BRPI0815946B1 - artigo de fabricação - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA TRATAR A ISQUEMIA, MÉTODO PARA TRATAR DERRAME, MÉTODO DE REPARAÇÃO DE UMA MEMBRANA CONJUNTIVA E ARTIGO DE MANUFATURA, um método de tratamento da isquemia em um indivíduo que precise é revelado; o método compreende a administração no indivíduo de uma quantidade de células aderentes terapeuticamente ativas de um tecido selecionado de um grupo que consiste de um tecido adiposo e de placenta tratando, dessa forma, a isquemia do indivíduo; um método para o tratamento de uma condição médica que exija a regeneração e/ ou o reparo do tecido conjuntivo também é revelado.

Description

CAMPO E HISTORICO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a metodos para tratar doencas utilizando celulas aderentes de tecido adiposo ou da placenta, mais especificamente, a metodos para tratar a isquemia e/ou condiçãoes medicas que exijam a regeneracao e/ou reparo do tecido conjuntivo utilizando celulas aderentes.

No mundo medico em desenvolvimento, existe uma necessidade crescente de grandes quantidades de celulas-tronco adultas para propositos de enxerto celular e engenharia tecidual. Alem disso, a terapia com celulas-tronco adultas esta em continuo desenvolvimento para o tratamento e a cura de diversas condiçãoes com disturbios hematopoieticos, doençãas cardçãacas, doençãa de Parkinson, doençãa de Alzheimer, acidente vascular cerebral, queimaduras, distrofia muscular, disturbios autoimunes, diabetes e artrite.

Nos ultimos anos, uma atividade se concentrou no potencial terapeutico das celulas estromais mesenquimais (MSCs) para diversas aplicaçãoes, incluindo o reparo tecidual de orgaos lesionados como o cerebro, o coratjao, os ossos e o figado e como suporte dos transplantes de medula ossea (BMT). As MSCs, uma populaqao heterogenea de celulas obtidas, por exemplo, da medula ossea, do tecido adiposo, da placenta e do sangue, sao 5 capazes de se diferenciar em tipos diferentes de celulas mesenquimais maduras (por exemplo, celulas reticulares endoteliais, fibroblastos, adipocitos, celulas osteogenicas precursoras) dependendo das influencias de diversos fatores bioativos. Dessa forma, as MSCs tem sido amplamente 10 estudadas na medicina regenerativa como a base para o desenvolvimento de novos tecidos como osso, cartilagem e gordura para o reparo de lesoes ou a substituiqao de tecidos patologicos e como tratamento para doenqas geneticas e adquiridas [Fibbe and Noort, Ann N Y Acad Sci (2003) 996: 15 235-44; Horwitz et al., Cytotherapy (2005) 7(5): 393-5; Zimmet and Hare, Basic Res Cardiol (2005) 100(6): 471-81].

Alem do mais, a capacidade multipotente das MSCs, seu facil isolamento e cultura, bem como seu elevado potencial de I expansao ex vivo fazem delas uma ferramenta terapeutica 20 atraente [Fibbe and Noort, supra; Minguell et al. Exp Biol Med (Maywood) (2001) 226(6): 507-20].

As MSCs derivadas da placenta exibem muitos marcadores comuns as MSCs isoladas de outros tecidos, por exemplo, CD105, CD73, CD90 e CD29, e a falta de 25 expressao de marcadores celulares hematopoieticos, endoteliais e trofoblasticos especfficos. A diferenciaqao adipogenica, osteogenica e neurogenica foi alcanqada depois da cultura de MSCs derivadas da placenta sob condipoes apropriadas [Yen et al., Stem Cells (2005) 23(1): 3-9]. Alem do mais, as MSCs isoladas da placenta e submetidas a cultura in vitro demonstraram ser imunes, privilegiadas de forma semelhante as MSCs. Assim, a placenta proporciona uma fonte 5 eticamente nao-controversa e facilmente acessivel e MSCs para aplicaqoes experimentais e clinicas [Zhang et al., Exp Hematol (2004) 32(7): 657-64].

Os presentes inventores planejaram previamente condipoes de cultura tridimensional (3D) adequadas para expansao das MSCs derivadas da placenta (Requerimento do PCT N° IL2007/000380) totalmente incorporadas aqui por referenda na Integra.

Usos clinicos de ponta das MSCs estao resumidos abaixo. Isquemia Doenq:a arterial periferica (DAP)

A doenqa arterial periferica (DAP) e uma doenqa cronica que progressivamente restringe o fluxo sanguineo nos membros, que pode levar a complicaqoes F medicas serias. Essa doenqa esta frequentemente associada com outras condiqoes clinicas, incluindo a hipertensao, a doenqa cardiovascular, a hiperlipidemia, o diabetes, a obesidade e o acidente vascular cerebral. A Isquemia Critica de Membro (ICM) e utilizada para descrever pacientes com dor, ulceras, perda de tecido ou gangrena no membro 25 induzidas pela isquemia cronica. A ICM representa o estagio final de pacientes com DAP que precisam de tratamento abrangente atraves de cirurgia vascular ou com um especialista vascular. Ao contrario da doenqa coronariana e da doenqa arterial cerebral, a doenqa arterial perif erica (DAP) continua sendo uma condiqao subapreciada que apesar de ser seria e extremamente predominante e raramente diagnosticada e ate mesmo menos frequentemente tratada.

Consequentemente, a ICM frequentemente leva a amputaqao ou a morte e as taxas de mortalidade em pacientes com DAP ultrapassam aquelas de pacientes com infarto do miocardio e acidente vascular cerebral.

Na tentative de tratar 10 condiqoes isquemicas, diversas celulas-tronco adultas tem sido utilizadas. Dessa forma, a cocultura de celulas estromais derivadas de tecido adiposo (ADSC) e celulas endoteliais (CE) resultou em um aumento significativo na viabilidade de CE, migraqao e formaqao de tubo 15 principalmente atraves da secreqao de VEGF e HGF. Quatro semanas apos o transplants das celulas estromais no membro traseiro de um camundongo isquemico, os escores angiogenicos melhoraram [Nakagami et al., J Atheroscler Thromb (2006) F 13(2): 77-81]. Moon et al. [Cell Physiol Biochem. (2006) 17: 20 279-90] testaram a capacidade das celulas progenitoras derivadas de tecido adipose (ADSC) de tratar a isquemia de membro em camundongos imunodeficientes e demonstraram um aumento significativo no indice de perfusao por laser Doppler no grupo transplantado com ADSC.

Alem disso, quando celulas-tronco mesenquimais derivadas do sangue do cordao umbilical (UCB) foram transplantadas em quatro homens com doenqa de Buerger que ja haviam recebido tratamento medico e terapias cirurgicas, a dor isquemica em repouso desapareceu repent inamente de suas extremidades afetadas [Kim et al., Stem Cells (2006) 24(6): 1620-6], Alem do mais, o transplante de celulas-tronco mesenquimais humanas isoladas 5 de membranas fetais de placenta a termo (FMhMSC) em coraqoes de ratos infartados foi associado com aumento da densidade capilar, normalizaqao da funqao ventricular esquerda, e diminuiqao significativa de tecido cicatricial, que melhorou quando as celulas-tronco foram pre-condicionadas com uma 10 mistura de ester de hialuronan com acido butirico e retinoico [Ventura et al., (2007) J. Biol. Chem., 282: 14243-52] .

Acidente Vascular Cerebral

O acidente vascular cerebral e uma das principals causas de morte no mundo, causando aproximadamente 9 % de todas as mortes e consumindo aproximadamente 2-4 % dos custos totais com o cuidado da saude. Embora tenha havido uma reduqao constante na F mortalidade por acidente vascular cerebral em paises 20 desenvolvidos, provavelmente devido a melhora do controle dos fatores de risco do acidente vascular cerebral (principalmente a pressao arterial elevada, o diabetes e o tabagismo) , o acidente vascular cerebral ainda causa lesao permanente (por exemplo, lesao tecidual, lesao neurological.

Novos regimes de tratamento para acidente vascular cerebral incluem a terapia com celulas-tronco. 0 transplante de celulas-tronco ou progenitoras no local lesionado, seja localmente ou por vias intravenosas, para substituir celulas nao funcionais, melhorar a proliferaqao e/ou a diferenciaqao de celulas- tronco endogenas ou celulas progenitoras e suprir os moduladores imunologicos necessaries, foi contemplado e e 5 considerado como sendo a maior estrategia baseada em celulas. Fontes potenciais de celulas-tronco/progenitoras para acidente vascular cerebral incluem celulas-tronco neurais fetais, celulas-tronco embrionarias, celulas neurais de teratocarcinoma, celulas-tronco nao-hematopoieticas 10 derivadas do sangue do cordao umbilical, celulas-tronco derivadas da medula ossea e celulas-tronco mesenquimais derivadas da placenta [Andres et al., Neurosurg Focus (2008) 24(3-4) : E16] .

Em um estudo recente, Koh et. al [Koh et al., Brain Res. (2008)] examinaram os efeitos neuroprotetores e mecanismos das celulas-tronco mesenquimais derivadas do cordao umbilical humano (hUC-MSCs) implantadas em um modelo de rato com acidente vascular cerebral F isquemico. Vinte dias depois da induqao da diferenciaqao 20 neuronal in vitro, as hUC-MSCs apresentaram caracteristicas morfologicas de neuronics e expressaram marcadores celulares neuronais e fatores neuronais (por exemplo, fator neurotrofico derivado da linha celular glial, fator neurotrofico derivado do cerebro). Adicionalmente, a 25 implantaqao in vivo de hUC-MSCs no hemisferio lesionado de rates imunossuprimidos com acidente vascular cerebral isquemico melhorou a funqao neurocomportamental e reduziu o volume de infarto com relaqao aos rates de controle. Tres semanas apos a implantapao, as hUC-MSCs estavam presentes no hemisferio lesionado e expressavam marcadores especificos dos neuronios, ainda, essas celulas nao se tornaram celulas neuronais funcionalmente ativas.

Aplicapoes ortopedicas

Diversas condipoes e patologias exigem a regenerapao e/ou o reparo de tecido conjuntivo (por exemplo, osso, tendao e ligamento). Elas incluem, por exemplo, fraturas osseas, queimaduras, 10 ferimentos causados por queimaduras, ferimento profundo, osso degenerado, diversos canceres associado com a perda do tecido conjuntivo (por exemplo, cancer osseo, osteosarcoma, metastases osseas), e defeito da cartilagem articular.uso de BM-MSCs autologas para melhorar a cicatrizapao ossea foi descrita para aplicapoes ortopedicas veterinarias e humanas e inclui a injepao percutanea de medula ossea para cicatrizapao de ligamento (Carstanjen et al., 2006), tratamento de defeitos P osseos atraves de autoenxertos e ou aloenxertos na clinica 20 ortopedica (Horwitz et al., 1999, Horwitz et al., 2002), regenerapao de defeito osseo criticamente dimensionado em caes utilizando MSCs derivadas da medula ossea alogenicas [Arinzeh TL, et al., J Bone Joint Surg Am. 2003, 85- A(10):1927-35] ou autologas [Bruder SP, et al., J Bone Joint Surg Am. 1998 Jul;80(7) :985-96] carregadas em um cilindro ceramico consistindo de hidroxiapatita-fosfato tricalcio, ou em coelhos utilizando MSCs alogenicas derivadas do sangue periferico (Chao et al., 2006.), e extensa formapao ossea utilizando o implante de MSCs em babuinos (Livingston et al, 2003).

Dentro do campo ortopedico equino, celulas-tronco mesenquimais da MO e de fontes 5 adiposas foram utilizadas experimentalmente para tratamento cirurgico de cistos osseos subcondrais, reparo de fratura ossea [Kraus and Kirker-Head,Vet Surg (2006) 35(3): 232-42] e reparo de cartilagem [Brehm et al., Osteoarthritis Cartilage (2006) 14(12): 1214-26; Wilke et al., J Orthop Res 10 (2007) 25(7): 913-25] e clinicamente no tratamento de lesoes induzidas pelo esforqo exagerado dos tendoes em cavalos. Alem disso, diferentes abordagens terapeuticas foram utilizadas para promover a cicatrizaqao do ligamento suspensor em cavalos (Herthel, 2001) . Herthel (2001) 15 demonstrou uma nova abordagem biologica para facilitar a cicatrizaqao do ligamento suspensor que envolve a injeqao intralesional de celulas-tronco autologas e componentes associados da medula ossea para estimular a regenerapao ynatural do ligamento.

Modelos de coelhos para tendoes lesionados mostraram que tecidos trades com MSC eram mais fortes e mais resistentes do que os tecidos naturais reparados (Gordeon et al., 2005). Alem disso, a semeadura de MSCs submetidas a cultura no espaqamento do tendao resultou 25 na melhora significativa da biomecanica do reparo (Young et al., 1998, Osiris Therapeutics, www.osiris.com).

O Condrogenio da Osiris(Celulas-Tronco Mesenquimais adultas) esta sendo testado em pacientes a firn de avaliar a seguranpa e a eficacia. Em animais tratados com MSC, o tecido meniscal removido cirurgicamente foi regenerado, a superficie cartilaginosa foi protegida e foi observada diminuipao da lesao articular 5 em comparapao com os animais de controle. Esses beneficios persistiram em modelos animais durante pelo menos um ano (Osiris Therapeutics, www.osiris.com).

RESUMO DA Invenção

De acordo com um aspecto de 10 algumas aplicapoes da presente invenção, apresenta-se um metodo para tratar a isquemia em um individuo que precise dele, o metodo compreendendo a administrapao de uma quantidade terapeuticamente eficaz de celulas aderentes de um tecido selecionado de um grupo que consiste de um tecido 15 adiposo e da placenta em um individuo tratando, dessa forma, a isquemia do individuo.

De acordo com um aspecto de algumas aplicapoes da presente invenção, apresenta-se um | metodo para tratar uma condipao medica que exija a 20 regenerapao e/ou o reparo em um individuo que precise dele, o metodo compreendendo a administrapao de uma quantidade terapeuticamente eficaz de celulas aderentes de um tecido selecionado de um grupo que consiste de um tecido adiposo e da placenta em um individuo tratando, dessa forma, a 25 condipao medica que exige a regenerapao e/ou o reparo do tecido conjuntivo do individuo.

De acordo com um aspecto de algumas aplicapoes da presente invenção, apresenta-se o uso de celulas aderentes de um tecido selecionado de um grupo que consiste de um tecido adiposo e da placenta para a fabricação de um medicamento identificado para tratamento de isquemia.

De acordo com um aspecto de algumas aplicapoes da presente invenção, apresenta-se o uso de celulas aderentes de um tecido selecionado de um grupo que consiste de um tecido adiposo e da placenta para a fabricação de um medicamento identificado para tratamento de 10 uma condipao medica que exija a regenerapao e/ou o reparo do tecido conjuntivo.

De acordo com um aspecto de algumas aplicapoes da presente invenção, apresenta-se um artigo de fabricação compreendendo um material de embalagem 15 que envolve um adesivo para uso no tratamento da isquemia, o material de embalagem embalando uma quantidade farmaceuticamente eficaz de celulas aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste de um tecido adiposo e da P placenta.

De acordo com um aspecto de algumas aplicapoes da presente invenção, apresenta-se um artigo de fabricação compreendendo um material de embalagem que envolve um adesivo para uso no tratamento de uma condipao medica que exija a regenerapao e/ou o reparo do 25 tecido conjuntivo, o material de embalagem embalando uma quantidade farmaceuticamente eficaz de celulas aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste de um tecido adiposo e da placenta.

De acordo com algumas aplicaqoes da presente Invenção, as celulas aderentes sao capazes de suprimir a reaqao imune do individuo.

De acordo com algumas 5 aplicaqoes da Invenção, pelo menos 10% das celulas aderentes estao em uma fase proliferativa.

De acordo com algumas aplicaqoes da Invenção, a isquemia e a doenqa arterial periferica (DAP).

De acordo com algumas aplicaqoes da Invenção, a doenqa arterial periferica (DAP) e a isquemia critica de membro (ICM).

De acordo com algumas aplicaqoes da Invenção, a isquemia inclui a isquemia do 15 sistema nervoso central (SNC).

De acordo com algumas aplicaqoes da Invenção, a isquemia e selecionada do grupo que consiste de doenqa arterial periferica, doenqa vascular isquemica, doenqa cardiaca isquemica, doenqa cerebral isquemica, doenqa renal isquemica e placenta isquemica.

De acordo com algumas aplicaqoes da Invenção, as celulas aderentes sao obtidas a partir de uma cultura tridimensional (3D) .

De acordo com algumas aplicaqoes da Invenção, a cultura tridimensional (3D) inclui um biorreator 3D.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, a cultura das celulas na cultura 3D e efetuada sob perfusao.

De acordo com algumas 5 aplicapoes da invenção, as condipoes de cultura da cultura tridimensional envolve um material aderente selecionado do grupo que consiste de um poliester e de polipropileno.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, a cultura das celulas e efetuada por 10 pelo menos 3 dias.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, a cultura das celulas e efetuada ate que pelo menos 10% das celulas estejam proliferando.

De acordo com algumas 15 aplicapoes da invenção, as celulas aderentes incluem uma expressao positiva do marcador selecionado do grupo que consiste de CD73, CD90, CD29 e CD105.

De acordo com algumas | aplicapoes da invenção, as celulas aderentes incluem uma 20 expressao negativa do marcador selecionado do grupo que consiste de CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CDllb, CD14, CD19, CD34 e CD79.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, as celulas aderentes incluem um 25 perfil de expressao essencialmente conforme descrito aqui.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, as celulas aderentes incluem celulas que compreendem um fenotipo da celula-tronco estromal.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, o fenotipo da celula-tronco estromal inclui a atividade de supressao da celula T.

De acordo com algumas 5 aplicapoes da invenção, o tecido conjuntivo inclui um tendao, um osso e/ou ligamento.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, a condipao medica que exige a regenerapao e/ou o reparo do tecido conjuntivo e selecionada 10 do grupo que consiste de fratura ossea, cancer osseo, ferimento por queimadura, defeito de cartilagem articular e ferimento profundo.

De acordo com algumas aplicapoes da invenção, a condipao medica e selecionada do 15 grupo que consiste de um cisto osseo subcondral, uma fratura ossea, osteoporose, osteoartrite, um osso degenerado, cancer osseo, uma lesao cartilaginosa, um defeito da cartilagem articular, uma doenpa degenerative do disco, uma osteogenese fimperfeita (01), uma queimadura, um ferimento por 20 queimadura, um ferimento profundo, uma cicatrizapao demorada, um tendao lesionado e um ligamento lesionado.

A menos que seja definido de outra forma, todos os termos tecnicos e cientificos utilizados aqui tem o mesmo significado que aquele que e 25 comumente compreendido por alguem com habilidade normal na arte a qual essa invenção pertence. Embora os metodos e materials semelhantes ou equivalentes aqueles descrito aqui possam ser utilizados na pratica ou para testar a invenção, metodos e materials adequados sao descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificapao da patente, incluindo as definipoes, controlarao. Alem disso, os materials, metodos e exemplos sao apenas ilustrativos e nao pretendem ser 5 limitantes.

BREVE DESCRIPAO DOS DESENHOS

A invenção e descrita aqui, apenas por intermedio de exemplos, com referenda aos desenhos que a acompanham. Agora, com referenda espedfica 10 aos desenhos em detalhe, deve-se enfatizar que as particularidades apresentadas estao na forma de exemplos e apenas para propositos de discussao ilustrativa das configurapoes da invenção, e sao apresentadas com o firn de proporcionar o que se acredita ser a descripao mais util e 15 prontamente entendida dos principles e dos aspectos conceituais da invenção. A este respeito, nenhuma tentative e feita para mostrar os detalhes estruturais da invenção mais detalhadamente do que o necessario para uma compreensao F fundamental da invenção, a descripao juntamente com os 20 desenhos tornando aparente para os conhecedores do assunto como as diversas formas da invenção podem ser aplicadas na pratica. Nos desenhos: as figuras 1A-G descrevem o microambiente semelhante ao 25 osso criado no sistema de biorreator contend transportadores 3-D. As Figuras 1A-B sao micrograficos de eletrons que descrevem a comparapao do osso natural (Figura 1A) e  estrutura do transportador 3D PluriX™ 7 dias apos a semeadura de celulas aderentes, imitando o microambiente osseo (Figura IB). As Figuras 1C-F sao micrograficos de eletrons que descrevem a matriz 3D PluriX™ semeada com celulas aderentes, produzidas a partir da medula ossea, 20 dias (Figuras 1C-D, ampliada X 150 e 250, respectivamente) e 40 dias (Figuras E-F, ampliada X 350 e 500, respectivamente) apos a semeadura. A Figura 1G e um diagrama do biorreator de fluxo pistonado 3D Plurix com partes separadas definidas por numeros: Reservatorio do meio de cultura (1) , suprimento de mistura gasosa (2), filtro (3), ponto de injeqao (4), coluna na qual os transportadores 3D sao colocados (5) monitor de fluxo (6), valvula de fluxo (6a), recipiente separador (7), analisadores de crescimento celular (8) ; bomba peristaltica (9), ponto de amostragem (10), eletrodo para mediqao de O2 dissolvido (11), eletrodo para mediqao de pH (12), sistema de controle (13), meio de crescimento fresco (14), meio de crescimento utilizado (15) ;a figura 2 e um grafico que descreve diferentes lotes de produqao de celulas aderentes (Lotes 5-8) originarios da placenta, cultivados em condiqoes de cultivo 3D dentro dos sistemas de biorreator. As celulas aderentes (2 X 106) foram semeadas no biorreator a uma densidade de 10000 - 15000 celulas/um transportador. Depois de uma cultura de 12 dias, as celulas aderentes 3D atingiram uma densidade entre 150.000 - 250.000 celulas/transportador ou 22,5-37,5 X 106 em um biorreator contendo 150 transportadores;as figuras 3A-B sao graficos de barras que descrevem a diferenqa nos niveis de expressao de marcadores de membrana expresses na placenta derivados de celulas aderentes 3D (roxo escuro) em comparaqao com marcadores de membrana em celulas placentarias submetidas a cultura em condiqoes convencionais de cultura 2D (roxo claro). As celulas aderentes sao cultivadas por 4-6 semanas em frascos (2D) ou por 2-3 semanas no sistema de biorreator, em transportadores de poliestireno (3D). Depois da colheita dos frascos ou dos transportadores, as celulas sao incubadas e ligadas a um painel de anticorpos monoclonais (MAb), que reconhecem os marcadores de membrana caracteristicos das celulas aderentes (Figura 3A), ou celulas hematopoieticas (Figura 3B). Observe a expressao significativamente maior dos marcadores de membrana das MSCs nas celulas submetidas a cultura 2D conforme demonstrado para os marcadores de membrana CD90, CD105, CD73 e CD2 9, em comparaqao com os marcadores de membrana das MSCs expresses em celulas aderentes submetidas a cultura 3D, principalmente o CD105 que apresentou 56% de expressao em celulas submetidas a cultura 3D vs. 87% nas celulas submetidas a cultura 2D (Figura 3A) . As celulas aderentes tanto da cultura 2D como da 3D, nao expressaram qualquer marcador de membrana hematopoietic© (Figura 3B); a figuras 4A-D sao graficos de barras que descrevem uma comparaqao dos niveis de proteinas nas celulas aderentes produzidas a partir da placenta submetidas a condiqoes de cultura 2D e 3D ou meio condicionado delas. As Figuras 4A-C descrevem niveis de ligante Flt-3 (Figura 4A) , IL-6 (Figura 4B) e SCF (Figura 4C) em pg/ml, normalizados para 1 X 106 celulas/ml, conforme analise realizada por ELISA, no meio condicionado de celulas aderentes submetidas a cultura 2D e 3D. Os resultados representam um de tres experimentos independentes. A Figura 4D mostra os niveis de expressao de diferentes proteinas celulares, analisadas por espectrometria de massa com amostras de proteinas marcadas com reagentes iTRAQ comparadas entre si. As amostras de proteina foram coletadas de celulas aderentes cultivadas sob condiqoes 2D (barras brancas) e 3D (barras cinzas) . A figura representa uma de duas replicas dos experimentos. Observe a diferenqa no nivel de expressao de algumas das proteinas nas celulas e no meio condicionado das condipoes de cultura 2D e 3D;as figuras 5A-D sao micrograficos que descrevem a capacidade de diferenciapao in vitro de celulasaderentes 3D derivadas da placenta em relapao aos osteoblastos. As celulas aderentes derivadas da placenta humana foram submetidas a cultura em meio de indupao osteogenic© (DMEM contendo 10% de FCS, 100 nM de dexametasona, 0,05 mM de acido ascorbico 2-fosfato, 10 mM de B-glicerofosfato) por um periodo de 3 semanas. As Figuras 5A-B mostram celulas que expressa a matriz calcificada, indicada por colorapao com Vermelho de Alizarina S. As Figuras 5C-D mostras celulas de controls, que nao foram tratadas com meio de indupao osteogenico e mantiveram um fenotipo semelhante ao fibroblasto e nao demonstrando F qualquer mineralizapao; a figura 6 e um grafico que descreve o percentual de celulas CD45+ humanas detectadas na medula ossea (MO) de camundongos NOD-SCID, tratados com quimioterapia (injepoes intraperitoneais de 25 mg/kg de busulfan por duas semanas consecutivas) 3,5 semanas depois do transplante. Celulas CD34 + (100.000) purificadas de celulas mononucleares derivadas de sangue do cordao, foram transplantadas sozinhas (5 camundongos, a)  cotransplantadas com 0,5 X 106 celulas aderentes derivadas da placenta submetidas a cultura em condipoes 2D (celula aderente 2D; 2 camundongos, b), ou celulas aderentes derivadas da placenta submetidas a cultura em condipoes 3D (celula aderente 3D), no biorreator PluriX™ (5 camundongos, c) . A MO foi, entao, coletada de femures e tibias de camundongos. As celulas humanas na MO foram detectadas por citometria de fluxo. 0 percentual de CD45 expressando celulas humanas foi determinado incubando-se as celulas com CD45-FITC anti-humano. Observe o percentual maior de celulas humanas (hCD45+) na medula ossea de camundongos cotransplantados com celula aderente 2D (b), bem como com celula aderente 3D (c) em comparapao com o percentual de celulas humanas nos camundongos tratados apenas com HSCs (a) . 0 maior enxertamento observado em camundongos tratados com celulas submetidas a cultura em celulas aderentes 3D em comparapao com camundongos tratados com celulas submetidas a cultura em celulas aderentes 2D indica uma vantagem terapeutica maior exclusiva das celulas aderentes submetidas a cultura 3D; as figuras 7A-B sao analises FACS de celulas CD45+ de enxerto humano em camundongos transplantados apenas com celulas CD34+ (Figura 7A) emcomparapao com celulas CD34+ juntamente celulas aderentes derivadas de tecido adiposo (Figura 7B). Observe o percentual significativamente maior de populaqao hematopoietica humana (hCD45+) (7A - 29%) em um camundongo transplantado com celulas aderentes derivadas de tecido adiposo em comparaqao com um camundongo tratado apenas com CD34 + humana (7B - 12%) ; a figura 8Ae um grafico de barras que descreve uma reaqao linfocitica mista realizada entre celulas mononucleares do sangue do cordao humano (CB), e quantidades iguais de celulas do sangue do cordao irradiadas (3000 Rad) (iCB), monocitos derivados do sangue periferico humano (PBMC), celulas aderentes derivadas da placenta submetidas a cultura 2D (2D) ou 3D (3D) , ou uma combinaqao de PBMC e celulas aderentes derivadas da placenta submetidas a cultura 2D e 3D (PBMC+2D e PBMC+3D). 0 tamanho da populaqao de celulas CB e representado pela captaqao de 3H- timidina (medida na CPM), que foi medida durante as ultimas 18 horas de cultura. A elevaqao na proliferaqao estimulada de celulas CB indica uma resposta imune de nivel mais elevado. Observe o nivel mais baixo de resposta imune exibido por celulas incubadas com celulas aderentes e, em particular, a reduqao da resposta imune das CBs aos PBMCs quando coincubadas com celulas aderentes. Foram cada reapao; realizadas tres replicas de a figura 8Be um fluxograma que descreve a produqao de celulas aderentes 3D a partir de placentas por Celligen™ (chamadas de celulas PLX-C); a figura 8Ce um diagrama de um recipiente e das portas do biorreator Celligen™ adaptados da pagina do The New Brunswick Scientific na internet; as figuras 9A-B descrevem uma analise do ciclo celular da 10 fabricaqao de celulas aderentes 3D por Plurix (chamadas de PLX, Figura 9B) e por Celligen (chamadas de PLX-C, Figura 9A) . As celulas foram fixadas em 70% de EtOH O.N, centrif ugadas e ressuspensas em uma soluqao de lodeto de Propidio (IP) e, entao, analisadas por FACS; as figuras 10A-C descrevem a expressao de marcadores tipicos de fibroblastos, mas nao a expressao de marcadores endoteliais tipicos na PLX-C. A Figura A descreve a expressao negative do marcador endotelial CD31; a Figura 10B descreve a expressao negativa do marcador endotelial KDR; e a Figura 10C descreve a expressao positive do marcador de fibroblasto humano (D7-FIB). Deve-se observar que os histogramas vermelhos para o Isotipo IgGl (FITC) representam o controle negative, enquanto os histogramas azuis representam as celulas coradas positivamente; as figuras 11A-D descrevem a expressao de moleculas estimu- lantes e coestimulantes sobre as celulas PLX-C. A Figura 11A descreve a expressao de CD80 em celulas PLX-C; a Figura 11B descreve a expressao de CD86 em celulas PLX-C; a Figura 11C descreve a expressao de CD40 em celulas PLX-C; e a Figura 11D descreve a expressao de HLA-A/B/C em celulas PLX-C. Foram preparados controles negativos com moleculas relevantes de fluorescencia para isotipo. Deve-se observar que os histogramas vermelhos indicam a populaqao de celulas expressando o marcador de PLX-C, os histogramas azuis indicam a populaqao de celulas expressando o marcador da medula ossea (MO), e os histogramas verdes indicam a populaqao de celulas expressando o marcador de celulas mononucleares (MNC); as figuras 12A-B descrevem a inibiqao da proliferaqao de linfocitos por PLX-C. A Figura 12A descreve os F testes de MLR realizados com 2 x 105 MNCs derivadas do sangue periferico (PB) (doador A) estimuladas com uma quantidade igual de MNCs irradiadas (3000 Rad) derivadas do PB (doador B) seguidos pela adiqao de quantidades crescentes de celulas PLX-C nas culturas. Tres replicas de cada grupo foram semeadas em placas de 96 popos. A taxa de proliferaqao foi medida atraves da incorporaqao de [3H] timidina; a Figura 12B descreve MNCs derivadas do sangue periferico (PB) estimuladas com ConA (1,5 mg/ml) . Quantidades crescentes de celulas PLX-C foram adicionadas as culturas. Tres replicas de cada grupo foram semeadas em placas de 96 popos. A 5 taxa de proliferapao foi medida atraves da incorporapao de [3H] timidina; as figuras 13A-C descreve a regulapao das PLX-C da secrepao de citocinas pro-inflamatorias e anti- inf lamatorias apos a cocultura com celulas do 10 sangue periferico. As Figuras 13A-B descrevem a secrepao de IFNy (Figura 13A) e TNFa (Figura 13B) apos a cocultura de MNCs derivadas de humanos (isoladas do sangue periferico) estimuladas com ConA com PLX-C; a Figura 13C 15 descreve a secrepao de IFNy, TNFa e IL-10 apos a cocultura de MNCs derivadas de humanos (isoladas do sangue periferico) estimuladas com LPS com PLX-C. Os sobrenadantes foram coletados e | submetidos a analise de citocinas utilizando-se o metodo ELISA; a figura 14descreve o vetor de expressao da luciferase utilizado para infectar as celulas PLX-C. 0 vetor de expressao Lv33 da OmicsLink foi utilizado aqui. 0 gene da Luciferase foi clonado 25 na ORF; a figura 15descreve a elevada expressao da luciferase pelas celulas PLX-C infectadas. As celulas foraminfectadas com o vetor de expressao da luciferase e visualizadas pelo sistema IVIS 48 horas apos a infecqao. Deve-se observar que as celulas apresentavam altos niveis de expressao da luciferase; as figuras 16A-D descrevem a injeqao de 2 x 106 de luciferase expressando celulas PLX-C em camundongos SCID/Bege. Um camundongo foi injetado IM [intramuscularmente] e um IV [intravenosamente]. Os camundongos injetados foram monitorados utilizando-se o sistema IVIS a firn de avaliar a biodistribuiqao de PLX-C in vivo. Sao apresentados os resultados do sistema IVIS do dia 1 (Figura 16A) , dia 4 (Figura 16B) , dia 6 (Figura 16C) e dia 22 (Figura 16D); a figura 17e um grafico que descreve o aumento de perfusao no quadril e na pata dos camundongos tratados com as celulas aderentes da invenção (chamadas de PLX-C) . A figura descreve a mediana do percentual de perfusao no quadril e na pata do camundongo. Os fluxos sanguineos no quadril e na pata foram medidos utilizando-se um laser Doppler sem contato de ambos os lados nos dias 0, 6, 9, 14 e 21 apos a operaqao (sao mostradas as mediqoes no dia 21). Os resultados sao expresses como a relaqao do fluxo sanguineo no membro isquemico com aquele do membro normal durante o experimento; a figura 18 e um grafico que descreve a avaliapao in vivo da funqao do membro e a lesao isquemica. Foi realizada uma avaliaqao semiquantitativa em serie do uso prejudicado do membro isquemico utilizando-se o seguinte sistema de classificaqao: 3 = arrasta a pata, 2 = sem arrastar, mas sem flexao plantar, 1 = flexao plantar, e 0 = flexao dos dedos para resistir a uma leve traqao da cauda; as figuras 19A-C descrevem o aumento da densidade capilar apos o tratamento com PLX-C. A Figura 19A descreve a densidade capilar em camundongos tratados com PBS; a Figura 19B descreve a densidade capilar em camundongos tratados com celulas PLX-C; a Figure 19C e um grafico de barras que descreve o numero de capilares por celulas musculares. Deve-se observar que o aumento da densidade capilar foi observado em camundongos tratados com PLX-C, mas nao em• camundongos de controle, apos a isquemia de membro induzida demonstrada por coloraqao capilar especifica; as figuras 20A-B descrevem a reduqao do estresse oxidativo e a inflamaqao edotelial apos a administraqao de PLX-C. A Figura 20A e um grafico de barras que descreve o estresse oxidativo (coloraqao para Nitrotirosina) ; e a Figura 20B e um grafico de barras que descreve a inflamaqao endothelial reduqao do estresse oxidativo e a inflamaqao endotelial sao notadas em camundongos tratados com PLX-C.

DESCRIÇÃO DAS APLICAQOES DA Invenção

A Invenção refere-se, em algumas aplicaqoes, a metodos para aumentar a angiogenese em um tecido e tratar a isquemia ou condiqoes medicas que exigem a regeneraqao e/ou o reparo do tecido conjuntivo utilizando celulas aderentes de tecidos adiposos e da 10 placenta.

Os principles e a operaqao da Invenção pode ser mais bem compreendida com o auxilio dos desenhos e das descriqoes que os acompanham.

Antes de explicar pelo menos 15 uma aplicaqao da Invenção detalhadamente, deve-se entender que a Invenção nao esta limitada neste requerimento aos detalhes estabelecidos na Descrição a seguir ou exemplificada pelos Exemplos. A Invenção e capaz de outras | aplicaqoes ou de ser praticada ou realizada de varias 20 formas. Tambem, deve-se entender que a fraseologia e a terminologia empregadas aqui tem o proposito de Descrição e nao devem ser consideradas como limitantes.

Ao reduzir a Invenção a pratica, os presentes inventores descobriram que as celulas aderentes da placenta ou de um tecido adiposo sao altamente eficientes no aumento da angiogenese em um tecido e no tratamento da isquemia e de condiqoes medicas que exijam a regeneraqao e/ou o reparo do tecido conjuntivo.

Conforme ilustrado abaixo e no Exemplo 1-8 da seqao de Exemplos que segue, os presences inventores foram capazes de expandir as celulas aderentes derivadas do tecido adiposo e da placenta, que incluem propriedades das celulas-tronco estromais. Descobriu-se que as celulas expandidas adequadamente sao viaveis, apos a criopreservaqao, conforme evidenciado por ensaios de aderencia e repopulaqao (veja o Exemplo 1) . Uma analise de citometria de fluxo de celulas aderentes derivadas da placenta descobriu um padrao distinto de expressao do marcador (veja as Figuras 3A-B). Conforme mostrado adicionalmente no Exemplo 6 da seqao de Exemplos que segue, o implante de celulas aderentes derivadas da placenta induziu significativamente o fluxo sanguineo no quadril e na pata (Figura 17) de camundongos sujeitos a ligaqao arterial (o modelo de membro posterior isquemico), aumentaram significativamente a funqao do membro (Figura 18) , aumentaram a densidade capilar (Figuras 19A-C) e reduziram o estresse oxidativo e a inflamaqao endotelial (Figuras 20A- B) .

Assim, de acordo com um aspecto da Invenção, apresenta-se um metodo para aumentar a angiogenese em um tecido. 0 metodo e efetuado atraves do contato do tecido com as celulas aderentes de um tecido selecionado do grupo que consiste da placenta e de um tecido adiposo aumentando, dessa forma, a angiogenese do tecido.

Conforme utilizada aqui, a frase "aumentando a angiogenese em um tecido" refere-se ao aumento (indupao, regulapao ascendente) do processo de gerapao de novos vasos sanguineos capilares em um tecido.

Conforme utilizada aqui, a frase "celulas aderentes" refere-se a uma populapao 5 homogenea ou heterogenea de celulas que sao dependentes de ancoragem, isto e, exigem a ligapao a uma superficie para crescerem in vitro.

Conforme utilizada aqui, a frase "tecido adiposo" refere-se a um tecido conjuntivo que 10 inclui celulas de gordura (adipocitos).

Conforme utilizado aqui, o termo "tecido da placenta" se refere a qualquer porpao do orgao feminino mamifero que reveste a parede uterina e durante a gravidez envelopa o feto, ao qual esta ligado 15 atraves do cordao umbilical. Apos o nascimento, a placenta e expelida (e e chamada de placenta pos-parto). Em uma aplicapao exemplar, a placenta refere-se a toda a placenta.

As celulas aderentes derivadas k da placenta ou do tecido adiposo podem ser propagadas 20 utilizando-se condipoes de cultura bidimensional ou tridimensional.

As condipoes para propagar celulas aderentes em cultura 2D sao descritas adicionalmente abaixo e na sepao de Exemplos que segue.

Conforme utilizada aqui, afrase "cultura tridimensional" refere-se a uma cultura na qual as celulas sao expostas a condipoes compativeis com o crescimento celular permitindo que as celulas crespam em mais de uma camada. Estima-se que o ambiente in situ de uma celula em um organismo vivo (ou um tecido) esteja localizado em uma arquitetura tridimensional. As celulas sao rodeadas por outras celulas. Elas sao mantidas em uma rede complexa . 5 de fibras em nanoescala da matriz extracelular que permite o estabelecimento de varios microambientes locais. Seus ligantes extracelulares mediam nao apenas a ligaqao a membrana basal mas, tambem, o acesso a uma variedade de vasos linfaticos. 0 oxigenio, os hormonios e nutrientes sao 10 levados para as celulas e os produtos de descarte sao eliminados. As condiqoes na cultura tridimensional da Invenção sao desenhadas para imitar esse ambiente conforme e exemplificado adicionalmente abaixo.

Estima-se que as condiqoes da cultura tridimensional sejam tais que permitam a expansao das celulas aderentes.termos "expandindo" e "expansao" referem-se a manutenqao | substancialmente sem diferenciaqao das celulas e, finalmente, ao crescimento celular, isto e, o aumento de uma populaqao celular (por exemplo, pelo menos 2 vezes) sem que haja diferenciaqao acompanhando esse aumento.

Conforme utilizados aqui, os termos "mantendo" e "manutenqao" referem-se a renovaqao celular substancialmente sem diferenciaqao, isto e, a populaqao celular substancialmente imobilizada sem que haja diferenciaqao acompanhando essa imobilizaqao.

Conforme mencionado, as celulas aderentes desse aspecto da invenção sao recuperadas de um tecido adiposo ou placentario.

Celulas placentarias podem ser obtidas de uma placenta a termo ou prematura. A placenta e preferivelmente coletada uma vez que ela tenha perdido o sangue. A placenta e preferivelmente perfundida por um periodo de tempo suficiente para remover as celulas residuais. Os termos "perfundir" ou "perfusao" utilizados 10 aqui, referem-se ao ato de fluir ou passar um liquido por ou atraves de um orgao ou tecido. O tecido placentario pode ser de qualquer mamifero; por exemplo, o tecido placentario e humano. Uma fonte conveniente de tecido placentario e uma placenta pos-parto (por exemplo, 1-6 horas); no entanto, a 15 fonte do tecido placentario ou celulas ou o metodo de isolamento do tecido placentario nao e critico para a invenção.

As celulas derivadas da k placenta podem ser obtidas tanto das partes fetais (isto e, 20 amnion ou partes internas da placenta, veja o Exemplo 1) e maternais (isto e, decidua basalis e decidua parietalis) da placenta. As amostras de tecido sao lavadas em um tampao fisiologico [por exemplo, solupao salina tamponada com fosfato (PBS) ou tampao de Hank]. Suspensoes de celulas 25 unicas sao feitas tratando-se o tecido com uma enzima digestiva (veja abaixo) e/ou fragmentando e lavando partes do tecido atraves de um filtro de nailon ou pipetando gentilmente (Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA) com meio de lavagem.

Celulas aderentes derivadas de tecido adiposo podem ser isoladas atraves de uma variedade de metodos conhecidos por conhecedores do assunto. Por exemplo, tais metodos estao descritos na Patente dos EUA N° 6.153.432. 0 tecido adiposo pode ser derivado de sitios omentais/viscerais, mamarios, gonadais ou de outro tecido adiposo. Uma fonte de tecido adiposo e o adiposo omental. Em humanos, o adiposo e tipicamente isolado por lipoaspiraqao.

Celulas aderentes isoladas do tecido adiposo podem ser derivadas tratando-se o tecido com uma enzima digestiva como a colagenase, a tripsina e/ou a dispase; e/ou concentraqoes de hialuronidase ou DNAse; e acido etilenodiaminotetracetico (EDTA); a temperaturas entre 25 - 50° C por periodos entre 10 minutos a 3 horas. Entao, as celulas podem ser passadas atraves de um filtro de malha de nailon ou gaze de algodao de 20 microns a 1 mm. Entao, as celulas sao submetidas a centrifugaqao diretamente em meio ou Ficoll ou Percoll ou outro gradiente particulado. As celulas sao centrifugadas a velocidades entre 100 a 3000 x g por periodos entre 1 minuto a 1 hora a temperaturas entre 450 °C (veja a Patente dos EUA N° 7.078.230).

Alem das celulas aderentes derivadas da placenta ou do tecido adiposo, a invenção tambem preve o uso de celulas aderentes de outras fontes celulares caracterizadas pelo fenotipo de celulas-tronco estromais (a ser adicionalmente descrito abaixo). As fontes teciduais das quais as celulas aderentes podem ser recuperadas incluem, mas nao se limitam, ao sangue do cordao, ao escalpo, foliculos capilares [por exemplo, conforme descrito na Patente dos EUA App. 20060172304],testiculos [por exemplo, conforme descrito em Guan K., et * 5 al., Nature. 2006 Apr 27;440(7088):1199-203], mucosa . olfativa humana [por exemplo, conforme descrito em Marshall, CT., et al., Histol Histopathol. 2006 Jun;21(6) : 63 3-43] , saco vitelino [por exemplo, conforme descrito em Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8 ; 427(6970) : 148 - 54] e do liquido amniotico 10 [Pieternella et al. (2004) Stem Cells 22:1338-1345], todos conhecidos por incluirem celulas-tronco mesenquimais. Celulas aderentes dessas fontes teciduais podem ser isoladas atraves da cultura das celulas em uma superficie aderente isolando, dessa forma, as celulas aderentes de outras 15 celulas na populaqao inicial.

Independents da origem (por exemplo, placenta ou tecido adiposo) , a recuperaqao celular e preferivelmente efetuada sob condiqoes estereis. Uma vez . obtidas celulas isoladas, elas podem aderir a um material 20 aderente (por exemplo, configurado como uma superficie) para, assim, isolar as celulas aderentes. A cultura pode ser realizada sob condiqoes 2D conforme descrito no Exemplo 4 da sec;ao de Exemplos e as celulas podem ser transferidas adicionalmente para condiqoes 3D.

Conforme utilizado aqui, "um material aderente" refere-se a um material sintetico, que ocorre naturalmente ou uma combinaqao do mesmo, de um material nao-toxico (isto e, biologicamente compativel) com estrutura quimica (por exemplo, grupos expostos a uma superficie carregada) que pode reter as celulas na superficie.

Exemplos de materials aderentes que podem ser utilizadas de acordo com esse aspecto da Invenção incluem, mas nao se limitam, ao poliester, polipropileno, polialquileno, polifluorocloroetileno, um cloreto polivinilico, poliestireno, polissulfona, acetato de celulose, fibra de vidro, partfcula ceramica, matrigel, um componente da matriz extracelular (por exemplo, fibronectina, condronectina, laminina), colageno, acido poli-L-latico e uma fibra metalica inerte.

Etapas adicionais de purificaqao ou enriquecimento para celulas-tronco estromais podem ser efetuadas utilizando metodos bem conhecidos na arte (como por FACS utilizando a expressao do marcador da celula-tronco estromal, conforme descrito adicionalmente abaixo).

Exemplos nao-limitantes de meio base util na cultura de acordo com a Invenção incluem o Meio Minimo Essencial de Eagle, ADC-1, LPM (livre de Albumina Serica Bovina), FIO(HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, Meio BGJ (com e sem Modificaqao de Fitton- Jackson), Meio Basal de Eagle (BME-com adiqao de base salina de Earle) , Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM-sem soro), Yamane, IMEM-20, Meio de Eagle Modificado de Glasgow (GMEM) , Meio Leibovitz L-15, Meio 5A de McCoy, Meio M199

(M199E-com base salina de Earle), Meio M199 (M199H-com base salina de Hank), Meio Minimo Essencial de Eagle (MEM-E-com base salina de Earle), Meio Minimo Essencial de Eagle (MEM- H-com base salina de Hank) e Meio Minimo Essencial de Eagle ’ 5 (MEM-NAA com aminoacidos nao-essenciais), entre varios - outros, incluindo o meio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams’ G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Um meio preferido para uso na 10 invenção e o DMEM. Esses e outros meios uteis estao disponiveis de GIBCO, Grand Island, N.Y., EUA e Industrias Biologicas, Bet HaEmek, Israel, entre outros. Uma variedade desses meios esta resumida em Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62 72, editado por William B. 15 Jakoby e Ira H. Pastan, publicado pela Academic Press, Inc.

O meio pode ser suplementado, por exemplo, com soro, como o soro fetal bovino ou de outras especies e, opcionalmente ou alternativamente, fatores de crescimento, vitaminas (por exemplo, acido ascorbico), 20 citocinas, sais (por exemplo, B-glicerofosfato), esteroides (por exemplo dexametasona) e hormonios por exemplo, hormonio de crescimento, eritropoietina, trombopoietina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, fator estimulante de colonia de macrofagos, ligante c-kit/fator de celula-tronco, 25 ligante da osteoprotegerina, insulina, fatores de crescimento semelhantes a insulina, fator de crescimento epidermico, fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento nervoso, fator neurotrofico ciliar, fator de crescimento derivado de plaquetas e proteina morfogenetica ossea em concentrapoes entre niveis de picograma/ml a miligrama/ml.

Reconhece-se ainda que componentes adicionais podem ser adicionados ao meio de cultura. Tais componentes podem ser antibioticos, antimicdticos, albumina, aminoacidos e outros componentes conhecidos na arte da cultura celular. Adicionalmente, e possivel adicionar componentes para melhorar o process© de diferenciapao, quando necessario (veja abaixo).

Estima-se que no caso de as celulas aderentes da invenção serem administradas a um individuo humano, as celulas e o meio de cultura (por exemplo, com os aditivos de meios descritos acima) devem ser substancialmente xeno-free, isto e, desprovidos de qualquer contaminante animal, por exemplo, o micoplasma. Por exemplo, o meio de cultura pode ser suplementado com substituipao de soro, soro humano e/ou sintetico ou fatores recombinantemente produzidos.

Conforme mencionado, uma vez que as celulas aderentes estejam disponiveis, elas podem ser submetidas a cenarios bidimensionais ou tridimensionais (veja os Exemplos 1 e 4 da sepao de Exemplos, que segue) . Estima-se, no entanto, que as celulas possam ser transferidas para uma matriz configurada 3D imediatamente apos o isolamento ou que, alternativamente, possam ser passadas para cenarios tridimensionais apos condipoes bidimensionais (conforme mencionado acima).

Dessa forma, o material aderente desse aspecto da invenção e configurado para cultura 3D proporcionando, assim, uma matrix de crescimento que aumenta susbstancialmente a superficie de ligapao 5 disponivel para a aderencia das celulas de forma a imitar a infraestrutura do tecido (por exemplo, a placenta).

Para produpao em grande escala a cultura pode ser efetuada em um biorreator 3D.

Exemplos desses biorreatores 10 incluem, mas nao se limitam, a um biorreator de fluxo pistonado, um biorreator de tanque continuamente agitado, um biorreator de leito fixo, um sistema biorreator CelliGen Plus® (New Brunswick Scientific (NBS)) ou um sistema biorreator BIOFLO 310 (New Brunswick Scientific (NBS)).

Conforme mostra o Exemplo 4 da sepao de Exemplos, o biorreator Celligen e capaz de expandir as celulas aderentes 3D sob condipoes controladas (por exemplo, pH, temperatura e niveis de oxigenio) e com perfusao constante do meio de crescimento celular. Alem 20 disso, as culturas celulares podem ser monitoradas diretamente quanto aos niveis de concentrapao de glicose, lactato, glutamina, glutamato e amonio. A taxa de consume de glicose e a taxa de formapao de lactato das celulas aderentes permitem medir a taxa de crescimento celular e 25 determinar o moment© da colheita.

Outros biorreatores 3D que podem ser utilizados com a invenção incluem, mas nao estao limitados, a um biorreator de tanque continuamente agitado,onde um meio de cultura e continuamente alimentado no biorreator e um produto e continuamente retirado a firn de manter um estado de equilibrio constante em termos de tempo dentro do reator. Um biorreator de tanque agitado com um 5 ceto de leito fibroso esta disponivel, por exemplo na New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ. Um biorreator de leito fixo, um biorreator tipo air-lift, onde o ar e tipicamente alimentado na parte inferior de um de um tubo central, soprando formando bolhas, e removendo o gas exalado na parte 10 superior da coluna, um biorreator de perfusao de semeadura celular com espumas Poliativas [conforme descrito em Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)] andaimes porosos tubulares de acido poli-L-latico tubular (PLLA) em um biorreator de perfusao de fluxo Radial [conforme 15 descrito em Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93 (5) : 947-954 (2006) ] . Outros biorreatores que podem ser utilizados de acordo com a invenção estao descritos nas Patentes dos EUA N°s 6.277.151, 6.197.575, 6.139.578, 6.132.463, 5.902.741 e 20 5.629.186.

A semeadura celular e efetuada preferivelmente com 100.000-1.500.000 celulas/mm na semadura. Em uma aplicaqao exemplar, um total de 150 + 30 x 106 celulas sao semeadas, 3-5 x 106 celulas/gr de 25 transportador sao semeados, ou 0,015-0,1 x 10b celulas / ml sao semeadas.

As celulas podem ser colhidas quando pelo menos aproximadamente 10% das celulas estiverem proliferando evitando a diferenciaqao e a senescencia descontroladas.

A cultura e efetuada por pelo menos aproximadamente 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 10 5 dias, 20 dias, um mes ou ate mais. Estima-se que a cultura em um biorreator possa prolongar esse periodo. A cultura de celulas aderentes em cultura 3D pode ser efetuada sob fluxo continuo de um meio de cultura. Pode-se, tambem, efetuar a passagem para aumentar o numero de celulas. Estima-se que o 10 meio de cultura possa ser modificado a firn de prolongar e melhorar as condiqoes de cultura.

A celulas aderentes de algumas aplicaqoes da presente Invenção incluem pelo menos aproximadamente 10 %, 28 %, 30 %, 50 %, 80 % ou mais celulas 15 proliferativas (conforme e posslvel testar por FACS monitorando as fases S e G2/M).

As celulas aderentes de algumas aplicaqoes da Invenção podem incluir pelo menos um F "fenotipo de celula-tronco estromal".

Conforme utilizado aqui, "um fenotipo de celula-tronco estromal" refere-se a um fenotipo estrutural ou funcional tipico de uma celula-tronco estromal derivada da medula ossea (isto e, mesenquimal).

Conforme utilizada aqui, a frase "celula-tronco" refere-se a uma celula que nao e diferenciada terminalmente.

Dessa forma, por exemplo, as celulas podem ter a forma de um eixo. Alternativamente ou adicionalmente, as celulas podem expressar um marcador ou uma colepao de marcadores (por exemplo, um marcador de superficie) tipicos das celulas-tronco estromais. Exemplos de marcadores de superficie (positivos e negativos) de celulas-tronco estromais incluem, mas nao se limitam a CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD3-, CD4-, CD34-, CD45, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CD11B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR-, e FMC7-. Outros marcadores de celulas-tronco estromais incluem mas nao se limitam a tirosina hidroxilase, nestina e H-NF.

As celulas aderentes de tecido placentario geradas de acordo com os presentes ensinamentos apresentam um perfil de expressao genetica essencialmente conforme descrito no Exemplo 4 da sepao de Exemplos, que segue.

Exemplos de fenotipos funcionais tipicos de celulas-tronco estromais incluem, mas nao se limitam a atividade de supressao da celula T (nao estimular as celulas T e suprimi-las inversamente) , atividade de suporte da celula-tronco hematopoietica, bem como qualquer diferenciapao adipogenica, hepatogenica, osteogenica e neurogenica.

Quaisquer dessas caracteristicas estruturais e funcionais podem ser utilizada para quantificar as celulas da invenção (veja o Exemplo 4 da sepao de Exemplos, que segue).

Populapoes de celulas geradas de acordo com os presentes ensinamentos sao caracterizadas por um perfil de expressao de protefna exclusivo, conforme mostra o Exemplo 1 da sepao de Exemplos. Dessa forma, por exemplo, as celulas aderentes de tecido placentario ou adiposo geradas de acordo com os presentes ensinamentos sao 5 capazes de expressar e/ou secretar altos niveis de fatores selecionados. Por exemplo, essas celulas expressam ou secretam SCF, Flt-3, familia de histonas H2A (H2AF) ou Aldeido desidrogenase X (ALDH X) pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou ate mesmo 12 vezes mais do que aquelas 10 expressas ou secretadas por celulas aderentes de tecido placentario ou adiposo cultivadas em uma cultura 2D. Adicionalmente ou alternativamente, a populapao de celulas da invenção secretam ou expressam IL-6, fator 2 de alongamento da tradupao eucariotica (EEEF2), reticulocalbina 15 3, dominio EF de ligapao ao calcio (RCN2) ou calponina 1 de musculo liso basico (CNN1) a um nivel minimo 2, 3 ou 5 vezes maior do que aquele expresso ou secretado pelas celulas aderente de tecido placentario ou adiposo cultivadas em uma cultura 2D. Adicionalmente ou alternativamente, a populapao 20 de celulas da invenção e caracterizada por um nivel mais baixo de expressao de diversas outras proteinas em comparapao com as celulas submetidas a cultura 2D. Assim, por exemplo, essas celulas expressam ou secretam menos de 0,6, 0,5, 0,25 ou 0,125 do nivel de expressao de ribonucleoproteina nuclear heterogenea Hl (Hrnphl),precursor da isoforma 2 do antigeno CD44, isoforma 2 da sintase de 2 fosfoadenosina 5 fosfosulfato (Papss2) ou protefna ribossomica L7a (rpL7a) expressa ou secretada por celulas aderentes de tecido placentario ou adiposo cultivados em uma cultura 2D.

Conforme mostram os Exemplos 3-4 da seqao de Exemplos que segue, descobriu-se que as celulas aderentes e, principalmente, as celulas aderentes 3D, suprimem a reaqao imune das celulas mononucleares do sangue do cordao humano em um ensaio de reaqao mista de linfocitos (MLR) exibindo, dessa forma, atividades biologicas que podem ser preferencialmente utilizadas na clinica (por exemplo, a atividade de supressao da celula T, a atividade de suporte da celula-tronco hematopoietica).

De acordo com uma aplicaqao da Invenção, as celulas aderentes da Invenção sao capazes de suprimir a reaqao imune de um individuo.

Conforme utilizada aqui, a frase "suprimir a reaqao imune de um individuo" refere-se a diminuiqao ou a inibiqao da reaqao imune que ocorre em um individuo em resposta a um antigeno (por exemplo, uma celula estranha ou uma parte dela) . A resposta imune que pode ser suprimida pelas celulas aderentes incluem as respostas imunes humorais e as respostas imunes celulares, que envolvem o reconhecimento especifico de antigenos patogenicos atraves dos anticorpos e dos linfocitos T (proliferaqao de celulas T), respectivamente.

De acordo com uma aplicaqao da Invenção, as celulas aderentes da Invenção sao caracterizadas por uma atividade imunossupressora maior do que aquela das celulas aderentes da placenta ou do tecido adiposo cultivadas em uma cultura bidimensional (2D) .

De acordo com uma aplicapao da invenção, a atividade imunossupressora inclui a redupao da proliferapao da celula T.

Conforme mencionado acima e descrito no Exemplo 6 da sepao de Exemplos que segue, as celulas aderentes da invenção induziram a angiogenese in vivo (por exemplo, o fluxo sanguineo do quadril e da pata), melhoraram significativamente a funpao do membro de animais submetidos a ligapao arterial, aumentaram a densidade capilar e reduziram o estresse oxidativo e a inflamapao endotelial. Adicionalmente, conforme descrito detalhadamente no Exemplo 7 da sepao de Exemplos que segue, as celulas aderentes da invenção melhoraram significativamente a recuperapao do acidente vascular cerebral em um modelo de rato.

Assim, de acordo com outro aspecto da invenção, apresenta-se um metodo para tratar a isquemia em um individuo que precisa dele. 0 metodo e efetuado administrando-se de uma quantidade terapeuticamente eficaz de celulas aderentes da invenção em um individuo tratando, dessa forma, a isquemia do individuo.

O termo "isquemia" conforme e utilizado aqui, refere-se a qualquer patologia (doenpa, condipao, sindrome ou disturbio) caracterizada ou associada com angiogenese insuficiente. Exemplos incluem, mas nao estao limitados a uma doenpa arterial periferica (DAP) como a isquemia de membro e a isquemia critica de membro (ICM), doenpa cardlaca isquemica, doenpa cerebral isquemica (por exemplo, acidente vascular cerebral), atraso na cicatrizapao de um ferimento, atraso na cicatrizapao de uma ulcera, disturbios associados a reprodupao, arteriosclerose, doenpa vascular isquemica, doenpa cardlaca isquemica, isquemia miocardica, doenpa arterial coronariana (DAC), doenpa cardiovascular aterosclerotica, doenpa arterial coronariana principal esquerda, doenpa arterial oclusiva, isquemia periferica, doenpa vascular periferica, doenpa vascular do rim, doenpa arterial periferica, isquemia de membro, isquemia de extremidade inferior, isquemia cerebral, doenpa cerebrovascular, retinopatia, reparo retinal, disturbio de remodelapao, sindrome de von Hippel-Lindau, teleangiectasia hemorragia hereditaria, doenpa vascular isquemica, doenpa de Buerger, doenpa renal isquemica e placenta isquemica.

Conforme utilizado aqui, o termo "tratar" refere-se a inibir ou interromper o desenvolvimento de uma patologia (por exemplo, a isquemia) e/ou causar a redupao, remissao ou regressao de uma patologia. Aqueles com conhecimento do assunto irao entender que diversas metodologias e ensaios podem ser uteis para avaliar uma patologia, e semelhantemente, diversas metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar a redupao, remissao ou regressao de uma patologia. 0 termo "tratar" tambem pode se referir ao alivio ou a diminuipao de um sintoma associado com a patologia.

Conforme utilizada aqui, a frase "individuo que precisa" refere-se a qualquer individuo (por exemplo, um mamifero), como um individuo humano diagnosticado ou que sofre da patologia.

Conforme mencionado acima e descrito no Exemplo 8 da seqao de Exemplos, que segue, os presences inventores descobriram que as celulas aderentes da Invenção sao capazes de regenerar e/ou reparar o tecido conj untivo.

Assim, de acordo com outro aspecto da Invenção, apresenta-se um metodo para tratar uma condiqao medica que exige a regeneraqao e/ou o reparo do tecido conjuntivo em um individuo que precisa dele. O metodo e efetuado administrando-se uma quantidade terapeuticamente 15 eficaz de celulas aderentes da Invenção em um individuo.

A frase "tecido conjuntivo" refere-se a um tecido com estrutura de suporte incluindo filamentos de colageno, fibras elasticas (por exemplo, entre e ao redor dos musculos e vasos sanguineos) e celulas 20 simples. Exemplos de tecidos conjuntivos incluem, mas nao estao limitados ao tecido conjuntivo denso (por exemplo, ligamento, tendao, ligamento periodontal), tecido conjuntivo areolar (por exemplo, com fibras proteinaceas como o colageno e a elastina), tecido conjuntivo reticular, tecido 25 adiposo, sangue, osso, cartilagem, pele, disco intervertebral, polpa dentaria, dentina, gengiva, celulas formadoras de matriz extracelular (ECM), tecido conjuntivo mole e celulas de musculo liso.

Conforms utilizada aqui, a frase "condipao medica que exija regenerapao e/ou reparo do tecido conjuntivo" refere-se a qualquer patologia caracterizada por lesao (isto e, tecido nao-funcional, 5 cancerigeno ou tecido pre-cancerigeno, tecido quebrado, tecido fraturado, tecido fibrotico, ou tecido isquemico) ou perda (por exemplo, apos um trauma, uma doenpa infecciosa, uma doenpa genetica, e similares) do tecido conjuntivo. Exemplos nao-limitantes de tais patologias incluem fraturas 10 osseas, cancer osseo (por exemplo, osteosarcoma, metastase de cancer osseo), ferimentos causados por queimaduras, defeito da cartilagem articular e ferimentos profundos.

A frase "administrar no individuo" refere-se a introdupao das celulas da invenção no 15 tecido alvo. As celulas podem ser derivadas do recebedor ou de um doador alogeneico ou xenogeneico. Essa frase tambem compreende "transplante", "reposipao celular" ou "enxerto" das celulas da invenção no individuo.

O individuo pode ser qualquer 20 mamifero que precise de regenerapao e/ou reparo do tecido conjuntivo incluindo, por exemplo, humanos ou animais domesticados, mas nao se limitando a cavalos (isto e, equinos), gado, cabras, ovelhas, porcos, caes, gatos, camelos, alpacas, lhamas e iaques.

De acordo com uma aplicapao dos presentes ensinamentos, as celulas aderentes da presente invenção podem ser utilizadas para tratar condipoes incluindo cistos osseos subcondrais, fraturas osseas, osteoporose, osteoartrite, degenerapao ossea, diversos canceres associados com a perda do tecido conjuntivo (por exemplo, cancer osseo, osteosarcoma, metastases osseas), lesao cartilaginosa, defeito da cartilagem articular, doenpa degenerativa de disco, osteogenese imperfeita (01), queimaduras, ferimentos causados por queimaduras, ferimentos profundos, atraso na cicatrizapao de um ferimento, ligamentos e tendoes lesionados, por exemplo, lesoes induzidas por esforpo extreme dos tendoes em cavalos e outros individuos que precisam dela (conforme declarado acima).

Celulas que podem ser administradas de acordo com esse aspecto da invenção incluem as celulas aderentes descritas acima, que podem ser cultivadas em cenarios tridimensionais ou bidimensionais, bem como, derivados mesenquimais e nao-mesenquimais parcialmente ou terminalmente diferenciados delas.

Metodos para derivar celulas de linhagem especifica de celulas-tronco estromais da invenção sao conhecidas na arte. Veja, por exemplo, as Patentes dos EUA Nos 5.486.359, 5.942.225, 5.736.396, 5.908.784 e 5.902.741.

As celulas podem ser virgens ou geneticamente modificadas de forma a derivar uma linhagem de interesse (veja o Req. de Patente dos EUA N° 20030219423).

As celulas podem ser de fonte autologa ou nao-autologa (isto e, alogeneica ou xenogeneica) de preparaqoes frescas ou congeladas (por exemplo, criopreservadas).

Dependendo da condiqao medica, o individuo pode ser tratado com drogas quimicas adicionais (por exemplo, imunomoduladores, quimioterapia, etc.) ou celulas.

Como as celulas nao-autologas podem induzir uma reaqao imune quando administradas no organismo, diversas abordagens foram desenvolvidas a firn de reduzir a probabilidade de rejeiqao de celulas nao- autologas. Elas incluem a supressao do sistema imunologico do recebedor ou o encapsulamento das celulas nao-autologas em membranas imunoisolantes, semipermeaveis antes do transplante.

As tecnicas de encapsulamento sao, geralmente, classificadas como microencapsulamento, envolvendo membranas maiores de superficie lisa e de fibra oca (Uludag, H. et al. Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64).

Os metodos para o prepare das microcapsulas sao conhecidos na tecnica e incluem, por exemplo, aqueles revelados por Lu MZ, et al., Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene- acetylated poly(allylamine) . Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83, Chang TM and Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60,and Lu MZ, et al., A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha- cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul. 2000, 17: 24551.

Por exemplo, as microcapsulas sao preparadas formando complexos de colageno modificado com um envoltorio de terpolimero de 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), acido metacrilico (MAA) e metilmetacrilato (MMA), resultando em uma capsula com espessura de 2-5 f.im. Essas microcapsulas podem ser encapsuladas adicionalmente com envoltorios de terpolimero de 2-5 |.im a firn de proporcionar uma superficie lisa carregada negativamente e minimizar a absorqao da proteina plasmatica (Chia, S.M. et al. Multilayered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 2002 23: 849-56).

Outras microcapsulas sao baseada em alginado, um polissacarideo marinho (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003, 5: 665-8) ou seus derivados. Por exemplo, as microcapsulas podem ser preparadas atraves da formaqao de complexos de polieletrolitos entre os polianions de alginato de sodio e celulose-sulfato de sodio com o polication de cloridrato de poli(metileno-co-guanidina) na presenpa de cloreto de calcio.

Estima-se que o encapsulamento celular seja melhorado com o uso de capsulas menores. Dessa forma, o controle de qualidade, a estabilidade mecanica, as propriedades de difusao, e as atividades in vitro das celulas encapsuladas melhoraram quando o tamanho da capsula foi reduzido de 1 mtn para 400 pm (Canaple L. et al., Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002;13:783-96). Alem do mais, descobriu-se que biocapsulas nanoporosas com tamanho de poro 5 bem controlado, de 7 nm, quimicas de superficie apropriadas - e microarquiteturas precisas imunoisolam com sucesso os microambientes para as celulas (Williams D. Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, 10 T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46).

Exemplos de agents imunossupressores incluem, mas nao se limitam ao metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, 15 cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sais de ouro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximabe (REMICADE), etanercept, bloqueadores da TNF-alfa, um agente biologica que tem como alvo uma citocina inflamatoria, e Medicaqoes 20 Anti-inflamatorias Nao-Esteroides (AINEs). Exemplos de AINEs incluem, mas nao se limitam ao acido acetilsalicilico, salicilato de magnesio e colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, 25 indometacina, cetoprofeno, cetorolaco,meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inibidores de Cox-2 e tramadol.

Em quaisquer dos metodos descritos aqui, as celulas podem ser administradas per se ou, preferivelmente como parte de uma composipao farmaceutica que inclua adicionalmente um transportador farmaceuticamente aceito.

Conforme utilizada aqui, uma "composipao farmaceutica" refere-se a uma preparapao das celulas aderentes da invenção (isto e, celulas aderentes de um tecido selecionado de um grupo que consiste de um tecido adiposo e da placenta, obtidas a partir de uma cultura tridimensional), com outros componentes quimicos como transportadores e excipientes farmaceuticamente adequados. 0 proposito de uma composipao farmaceutica e facilitar a administrapao das celulas em um individuo.

A partir daqui, o termo "transportador farmaceuticamente aceito" refere-se a um transportador ou um diluente que nao cause irritapao significativa em um individuo e que nao suspenda a atividade biologica e as propriedades do composto administrado. Exemplos, sem limitapao, de transportadores sao o propilenoglicol, solupao salina, emulsoes e misturas de solventes organicos com agua.

Aqui, o termo "excipiente" refere-se a uma substancia inerte adicionada a uma composipao farmaceutica a firn de facilitar adicionalmente a administrapao de um composto. Exemplos, sem limitapao, de excipientes incluem o carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos atjucares e tipos de amido, derivados da celulose, gelatina, oleos vegetais e polietilenoglicois.

De acordo com uma aplicapao preferida da invenção, o transportador farmaceutico e uma solupao salina aquosa.

Tecnicas para a formulapao e a administrapao de medicamentos podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, ultima edipao, que esta incorporada aqui como referenda.

Uma pessoa pode administrar a composipao farmaceutica de forma sistemica (conforme detalhado acima). Alternativamente, uma pessoa pode administrar a composipao farmaceutica localmente, por exemplo, por meio de injepao da composipao farmaceutica diretamente em uma regiao tecidual de um paciente.

Composipoes farmaceuticas da invenção podem ser fabricadas por processes bem conhecidos no ramo, por exemplo, por meio de mistura convencional, dissolupao, granulapao, montagem de drageas, levigapao, emulsificapao, encapsulamento, ou processes de encapsulamento ou liofilizapao.

Composipoes farmaceuticas para uso de acordo com a invenção, assim, podem ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitos, incluindo excipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dos ingredientes ativos em preparapoes que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulaqao apropriada depende da via de administrate escolhida.

Para injeqao, os ingredientes ativos da composite farmaceutica podem ser formulados em 5 solutes aquosas, preferivelmente em tampoes - fisiologicamente compativeis como a soluqao de Hank, solupao de Ringer, tampao salino fisiologico, ou meio de congelamento contendo criopreservantes. Para administrate transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser 10 permeada sao utilizados na formulate. Esses penetrantes sao, geralmente, conhecidos no ramo.

Para qualquer preparapao utilizada nos metodos da invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz ou dose pode ser estimada 15 inicialmente a partir de ensaios de culturas celulares e in vitro. Preferivelmente, a dose e formulada em um modelo animal para atingir uma concentrate ou titulo desejado. Essa informaqao pode ser utilizada para determinar mais precisamente as doses uteis em humanos.

A toxicidade e a eficacia terapeutica dos ingredientes ativos descritos aqui podem ser determinadas atraves de procedimentos farmaceuticos padrao in vitro, em culturas celulares ou em animais experimentais.

Os dados obtidos desses 25 ensaios de culturas celulares e in vivo e de estudos em animais podem ser utilizados na formulate de uma variedade de dosagens para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da apresentaqao e da via da administrate utilizadas. A formulapao exata, a via de administrapao e a dosagem podem ser escolhidas pelo medico individual tendo em vista a condipao do paciente (veja, por exemplo, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", '5 Ch. 1 p.l). Por exemplo, um paciente com Parkinson pode ser . monitorado sintomaticamente quanto a melhora das funpoes motoras indicando resposta positiva ao tratamento.

Para injepao, os ingredientes ativos da composipao farmaceutica podem ser formulados em 10 solupoes aquosas, preferivelmente em tampoes fisiologicamente compatfveis como a solupao de Hank, solupao de Ringer ou tampao salino fisiologico.

A quantidade da dosagem e o interval© podem ser ajustados individualmente para niveis do 15 ingredients ativo que sejam suficientes para regular eficazmente a sintese do neurotransmissor pelas celulas implantadas. As dosagens necessarias para alcanpar o efeito desejado dependerao das caracteristicas individuals e da via de administrapao. Ensaios de detecpao podem ser utilizados 20 para determiner as concentrapoes plasmaticas.

Dependendo da severidade e da responsividade da condipao a ser tratada, a dosagem pode se uma unica ou de uma pluralidade de administrapoes, com o ciclo de tratamento durando de diversos dias a diversas 25 semanas ou ate que a diminuipao do estado da doenpa seja alcanpada.

A quantidade de uma composipao a ser administrada dependera, certamente, do individuo que esta sendo tratado, da severidade da condipao, da forma de administrapao, do julgamento do medico prescritor, etc. A dosagem e o periodo de administrapao serao responsivos a um monitoramento cuidadoso e continue da mudanpa da condipao do - 5 individuo. Por exemplo, um paciente com Parkinson tratado recebera uma quantidade de celulas que seja suficiente para aliviar os sintomas da doenpa, com base nas indicapoes do monitoramento.

Modelos de lesao de ligamento 10 incluem, mas nao se limitam ao modelo de coelho de reconstrupao de ligamento cruzado anterior utilizando celulas-tronco mesenquimais [Jit-Kheng et al., Arthroscopy (2004) 20(9) : 899-910], ao modelo de cabra para uso de plataformas biorreabsorviveis para reparo de ligamento 15 cruzado anterior [Altman et al., J Am Acad Orthop Surg.(2008) 16(4) : 177-187] . Modelos de reparo de tendao incluem, mas nao se limitam ao modelo de Coelho New Zealand White adulto para reparo de tendao mediado por celulas-tronco mesenquimais autologas [Awad et al., Tissue Eng. (1999) 20 5(3) :267-77] . Modelos de reparo osseo foram descrito, por exemplo, em Stem Cells in Endocrinology, Humana Press (2005) 183-206, descrevendo a manipulapao de celulas-tronco mesenquimais para reparo osseo.

Apos o transplante, as celulas 25 da invenção sobrevivem, preferivelmente, na area afetada por um periodo de tempo (por exemplo, aproximadamente 1 mes) , de forma que e possivel observer um efeito terapeutico.

Composiqoes incluindo a preparapao da invenção formulada em um transportador farmaceutico compatlvel tambem podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para '5 tratamento de uma condipao indicada.

As composipoes da invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositive dispensador, como um kit aprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitarias contendo 10 o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, incluir uma lamina de metal ou de plastico, como uma embalagem tipo blister. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instrupoes para administrapao. A embalagem ou dispensador tambem pode acompanhada por uma informapao 15 associada com o recipiente em um formato prescrito por uma agenda governamental reguladora da fabricação, do uso ou da venda de produtos farmaceuticos, cuja informapao reflita a aprovapao, por parte da agenda, da forma das composipoes ou da administrapao humana ou veterinaria. Essa informapao, por 20 exemplo, pode ser de um rotulo aprovado pela Agenda de Administrapao de Alimentos e Medicamentos dos EUA para medicamentos prescritos ou de uma bula aprovada do produto.

As celulas aderentes da invenção podem ser formuladas adequadamente como composipoes 25 farmaceuticas que podem ser embaladas apropriadamente como um artigo de fabricação. Esse artigo de fabricação inclui um material de embalagem que envolve um adesivo para uso no aumento da angiogenese em um tecido, no tratamento da isquemia e/ou de uma patologia exija a regeneraqao e/ou reparo do tecido conjuntivo, onde o material de embalagem esta embalando as celulas aderentes da Invenção.

Estima-se que as celulas aderentes da presente Invenção sejam capazes de induzir a - imunossupressao e/ou a tolerancia em um individuo. Assim, as celulas aderentes podem ser utilizadas para tratar qualquer condiqao que precise de imunossupressao e/ou de tolerancia. Essas condiqoes incluem, mas nao se limitam a doenqas autoimunes e doenqas inflamatorias (incluindo doenqas inflamatorias agudas e cronicas) incluindo, mas nao se limitando a doenqas cardiovasculares, doenqas reimatoides, doenqas glandulares, doenqas gastrointestinais, doenqas cutaneas, doenqas hepaticas, doenqas neuroldgicas, doenqas musculares, doenqas nefrologicas, doenqas relacionadas a reproduqao, doenqas do tecido conjuntivo e doenqas sistemicas.

Exemplos de doenqas cardiovasculares imunes incluem, mas nao se limitam a aterosclerose (Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), infarto do miocardio (Vaarala 0. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), trombose (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9), granulomatose de Wegener, artrite de Takayasu, sindrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16) :660) , doenqa autoimune antifator VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157), vasculite necrosante de vasos pequenos, poliangeite microscopica, sindrome de Churg e Strauss, glomerulonefrite focal necrosante e crescentica pauci-imune (Noel LH. Ann Med Interne (Paris) . 2000 May;151 (3):178), sindrome antifosfolipidica (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171), insuficiencia cardiaca induzida pelo anticorpo (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H), purpura trombocitopenica (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245), anemia hemolitica autoimune (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3- 4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar;74 (3):139), autoimunidade cardiaca na doenpa de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709) e autoimunidade do linfocito T antiajudante (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9).

Exemplos de doenpas reumatoides autoimunes incluem, mas nao se limitam a artrite reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437) e a espondilite anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3) : 189) .

Exemplos de doenpas glandulares autoimunes incluem, mas nao se limitam a doenpa pancreatica, diabetes Tipo I, doenpa da tireoide, doenpa de Graves, tireoidite, tireoidite autoimune espontanea, tireoidite de Hashimoto, mixedema idiopatico, autoimunidade ovariana, infertilidade autoimune antiespermatozoide, prostatite autoimune e sindrome poliglandular autoimune Tipo I. As doenpas incluem, mas nao se limitam a doenpas autoimunes do pancreas, diabetes Tipo 1 (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125), doenpas autoimunes da tireoide, doenpa de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab - 5 Clin North Am 2000 Jun;29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77), tireoidite autoimune espontanea (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262), tireoidite de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8):1810), mixedema idiopatico (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug,-57 (8):1759), autoimunidade ovariana (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87), infertilidade autoimune antiespermatozoide (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43 (3):134), prostatite autoimune (Alexander RB. et 15 al., Urology 1997 Dec,-50 (6):893) sindrome poliglandularautoimune Tipo I (Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5) :1127) .

Exemplos de doenpas gastrointestinais autoimunes incluem, mas nao se limitam a 20 doenpas intestinais inflamatorias cronicas (Garcia Herola A.et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1) :16) , celiac disease (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16 ; 13 8 (2) :122) , colite, ileite e doenpa de Crohn.

Exemplos de doenpas cutaneas autoimunes incluem, mas nao se limitam a doenpas cutaneas bolhosas autoimunes, como, mas sem se limitar a pemphigus vulgaris, penfigoide bolhoso e pemphigus foliaceus.

Exemplos de doenqas hepaticas autoimunes incluem, mas nao se limitam a hepatite, hepatite ativa cronica autoimune (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54 (3) :382), cirrose biliar primaria 5 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551; Strassburg - CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11 (6):595) e hepatite autoimune (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2) :326) .

Exemplos de doenqas neurologicas autoimunes incluem, mas nao se limitam a esclerose multiple (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2) :1), doenqa de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77), miastenia gravis (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2) :83; Oshima M. 15 et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12 ) :2563 ) , neuropatias, neuropatias motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3) :191) ; sindrome de Guillain-Barre e neuropatias autoimunes (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4) :2 3 4 ) , miastenia, syndrome miastenica de Lambert - Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204); doenqas neurologicas paraneoplasicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplasica e sindrome do homem rigido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27;98 (7):3988); sindrome do homem rigido nao-paraneoplasica, atrofias cerebelares progressives, encefalite, encefalite de Rasmussen, esclerose lateral amiotrofica, coreia de Sydeham, sindrome de Gilles de la Tourette e poliendocrinopatias autoimunes (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23);neuropatias disimunes (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419); ' 5 neuromiotonia adquirida, artrogripose multiple congenita . (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482), neurite, neurite optica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May,-57 (5) :544) e doenpas neurodegenerat ivas.

Exemplos de doenpas musculares autoimunes incluem, mas nao se limitam a miosite, miosite autoimune e sindrome de Sjogren primaria (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123 (1) :92) e doenp autoimune do musculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6) :234) .

Exemplos de doenpas nefrologicas autoimunes incluem, mas nao se limitam a nefrite e nefrite intersticial autoimune (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;l (2):140).

Exemplos de doenpas autoimunes relacionadas a reprodupao incluem, mas nao se limitam a perda fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9).

Exemplos de doenpas autoimunes do tecido conjuntivo incluem, mas nao se limitam as doenpas do ouvido, doenpas autoimunes do ouvido (Yoo T J. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249) e doenpas autoimunes do ouvido interno (Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266) .

Exemplos de doenpas sistemicas autoimunes incluem, mas nao se limitam ao lupus eritematoso sistemico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2) :49) 5 e esclerose sistemica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107) .

Alem disso, as celulas aderentes podem ser utilizadas para tratar doenpas 10 associadas com o transplants de um enxerto, incluindo, mas nao se limitando a rejeipao de enxerto, rejeipao cronica de enxerto, rejeipao de enxerto hiperaguda, rejeipao de enxerto aguda e doenpa de enxerto versus hospedeiro.

Conforme utilizado aqui, o 15 termo "aproximadamente" refere-se ± 10 %. Objetivos adicionais,vantagens e novas caracteristicas da invenção ficarao aparentes para aqueles comumente conhecedores do assunto com o exame dos seguintes exemplos, que nao pretendem ser 20 limitantes. Adicionalmente, cada uma das diversas aplicapoes e aspectos da invenção, conforme descritos acima e reivindicados na sepao de reivindicaçoes abaixo descobre um apoio experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

Agora, faz-se referenda aos exemplos a seguir que, juntamente com as descripoes acima,ilustram a invenção de forma nao-limitante. Geralmente, a nomenclature utilizada aqui e os procedimentos laboratoriais utilizados na Invenção incluem tecnicas moleculares, bioquimicas, microbiologicas e de DNA recombinante. Essas tecnicas sao 5 explicadas cuidadosamente na literatura. Veja, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes IIII Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conforme estabelecido nas Patentes dos EUA Nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531;5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology"(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980) ; imunoensaios disponiveis sao descritos extensivamente na literatura cientifica e de patentes, veja, por exemplo as Patentes dos EUA Nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578;3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. , and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos sao incorporados como referencias da forma estabelecida aqui. Outras referencias gerais sao apresentadas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos descritos sejam bem conhecidos no ramo e sao fornecidos para conveniencia para o leitor. Todas as informaqoes contidas na literatura sao incorporadas aqui como referenda.

EXEMPLO 1 PRODUQAO E CULTURA DE CELULAS ADERENTES DA MEDULA OSSEA, PLACENTA E TECIDO ADIPOSO

As celulas aderentes foram cultivadas em um sistema biorreator contendo transportadores 3D para gerar celulas 3D aderentes, caracterizadas por um perfil de expressao de marcador celular especifico. A eficiencia do cultivo foi testada por meio da contagem celular. A capacidade de diferenciaqao dessas celulas foi testada por cultura em um meio de diferenciaqao.

Materials e Procedimentos Experimentais

Celulas aderentes da medula ossea - As celulas aderentes da medula ossea (MO) foram obtidas a partir da medula do esterno aspirada de doadores 5 saudaveis hematologicamente sendo submetidos a cirurgia de • corapao aberto (open-heart) ou biopsia da MO. Os aspirados da medula foram diluidos 3 vezes em Solupao Balanceada de Sais de Hank (HESS; GIBCO BRL, Invitrogen, Gaithersburg MD) e submetidos a centrifugapao em gradiente de densidade 10 Ficoll-Hypaque (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA).

Assim, celulas mononucleares da medula (<1,077 gm/cm3) foram coletadas, lavadas 3 vezes em HBSS e novamente suspenses em meio de crescimento [DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel) acrescida de 10% FCS (GBCO BRL) 10’4M 15 mercaptoetanol (Merck, White House Station, NJ) , mistura

Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 pg/ml:1.25 un/ml; Beit Ha'Emek), 2 mM L-glutamina (Beit Ha'Emek)]. As celulas de doadores individuals foram incubadas separadamente em frascos de cultura de tecido (Corning, Acton, MA) a 37°C (5% 20 CO2) com troca semanal do meio de cultura. As celulas foram divididas a cada 3-4 dias usando 0,25% tripsina-EDTA (Beit Ha'Emek). Apos 2-40 passagens, ao atingir 60-80% de confluencia, as celulas foram coletadas para analise ou para cultura em biorreatores.

Celulas aderentes derivadas da placenta - As partes internas de uma placenta de parto a termo (Bnei Zion medical center, Haifa, Israel) foram cortadas em condipoes estereis, lavadas 3 vezes com tampao de Hank e incubadas por 3 horas a 37°C com 0,1% de colagenase (1 mg /ml tecido; Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO). Usando pipetaqao suave, as celulas suspensas foram, entao, lavadas com DMEM acrescido de 10% FCS, mistura Pen-Strp- Nistatina (100 U/ml:100 |.ig/ml:l,25 un/ml) e 2 mM L- glutamina, semeadas em frascos de 75 cm2 e incubadas a 37 °C em um incubador de cultura de tecido em condipao umidificada com 5 % CO2. Assim, foi permitido que as celulas aderissem a uma superficie plastica por 72 horas, apos o que, o meio foi trocado a cada 3-4 dias. Ao atingir a confluencia de 60-80% (geralmente 10-12 dias), as celulas foram separadas do frasco de crescimento usando 0,25% tripsina-EDTA e semeadas em novos frascos. As celulas cultivadas foram, entao, coletadas para analise ou para cultura em biorreatores.

Celulas aderentes derivadas do tecido adiposo - Celulas aderentes foram obtidas do tecido adiposo humano dos procedimentos de liposucqao (Rambam Haifa, Israel) . 0 tecido adiposo foi lavado extensivamente com volumes iguais de PBS e dissolvido a 37°C por 30 minutos com colagenase (20 mg/ml). As celulas foram lavadas com DMEM contendo 10% FCS, mistura Pen-Strp-Nistatina (100 U/ml:100 ).ig/ml:l,25 un/ml) e L- Glutamina e centrifugadas a 1200 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente (TA) , passaram por nova suspensao com solugao de lise (1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, para descartar as hemacias), centrifugadas e novamente suspendidas com SMEM contendo 10 % FCS, mistura de Pen-Strep-Nistatinamixture (100 U/ml:100 |.ig/ml:l,25 un/ml) e L- Glutamina. As celulas lavadas foram semeadas em frasco de meio de cultura de tecido esteril em 3-10 X 107 celulas/frasco. No dia seguinte, as celulas foram lavadas com PBS para remover • 5 hemacias residuais e celulas mortas. As celulas foram mantidas a 37°C em uma incubadora de cultura de tecido sob condiqoes de umidificapao com 5%CO2. 0 meio foi trocado a cada 3 ou 4 dias. Com confluencia de 60-80%, as celulas foram separadas do frasco de crescimento usando 0,25% 10 tripsina-EDTA e semeadas em novos frascos. Apos 2-40 passagens, quando as celulas atingiram 60-80% de confluencia, elas foram coletadas para analise ou para cultura em biorreatores.

PluriX'M Plug Flow bioreactor - 15 0 biorreator de fluxo em pistao Plurix® (Pluristem, Haifa,Israel; conforme ilustrado na Figura 1G, ver tambem Patents Americana N° 6.911.201), foi carregado com 1-100 ml de carregadores porosos 3D embalados (4 mm de diametro) feito de matriz de poliester. Esses carregadores permitem a 20 propagapao de grandes numeros de celulas em um volume relativamente pequeno. O artigo de vidro foi desenhado e fabricado pela Pluristem (Pluristem, Haifa, Israel). 0 biorreator foi mantido em uma incubadora de 37°C, com taxa de fluxo regulada e monitorada por uma valvula (6a na Figura 25 1G) e bomba peristaltica (9 na Figura 1G) . O biorreator contem um ponto de amostra e injeqao (4 na Figura 1G) , permitindo a semeaqao sequential das celulas. 0 meio de cultura foi fornecido com pH 6.7-7.4 a partir do reservatorio (1 na Figura 1G). 0 reservatdrio foi fornecido por uma mistura de gas filtrado (2, 3 na Figura 1 G) , contendo ar/CO2/O2 em proporqoes diferentes, dependendo da densidade celular no biorreator. A proporqao de 02 foi 5 adequada ao nivel de 02 dissolvido na saida do biorreator, - determinada por um monitor (6 na Figura 1G) . A mistura de gas foi fornecida ao reservatorio via tubos de silicone ou difusor (Degania Bet, Emek Hayarden, Israel). 0 meio de cultura passou por um recipiente separado (7 na Figura 1G) 10 que permite a coleta de celulas nao aderentes circulantes.

A circulaqao do meio foi obtida por uma bomba peristaltica (9 na Figura 1G). 0 biorreator foi adicionalmente equipado com um ponto de amostragem adicional (10 na Figura 1G) e recipientes para troca de meio continua.

Produqao de celulas 3D aderentes - As culturas de celula 2D aderentes primariamente humanas nao confluentes, cultivadas conforme descrito acima, foram tripsinizadas, lavadas, ressuspendidas em DMEM acrescido de 10% FBS, mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:l,25 um/ml) e 2 mM L-glutaminas, e semeadas (103-105 celulas/ml) via um ponto de injeqao nos transportadores 3D em um biorreator de fluxo em pistao (ver Figura 1G). Antes da inoculaqao, o biorreator foi carregado com PBS-Ca-Mg (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel), 25 passou por autoclave (120 °C, 30 min) e lavado com meio de crescimento Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino inativado por calor e mistura Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml:100 ug/ml:l,25 un/ml) . 0 fluxo foi mantido a uma taxa de 0,1-5 ml/min. 0 process© de semeatjao envolveu a interrupqao da circulaqao por 2-48 horas, possibilitando, assim, que as celulas se fixem aos carregadores. O biorreator foi mantido sob temperatura controlada (37° C) e condiqoes de pH (pH = 6.7-7.4), usando uma incubadora fornecida com ar esteril e CO2, conforme necessario. 0 meio de crescimento foi substituido 2-3 vezes por semana. 0 meio de circulaqao foi substituido por meio DMEM fresco, a cada 4 horas ate 7 dias. Com uma densidade de 1 X 106-l X 10' celulas/ml (apos 12-40 dias de crescimento), o volume total do meio foi removido do biorreator e o biorreator e os carregadores foram lavados 2-5 vezes com PBS. As celulas 3D aderentes foram, entao, soltas dos carregadores com Tripsina-EDTA; (Biological Industries, Beit Ha’emek, Israel;3-15 minutos com agitaqao leve, 1-5 vezes) e foram ressuspendidas em DMEM e criopreservadas.

Ensaios biologicos de qualidade de celula 3D aderente - Celulas criopreservadas 3D aderentes foram descongeladas e contadas. Para a avaliaqao de viabilidade celular, 2 X 105 celulas foram semeadas em um frasco de cultura de tecido de 150 cm2 e sua capacidade de aderencia e repopulaqao foi avaliada em 7 dias apos a semeaqao. Assim, o fenotipo do marcador da membrana celular 3D aderente foi analisado usando citometria de fluxo de anticorpos monoclonais fluorescentes (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Comparaqao entre perfil de marcador de membrana celular de celulas aderentes cultivadas 3D e 2D usando ensaios de citometria de fluxo - 10.000 - 200.000 celulas aderentes de cultures 2D e cultures de sistema de fluxo 3D foram suspensas em 0,1 ml de meio de cultura em um tubo de 5 ml e incubadas (4 °C, 30 minutos, 5 condipoes escuras) com concentrapoes de saturate de acordo . com os seguintes MAbs: CD90 anti-humano FITC conjugado (Chemicon International Inc. Temecula, CA), CD73 anti-humano PE conjugado (Bactlab Diagnostic, Ceasarea, Israel), CD105 anti-humano PE conjugado (eBioscience, San Diego, CA) , CD29 10 anti-humano FITC conjugado (eBioscience, San Diego, CA) ,CD45 atni-humano Cy7-PE conjugado (eBiosience), CD19 anti- humano PE-conjugado (IQProducts, Groningen, Paises Baixos), CD14 MAb anti-humano PE conjugado (IQProducts), CDllb atni- humano FITC conjugado (IQProducts) e CD34 anti-humano PE 15 conjugado (IQProducts) ou com HLA-DR MAb anti-humano FITC conjugado (IQProducts). Apos a incubapao, as celulas foram lavadas duas vezes ao dia em PBS frio como gelo contendo 1% de FCS inativado por calor em 500 jil formaldeido 0,5% e analisadas usando citometria de fluxo FC-500 (Beckman 20 Coulter, Fullerton, CA).

Comparapao entre o perfil de proteina de celulas aderentes cultivadas 3D e 2D usando analise de espectrometria de massa - Celulas aderentes 2D e 3D derivadas de procedimentos de cultura foram produzidas a 25 partir da placenta, conforme descrito acima. Em suma, as culturas 2D foram geradas com a cultura de 0,3-0,75 X 106 celulas em frascos de 175 cm2 por 4 dias sob umidificapao de 5% CO2, atmosfera a 37%, ate atingir 60-80% de confluencia.

As culturas 3D foram feitas semeando 2-10 x 106 celulas/grama em um biorreator contendo 2000 carregadores com cultura por 18 dias. Apos a colheita, as celulas foram lavadas (x3) para remover todo o soro, peletizadas e congeladas. As proteinas foram isoladas das bolas formadas [usando kit Tri Reagente (Sigma, Saint Louis, EUA) e dissolvidas com tripsina e rotuladas com o reagente iTRAQ (Applied Biosciences, Foster City, CA)], de acordo com o protocolo dos fabricantes. Em suma, os reagentes iTRAQ sao reagentes nao polimericos isobaricos. Os peptideos em cada amostra sao classificados com uma das quatro identificaqoes de isotopos isobaricos via as cadeias laterals de lisina e/ou N-terminal. As quatro amostras rotuladas sao misturadas e os peptideos sao analisados por espectrometria de massa. Com a fragmentaqao de peptideos, cada identificaqao libera um ion informante de massa diferente; a razao dos quatro informantes fornece abundancia relativa do peptideo especificado na amostra. (informaqoes em: www.docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf) .

A analise proteomica da cultura 2D versus cultura 3D da placenta derivada das celulas aderentes foi feita no centro proteomico Smoler (departamento de Biologia, Technion, Haifa, Israel) usando LC-MS/MS em QTOF-Premier (Waters, San Francisco, CA) , com a identificaqao e analise feitas pelo software Pep-Miner [Beer, I., et al, Proteomics, 4, 950-60 (2004)] contra a parte humana do banco de dados. As proteinas analisadas foram: ribonucleoproteina nuclear heterogenea Hl(Hnrphl GenBank Acesso N° NP 005511) , familia histona H2A (H2AF, GenBank Acesso N° NP 034566.1), fator de elongaqao de traduqao eucariotica 2 (EEEF2, GenBank Acesso N° NP 031933.1), reticulocalbina 3, dominio de ligaqao de calcio EF-hand (RCN2, GenBank Acesso N° NP 065701), precursor isoforme 2 antigeno CD44 (GenBank Acesso N° NP 001001389, calponina 1 basica musculo liso (CNN1, GenBank Acesso N° NP 001290), 3 fosfoadenosina 5 fosfosulfato sintase 2 isoforme a (Papss2, GenBank Acesso N° NP 044661), proteina ribossomica L7a (rpL7a, GenBank Acesso N° NP_000963) e aldeido desidrogenase X (ALDH X, GenBank Acesso N° NP P47738). Todos os experimentos foram feitos duas vezes. Em razao da natureza da analise, cada proteina foi analisada de acordo com o numero de peptideos que apareceram em uma amostra (2-20 aparecimentos de uma proteina em cada analise) Comparaqao entre as proteinas secretadas em celulas aderentes cultivadas 3D e 2D usando ELISA - celulas aderentes derivadas de procedimentos de cultura 2D e 3D produzidas a partir da placenta foram produzidas conforme descrito acima, com culturas 3D por 24 dias. Os meios condicionados foram, entao, coletados e analisados por Flt-3 ligante, IL-6, trombopoietina (TPO) e fator de celula tronco (SCF), usando ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), em tres experimentos independentes. Os resultados foram normalizados para 1 X 106 celulas/ml.

Meio de diferenciaqao osteoblasto - A diferenciaqao osteogenica foi avaliada pela cultura de celulas em um meio de dif erenciaqao de osteoblast© consistindo em DMEM suplementado com 10% FCS, 100 nM dexametasona, 0,05mM acido ascorbico 2-fosfato, 10 mM B-glicerofosfato, por um periodo de 3 semanas. A matriz calcificada foi indicada por colorapao Alizzarin Red Sea 5 fosfatase alcalina foi detectada pelo kit de ensaio de fosfatase alcalina (todos os reagentes da Sigma- Aldrich, St. Lewis, MO).

Resultados Experimentais

O Sistema Biorreator Plurix'M 10 cria um microambiente semelhante ao fisiologico.

Visando gerar condipoes de cultura eficientes para as celulas aderentes, um ambiente semelhante ao fisiologico (mostrado na Figura 1A) foi criado artificialmente, usando o Biorreator PluriX (Pluristem, 15 Haifa, Israel; carregador e ilustrado na Figura 1G e mostrado antes da semeapao na Figura IB). Conforme e mostrado nas Figuras 1C-F, a medula ossea produzida em celulas 3D aderentes foram cultivadas com sucesso e expandidas na matriz 3D, 20 dias (Figuras 1B-C, ampliada20 xl50 e 150, respectivamente) e 40 dias (Figuras 1C-D, ampliada x 350 e 500, respectivamente) apos a semeapao.

Cultura celular no sistema Biorreator PluriX foram significativamente expandidas - Diferentes lotes de produpao de placenta derivadas de 25 celulas aderentes 3D foram cultivadas em sistemas biorreatores PluriX. A densidade de semeapao foi 13.300 celulas/carregador (para um total de 2X 106 celulas). Quatorze dias apos a semeapao, densidade cellular multiplicada por 15 vezes, atingindo aproximadamente 200.000 celulas/carregador (Figura 2) ou 30 X 106 em um biorreator de 150 carregadores. Em um experimento diferente, as celulas foram semeadas no biorreator na densidade de 1.5 X 5 IO4 celulas/ml e 30 dias apos a semeapao dos carregadores contidos em mais de 50 vezes o numero de celula mais alto, isto e, aproximadamente 0,5 X106 celulas/carregador ou 0.5 X 10 celulas/ml. A densidade celular nos carregadores em varios niveis da coluna de crescimento foi consistente, 10 indicando uma transferencia homogenea de oxigenio e nutrientes as celulas. O sistema de cultura 3D provou, entao, sustentar as condipoes do crescimento e manutenpao prolongada de culturas de celulas do mesenquima de alta densidade, que podem ser cultivadas de forma eficaz em uma 15 quantidade suficiente para os fins de suportar um enxerto e transplante com sucesso.

Celulas aderentes 3D mostram caracteristicas unicas do marcador da membrana - Para definir a diferenpa no perfil de secrepao das moleculas 20 soluveis e produpao de protefna, resultando da imitapao do ambiente osseo do procedimento de cultura 3D, analise FACs foi realizada. Conforme mostrado na Figura 3A, analises FACS dos marcadores celulares mostram que as celulas 3D aderentes mostram um padrao de expressao de marcador 25 diferente do que as celulas aderentes cultivadas em condipoes 2D. As celulas cultivadas 2D expressaram niveis significativamente mais altos de marcadores de membrane positives CD90, CD105, CD73 e marcadores de membrana CD29 em comparaqao as celulas cultivadas 3D. Por exemplo, CD105 mostrou uma expressao de 56% nas celulas cultivadas 3D VS. 87% nas celulas cultivadas 2D. As celulas aderentes 2D e 3D das cultures de placenta nao expressaram qualquer marcador hematopoietico da membrana (Figura 3B).

Celulas aderentes 3D mostram um perfil unico de fatores soluveis - O nicho hematopoietico inclui celulas de suporte que produzem uma abundancia de citocinas, quimocinas e fatores de crescimento. Visando definir ainda mais a diferenqa entre as celulas aderentes cultivadas 2D e 3D, o perfil das quatro proteinas secretadas hematopoieticas no meio condicionado das culturas de celulas aderentes 2D e 3D foi feito por ELISA. As Figuras 4A-C mostram que a cultura celular em condiqoes 3D gerou meios de condiqao com niveis mais altos de ligante Flt-3 (Figura 4a), IL-60 (Figura 4B) e SCF (Figura 4C) , enquanto que baixos niveis de IL-6 e quase nivel zero de ligante Flt3 e SCF foram detectados nos meios de condiqao das culturas 2D. A produqao de Trombopoietina (TPO) foi muito baixa e igual nas duas culturas.

Celulas aderentes 3D mostram um perfil de proteina unico nas analises de espectrometria de massa - Para definir ainda mais a diferenqa entre celulas aderentes cultivadas 2D e 3D, o perfil de proteina dessas celulas foi analisado por espectrometria de massa. A Figura 4D mostra que as celulas aderentes cultivadas 2D e 3D mostram um perfil de expressao de proteina acentuadamente diferente. Conforme mostrado na Tabela 1 abaixo, as celulas cultivadas 3D mostram um nivel de expressao muito mais alto de H2AF e ALDH X (mais de 9 e 12 vezes maior, respectivamente) e um maior nivel de proteinas EEEF2, RCN2 e CNN1 (ca. 3, 2,5 e 2 vezes, respectivamente). Alem disso, as celulas cultivadas 3D mostram metade dos niveis de expressao das proteinas Hnrphl e precursor isoforme 2 antigeno CD44 e um terpo dos niveis de expressao de Papss2 and rpL7a.

Celulas aderentes 3D possuem a capacidade de se diferenciarem em osteoblastos - Para caracterizar ainda mais as celulas 3D aderentes, as celulas foram cultivadas em um meio de diferenciapao de osteoblasto por um periodo de 3 semanas. Assim, a precipitapao de calcio foi realizada. As celulas diferenciadas mostraram produzir calcio (mostrado em vermelho nas Figuras 5A-B), enquanto que as celulas de controle mantiveram um fenotipo semelhante a fibroblasto e nao demonstraram mineralizapao (Figuras 5C-D). Esses resultados mostram que as celulas 3D aderentes derivadas de placenta possuem a capacidade de se diferenciarem in vitro das celulas de osteoblastos.

EXEMPLO 2 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DAS CELULAS 3D ADERENTES DERIVADAS DA PLACENTA DE MELHORAR 0 TRANSPLANTS DE HSC

O suporte das celulas 3D aderentes ao transplants de HSC foi avaliado pelo nivel de celulas hematopoieticas humanas (hCD45+) detectadas em camundongos NOD-SCID imunodeficientes irradiados de forma sub fatal ou pre-tratados com quimioterapia.

Materials e Procedimentos Experimentals

Isolamento de Celulas CD34+ - Amostras de sangue do cordao umbilical foram obtidas em condipoes estereis durante o parto (Bnei Zion Medical Center, Haifa, Israel) e celulas mononucleares foram fracionadas usando Limphoprep (Axis-Shield PoC As, Oslo, Norway), centrifugaqao com gradients de densidade e foram criopreservadas. As celulas mononucleares descongeladas foram lavadas e incubadas com anticorpos anti-CD34 e isoladas usando midi MACS (Miltenyl Biotech, Bergish Gladbach, Alemanha) . As celulas de mais de uma amostra foram agrupadas para atingir a quantidade desejada (50.000100.000 celulas).

Detecqao de celulas transplantadas em camundongos irradiados - Camundongos NOD- SCID machos e femeas de sete semanas de idade (NOD-CB17- Prkdcscid/J; Harlan/ Weizmann Inst., Rehovot Israel) foram mantidos em gaiolas com sistema aberto esteril, recebendo dietas estereis e agua acida esterilizada em autoclave. Os camundongos foram irradiados sub letalmente (350 cGy) e subsequentemente (48 horas apos a irradiaqao) transplantados com 50.000-100.000 celulas hCD34 +, com ou sem celulas aderentes adicionais (0,5xl06 -lx 106) derivadas da 5 placenta ou tecido adiposo (3-7 camundongos em cada grupo), por injeqao intravenosa em uma veia lateral da cauda. Quatro a seis semanas depois do transplante os camundongos foram sacrificados por deslocamento e a MO foi coletada inserindo tampao FACS nos dois femures e tibias (50 ml PBS, 10 5 ml FBS, 0.5 ml acido sodico 5 %) . As celulas humanas na

MO dos camundongos foram detectadas por citometria e o percentual das celulas de expressao do marcador de celula hematopoietica CD45 humana e murina nos camundongos NOD-SCID tratados foi feito incubando as celulas com CD45-FITC anti- humano (IQ Products, Groningen, Paises Baixos). 0 limiar mais baixo de transplante humano inequivoco foi designado como 0,5%.

Detecqao de celulas transplantadas em camundongos tratados com quimioterapia - 20 camundongos NOD-SCID machos de 6,5 semanas de idade(.CB17/JhkiHsd-scid; Harlan, Rehovot Israel), mantidos conforme descrito acima para os camundongos irradiados, receberam a injeqao intraperitoneal de Busulfan (25 mg/kg - por 2 dias consecutivos) . Dois dias apos a segunda injeqao 25 de Busulfan, os camundongos receberam a injeqao de celulas CD34+ isoladas ou junto com 0.5 X 106 celulas aderentes, produzidas a partir da placenta. 3,5 semanas apos o transplante, os camundongos foram sacrificados e a presenqa das celulas hematopoieticas humanas foi determinada conforme descrito acima para os camundongos irradiados.

Resultados Experimentais

As celulas 3D aderentes melhoraram o transplante de HSC em camundongos irradiados - As celulas hematopoieticas CD34+ humanas e as celulas aderentes 3D derivadas da placenta ou tecido adiposo foram co-transplantadas em camundongos NOD-SCID irradiados. A eficacia do transplante foi avaliada 4 semanas apos o co- transplante e comparada aos camundongos transplantados apenas com HSC. Conforme mostrado na Tabela 2, o co- transplante de celulas 3D-aderentes e celulas UCB CD34 resultou em taxas de transplante consideravelmente altas e niveis maiores de celulas humanas na MO dos camundongos receptores em comparapao aos camundongos tratados com celulas UCB CD34+.

Celulas 3D aderentes melhoram o transplante de HSC em camundongos tratados com 20 quimioterapia - Celulas hematopoieticas CD34+ humanas foram co-transplantadas com 500.000 celulas 2D aderentes ou celulas 3D aderentes derivadas da placenta em camundongos NOD-SCID pre-tratados com quimioterapia. A eficacia do transplante foi avaliada 3,5 semanas apos o co-transplante e comparada aos camundongos transplantados apenas com HSC.

Conforme mostrado na Tabela 3 e Figura 6, o co-transplante de celulas aderentes e celulas UCB CD34 + resultou em maiores niveis de transplants na MO dos camundongos receptores comparadas a celulas UCB CD34+ isoladas. Alem disso, conforme mostrado na Tabela 3, o nivel medio de transplante foi maior em camundongos co-transplantados com celulas aderentes cultivadas no sistema biorreator PluriX (celulas 3D aderentes) do que nos camundongos co-transplantados com celulas do mesmo doador, cultivadas nas condipoes de cultura 2D estaticas convencionais (frasco).

Os resultados da analise FACS mostrados nas Figuras 7A-B demonstram a vantagem do co- transplante de celulas aderentes com hHSCs (Figura 7B) e a 15 capacidade das celulas aderentes de melhorar a recuperaqao do sistema hematopoietico apos o transplante de HSC.

Considerados em conjunto, esses resultados mostram que as celulas aderentes podem servir como celulas de suporte para melhorar a recuperaqao 20 apos o transplante de HSCs (autologo ou alogenico). A capacidade das celulas 3D aderentes de aumentar o transplante de celulas tronco hematopoieticas e/ou progenitoras apos o transplante de HSCs pode resultar da capacidade da celula 3D aderente de secretar citocinas de 25 suporte a HSC que podem melhorar a capacidade de retorno, auto-renovaqao e proliferapao das celulas transplantadas ou da capacidade dessas celulas de reconstruir o microambiente hematopoietico danificado necessario para o retorno e proliferapao das HSCs transplantaveis.

EXEMPLO 3 SUPRESSAO DA RESPOSTA LINFOCITICA POR CELULAS ADERENTES CULTIVADAS 2D E 3D

Celulas aderentes e, particularmente, as celulas aderentes 3D foram identificadas por suprimir a reapao imune das celulas mononucleares do cordao humano em um ensaio MLR.

Materials e Procedimentos Experimentais

Ensaio de reapao linfocitica mista (MLR) - As propriedades imunossupressivas e imunoprivilegiadas das celulas aderentes 2D e 3D derivadas dos procedimentos de cultura produzidas da placenta foram resultado do ensaio MLR, que mede a histocompatibilidade no HLA, conforme obtido por taxa de proliferapao de linfocitos incompativeis na cultura mista de celulas responsivas (proliferantes) e estimulantes (nao proliferativas). As celulas mononucleares do cordao umbilical humano (CB) (2 x 105) foram usadas como celulas responsivas e foram estimuladas por serem co-cultivadas com quantidades iguais (105) de monocitos derivados do sangue periferico (PBMC) humano irradiados (3000 Rad) ou com celulas aderentes 2D ou 3D cultivadas, produzidas a partir da placenta ou uma combinapao de celulas aderentes e PBMCs. Cada ensaio foi replicado tres vezes. As celulas foram co-cultivadas por 4 dias em meio PRMI 1640 (contendo 20% FBS em atmosfera umidificada 5% C02 a 37°C), em uma placa de 96 popos. As placas foram pulsadas com lpC 3H-timidina durante as ultimas 18 horas de cultura. As celulas foram, entao, cultivadas em filtro de fibra de vidro e a captapao de timidina foi 5 quantificada com um contador de cintilapao.

Resultados Experimentais

A Figura 8A mostra a resposta imune das celulas CB, conforme representado pela proliferapao elevada dessas celulas quando estimuladas com 10 PBMCs, que, sem haver ligapao em teoria, esta provavelmente associada a proliferapao de celula T em resposta a incompatibilidade HLA. Entretanto, um nivel consideravelmente menor de resposta imune foi exibido por essas celulas quando encubadas com as celulas aderentes da 15 invenção. Alem disso, a resposta imune CB a PBMCs foi reduzida substancialmente quando co-incubadas com essas celulas aderentes. Assim, de forma semelhante a MSCs, as celulas aderentes foram identificadas por ter a capacidade potencial de reduzir a proliferapao de celula T das celulas 20 doadoras, geralmente GvHD. Embora as duas culturas, 2D e 3D, tenham reduzido a resposta imune dos linfocitos e, em linha com outras vantagens das celulas 3D aderentes descritas acima, as celulas 3D aderentes foram mais imunossupressivas.

EXEMPLO 4 CELULAS 3D ADERENTES FABRICADAS PELA PLURIX EM COMPARAQAO A CELULAS 3D FABRICADAS PELA CELLIGEN

Visando fornecer celulas 3D aderentes em grande escala, um novo sistema de fabricação foi utilizado, doravante denominado Celligen. Materials e Metodos Experimentais Biorreator de Fluxo em Pistao PluriX™ - conforme descrito no Exemplo 1 acima.

Produpao de celulas 3D aderentes por Plurix (celulas PLX) - Conforme descrito no Exemplo 1 acima.

Biorreator de Fluxo em Pistao Celligen™ - A produpao de celulas aderentes pela Celligen™ (celulas PLX-C) e composta per diversas etapas principals, conforme ilustrado na Figura 8B. 0 process© comepa pela coleta da placenta de um parto cesariano planejado a termo.

As celulas aderentes sao, entao, isoladas das placentas, cultivadas em frascos de cultura de tecido (culturas 2D), colhidas e armazenadas em nitrogenio liquido como Estoque de Celula 2D (2DCS), a quantidade apropriada de 2DCS e descongelada, lavada e semeada em carregadores em biorreatores para expansao adicional como cultura 3D. Apos 1-3 semanas de crescimento nos biorreatores, as celulas sao colhidas e criopreservadas em fase gasosa de nitrogenio liquido como PLX-C. Recebimento de Tecido Humano

Todas as placentas obtidas foram recebidas da maternidade mediante a aprovapao do Comite de Helsinki da unidade medica. Consequentemente, todas as doadoras de placenta assinaram um termo de consentimento e Selepao do Doador e Teste de Doador foram realizados (IPC1). Imediatamente apos obter a placenta da doadora (durante o procedimento de cesarea), ela foi colocada em uma bolsa plastica esteril e em uma caixa de isopor com pacotes de gelo. A placenta foi entregue e imediatamente colocada em uma area de quarentena ate liberapao para uso pelo Controle de Qualidade (CQ) e Garantia de Qualidade (GQ) . Todas as etapas de produpao seguintes foram realizadas em instalapoes de sala limpa de quarentena ate que os resultados de aprovapao do teste de mycoplasma do CQ chegaram e as celulas foram liberadas para cultura de celula 2D.

Recuperapao e Processamento de celulas aderentes

Para iniciar o process©, a placenta inteira foi cortada em pedapos em condipoes assepticas sob fluxo laminar, lavada com solupao tampao de Hank e incubada por 3 horas a 37°C com 0,1% de colagenase (1 mg colagenase/ml tecido) . 0 meio de celula 2D (Meio 2D abrangendo DMEM acrescido de 10% FBS, fungizona 0,25 jug/ml e gentamicina 50 çãg/ml) foi adicionado e o tecido dissolvido foi filtrado com um filtro de metal esteril, coletado em um becuer esteril e centrifugado (10 minutos, 1200 RPM, 4°C) . Usando pipetapao leve, as celulas suspenses foram, entao, lavadas com Meio 2D acrescida com antibioticos, semeada em frascos de 80 cm2 e incubadas a 37°C em uma incubadora de cultura de tecido em condipao umidificada acrescida de 5% C02. Apos 2-3 dias, nos quais foi permitido que as celulas aderissem a superficie do frasco, elas foram lavadas com PB e Meio 2D foi adicionado.

Cultura Celular Bi-Dimensional (2D)

Antes da primeira passagem, as amostras do meio de crescimento del0% do numero total do frasco em quarentena foram agrupadas e encaminhadas para teste de mycoplasma (IPC2). Se as celulas fossem identificadas como negativas para mycoplasma, (EZ-PCR Mycoplasma kit, Biological Industries, Israel), eram liberadas da quarentena. Apos 1-2 passagens adicionais, as celulas foram transferidas para a sala limpa de produpao 2D (2DP) . Uma vez na Sala 2DP, a cultura foi continuada por outras 3-5 passagens. A amostra IPC-3 foi obtida para fenotipo imune apos a passagem 4. Durante o processo, as culturas foram cultivadas em Meio 2D sem antibioticos em uma incubadora de cultura de tecido sob condiqoes de umidificaqao com 5% C02 a 37°C. Apos um total de 6-8 passagens (9-16 duplicaqoes celulares), as celulas foram coletadas e criopreservadas como Celula Estoque 2D (2DCS).

A primeira passagem foi geralmente feita apos 10-15 dias. Iniciando na passagem 2 e continuando ate a passagem 6-8, as celulas foram passadas quando a cultura atingiu 70-80% de confluencia, geralmente apos 3-5 dias (1,5-2 duplicates) . As celulas foram separadas dos frascos usando 0,25% tripsina-EDTA (4 minutos a 37°C) e semeadas em uma densidade de cultura de 3 + 0,2 x 10J celulas/cm2 0 tamanho dos frascos de cultura de tecido aumentou conforme as passagens foram ocorrendo. O processo de cultura iniciou em frasco de cultura de tecido de 80 cm2, continuou com 175 cmz, depois em 500 cm2 (Frasco Triple) e finalmente as celulas foram semeadas em bandejas 10 para semeaqao de celulas (6320 cm2) .

Antes da criopreservaqao, no final do periodo de crescimento 2DCS, o meio de crescimento foi coletado e a amostra foi preparada para envio a um laboratorio aprovado pelas BPLs para teste de mycoplasma (IPC4).

Procedimento de Criopreservaqao do Produto de Celula 2D Estoque

Para a criopreservaqao 2DCS, as celulas de cultura 2D foram coletadas em condiqoes assepticas usando 0,25% tripsina-EDTA. As celulas foram centrifugadas (1200 RPM, 10', 4 °C), contadas e ressupendidas em Meio 2D.

Para o congelamento, as suspensoes celulares foram diluidos 1:1 com Mistura Congelante 2D (as concentraqoes finais foram 10% DMSO, 40% FBS e 50% Meio 2D). Aproximadamente 1,5 - 2,5 x 109 celulas foram fabricadas a partir de uma placenta. 4 ml das celulas foram armazenados em uma concentraqao final de 10 x 106/ ml em 5 ml de frascos de polipropileno de criopreservaqao. Os frascos foram rotulados e transferidos para um freezer controlado para um process© de reduqao de temperatura gradual (1 °C/min), apos o que foram transferidos para armazenamento em fase gasosa em um freezer de nitrogenio liquido localizado na Sala Frigorifica. Esse material foi referido como o lote de Celula 2D Estoque (2DCS).

Inicio dos Procedimentos de Cultura Tri-Dimensional (3D)

Para iniciar a cultura 3D, uma quantia apropriada (150 + 30 x 106) de celulas de 2DCS foi descongelada na sala 2DP e lavada com Meio 3D (DMEM com 10% FBS e 20 Mm Hepes) para remover DMSO antes da semeaqao nos sistemas de biorreator preparado com antecedencia. 0 conteudo de cada frasco 2DCS foi pipetado e diluido 1:9 com meio 3D pre-aquecido (37°C). As celulas foram centrifugadas (1200 RPM, 10', 4 °C) e ressuspendidas novamente em 50-100 ml de Meio 3D pre-aquecido (37°C) em um frasco esteril de 250 ml. Uma amostra foi obtida e as celulas foram contadas usando coloraqao Trypan Blue para determiner o numero de celula e viabilidade. A suspensao celular foi transferida em fluxo laminar em um frasco de semeaqao de 0,5L. Do frasco de semeaqao, a suspensao celular foi transferida via tubo esteril para o biorreator por gravitaqao.

Produqao das celulas aderentes 3D no Biorreator Celligen (PLX-C) Descrição do Biorreator

A fase de crescimento 3D foi feita usando um sistema de biorreator BIOFLO 310 ou CelliGen Plus® automatico [(New Brunswick Scientific (NBS)] mostrado na Figura 8C. 0 sistema de biorreator foi usado para cultivo de cultura celular, em que as condiqoes eram adequadas para altas concentraqoes celulares. O processo de cultivo foi feito usando um biorreator em modo de perfusao. 0 biorreator de escala laboratorial foi construido a partir de dois sistemas principals - o sistema de controle e o proprio biorreator (frasco e acessorios). Os parametros do processo foram monitorados e controlados por um console de controle que incluiu conectores para sondas, motor e bombas, loops de controle de Oxigenio Dissolvido (DO), pH, perfusao e agitaqao (com um motor), sistema de controle de gases, circulaqao de agua e sistema de aquecimento para controle de temperatura e interface do operador. Os parametros de processo controlados (como temperatura, pH, DO, etc.) podem ser exibidos na interface do operador e monitorados por um controlador designado.

Procedimento de cultura celular nos biorreatores

Conforme observado na seqao acima, 150 + 30 x 106celulas de 2DCS criopreservadas foram descongeladas, lavadas e semeadas em um biorreator esteril. 0 biorreator continha carregadores de 30-50 gr (discos FibraCel®, NBS, feitos de Poliester e Polipropileno e Meio 3D de 1,5 ± 0,1 L. 0 meio de crescimento no biorreator foi mantido nas seguintes condiqoes: 37 °C, 70 % Oxigenio Dissolvido (DO) e pH 7.3. Os gases filtrados (Ar, CO2, N2 e O2) foram fornecidos conforme determinado pelo sistema de controle para manter o valor DO em 70% e o valor do pH em 7.3. Nas primeiras 24 horas, o meio foi agitado a 50 rotaqoes por minuto (RPM) e elevado para 200 RPM no dia 2. Nos primeiros 2-3 dias, as celulas foram cultivadas em modo de batch. Perfusao foi iniciada quando a concentraqao de glicose media diminuiu abaixo de 550 mg/litro. 0 meio foi bombeado do recipiente de alimentaqao para o biorreator usando tubo de silicone esteril. Todas as conexoes de tubes foram feitas sob fluxo laminar usando conectores estereis.

A perfusao foi ajustada diariamente para manter a concentrapao de glicose constante em aproximadamente 550+ 50 mg\litro. Uma amostra do meio de crescimento foi obtida a 5 cada 1-2 dias para determinapao da concentrapao de glicose, lactato, glutamina, glutamato e amonio (BioProfile 400 analyzer, Nova Biomedical) . A taxa de consume de glucose e a taxa de formapao de lactato da cultura celular permitiu medir a taxa de crescimento celular. Esses parametros foram 10 usados para determinar o tempo de colheita em dados experimentais acumulados.

Colheita das Celulas 3D cultivadas PLX-X do Biorreator

O processo de colheita celular iniciou no final da fase de crescimento (4-10 dias). Duas 15 amostras do meio de crescimento foram coletadas. Uma amostra foi preparada para ser enviada a um laboratorio de BPL aprovado para teste de mycoplasma de acordo com os padroes USP e Eu, e outra foi transferida para um freezer controlado para um processo de redupao de temperatura 20 gradual (1 °C/min), apos o qual foi transferida para armazenamento em fase gasosa de um freezer de nitrogenio liquido na Sala Frigorifica, no caso de um teste de mycoplasma ser necessario. Essas amostras do meio foram consideradas parte do teste de mycoplasma do produto final e 25 os resultados foram considerados como parte dos criterios de liberapao do produto.

A cultura cultivada em 3D foi coletada na area laminar Classe 100 em sala 3DP, como segue:

O recipiente do biorreator foi esvaziado usando gravitaqao atraves do tubo para um recipiente de descarte. 0 recipiente foi aberto removendo a placa superior e os carregadores foram transferidos '5 assepticamente, usando forceps esteril, do cesto para o . cesto superior (ver Figura 8C) . 0 recipiente do biorreator foi, entao fechado e repreenchido com 1,5L de PBS pre- aquecido (37°C) . A velocidade de agitaqao foi elevada para 150 RPM por 2 minutos. O PBS foi drenado atraves de tubo 10 por pressao ou gravidade para o frasco de descarte. 0 procedimento de lavagem foi repetido duas vezes.

Para liberar as celulas dos carregadores, 1,5L de Tripsina-EDTA (Tripsina 0,25%, EDTA ImM) pre-aquecido a 37°C foi adicionado ao recipiente do 15 biorreator e os carregadores foram agitados por 5 minutos em 150 RPM, 37 °C. A suspensao das celulas foi coletada em um recipiente esteril de 5L contendo 250 ml FBS. A suspensao celular foi dividida em tubos centrifuges estereis de 4.500 ml e uma amostra para teste de mycoplasma foi retirada. Os 20 tubos de centrifugaqao fechados foram transferidos por meio da forma de passagem ativa 3D na classe de 10.000 da sala de preenchimento (FR1), onde as celulas foram assepticamente completadas e criopreservadas como PLX-C.

Analise do ciclo celular - As 25 celulas PLX-C obtidas com Celligen e as celulas PLX obtidas por Plurix foram fixadas com 70% EtOH O.N, centrifugadas e ressuspendidas em uma soluqao de iodeto de propidio (PI)contendo2 pg/ml PI (Sigma), 0,2 mg/ml Rnase A (Sigma) e 0,1 % (v/v) Triton (Sigma) por 30 minutos O ciclo celular foi analisado por FACS.

Arranjo de expressao genetica (Microarranjo) - Celulas aderentes foram obtidas das placentas humanas a termo e foram expandidas por Plurix ou Celligen. Tres lotes diferentes de celulas foram obtidos de cada metodo de expansao para exame adicional.

RNA foi extraido das celulas (micro kil Qiagen- Rneasy) e aplicado a um arranjo de expressao de genoma Affymetrix. 0 chip usado foi GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, California, EUA).

Analise FACS dos marcadores da membrana - as celulas foram tingidas com anticorpos monoclonais, conforme descrito anteriormente. Em suma, 400.000-600.000 celulas foram suspensas em 0,1 ml de tampao em citometria de fluxo em um tubo de ensaio de 5 ml e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro, com os seguintes anticorpos monoclonais (MAbs): MAb CD29 anti-humano FITC-conjugado (eBioscience), Mab CD73 anti-humano PE-conjugado (Becton Dickinson), MAb CD105 anti-humano PE- conjugado (eBioscience), Mab CD90 anti-humano PE- conjugado (Becton Dickinson), MAb CD45 FITC- conjugado (IQProducts), MAb CD19 anti-humano PE- conjugado ( IQProduct s) , MAb CD14 anti-humano PE conjugado (IQProducts) , MAb HLA-DR anti-humano FITC conjugado (IQProduct), MAb CD34 anti-humano PE conjugado (IQProducts), MAb CD31 anti-humano FITC conjugado (eBioscience) , MAb KDR anti-humano FITC conjugado (R&D systems) , MAb marcador de fibroblastos anti-humano (D7-FIB) (ACRIS) , MAb CD80 anti-humano FITC-conjugado (BD) , MAb CD86 anti-humano FITC-conjugado (BD), MAb CD40 anti-humano FITC- conjugado (BD), MAb HLA-ABC anti-humano FITC-conjugado (BD), Isotipo IgGl FITC conjugado (IQ Products), Isotipo IgGl PE conjugado (IQ Products).

As celulas foram lavadas duas vezes com tampao de citometria de fluxo, ressuspendidas em 500 nl de tampao de citometria de fluxo e analisadas por citometria de fluxo usando Citometro de Fluxo FC-500 (Beckman Coulter). Controles negativos foram preparados com moleculas fluorescentes de isotipo relevantes.

Reaqao linfocitaria mista (MLR) 2 x 105MNC derivadas de sangue periferico (PB) (do doador A) foram estimuladas com uma quantidade igual de MNCs (do doador B) derivadas de PB irradiadas (3000 Rad). Quantidades elevadas de PLX-Cs foram adicionadas as culturas. Tres replicaqoes de cada grupo foram semeadas em placas de 96 pogos . As celulas foram cultivadas em meio PRMI 1640 contento 30% FBS . As placas foram pulsadas com 1/zC 3H-timidina durante as ultimas 18 horas do dia 5 de cultura. As celulas foram, entao, cultivadas em filtro de fibra de vidro e a captaqao de timidina foi quantificada com um contador de cintilaqao.

Para a colorapao CFSE, as celulas PB-MNC foram marcadas para CFSE (sonda molecular) para medida de proliferapao antes da cultura. As celulas foram coletadas apos 5 dias e a intensidade da colorapao 5 CFSE foi detectada por Citometria de Fluxo.

ELISA

ELISA foi feito conforme descrito anteriormente. Em suma, MNCs isoladas do sangue periferico) foram estimuladas com 5 /xg/ml ConA 10 (Sigma) , 0,5 /zg/ml LPS (SIGMA) , ou 10 çãng/ml PHA(SIGMA) na presenpa de PLX-C sob condipao de umidificapao 5 % CO2 a 37 °C. Sobrenadantes foram coletados e submetidos a analise de citocina usando kits ELISA para IFNy (DIACLONE), TNFa (DIACLONE) e 15 IL-10 (DIACLONE).

Resultados Experimentais

Alterapoes na fabricação com Celligen em comparapao a Plurix resultou em diversas diferenpas importantes (resumidas na Tabela 4 abaixo). Tabela 4: Comparapao entre o sistema Plurix e sistema Celligen

As mudanpas no processo de fabricação resultaram em mudanpas nas caracteristicas das celulas 3D aderentes obtidas. Essas diferenpas estao resumidas abaixo.

A analise do ciclo celular de PLX fabricado pela Plurix em comparapao a PLX-C fabricada pela Celligen - as celulas PLX-C obtidas pela Celligen foram comparadas as celulas PLX obtidas pela Plurix para examinar a distribuipao das celulas entre as diferentes fases do ciclo celular. Conforme fica claro a partir das Figuras 9A- B, as celulas expandidas por Celligen exibiram um perfil de proliferapao tipico (distribuipao das celulas entre as diferentes fases de ciclo celular). Especificamente, 28% das celulas estavam nas fases S e G2/M (Figura 9A) . Esses resultados indicaram que as celulas foram colhidas durante a proliferapao e que as condipoes do biorreator Celligen sustentaram o crescimento celular.

A comparapao de microarranjo entre as celulas obtidas de Plurix e Celligen - arranjos de expressao genetica permitiram monitorar simultaneamente os perfis de expressao de genoma das celulas aderentes derivadas das placentas humanas a termo expandidas por Plurix (PLX) ou Celligen (PLX-C). Esses resultados permitiram avaliar o mecanismo molecular subjacentes A variapao fenotipica entre as celulas obtidas por esses metodos de crescimento diferentes (ver Tabela 5 abaixo). Tabela 5: Expressao genetica em Celligen comparada as celulas Plurix

Expressao dos marcadores celulares nas celulas PLX-C - os antigenos de superficie expresses por PLX-C foram examinados usando anticorpos monoclonais. Os resultados indicaram que as celulas PLX-C foram caracterizadas pelos marcadores positives: CD73, CD29 e CD105 e marcadores negatives: CD34, CD45, CD19, CD14 w HLA-DR (dados nao mostrados) . As especificapoes do teste fenotipo imune foram determinadas como: £ 90 % de todos os marcadores positives e 3% de todos os marcadores 10 negatives.

Alem disso, conforme mostrado nas Figuras 10A-B, as culturas PLX-C nao expressaram os marcadores endoteliais, conforme mostrado por coloraqao negativa para os dois marcadores endoteliais CD31 e KDR.

Entretanto, a expressao PLX-C de um marcador tipico de fibroblasto foi evidente (expressao de D7-fib, Figura10C) .

Propriedades de imunogenicidade e imunomoduladoras das celulas PLX-C - como PLX-C e composto de celulas aderentes da placenta, e esperado que expresse HLA tipo I, que e express© por todas 5 as celulas do corpo e conhecido por induzir uma resposta imune alorreativa. HLA tipo II e outras moleculas co-estimulatorias sao tipicamente expresses apenas na superficie das Celulas Apresentadoras de Antigeno (APCs).

Para examinar a imunogenicidade das celulas PLX-C obtidas, a expressao de moleculas co-estimuladoras na superficie dessas membranas celulares foi feita. A analise FACS demonstrou a ausencia de CD80, CD86 e CD40 nas membranas das celulas PLX-C (Figura 11A-C). Alem disso, PLX-C expressou baixos niveis de HLA 15 classe I conforme detectado pela coloraqao para HLA A/B/C (Figura 11D). A expressao das moleculas estimuladoras e co- estimuladoras foi semelhante a MSCs derivada da medula ossea (MO) (conforme mostrado nas Figuras 11A-D).

Para investigar ainda mais a 20 imunogenicidade, bem como as propriedades de imunomodulaqao das celulas PLX-C, testes de Reaqao Mista de Linfocitos (MLR) foram realizados. Conforme mostrado na Figura 12A-B, as celulas PLX-C escapam do alorreconhecimento e reduzem a resposta de celula T, conforme medido pela incorporaqao de 25 Timidina. Alem disso, a reduqao na proliferaqao dos linfocitos (avaliada pela mediçãao de CPM) foi maior, conforme o numero de celulas PLX-C aumentou (de forma dose dependente). A PLX-C tambem reduziu a proliferaqao de linfocito apos a estimulapao mitogenica, como Concavalina A (Con A, Figura 12B) e Fitohemaglutina (PHA) e estimulapao nao especifica por anti-CD3, anti-CD28 (dados nao mostrados).

Para investigar o mecanismo de apao pelo qual PLX-C imunomodula a proliferapao de linfocitos e para verificar se essa apao e mediada via interapao celula com celula ou secrepao de citocinas, celulas Mononucleares derivadas de PB (MNCs) foram estimuladas por PHA usando o metodo de tranwell (que evita que contato celula com celula, mas permite a difusao da citocinas entre os dois compartimentos) . Os resultados mostraram que a inibipao da proliferapao se manteve mesmo quando o contato celula a celula foi inibido (dados nao mostrados)

Secrepao de citocinas -conforme mostrado acima, a PLX-C reduz a taxa de proliferapao dos linfocitos, provavelmente por meio de fatores soluveis. Investigapoes adicionais das citocinas secretadas pelos linfocitos em resposta a PLX-C foram realizadas para elucidar o mecanismo de apao de PLX-C. Conforme mostrado nas Figuras 13A-B, a cultura de celulas mononucleares com PLX-C reduz um pouco a secrepao da citocina pro-inflamatoria INFy e reduz dramaticamente a secrepao de TNFo (mesmo na presenpa de baixas quantidades de PLX-C) . Alem disso, apos a estimulapao de lipopolissacarideos (LPS), a secrepao de IL-10 de MNCs derivadas de PB aumento na presenpa de PLX-C, enquanto que o nivel de secre<?ao de TNFa diminuiu, de uma forma dose- dependente (Figura 13C).

EXEMPLO 5 BIODISTRIBUIQAO DE PLX-C Materials e Metodos Experimentais Transfecpao de celulas PLX-C com vetor de expressao Luciferase

As celulas PLX-C foram infectadas de forma estavel com um constructo lentiviral expressando o gene de luciferase sob o promotor de CMV (Figura 14).

Produpao de virus infectantes

As celulas produtoras 293TN foram cultivadas em meio DMEM (Gibco) acrescidas de soro e 15 antibioticos por 2-3 dias (50-70% de confluencia) antes da transfecpao. Uma mistura de 10 pig do plasmideo e 2 pig do constructo de expressao e 20 ngde Reagente Plus (Invitrogen) foi adicionada a 400 pig de DMEM sem adipoes. A mistura foi incubada por 15 min em temperatura ambiente e Lipof ectamine™ (30 pil diluido em 400 pil de DMEM foram adicionados) A mistura foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos. Celulas 293TN foram lavadas e transferidas para um meio de 2% de soro e a mistura de transfecpao foi adicionada. As celulas foram incubadas em incubadora de CO2 a 37°C durante a noite e o meio foi coletado 24-60 horas apos a infecpao. A produpao de pico de virus foi atingida apos 48 horas. 0 meio foi coletado e centrifugado a 3000 rpm em temperatura ambiente por 5 minutos para peletizar os fragmentos de celulas. Apos a centrifugaqao, o sobrenadante foi filtrado por filtros PVDF Millex-HV 0,45 pm (Millipore, Cat. #SLHVR25LS). Infecqao de PLX-C

As celulas PLX-C foram semeadas em uma placa de 24 poqos em uma densidade de 0.6-1 x 105 celulas por poqo em meio complete 24 horas antes da infeepao viral. Apos 24 horas, 0,5 ml de suspensao de virus (diluida em meio complete com Polybrene em uma concentraqao final de 5-8 pg/ml) foi adicionado. As celulas foram incubadas por 24 horas, entao, o meio foi substituido por meio DMEM complete e as celulas foram incubadas a 37°C com 5% CO2 durante a noite. No dia 4, a cultura atingiu confluencia e foi dividida em 1:3 a 1:5, as celulas foram deixadas crescendo por 48 horas em DMEM complete e analisadas quanto a expressao de Luciferase.

As taxas de eficiencia de infeeqao ficaram perto dos 100%. A avaliaqao da luminescencia em celulas vivas e em camundongos vivos foi 20 feita usando o sistema de Imagem IVIS Lumina, que incluia uma camera CCD altamente sensivel que capturava o sinal de luminescencia de luciferase.

Duas semanas apos a infeeqao 2 x 106 celulas firam injetadas IM ou IV em camundongos 25 SCID/Beige, NOD/SCID, SCID e Balb/C. As celulas injetadas foram monitoradas usando o sistema IVIS descrito.

Resultados Experimentais

Conforme evidente a partir dos resultados, as celulas CXL continuaram a se dividir apos a infecqao e os niveis de expressao de luciferase nas celulas em crescimento continuaram fortes e estaveis (Figura 15) .

Uma vez que as celulas PLX-C foram injetadas em camundongos Balb/C, o padrao de biodistribuiqao foi examinado. Conforme evidente a partir dos resultados, as celulas desapareceram 72 horas apos a injeqao IM (dados nao mostrados). Entretanto, as celulas PLX-C detiveram niveis altos constantes da expressao de luciferase, in vitro, por mais de tres semanas (dados nao mostrados).

Conforme mostrado nas Figuras 16A-D, as celulas injetadas IM em camundongos SCID/Beige imunodeficientes foram retidas por ate 5 dias no local da injeqao e nao foram observadas apos isso. AS celulas CXL injetadas IV em camundongos SCID/Beige migraram apos 24 horas para os pulmoes, depois para o local da injeqao (presumidamente retornando ao local da lesao). Posteriormente, as celulas desapareceram gradualmente e nao foram observadas apos 3-4 semanas.

EXEMPLO 6 CELULAS ADERENTES SAO CAPAZES DE TRATAR ISQUEMIA DE MEMBRO IN VIVO

Para determiner se o implante de celulas aderentes derivadas da placenta pode reduzir o dano isquemico e melhorar as funqoes clinicas e motoras, o modelo de isquemia do membro traseiro foi usado, conforme segue.

Materials e Metodos Experimentais

Modelo de Isquemia do membro traseiro - Isquemia do membro traseiro foi induzida em 20 camundongos machos Balb/c, que nao sao imunodeficientes, com peso corpora- de aproximadamente 25 g + 20 %. O tratamento dos animais foi de acordo com o National Institute of Health (NIH) and the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Os animais foram abrigados de acordo com as condiqoes laboratoriais padrao. Os animais foram mantidos em um ambiente com clima controlado. A faixa de temperatura foi entre 20 - 24 °C e a umidade relativa (UR) foi entre 30 - 70% com ciclo de 12 horas de luz e 12 horas no escuro.

Os animais foram randomizados usando um programa de random!zat;ao gerada por computador "Research Randomizer" e divididos em 2 grupos de 10 animais. Um grupo recebeu injeqao intramuscular (IM) de 1 x 106 de celulas aderentes derivadas da placenta (PLX-C) e o outro grupo serviu como controle e foi injetado com PBS.

Procedimentos Cirurgicos - Incisao de 1-1,5 cm foi feita na pele na area inguinal. A arteria femoral foi ligada duas vezes com fio de seda 6-0 e feita a transeqao distal ate a ligaqao. A ferida foi fechada com fio de sedo 3-0 e os camundongos foram deixados para recuperaqao. Cinco horas apos a excisao de uma arteria femoral, os camundongos receberam uma injeqao IM de 1 x 106 celulas aderentes derivadas da placenta (PLX-C) em um volume total de 50 pil em 2 locais de administraqao. Os animais do grupo de controle foram injetados de forma identica com PBS (Gibco), ver Tabela 6 abaixo.

Acompanhamento - 0 fluxo sanguineo nas pernas dos dois lados foi medido 3 vezes consecutivas com um laser Doppler sem contato logo apos a operaqao e nos dias 6, 9, 14 e 21 pos-operaqao e e express© como a razao do fluxo no membro isquemico em relaqao ao membro normal [Tokai. J. et al].

Avaliaqao macroscopica da gravidade isquemica - 0 membro isquemico foi macroscopicamente avaliado nos dias 1, 6, 9, 14, 21, ate o termino do estudo usando escalas morfologicas graduadas da area necrotica ; grau 0 : ausencia de necrose, grau I : necrose limitada aos dedos (perda dos dedos, grau II : necrose se estendendo ate o dorso do pe (perda do pe) , grau III: necrose se estendendo ate a perna (perda do joelho), grau IV : necrose se estendendo ate a coxa (perda total do membro traseiro) [Tokai. J. et al].

Avaliaqao in vivo da funqao do membro e dano isquemico - Avaliaqao semiquantitativa do uso debilitado do membro isquemico foi feita serialmente da seguinte dorma: 3 = pes arrastando, 2 = sem arrastar, mas sem flexao plantar, 1 = flexao plantar e 0 = flexao dos dedos para resistir a traqao leve d rabo (Rutherford et al., 1997) .

Analise molecular e bioquimica Alem da avaliaqao clinica, as amostras moleculares e bioquimicas foram obtidas no dia 21 e estao sendo analisadas atualmente para melhor compreender os mecanismos moleculares sustentando a melhor cicatrizaqao nos grupos injetados com celulas aderentes derivadas da placenta (PLX-C).

Resultados Experimentais

Implante de celulas aderentes derivadas da placenta induzem significativamente o fluxo sangufneo no quadril e pe do modelo de membro traseiro isquemico - Para testar a eficacia das celulas aderentes in vivo, os camundongos passaram po ligaqao de arteria seguida por injeqoes intramusculares das celulas aderentes derivadas da placenta e o fluxo sanguineo foi medido nos quadris e pe (dos dois lados do corpo) usando um laser Doppler sem contato em um periodo pre-determinado apos o tratamento. Conforme mostrado na Figura 17, a injeqao de PLX-C melhorou acentuadamente o fluxo sanguineo (BF) do membro danificado, conforme determinado por avaliaqoes de fluxo sanguineo, aumento na funqao do membro, aumento na densidade capilar, diminuiqao no stress oxidativo e dano endotelial. Em termos de fluxo sanguineo,o efeito foi demonstrado 9 dias apos a injeqao e foi observado durante todo o estudo. No grupo tratado com PLX-C, o BF aumentou de 24 + 2,3 a + 4,7 %, enquanto que no controle, o BF do grupo tratado com o veiculo ficou na faixa de 35 + 2 a 54 ±4,5 % - na area do implante/quadril (dia 0 vs. dia 21, respectivamente). De forma semelhante a area do quadril, mas em menor extensao, um aumento no BF tambem foi demonstrado na area da pata dos camundongos tratados com PLX-C. Assim, no grupo tratado com veiculo, o BF aumentou de 12 + 0,6 a 46 + 4,9 %, enquanto que no grupo de PLX-C o BF aumentou de 10 + 0,7 a 52 ± 5,5 % (dia 0 vs. dia 21, respectivamente), conforme mostrado na Figura 17.

As celulas aderentes sao capazes de melhorar a funqao do membro in vivo - Para melhor avaliar os efeitos in vivo das celulas aderentes derivadas da placenta, as funqoes dos membros nos camundongos tratados foram avaliadas usando o sistema de classificaqao descrito em Materials e Metodos Experimentais acima. Conforme mostrado na Figura 18, os camundongos tratados com as celulas aderentes exibiram uma melhoria significativa na funqao do membro (2,5 ± 0,2 vs. 2,1 + 0,2 controle vs. grupo PLX-C, respectivamente, observando o efeito significativo no dia 21 pos-tratamento). Entretanto, o nivel de melhoria na funqao do membro durante os 21 dias de observaqao foi comparavel, sugerindo que PLX-C nas condiqoes do presente estudo nao exibiu uma mudanqa importante na funqao de recuperaqao.

A avaliaqao macroscopica da gravidade isquemica revelou que no controle, o grupo tratado com veiculo, necrose limitada aos dedos foi observada em dois animais no dia 6. No grupo tratado com PLX-C, necrose limitada aos dedos foi demonstrada apenas em um animal e apenas apos 14 dias. Analises pos-morte imunohistoquimicas dos membros tratados com PLX-C indicaram um aumento significativo no numero de novos capilares (vasos) suprindo o membro e sugerindo que PLX-C possui a capacidade de promover angiogenese (Figura 19) .

Por firn, um menor stress oxidativo e redupao na inflamapao endotelial (que foi um parametro substituo para melhor funpao endotelial) nos animais tratados foram observados nos camundongos tratados com PLX-C (Figuras 20A-B). Isso foi provavel em razao do aumento no suprimento de oxigenio em camundongos tratados com celulas PLX-C, mas nao em camundongos tratados com PBS.

Concluindo, em comparapao aos controles, camundongos injetados com PBT, nenhum dos camundongos injetados com PLX-C exibiu quaisquer sinais ou sintomas clfnicos adversos em resposta a administrapao de celula intramuscular (i.m.). Assim, PLX-C induz um aumento no fluxo sanguineo, provavelmente resultante da angiogenese, conforme sustentado pela avaliapao histologica do membro danificado. Alem disso, o atraso no desenvolvimento da necrose e a diferenpa no numero de animais afetados e sugestivo de uma resposta clinica.

Implante de celulas aderentes derivadas da placenta

Outro estudo de eficacia foi feito em camundongos Balb/C envolvendo endpoints de seguranpa (isto e, necropsia macroscopica e analise histopatologica dos orgaos selecionados), conforme descrito na seQao de materials e metodos acima.

Neste estudo, sete grupos de camundongos, cada um consistindo em 10 camundongos machos Balb/c (membro traseiro isquemico) foram usados conforme 5 detalhado na Tabela 7 abaixo. Um grupo unico de 10 camundongos nao teve isquemia induzida (para testar a seguranqa geral e tolerabilidade das celulas PLX-C em animais saudaveis normals). Apos a induqao da isquemia, o tampao de controle ou celulas PLX-C foram administrados i.m. no membro afetado e os camundongos foram observados por ate 1 mes apos a dose. Um grupo unico de camundongos recebeu duas injeqoes separadas no membro afetado, separadas em 1 semana (Dias 1 e 8) . O fluxo sanguineo foi monitorado por analise de Laser Doppler e a gravidade isquemica foi 15 avaliada macroscopicamente e comportamentalmente em ate 30 dias apos a dose, quando os camundongos foram sacrificados e os tecidos retidos para analise histologica.

Neste estudo, lotes diferentes de PLX-C em tres concentraqoes foram administrados. Os resultados mostraram que 0,1 x 106 e 0,5 x 106 PLX-C tiveram um beneficio terapeutico inferior. Uma melhoria notavel no fluxo sanguineo foi observada no dia 29 (termino do experiment©) nos animais tratados com 1 x 106. Essa melhoria no fluxo sanguineo foi significativa (p <0,05) no grupo 2M (lote G.C25) em comparapao ao controle, camundongos injetados com veiculo. Alem disso, uma segunda injepao do mesmo lote de celulas melhorou significativamente o BF no dia 15 em comparapao a uma unica injepao (55 + 24 comparado a 31 ± 12,9 e 27 + 12,5%, respectivamente). A avaliapao macroscopica da gravidade isquemica revelou que houve uma tendencia de melhora nos grupos recebendo 1 x 106 (IM &2M) em comparapao ao grupo tratado com veiculo de controle (6M).

Em conjunto, esses resultados demonstraram a eficacia das celulas aderentes de induzir a vascularizapao (exemplo, fluxo sanguineo) e de melhorar a funpao do membro no modelo de camundongos de membros traseiros isquemicos e sugerem o uso dessas celulas (exemplo, celulas aderentes derivadas da placenta) no tratamento de doenpas de membro isquemico.

EXEMPLO 7 PLX-C PARA 0 TRATAMENTO DE DERRAME

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficacia terapeutica do transplante de celulas aderentes derivadas da placenta PLX-C humanas sistemicas (intravenosa) no tratamento do derrame.

Materials e Metodos Experimentais Sujeitos de pesquisa, cirurgia e transplante

Ratos machos espontaneamente hipertensos, sofrendo de hipertensao, hipercolesterolemia, diabetes e microangiopatias foram usados. Os animais foram mantidos sob condipoes constantes no que se refere a temperatura, umidade do ar e ciclo claro/escuro. Os sujeitos de pesquisa foram designados a grupos experimentais de forma aleatoria (ver Tabela 8 abaixo).

Os animais receberam uma dose unica ou dupla de 1 x 106 PLX-C lotes diferentes. Todos os procedimentos de transplante foram feitos por via intravenosa. O grupo injetado 2 vezes foi transplantado 10 e 24 horas apos isquemia cerebral, enquanto os transplantes unices foram feitos em 24 horas do derrame. Todas as 15 celulas transplantadas foram pre-rotuladas com corante fluorescente PKH26.

Isquemia cerebral experimental foi feita por meio de oclusao permanente da arteria cerebral direita. Importante dizer que um animal morreu apos a 20 anestesia.Investigaqao por ressonancia magnetica (RM) RM do desenvolvimento da lesao foi feita nos dias 1, 8, 29 e 60 usando um scanner 1.5T (Philips). Volumetria do infarto e atrofia cerebral foram medidos e calculados como medias dos valores obtidos por tres investigadores cegos usando sequencias T2 coronarias. Testes comportamentais

Alteraqoes funcionais foram medidas usando dois arranjos de teste comportamental dependentes. O teste de caminhada em barra e um teste comum usado para quantificar os deficits sensoriais-motores. Os ratos foram condicionados a correr por uma barra horizontal 10 montada com a gaiola do rato no final. 0 tempo de transito foi medido por cinco vezes e documentado como valor medio diurno. A inclinaqao na barra foi avaliada com 20 segundos e queda com 30 segundos. As avaliaqoes ocorreram diariamente durante a primeira semana e a cada sete dias ate 15 o final do periodo de observaqao.

O segundo teste, a classificaqao de gravidade neurologica modificada (mNSS) , continha itens sensoriais, motores e reflexos adicionais. 0 resultados da mNSS foram expresses como uma classificapao 20 entre 1 e 18, em que os pontos entre 1 e 6 mostram uma lesao leve, 7 a 12 moderada e 13 a 18 grave. A avaliapao da classificapao mNSS foi realizada nos dias 1, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 apos isquemia cerebral.

Histologia

Apos o termino do period experimental, todos os ratos foram sacrificados e passaram por perfurapao transcardiaca com 4% de solupao formalina. Os cerebros extraidos foram criopreservados e cortados em sepoes de 30 pm de espessura. Para avaliapao da reapao glia, uma investigapao imunohistoquimica foi feita com anticorpo primario contra GFAP. Uma area ampla de 750 pm foi examinada (semi-quantitativamente) proxima a area do infarto para verificar a densidade das celulas GFAP+. Para inspepao da reatividade astroglial, 15 regioes foram incluidas com uma media de 0,6 mm de espapo de diferenpa. Estatistica

Todos os dados relatives ao peso, analise de RM e exames histologicos foram investigador para distribuipao Gaussiana e analisados quanto as diferenpas estatisticamente significativas usando ANOVA e, apropriadamente, a ANOVA nas classificapoes.

Os dados coletados no teste de caminhada e mNSS passaram por analises estatisticas detalhadas possibilitando avaliapoes repetidas dos sujeitos de pesquisa, bem como o desenvolvimento temporal de sujeitos de pesquisa individualmente (analise estratificada). Para balancear as diferenpas interindividuais em relapao ao grau de dano cerebral, um modelo de interceptapao aleatoric foi usado. Os dados coletados no teste de caminhada, assim,tiveram que ser transformados em um sistema categorico.

Aqui, os valores temporals de menos de 5 segundos foram considerados como categoria (0), 5 a 10 segundos; como categoria (1), 10 a 15 segundos; como categoria (2), 15 a 20 segundos; como categoria (3), inclinapao como categoria (4) e queda como categoria (5) .

Resultados Experimentais Peso

A pesagem periodica possibilitou uma boa estimativa do estado geral de saude do sujeito de pesquisa. Uma redupao inicial do peso foi observada em todos os grupos em razao da anestesia e da intervenpao cirurgica (dados nao mostrados). Subsequentemente, uma rapida normalizapao de peso e um curso estavel ate o termino do experiment© no dia 60 foram observados (dados nao mostrados). Os grupos experimentais mostraram uma progressao homologa de peso corporal. Teste de Caminhada em Barra

Todos os grupos experimentais mostraram uma redupao significativa das categorias da Caminhada durante o curso do experiment© (dados nao mostrados). Uma redupao significativa menor nas categorias da caminhada foi observada no grupo experimental 1 (PLX-C lote 1 de administrapao unica) em comparapao ao grupo de controle (-0,01247 vs. -0,02931, respectivamente). Nao houve evidencia de diferenpas estatisticamente significativas entre o grupo experimental 3 (PLX-C lote 2 de administrapao unica) e o grupo de controle (dados nao mostrados).

Classificapao de Gravidade Neurologica Modificada (mNss)

Todos os grupos experimentais mostraram uma redupao significativa nos pontos de classificapao neurologica (dados nao mostrados). A comparapao dos resultados do mNSS dos sujeitos de pesquisa tratados com PLX-2 (PLX-C de administrapao dupla) revelou uma superioridade estatisticamente significativa em comparapao ao grupo de controle. 0 transplante duplo do lote 2 (grupo 3) mostrou uma melhoria significativa no teste mNSS comparado a injepao simples do mesmo lote (dados nao mostrados). Volumetria do Infarto

Ressonancia magnetica e um metodo altamente sofisticado para estimar o grau de dano cerebral e perda de tecido in vivo. Levando as flutuapoes interindividuais em considerapao, o desenvolvimento do volume do infarto foi estipulado como percentual do volume de infarto no dia 1, individualmente. O volume do infarto no dia 1 nao diferiu significativamente entre os grupos experimentais. O desenvolvimento geral do volume de infarto mostrou uma redupao aproximada de 50% entre o dia 1 e o dia 8. Isso foi decorrente principalmente da retrogressao do edema cerebral inicial. 0 exame do desenvolvimento da lesao in vivo usando RM revelou que os sujeitos de pesquisa do grupo 4 (PLX-C lote 2 de administrapao dupla) mostraram um coeficiente de infarto reduzido de forma significativa no Dia 60 (0,48 + 0,02 vs. 0,60 ± 0,03, respectivamente,resultados nao mostrados).

Considerados em conjunto, esses resultados indicaram que a administrapao intravascular de PLX-C resultou em uma melhoria significativa da recuperapao funcional nos dois testes comportamentais no tratamento do derrame. Alem disso, uma superioridade consideravel e estatisticamente significativa dos transplantes duplos PLX-C foi observada em comparapao a injepao unica analoga.

Uma corroborapao das melhorias comportamentais medidas por RM foi evidente em sujeitos de pesquisa tratados duas vezes com PLX-C. Alem disso, uma redupao significative do volume de infarto e atrofia cerebral foi observada no final do experimento. Alem disso, nos dois testes funcionais, uma melhoria estavel da recuperapao funcional apos o transplante de dose-dupla de PLX-C foi observada nos controles e efeitos nao verificados com as injepoes unicas. EXEMPLO 8 TRATAMENTO DE PATOLOGIAS QUE DEMANDAM REGENERAQAO E/OU REPARO DO TECIDO CONECTIVO

Patologias em tratamento que requerem regenerapao ossea e/ou reparo usando as celulas aderentes da invenção

Os modelos animais (exemplo coelhos New Zeland White adultos) sao usados para examinar o efeito de celulas aderentes da invenção (que sao derivadas do tecido da placenta ou adiposo e sao obtidas a partir de uma cultura 3D, exemplo, celulas PLX-C) na cicatrizapao de defeitos segmentais de tamanho critico no femur. Os animais sao aleatoriamente designados para um dos tres grupos. Os animais do grupo A foram injetados com 1-10 x 106 das celulas aderentes (celulas PLX-C) no local defeituoso. Os animais do grupo B foram injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito foi deixado sem tratamento. Radiografias sao feitas imediatamente apos a operapao e em intervalos de uma semana. Em 12 semanas, os animais sao sacrificados, os femures envolvidos sao removidos e as sepoes histologicas descalcificadas dos defeitos e osso adjacente sao preparadas. Estudos mecanicos, histologicos e histomofometricos sao realizados para examinar a cicatrizapao dos defeitos e a formapao de osso no e ao redor do local defeituoso. Alem disso, uma reapao em cadeia da polimerase por transcriptase reversa (RT-PCR) 1 feita para detectar mRNA de colageno tipo I e tipo II.

Patologias em tratamento que requerem regenerapao ossea e/ou reparo usando as celulas aderentes da invenção

Os modelos animais (exemplo, coelhos New Zealand White com esqueleto maduro) sao usados para examinar o efeito das celulas aderentes da invenção (exemplo, celulas PLX-C) na cicatrizapao dos tendoes. Os tendoes hallucis longus sao traduzidos em tuneis com diametro de 2,5-mm do osso calcaneu. Os tuneis osseos sao tratados com ou sem PLX-C. Os animais sao designados aleatoriamente a um dos tres grupos. Os animais do grupo A foram injetados com 1-10 x 106 celulas PLX-C no local defeituoso ou IV. Os animais do grupo B foram injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito foi deixado sem tratamento. Tres especimes de cada grupo sao colhidos em 2, 4 e 6 semanas apos a operapao e a avaliapao das caracteristicas morfologicas do tendao em cicatrizapao na interface ossea e feita com o uso de histologia convencional e localizagao imunohistoquimica de colageno Tipos I, II e III.

Patologias em tratamento que requerem regeneraqao e/ou reparo de cartilagem usando as 5 celulas aderentes da Invenção

Os modelos animals (exemplo, coelhos New Zealand White com esqueleto maduro) sao usados para examinar o efeito das celulas aderentes da Invenção (exemplo, celulas PLX-C) na cicatrizaqao da cartilagem. Um 10 defeito de espessura total da cartilagem articular do sulco patelar do femur distal esquerdo feito. Uma ponta de cerca de 6 mm e retirada da fascia sobre o musculo do quadriceps e suturada na margem periferica do defeito artificial com 6-0 categute. Os animais sao aleatoriamente designados para um 15 dos tres grupos. Os animais do grupo A foram injetados com 1-10 x 106 celulas PLX-C no local defeituoso ou IV. Os animais do grupo B foram injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito foi deixado sem tratamento. Os animais sao sacrificados. Quatorze semanas apos o implante das celulas PLX-C no defeito osteocondral, os femures distais sao amputados e a avaliaqao histologica e feita e os especimes graduados semi-quantitativamente com base na natureza predominante do tecido de reparo, coloraqao matriz, regularidade da superficie, integridade estrutural, 25 espessura do reparo, aposiqao entre a cartilagem reparada e as cartilagens normals circundantes, liberdades dos sinais degenerativos no tecido de reparo e liberdade das mudanqas degenerativas da cartilagem normal circundante.

Patologias em tratamento que requerem regenerapao e/ou reparo de ligamento usando as celulas aderentes da invenção

Os modelos animais (exemplo, coelhos New Zealand White com esqueleto maduro) sao usados para examinar o efeito das celulas aderentes da invenção (exemplo, celulas PLX-C) na cicatrizapao da ligamento. Defeitos circulares unicorticais de 8 mm de diametro serao realizados. Os animais sao aleatoriamente designados para um dos tres grupos. Os animais do grupo A foram injetados com 1-10 x 106 celulas PLX-C no local defeituoso ou IV. Os animais do grupo B foram injetados com PBS. Nos animais do grupo C, o defeito foi deixado sem tratamento. Os animais sao sacrificados quatorze semanas apos o implante das celulas PLX-C no defeito do ligamento. Avaliapoes histologicas sao realizadas e os especimes sao graduados semi-quantitativamente com base na natureza predominante do tecido reparado.

E avaliado que algumas caracteristicas da invenção, que sao, para clareza, descritas no contexto de partes separadas, tambem possam ser fornecidas em combinapao em uma parte unica. Ao contrario, varias caracteristicas da invenção, que sao, por redupao, descritas no contexto de uma unica parte, podem ser fornecidas separadamente ou em alguma subcombinapao adequada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com partes especificas, e evidente que muitas alternativas, modificapoes e variapoes serao aparentes para aqueles especializados na area.

Consequentemente, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificapoes e variances que estao incluidas no espirito e escopo amplo das reivindicaçoes anexas. Todas . as publicapoes, patentes e pedidos de patente e numeros de acesso do GenBank mencionados nesta especificapao sao incorporados em sua total idade pela referenda na especificapao, na mesma extensao como se cada publicapao, patente ou pedido de patente ou numero de acesso do GenBank individuals fosses especificamente e individualmente indicados para serem incorporados aqui por referenda. Alem disso, a citapao ou identificapao de qualquer referenda neste pedido nao deve ser interpretado como uma admissao de que essa referenda esteja disponivel antes da invenção. REFERENCIAS (Referencias adicionais sao mencionadas no texto) Bauer, Thomas W., Muschler, George F., Bone Graft Materials: An Overview of the Basic Science. Clinical Orthopaedics & Related Research. 371:10-27, February 2000. Carstanjen B, Desbois C., Hekmati M, and Behr L. Successful engraftment of cultured autologous mesenchymal stem cells in a surgically repaired soft palate defect in an adult horse. Can J Vet Res. 2006 April; 70(2): 143-147. Bruder SP, et al. 1998 The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J Bone Joint Surg Am. 80 (7) :985-96. Chao Wan, Qiling He, Gang Li, 2006. Allogenic peripheral blood derived mesenchymal stem cells (MSCs) enhance bone regeneration in rabbit ulna critical-sized bone defect model. Journal of Orthopaedic Research 24 (4) 610-618. Herthel D. J. 2001, Enhanced Suspensory Ligament Healing in 100 Horses by Stem Cells and Other Bone Marrow Components. AAEP PROCEEDINGS / Vol. 47. Gordon et al, Tendon Regeneration Using Mesenchymal Stem Cells.p313-320 in Tendon Injuries. Springer London. 2005. Horwitz et al., 1999. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat. Med. 5:309-313. Horwitz et al., 2002. Isolated allogeneic bone marrow- derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in 15 children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. PNAS 99(13)8932-8937. Livingston, T. L. 2003 Mesenchymal stem cells combined with biphasic calcium phosphate ceramics promote bone regeneration. Journal of Materials Science: Volume 14 20 (3) :211-218. Young et al. 1998. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J Orthop Res. 16 (4) :406-13 .Legenda das Figuras Figuras 1A, IB, 1C, ID, IE, IF A) Osso denso B) Tranportador *150 C) 20 dias *150 D) 20 dias *250 E) 40 dias *350 F) 20 dias *500 Figura 8B G) Recebimento, recuperaqao e processamento de celulas aderentes do Plasma Humano H) Crescimento celular bidimensional (2D) I) Procedimento de Criopreservaqao para o Produto do Estoque de Celulas 2D J) Semeadura de aproximadamente 5 X 106celulas aderentes em culturas tridimensionais (3D), em um biorreator Celligen, em perfusao constante e com monitoramento constante do pH, temperatura, niveis de glicose, etc K) Crescimento celular em biorreator L) Colheita das Celulas aderentes 3D no biorreator M) Envase asseptico e criopreservaqao N) Armazenagem de celulas PLX-C em nitrogenio liquido Figura 8C O) Sistema de controle automatico do volume P) Bomba de alimentaqao Q) Sonda de nivel R) Bomba de colheita S) Sistema de aeraqao T) Difusor U) Cobertura V) Localizaqao do Motor X) Placa superior Y) Rede do cesto superior W) Transportadores - nos quais ocorre o crescimento celular Z) Impulsor com difusor Figura 14 Al) pRecebedor-Lv33 (a, x, y) Expressao Clone - 6850+mc 5 Figura 16A e 16B Bl) 24 horas apos a injeqao Cl) Injeqao IV DI) Injeqao IM El) 4 dias apos a injeqao 10 Figuras 16C e 16D Fl) 6 dias apos a injeqao GI) 22 dias apos a injeqao Cl) Injeqao IV DI) Injeqao IM 15 Figuras 19A e 19B Hl) Ampliaqao 400x

Claims (9)

1. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende um material de embalagem que compreende um rotulo para uso no tratamento de isquemia, o referido material de embalagem embalando uma quantidade farmaceuticamente eficaz de celulas placentarias aderentes, em que pelo menos 10% das referidas celulas aderentes estao em uma fase proliferativa, em que as referidas celulas sao propagadas utilizando uma cultura tridimensional (3D), e em que as condipoes de cultura da referida cultura tridimensional compreendem um material aderente que e poliestireno.

2. Artigo de fabricação de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cultura tridimensional (3D) e efetuada em um biorreator 3D.

3. Artigo de fabricação de acordo com a reinvindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cultura das referidas celulas na referida cultura 3D e efetuada sob perfusao.

4. Artigo de fabricação de acordo com a reinvindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida taxa de perfusao e ajustada com o intuito de manter uma concentrapao de glicose constante no meio da cultura.

5. Artigo de fabricação de acordo com a reinvindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida concentrapao de glicose constante e 550 mg/L ± 50 mg/L.

6. Artigo de fabricação de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as referidas celulas compreendem uma expressao de marcador positivo selecionado a partir do grupo que consiste em CD73, CD90, CD29 e CD105.

7. Artigo de fabricação de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as referidas celulas compreendem uma expressao de marcador negativo selecionado a partir do grupo que consiste em CD3, CD4, CD45, CD80, HLA-DR, CD11b, CD14, CD19, CD34 e CD79.

8. Artigo de fabricação de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas celulas aderentes compreendem um fenotipo de celulas tronco estromais.

9. Artigo de fabricação de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida isquemia e selecionada a partir do grupo que consiste em doenga arterial periferica (PAD) e isquemia do sistema nervoso central (CNS).

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