BRPI0816191B1

BRPI0816191B1 - processo para converter um material contendo lignocelulose em um hidrolisado

Info

Publication number: BRPI0816191B1
Application number: BRPI0816191-7A
Authority: BR
Inventors: Haiyu Ren; Hond Zhi Huang; Jie Zheng
Original assignee: Novozymes A/S; Cofco Ltd
Priority date: 2007-09-03
Filing date: 2008-09-03
Publication date: 2020-12-29
Also published as: EP2191061A1; ES2425596T3; EP2191061B1; CN101796247B; WO2009030713A1; US20090056889A1; CN101796247A; BRPI0816191A2; DK2191061T3; US20170226694A1; US9695549B2; US10072380B2

Abstract

processos para produzir um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, para converter um material contendo lignocelulose em um hidrolisado, e para converter um material contendo lignocelulose em um produto de fermentação a invenção refere-se a um processo de destoxificação de material contendo lignocelulose pré-tratado compreendendo lavagem do material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem e tratamento da solução de lavagem usada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor de organismo fermentativo antes do reciclo da solução de lavagem usada.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a processos incluindodestoxificação e reciclo da solução de lavagem usada no pré-tratamento de materiais contendo lignocelulose. A invenção também se refere a processos de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo lignocelulose usando um organismo fermentativo, incluindo um processo de destoxificação da invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Devido às reservas limitadas de combustíveis fósseis epreocupações acerca da emissão de gases estufa existe um foco crescente no uso de fontes renováveis de energia. Produção de produtos de fermentação provenientes de material contendo lignocelulose é conhecida na arte e inclui convencionalmente pré-tratamento, hidrólise, e fermentação do material contendo lignocelulose. Pré-tratamento resulta na liberação dos produtos de degradação do material contendo lignocelulose que podem se ligar irreversivelmente e inibir enzimas adicionadas durante hidrólise e fermentação. Estes compostos podem também ser tóxicos ao metabolismo do organismo fermentativo e inibir o desempenho do organismo fermentativo.

[003] Destoxificação por extração com vapor foi sugerido, mas éuma etapa adicional de processo trabalhosa e cara. Foi também sugerido lavar o material pré-tratado contendo lignocelulose antes da hidrólise. Entretanto, os inibidores frequentemente possuem baixa solubilidade e reciclo da água de lavagem somente é possível a uma extensão muito limitada devido ao acúmulo de inibidores. A lavagem, portanto, exige montantes enormes de água.

[004] Consequentemente, há uma necessidade de prover processospara destoxificação de material contendo lignocelulose pré-tratado para obter substratos adequados para hidrólise e fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção refere-se a processos de destoxificação dematerial pré-tratado contendo lignocelulose por lavagem e regeneração e reciclo da solução de lavagem usada. A solução de lavagem usada é regenerada por remoção de um inibidor de enzima e/ou um inibidor de um organismo fermentativo. A invenção também se refere a processos de produção de um hidrolisado e um produto de fermentação a partir de um material contendo lignocelulose incluindo um processo de destoxificação da invenção.

[006] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um processopara produzir um material pré-tratado e lavado contendo lignocelulose, o método compreendendo as etapas de: a) submeter um material contendo lignocelulose a um pré-tratamento, b) lavar o material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem, c) separar a solução de lavagem usada, para obter um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, repetindo continuamente as etapas (a) a (c), sendo que a solução de lavagem usada da etapa (b) é tratada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor de um organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa (b).

[007] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um processopara converter um material contendo lignocelulose em um hidrolisado contendo mono- e oligossacarídeos, o método compreendendo as etapas de; a) submeter um material contendo lignocelulose a um pré-tratamento, b) lavar o material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem, c) separar a solução de lavagem usada para obter um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, d) submeter o material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado a um tratamento resultando em pelo menos hidrólise parcial da celulose e hemicelulose para obter um hidrolisado contendo açúcares fermentáveis, e repetir continuamente as etapas (a) a (d), sendo que a solução de lavagem usada da etapa (b) é tratada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor de um organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa (b).

[008] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um processopara converter um material contendo lignocelulose em um produto de fermentação, o método compreendendo as etapas de: a) submeter um material contendo lignocelulose a um pré-tratamento, b) lavar o material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem, c) separar a solução de lavagem usada para obter um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, d) submeter o material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado a um tratamento resultando em pelo menos hidrólise parcial da celulose e hemicelulose para obter um hidrolisado contendo açúcares fermentáveis, e) por em contato o hidrolisado da etapa (d) com um organismo fermentativo para produzir um produto de fermentação, em que a solução de lavagem da etapa (b) usada é tratada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor do organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa (b).

[009] As vantagens dos processos incluem o fato de que açúcaressolúveis (por exemplo, xilose, oligossacarídeos) produzidos a partir do pré- tratamento podem ser concentrados na solução de lavagem; eficiência aumentada da hidrólise; crescimento melhorado de levedura e/ou fermentação melhorada dos hidrolisados; redução da fase estacionária da fermentação; e redução significativa do consumo de solução de lavagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0010] Em uma modalidade do primeiro aspecto, a invenção refere-se a um processo para produzir um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, o método compreendendo as etapas de: a) submeter um material contendo lignocelulose a um pré-tratamento, b) lavar o material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem, c) separar a solução de lavagem usada, para obter um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, repetindo continuamente as etapas (a) to (c), sendo que a solução de lavagem usada da etapa (b) é tratada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor de um organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa (b).

[0011] Em uma modalidade do segundo aspecto, a invenção refere-se a um processo para converter um material contendo lignocelulose em um hidrolisado contendo mono- e oligossacarídeos, o método compreendendo as etapas de: a) submeter um material contendo lignocelulose a um pré- tratamento, b) lavar o material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem, c) separar a solução de lavagem usada para obter um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, d) submeter o material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado a um tratamento resultando em pelo menos hidrólise parcial da celulose e hemicelulose para obter um hidrolisado contendo açúcares fermentáveis, e repetir as etapas (a) a (d), em que a solução de lavagem usada da etapa (b) é tratada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor de um organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa (b).

Material contendo lignocelulose

[0012] O termo “materiais contendo lignocelulose” aqui utilizado refere-se a um material consistindo principalmente de celulose, hemicelulose, e lignina. Materiais contendo lignocelulose são frequentemente referidos como “biomassa”.

[0013] A estrutura de lignocelulose não é diretamente acessível à hidrólise enzimática. Assim, a lignocelulose tem de ser pré-tratada, por exemplo, por hidrólise ácida em condições adequadas de pressão, umidade e temperatura, para quebrar o selo de lignina e romper a estrutura cristalina de celulose. Isto causa solubilização e sacarificação da fração de hemicelulose. A fração de celulose pode ser hidrolisada, por exemplo, enzimaticamente por enzimas celulase, para converter os polímeros de carboidrato em mono- e oligossacarídeos, que podem ser fermentados em um produto desejado de fermentação, como etanol. Opcionalmente o produto de fermentação é recuperado, por exemplo, por destilação.

[0014] Qualquer material contendo lignocelulose é contemplado de acordo com a presente invenção. O material contendo lignocelulose pode ser qualquer material contendo lignocelulose. Em uma modalidade preferida, o material contendo lignocelulose contém pelo menos 30 % em peso, preferivelmente pelo menos 50 % em peso, mais preferivelmente pelo menos 70 % em peso, Inda mais preferivelmente pelo menos 90 % em peso de lignocelulose. Deve ser entendido que o material contendo lignocelulose pode também conter outros constituintes como material celulósico, incluindo celulose e hemicelulose, e pode também conter outros constituintes como material protéico, amido, açúcares como açúcares fermentáveis e/ou açúcares não fermentáveis.

[0015] Material contendo lignocelulose é geralmente encontrado, por exemplo, nos caules, folhas, cascas, cascas secas (palhas), e sabugos de plantas ou folhas, ramos, e madeira de árvores. Material contendo lignocelulose pode também ser, mas não se restringe a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, papel residual, e polpa e resíduos de plantas de papel. É entendido que o material contendo lignocelulose, neste contexto, pode estar na forma de um material de parede celular de plantas contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista.

[0016] Em uma modalidade preferida, o material contendo lignocelulose inclui cavacos de madeira, bagaço, resíduo de processamento de papel ou polpa.

[0017] Outros exemplos incluem palha de milho, madeira dura, como choupo e bétula, madeira macia como madeira de pinho, panicum virgatum (grama de ponta), palha e/ou cascas secas de cereais, como palha de arroz, trigo, cevada, centeio, etc., resíduo sólido municipal (municipal solid waste (MSW)), resíduo orgânico industrial, papel de escritório, ou misturas dos mesmos.

[0018] Em uma modalidade preferida o material contendo celulose é palha de milho. Em outro aspecto preferido, o material contendo celulose é fibra de milho.

Pré-tratamento

[0019] O material contendo lignocelulose pode ser pré-tratado de qualquer maneira adequada. Pré-tratamento é realizado antes da hidrólise e/ou fermentação. Em uma modalidade preferida o material pré-tratado é hidrolisado, preferivelmente enzimaticamente, após o pré-tratamento. O objetivo do pré-tratamento é separar e/ou liberar celulose, hemicelulose e/ou lignina e desta forma melhorar a velocidade da hidrólise. Métodos de pré- tratamento como oxidação a úmido e pré-tratamento alcalino visam à lignina, enquanto ácido diluído e auto-hidrólise visam à hemicelulose. Explosão de vapor é um exemplo de pré-tratamento que visa à celulose.

[0020] De acordo com a invenção, a etapa de pré-tratamento (a) pode ser uma etapa de pré-tratamento convencional usando técnicas bem conhecidas na arte. Em uma modalidade preferida, o pré-tratamento ocorre em lama aquosa. O material contendo lignocelulose pode estar presente durante o pré-tratamento em um montante entre 10-80 % em peso, preferivelmente entre 20-70 % em peso, especialmente entre 30-60 % em peso, como num montante de cerca de 50 % em peso.

[0021] O material contendo lignocelulose pode, de acordo com a invenção ser química, mecânica e/ou biologicamente pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. Tratamento mecânico (frequentemente referido como tratamento físico) pode ser usado sozinho ou em combinação com hidrólise subsequente ou simultânea, especialmente hidrólise enzimática.

[0022] Preferivelmente, o pré-tratamento químico mecânico e/ou biológico é realizado antes da hidrólise e/ou fermentação. Alternativamente, o pré-tratamento químico, mecânico e/ou biológico pode ser realizado simultaneamente com hidrólise, como simultaneamente com adição de uma ou mais enzimas celulase, ou outras atividades enzimáticas mencionadas abaixo, para liberar, por exemplo, açúcares fermentáveis, como glicose e/ou maltose.

[0023] O termo “tratamento químico” refere-se a qualquer pré- tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Exemplos de pré-tratamentos químicos adequados incluem tratamento com, por exemplo, ácido diluído, cal, tratamento alcalino, com solvente orgânico, amônia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono. Além disso, oxidação a úmido e hidrotermólise com pH controlado são também consideradas pré-tratamentos químicos.

[0024] Em uma modalidade preferida o pré-tratamento químico é tratamento ácido, mais preferivelmente, um tratamento contínuo de ácido diluído e/ou brando, como, tratamento com ácido sulfúrico, ou outro ácido orgânico, como ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas dos mesmos. Outros ácidos podem também ser usados. Tratamento ácido brando significa que o pH do tratamento fica na faixa de 1-5, preferivelmente pH 1-3. Em uma modalidade específica a concentração de ácido fica na faixa de 0,1 a 2,0 % em peso de ácido, preferivelmente ácido sulfúrico. O ácido pode ser posto em contato com o material contendo lignocelulose e a mistura pode ser mantida em uma temperatura na faixa de 160-220°C, como 165-195°C, por períodos na faixa de, por exemplo, 1-60 minutos, como 2-30 minutos ou 3-12 minutos. Adição de ácidos fortes como ácido sulfúrico, pode ser aplicada para remover hemicelulose. Isto aumenta a digestibilidade da celulose.

[0025] Outras técnicas são também contempladas. Tratamento de celulose por solvente mostrou converter cerca de 90% de celulose em glicose. Foi também mostrado que a hidrólise enzimática poderia ser grandemente melhorada quando a estrutura da lignocelulose é rompida. H2O2 alcalina, ozônio, organosolv (usa ácidos de Lewis, FeCl3, (Al)2SO4 em alcoóis aquosos), glicerol, dioxano, fenol, ou etileno glicol estão entre solventes conhecidos por romper a estrutura da celulose e promover a hidrólise (Mosier et al. Bioresource Technology 96 (2005), p. 673-686).

[0026] Pré-tratamento químico alcalino com base, por exemplo, NaOH, Na2CO3 e/ou amônia ou similar, é também contemplado de acordo com a invenção. Métodos de pré-tratamento usando amônia são descritos em, por exemplo, WO2006110891, WO200611899, WO200611900,WO2006110901 (que são aqui incorporados por referência)

[0027] Técnicas de oxidação a úmido envolvem o uso de agentes de oxidação, como: agentes de oxidação baseados em sulfito ou similares. Exemplos de pré-tratamentos por solvente incluem tratamento com DMSO (Dimetil Sulfóxido) ou similar. Pré-tratamento químico é geralmente realizado por 1 a 60 minutos, como de 5 a 30 minutos, mas pode ser realizado por períodos mais curtos ou mais longos de tempo dependendo do material a ser pré-tratado.

[0028] Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al. (2003) Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108, p. 69-85, Mosier et al. Bioresource Technology 96 (2005) 673-686, Ahring et al. em WO2006032282 e WO200160752, Foody et al. em WO2006034590, e Ballesteros et al. em publicação US no. 20020164730, cujas referências estão todas aqui incorporadas por referência.

[0029] O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a qualquer tratamento mecânico (ou físico) que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material contendo lignocelulose. Por exemplo, pré-tratamento mecânico inclui vários tipos de moagem, irradiação, cozimento por vapor/explosão de vapor, oxidação a úmido, e outros tratamentos hidrotérmicos.

[0030] Pré-tratamento mecânico inclui cominuição (redução mecânica do tamanho). Cominuição inclui moagem a seco, moagem a úmido e moagem em moinho de bolas vibratório. Pré-tratamento mecânico pode envolver alta pressão e/ou alta temperatura (explosão de vapor). Em uma modalidade da invenção alta pressão significa pressão na faixa de 2,07 MPa a 4,14 MPa, preferivelmente 2,76 a 3,45 MPa, como cerca de 3,10 MPa. Em uma modalidade da invenção alta temperatura significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a 300°C, preferivelmente de cerca de 140 a 235°C. Em uma modalidade preferida pré-tratamento mecânico é um sistema hidrolisador por pistola de vapor em processo em batelada que usa alta pressão e alta temperatura como definido acima. Um Sunds Hidrolyzer (disponível da Sunds Defibrator AB (Suécia) pode ser usado para isto.

[0031] Em uma modalidade preferida ambos os pré-tratamentos, químico e mecânico, são realizados. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver tratamento ácido diluído ou brando e tratamento com alta temperatura e/ou pressão. Os pré-tratamentos químico e mecânico podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, conforme desejado.

[0032] Assim, em uma modalidade preferida, o material contendo lignocelulose é submetido a ambos os tratamentos, químico e mecânico, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[0033] Em uma modalidade preferida um pré-tratamento mecânico é realizado antes de um pré-tratamento por explosão de vapor.

[0034] Em uma modalidade preferida o pré-tratamento é realizado como uma etapa de ácido diluído ou brando-explosão de vapor. Em outra modalidade preferida pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra de amônia (etapa de pré-tratamento AFEX).

[0035] Na presente invenção o termo ”pré-tratamento biológico” se refere a qualquer pré-tratamento biológico que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina do material contendo lignocelulose. Técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver a aplicação de microorganismos de solubilização de lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass (Pré-tratamento de biomassa), no Handbook on Bioethanol: Production and Utilization (Manual de bioetanol; produção e utilização), Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., e Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass (Tratamentos físico- químicos e biológicos para conversão enzimática / microbiana de biomassa lignocelulósica), Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review (Pré-tratamento de biomassa lignocelulósica: uma revisão), em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production (Conversão enzimática de biomassa para produção de combustíveis), Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources (Produção de etanol a partir de recursos renováveis), em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Avanços em Engenharia bioquímica / biotecnologia), Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., e Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of lignocellulosic hidrolysates for ethanol production (Fermentação de hidrolisados lignocelulósicos para produção de etanol), Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander, L., e Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art (Produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos: estado da arte), Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Processo de destoxificação de material contendo lignocelulose pré-tratado

[0036] Quando material contendo lignocelulose é pré-tratado, produtos de degradação que são tóxicos e ou inibitórios para enzimas e organismos fermentativos são produzidos. Estes compostos reduzem severamente tanto a taxa de hidrólise quanto de fermentação.

[0037] Destoxificação de material contendo lignocelulose pré-tratado para remover inibidores de enzimas e/ou um organismo fermentativo melhorará a hidrólise enzimática e/ou melhorará o desempenho do organismo fermentativo durante fermentação. Em outras palavras, destoxificação de acordo com a invenção resulta em um tempo de processo menor de “material contendo lignocelulose para produto de fermentação”.

[0038] Os inibidores são produtos de degradação de lignocelulose incluindo produtos de degradação de lignina, produtos de degradação de celulose e produtos de degradação de hemicelulose. Os produtos de degradação de lignina podem ser de natureza fenólica. Os produtos de degradação de hemicelulose incluem furanos oriundos de açúcares (como hexoses e/ou pentoses), incluindo xilose, manose, galactose, ramanose, e arabinose. Exemplos de hemiceluloses incluem xilano, galactoglucomanano, arabinogalactano, arabinoglucuronoxilano, glucuronoxilano, e seus derivados e combinações. Exemplos de compostos inibitórios, i.e., produtos de degradação de lignocelulose pré-tratada, incluem álcool benzílico 4-OH, benzaldeído 4-OH, ácido benzóico 4-OH, trimetil benzaldeído, ácido 2- furóico, ácido cumárico, ácido ferúlico, fenol, guaiacol, veratrol, pirogalol, pirogalol mono metil éter, vanilil álcool, vanilina, isovanilina, ácido vanílico, ácido isovanílico, ácido homovanílico, veratril álcool, veratraldeído, ácido verátrico, ácido 2-O-metil gálico, siringil álcool siringaldeído, ácido siríngico, ácido trimetil gálico, homocatecol, etil vanilina, creosol, p-metil anisol, anisaldeído, ácido anísico, furfural, hidroximetilfurfural, 5- hidroximetilfurfural, ácido fórmico, ácido acético, ácido levulínico, ácido cinâmico, coniferil aldeído, isoeugenol, hidroquinona, eugenol ou suas combinações.

[0039] De acordo com o primeiro, segundo e terceiro aspectos da presente invenção compostos tóxicos e/ou inibitórios a enzimas e/ou um organismo fermentativo são removidos do material contendo lignocelulose pré-tratada por lavagem com uma solução de lavagem. A solução de lavagem é preferivelmente uma solução de lavagem aquosa. A solução de lavagem pode ser uma solução substancialmente pura de água, ou água com um montante significativo de aditivos, por exemplo como um detergente e/ou um solvente orgânico para melhorar a extração e/ou solubilidade dos compostos tóxicos e/ou inibitórios a enzimas e/ou um organismo fermentativo. Um solvente orgânico adequado é etanol ou metanol.

[0040] A solução de lavagem é preferivelmente aplicada em uma temperatura de 5 a 70°C, preferivelmente de 10 a 50°C, e mais preferivelmente 15 a 30°C, por exemplo, em uma temperatura de 20 a 25°C.

[0041] A etapa de lavagem termina quando a solução de lavagem usada é separada do PCS lavado. A separação da solução de lavagem usada pode ser obtida por qualquer método adequado incluindo mas não limitado a drenagem, filtração, centrifugação e prensagem.

[0042] De acordo com o primeiro, segundo e terceiro aspectos da presente invenção a solução de lavagem usada é tratada para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor do organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa de lavagem. O tratamento regenera a solução de lavagem usada para criar uma solução de lavagem usável. Em uma modalidade preferida, a solução de lavagem usada é tratada colocando-a em contato com uma resina ou uma combinação de resinas. A combinação de resinas pode ser aplicada como uma mistura de duas ou mais resinas e/ou de duas ou mais resinas aplicadas uma após a outra. A resina pode ser uma resina com um grupo funcional polar, fracamente polar ou não polar. A resina pode ser um trocador de cátions fortemente ácido, um trocador de cátions fracamente ácido, um trocador de ânions fortemente básico, ou um trocador de ânions fracamente básico. Grupos funcionais preferidos incluem-SO3,- COOH,-N+(CH3)3,-N(CH3)2 e-NH2. A resina pode também ser uma resina de carvão; uma resina adequada pode ser selecionada do grupo que consiste de resinas D380, H103, AB-8, D101, NKA, NKA9, D301T, D296R e D401, que podem ser obtidas de NanKai Chemical Industry, Japão. Resinas particularmente preferidas são D380 e H103. Em uma modalidade preferida a solução de lavagem usada é tratada pondo-a em contato com carvão ativado.

[0043] Em uma modalidade preferida a solução de lavagem usada é passada através de uma coluna contendo a resina e/ou carvão ativado.Hidrólise

[0044] Antes e/ou simultaneamente com a fermentação o material pré-tratado e lavado contendo lignocelulose pode ser hidrolisado para romper a celulose e hemicelulose em açúcares e/ou oligossacarídeos.

[0045] O teor de sólidos secos durante a hidrólise pode ficar na faixa de 5-50 % em peso, preferivelmente de 10-40 % em peso, preferivelmente de 20-30 % em peso. Hidrólise pode, em uma modalidade preferida, ser realizada como um processo de alimentação em batelada onde o material contendo lignocelulose pré-tratado (substrato) é alimentado gradualmente, por exemplo a uma solução de hidrólise contendo enzima. O material contendo lignocelulose pré-tratado pode ser suprido à solução de hidrólise contendo enzima em uma ou mais bateladas distintas, como um ou mais fluxos contínuos distintos ou como uma combinação de uma ou mais bateladas distintas e um ou mais fluxos contínuos distintos.

[0046] Em uma modalidade preferida, hidrólise é realizada enzimaticamente. De acordo com a invenção o material contendo lignocelulose pré-tratado pode ser hidrolisado por uma ou mais hidrolases (classe EC 3 de acordo com a Nomenclatura de Enzimas), preferivelmente uma ou mais carbo-hidrases selecionadas no grupo que consiste de celulase, hemicelulase, amilase, como alfa-amilase, enzima geradora de carboidratos, como glucoamilase, esterase, como lipase, ou protease. Alfa-amilase, glucoamilase e/ou similar podem estar presentes durante hidrólise e/ou fermentação já que o material contendo lignocelulose pode incluir algum amido.

[0047] A(s) enzima(s) usada(s) para hidrólise é(são) capaz(ES) de converter direta ou indiretamente polímeros de carboidrato em açúcares fermentáveis que podem ser fermentados em um produto de fermentação desejado, como etanol.

[0048] Em uma modalidade preferida a carboidrase tem atividade de enzima celulase. Carboidrases adequadas são descritas na seção “Enzimas” abaixo.

[0049] Polímeros de Hemicelulose podem ser quebrados por hemicelulases e/ou hidrólise ácida para liberar seus componentes açúcar de cinco ou seis carbonos. Os açúcares de seis carbonos (hexoses), como glicose, galactose, arabinose, e manose, podem prontamente ser fermentados a, por exemplo, etanol, acetona, butanol, glicerol, ácido cítrico, ácido fumárico etc. por organismos fermentativos adequados incluindo levedura. Para fermentação de etanol é preferido levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, preferivelmente cepas que são resistentes a altos níveis de etanol, i.e., até, por exemplo, cerca de 10, 12 ou 15 vol. % de etanol ou mais, como 20 vol. % etanol.

[0050] Em uma modalidade preferida o material contendo lignocelulose pré-tratado é hidrolisado usando uma hemicelulase, preferivelmente uma xilanase, esterase, celobiase, ou combinação das mesmas.

[0051] Hidrólise pode também ser realizada na presença de uma combinação de hemicelulases e/ou celulases, e opcionalmente uma ou mais das outras atividades de enzima mencionadas na seção “Enzima” abaixo.

[0052] Tratamento enzimático pode ser realizado em um ambiente aquoso adequado em condições que podem ser prontamente determinadas por um especialista na arte. Em uma modalidade preferida hidrólise é realizada em condições adequadas, preferivelmente ótimas para a(s) enzimas em questão. Tempo de processo, temperatura e condições de pH adequados podem ser prontamente determinados por um especialista na arte da presente invenção. Preferivelmente, hidrólise é realizada em uma temperatura entre 25°C e 70°C, preferivelmente entre 40°C e 60°C, especialmente a cerca de 50°C. O processo é preferivelmente realizado em um pH na faixa de 3-8, preferivelmente pH 4-6, especialmente em pH de cerca de 5.

[0053] Preferivelmente, hidrólise é realizada em um período de 12 a 144 horas, preferivelmente de 16 a 120 horas, mais preferivelmente de 24 a 96 horas, como de 32 a 48 horas.

[0054] De acordo com a invenção hidrólise da etapa (c) e fermentação da etapa (d) podem ser realizadas simultaneamente (processo SHHF) ou sequencialmente (processo SHF).

Fermentação

[0055] De acordo com a invenção o material pré-tratado (e hidrolisado) contendo lignocelulose é fermentado por pelo menos um organismo fermentativo capaz de fermentar açúcares fermentáveis, como glicose, xilose, manose, e galactose direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado.

[0056] A fermentação se processa preferivelmente em um período de 8 a 96 horas, preferivelmente de 12 a 72, mais preferivelmente de 24 a 48 horas. Em uma modalidade a fermentação é realizada em uma temperatura entre 20 e 40°C, preferivelmente de 26 a 34°C, em particular em cerca de 32°C. Em uma modalidade o pH é de pH 3 a 6, preferivelmente de cerca de pH 4 a 5.

[0057] Contemplada de acordo com a invenção é hidrólise e fermentação simultâneas (simultaneous hidrolysis and fermentation (SHF)). Em uma modalidade não há um estágio de permanência separado para a hidrólise, significando que a(s) enzima(s) hidrolisantes e o organismo fermentativo são adicionados juntos. Quando a fermentação (por exemplo fermentação de etanol usando levedura Saccharomyces) é realizada simultaneamente com a hidrólise, a temperatura fica preferivelmente entre 26°C e 35°C, mais preferivelmente entre 30°C e 34°C, como em cerca de 32°C. Um programa de temperatura incluindo pelo menos dois estágios de permanência em diferentes temperatura pode ser aplicado de acordo com a invenção.

[0058] Durante a lavagem do material contendo lignocelulose pré- tratado, açúcares dissolvidos podem se acumular na solução de lavagem aquosa reciclada. estes açúcares podem ser separados e fermentados com um organismo fermentativo adequado. Como os açúcares dissolvidos conterão açúcares C5 oriundos da degradação da hemicelulose, como xilose, um organismo fermentativo preferido é capaz de converter açúcares C5 em um produto de fermentação desejado.

[0059] O processo da invenção pode ser realizado como um processo em batelada, alimentação em batelada ou como processo contínuo. Preferivelmente a etapa de fermentação é realizada como uma fermentação contínua. Recuperação Após a fermentação, o produto de fermentação pode ser separado do caldo da fermentação. O caldo pode ser destilado para extrair o produto de fermentação ou o produto de fermentação pode ser extraído do caldo de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração por membrana. Alternativamente o produto de fermentação pode ser recuperado por extração. Métodos de recuperação são bem conhecidos na arte.

Produtos de fermentação

[0060] O processo da invenção pode ser usado para produção de qualquer produto de fermentação. Produtos de fermentação especialmente contemplados incluem alcoóis (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO2); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios.

[0061] Produtos também contemplados incluem produtos industriais alcoólicos consumíveis, por exemplo, cerveja e vinho; produtos laticínios industriais, por exemplo, laticínios fermentados; produtos da indústria de couro e produtos da indústria do tabaco. Em uma modalidade preferida, o produto de fermentação é um álcool, especialmente etanol. O produto de fermentação, como etanol, obtido de acordo com a invenção, pode preferivelmente ser combustível álcool/etanol. Entretanto, no caso de etanol este pode ser usado como etanol potável.

Organismo fermentativo

[0062] O termo “organismo fermentativo” refere-se a qualquer organismo, inclusive organismos bacterianos e fúngicos, adequados para produção de um produto de fermentação desejado. Organismos fermentativos de acordo com a invenção especialmente adequados são capazes de fermentar, i.e., converter açúcares, como glicose, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Também adequados são organismos fermentativos capazes de converter açúcares C5 como xilose em um produto de fermentação desejado. Exemplos de organismo fermentativos incluem organismos fúngicos, especialmente levedura. Leveduras preferidas incluem cepas de Saccharomyces spp., em particular uma cepa de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum; uma cepa de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, como Pichia stipitis CBS 5773; uma cepa de Candida, em particular uma cepa de Candida utilis, Candida diddensii, ou Candida boidinii. Outra levedura contemplada inclui cepas de Zymomonas; Hansenula, em particular H. anomala; Klyveromyces, em particular K. fragilis; e Schizosaccharomyces, em particular S. pombe.

[0063] Leveduras comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, levedura ETANOL RED™ (disponível da Fermentis/Lesaffre, USA), FALI (disponível da Fleischmann’s Yeast, USA), levedura fresca SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponíveis da Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis da NABC- North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND (disponível da Gert Strand AB, Sweden), e FERMIOL (disponível da DSM Specialties). ANQI YEAST (disponível da Anqi yeast (CHIFENG) CO.LTD, China).

Enzimas

[0064] Embora não mencionado especificamente no contexto de um processo da invenção, deve ser entendido que as enzimas (bem como outros compostos) são usados em um “montante efetivo”.

Celulases

[0065] O termo “celulases” neste contexto é entendido como abrangendo as celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91), por exemplo, celobio- hidrolase I e celobio-hidrolase II, bem como as endo-glucanases (EC 3.2.1.4) e beta-glucosidases (EC 3.2.1.21).

[0066] Para ser eficiente, a digestão de celulose e hemicelulose exige vários tipos de enzimas agindo em cooperação. Pelo menos três categorias de enzimas são necessárias para converter celulose em açúcares fermentáveis: endo-glucanases (EC 3.2.1.4) que cortam as cadeias de celulose aleatoriamente; celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91) que clivam unidades celobiosila das extremidades da cadeia de celulose e beta-glucosidases (EC 3.2.1.21) que convertem celobiose e celodextrinas solúveis em glicose. Entre estas três categorias de enzimas envolvidas na biodegradação de celulose, celobio-hidrolases são as enzimas chave para a degradação de celulose cristalina nativa. O termo “celobio-hidrolase I” é aqui definido como uma atividade de celulose 1,4-beta-celobiosidase (também referida como exo- glucanase, exo-celobio-hidrolase ou 1,4-beta-celobio-hidrolase), como definido na classe de enzima EC 3.2.1.91, que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas na celulose e celotetraose, pela liberação de celobiose das extremidades não redutoras das cadeias. A definição do termo “atividade de celobio-hidrolase II” é idêntico, exceto pelo fato de que celobio-hidrolase II ataca a partir das extremidades redutoras das cadeias.

[0067] Endoglucanases (EC No. 3.2.1.4) catalisam endo hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas da celulose, derivados de celulose (como carbóxi metil celulose e hidróxi etil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanos mistos como beta-D-glucanos ou xiloglucanos de cereais e outros materiais de planta contendo partes celulósicas. O nome autorizado é endo-1,4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolase, mas o termo abreviado endoglucanase é usado no presente relatório.

[0068] As celulases podem conter um módulo de ligação de carboidrato (carbohydrate-binding module (CBM)) que promove a ligação da enzima a uma fibra contendo celulose e aumenta a eficácia da parte ativa catalítica da enzima. Um CBM é definido como uma sequência de aminoácidos contígua em uma enzima carboidrato-ativa com um discreto dobra tendo atividade de ligação de carboidrato. Para informação adicional de CBMs ver o CAZy internet server (Supra) ou Tomme et al., (1995) em Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Degradação enzimática de polissacarídeos insolúveis) (Saddler, J.N. & Penner, M., eds.), Celulose- binding domains: classification and properties (Domínios de ligação a celulose: classificação e propriedades). pp. 142-163, American Chemical Society, Washington.

[0069] A atividade de celulase pode, em uma modalidade preferida, ser derivada de uma fonte fúngica, como uma cepa do gênero Trichoderma, preferivelmente uma cepa de Trichoderma reesei; uma cepa do gênero Humicola, como uma cepa de Humicola insolens; ou uma cepa de Chrysosporium, preferivelmente uma cepa de Chrysosporium lucknowense.

[0070] Em uma modalidade preferida as celulases podem ter uma preparação como definida no pedido co-pendente Pedido US # 60/941 251, que é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade preferida a preparação de celulase inclui um polipeptídeo tendo atividade de melhoramento celulolítico (GH61A), preferivelmente o divulgado no WO2005074656. A preparação de celulase pode incluir adicionalmente uma beta-glucosidase, como a proteína de fusão divulgada em US 60/832 511. Em uma modalidade, a preparação de celulase também inclui uma CBH II, preferivelmente celobio-hidrolase II Thielavia terrestris CEL6A. Em uma modalidade, a preparação de celulase também inclui a preparação de enzimas celulase, preferivelmente aquela derivada de Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferida, a preparação de celulase é Preparação de Celulase A usada no Exemplo 1 divulgado no pedido US co-pendente # 60/941 251.

[0071] Em uma modalidade a celulase é o produto comercialmente disponível CELLUCLAST® 1.5L ou CELLUZYME™ (Novozymes A/S, Dinamarca).

[0072] A celulase pode ser adicionada para hidrolisar o material contendo lignocelulose pré-tratado. A celulase pode ser dosada na faixa de 0,1-100 FPU por grama de sólidos secos (dry solids (DS)), preferivelmente 0,5-50 FPU por grama de DS, especialmente 1-20 FPU por grama de DS.

Hemicelulases

[0073] Hemicelulose pode ser quebrada por hemicelulases e/ou hidrólise ácida para liberar seus componentes açúcar de cinco e seis átomos. Em uma modalidade da invenção o material derivado de lignocelulose pode ser tratado com uma ou mais hemicelulases.

[0074] Qualquer hemicelulase adequada para uso na hidrólise de hemicelulose pode ser usada. Hemicelulases preferidas incluem xilanases, arabinofuranosidases, acetil xilan esterase, feruloil esterase, glucuronidases, endo-galactanase, manases, endo ou exo arabinases, exo-galactanases, e misturas de dois ou mais dos mesmos. Preferivelmente, a hemicelulase para uso na presente invenção é uma hemicelulase exo-agente, e mais preferivelmente, a hemicelulase é uma hemicelulase exo-agente que tem a capacidade de hidrolisar hemicelulose em condições ácidas de pH abaixo de 7, preferivelmente pH 3-7. Um exemplo de hemicelulase adequada para uso na presente invenção inclui VISCOZYME™ (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca).

[0075] Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não redutores em alfa-L-arabinosídeos.

[0076] Galactanase (EC 3.2.1.89), arabinogalactan endo-1,4-beta- galactosidase, catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-D-galactosídicas em arabinogalactanas.

[0077] Pectinase (EC 3.2.1.15) catalisa a hidrólise de ligações 1,4- alfa-D-galactosidurônicas em pectato e outras galacturonanas.

[0078] Xiloglucanase catalisa a hidrólise de xiloglucano.

[0079] A hemicelulase pode ser adicionada em um montante efetivo para hidrolisar hemicelulose, como, em montantes de cerca de 0,001 a 05 % em peso de sólidos secos (DS), mais preferivelmente de cerca de 0,05 a 0,5 % em peso de DS.

Alfa-Amilase

[0080] De acordo com a invenção uma alfa-amilase pode ser usada. Em uma modalidade preferida a alfa-amilase é uma alfa-amilase ácida, por exemplo, alfa-amilase ácida fúngica ou alfa-amilase ácida bacteriana. O termo “alfa-amilase ácida ” significa uma alfa-amilase (E.C. 3.2.1.1) que adicionada em um montante efetivo tem uma atividade ótima em um pH na faixa de 3 a 7, preferivelmente de 3,5 a 6, ou mais preferivelmente de 4-5.

Alfa-Amilase Bacteriana

[0081] De acordo com a invenção a alfa-amilase bacteriana é preferivelmente derivada do gênero Bacillus.

[0082] Em uma modalidade preferida a alfa-amilase Bacillusé derivada de uma cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis ou B. stearothermophilus, mas pode também ser derivada de outras Bacillus sp. Exemplos específicos de alfa-amilases contempladas incluem a Bacillus licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO9919467, a alfa-amilase Bacillus amyloliquefaciens SEQ ID NO: 5 em WO9919467 e a alfa-amilase Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO9919467 (todas as sequências aqui incorporadas por referência). Em uma modalidade da invenção a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, preferivelmente de pelo menos 70%, com maior preferência de pelo menos 80%, com maior preferência ainda de pelo menos 90%, como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com quaisquer das sequências mostradas em SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3, respectivamente, em WO9919467.

[0083] A alfa-amilase Bacillus pode também ser uma variante e/ou híbrido, especialmente um dos descritos em qualquer um dos documentos WO9623873, WO9623874, WO9741213, WO9919467, WO0060059, e WO0210355 (todos aqui incorporados por referência). Variantes de alfa- amilase especificamente contempladas são divulgadas nas patentes nos. 6 093 562, 6 297 038 ou 6 187 576 (aqui incorporadas por referência) e incluem variantes de alfa-amilase Bacillus stearothermophilus (alfa-amilase de BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos nas posições R179 a G182, preferivelmente uma dupla deleção divulgada em WO1996023873 - ver, por exemplo, página 20, linhas 1-10 (aqui incorporada por referência), preferivelmente correspondente a delta(181-182) comparadas à sequência de aminoácidos de alfa-amilase de BSG do tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO:3 divulgada em WO9919467 ou deleção de aminoácidos R179 e G180 usando SEQ ID NO:3 em WO9919467 para numeração (cuja referência está aqui incorporada por referência). Ainda mais preferidas são alfa-amilases Bacillus, especialmente alfa-amilase Bacillus stearothermophilus, que têm uma dupla deleção correspondente a delta(181-182) incluindo adicionalmente uma substituição N193F (também representada por I181* + G182* + N193F) comparada à sequência de aminoácidos alfa-amilase BSG do tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO:3 divulgada em WO9919467.

Alfa-amilase Híbrida Bacteriana

[0084] Uma alfa-amilase híbrida especificamente contemplada inclui resíduos de aminoácidos 445 C-terminal da alfa-amilase Bacillus licheniformis (mostrada em SEQ ID NO: 4 de WO9919467) e os resíduos de aminoácidos 37 N-terminal da alfa-amilase derivada do Bacillus amylolique- faciens (mostrado na SEQ ID NO: 5 de WO9919467), com uma ou mais, especialmente todas, da seguinte substituição:

[0085] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (usando a numeração do Bacillus licheniformis da SEQ ID NO: 4 de WO9919467). Também preferidas são variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras espinhas dorsais de alfa-amilase de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferivelmente deleção de E178 e G179 (usando a numeração da SEQ ID NO: 5 de WO9919467).

Alfa-amilase Fúngica

[0086] Alfa-amilases fúngicas incluem alfa-amilases derivadas de uma cepa do gênero Aspergillus, como alfa-amilases Aspergillus oryzae, Aspergillus niger e Aspergillis kawachii.

[0087] Uma alfa-amilase fúngica ácida preferida é uma alfa-amilase similar a Fungamil que é derivada de uma cepa de Aspergillus oryzae. De acordo com a presente invenção, o termo "alfa-amilase similar a Fungamil " indica uma alfa-amilase que apresenta uma alta identidade, i.e. pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 de WO9623874.

[0088] Outra alfa-amilase ácida preferida é derivada de uma cepa Aspergillus niger. Em uma modalidade preferida a alfa-amilase fúngica ácida é uma dentre A. niger divulgada como “AMYA_ASPNG” no banco de dados Swiss-prot/TeEMBL sob o acesso primário no. P56271 e descrita em WO8901969 (Exemplo 3). Uma alfa-amilase fúngica ácida comercialmente disponível derivada de Aspergillus niger é SP288 (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca).

[0089] Outras alfa-amilases do tipo selvagem contempladas incluem aquelas derivadas de uma cepa dos gêneros Rhizomucor e Meripilus, preferivelmente uma cepa de Rhizomucor pusillus (WO2004055178 incorporada por referência) ou Meripilus giganteus.

[0090] Em uma modalidade preferida a alfa-amilase é derivada de Aspergillus kawachii e divulgada por Kaneko et al. J. Ferment. Bioeng. 81:292-298(1996) “Molecular-cloning and determination of the nucleotide- sequence of a gene encoding an acid-stable alfa-amilase from Aspergillus kawachii." (Clonagem molecular e determinação da sequência de nucleotídeos de um gene de codificação de uma alfa-amilase estável a ácido proveniente de Aspergillus kawachii); e mais tarde como EMBL:#AB008370.

[0091] A alfa-amilase fúngica pode também ser uma enzima do tipo selvagem contendo um domínio de ligação de amido (starch-binding domain (SBD)) e um domínio catalítico de alfa-amilase (i.e., não híbrido), ou uma variante da mesma. Em uma modalidade a alfa-amilase do tipo selvagem é derivada de uma cepa de Aspergillus kawachii.

Alfa-amilase Fúngica Híbrida

[0092] Em uma modalidade preferida a alfa-amilase fúngica ácida é uma alfa-amilase híbrida. Exemplos preferidos de alfa-amilases fúngicas híbridas incluem aquelas divulgadas em WO2005003311 ou Publicação de Patente U.S. no. 2005/0054071 (Novozymes) ou Pedido de Patente US no. 60/638,614 (Novozymes) que é aqui incorporada por referência. Uma alfa- amilase hibrida pode incluir um domínio catalítico (catalytic domain (CD)) de alfa-amilase e um domínio/módulo de ligação de carboidrato (carbohydrate- binding domain/module (CBM)), como um domínio de ligação de amido e opcionalmente um ligante.

[0093] Exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem aquelas divulgadas na Tabela 1 a 5 dos exemplos do pedido de patente US no. 60/638 614, incluindo variante Fungamil com domínio catalítico JA118 e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO:100 em US 60/638,614), alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante AMG e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO:101 em US 60/638,614), alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante glucoamilase e SBD de Aspergillus niger (que é divulgada na Tabela 5 como uma combinação de sequências de aminoácidos SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:72 e SEQ ID NO:96 no pedido US no. 11/316 535 e adicionalmente como SEQ ID NO: 13 aqui) ou como V039 na Tabela 5 em WO2006069290, e alfa-amilase de Meripilus giganteus com ligante glucoamilase e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO:102 em US 60/638,614). Outras alfa-amilases híbridas especificamente contempladas são quaisquer daquelas listadas nas Tabelas 3, 4, 5, e 6 do Exemplo 4 do pedido US no. 11/316 535 e WO2006069290 (aqui incorporado por referência)

[0094] Outros exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem aquelas divulgadas na Publicação de Patente U.S. no. 2005/0054071, incluindo aquelas divulgadas na Tabela 3 da página 15, como alfa-amilase de Aspergillus niger com ligante e domínio de ligação de amido de Aspergillus kawachii.

[0095] São contempladas também alfa-amilases que apresentam uma alta identidade com quaisquer das alfa-amilases acima mencionadas, i.e., pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até 100% de identidade com as sequências de enzima maduras.

[0096] Uma alfa-amilase ácida pode de acordo com a invenção ser adicionada em um montante de 0,1 a 10 AFAU/g DS, preferivelmente de 0,10 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g DS.

Produtos Alfa-amilase Comerciais

[0097] Composições comerciais preferidas contendo alfa-amilase incluem MYCOLASE da DSM, BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X e SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) e CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, e SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.), e a alfa-amilase fúngica ácida vendida com o nome comercial SP288 (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca).

Enzima Geradora de Fonte de Carboidratos

[0098] O termo “enzima geradora de fonte de carboidratos” inclui glucoamilase (sendo geradora de glicose), beta-amilase e amilase maltogênica (sendo geradoras de maltose). Uma enzima geradora de fonte de carboidratos é capaz de produzir um carboidrato que pode ser usado como uma fonte de energia pelo(s) organismo(s) fermentativo(s) em questão, por exemplo,quando usada em um processo da invenção para produzir um produto de fermentação, como etanol. O carboidrato gerado pode ser convertido direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado, preferivelmente etanol. De acordo com a invenção uma mistura de enzimas geradoras de fonte de carboidrato pode ser usada. Misturas especialmente contempladas são misturas de pelo menos uma glucoamilase e uma alfa- amilase, especialmente uma amilase ácida, com preferência maior ainda uma alfa-amilase fúngica ácida. A razão entre atividade de alfa-amilase fúngica ácida (AFAU) e atividade de glucoamilase (AGU) (AFAU por AGU) pode em uma modalidade da invenção ser de pelo menos 0,1, em particular de pelo menos 0,16, como na faixa de 0,12 a 0,50 ou mais.

Glucoamilases

[0099] Uma glucoamilase usada de acordo com a invenção pode ser derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo, derivada de um microorganismo ou uma planta. Glucoamilases preferidas são de origem fúngica ou bacteriana, selecionadas no grupo que consiste de glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilase de A. niger G1 ou G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), ou suas variantes, como as divulgadas em WO9200381, WO0004136 e WO0104273 (da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO8402921, glucoamilase de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), ou variantes ou fragmentos da mesma. Outras variantes de glucoamilase de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica aumentada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; e introdução de resíduos Pro na posição A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204.

[00100] Outras glucoamilases incluem glucoamilase de Athelia rolfsii (anteriormente designada como Corticium rolfsii) (ver patente US no. 4 727 026 e (Nagasaka,Y. et al. (1998) “Purification and properties of the raw- starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”(Purificação e propriedades de glucoamilases degradadoras de amido bruto de Corticium rolfsii), Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO9928448), Talaromyces leycettanus (Patente US no. Re. 32 153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (Patente US no. 4 587 215).

[00101] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135 138), e C. thermohidrosulfuricum (WO86/01831) e Trametes cingulata divulgada em WO2006069289 (que é aqui incorporada por referência).

[00102] Glucoamilases híbridas também são contempladas de acordo com a invenção. São exemplos as glucoamilases híbridas divulgadas em WO2005045018. Exemplos específicos incluem as glucoamilases híbridas divulgadas na Tabela 1 e 4 do Exemplo 1 (cujos híbridos são aqui incorporados por referência).

[00103] São também contempladas glucoamilases que exibem uma alta identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, i.e., pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até 100% de identidade com as sequências de enzimas maduras.

[00104] Composições contendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U e AMG™ E (da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300 (da Genencor Int.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (da DSM); G-ZYME™ G900, G- ZYME™ e G990 ZR (da Genencor Int.).

[00105] Glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas em um montante de 0,02-20 AGU/g DS, preferivelmente 0,1-10 AGU/g DS, especialmente entre 1-5 AGU/g DS, como 0,5 AGU/g DS.

Amilase maltogênica

[00106] A amilase pode também ser uma alfa-amilase maltogênica. Uma “alfa-amilase maltogênica” (glucan 1,4-alfa-malto-hidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina a maltose na configuração alfa. Uma amilase maltogênica de cepa Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 é comercialmente disponível da Novozymes A/S. Alfa-amilases maltogênicas são descritas nas Patentes US nos. 4 598 048, 4 604 355 e 6 162 628, que são aqui incorporadas por referência.

[00107] A amilase maltogênica pode, em uma modalidade preferida, ser adicionada em um montante de 0,05- 5 mg de proteína total/grama DS ou 0,05- 5 MANU/g DS.

Proteases

[00108] A protease pode de acordo com a invenção ser qualquer protease. Em uma modalidade preferida a protease é uma protease ácida de origem microbiana, preferivelmente de origem fúngica ou bacteriana.

[00109] Proteases adequadas incluem proteases microbianas, como proteases fúngicas e bacterianas. Proteases preferidas são proteases ácidas, i.e., proteases caracterizadas pela capacidade de hidrolisar proteínas em condições ácidas abaixo de pH 7.

[00110] Proteases ácidas fúngicas contempladas incluem proteases fúngicas derivadas de Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotiumand Torulopsis. Especialmente contempladas são proteases derivadas de Aspergillus niger (ver, por exemplo, Koaze et al., (1964), Agr. Biol. Chem. Japan, 28, 216), Aspergillus saitoi (ver, por exemplo, Yoshida, (1954) J. Agr. Chem. Soc. Japan, 28, 66), Aspergillus awamori (Hayashida et al., (1977) Agric. Biol. Chem., 42(5), 927-933, Aspergillus aculeatus (WO95/02044), ou Aspergillus oryzae, como protease pepA; e proteases ácidas de Mucor pusillus ou Mucor miehei.

[00111] São também contempladas proteases neutras ou alcalinas, como uma protease derivada de uma cepa de Bacillus. Uma protease particular contemplada para a invenção é derivada de Bacillus amyloliquefaciens etem a sequência obtenível em Swissprot as Accession No. P06832. Também contempladas são as proteases tendo pelo menos 90% de identidade a sequência de aminoácidos obtenível em Swissprot as Accession No. P06832 como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou particularmente pelo menos 99% de identidade.

[00112] Adicional,mente contempladas são as proteases tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos divulgada como SEQ.ID.NO:1 na WO2003048353 como de 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou particularmente pelo menos 99% de identidade.

[00113] Também contempladas são proteases semelhantes à papaína como proteases no interior de E.C. 3.4.22.* (protease cisteína), como EC 3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6 (quimopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaína), EC 3.4.22.14 (actinidaína), EC 3.4.22.15 (catepsina L), EC 3.4.22.25 (glicil endopeptidase) e EC 3.4.22.30 (caricaína).

[00114] Proteases podem ser adicionadas nos montantes de 0,1-1000 AU/kg dm, preferivelmente 1-100 AU/kg DS e no máximo da preferência de 5-25 AU/kg DS.

MATERIAIS & MÉTODOS Enzimas:

[00115] Preparação de Celulase A: Composição celulolítica contendo um polipeptídeo tendo atividade celulolítica melhorada (GH61A) divulgada em WO2005074656; uma beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (na proteína de fusão divulgada em US 60/832 511),, e uma preparação de enzimas celulolíticas derivada de Trichoderma reesei. Preparação de celulase A é divulgada no pedido co-pendente US # 60/941 251.

Determinação de identidade

[00116] O grau de relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrito pelo parâmetro “identidade”.

[00117] O grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinado pelo método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151- 153) usando o programa LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplo: penalidade por intervalo (gap penalty) de10 e penalidade por comprimento de intervalo (gap length penalty) de 10. Parâmetros de alinhamento em pares são Ktuplo=1, penalidade por intervalo=3, janelas=5, e diagonais=5.

[00118] O grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinado pelo método de Wilbur-Lipman (Wilbur e Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) usando o programa LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguinte parâmetros de alinhamento múltiplo: penalidade por intervalo de 10 e penalidade por comprimento de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamento em pares são Ktuplo=3, penalidade por intervalo =3, e janelas =20.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00119] Palha de milho foi pré-tratada usando explosão de vapor a 205°C por 5,4 min. Palha de milho pré-tratada (pretreated corn stover- PCS) 666 g com teor de sólidos secos (DS) de 38% foi misturada com 2L de solução aquosa de lavagem (razão em peso de água para PCS 3:1) e incubada com agitação por 30 minutos em temperatura ambiente. A solução de lavagem usada da PCS foi espremida através de 8 camadas de pano tipo gaze (cheese cloth) e filtrada através de 32 camadas de pano tipo gaze. Foram obtidos cerca de 1800 ml de solução de lavagem usada. A solução de lavagem usada foi tratada por incubação com 500 g de resina D380 (razão média de solução de lavagem usada para resina aproximadamente 3:1) em um béquer por 60 minutos com sacudimento. D380 é um trocador aniônico fracamente básico macroporoso. Antes do uso a resina foi lavada de maneira convencional. A solução de lavagem tratada foi reciclada para lavar uma nova batelada de 600g de PCS não lavado, seguindo-se separação, filtração, e tratamento de resina e reciclo para ainda uma lavagem. Esta solução de lavagem foi reciclada 5 vezes para lavar 5 bateladas de PCS não lavado. Como tratamento de controle solução de lavagem usada foi reciclada sem tratamento de resina 5 vezes. Aproximadamente 90% da solução de lavagem foi recuperada de cada lavagem. O tamanho da porção subsequente de PCS foi correspondentemente reduzida para manter uma razão em peso de água para PCS constante.

[00120] O PCS lavado foi submetido a um processo de hidrólise de alimentação em batelada partindo de uma batelada de hidrólise contendo 110 g de água e substrato com uma concentração inicial de sólidos secos de 12%. Penicilina foi adicionada para controlar contaminação bacteriana. Composição de celulase A foi utilizada para hidrólise enzimática em uma concentração de 138 EGU/g celulose. PCS lavado foi adicionado em 3 cargas adicionais até um peso final de 350 gramas e uma concentração final de sólidos secos de 25%. O processo de hidrólise com alimentação em batelada foi realizado a 50°C e pH 4,8. Não sendo especificado o tempo de hidrólise total foi de 96 horas. Os resultados são mostrados na tabela 1.

[00121] Os hidrolisados foram inoculados com levedura seca Anqi (0,5% p/p), 0,25% uréia e fermentados a 32°C por 6 dias. Os resultados são mostrados na tabela 2

.

[00122] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas aqui divulgadas, já que estas modalidades pretendem ser ilustrações de vários aspectos da invenção. Pretende-se incluir quaisquer modalidades equivalentes no escopo desta invenção. Na realidade, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, ficarão aparentes para o especialista na arte a partir da descrição anterior. Essas modificações pretendem também ser cobertas pelo escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições prevalecerá.

[00123] Várias referências são aqui citadas, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Exemplo 2

[00124] Palha de milho foi pré-tratada usando explosão de vapor a 200°C por 5,4 min. Palha de milho pré-tratada (PCS) 666 g com TS de 32,12 % foi misturada com 2L de solução aquosa de lavagem (razão em peso de água para PCS 3:1) e incubada com agitação por 30 minutos em temperatura ambiente. A solução de lavagem usada do PCS foi espremida através de 8 camadas de pano tipo gaze (cheese cloth) e filtrada através de 32 camadas de pano tipo gaze. Foram obtidos cerca de 1800 ml de solução de lavagem usada. A solução de lavagem usada foi tratada por incubação com 500 g de resina D380 e H103 (razão média de solução de lavagem usada para resina aproximadamente 3:1) em um béquer por 60 minutos com sacudimento. D380 é um trocador aniônico fracamente básico macroporoso, e H103 é uma resina não polar macroporosa. Antes do uso a resina foi lavada de maneira convencional. A solução de lavagem tratada foi reciclada para lavar uma nova batelada de 600g de PCS não lavado, seguindo-se separação, filtração, e tratamento de resina e reciclo para ainda uma lavagem. Esta solução de lavagem foi reciclada 5 vezes para lavar 5 bateladas de PCS não lavado. Como tratamento de controle, solução de lavagem usada foi reciclada sem tratamento de resina 5 vezes. Aproximadamente 90% da solução de lavagem foi recuperada de cada lavagem. O tamanho da porção subsequente de PCS foi correspondentemente reduzida para manter uma razão em peso de água para PCS constante.

[00125] O PCS lavado foi submetido a um processo de hidrólise de alimentação em batelada partindo de uma batelada de hidrólise contendo 50 g de água e substrato com uma concentração inicial de sólidos secos de 12,60%. Penicilina foi adicionada para controlar contaminação bacteriana. Composição de celulase A foi utilizada para hidrólise enzimática em uma concentração de 45 EP/g celulose. PCS lavado foi adicionado em 3 cargas adicionais até um peso final de 300 gramas e uma concentração final de sólidos secos de 30%. O processo de hidrólise com alimentação em batelada foi realizado a 50°C e pH 4,8. Amostras são retiradas em 72 horas, 96 horas, e 120 horas para análise de açúcar. Os resultados são mostrados na tabela 1.

[00126] Os hidrolisados foram centrifugados e filtrados por papel de filtro. O hidrolisado filtrado foi inoculado com levedura seca (0,5% p/p), 0,25% uréia e fermentado a 32°C por 7 dias. Os resultados são mostrados natabela 2.

Claims

1. Processo para converter um material contendo lignocelulose em um hidrolisado contendo mono- e oligossacarídeos, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de: a) submeter um material contendo lignocelulose a um pré- tratamento, b) lavar o material contendo lignocelulose pré-tratado em uma solução de lavagem, c) separar a solução de lavagem usada para obter um material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado, d) submeter o material contendo lignocelulose pré-tratado e lavado a uma hidrólise enzimática, resultando em pelo menos hidrólise parcial da celulose e/ou hemicelulose para obter um hidrolisado contendo mono- e/ou oligossacarídeos, e repetir continuamente as etapas (a) a (d), sendo que a solução de lavagem usada da etapa (b) é tratada por uma coluna compreendendo uma resina diretamente após a lavagem e separação para remover um inibidor de enzima e/ou um inibidor de um organismo fermentativo antes de ser reciclada para a etapa (b).

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o material contendo lignocelulose se origina de materiais selecionados no grupo consistindo de palha de milho, fibra de milho, madeira dura, como choupo e bétula, madeira macia, palha de cereais, como palha de trigo, panicum virgatum (grama de ponta), cascas de arroz, trigo, resíduo sólido municipal, resíduo orgânico industrial, papel de escritório, ou misturas dos mesmos.

3. Processo de acordo com quaisquer da reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato que o material contendo lignocelulose da etapa (a) é química e/ou mecanicamente pré-tratado.

4. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que o material contendo lignocelulose da etapa (a) é quimicamente pré-tratado usando ácido.

5. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato que o material contendo lignocelulose na etapa (a) é mecanicamente pré-tratado em alta temperatura e/ou alta pressão.

6. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato que o material contendo lignocelulose na etapa (a) é pré-tratado por explosão de vapor, oxidação a úmido e/ou explosão de vapor de ácido diluído.

7. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato que a solução de lavagem da etapa (b) inclui água, solvente orgânico ou uma mistura de água e solvente orgânico.

8. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato que a solução de lavagem aquosa usada da etapa (b) é tratada pondo-a em contato com uma coluna de resina antes de ser reciclada para a etapa (b).

9. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato que a resina compreende -NH2 como grupo funcional.

10. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato que inibidores de enzimas e/ou inibidores do organismo fermentativo são terpenos, aldeído, aromáticos poli-hidroxilados, álcool benzílico 4-OH, benzaldeído 4-OH, ácido benzóico 4-OH, trimetil benzaldeído, ácido 2-furóico, ácido cumárico, ácido ferúlico, fenol, guaiacol, veratrol, pirogalol, pirogalol mono metil éter, vanilil álcool, vanilina, isovanilina, ácido vanílico, ácido isovanílico, ácido homovanílico, veratril álcool, veratraldeído, ácido verátrico, ácido 2-O-metil gálico, siringil álcool, siringaldeído, ácido siríngico, ácido trimetil gálico, homocatecol, etil vanilina, creosol, p-metil anisol, anisaldeído, ácido anísico, ou suas combinações.

11. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a10, caracterizado pelo fato que hidrólise e/ou fermentação é realizada usando uma ou mais hidrolases selecionadas no grupo que consiste de celulase, hemicelulase, amilase, protease, esterase; como endoglucanase, beta- glucosidase, celobio-hidrolase, celobiase, xilanase, alfa-amilase, alfa- glucosidase, glucoamilase, proteases e lipases, ou uma mistura das mesmas.

12. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato que a hidrólise é realizada em uma temperatura entre 25°C e 70°C, preferivelmente entre 40°C e 60°C, especialmente em 50°C.

13. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato que a hidrólise é realizada em um pH na faixa de 3-8, preferivelmente pH 4-6, especialmente em pH 5.

14. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a13, caracterizado pelo fato que compreende adicionalmente por em contato o hidrolisado da etapa (d) com um organismo fermentativo para produzir um produto de fermentação.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato que a fermentação é realizada entre 25°C e 40°C, preferivelmente de 30 a 38°C, especialmente em 32°C.

16. Processo de acordo com quaisquer da reivindicação 14 ou15, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma etapa de recuperação do produto de fermentação, por exemplo, por destilação.

17. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a16, caracterizado pelo fato que o pH durante fermentação fica na faixa de 3-7, preferivelmente em pH 4-6, especialmente entre pH 4 e 5.

18. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a17, caracterizado pelo fato que o organismo fermentativo da etapa e) é uma levedura.

19. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato que o produto de fermentação é um álcool, preferivelmente etanol.

20. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato que o pH durante a fermentação fica na faixa de 3- 7, preferivelmente pH 4-6, especialmente entre pH 4 e 5.