BRPI0815818B1 - Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 18 - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA LI TRUNCADA DO PAPILOMA VÍRUS HUMANO TIPO 18 A invenção refere-se à proteína LI truncada do Papiloma vírus Humano Tipo 18, uma particula tipo virus (VLP) que consiste da proteína, à vacina que compreende a mencionada partícula e ao uso da vacina na prevenção de câncer cervical.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se à proteína LI truncada do Vírus do Papiloma Humano Tipo 18 tal como definida na reivindicação 1, uma partícula semelhante a vírus que consiste da proteína, a uma vacina que inclui a mencionada partícula e ao uso da vacina na prevenção de câncer cervical.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O vírus do papiloma humano, um vírus ácido desoxirribonucléico (DNA) sem cápsula virai, pertence à família papovaviridae. O genoma virai é um DNA círculo fechado de cadeia dupla que tem aproximadamente 7.2-8kb de extensão e contém 8 quadros de leitura aberta (ORF, em inglês) . O genoma pode ser dividido em três partes em relação a funções: (1) a região inicial (E), de aproximadamente 4.5kb de extensão, que codifica 6 proteínas não estruturais, El, E2, E4~E7, associadas à replicação, à transcrição e a transformação do vírus; (2) a região final (L) , de aproximadamente 2.5kb de extensão, que codifica a proteína LI principal do capsídio e a proteína L2 secundária do capsídeo; (3) a região reguladora (LCR, em inglês), localizada entre o final da região Leo terminal de início da região E, de aproximadamente 800-900bp de extensão, inclui elementos regulares para a réplica de DNA e a expressão ao invés de codificar proteínas. As partículas virais têm 45-55nm de diâmetro, onde o nucleocapsídeo, que consiste de L1 e L2, exibe simetria icosaédrica e compreende 72 capsômeros.

[0003] Atualmente, existem mais de 90 tipos diferentes de HPV, que causam, principalmente, doença papilar na pele e na mucosa humana. Os tipos de HPV são divididos em três grupos, dependendo de sua relação com carcinogênese: (1) grupo de sem ou de baixo risco de carcinogênese, que contém os tipos 6, 11, 39, 41, 42 e 43; (2) grupo de risco médio de carcinogênese, que contém os tipos 31, 33, 35, 51 e 52; e (3) grupo de risco alto de carcinogênese, que contém os tipos 16, 18, 45 e 56.

[0004] A investigação epidemiológica molecular sugere que a infecção por tipos de HPV de risco alto é um fator importante no desenvolvimento de câncer cervical. O DNA do HPV é detectado em mais de 80% de incidência positiva em todos os casos de câncer cervical, cerca de 60% de HPV16 e cerca de 15% HPV18 (Clifford, G., S. Franceschi, et al. Vaccine 2006.24 Suppl 3:S26-34).

[0005] O câncer cervical é o segundo tumor mais comum em mulheres, seguido de câncer de mama, e ameaça gravemente a saúde de mulheres. Existem por volta de 490.000 novos casos relatados todo ano no mundo e quase 270.000 pessoas morrem desta doença anualmente (Boyle, P., and J. Ferlay. Ann Oncol 2005, 16:481-8). Casos em paises em desenvolvimento somam em aproximadamente 83% do total e, por volta de 15% destes casos, envolvem neoplasmas malignos, em contraste a 1.5% em paises desenvolvidos. O câncer cervical é mais predominante na África Subsaariana, na América Latina, no Extremo Oriente e na Ásia Meridional. O câncer cervical também é predominante na China. A incidência de câncer cervical entre mulheres casadas é tão alta quanto 1026/100000 no Municipio de Lueyang, Provinda de Shanxi. Portanto, uma vacina segura e eficaz, especialmente contra os tipos de risco alto, como o HPV 16 e 18, seria um modo eficaz de prevenir câncer cervical e melhorar a saúde das mulheres.

[0006] A proteina HPV Ll, com peso molecular de 55-60kDa, é a proteina de capsideo principal do virus do papiloma humano e o alvo principal da vacina contra HPV. A proteina HPV Ll expressada em múltiplos sistemas de expressão diferentes pode formar partículas semelhantes a virus (VLP) que se assemelham morfologicamente às partículas de HPV nativas, sem a assistência da proteina L2. A VLP, que consiste de 721 pentâmeros das proteínas Ll, exibe simetria icosaédrica. Como as VLPs mantêm o epitopos das partículas virais, elas são altamente imunogênicas e podem induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra o HPV homólogo (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sei USA 89(24) : 12180-4) . Além disso, as VLPs são seguras e não têm risco carcinógeno em potencial já que elas não contêm DNA virai. Portanto, as vacinas de VLP tornam-se o candidato principal para uma vacina contra HPV.

[0007] A chave para o desenvolvimento de uma vacina é produzir eficientemente vacinas de VLP de HPV em grande escala. Atualmente, os sistemas de expressão frequentemente mais usados são sistemas de expressão eucariótica e sistemas de expressão procariótica.

[0008] Os sistemas eucarióticos frequentemente usados incluem poxvirus, baculovirus de insetos e vetores de levedura. A proteína HPV LI expressa em sistemas eucarióticos demonstra pouca diferença de adaptação daquela do vírus nativo e pode formar-se em VLPs. Deste modo, VLPs purificadas podem ser facilmente obtidas após centrifugação por gradiente de densidade. Isto traz grande conveniência ao trabalho de purificação. Porém, devido aos altos custos de culturas e o baixo nível de expressão, é bastante difícil produzir industrialmente em grande escala. A vacina contra HPV Gardasil®, que entrou no mercado recentemente, é mais cara do que as outras devido ao baixo nível de expressão e o alto custo de produção do sistema de expressão por Saccharomyces cerevisiae empregado na sua fabricação.

[0009] A expressão da proteína HPV LI em um sistema procariótico como o por E. coli foi relatado anteriormente. Banks, Matlashewski, et al. publicou um artigo referente à expressão de HPV 16 LI através de emprego de E. coli (Banks, L., G. Matlashewski, et al. (1987) . J Gen Virol 68 (Pt 12) : 3081-9) . Porém, a maior parte das proteínas HPV LI expressas por E. Coli perde sua configuração nativa e não podem induzir a geração de anticorpos protetores contra HPV. Por outro lado, embora as VLPs de HPV possam ser obtidas a partir de proteínas revestidas incorretamente por etapas como purificação a partir de corpos de inclusão e novo revestimento, é difícil aplicar este método à produção em grande escala, já que a proteína é perdida em grandes proporções durante o processo de novo revestimento e a levedura é baixa (Kelsall, S. R. and J. K. Kulski (1995) . J Virol Methods 53 (1) : 75-90) . Embora a proteína HPV LI possa ser expressa em uma forma solúvel, com uma configuração correta em E. coli, e dissolvida em suspensão de lisado de E. coli, o nivel de expressão é baixo. Além disso, como há um grande número e quantidade de proteinas impuras, é dificil isolar as proteinas em que estamos interessados das outras. Embora seja relatado que o nivel de expressão da proteina LI pode ser aumentado em suspensão por meio de expressão por fusão GST e a purificação da proteina em que estamos interessados é facilitada P. Cripe, et al. (1997) , J Virol 71 (4) : 2988-95), ainda não se pode aplicar a produção em grande escala devido às enzimas caras que são necessárias para clivar a proteina de fusão.

[0010] Portanto, uma proteina HPV L1 tendo um baixo custo de produção e capaz de induzir a geração de anticorpos protetores contra HPV e uma partícula semelhante a virus que consista do mesmo ainda são necessárias na área, para que possa ser possivel produzir vacinas para câncer cervical industrialmente em grande escala.

Descrição da Invenção

[0011] Esta invenção tem como objetivo fornecer uma proteina HPV tipo 18 L1 original, as VLPs que consistem dela e uma vacina que inclui as VLPs.

[0012] Durante a pesquisa, foi descoberto por acaso que o sistema de expressão por E. coli pode produzir uma proteina HPV 18 L1 que pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra HPV 18. Após a purificação, a proteina HPV 18 LI pode ser produzida em levedura alta, com pelo menos 50% de pureza. O tratamento adicional da proteina HPV LI purificada pode produzir VLPs, que podem induzir a produção de anticorpos neutralizantes. A invenção foi completada baseando-se no que foi dito acima.

[0013] Portanto, o primeiro aspecto da invenção refere-se a proteinas HPV 18 Ll com 50, 55, ou 65- aminoácidos truncados em seu N-terminal quando comparado à proteina HPV 18 Ll do tipo natural. Preferencialmente, a proteina truncada tem a sequência disposta no SEQ ID NOs: 1, 2, ou 3, especialmente a sequência disposta no SEQ ID NO: 1.

[0014] Outro aspecto da invenção refere-se a um polinucleótido que codifica a proteina truncada de acordo com a invenção e um vetor que contém o polinucleótido.

[0015] Outro aspecto da invenção refere-se a uma célula que compreende o vetor.

[0016] A invenção também se refere à composição que compreende a proteina truncada, o polinucleótido, o vetor ou a célula.

[0017] Outro aspecto da invenção refere-se à HPV 18 VLP, que contém ou consiste de proteinas HPV 18 Ll com 50, 55, ou 65 aminoácidos truncados no N-terminal, como proteinas HPV 18 Ll que têm sequência disposta nas SEQ ID NOs: 1, 2, ou 3.

[0018] Outro aspecto da descrição refere-se ao método para a obtenção da proteina HPV 18 Ll, que inclui a expressão de um fragmento de gene HPV 18 Ll truncado em um sistema de E. coli e a purificação subsequente da proteina da suspensão de lisados.

[0019] Na modalidade preferida da invenção, um método de obter proteína HPV 18 L1 tal como definida nas reivindicações 1 e 2 compreende:a) expressar o fragmento de gene HPV 18 LI truncado em sistema de expressão por E. coli; b) desfazer o E. coli, que expressou a proteína HPV 18 L1 truncada, em uma solução a uma concentração de sal de lOOmM a 600mM, e isolar a suspensão;c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de lOOmM a 0, inclusive, usando água ou uma solução com baixo sal, e coletar o precipitado; d) re-dissolver o precipitado de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de uma redução, e, em seguida, isolar a solução resultante em que a solução contenha a proteína HPV 18 LI com pureza a, pelo menos, 50%.

[0020] De forma mais geral, a invenção também se refere ao método de obtenção da proteína HPV Llcompreendendo:a) expressar gene HPV L1 que codifica a proteína HPV LI em um sistema de expressão em E. coli;b) desfazer o E. coli, que expressou a proteína HPV Ll, em uma solução a uma concentração de sal de lOOmM a 600mM, e isolar a suspensão;c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de lOOmM a 0, inclusive, usando água ou uma solução com baixo sal, e coletar o precipitado; d) re-dissolver o precipitado de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de uma redução, e, em seguida, isolar a solução resultante em que a solução contenha a proteina HPV LI com pureza a, pelo menos, 50%.

[0021] A invenção também se refere a uma vacina para a prevenção de câncer cervical, que inclui VLPs de proteinas HPV 18 L1 truncadas de acordo com a invenção, preferencialmente em uma quantidade eficaz para prevenir câncer cervical. Preferencialmente, a vacina também inclui pelo menos uma VLP de proteinas HPV16, 11, 6, 31, 33, 45, 52 ou 58 Ll, preferencialmente em uma quantidade eficaz para prevenir o câncer cervical ou a infecção causada pelos tipos de HPV correspondentes. Geralmente, a vacina também contém excipientes ou vetores para vacina.

[0022] Preferencialmente, a vacina compreende VLPs de HPV 16 e VLPs de HPV 18, especialmente VLPs de HPV 16 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 7, VLPs de HPV 18 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 1. É ainda mais preferível que a vacina também compreenda VLPs de HPV 6 e VLPs de HPV 11, especialmente VLPs de HPV 6 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 8, VLPs de HPV 11 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 9.

[0023] Especialmente em uma modalidade preferida, a vacina compreende VLPs de HPV 16 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 7, VLPs de HPV 18 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 1, VLPs de HPV 6 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 8, VLPs de HPV 11 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 9, preferencialmente, em uma quantidade eficaz para prevenir câncer cervical ou infecção causada pelos subtipos de HPV correspondentes.

[0024] A invenção, além disso, refere-se ao uso da proteina HPV 18 Ll truncada ou aos VLPs dela na fabricação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical.

[0025] A invenção também se refere a vacina compreendendo uma quantidade preventiva eficaz de proteina HPV 18 Ll tal como definida nas reivindicações 1 e 2, para o uso na prevenção do câncer cervical.

[0026] A invenção envolve um método de obtenção de VLPs da proteina HPV 18 Ll, que compreende:e) purificação adicional da proteina HPV 18 Ll truncada com uma pureza de, pelo menos, 50% através de cromatografia;f) remoção da redução da proteina HPV 18 Ll obtida em e).

[0027] Esta invenção envolve um método de preparação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical, que inclui combinação dos VLPs acima e, opcionalmente, um ou mais VLPs selecionados do grupo que consiste de VLPs de tipos de HPV 6, 11, 16, 31, 33, 45, 52 e 58, com vetores ou excipientes para as vacinas.

Definições dos termos da presente invenção

[0028] De acordo com a invenção, o termo "sistema de expressão em E. coli" refere-se a um sistema de expressão que consiste de E. coli (estirpes) e vetores, no qual E. coli (estirpes) inclui, mas não está limitado a: GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3) e BLR (DE3), que estão disponíveis no mercado.

[0029] De acordo com a invenção, o termo "vetores" refere-se aos dispositivos de transporte de ácido nucléico que tenham o polinucleótido codificando certa proteina inserida no local e permitam a expressão da proteina O "vetor" pode ter o material qenético transportado expressado em uma célula hospedeira por transformação, transdução e transfecção dentro da célula hospedeira. Por exemplo, "vetores" incluem plasmideos, faqos, cosmideos e semelhantes.

[0030] De acordo com a invenção, o termo "um fragmento de gene da proteína HPV 18 L1 truncada" refere-se aos ácidos nucléicos com nucleotídeo (s) que codifica um ou mais sequências de aminoácidos eliminados em 5' ou 3' terminal do gene HPV 18 LI natural (cDNA). A sequência inteira de gene do gene HPV 18 L1 natural pode ser encontrada nas, mas não limitado a, seguintes sequências do NCBI: AY262282.1, X05015.1, AY863156.1 e U89349.1.

[0031] O termo "proteína HPV 18 LI truncada" refere-se à proteína com 50, 55 ou 65 aminoácidos eliminados no N-terminal da proteína HPV 18 LI natural. A sequência inteira de gene do gene HPV 18 LI natural pode ser encontrada nas, mas não limitado a, proteínas L1 inteiras codificadas pelas seguintes sequências do NCBI: AY262282.1, X05015.1, AY863156.1 e U89349.1.

[0032] De acordo com a invenção, o termo "excipientes e vetores para vacinas" refere-se a um ou mais reagentes, incluindo, mas não limitado a: Reguladores de pH, surfactantes, adjuvantes e fortalecedores iõnicos. Por exemplo, os regulares de pH incluem, mas não estão limitados a, soluções-tampão fosfato; surfactantes incluem, mas não estão limitados a: surfactantes de ânion surfactantes de cátions, surfactantes não iõnicos (por exemplo, mas não limitado a, Tween-80); adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, hidróxido de aluminio e adjuvante completo de Freund; e fortalecedores iõnicos incluem, mas não estão limitados a, NaCl.

[0033] De acordo com a invenção, o termo "cromatografia" inclui, mas não está limitado a: cromatografia de troca iônica (por exemplo, cromatografia de troca de cátions), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia absorvente (por exemplo, cromatografia em hidroxiapatite), cromatografia em gel filtração (cromatografia de exclusão em gel) e cromatografia de afinidade.

[0034] De acordo com a invenção, as proteinas HPV 18 L1 truncadas podem ser obtidas, preferencialmente, pelos seguintes passos:a) desfazer E. coli, que expressa a proteina HPV 18 LI truncada, em uma solução-tampão que contenha 100-600mM de sal, preferencialmente 200-500mM;b) isolar a suspensão da solução rompida, em seguida, diminuir a concentração de sal da suspensão para 100 mM - 0M com água ou solução-tampão de baixo sal (geralmente, com uma concentração de sal menor do que aquela da solução-tampão para romper);c) separar o precipitado da suspensão com uma concentração de sal tão baixa quanto 100 mM-0; d) redissolver o precipitado em uma solução que contenha um redutor e tenha uma concentração de sal de 150-2000mM, preferencialmente maior do que 200mM;e) Isolar uma solução das proteinas HPV 18 Ll truncadas com pureza de, pelo menos, 50%, preferencialmente em, pelo menos, 70%, sendo mais preferivel, pelo menos, 80%.

[0035] De acordo com a invenção, no método de obtenção das proteinas HPV 18 Ll, o termo "tampão" refere-se à solução que pode manter o valor de pH estável dentro de certa variação, incluindo, mas não limitado a: Soluções-tampão tris, soluções-tampão fosfato, soluções-tampão HEPES e soluções-tampão MOPS.

[0036] De acordo com a invenção, o rompimento da célula hospedeira procariótica pode ser realizado por métodos que incluem, mas não estão limitados a, um ou mais rompimentos homogenizadores, tratamento ultra-sônico, trituração, extrusão por pressão alta e tratamento por lisozima.

[0037] De acordo com a invenção, no método de obtenção das proteinas HPV 18 Ll truncadas, os sais usados incluem, mas não estão limitados a: um ou mais dos sais neutros, especialmente sal de metal alcalino, sais de amónio, cloridratos, sulfatos, bicarbonatos, hidrogenofosfatos ou sais de fosfato, especialmente NaCl, KC1, NH4CI, (NH4)2SC>4. É preferível NaCl. A redução usada inclui, mas não está limitado a, DTT e 2-mercaptoetanol, em uma quantidade de, mas não limitado a, lO-lOOmM.

[0038] De acordo com a invenção, as VLPs das proteinas HPV 18 LI truncadas podem ser produzidas pelos seguintes passos: purificação adicional da proteina HPV 18 LI isolada truncada com pureza de, pelo menos, 50% a submetendo à cromatografia e, com isso, obtendo uma solução purificada de proteina HPV 18 L1 truncada; e remoção da redução da solução purificada de proteina HPV 18 L1 e, com isso, obtendo as VLPs HPV 18 L1 truncadas. Os métodos para a remoção da redução incluem, mas não estão limitados a, técnicas conhecidas na área, como diálise, ultrafiltração e cromatografia.

[0039] De acordo com a invenção, a proteina HPV L1 tem, preferencialmente, a sequência disposta no SEQ ID NO: 1.

[0040] De acordo com a invenção, a vacina pode ser administrada em forma aceita pelo paciente, incluindo, mas não limitado a, oral e injeção, preferencialmente injeção.

[0041] De acordo com a invenção, a vacina é usada, preferencialmente, em dose única. Cada dose contém 5-80μg de VLP de HPV 18 LI truncada, preferencialmente 20-40μg.

Efeitos Benéficos

[0042] Atualmente, os sistemas de expressão úteis à preparação de VLPs de HPV incluem sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.

[0043] As proteínas HPV LI expressas em sistemas de expressão eucarióticos mantêm sua configuração nativa e podem formar VLPs sozinhas. Na maioria dos casos, uma VLP com configuração correta pode ser obtida por purificação simples. No entanto, sistemas de expressão eucarióticos, como sistemas de expressão por baculovírus e levedura, são difíceis de serem aplicados em produção de grande escala industrial devido aos níveis baixos de expressão e aos altos custos.

[0044] Sistemas de expressão procarióticos, como sistemas em E. coli, têm a vantagens de ter altos níveis de expressão a um menor custo. Porém, quando expressos em um sistema procarióticos, a proteína HPV L1 normalmente perde sua configuração nativa e é expressa em uma forma de corpos de inclusão no precipitante. A renaturação da proteína a partir de corpos de inclusão ainda é um problema mundial. Devido à dificuldade e da ineficiência da renaturação, este método está limitado à pesquisa laboratorial em pequena escala e não pode ser aplicado em grande escala para obter VLP com configuração correta a partir dos corpos de inclusão. Embora a proteína HPV LI possa existir em sua configuração nativa na suspensão de lisado de E. coli, seus níveis de expressão são baixos. Além disso, é bastante difícil purificar a proteína HPV LI a partir das numerosas proteínas solúveis na suspensão de lisado de E. coli. Geralmente, a purificação é completada através de métodos, como expressão por fusão e cromatografia de afinidade, que não são viáveis para processos em escala industrial devido às enzimas caras empregadas nos métodos.

[0045] Nesta invenção, a proteina HPV 18 Ll N-truncada é expressa em sistema de expressão em E. coli e é precipitada seletivamente a partir da suspensão do lisado de E. coli sob condições amenas. A proteina HPV Ll é, em seguida, redissolvida em solução-tampão de sal para aprimorar significativamente sua pureza enquanto ainda mantém sua configuração nativa. A proteina redissolvida de interesse pode ser submetida imediatamente à cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica para se obter a proteina pura. A proteina HPV 18 Ll truncada purificada, obtida a partir destes passos, pode formar-se em VLPs com boa imunogenicidade e com a habilidade de induzir anticorpos neutralizantes de alto titulo contra HPV 18, que é uma boa vacina para a prevenção humana contra a infecção de HPV 18 . Além disso, a proteina HPV 18 Ll truncada usada na presente invenção é facilmente expressa em um sistema de expressão em E. coli e pode ser purificada de forma econômica sem o uso de enzimas caras, pois seu custo de produção é baixo. Ademais, como a proteina de interesse não é submetida aos procedimentos intensos de desnaturação e renaturação durante a purificação, o método pode ser aplicado industrialmente em grande escala devido à baixa perda.

[0046] A invenção será mais evidente após a consulta da seguinte descrição detalhada e os desenhos.

Descrição dos Desenhos

[0047]A Fig. 1 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteina HPV18N65C-L1 em diferentes fases durante as etapas a)-d) do método de acordo com a invenção. M: Marcador de Peso Molecular; Rota 1: Suspensão de lisado 10 vezes diluida; Rota 2: proteina HPV18N65C-L1 precipitada por fluxo tangencial; Rota 3: HPV18N65C-L1 redissolvida em solução de re-suspensão. O resultado eletroforético mostra que a pureza da HPV1630C-L1 atingiu cerca de 70% após as etapas de precipitação e re-dissolução.A Fig. 2 mostra o resultado de SDS-PAGE de HPV18N65C-L1 que foi obtida na etapa d) e que foi também, purificada de acordo com a etapa e) . M: Marcador de Peso Molecular; Rota 1: HPV18N65C-L1 purificada de acordo com a etapa e), 5μL; Rota 2: HPV18N65C-L1 purificada de acordo com a etapa e), 25μL. O resultado mostra que HPV18N65C-L1 purificada de acordo com a etapa e) atingiu uma pureza de cerca de 98%.A Fig. 3 mostra a fotografia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das VLPs da HPV18N65C-V1 obtidas na etapa f) , tiradas em 100,000x de ampliação, bar representa O.lμm. Foram observadas muitas VLPs em um raio de por volta de 25 nm no campo visual, onde o tamanho das particulas era consistente com o tamanho teórico e as particulas eram homogêneas.A Fig. 4 mostra o resultado da medição de dispersão dinâmica de luz de VLPs de HPV18N65C-L1 obtidas na etapa f) . O resultado mostra que VLP de HPV18N65C-L1 tinha radio hidrodinâmico de 29.38nm e taxa de montagem de particular de 100%.A Fig. 5 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes em soro a diferentes estágios após a inoculação de cabra com VLPs de HPV18N65C-L1. Os momentos de vacinação são indicados com setas. O titulo de anticorpos neutralizantes aumentou rapidamente uma semana após a primeira vacinação e atingiu o nivel máximo de 107 após um reforçador.A Fig. 6 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes em soro a diferentes estágios após a inoculação de coelho com VLPs de HPV18N65C-L1. Os momentos de vacinação são indicados com setas. O titulo de anticorpos neutralizantes aumentou rapidamente após a primeira vacinação e atingiu o nivel máximo de 106 após um reforço.A Fig. 7 mostra os titulos de anticorpo imunoglobulina G (IgG) total contra HPV 18 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 8 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes contra HPV 18 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 9 mostra os titulos de anticorpo imunoglobulina G (IgG) total contra HPV 16 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. 0 titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 10 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes contra HPV 16 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5 . A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 11 mostra as mudanças de titulos de anticorpos neutralizantes HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 após a inoculação de rato com vacina quadrivalente de HPV6/11/16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 2 semanas. O titulo de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 105-106 após um reforçador.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

[0048]SEQ ID NO:1:1 MRPSDNTVYL PPPSVARWN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP AGGGNKQDIP61 KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL GVGLSGHPFY121 NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT ACKSRPLSQG181 DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD YLQMSADPYG241 DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP SPSGSIVTSD301 SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP GQYDATKFKQ361 YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT SLVDTYRFVQ421 SVAIACQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA GLRRKPTIGP 481 RKRSAPSATT ASKPAKRVRV RARKSEQ ID NO:2:1 MRNVNVFPIF LQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP61 YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG121 RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH181 WAKGTACKSR PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI241 CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS301 CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST361 QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP421 PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK481 FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:3:1 MFPIFLQMAL WRPSDNTVYL PPPSVARWN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP61 AGGGNKQDIP KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL121 GVGLSGHPFY NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT181 ACKSRPLSQG DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD241 YLQMSADPYG DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP301 SPSGSIVTSD SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP 361 GQYDATKFKQ YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT421 SLVDTYRFVQ SVAITCQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA 481 GLRRKPTIGP RKRSAPSATT SSKPAKRVRV RARKSEQ ID NO:4:1 MQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN61 KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS121 GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR181 PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS241 ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS301 IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA361 TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT421 YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK 481 PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:5:1 MTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY61 QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD121 TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR PLSQGDCPPL181 ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF241 CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN301 KPYWLHKAQGVHNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV361 EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT421 CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA 481 PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:6:1 ATGCGGCCT AGTGACAAT ACCGTATAT CTTCCACCT CCTTCTGTG GCAAGAGTT55 GTAAATACC GATGATTAC GTGACTCGC ACAAGCATA TTTTATCAT GCTGGCAGC109 TCTAGATTA TTAACTGTT GGTAATCCA TATTTTAGG GTTCCTGCA GGTGGTGGC163 AATAAGCAG GATATTCCT AAGGTTTCT GCATACCAA TATAGAGTA TTTAGGGTG217 CAGTTACCT GACCCAAAT AAATTTGGT TTACCTGAT ACTAGTATT TATAATCCT271 GAAACACAA CGTTTAGTG TGGGCCTGT GCTGGAGTG GAAATTGGC CGTGGTCAG325 CCTTTAGGT GTTGGCCTT AGTGGGCAT CCATTTTAT AATAAATTA GATGACACT379 GAAAGTTCC CATGCCGCC ACGTCTAAT GTTTCTGAG GACGTTAGG GACAATGTG 433 TCTGTAGAT TATAAGCAG ACACAGTTA TGTATTTTG GGCTGTGCC CCTGCTATT487 GGGGAACAC TGGGCTAAA GGCACTGCT TGTAAATCG CGTCCTTTA TCACAGGGC541 GATTGCCCC CCTTTAGAA CTTAAAAAC ACAGTTTTG GAAGATGGT GATATGGTA595 GATACTGGA TATGGTGCC ATGGACTTT AGTACATTG CAAGATACT AAATGTGAG649 GTACCATTG GATATTTGT CAGTCTATT TGTAAATAT CCTGATTAT TTACAAATG703 TCTGCAGAT CCTTATGGG GATTCCATG TTTTTTTGC TTACGGCGT GAGCAGCTT757 TTTGCTAGG CATTTTTGG AATAGAGCA GGTACTATG GGTGACACT GTGCCTCAA811 TCCTTATAT ATTAAAGGC ACAGGTATG CGTGCTTCA CCTGGCAGC TGTGTGTAT865 TCTCCCTCT CCAAGTGGC TCTATTGTT ACCTCTGAC TCCCAGTTG TTTAATAAA919 CCATATTGG TTACATAAG GCACAGGGT CATAACAAT GGTGTTTGC TGGCATAAT973 CAATTATTT GTTACTGTG GTAGATACC ACTCGCAGT ACCAATTTA ACAATATGT1027 GCTTCTACA CAGTCTCCT GTACCTGGG CAATATGAT GCTACCAAA TTTAAGCAG1081 TATAGCAGA CATGTTGAG GAATATGAT TTGCAGTTT ATTTTTCAG TTGTGTACT1135 ATTACTTTA AC TGC AG AT GTTATGTCC TATATTCAT AGTATGAAT AGCAGTATT1189 TTAGAGGAT TGGAACTTT GGTGTTCCC CCCCCGCCA ACTACTAGT TTGGTGGAT1243 ACATATCGT TTTGTACAA TCTGTTGCT ATTGCCTGT CAAAAGGAT GCTGCACCG1297 GCTGAAAAT AAGGATCCC TATGATAAG TTAAAGTTT TGGAATGTG GATTTAAAG1351 GAAAAGTTT TCTTTAGAC TTAGATCAA TATCCCCTT GGACGTAAA TTTTTGGTT1405 CAGGCTGGA TTGCGTCGC AAGCCCACC ATAGGCCCT CGCAAACGT TCTGCTCCA1459 TCTGCCACT ACGGCTTCT AAACCTGCC AAGCGTGTG CGTGTACGT GCCAGGAAG 1513 TAA

[0049] A descrição é ilustrada melhor juntamente com os Exemplos, onde não se limita aos Exemplos.

Exemplol: Expressão da Proteina HPV18 LI Truncada (SEQ ID NO. 1) Preparação de Fragmentos de Gene HPV18 LI como Modelo PCR

[0050] O DNA extraido da secreção vaginal de pacientes com câncer cervical da Cidade de Xiamen na provinda Fujian foi usado como modelo. O iniciador forward era 18H5430F: 5'-CCT CTT GGG ATG TGC CTG TAT AC-3' (SEQ ID NO: 10) e o iniciador reverse era 18H7190R: 5'-TACAAACAC AAC AAT AGATGT ATATA-3' (SEQ ID NO: 11) . A reação em cadeia da polimerase (PCR, em inglês) foi realizada em um termociclador Biometria T3 PCR com o uso dos seguintes parâmetros:

[0051] O produto de amplificação especifica, por volta de 1.6kb de extensão, foi usado como modelo para produzir fragmentos de DNA da proteina HPV18 L1 truncada nesta invenção.

Construção de Vetor de Expressão Sem Fusão de gene HPV18 LI truncado

[0052] Os fragmentos de DNA (l.ôkb) produzidos no passo anterior foram usados como modelo para a próxima reação em PCR. 0 iniciador forward era 18N65F: 5'-CAT ATg CGG CCT AGT GAC AAT AC-3', no 5' terminal no qual o sitio de restrição da endonuclease Ndel foi introduzido. A sequência do sitio NedI era CAT ATG, onde ATG era o códon de iniciação no sistema de E. coli. 0 iniciador reverse era 18CR: 5' -CTC gAg TTA CTT CCT GGC ACG TAC ACG CAC A-3' , no 5' terminal no qual o sitio de restrição da endonuclease Xhol foi introduzido. A amplificação foi realizada em um termociclador Biometria T3 PCR com o uso dos seguintes parâmetros:

[0053] Os fragmentos de DNA, por volta de 1.5kb de extensão, foram obtidos após a amplificação. Os produtos de PCR foram ligados ao vetor pMD 18-T (Takara Biosciences). Após a digestão com Ndel/Xhol, identificou-se que as colônias positivas, onde o gene HPV18 L1 truncado foi inserido, foram obtidas, designadas como PMD 18-T-HPV18N65C-L1.

[0054] A sequência de nucleotídeos de interesse, que foi inserida no plasmideo pMD 18-T-HPV18N65C-L1, foi determinada como SEQ ID NO: 6 por Shanghai Boya Bio Co. através da utilização de iniciadores +/- M13. SEQ ID NO: 6 codifica a seqüência de aminoácidos disposta SEQ ID NO: 1, que corresponde a uma proteina HPV 18 L1 com 65 aminoácidos truncados em seu N-terminal e nenhum aminoácido truncado em seu C-terminal e foi designada como HPV18N65C-L1.

[0055] Os fragmentos de gene HPV18N65C-L1 truncado foram obtidos por digestão Ndel/Xhol de plasmideo pMD 18-T-HPV18N65C-L1. Os fragmentos foram ligados ao vetor de expressão procariótica pTrxFus digerido com Ndel/Xhol (Invitrogen). Como a proteina de fusão foi clivada, a proteina de interesse foi expressa imediatamente após a iniciação da expressão do aminoácido Met, sem outras proteínas de fusão inclusas. As colônias foram selecionadas com digestão Ndel/Xhol. Colônias positivas contendo a inserção foram rotuladas com pTRX-HPV18N65C-Ll. lμL de plasmideo pTRX-HPV18N65C-Ll (0.15mg/ml) foi usado para transformar 40μL de E. coli GI698 competente (Invitrogen) preparado pelo método de cloreto de cálcio e, em seguida, revestido em meios CAA (dissolvendo 6g de Na2HPθ4, 3g de KH2PO4, 0.5g de NaCl, lgdeNHiCl, 20g de hidrolisado de caseina, 0.095 de MgC12, 1.5g de pó de ágar, 20 ml de 50% glicerina e 900 ml de água deionizada foram adicionados) contendo cloreto de benzila (a uma concentração final de 100 mg/ml, a mesma que a de baixo). As placas foram incubadas a 30°C por cerca de 10-12h até que se pudessem ser observadas claramente colônias únicas. As colônias únicas das placas foram transferidas para um tubo contendo 4ml de meio IMC liquido contendo cloreto de benzila. As culturas foram incubadas em uma incubadora com agitação a 220rpm por 10h a 25°C e, em seguida, 1 ml de solução bacteriana foi liofilizada e armazenada a -70°C.

Expressão de HPV18N65C-L1 em grande escala

[0056] E. coli transformada com pTRX-HPV18N65C-Ll foi tirada da estirpe liofilizada a -70 °C e diluida com um pouco de água estéril e, em seguida, incubada em 50mL de meio IMC contendo amina benzila a 200 rpm e 30°C por 8h. Em seguida, as culturas foram transferidas para dez frascos (5 ml de culturas por frasco) , cada um contendo 500mL de meio LB, e foram incubadas em uma incubadora com agitação durante a noite a 200rpm e 30°C. As culturas eram as culturas iniciais.

[0057] Um fermentador de 50L feito pela Shanghai Baoxing Biological Ltd foi usado na incubação em grande escala. 0 eletrodo de pH foi calibrado. 30L de meio LB foram preparados e transferidos ao fermentador, esterilizados a 121°C por 30 minutos. O eletrodo de oxigênio dissolvido foi calibrado, onde o valor foi determinado como 0 antes da introdução de ar após a esterilização e como 100% antes da inoculação após a introdução de ar, agitando a lOOrpm no inicio.

[0058] Preparação da alimentação: 30g de hidrolisados de caseina foram dissolvidas em 100mL de água deionizada para preparar uma solução (30%) e 50g de glicose foram dissolvidas em lOOml de água deionizada para preparar uma solução de glicose (50%) . As duas misturas foram esterilizadas a 121°C por 20min.

[0059] No segundo dia, as culturas iniciais nos dez frascos (para um total de 5L) foram transferidas para o fermentador. A 30°C e pH 7.0, o O2 dissolvido foi mantido a > 40% através de regulação da taxa de agitação ou de fornecimento de ar manualmente.

[0060] Fluxo de alimentação: 50% de glicose e 30% de hidrolisados de caseina foram misturados a uma proporção de massa de 2:1.

[0061] As taxas de fluxo foram as seguintes:lh: 5%2h: 10%3h: 20%4h: 40%5h até o fim: 60%

[0062] Quando ODeoo atingiu cerca de 10.0, a temperatura da cultura foi reduzida a 2°C e 4g de triptofânio foram adicionadas para iniciar uma indução da cultura de 4h. A fermentação foi interrompida quando ODÊOO atingiu cerca de 40. A cultura foi, então, centrifugada para obter estirpes (cerca de 3 kg).Meio IMC (1 litro):

Exemplo 2: Preparação de HPV18N65C-L1 com uma pureza de cerca de 70%

[0063] Estirpes de lg foram re-suspensos em lOml de tampão de lise (20mM de tampão tris com pH 7.2, 300mM de NaCl) . Estirpes foram interrompidas pela passagem através de um homogeneizador APV (Invensys Group) por cinco vezes a uma pressão de 600bar. O homogenato foi centrifugado a 30.000 g (13.500 rpm em rotor JA-14) por 15min. A suspensão foi submetida a SDS-PAGE em 10% de gel. Nesta fase, a HPV18N65C-L1 tinha uma pureza de cerca de 10%. A suspensão foi dialisada por um Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.) funcionando a uma pressão de 0.5psi, a uma taxa de fluxo de 500ml/min e a uma taxa de fluxo tangencial de 200ml/min, onde a retenção do peso molecular foi de 30kDa, o dialisato foi de lOmM de tampão de fosfato a pH 6.0, e o volume de diálise foi três vezes maior do que o volume da suspensão. Após a diálise completa, a mistura foi centrifugada a 12.000g (9500 rpm em rotor JA-10 (centrifuga de alta velocidade Beckman J25) ) por 20min e a precipitação foi coletada. A precipitação foi re-suspensa em lOmM de tampão de fosfato a pH 7.0 contendo lOmM de DTT e 300mM de NaCl, onde o volume do tampão foi 1/10 vezes maior do que o volume da suspensão. A mistura foi agitada por 30 min e centrifugada a 30.000g (13.500 rpm em rotor JA-14 (centrifuga de alta velocidade Beckman J25)) por 20 min. A suspensão passa através de uma membrana filtrante de 0.22μm. A amostra foi ainda submetida à cromatografia de troca catiônica. 30μL de 6x de tampão de carregamento foram adicionados a 150μL da suspensão filtrada e a solução resultante foi misturada. Depois de aquecer em banho-maria a 80°C, por lOmin, uma amostra foi submetida a SDS-PAGE em gel a 10% a 120V por 120 min. As bandas eletroforéticas foram tingidas por azul brilhante Coomassie. O resultado foi mostrado na Fig. 1. Segundo a análise de SDS-PAGE, a proteina HPV18N65C-L1 foi purificada e enriquecida após as etapas de precipitação e re-dissolução, com a pureza aumentada de cerca de 10% para cerca de 70%.

Exemplo 3: Purificação por Cromatografia de HPV18N65C-L1Purificação de HPV18N65C-L1 por Cromatografia de Troca Catiônica

[0064]Equipamento: Sistema de cromatografia liquida preparativa AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ou seja, a Amershan Pharmacia Co. original)Meios de cromatográfica: SP Sepharose 4 Fluxo RápidoVolume de Coluna: 5.5cmx20cmTampão: 20mM tampão de fosfato a pH 7.0, lOmM de DTT 2OiriM tampão de fosfato a pH 7.0, lOmM de DTT, 2M de NaClTaxa de Fluxo: 25mL/minDetector de Comprimento de Onda: 280nmAmostra: 3L de 70% de solução de HPV18N65C-L1 puraProtocolo de eluição: eluir proteinas indesejadas com 300mM de NaCl, eluir a proteina de interesse com 500mM de NaCl, coletar 500mM de elutato de NaCl e, finalmente, recolher cerca de 1000mL de amostra de HPV18N65C-L1 purificada.

Purificação de HPV18N65C-L1 por Cromatografia CHT-II

[0065]Equipamento: Sistema de cromatografia liquida preparativa AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ouseja a Amershan Pharmacia Co. original)Meios de cromatografia: CHT-II (Bio-Rad)Volume de Coluna: 5.5cmx20cmTampão: lOmM tampão de fosfato a pH 7.0, lOmM de DTT, 0.5M de NaClTaxa de Fluxo: 20mL/minDetector de Comprimento de Onda: 280nmAmostra: 500mM de eluato de NaCl do SP Sepharose 4 Fluxo RápidoProtocolo de eluição: coleta direta do passante que contém a proteina de interesse.

[0066] O passante, que contém HPV18N65C-L1, foi coletado e cerca de 1100mL de HPV18N65C-L1 purificadas foram obtidos. 30μL de 6x do tampão de carregamento foram adicionados a 150μL da amostra de HPV18N65C-L1 purificada de acordo com o método do Exemplo e, em seguida, a solução resultante foi misturada completamente. Depois de aquecer a solução em banho-maria a 80°C por lOmin, uma amostra de 10uL foi submetida a SDS-PAGE em gel a 10% a 120V por 120min. As bandas eletroforéticas foram coradas por azul brilhante Coomassie. O resultado foi mostrado na Fig. 2. A concentração da proteina de interesse foi de cerca de 0,8 mg/ml e a pureza foi maior do que 98% de acordo com SDS-PAGE.

Exemplo 4: Montagem de VLPs de HPV18N65C-L1

[0067]Equipamento: Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.), MW 30kDa de retenção.Amostra: IlOOmL de HPV18N65C-L1 obtida no Exemplo 3Concentração da Amostra: A amostra foi concentrada a 800mL com a taxa de fluxo tangencial do sistema ajustada a 50mL/minRenaturação de Amostra: Renaturação de Amostra: O tampão da amostra foi trocado com 10L de tampão de renaturação (20mM de PB a pH 6.0, 2mM de CaCls, 2mM de MgCl∑, 0,5M de NaCl) completamente. Ao executar o Filtro de Fluxo Tangencial, a pressão era de 0,5psi e a taxa de fluxo tangencial era de lOml/min. Quando troca foi concluída, o tampão da amostra foi substituído por tampão de armazenamento (20L de PBS: 20mM de PB a pH 6.5, 0,5M de NaCl) • 0 volume de troca foi de 20L. A pressão em execução foi de 0.5psi e a taxa de fluxo tangencial foi de 25mL/min. Quando o liquido de troca foi finalizado, a amostra foi assepticamente filtrada com um filtro Pali (0,20 μm) . A amostra filtrada foi incubada em uma incubadora a 37 °C durante a noite. As VLPs de HPV18N65C-L1 incubadas foram armazenadas a 4 °C para uso adicional.

Exemplo 5: Determinação da Morfologia e Imunogenicidade das VLPs de HPV18N65C-L1 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) de VLPs de HPV18N65C-L1

[0068] 0 equipamento foi um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL lOOkV (lOO.OOOx de ampliação). As VLPs de HPV18N65C-L1 foram negativamente coradas com 2% de ácido fosfotúngstico a pH 7.0 e fixadas em uma grade de cobre. Os resultados foram mostrados na Fig. 3. Pôde-se ver que as VLPs obtidas no Exemplo 4 tinham um raio de cerca de 25nm e eram homogêneas e de forma oca.

Medição de dispersão dinâmica de luz de VLPs de HPV18N65C-L1

[0069] Um instrumento de dispersão dinâmica de luz DynaPro MS/X (incluindo um controlador de temperatura) (US Protein Solutions Co.) foi utilizado para medições de dispersão de luz. 0 algoritmo de regulação foi usado nas medições. A amostra foi aquela obtida no Exemplo 4. A amostra foi passada através de uma membrana filtrante de 0.22μm antes da medição. Os resultados foram mostrados na Fig. 4. O resultado mostra que as VLPs de HPV18N65C-L1 tinham um raio Hidrodinâmico de 29.38nm.

Estabelecimento de um Modelo de Análise de Neutralização de Pseudo-virion para HPV18

[0070] 0 HPV dificilmente pode ser cultivado in vitro e o hospedeiro do HPV tinha forte especificidade. Assim, dificilmente o HPV pode ser propagado em outros hospedeiros que não sejam humanos. Ou seja, não existia um modelo animal adequado ao HPV. Portanto, a fim de avaliar a produtividade imunológica da vacina contra HPV rapidamente, houve a necessidade de estabelecer um modelo eficiente para neutralização em ensaios in vitro.

[0071] Modelo de Infecção In Vitro de Pseudo-virion: De acordo com a característica de que a VLP de HPV pode acondicionar ácidos nucléicos não especificamente, o pseudo-virion de HPV foi formado pela expressão da proteina Ll e L2 do HPV em células e pelo acondicionamento de DNA virai do episome ou introdução de plasmideos repórteres de forma heterogênea. Os métodos incluem sistemas de expressão baseados em virus recombinantes e cotransfecção de multi-plasmideos (ver Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M. et al (2000) Virology (278) 570-7) .

[0072] A invenção utiliza cotransfecção de um sistema de multi-plasmideos. Algumas melhorias foram feitas da seguinte maneira. Um método otimizado de transfecção de fosfato de cálcio foi estabelecido para a linhagem celular 293FT, com uma eficiência de transfecção de acima de 90%, o que facilita a produção em grande escala. 0 plasmideo de expressão por códon otimizado resultante de proteina do HPV pode expressar o gene HPV Ll e L2 eficientemente em linhas de células de mamiferos, facilitando a montagem eficiente de pseudoviron.

1. Construção de Pseudoviron de HPV:

[0073] P18Llh, pl8L2h e pN31-EGFP (doado pelo Professor T. Schiller da NIH) contêm genes para HPV18L1, HPV18L2 e GFP, respectivamente. Estes plasmideos foram purificados utilizando CsCl centrifugação em gradiente de densidade, conforme descrito em The Molecular Cloning Experiment Guide, (3a edição). 0 procedimento depurificação foi o seguinte:• Plasmideos foram usados para transformar E. coli DH5a;• Colônias únicas foram transferidos para meio de cultura LB de 500mL e incubadas em um frasco de agitação a 37°C por 16h;• 0 meio de cultura foi centrifugado a 9.000g durante 5min e as manchas foram coletadas;• As seguintes substâncias foram adicionadas sucessivamente às bactérias em cada 1000mL de LB: 40mL de solução I (50mM de glicose, 25mM de Tris-Cl a pH 8.0, lOmM de EDTA a pH 8.0) e 2ml de lμg/μL de RNase A), 40mL de solução II (0.2MdeNaOH, 1% de SDS) , e 48mL de solução III (60.0 de 5M de acetato de potássio , 11.5mL de ácido acético e 28.5mL de água deionizada);• Após colocar em gelo por lOmin, a mistura foi centrifugada a 15.000g por 20min a 4°C;• A suspensão foi misturada com 0,6 de volume de álcool isopropilico, em seguida, foi novamente centrifugada a 15.000g por 30min;• A suspensão foi decantada em residuos e a precipitação foi lavada com 70% de etanol;• A precipitação foi dissolvida em TE e o teor de DNA foi determinado;• CsCl foi dissolvido na solução de DNA (lg de DNA por 1.01g de CsCl) e, em seguida, lOOμL de lOmg/mL de solução EB também foi dissolvido em DNA;• A mistura foi centrifugada, usando uma centrifuga Beckman NVT65, a 62.000g por 10hr a 20°C;• A seção do DNA de circulo fechado foi obtida com o uso de um injetor cabeça de alfinete;• EB foi extraido com volume equivalente de álcool isoamilico repetidamente por quatro vezes;• Três volumes de água deionizada e oito volumes de etanol seco foram adicionados a um volume de solução de DNA e, em seguida, a mistura foi centrifugada a 20000G por 30min a 4°C;• A precipitação foi coletada e lavada com 75% de etanol e, em seguida, dissolvida em lmL de TE;• A concentração da solução de DNA foi determinada, em seguida, a solução foi armazenada em pequenas embalagens a -20°C.

[0074] plδLlh, pl8L2h e células 293FT co-transfectadas pN31-EGFP 293FT (Invitrogen) purificadas cultivadas em uma placa de cultura de células de lOcm pelo método de fosfato de cálcio. 0 método de fosfato de cálcio foi descrito da seguinte forma. 40μg de plδLlh, 40μgdepl8L2h e 40μg de pN31-EGFP foram adicionados separadamente à mistura de lmL de solução HEPEs (125μL de 1M de HEPES/50mL de água deionizada, a pH 7.3 e 4°C;) e lmL de solução de 0,5 M de CaC12. Depois de misturar, 2mL de 2X da solução HeBS (0.28M de NaCl (16.36g), 0,05M de HEPES (11,9 g), 1.5mm de Na2HPC>4 (0.213g) , dissolvidos em 1000mL de água deionizada, a pH 6.96 e -70°C;), foram adicionados gota a gota. Após ficar em temperatura ambiente por 1 min, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 10cm, onde as células 293FT foram cultivadas. O meio de cultura original foi substituído por 10 ml de meio completo (Invitrogen Co.) 6 horas mais tarde. 48 horas após a transfecção, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram coletadas e contadas. Cada 108 de células foram suspensos em lmL de solução citolitica (0,25% de Brij58, 9.5mm de MgC12) . Após a lise, o lisado celular foi centrifugado a 5.000g por lOmin e a suspensão foi coletada A solução pseudo-virion foi obtida após a adição de 5M de NaCl à suspensão a uma concentração final de 850mM, em seguida, foi armazenada em pequenas embalagens a -20°C.

[0075] As células 293FT (Invitrogen) foram espalhadas em uma placa de cultura de células de 96 compartimentos (1.5X104 células/compartimento). A análise de neutralização foi realizada cinco horas mais tarde. As amostras de soro foram diluidas em série com 10% de DMEM metade a metade. Amostras diluidas de 50μL foram separadamente misturadas com 50μL de soluções de pseudo-virus diluídas com 10% de DMEM (moi = 0.1) . Após incubação a 4°C por lh, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 96 compartimentos espalhadas com células 293FT. A mistura foi então incubada por 72h a 37°C Títulos de neutralização das amostras foram avaliados pela observação de fluorescência. O percentual de infecção de células em cada compartimento foi verificado por citometria de fluxo (EPICS XL, American Beckman Coulter Co.) . Os títulos exatos de anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais foram calculados. O percentual de infecção foi a porcentagem de células na região positiva menos a células não infectadas na região positiva.

[0076] A porcentagem de controle de infecção =(1 - porcentagem de infecção da célula de amostra/percentual de infecção de células negativas) X 100%

[0077] O título de neutralização foi definido como o múltiplo de diluição mais elevado através do qual a porcentagem de controle de infecção era um pouco acima de 50%. Anticorpos monoclonais e policlonais foram considerados como tendo capacidade de neutralização se a sua porcentagem de controle de infecção estivesse acima de 50% após diluições por 50 vezes.

Proteção imunológica de animais inoculados com VLPs de HPV18:

[0078] Análise de 50% da Dose Eficaz (ED50) em Camundongo: As VLPs de HPV18N65C-L1 produzidas no Exemplo 4 foram adsorvidas em adjuvantes de hidróxido de alumínio e, em seguida, foram diluídas com diluentes da vacina a quatro diferentes concentrações, na proporção de 1:3 (ou seja, O.lμg/mL, 0.033μg/mL, 0.Oil μg/mL e 0.004μg/mL). Em cada grupo experimental, dez camundongos BALB/c foram inoculados com lml da vacina acima por injecção intraperitoneal. 0 soro foi coletado na quarta e na quinta semana após a injeção e os anticorpos neutralizantes de HPV foram avaliados pelas análises de neutralização de pseudo-viron pela EIA. Após a última coleta de soro, os camundongos foram sacrificados. 0 grupo de controle inclui dez camundongos BALB/c.

[0079] Valor de corte para EIA foi o valor negativo médio mais 0.16 (se o valor negativo médio estivesse abaixo do que 0.05, 0.05 foi usado no cálculo) . Antes da inoculação, todos os camundongos BALB/c tiveram resultado negativo nas análises de anticorpos neutralizantes de HPV, os resultados foram apresentados na Tabela 1.Tabela 1: resultado de ED50 de VLPs de HPV18N65C-L1 em camundongos BALB/c por Análise EIA

[0080] ED50 foi calculado de acordo com o método de Reed-Muench. Após a inoculação, foi coletado sangue para detectar ED50 na quarta e na quinta semana. As VLPs de HPV18N65C-L1 tinham um ED50 de 0.008μg na quarta semana e 0.008μg na quinta semana. Portanto, a imunização nestas doses pode induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes. A eficácia dessas doses foi muito menor do que a de O.lμg.

[0081] Os resultados da análise de neutralização de pseudo-viron só pode ser aceita quando mais de 20% das células do grupo de controle negativo e nenhuma das células do grupo de controle positivo produziu fluorescência. Foi considerado como resultado positivo quando menos de 50% das células no grupo de controle negativo produziu fluorescência. Os resultados foram apresentados na Tabela 2.Tabela 2: Resultado ED50 de VLPs de HPV18N65C-L1 VLP em camundongos Balb/c em Análise de Neutralização de Pseudo-viron

[0082] ED50 foi calculado de acordo com o método de Reed-Muench. Após a inoculação, foi coletado sangue para detectar ED50 na quarta e na quinta semana. As VLPs de HPV18N65C-L1 tinham um ED50 de O.Olδμg na quarta semana e 0.016μg na quinta semana. Portanto, a imunização nestas doses pode induzir altos niveis de anticorpos neutralizantes. A eficácia dessas doses foi muito menor do que a de O.lμg.

[0083] Coelhas (nivel geral) com 6-8 semanas de idade foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção à Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. As VLPs de HPV18N65C-L1, preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, as VLPs de HPV18N65C-L1 foram misturadas com adjuvante de Freund incompleto. As coelhas foram imunizadas através de injeção muscular, com lOOμg por coelha para a primeira imunização, e separadamente com 50μg por coelha para o reforço na semana 4, 10. Após a imunização, o sangue da veia externa foi coletado a cada semana e o soro foi separado e armazenado para detecção.

[0084] Cabras (nível geral) com 6-8 semanas de idade foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção à Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. As VLPs de HPV18N65C-L1, como preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, as VLPs de HPV18N65C-L1 foram misturadas com adjuvante de Freund incompleto. As cabras foram imunizadas através de injeção muscular, com Img por cabra para a primeira imunização, e com 0.5 mg por cabra para o reforço separadamente nas semanas 4, 10 e 18. Após a imunização, o sangue foi coletado da veia externa e o soro foi separado e armazenado para detecção.

[0085] Os títulos de neutralização dos anti-soros foram avaliados usando uma análise de modelo de célula de neutralisação a base de pseudo-víron. Como mostrado na Fig. 5 e 6, a vacina produzida pela mistura de VLPs de HPV18N65C-L1 preparadas no Exemplo 4 com adjuvantes de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório, além de adjuvantes de Freund, teve boa imunogenicidade, pôde induzir anticorpos neutralizantes com titulo elevado em animais e poderia ser uma vacina eficaz útil para a prevenção da infecção pelo HPV.

Resposta Imunológica de Macacos Rhesus Inoculados com Vacina Bivalente de HPV16/18

[0086] As fêmeas de macacos rhesus (nivel geral) , 2 anos, foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção a Doenças da provinda de Guangxi, onde foram criadas. A HPV18N65C-L1 preparada no Exemplo 4 foi adsorvida em adjuvantes de hidróxido de aluminio e VLPs de HPV16N30C-L1 preparadas de acordo com o método semelhante ao do Exemplo 4 também foram adsorvidas em adjuvantes de hidróxido de aluminio. Em seguida, as duas foram misturados na proporção de 2:1 de peso para produzir uma vacina bivalente de HPV16/18 . Cada dose (0,5 ml) continha 40μg de VLPs de HPV16N30C-L1, 20μg de VLPs de HPV18N65C-L1 e 0,6 mg de hidróxido de aluminio. Foi administrado separadamente aos macacos Rhesus 5μg, 10μg e 20μg de HPV 18 por injecção no deltóide do membro superior (em triplicata). Todos os animais candidatos mostraram que os anticorpos IgG totais e os anticorpos neutralizantes contra HPV 18 eram negativos antes da imunização. A vacina foi administrada a 0 e 4 semanas. Os animais foram criados durante 9 semanas e o sangue foi coletado toda semana. As amostras de sangue foram armazenadas a 37°C por 1.5h e, em seguida, centrifugadas a lO.OOOrpmpor 5min. O soro foi coletado para dosagem de titulos de anticorpos IgG totais e de anticorpos neutralizantes contra HPV16 e HPV18. Métodos de análise semelhantes foram usados para os dois tipos de anticorpos.

[0087] Como mostrado na Fig. 7 e Fig. 8, as VLPs de HPV18N65C-L1 de acordo com a invenção puderam induzir altos titulos de IgG total e anticorpos neutralizantes, superior a 20.000 na 9a semana após a primeira imunização. As VLPs de HPV18N65C-L1 tiveram boa imunogenicidade e poderiam ser usadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV18. Além disso, as VLPs de HPV16N30C-L1 da Vacina Bivalente pôde induzir altos titulos de IgG total e anticorpos neutralizantes contra o HPV16, superior a 20.000 na 9a semana após a primeira imunização, como mostrado na Fig. 9 e Fig. 10. As VLPs de HPV16N30C-L1 tiveram boa imunogenicidade e poderiam ser usadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV18.

[0088] A Sequência de Aminoácidos de HPV16N30C-L1 é mostrada no N° ID SEQ 7 da seguinte maneira. Proteção imunológica de Camundongos inoculados comVacina Quadrivalente de HPV6/11/16/18

[0089] Quatro camundongos SPF BALB/c de 4-5 semanas de idade foram utilizados. As VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1, preparadas de acordo com o método semelhante ao do Exemplo 4, foram misturadas na proporção de 1:2:2:1 (por peso), onde a concentração final deles foi 40μg/mL, 80μg/mL, 80μg/mL e 40μg/mL, respectivamente. A vacina foi misturada a uma quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização e foi misturada a uma quantidade igual de adjuvante de Freund incompleto para o reforço.

[0090] Os camundongos foram imunizados por injeção muscular. A quantidade para a primeira imunização foi de 10μg de HPV6N5C-L1, 10μg de HPV18N65C-L1, 20μg de HPV11N4C-L1, e 20μg de HPV16N30C-L1 por camundongo. O reforço foi administrado a cada duas semanas. A quantidade para o reforço foi de 20μg de HPV6N5C-L1, 20μg de HPV18N65C-L1, 40μg de HPV11N4C-L1, e 40μg de HPV16N30C-L1 por camundongo.

[0091] Após a imunização, o sangue da veia externa foi coletado semanalmente e o soro foi separado. Os titulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 em camundongos imunizados foram separadamente determinados de acordo com o método do Exemplo 5.

[0092] Os resultados foram mostrados na Fig. 11, indicando que a vacina quadrivalente de HPV6/11/16/18, preparada pela combinação de VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 conforme preparadas nos Exemplos 1-4, teve boa imunogenicidade, puderam induzir anticorpos neutralizantes com titulo elevado contra HPV 6, HPV 11, HPV 16 e HPV 18 em animais, e poderia ser usada como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção por HPV6/HPV11/HPV16/HPV18 (além de adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, a vacina poderia ser preparada combinando as quatro VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 com adjuvantes de hidróxido de aluminio ou fosfato de aluminio disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório).

[0093] A Sequência de Aminoácidos de HPV6N5C-L1 é mostrada no N° ID SEQ 8 da seguinte maneira. A Sequência de Aminoácidos de HPV11N4C-L1 é mostrada na SEQ ID NO:9:

[0094] A Sequência de Aminoácidos de VLP de HPV16N30C-L1 é mostrada no SEQ ID NO:7, conforme descrito acima.

[0095] Os resultados experimentais mostram que a vacina que foi formada VLPs de HPV18N65C-L1 preparadas no Exemplo 4 (além de adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, hidróxido de aluminio ou fosfato de aluminio adjuvantes disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório também poderiam ser usados), teve boa imunogenicidade, pôde induzir anticorpos neutralizantes com titulo elevado de animais e poderia ser uma vacina eficaz útil para a prevenção da infecção pelo HPV18.

Exemplo 6:

[0096] As proteínas HPV18L1 dispostas nos SEQ ID NOs: 2, 3, 4 e 5 foram preparadas de acordo com as técnicas usadas nos exemplos 1-5. Todas estas proteinas truncadas podem ser montadas em VLPs.

Claims (14)

1. Proteina Ll do HPV18 caracterizada por conter a sequência estabelecida nas SEQ ID Nos: 1, 2, ou 3.

2. Proteina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter a sequência estabelecida na SEQ ID No: 1.

3. Polinucleotideo, caracterizado por conter a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6.

4. Vetor, caracterizado por compreender o polinucleotideo, conforme definido na reivindicação 3.

5. Célula, compreendendo o vetor definido na reivindicação 4, caracterizada por a célula ser uma célula procarionte.

6. Composição caracterizada por conter a proteina de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

7. Particula semelhante ao virus HPV18 (VLP), caracterizada por compreender ou consistir da proteina HPV18 Ll, conforme definida nas SEQ ID Nos: 1, 2, ou 3.

8. Método para produzir a proteina HPV18 Ll, tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender:a) expressar um gene HPV Ll que têm a sequência definida na SEQ ID No. 6 ou as sequências degeneradas das mesmas que codificam a proteina HPV18 Ll de SEQ ID No. 1 em um sistema de expressão em E. coli; b) separar o E. coli, que expressou a proteina HPV Ll, em uma solução com concentração salina de l00 mM a 600mM, e isolar o sobrenadante;c) reduzir a concentração salina do sobrenadante de b) de l00 mM para 0, inclusive, usando água ou uma solução de baixa concentração salina para produzir um precipitado, e coletar o precipitado; ed) redissolver o precipitado de c) em uma solução a uma concentração salina de 150mM a 2500mM, adicionando um redutor a ela, e, em seguida, isolar a solução resultante, onde a solução contém a proteina HPV18 Ll com pureza de no minimo 50%.

9. O método da reivindicação 8 caracterizado por compreender:e) adicionalmente purificar a proteina HPV18 Ll com uma pureza de no minimo 50% por cromatografia; ef) remover o redutor da proteina HPV18 Ll obtida em e).

10. Vacina para a prevenção de câncer cervical, caracterizada por compreender:(1) HPV18 VLP, compreendendo ou consistindo da proteina HPV18 Ll, conforme definida nas SEQ ID Nos: 1, 2, ou 3, e (2) carreadores ou excipientes úteis para as vacinas.

11. Vacina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender uma HPV16 VLP compreendendo uma proteina contendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No: 7, e uma HPV18 VLP compreendendo uma proteina que possui uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No: 1; adicionalmente compreendendo uma HPV6 VLP compreendendo uma proteina contendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No: 8, e a HPV11 VLP compreendendo uma proteina contendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No: 9.

12. Uso da proteina HPV18 Ll, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou da HPV18 VLP, conforme definida na reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser aplicada na fabricação de uma vacina para a prevenção do câncer cervical.

13. Vacina para a prevenção do câncer cervical caracterizada por conter uma quantidade efetiva da proteina HPV18 Ll definida nas SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou HPV18 VLP compreendendo ou consistindo da proteina HPV18 Ll, conforme definida nas SEQ ID Nos: 1, 2, ou 3.

14. Método para a produção de uma vacina para a prevenção de câncer cervical, caracterizado por compreender misturar a HPV18 VLP, compreendendo ou consistindo da proteina HPV18 Ll, conforme definida nas SEQ ID Nos: 1, 2, ou 3 com carreadores ou excipientes úteis para as vacinas.