CC=C(C=CC(O)=O)C=C1O QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(54) Título: PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE UMA MISTURA DE CELULASES E DE HIDRÓLISE DE UM SUBSTRATO DE CELULOSE E USO DE MISTURA DE CELULASES EM PROCESSO DE FERMENTAÇÃO (51) Int.CI.: C12N 9/42; C12P 1/02; C12P 19/00; C12P 19/02; C12P 19/04; C12P 21/00 (30) Prioridade Unionista: 30/08/2007 US 60/969,025 (73) Titular(es): IOGEN ENERGY CORPORATION (72) Inventor(es): JASON B. EDWARDS; BRIAN E. FOODY; GLENN D. MUNKVOLD
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE UMA MISTURA DE CELULASES E DE HIDRÓLISE DE UM SUBSTRATO DE CELULOSE E USO DE MISTURA DE CELULASES EM PROCESSO DE FERMENTAÇÃO.
PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS
Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade de um pedido de patente provisório intitulado PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE CELULASES FÚNGICAS (METHOD FOR FUNGAL CELLULASE PRODUCTION), Pedido de Patente N° 60/969.025, depositado em 30 de agosto de 2007, cujo todo conteúdo é incorporado aqui como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo de fermentação para a produção de celulases partindo de uma célula hospedeira fúngica. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
A celulose e a hemicelulose constituem uma fonte de carbono renovável e barata importante para a produção de açúcares fermentáveis. A celulose consiste em unidades de D-glicose ligadas juntas em cadeias lineares através de ligações glicosídicas β-1,4. A hemicelulose consiste primariamente em uma estrutura básica de xilana linear que compreende unidades de D-xilose ligadas juntas através de ligações glicosídicas β-1,4 e várias cadeias laterais ligadas às unidades de xilose através de ligações glicosídicas β-1,2 ou β-1,3 ou de éster (por exemplo, L-arabinose, ácido acético, ácido ferúlico etc).
Trichoderma reesei (o anamorfo assexuado de Hypocrea jecorína) é um fungo filamentoso capaz de produzir uma mistura de celulases que compreende uma variedade de celulases e hemicelulases. Estas incluem duas celobiohidrolases, oito endoglucanases, quatro xilanases, duas α-L-arabinofuranosidases e uma beta-mananase. T. reesei produz ainda um número de enzimas acessórias que auxiliam na produção de monossacarídeos partindo da celulose e da hemicelulose, incluindo acetil xilana esterase, beta-xilosidase e várias beta-glucosidases.
A regulação da produção de celulases e hemicelulases por T. reesei é complexa e controlada primariamente no nível transcricional em resposta às fontes de carbono disponíveis. A glicose reprime a expressão gênica de celulases através da ação de reguladores transcricionais tais como cre1 (Strauss, J. e outros, 1995, FEBS Letters 376: 103-107) e ace1 (Aro, N. e outros, 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 56-65). Sob condições limitantes de glicose, a transcrição de celulases deixa de ser reprimida, com a ativação total da transcrição necessitando a presença de um carboidrato indutor, tal como celulose ou dissacarídeos β-ligados tais como celobiose, soforose, gentiobiose e lactose (llmen, M. e outros, 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Os carboidratos indutores de celulases (CIC) também levam à ativação da transcrição de hemicelulases (Mach, R.L. e Zeilinger, S., 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 515-522; Margolles-Clark e outros, 1997, J. Biotechnol 57: 167-179). Foi mostrado que o produto do gene xyr1 participa da ativação da transcrição de genes tanto de hemicelulases quanto de celulases pela xilose (Strieker, A.R. e outros, 2006, Eukaryotic Cell 5: 2128-2137).
Embora T. reesei produza baixos níveis de atividade de xilanase sob condições que induzem celulases, o sistema enzimático produzido pelas culturas de T. reesei que crescem em xilose ou outros carboidratos derivados da hemicelulose é enriquecido em atividades de hemicelulases em relação a atividades de celulases. A produção de xilanase secretada é aumentada por xilana (Bailey, M.J. e outros, 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 224-229) e arabinose (Xiong e outros, 2004, Appl. Microbiol. Biotech 64: 353-358). A transcrição de genes de hemicelulases é ativada pela hemicelulose ou por seus produtos de decomposição bem como pela celulose. Em Trichoderma reesei, a transcrição dos genes que codificam as xilanases 1 e 2 (xln1 e xln2) é ativada por celulose, soforose, xilana e arabinitol e a transcrição do gene de arabinofuranosidase gene abfl é ativada por arabinose, arabinitol e xilana (Margolles-Clark e outros, 1997, J. Biotechnol. 57: 167179). Entretanto, como um resultado da maior expressão de xilanase, a proporção relativa de celulase na composição enzimática secretada é reduzida. Isto resulta em uma atividade específica menor da celulase e, como uma consequência, dosagens maiores de proteína total são necessárias para a hidrólise eficiente de substratos celulósicos.
O fornecimento de quantidades equimolares de celobiose e xilobiose resulta em níveis similares de atividade de xilanase em culturas em batelada em frascos de agitação da cepa de T. reesei QM9414 (Zeilinger, S. e outros, 1996, J. Biol. Chem. 271: 25624-25629). As atividades de celulases produzidas pelas duas culturas não foram relatadas. A proporção relativa de xilanase secretada pela cepa de T. reesei RutC30 em culturas em batelada alimentada foi aumentada de 0,8% para 3,5% pela alteração da fonte de carbono de 100% de lactose para 75% de lactose/25% de xilose (Margeot, A. e outros, 2007, apresentação de pôster na Physiology of Yeast and Filamentous Fungi, Espoo, Finlândia). Ao mesmo tempo, a proporção combinada dos quatro componentes de celulases principais (celobiohidrolases 1 e 2, endoglucanases 1 e 2) foi reduzida de 82% para 62%. A proporção de outras hemicelulases e celulases não foi relatada. Foi relatado que as culturas em batelada em frascos de agitação da cepa de T. reesei RutC30, utilizando hidrolisados de pó de serragem, produziam níveis similares de atividade de celulases secretadas (em termos de unidades de papel de filtro por mL de cultura) como hidrolisados de celulose (Lo, C-H. e outros, 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. Spring (121-124): 561-573). Os hidrolisados de pó de serragem foram produzidos através de tratamento com ácido sulfúrico concentrado e consistiam em 25-40% de carboidratos derivados de hemicelulose, 5 a 9% de carboidratos indutores de celulases, 13 a 45% de glicose e 2 a 45% de oligossacarídeos. Entretanto, como não é fornecida qualquer informação em relação ao efeito dos hidrolisados de pó de serragem sobre a atividade de hemicelulases ou de proteína secretada total, o impacto dos hidrolisados de pó de serragem sobre as proporções relativas de celulase e hemicelulase na proteína secretada não podia ser estimado.
A proporção relativa de hemicelulases também pode ser manipulada através do ajuste do pH do meio de cultura de fermentação (Bailey, MJ. e outros, 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 224-229); a proporção da atividade de xilanase em relação à atividade de celulases é aumentada em pH 6-7. A transcrição de genes de xilanases em Aspergillus está sujeita à regulação pelo regulador da transcrição pacC dependente do pH (Maccabe,
A.P. e outros, 1998, J. Bacteriol. 180:1331-1333).
Há situações em que é desejável produzir misturas de celulases com uma alta proporção de celulases partindo de culturas de fungos utilizando fontes de carboidratos que compreendem principalmente xilose e outros açúcares de pentose derivados da hemicelulose, tais como os produzidos por tratamentos químicos de biomassa de lignocelulose. Os métodos para o pré-tratamento de biomassa de lignocelulose que contém hemicelulose são descritos nas Patentes U.S. 4.461.648, 5.916.780, 6.090.595, 6.043.392 e 4.600,590; em Weil e outros, 1997, Appl. Biochem. Biotechnol. 681: 21-40; e em Õhgren, K. e outros, 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. Spring (121-124): 1055-1067 (que são incorporados aqui como referência). SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo de fermentação para a produção de celulases partindo de uma célula hospedeira fúngica.
É o objetivo da presente invenção fornecer um método melhorado para a produção de celulase.
A presente invenção fornece um processo de fermentação para a produção de misturas de celulases com uma alta proporção de celulase em relação à hemicelulase, que compreende o cultivo de uma célula hospedeira capaz de produzir celulases sob condições que levam à produção de hemicelulases.
O processo de produção de celulase incorpora o uso de uma mistura enzimática fúngica proveniente de uma espécie de Trichoderma ou de Hypocrea com uma alta proporção de celulase:hemicelulase em fermentações líquidas submersas em alta produtividade, em que mais de 40% da fonte de carbono para o dito processo é de carboidratos derivados de hemicelulose e mais que 3%, mas menos que 20% da fonte de carbono é de carboidratos indutores de celulases.
A presente invenção fornece um processo de fermentação para a produção de uma mistura de celulases que compreende uma célula hospedeira que secreta celulases do gênero Trichoderma ou Hypocrea com uma fonte de carbono para produção de enzimas celulases, a fonte de car5 bono que compreende entre aproximadamente 40 por cento em peso e aproximadamente 97 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono é um carboidrato derivado de hemicelulose e entre aproximadamente 3 por cento em peso e aproximadamente 20 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono é um carboidrato indutor de celulases, durante aproximadamente 3 até aproximadamente 30 dias, a uma temperatura de aproximadamente 20°C até aproximadamente 35°C, em um pH de aproximadamente 3,0 até aproximadamente 6,5 e obtendo a mistura de celulose.
A presente invenção inclui o processo de fermentação descrito anteriormente, em que entre aproximadamente 80 por cento em peso e aproximadamente 97 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono é o carboidrato derivado de hemicelulose e em que entre aproximadamente 8 por cento em peso e aproximadamente 15 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono é o carboidrato indutor de celulases. Além disso, a mistura de celulases compreende celulases e hemicelulases em uma proporção de pelo menos 2:1 ou de pelo menos 3:1. A fonte de carbono utilizada no processo de fermentação que é descrito anteriormente pode compreender ainda uma ou mais fontes de carbono adicionais. A uma ou mais fontes de carbono adicionais podem ser glicerol ou um ácido orgânico. Além disso, o processo de fermentação pode ser em batelada, em batelada alimentada ou contínuo.
A presente invenção fornece o processo de fermentação que é definido anteriormente, em que a célula hospedeira é uma cepa de Trichoderma reesei.
A presente invenção fornece ainda o processo de fermentação que é descrito anteriormente, em que o processo produz pelo menos 2 vezes mais celulase secretada quando comparada à quantidade de celulase secretada produzida em um processo em que a fonte de carbono consiste em carboidratos derivados de hemicelulose. O processo também pode ser caracterizado por possuir um aumento de pelo menos 3 vezes na produtividade específica (qp) quando comparada à qp de um processo em que a fonte de carbono consiste em carboidratos derivados de hemicelulose. Além disso, o processo pode ser caracterizado por possuir um aumento de pelo menos 5 vezes na produtividade específica (qp) quando comparada à qp de um processo em que a fonte de carbono consiste em carboidratos derivados de hemicelulose.
A presente invenção também está direcionada a um uso da mistura de celulases produzida através do processo de fermentação que é descrito anteriormente para a hidrólise de um substrato de celulose. O substrato de celulose pode ser um substrato de lignocelulose pré-tratado.
A presente invenção fornece ainda um método de hidrólise de um substrato de celulose que compreende;
a adição da mistura de celulases produzida pelo processo de fermentação da reivindicação 1 a um substrato de celulose para produzir uma mistura de reação, em que a concentração do substrato de celulose é de aproximadamente 1 g/L até aproximadamente 200 g/L e a mistura de celulases é adicionada em uma concentração de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 100 mg de proteína por g de celulose; e a incubação da mistura de reação durante um período de tempo de aproximadamente 4 horas até aproximadamente 120 horas, a uma temperatura de aproximadamente 30°C até aproximadamente 60°C e em um pH de aproximadamente 3,5 até aproximadamente 7,0 para hidrolisar a celulose e produzir produtos de reação.
A presente invenção, em parte, se baseia na descoberta surpreendente de que fontes de carboidratos que contêm carboidratos derivados de hemicelulose (HDC) e carboidratos indutores de celulases (CIC) podem ser utilizadas em um processo de fermentação para produzir misturas de celulases fúngicas com uma alta proporção de celulase e uma baixa proporção correspondente de hemicelulase. A produtividade do processo de fermentação é significativamente maior que a do mesmo processo utilizando apenas carboidrato derivado de hemicelulose.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Estas e outras características da invenção se tornarão mais evi7 dentes partindo da descrição a seguir em que é feita referência às figuras em anexo em que:
a FIGURA 1 exibe uma análise de eletroforese em gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) das misturas de celulases produzidas e secretadas pelas cepas de T. reesei RutC30 (A) e P59G (B) em fermentações em batelada alimentada de 14 L em que o carboidrato alimentado à fermentação consistia em 0 a 15% de carboidrato indutor de celulases (celobiose para RutC30 ou um coquetel de CIC para P59G) e 85 a 100% de xilose.
a FIGURA 2 exibe uma análise de eletroforese em gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE) das misturas de celulases produzidas e secretadas pela cepa de T. reesei P59G em fermentações em batelada alimentada de 14 L em que o carboidrato alimentado à fermentação consistia em 0%, 2% ou 10% de carboidrato indutor de celulases e 100%, 98% ou 90% de arabinose.
a FIGURA 3 mostra a quantidade de biomassa produzida pela cepa de T. reesei P59G em fermentações em batelada alimentada de 14 L em que o carboidrato alimentado à fermentação consistia em (A) 0 a 15% de coquetel de CIC mais 85 a 100% de xilose como mostrado ou (B) 0 a 10% de celobiose mais 90 a 100% de arabinose. Cada barra mostra a média e o desvio-padrão de três fermentações independentes.
a FIGURA 4 mostra a quantidade de proteína secretada produzida pela cepa de T. reesei P59G em fermentações em batelada alimentada de 14 L em que o carboidrato alimentado à fermentação consistia em (A) ΟΙ 5% de coquetel de CIC mais 85-100% de xilose como mostrado ou (B) 010% de celobiose mais 90-100% de arabinose. Cada barra mostra a média e o desvio-padrão de três fermentações independentes.
A FIGURA 5 mostra a produtividade específica média (qp) em mg de proteína secretada/g de biomassa/h da cepa de T. reesei P59G em fermentações em batelada alimentada de 14 L em que o carboidrato alimentado à fermentação consistia em (A) 0 a 15% de coquetel de CIC mais 85 a 100% de xilose como mostrado ou (B) 0 a 10% de celobiose mais 90 a 100% de arabinose. Cada barra mostra a média e o desvio-padrão de três fermen8 tações independentes.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES PREFERIDAS
A presente invenção refere-se a um processo de fermentação para a produção de celulases partindo de uma célula hospedeira fúngica.
A descrição a seguir é de uma modalidade preferida somente com a finalidade de exemplo e sem limitação à combinação de características necessárias para a realização da invenção eficazmente.
A presente invenção fornece uma produção de celulase partindo da fermentação de células de fungo, preferencialmente em fermentações em culturas líquidas submersas.
Processo de Produção de Misturas de Celulases
As misturas de celulases podem ser produzidas através da submissão de uma cultura de fungo que cresce ativamente a meios (sólidos ou líquidos) que contêm pouca ou nenhuma glicose e um carboidrato indutor de celulases (CIC), bem como outros nutrientes necessários para o crescimento celular, a temperaturas e pH adequados para a célula hospedeira. Como descrito aqui, pode ser utilizado qualquer processo conhecido para a produção de celulase em que o indutor, tal como tal como celulose pura, é substituído por uma fonte de carboidratos que compreende carboidratos derivados de hemicelulose (HDC) e carboidratos indutores de celulases (CIC), preferencialmente de aproximadamente 40% até aproximadamente 97% de HDC ou qualquer quantidade intermediária e de aproximadamente 3% até aproximadamente 20% de CIC ou qualquer quantidade intermediária. Por exemplo, a fonte de carboidrato pode conter aproximadamente 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97% de HDC ou qualquer quantidade intermediária e aproximadamente 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20% de CIC ou qualquer quantidade intermediária.
As fermentações líquidas submersas de Trichoderma e fungos filamentosos relacionados são tipicamente conduzidas na forma de um processo em batelada, em batelada alimentada ou contínuo. Em um processo em batelada, todos os materiais necessários, com a exceção de oxigênio para processos aeróbios, são colocados em um reator no início da operação e é permitido que a fermentação continue até ser completada, em cujo ponto o produto é coletado. Em um processo em batelada alimentada, a cultura é alimentada continuamente ou sequencialmente com um ou mais componentes do meio com a remoção de um fluido de cultura. Em um processo contínuo, o meio fresco é fornecido e o fluido de cultura é removido continuamente em taxas volumetricamente equivalentes para manter a cultura em uma taxa de crescimento uniforme.
O processo da presente invenção pode ser realizado na forma de um processo em batelada, em batelada alimentada, em batelada alimentada repetida, contínuo ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, o processo pode ser um processo em batelada alimentada.
O processo da presente invenção pode ser realizado a uma temperatura de aproximadamente 20°C até aproximadamente 35°C ou qualquer temperatura intermediária, por exemplo, de aproximadamente 25°C até aproximadamente 30°C ou qualquer temperatura intermediária ou 20, 22, 25, 26, 27,28, 29, 30, 32, 35°C ou qualquer temperatura intermediária.
O processo da presente invenção pode ser realizado em um pH de aproximadamente 3,0 até 6,5 ou qualquer pH intermediário, por exemplo, pH de aproximadamente 3,5 até pH 5,5 ou qualquer pH intermediário, por exemplo, pH de aproximadamente 3,0, 3,2, 3,4, 3,5, 3,7, 3,8, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,2, 5,4, 5,5, 5,7, 5,8, 6,0, 6,2, 6,5 ou qualquer pH intermediário.
O processo da presente invenção pode ser realizado ao longo de um período de 3-30 dias ou qualquer período intermediário, por exemplo, entre 3 e 10 dias ou qualquer período intermediário, entre 4 e 8 dias ou qualquer período intermediário ou de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 dias ou qualquer período intermediário.
O processo da presente invenção pode ser realizado em culturas de pelo menos 1 litro, por exemplo, de aproximadamente 1 até aproximadamente 400.000 litros ou qualquer quantidade intermediária, por exemplo, 10 até aproximadamente 400.000 litros ou qualquer quantidade intermediária, 1.000 até aproximadamente 200.000 litros ou qualquer quantidade interme10 diária ou 10.000 até aproximadamente 200.000 litros ou qualquer quantidade intermediária ou de aproximadamente 1, 10, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, 100.000, 150.000, 200.000, 300.000,
400.000 litros em volume ou qualquer quantidade intermediária.
O processo da presente invenção pode ser realizado de forma aeróbia, na presença de oxigênio ou de forma anaeróbia, na ausência de oxigênio. Por exemplo, o processo pode ser realizado de forma aeróbia.
O processo de fermentação da presente invenção pode produzir pelo menos 2,5 vezes, mais preferencialmente 3 vezes, mais proteína secretada que um processo correspondente em que a fonte de carbono contém apenas HDC e é realizado utilizando uma cepa de fungo que não foi modificada ou selecionada para maior ativação de produção de celulases por HDC. Por exemplo, o processo descrito aqui pode produzir 2,5 até aproximadamente 10 vezes mais ou qualquer quantidade intermediária, por exemplo, aproximadamente 2,5, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8,
9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, 10 vezes mais proteína secretada ou qualquer quantidade intermediária ou mais de 10 vezes mais proteína secretada, que um processo correspondente em que a fonte de carbono contém apenas HDC e é realizado utilizando uma cepa de fungo que não foi modificada ou selecionada para maior ativação de produção de celulases por HDC. Assim, o processo de fermentação pode ser caracterizado por possuir um aumento de pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente de 5 vezes ou qualquer quantidade intermediária, na produtividade específica (qp) em termos de mg de celulase produzida secretada/g de biomassa/h que um processo correspondente em que a fonte de carbono contém apenas HDC e é realizado utilizando uma cepa de fungo que não foi modificada ou selecionada para maior ativação de produção de celulases por HDC. Um aumento na produtividade específica de produção de proteína na presença de quantidades variáveis de HDC, CIC ou tanto de HDC quanto de CIC como descrito aqui, é mostrado na Tabela 1.
Tabela 1: Produção de proteína e células de fungo partindo de culturas líquidas submersas de cepas de T. reesei crescidas em HDC mais 0-20% de CIC
| em fermentações em bal | .elada alimentada de 14 L. | ||||
| Cepa | HDC (%) | % de CIC | Proteína Final (g/L)c | Células Finais (g/L)c | qp (mg de proteína/g de células/h) |
| P59G | Xilose (100) | 0 | 8 | 41 | 2 |
| Xilose (97) | 3a | 25 | 35 | 14 | |
| Xilose (92) | 8a | 32 | 32 | 19 | |
| Xilose (85) | 15a | 32 | 25 | 24 | |
| Arabinose (100) | 0b | 5 | 30 | 3,5 | |
| Arabinose (98) | 2b | 25 | 27 | 7 | |
| Arabinose (90) | 10b | 0,66 | 13 | 14 | |
| RutC30 | Xilose (100) | ob | 3,6 | 6,9 | 4 |
| Xilose (92) | 8b | 8 | 41 | 23 |
aCIC para estas fermentações era um coquetel de indução com5 preendendo, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, 14% de soforose, 6% de celobiose, 10% de trealose, 6% de maltotriose, 4% de glicose e 14% de outros carboidratos bCIC para estas fermentações era celobiose.
cPara a cepa P59G, os valores relatados são os resultados mé10 dios de três (xilose) ou duas (arabinose) fermentações repetidas; para a cepa RutC30, os valores relatados são os resultados de fermentações isoladas.
Meios de Fermentação
Em modalidades da presente invenção, as células de fungo são fornecidas com pelo menos duas fontes de carbono durante o processo de fermentação: um carboidrato derivado de hemicelulose (HDC) e um carboidrato indutor de celulases (CIC).
Como utilizado aqui, o termo carboidrato derivado de hemicelulose ou HDC refere-se a um ou mais oligo, di ou monossacarídeo que é deri20 vado de hemicelulose e pode ser utilizado pelo micro-organismo hospedeiro para crescimento, produção de enzimas ou ambos. Os exemplos não limitantes de HDC incluem xilo-oligossacarídeos, arabinoxilo-oligossacarídeos,
D-xilose, xilobiose, L-arabinose, D-manose e D-galactose. Preferencialmente, o HDC contém D-xilose e/ou L-arabinose. O carbono derivado do HDC representa de aproximadamente 40% até aproximadamente 97% do carbono total alimentado às células de fungo durante o processo de fermentação. Por exemplo, o carbono derivado do HDC pode representar 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou qualquer quantidade intermediária, do carbono total alimentado às células de fungo durante o processo de fermentação. Por exemplo, o carbono derivado do HDC pode representar de aproximadamente 80% até aproximadamente 97% do carbono total alimentado às células de fungo durante o processo de fermentação.
Como utilizado aqui, o termo carboidrato indutor de celulases ou CIC refere-se a um ou mais oligo, di ou monossacarídeo que leva à indução de produção de celulases pela célula hospedeira. Preferencialmente, o CIC é um ou mais de celobiose, soforose ou gentiobiose. O CIC pode ser produzido através da hidrólise enzimática de celulose com uma ou mais enzimas celulases para produzir principalmente dímeros de glicose beta-ligados. Alternativamente, um xarope com alta concentração de glicose pode ser condensado para formar misturas de dímeros de glicose. A reação de condensação para produzir glicose pode ser catalisada por ácido diluído e realizada a temperaturas acima de 120 a 150°C ou por enzimas beta-glucosidase ou celulase a temperaturas mais moderadas de aproximadamente 40 a 70°C (Publicação de Patente N° U.S. US2004/0121446A1). A prática da presente invenção não é limitada pelo método utilizado para produzir o CIC.
Preferencialmente, o carbono derivado do CIC representa de aproximadamente 3% até aproximadamente 20% ou qualquer quantidade intermediária, do carbono total alimentado às células de fungo durante o processo de fermentação. Por exemplo, o carbono derivado do CIC pode representar 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% ou qualquer quantidade intermediária, do carbono total alimentado às células de fungo durante o processo de fermentação. Por exemplo, o carbono derivado do CIC representa de aproximadamente 8% até aproximadamente 15% ou qualquer quantidade interme13 diária, do carbono total alimentado às células de fungo durante o processo de fermentação.
Em adição ao HDC e ao CIC, de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 20% ou qualquer quantidade intermediária, do carbono total fornecido à célula hospedeira durante o processo de fermentação pode compreender um ou mais de glicose, glicerol, ácido orgânicos ou outras fontes de carbono que podem ser utilizadas pela célula hospedeira. Por exemplo, de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12,0, 14,0, 16,0, 18,0, 20% ou qualquer quantidade intermediária, do carbono total fornecido à célula hospedeira durante o processo de fermentação pode compreender um ou mais de glicose, glicerol, ácido orgânicos ou outras fontes de carbono que podem ser utilizadas pela célula hospedeira.
No caso de fermentação em batelada, a fonte de carbono pode ser adicionada ao meio de fermentação antes ou simultaneamente à inoculação. Nos casos de operações em batelada alimentada ou contínuas, a fonte de carbono também pode ser fornecida continuamente ou intermitentemente durante o processo de fermentação. Preferencialmente, a taxa de alimentação está entre 0,2 e 2,5 g de carbono/L de cultura/h ou qualquer quantidade intermediária. Mais preferencialmente, a taxa de alimentação está entre 0,4 e 1,6 g de carbono/L de cultura/h ou qualquer quantidade intermediária.
Um versado na técnica está a par que outros nutrientes, vitaminas e minerais podem ser adicionados aos meios de fermentação para aumentar o crescimento e a produção de enzimas da célula hospedeira. Estes outros componentes do meio podem ser adicionados antes, simultaneamente ou após a inoculação da cultura com a célula hospedeira. Fontes de nitrogênio orgânico tais como aminoácidos e peptídeos são algumas vezes utilizadas como fontes de carbono; entretanto, estas fontes de nitrogênio orgânico não estão incluídas no cálculo do carbono total fornecido à célula hospedeira durante o processo de fermentação.
Após a fermentação, o caldo de fermentação contendo a enzima celulase pode ser utilizado diretamente ou a enzima celulase pode ser separada das células de fungo, por exemplo, através de filtração ou de centrifugação. Solutos de baixo peso molecular tais como componentes não consumidos do meio de fermentação podem ser removidos através de ultrafiltração. A enzima celulase pode ser concentrada, por exemplo, através de evaporação, precipitação, sedimentação ou filtração. Reagentes químicos tais como glicerol, sacarose, sorbitol e similares podem ser adicionados para estabilizar a enzima celulase. Outros reagentes químicos, tal como benzoato de sódio ou sorbato de potássio, podem ser adicionados à enzima celulase para prevenir o crescimento contínuo de micro-organismos.
Células de Fungo para Produção de Celulases
A célula de fungo para o processo pode ser de qualquer fungo filamentoso pertencente à família Acomycotina ou Basidiomycotina, tal como espécies de Trichoderma, Hypocrea, Aspergillus, Humicola, Neurospora, Orpinomyces, Gibberella, Emericella, Chaetomium, Fusaríum, Penicillium, Magnaporthe ou Phanerochaete. Preferencialmente, a célula hospedeira é uma espécie de Trichoderma ou Hypocrea. Mais preferencialmente, a célula hospedeira é uma cepa de Trichoderma reesei.
A célula de fungo pode ser modificada de forma a aumentar ou reduzir a produção e a secreção de uma ou mais proteínas homólogas ou heterólogas. Por exemplo, a célula de fungo pode ser modificada com uma ou mais construções genéticas que compreendem um gene que codifica uma enzima celulase ligado de forma operacional a um promotor que pode ser induzido por HDC e/ou CIC. Por exemplo, a célula de fungo pode ser modificada de forma a superexpressar uma enzima beta-glucosidase de acordo com a Patente U.S. N° 6.015.703. A célula hospedeira também pode ser modificada de forma a produzir uma mistura otimizada de componentes de celulase e componentes acessórios de acordo com as Publicações de Patentes U.S. co-pendentes 2008/0057541 A1 e 2009/0061484 A1. Os métodos para preparar construções genéticas que compreendem promotores que podem ser induzidos por CIC ou HDC ligados de forma operacional a um gene de celulase e os métodos para modificar geneticamente cepas de fungos inclu15 em os conhecidos pelos versados na técnica, incluindo, mas não limitados ao tratamento de células com CaCI2, eletroporação, bombardeio biolístico, fusão de protoplastos mediada por PEG (Patente U.S. N° 6.015.703 e 6.939.704).
Misturas de Celulases
Como utilizado aqui, uma mistura de celulases e a mistura de celulases, hemicelulases e outra proteína secretada pela célula de fungo durante o processo de fermentação. A mistura de celulases produzida utilizando o processo de fermentação da presente invenção contém preferencialmente uma proporção de componentes de celulase:hemicelulase aproximadamente maior que aproximadamente 2:1 (Tabela 2). Mais preferencialmente, a proporção de celulase:hemicelulase é de pelo menos aproximadamente 3:1. De forma mais preferível, a proporção de celulase:hemicelulase é de pelo menos aproximadamente 4:1. Por exemplo, a proporção de hemicelulase:celulase pode ser de aproximadamente 2:1, 2,5:1, 3:1, 3,5:1 ou 4:1 ou qualquer proporção intermediária.
Tabela 2: composição de enzima secretada de culturas de T. reesei crescidas em culturas líquidas submersas em HDC e CIC em fermentação em batelada alimentada de 14 L.
| Cepa | HDC (%) | % de CIC | Proporção de Celula- se:Hemicelulase* |
| P59G** | Controle de Glicose (85) | 15 | 20:1 |
| Xilose (100) | 0 | -1:1 | |
| Xilose (97) | 3a | 2:1 | |
| Xilose (92) | 8a | 2:1 | |
| Xilose (85) | 15a | 3:1 | |
| Arabinose (100) | 0b | 0.8:1 | |
| Arabinose (98) | 2b | 1,5:1 | |
| Arabinose (90) | TÕ6 | 2,4:1 | |
| RutC30 | Xilose (100) | 0b | 2:1 |
| Xilose (92) | 8b | 3:1 |
‘Determinada por densitometria de varredura da análise de SDS-PAGE das proteínas secretadas no caldo de fermentação sob cada condição que é descrita no Exemplo 4.
**Atividade relativa de hidrólise em um substrato de lignocelulose pré-tratado que é descrito no Exemplo 4.
aCIC para estas fermentações era um coquetel de indução com5 preendendo, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose de 6%, glicose a 4% e outros carboidratos a 14%.
bCIC para estas fermentações era celobiose.
Hidrólise de Substratos de Celulose
As enzimas celulases secretadas produzidas utilizando o processo de fermentação da presente invenção são úteis para a hidrólise de um substrato de celulose. Pelo termo substrato de celulose, entende-se qualquer substrato derivado de biomassa vegetal e que compreende celulose, incluindo, mas não limitado a matérias-primas de lignocelulose pré-tratadas para a produção de etanol ou outros produtos de alto valor, produtos alimentícios para animais, produtos de rejeitos florestais, tais como polpa e aparas de madeira e produtos têxteis. A atividade de enzimas de celulose secretadas em lignocelulose pré-tratada e papel de filtro é apresentada na tabela 3. Tabela 3: atividade de misturas de celulases de culturas de T. reesei cresci20 das em culturas líquidas submersas em HDC e CIC em fermentação em batelada alimentada de 14 L.
| Cepa | HDC (%) | % de CIC | Atividade relativa em lignocelulose pré-tratada** | Atividade relativa em papel de filtro** |
| P59G** | Controle de Glicose (85) | 15 | 1,0 | n.d. |
| Xilose (100) | 0 | n.d. | 0,11 | |
| Xilose (92) | 8a | 0,58 | 0,41 | |
| Xilose (85) | 15a | 0,62 | n.d. | |
| Arabinose (100) | 0b | n.d. | 0,05 | |
| Arabinose (98) | 2b | 0,31 | n.d. | |
| Arabinose (90) | 10b | 0,84 | 0,66 | |
| RutC30 | Xilose (100) | 0u | n.d. | <0,05 |
| Xilose (92) | 8b | n.d | 0.38 |
*Determinada por densitometria de varredura da análise de SDS-PAGE das proteínas secretadas no caldo de fermentação sob cada condição que é descrita no Exemplo 4.
**Atividade relativa de hidrólise em um substrato de lignocelulose pré-tratado que é descrito no Exemplo 4; n.d.=não determinada aCIC para estas fermentações era um coquetel de indução compreendendo, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e de outros carboidratos 14%.
bCIC para estas fermentações era celobiose.
A enzima celulase produzida pelo processo de fermentação da presente invenção pode ser utilizada para a hidrólise enzimática de uma matéria-prima de lignocelulose pré-tratada. Uma matéria-prima de lignocelulose pré-tratada é um material de origem vegetal que, antes do prétratamento, contém pelo menos 20% de celulose (peso seco), mais preferencialmente mais que aproximadamente 30% de celulose, ainda mais preferencialmente mais que 40% de celulose e pelo menos 10% de lignina (peso seco), mais tipicamente pelo menos 12% (peso seco) e que foi submetido a processos físicos e/ou químicos para tornar a fibra mais acessível e/ou receptiva às ações de enzimas celulolíticas. Os exemplos não limitantes de processos de pré-tratamento incluem o tratamento químico de uma matériaprima de lignocelulose com ácido sulfúrico ou sulfuroso ou outros ácidos; amônia, cal, hidróxido de amônio ou outro álcali; etanol, butanol ou outros solventes orgânicos; ou água pressurizada (Ver as Patentes U.S. N/j 4.461.648, 5.916.780, 6.090.595, 6.043.392 e 4.600.590, Weil e outros, 1997, Appl. Biochem. Biotechnol. 681: 21-40 e Õhgren, K. e outros, 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. Spring (121-124): 1055-1067; que são incorporados aqui como referência).
Por exemplo, o substrato de celulose, pode ser incubado com a enzima celulase produzida utilizando os métodos descritos aqui, em uma concentração de aproximadamente 1 até aproximadamente 200 g de celulose por litro de mistura de reação ou qualquer quantidade intermediária, por e18 xemplo, de aproximadamente 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 ou qualquer quantidade intermediária e com uma dosagem de celulase de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 100 mg de proteína por g de celulose ou qualquer quantidade intermediária, por exemplo, de aproximadamente 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg de proteína/g de celulose ou qualquer quantidade intermediária. A mistura de reação pode ser incubada durante aproximadamente 4 horas até aproximadamente 120 horas ou qualquer período de tempo intermediário, a uma temperatura de aproximadamente 30° até aproximadamente 60°C ou qualquer temperatura intermediária, por exemplo, de aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60°C ou qualquer temperatura intermediária e em um pH de aproximadamente 3,5 até aproximadamente 7,0 ou qualquer pH intermediário, por exemplo, desde o pH de aproximadamente 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 ou qualquer pH intermediário. Após a incubação, os produtos de reação, incluindo carboidratos derivados de hemicelulose, carboidratos indutores de celulases, glicose, oligossacarídeos podem ser utilizados para o processamento adicional, por exemplo, como um substrato para a produção de etanol, butanol, alcoóis de açúcares, ácido láctico, ácido acético ou os produtos finais podem ser concentrados e purificados utilizando métodos padronizados que são conhecidos na técnica.
Em resumo, a presente invenção fornece processos de fermentação altamente produtivos que produzem enzimas celulases com baixo conteúdo de hemicelulase úteis para a hidrólise de substratos de celulose.
Não é pretendido que a descrição anterior limite a invenção reivindicada de maneira alguma. Além disso, a combinação de características discutidas poderia não ser absolutamente necessária para a solução da invenção.
EXEMPLOS
A presente invenção será adicionalmente ilustrada nos exemplos a seguir. Entretanto, deve ser entendido que estes exemplos têm apenas finalidades ilustrativas e não devem ser utilizados para limitar o âmbito da presente invenção de forma alguma.
O Exemplo 1 descreve as cepas utilizadas nos exemplos a seguir. O Exemplo 2 descreve um processo de fermentação em batelada alimentada e contínuo utilizando HDC e CIC. O Exemplo 3 descreve a determinação da produtividade específica e dos rendimentos dos processos para processos de fermentação em batelada alimentada utilizando HDC e CIC. O Exemplo 4 descreve a caracterização de misturas de celulases produzidas em fermentações em batelada alimentada utilizando HDC e CIC.
Exemplo 1: Cepas de Trichoderma reesei
As cepas de T. reesei RutC30 (ATCC N°56765; Montenecourt, B. e Eveleigh, D. 1979. Adv. Chem. Ser. 181: 289-301) ou P59G foram utilizadas nos exemplos a seguir. A cepa P59G é uma cepa modificada geneticamente que produz e secreta altos níveis da beta-glucosidase codificada por bgl1 de T reesei como descrito na Patente U.S. N° 6.015.703. A cepa original de P59G, a cepa BTR213, é um derivado de RutC30 produzido por mutagênese aleatória e selecionado em primeiro lugar pela capacidade de produzir zonas de clareamento maiores em ágar de meio mínimo contendo celulose intumescida com ácido a 1% e 4 g de L'1 2-desoxiglicose e então selecionado em relação à capacidade de crescer em meios de lactose contendo 0,2 pg/mL de carbendazim.
Exemplo 2: Fermentações Utilizando Misturas de HDC e CIC
Esporos de Trichoderma provenientes de estoques de glicerol a 15% congelados (-80°C) foram inoculados sobre placas de Petri de 85 mm padronizadas contendo ágar com dextrose de batata (PDA). Estas placas foram incubadas a 28°C durante 3 a 5 dias para atingir um crescimento confluente de esporos verdes frescos. Para preparar o inóculo para o teste de fermentação, os esporos provenientes de uma única placa de PDA foram transferidos para um frasco Erlenmeyer com chicanas de 2 L contendo 750 mL de meio de Berkley líquido (pH 5,5) suplementado com 5,1 g/L de solução de milho macerado em pó e 10 g/L de glicose. Os frascos foram incubados a 28°C durante 3 dias utilizando um agitador orbital (Modelo G-52 New Brunswick Scientific Co.) funcionando a 100 rpm.
Meios de Berkley para Frascos
Componente g/L (NH4)2SO4 1,4
KH2PO4 2,00
MgSO4.7H2O 0,31
CaCI2.2H2O 0,53
Solução de Milho Macerado Seca 5,1 Glicose 10
Elementos traços* 1 mL/L *A solução de elementos traços contém 5 g/L de FeSO4.7H2O; 1,6 g/L de MnSO4.H2O; 1,4 g/L de ZnSO4.7H2O.
2a. Fermentações em batelada alimentada
O conteúdo de um frasco de inoculo foi transferido para um recipiente de fermentação em escala piloto de 14 L (Modelo MF114 New Brunswick Scientific Co.) ajustado como 10 mL de Meio Piloto Inicial (pH 5,5). O recipiente foi acionado no modo de batelada até que a glicose no meio fosse esgotada. Neste ponto, foi adicionada a fonte de carbono, em uma base contínua, de um estoque que consistia tipicamente em 36 % em peso de sólidos Foram usadas bombas peristálticas para liberar a fonte de carbono a uma alimentação a uma taxa de 0,4 grama de carbono/litro de cultura/hora. Os parâmetros operacionais durante ambas as porções de batelada alimentada da corrida foram: mistura por agitação com impulsor a 500 rpm, aspersão de ar a 8 litros padronizados por minuto e uma temperatura de 28°C. O pH da cultura foi mantido a 4,0 a 4,5 durante o crescimento da batelada e pH 3,5 durante a produção de celulase utilizando um controlador automatizado conectado a uma sonda de pH online e a uma bomba que permite a adição de uma solução de hidróxido de amônio a 10%. Periodicamente foram retiradas amostras de 100 mL de caldo para análise da biomassa e da proteína. O tempo de fermentação total é tipicamente entre 96 a 144 horas.
| Meios Iniciais para Fermentações em batelada alimentada | |
| Componente | g/L |
| (NH4)2SO4 | 2,20 |
| kh2po4 | 1,39 |
| MgSO4.7H2O | 0,70 |
| CaCI2.2H2O | 0,185 |
| Solução de Milho Macerado Seca | 6,00 |
| Glicose | 13,00 |
| Elementos traços* | 0,38 mL/L |
* A solução com elementos traços contém 5 g/L de FeSO4.7H20; 1,6 g/L de MnSO4.H2O; 1,4 g/L de ZnSO4.7H2O.
O teor de biomassa do caldo do fermentador foi determinado utilizando alíquotas de 5 a 10 mL que tinham sido pesadas, filtradas a vácuo através de microfibra de vidro e secas em estufa a 100°C durante 4 a 24 horas. A concentração de biomassa foi determinada de acordo com a equação a seguir.
Biomassa (g/L)- papel de filtro e torta secos (9) massa do filtro (g) x densidade do caldo (g/mL) x 1000 (mL/L) massa da amostra úmida (g)
A concentração de proteína do filtrado do caldo de fermentação foi determinada utilizando o ensaio de Bradford. As variações de intensidade de cor no corante Coomassie Brilliant Blue G-250, que constitui a base deste ensaio, foram avaliadas quantitativamente espectrofotometricamente utilizando medidas de absorbância a 595 nm. O controle padronizado para o ensaio usado foi uma mistura de celulases de composição e concentração conhecidas.
O processo em batelada alimentado de fermentação utilizando tanto HDC como CIC produziu 3 a 5 vezes mais proteína e entre 10% até 46% menos biomassa do que o processamento correspondente utilizando apenas HDC (Tabela 4, Figura 3).
Tabela 4: produção de proteína secretada e massa de células de fungo em culturas alimentadas em batelada de 14L de cepas de T. reesei utilizava HDC com ou sem CIC.
| Cepa | Fonte de Carbono (HDC/CIC) | Proteína final média (g/L)b | Células finais médias (g/L)b |
| P59G | 100% xilose | 8 | 41 |
| 97% xilose/ 3% CICa | 25 | 35 | |
| 92% xilose/ 8% CICa | 32 | 32 | |
| 85% xilose/15% CICa | 32 | 25 | |
| 100% arabinose | 5 | 30 | |
| 90% arabinose/10% cellobiose | 25 | 27 | |
| RutC30 | 100% xilose | 0,66 | 13 |
| 92% xilose/ 8%cellobiose | 3,6 | 6,9 |
aCIC: coquetel de indução que compreende, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e outros carboidratos a 14%.
bPara a cepa P59G, os valores relatados são os resultados médios de três (xilose) ou duas (arabinose) fermentações repetidas; para a cepa RutC30, os valores relatados são os resultados de fermentações isola10 das.
2b. Fermentações Contínuas
Foram preparados frascos de inóculo de Trichoderma como no Exemplo 2a, acima.
O conteúdo de um frasco de inoculo foi transferido para um reci15 piente para fermentação em escala piloto de 14L (Modelo MF114 New Brunswick Scientific Co.) com 5 L de Meios Pilotos Iniciais (pH 5,5) como descrito no Exemplo 2a, acima. O recipiente foi posto para funcionar em modo em batelada até que a glicose nos meios estivesse esgotada. Neste ponto, foram adicionados a fonte de carbono e os nutrientes frescos, em uma base contínua.
Foram usadas bombas peristálticas para liberar a fonte de carbono a uma alimentação a uma taxa de entre 0,85 e 1,1 gramas de carbono/litro de cultura/hora a uma taxa de diluição de 0,025 h1. A fonte de carbono consistia de HDC a 92% e CIC a 8% como uma função de carboidrato total. O HDC era uma mistura de xilose pura, glicose e arabinose ou um hidrolisado para pré-tratamento, produzido pelo pré-tratamento de palha de trigo e consistia em xilose a 81,1%, glicose a 11,1% e arabinose a 7,8%. O CIC era um coquetel de indução com a composição apresentada a seguir. O volume da cultura foi mantido a 5L durante toda a fermentação através do uso de um sifão. Parâmetros operacionais através do uso de um sifão. Parâmetros operacionais durante as porções em batelada e batelada-alimentada da corrida foram: mistura por agitação do impulsor a 500 rpm, aspersão de ar a 8 litros padronizados por minuto e uma temperatura de 28°C. O pH da cultura foi mantido a 4,0-4,5 durante o crescimento da batelada e pH 3,5 durante a produção de celulase utilizando um controlador automatizado conectado a uma sonda de pH online e uma bomba que permite a adição de uma solução a 10% de hidróxido de amônio. Periodicamente, foram retiradas amostras de 100 mL de caldo para análise da biomassa e da proteína. O tempo total de fermentação foi de tipicamente 24 horas para a fase em batelada e de 144 horas para a fase contínua.
Composição de meios nutrientes para fermentação contínua
Componente g/kg (NH4)2SO4 1,68
KH2PO4 1,06
MgSO4.7H2O 0,53
CaCI2.2H2O 0,11
Solução de Milho Macerado Seca 2,52
Elementos traços* 0,29 (mL/L)
Açúcares (Xilose, Arabinose, Glicose) e aCIC) 97 *A solução com elementos traços contém 5 g/L de FeSO4.7H20; 1,6 g/L de MnSO4.H2O; 1,4 g/L de ZnSO4.7H2O.
aCIC: coquetel de indução que compreende, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e outros carboidratos a 14%.
O teor do caldo do fermentador e a concentração de proteína do filtrado do caldo foram determinados como no Exemplo 2a. Como mostrado na tabela 5, pois as culturas crescidas utilizando misturas de HDC de açúcares puros ou hidroiisado de pré-tratamento produzem quantidades similares de proteína e de células.
Tabela 5: produção de proteína secretada e massa de células de fungo em de culturas contínuas de 14L de T. reesei usando misturas de CIC e HDC provenientes do hidroiisado de pré-tratamento ou de substâncias químicas puras
| Cepa | Fonte de Carbono (HDC/CIC) | Proteína média secretada (g/i)b | Células médias (g/l)b |
| P59G | Controle: Açúcares 92 % puros / 8 % aCIC | 14 | 15 |
| 92 % de HDC 8% de CICa | 14 | 20 |
aCIC: coquetel de indução que compreende, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e outros carboidratos a 14%.
bOs valores apresentados são os resultados médios de duas fermentações repetidas.
Exemplo 3: Produtividade específica
O processo em batelada de fermentação alimentada que utiliza tanto HDC como CIC exibe produtividade específica 4-12 vezes mais alta do que um processo correspondente que utiliza apenas HDC (Tabela 6, Figura 4).
Tabela 6: produtividade específica de culturas em batelada alimentada de 14
L de cepas de T. reesei utilizando HDC corn ou sem CIC._
| Cepa | Fonte de Carbono (HDC/CIC) | qp b(mg de proteína/g de células/h) |
| P59G | 100% xilose | 2 |
| 97% xilose/ 3% CICa | 14 | |
| 92% xilose/ 8% CICa | 19 | |
| 85% xilose/15% CICa | 24 | |
| 100% arabinose | 3,5 | |
| 90% arabinose/10% celobiose | 14 | |
| RutC30 | 100% xilose | 4 |
| 92% xilose/ 8% celobiose | 23 |
aCiC: coquetel de indução compreendendo, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e de outros carboidratos 14%.
bPara a cepa P59G, os valores relatados são os resultados médios de três (xilose) ou duas (arabinose) fermentações repetidas; para a cepa RutC30,os valores relatados são os resultados de fermentações isoladas.
Processos contínuos de fermentação utilizando CIC em combinação com mistura HDC produzida pelo pré-tratamento de vapor de ácido diluído de uma palha de trigo (como nas Patentes U.S, 4.461.648 e 5.916.780) ou com uma mistura equivalente de HDC obtida utilizando açúcares puros. Estas misturas HDC continham, como uma função de carboidrato total: xilose a 81,1%, glicose a 11,1% e arabinose a 7,8%. Como mostrado na Tabela 7, as produtividades específicas das culturas contínuas que utilizam misturas HDC na forma de um hidrolisado pré-tratamento ou açúcares puros foram similares.
Tabela 7: produtividade específica de culturas de CSTR de uma cepa de T. reesei que utiliza misturas de CIC e HDC de hidrolisado de pré-tratamento ou substâncias químicas puras.
| Cepa | Fonte de Carbono (HDC/CIC) | qp médio (mg de proteína/g de células/h)b |
| P59G | Controle: 92% de açúcares puros | 27 |
| 92% HDC/ 8% CICa | 24 |
aCIC: coquetel de indução que compreende, como uma função de carboidrato total, gentiobiose a 56%, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e outros carboidratos 14%.
bOs valores relatados representam a média da corrida das duas fermentações contínuas utilizando cada uma das misturas HDC/CIC Exemplo 4: caracterização de Misturas de Celulases Produzidas em Fermentações em Batelada Alimentada
Os componentes individuais de misturas de celulases produzidas pelos processos de fermentação descritos no Exemplo 2 foram separados na base do tamanho utilizando eletroforese em SDS-poli-acrilamida (SDSPAGE). Para esta finalidade, os géis de empilhamento consistiam em acrila26 mida a 4%, Tris-HCI a 0,125 M, pH 6,8; os géis de separação consistiam em acrilamida a 12%, Tris-HCI a 0,375 M, pH 8,8. A proporção de solução de monômero de gel de estoque usada para preparação de gel foi de 37,5:1 acrilamida:bis-acrilamida. Antes do carregamento, as amostras de proteína foram desnaturadas fervendo durante 5 minutos em tampão contendo beta-mercaptoetanol. Subsequentemente, géis de 10x8x0,075cm foram carregados com aproximadamente 10 pg de proteína/faixa. A separação eletroforética foi feita a 200V durante aproximadamente 45 minutos. As proteínas fracionadas foram visualizadas corando com uma solução de corante Coomassie Brilliant Blue G-250.
As proporções de celulases e hemicelulases fracionadas por SDS-PAGE foram caracterizadas utilizando densitometria de varredura em gel. Este processo acarretava primeiro a captura de uma imagem digital de um gel corado com corante Coomassie Brilliant Blue G-250. Isto foi feito utilizando um sistema CHEMIGENIUS2 Bioimaging (Synoptics Ltd.) e o pacote de softwares GeneSnap v6.03 (Synoptics Ltd.). As proteínas celulase e hemicelulase fracionadas, visualizadas como faixas distintas, foram então caracterizadas baseadas em sua intensidade de sinal de imagem relativa à soma total do sinal para todas as faixas em uma dada amostra. A intensidade do sinal foi determinada utilizando o pacote de softwares GeneTools v 3.05 (Synoptics Ltd.) com os ajustes pré-determinados habilitados. Os dados foram exportados para uma planilha em Excel (Microsoft Inc.) para análise posterior.
A atividade específica das misturas de celulases produzidas por fermentações por T. reesei utilizando misturas de HDC e CIC foi determinada pela medida da liberação de açúcares redutores de um substrato de palha de trigo pré-tratado ou de papel de filtro.
A hidrólise de papel de filtro foi conduzida de acordo com os métodos padronizados IUPAC para a medida da atividade de celulases (Ghose, T.K., 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 257-268). Os valores apresentados são atividades específicas de celulases em Ul/mg de proteína.
A hidrólise de palha de trigo foi conduzida como a seguir: diluições dos filtrados de fermentação em tampão de citrato a 50 mM com pH 5,0 contendo benzoato de sódio a 0,5%, foram complementadas com uma pre27 paração de β-glucosidase proveniente de Aspergillus nigere incubadas com palha de trigo pré-tratada com ácido preparada como para como para a Patente U.S. Nj 4.461.648; as misturas de reação foram agitadas a 50°C durante 24 horas e o nível de conversão-alvo da celulose era maior do que
70%. A atividade da enzima foi calculada por determinação da quantidade de enzima necessária para alcançar o nível de conversão-alvo da celulose. Estas atividades foram normalizadas até a atividade de um filtrado de fermentação de controle produzido em uma cultura em batelada alimentada de 14L da mesma cepa crescida utilizando uma fonte de carbono produzida pela condensação com ácido de glicose. A massa total de proteína testadas nos ensaios para todos os filtrados de fermentação era a mesma.
Como apresentado na tabela 8, os filtrados de fermentação produzidos por culturas de T. reesei crescidas com pelo menos CIC a 3% em combinação com HDC produziram celulases de melhor qualidade do que as culturas cres15 cidas somente com HDC. A inclusão de pelo menos CIC a 3% na fonte de carbono alimentada para a fermentação melhorou a proporção de celulase: hemicelulase e a atividade específica da celulase para hidrólise de substratos de celulose. Tabela 8: composição de enzima secretada de culturas de T. reesei crescidas em culturas líquidas submersas em HDC e CIC em fermentação em ba20 telada alimentada de 14 L.
| Cepa | HDC (%) | % de CIC | Proporção de Celulase: He- micelulase | Atividade Relativa de Celulase | |
| Lignocelulose prétratada0 | Papel de filtro0 | ||||
| P59G** | Controle de glicose (85) | 15 | 20:1 | 1,0 | n.d. |
| Xilose (100) | 0 | ~1:1 | n.d. | 0,11 | |
| Xilose (92) | 8a | 2:1 | 0,58 | 0,41 | |
| Xilose (85) | 15a | 3:1 | 0,62 | n.d. | |
| Mistura de HDCd (92) | 8b | n.d | n.d. | 0,42 | |
| Mistura de HDCe (92) | 8b | n.d. | n.d. | 0,52 | |
| Arabinose (100) | 0b | 0.8:1 | n.d. | 0,05 | |
| Arabinose (98) | 2b | 1,5:1 | 0,31 | n.d. | |
| Arabinose (90) | 2,4:1 | 0,84 | 0,66 | ||
| RutC30 | Xilose (100) | 0b | 2:1 | n.d. | <0,05 |
| Xilose (92) | 8b | 3:1 | n.d | 0,38 |
aCIC para estas fermentações era um coquetel de indução compreendendo, como uma função de carboidrato total, 56% de gentiobiose, soforose a 14%, celobiose a 6%, trealose a 10%, maltotriose a 6%, glicose a 4% e de outros carboidratos a 14%.
bCIC para estas fermentações era celobiose.
cAtividade relativa de hidrólise em um substrato de lignocelulose pré-tratado ou papel de filtro. Os valores representam a média de ensaios em triplicata realizados nas enzimas secretadas provenientes de filtrados de três (HDC=xilose) ou duas (HDC=arabinose) fermentações em 14 L independentes (n.d.= não determinada).
dMistura de açúcares puros (xilose a 81,1%, glicose a 11,1% e arabinose a 7,8%).
eMistura de açúcares no hidrolisado pré-tratado (xilose a 81,1%, glicose a 11,1%, arabinose a 7,8%)
Claims (17)
- REIVINDICAÇÕES1. Processo de fermentação para a produção de uma mistura de celulases, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de uma célula hospedeira que secreta celulases do gênero Trichoderma ou Hypocrea5 com uma fonte de carbono para produção de enzimas celulases, a fonte de carbono compreendendo um carboidrato derivado de hemicelulose de 40 por cento em peso até 97 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono e um carboidrato indutor de celulases de 3 por cento em peso até 20 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono, durante 310 até 30 dias, a uma temperatura de 20°C até 35°C, em um pH de 3,0 até 6,5 e a obtenção da mistura de celulase assim produzida, em que o carboidrato derivado de hemicelulose compreende um ou mais oligossacarídeo, dissacarídeo ou monossacarídeo selecionado do grupo consistindo em xilooligossacarídeos, arabino xilooligossacarídeos, D-xilose, xilobiose, L15 arabinose, D-manose, D-galactose e uma combinação destes e em que a mistura de celulase compreende celulases e hemicelulases em um proporção de pelo menos 2:1 (massa/massa). .
- 2. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que desde 80 por cento em peso até 97 por cento20 em peso do carbono total presente na fonte de carbono é o carboidrato derivado de hemicelulose e em que desde 8 por cento em peso até 15 por cento em peso do carbono total presente na fonte de carbono é o carboidrato indutor de celulases.
- 3. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 1 ou 2,25 caracterizado pelo fato de que a mistura de celulases compreende celulases e hemicelulases em uma proporção de pelo menos 3:1.
- 4. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono compreende uma ou mais fontes de carbono adicionais.30
- 5. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais fontes de carbono adicionais são glicerol ou um ácido orgânico.Petição 870170083980, de 31/10/2017, pág. 4/9
- 6. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma cepa de Trichoderma reesei.
- 7. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das 5 reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o processo produz pelo menos 2 vezes mais celulase secretada quando comparado à quantidade de celulase secretada produzida em um processo em que a fonte de carbono consiste em carboidratos derivados de hemicelulose.
- 8. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das 10 reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de possuir um aumento de pelo menos 3 vezes na produtividade específica (qp) quando comparada à qp em um processo em que a fonte de carbono consiste em carboidratos derivados de hemicelulose.
- 9. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 8, 15 caracterizado pelo fato de possuir um aumento de pelo menos 5 vezes na produtividade específica (qp) quando comparada à qp em um processo em que a fonte de carbono consiste em carboidratos derivados de hemicelulose.
- 10. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo é em batelada20 alimentada.
- 11. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo é contínuo.
- 12. Processo de fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o processo é conduzido25 de forma aeróbia.
- 13. Uso da mistura de celulases produzida através do processo de fermentação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a hidrólise de um substrato de celulose.
- 14. Uso da mistura de celulases produzida através do processo de 30 fermentação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a hidrólise de um substrato de lignocelulose pré-tratado, o qual substrato de lignocelulose é produzido por tratamento físico,Petição 870170083980, de 31/10/2017, pág. 5/9 tratamento químico ou uma combinação destes, para tornar as fibras nele contidas mais acessíveis ou receptivas à ação das enzimas celulolíticas.
- 15. Processo de hidrólise de um substrato de celulose, caracterizado pelo fato de que compreende, a adição da mistura de celulases produzida através do processo de fermentação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ao substrato de celulose para produzir uma mistura de reação, em que a concentração de celulose na mistura de reação é de 1 g/L até 200 g/L e a mistura de celulases é adicionada em uma concentração de 0,1 mg de proteína/g de celulose até 100 mg de proteína/g de celulose; e a incubação da mistura de reação durante um período de tempo de 4 até 120 horas, a uma temperatura de 30°até 60°C e em um pH de 3,5 até 7,0 para hidrolisar o substrato de celulose e obter produtos de reação.
- 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os produtos de reação incluem carboidrato derivado de hemicelulose, glicose, oligossacarídeos, carboidratos indutores de celulases ou uma combinação dos mesmos.
- 17. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o substrato de celulose é um substrato de lignocelulose pré-tratado, o qual substrato de lignocelulose pré-tratado é produzido por tratamento físico, tratamento químico, ou uma combinação destes, para fazer das fibras nele contidas mais acessíveis ou receptivas às ações das enzimas celulolíticas.Petição 870170083980, de 31/10/2017, pág. 6/91/5
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96902507P | 2007-08-30 | 2007-08-30 | |
| US60/969,025 | 2007-08-30 | ||
| PCT/CA2008/001537 WO2009026716A1 (en) | 2007-08-30 | 2008-08-28 | Method for cellulase production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0816478A2 BRPI0816478A2 (pt) | 2014-10-14 |
| BRPI0816478B1 true BRPI0816478B1 (pt) | 2018-02-14 |
Family
ID=40386625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0816478-9A BRPI0816478B1 (pt) | 2007-08-30 | 2008-08-28 | Processos de fermentação para a produção de uma mistura de celulases e de hidrólise de um substrato de celulose e uso de mistura de celulases em processo de fermentação |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8093019B2 (pt) |
| EP (1) | EP2198019A4 (pt) |
| JP (1) | JP2010536390A (pt) |
| CN (1) | CN101809151B (pt) |
| AU (1) | AU2008291598A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0816478B1 (pt) |
| CA (1) | CA2697090A1 (pt) |
| MX (1) | MX2010002185A (pt) |
| WO (1) | WO2009026716A1 (pt) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9206446B2 (en) * | 2006-05-01 | 2015-12-08 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Extraction of solubles from plant biomass for use as microbial growth stimulant and methods related thereto |
| US8968515B2 (en) | 2006-05-01 | 2015-03-03 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Methods for pretreating biomass |
| AU2007248736B2 (en) * | 2006-05-01 | 2010-04-22 | Dartmouth College | Process for the treatment of lignocellulosic biomass |
| US20090011474A1 (en) * | 2007-06-20 | 2009-01-08 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Process for producing sugars from cellulosic biomass |
| US20090053771A1 (en) * | 2007-08-22 | 2009-02-26 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Process for making fuels and chemicals from AFEX-treated whole grain or whole plants |
| US8367378B2 (en) * | 2007-10-03 | 2013-02-05 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Process for producing sugars and ethanol using corn stillage |
| CN102292438A (zh) | 2008-11-03 | 2011-12-21 | 艾欧基能源公司 | 用于生产纤维素酶的宿主和发酵方法 |
| CN102325938A (zh) * | 2009-02-18 | 2012-01-18 | 李荣秀 | 生物质转化方法 |
| WO2010127219A2 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Danisco Us Inc. | Altering enzyme balance through fermentation conditions |
| EP2411492B1 (en) | 2009-08-24 | 2014-10-22 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Pretreated densified biomass products and methods of making and using same |
| US10457810B2 (en) | 2009-08-24 | 2019-10-29 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Densified biomass products containing pretreated biomass fibers |
| US8945245B2 (en) | 2009-08-24 | 2015-02-03 | The Michigan Biotechnology Institute | Methods of hydrolyzing pretreated densified biomass particulates and systems related thereto |
| JP2011160753A (ja) * | 2010-02-12 | 2011-08-25 | Univ Of Tokyo | 糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法 |
| MX341792B (es) | 2010-04-19 | 2016-09-02 | Univ Michigan State | Biomasa lignocelulósica digeribles y extractos y métodos para producir la misma. |
| EP3859017A1 (en) | 2010-06-26 | 2021-08-04 | Virdia, Inc. | Methods for production of sugar mixtures |
| IL206678A0 (en) | 2010-06-28 | 2010-12-30 | Hcl Cleantech Ltd | A method for the production of fermentable sugars |
| FR2962444B1 (fr) | 2010-07-12 | 2012-08-31 | Inst Francais Du Petrole | Procede de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hemicellulolytiques ameliore |
| US8735633B2 (en) | 2010-07-14 | 2014-05-27 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Methods for making 1,3-dihydroxyacetone (DHA) from glycerol |
| IL207945A0 (en) * | 2010-09-02 | 2010-12-30 | Robert Jansen | Method for the production of carbohydrates |
| WO2012137201A1 (en) | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Hcl Cleantech Ltd. | Lignocellulose conversion processes and products |
| FR2979111B1 (fr) * | 2011-08-19 | 2015-05-01 | IFP Energies Nouvelles | Procede de production de cellulases par un champignon filamenteux adapte a un fermenteur ayant un faible coefficient de transfert volumetrique d'oxygene kla |
| US20140363846A1 (en) * | 2011-08-26 | 2014-12-11 | Iogen Energy Corporation | Process for producing cellulase mixtures from myceliophthora and related organisms |
| FR2981364B1 (fr) * | 2011-10-14 | 2015-01-30 | IFP Energies Nouvelles | Procede de production de cellulases en continu par un champignon filamenteux utilisant un substrat carbone issu d'un pretraitement acide |
| FR2984353B1 (fr) | 2011-12-14 | 2014-11-21 | IFP Energies Nouvelles | Procede de production d'un cocktail enzymatique utilisant les residus solides d'un procede de conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques |
| FR2985736B1 (fr) * | 2012-01-18 | 2020-01-10 | IFP Energies Nouvelles | Procede de pretraitement de la biomasse lignocellulosique avec un sel inorganique hydrate permettant d'obtenir une fraction cellulosique et une fraction hemicellulosique |
| US10202660B2 (en) | 2012-03-02 | 2019-02-12 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Methods for increasing sugar yield with size-adjusted lignocellulosic biomass particles |
| GB2517338B (en) | 2012-05-03 | 2020-03-25 | Virdia Inc | A method for fractionating a liquid sample |
| FR2991997B1 (fr) * | 2012-06-18 | 2015-08-21 | IFP Energies Nouvelles | Procede de production d'un cocktail enzymatique utilisant les residus liquides d'un procede de conversion biochimique de materiaux ligno-cellulosiques |
| FR2997400B1 (fr) * | 2012-10-29 | 2015-07-24 | IFP Energies Nouvelles | Procede de production de sophorose a partir de sophorolipides |
| FR3000106B1 (fr) * | 2012-12-20 | 2015-01-30 | Ifp Energies Now | Procede de production d'oligosaccharides a partir de biomasse lignocellulosique |
| CN112226466A (zh) | 2015-01-07 | 2021-01-15 | 威尔迪亚公司 | 萃取和转化半纤维素糖的方法 |
| CN104630186A (zh) * | 2015-02-07 | 2015-05-20 | 大连理工大学 | 一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法及应用 |
| SG11201707406VA (en) * | 2015-03-31 | 2017-10-30 | Xyleco Inc | Compositions for enhanced enzyme production |
| CN104894087A (zh) * | 2015-05-22 | 2015-09-09 | 江南大学 | 一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法 |
| EP3303639B1 (en) | 2015-05-27 | 2020-08-05 | Virdia, Inc. | Integrated methods for treating lignocellulosic material |
| EP3540052B1 (en) * | 2018-03-14 | 2025-11-05 | Indian Oil Corporation Limited | A stable lignocellulolytic enzyme composition |
| WO2020004473A1 (ja) * | 2018-06-28 | 2020-01-02 | 関西化学機械製作株式会社 | セルラーゼ剤の製造方法ならびに当該セルラーゼ剤を用いた糖化発酵産物の製造方法 |
| FR3088934B1 (fr) * | 2018-11-26 | 2024-07-26 | Ifp Energies Now | Procede de production d’enzymes par une souche appartenant a un champignon filamenteux |
| JP7446089B2 (ja) * | 2019-11-18 | 2024-03-08 | 花王株式会社 | セルラーゼの製造方法 |
| CN111500559A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-08-07 | 湖南农业大学 | 一种纤维素酶发酵调控剂及应用 |
| CN114703164A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-05 | 上海交通大学 | 一种高效纤维素酶诱导物及其制备和应用方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4461648A (en) * | 1980-07-11 | 1984-07-24 | Patrick Foody | Method for increasing the accessibility of cellulose in lignocellulosic materials, particularly hardwoods agricultural residues and the like |
| US4600590A (en) * | 1981-10-14 | 1986-07-15 | Colorado State University Research Foundation | Method for increasing the reactivity and digestibility of cellulose with ammonia |
| JPS6027384A (ja) * | 1983-07-27 | 1985-02-12 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | セルラ−ゼの製造方法 |
| US5837515A (en) * | 1990-05-16 | 1998-11-17 | Alko-Yhtiot Oy | Enzyme preparations and methods for their production |
| US5916780A (en) * | 1997-06-09 | 1999-06-29 | Iogen Corporation | Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol |
| US6043392A (en) * | 1997-06-30 | 2000-03-28 | Texas A&M University System | Method for conversion of biomass to chemicals and fuels |
| CN1335395A (zh) * | 2001-09-04 | 2002-02-13 | 湖南尤特尔生化有限公司 | 高活性纤维素酶组合物及其制备方法 |
| ITMI20012135A1 (it) * | 2001-10-16 | 2003-04-16 | Bioren S A | Soluzioni iniettabili pronte all'uso di paracetamolo |
| ATE481496T1 (de) * | 2002-03-15 | 2010-10-15 | Iogen Energy Corp | Verfahren zur herstellung von glukose durch verwendung von endoglucanase-core-protein zur verbesserten rückgewinnung und wiederverwendung des enzyms |
| CN100362093C (zh) * | 2005-04-29 | 2008-01-16 | 浙江大学 | 一种好氧高温堆肥发酵功能菌培养基的配制方法 |
-
2008
- 2008-08-28 BR BRPI0816478-9A patent/BRPI0816478B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-08-28 JP JP2010522148A patent/JP2010536390A/ja active Pending
- 2008-08-28 EP EP08783431A patent/EP2198019A4/en not_active Withdrawn
- 2008-08-28 WO PCT/CA2008/001537 patent/WO2009026716A1/en not_active Ceased
- 2008-08-28 CA CA2697090A patent/CA2697090A1/en not_active Abandoned
- 2008-08-28 MX MX2010002185A patent/MX2010002185A/es active IP Right Grant
- 2008-08-28 US US12/200,492 patent/US8093019B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-28 CN CN2008801095529A patent/CN101809151B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-28 AU AU2008291598A patent/AU2008291598A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0816478A2 (pt) | 2014-10-14 |
| EP2198019A1 (en) | 2010-06-23 |
| JP2010536390A (ja) | 2010-12-02 |
| US20090061486A1 (en) | 2009-03-05 |
| WO2009026716A1 (en) | 2009-03-05 |
| WO2009026716A8 (en) | 2010-04-15 |
| CN101809151B (zh) | 2013-04-24 |
| CA2697090A1 (en) | 2009-03-05 |
| EP2198019A4 (en) | 2011-05-11 |
| CN101809151A (zh) | 2010-08-18 |
| MX2010002185A (es) | 2010-06-17 |
| US8093019B2 (en) | 2012-01-10 |
| AU2008291598A1 (en) | 2009-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0816478B1 (pt) | Processos de fermentação para a produção de uma mistura de celulases e de hidrólise de um substrato de celulose e uso de mistura de celulases em processo de fermentação | |
| Jørgensen et al. | Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis | |
| Ahamed et al. | Culture-based strategies to enhance cellulase enzyme production from Trichoderma reesei RUT-C30 in bioreactor culture conditions | |
| US10190108B2 (en) | Method for reducing viscosity in saccharification process | |
| EP2183363B1 (en) | Fungal xylanase | |
| ES2745754T3 (es) | Procedimiento para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico mediante el uso de oxígeno | |
| MX2011002142A (es) | Beta-glucosidasas modificadas con estabilidad mejorada. | |
| US10457925B2 (en) | Process for the production of cellulolytic and/or hemicellulolytic enzymes | |
| WO2013029170A1 (en) | A process for producing cellulase mixtures from myceliophthora and related organisms | |
| Biely et al. | Xylan-degrading activity in yeasts: growth on xylose, xylan and hemicelluloses | |
| US8530193B2 (en) | Altering enzyme balance through fermentation conditions | |
| CN102159707A (zh) | 木质素所致失活降低的第6家族纤维素酶 | |
| PT2766471T (pt) | Processo de produção de celulases sem interrupção por um fungo filamentoso que utiliza um substrato de carbono derivado de um pré-tratamento ácido | |
| US10030236B2 (en) | Process for the production of an enzymatic cocktail using liquid residues from a process for the biochemical conversion of lignocellulosic materials | |
| Robison | Cellulase and xylanase production by Trichoderma reesei Rut C-30 | |
| Bekkarevich et al. | Cultivation of a novel cellulase/xylanase producer, Trichoderma longibrachiatum mutant TW 1-59-27: Production of the enzyme preparation and the study of its properties | |
| Kerns et al. | Formation and release of β‐glucosidase by aspergillus niger zimet 43 746 in correlation to process operations | |
| US20200165589A1 (en) | Provident method of cellulases enzymes production by penicillium funiculosum mrj-16 using low cost media components | |
| Kropatsch | Characterization of the recombinantly expressed hydrolases PcCel5A and PcCel6A | |
| Lo | Cellulase Production by Trichoderma Reesei Rut-C30 | |
| BR102019025066B1 (pt) | Método para produção de enzimas celulases por penicillium funiculosum mrj-16 usando componentes mínimos de meio | |
| Othman et al. | Dual Carbon Fermentation for the Production of Inducible Cellobiohydrolase by Recombinant Aspergillus Niger | |
| Zeltina et al. | Determination of the cellulolytic activity of Micromycetes by an express method | |
| Nipa et al. | Cellobiose Octaacetate (COA) Enhance the Production of Cellulase by Aspergillus Fumigatus | |
| BR112017028171B1 (pt) | Polinucleotídeo que codifica uma proteína tendo atividade de xilanase, vetor compreendendo o dito polinucleotídeo, método para fabricação de um transformante, transformante transformado com o dito vetor, agente de sacarificação de biomassa compreendendo proteína com atividade de xilanase e método para fabricação de açúcar a partir de biomassa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] | ||
| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 14A ANUIDADE. |
|
| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2685 DE 21-06-2022 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |