BRPI0815818B1

BRPI0815818B1 - Truncated LI protein of human papillomavirus type 18

Info

Publication number: BRPI0815818B1
Application number: BRPI0815818-5A
Authority: BR
Inventors: Wentong Shen; Zhongyi Li; Minghui Xie; Huirong Pan; Ningshao Xia; Shaowei Li
Original assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd
Priority date: 2007-04-29
Filing date: 2008-04-29
Publication date: 2025-12-16

Abstract

PROTEÍNA LI TRUNCADA DO PAPILOMA VÍRUS HUMANO TIPO 18 A invenção refere-se à proteína LI truncada do Papiloma vírus Humano Tipo 18, uma particula tipo virus (VLP) que consiste da proteína, à vacina que compreende a mencionada partícula e ao uso da vacina na prevenção de câncer cervical.TRUNCATED LI PROTEIN OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 18 The invention relates to the truncated LI protein of Human Papillomavirus Type 18, a virus-like particle (VLP) consisting of the protein, to the vaccine comprising said particle, and to the use of the vaccine in the prevention of cervical cancer.

Description

FIELD OF THE INVENTION

[0001] A invenção refere-se à proteína LI truncada do Vírus do Papiloma Humano Tipo 18 tal como definida na reivindicação 1, uma partícula semelhante a vírus que consiste da proteína, a uma vacina que inclui a mencionada partícula e ao uso da vacina na prevenção de câncer cervical.[0001] The invention relates to the truncated LI protein of Human Papillomavirus Type 18 as defined in claim 1, a virus-like particle consisting of the protein, a vaccine that includes said particle, and the use of the vaccine in the prevention of cervical cancer.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] O vírus do papiloma humano, um vírus ácido desoxirribonucléico (DNA) sem cápsula virai, pertence à família papovaviridae. O genoma virai é um DNA círculo fechado de cadeia dupla que tem aproximadamente 7.2-8kb de extensão e contém 8 quadros de leitura aberta (ORF, em inglês) . O genoma pode ser dividido em três partes em relação a funções: (1) a região inicial (E), de aproximadamente 4.5kb de extensão, que codifica 6 proteínas não estruturais, El, E2, E4~E7, associadas à replicação, à transcrição e a transformação do vírus; (2) a região final (L) , de aproximadamente 2.5kb de extensão, que codifica a proteína LI principal do capsídio e a proteína L2 secundária do capsídeo; (3) a região reguladora (LCR, em inglês), localizada entre o final da região Leo terminal de início da região E, de aproximadamente 800-900bp de extensão, inclui elementos regulares para a réplica de DNA e a expressão ao invés de codificar proteínas. As partículas virais têm 45-55nm de diâmetro, onde o nucleocapsídeo, que consiste de L1 e L2, exibe simetria icosaédrica e compreende 72 capsômeros.[0002] Human papillomavirus, a capsidless deoxyribonucleic acid (DNA) virus, belongs to the Papovaviridae family. The viral genome is a double-stranded closed-loop DNA that is approximately 7.2-8 kb long and contains 8 open reading frames (ORFs). The genome can be divided into three parts in relation to function: (1) the initial region (E), approximately 4.5 kb long, which encodes 6 non-structural proteins, E1, E2, E4~E7, associated with viral replication, transcription, and transformation; (2) the final region (L), approximately 2.5 kb long, which encodes the major capsid protein LI and the minor capsid protein L2; (3) the regulatory region (LCR), located between the terminal Leo end of the E start region, approximately 800-900 bp in length, includes regulatory elements for DNA replication and expression rather than encoding proteins. Viral particles are 45-55 nm in diameter, where the nucleocapsid, which consists of L1 and L2, exhibits icosahedral symmetry and comprises 72 capsomeres.

[0003] Atualmente, existem mais de 90 tipos diferentes de HPV, que causam, principalmente, doença papilar na pele e na mucosa humana. Os tipos de HPV são divididos em três grupos, dependendo de sua relação com carcinogênese: (1) grupo de sem ou de baixo risco de carcinogênese, que contém os tipos 6, 11, 39, 41, 42 e 43; (2) grupo de risco médio de carcinogênese, que contém os tipos 31, 33, 35, 51 e 52; e (3) grupo de risco alto de carcinogênese, que contém os tipos 16, 18, 45 e 56.[0003] Currently, there are more than 90 different types of HPV, which mainly cause papillary disease in human skin and mucous membranes. HPV types are divided into three groups depending on their relationship to carcinogenesis: (1) group with no or low risk of carcinogenesis, which contains types 6, 11, 39, 41, 42 and 43; (2) group with medium risk of carcinogenesis, which contains types 31, 33, 35, 51 and 52; and (3) group with high risk of carcinogenesis, which contains types 16, 18, 45 and 56.

[0004] A investigação epidemiológica molecular sugere que a infecção por tipos de HPV de risco alto é um fator importante no desenvolvimento de câncer cervical. O DNA do HPV é detectado em mais de 80% de incidência positiva em todos os casos de câncer cervical, cerca de 60% de HPV16 e cerca de 15% HPV18 (Clifford, G., S. Franceschi, et al. Vaccine 2006.24 Suppl 3:S26-34).[0004] Molecular epidemiological research suggests that infection with high-risk HPV types is an important factor in the development of cervical cancer. HPV DNA is detected in more than 80% of all cases of cervical cancer, approximately 60% HPV16 and approximately 15% HPV18 (Clifford, G., S. Franceschi, et al. Vaccine 2006.24 Suppl 3:S26-34).

[0005] O câncer cervical é o segundo tumor mais comum em mulheres, seguido de câncer de mama, e ameaça gravemente a saúde de mulheres. Existem por volta de 490.000 novos casos relatados todo ano no mundo e quase 270.000 pessoas morrem desta doença anualmente (Boyle, P., and J. Ferlay. Ann Oncol 2005, 16:481-8). Casos em paises em desenvolvimento somam em aproximadamente 83% do total e, por volta de 15% destes casos, envolvem neoplasmas malignos, em contraste a 1.5% em paises desenvolvidos. O câncer cervical é mais predominante na África Subsaariana, na América Latina, no Extremo Oriente e na Ásia Meridional. O câncer cervical também é predominante na China. A incidência de câncer cervical entre mulheres casadas é tão alta quanto 1026/100000 no Municipio de Lueyang, Provinda de Shanxi. Portanto, uma vacina segura e eficaz, especialmente contra os tipos de risco alto, como o HPV 16 e 18, seria um modo eficaz de prevenir câncer cervical e melhorar a saúde das mulheres.[0005] Cervical cancer is the second most common tumor in women, after breast cancer, and seriously threatens women's health. There are around 490,000 new cases reported every year worldwide and almost 270,000 people die from this disease annually (Boyle, P., and J. Ferlay. Ann Oncol 2005, 16:481-8). Cases in developing countries account for approximately 83% of the total, and around 15% of these cases involve malignant neoplasms, in contrast to 1.5% in developed countries. Cervical cancer is most prevalent in Sub-Saharan Africa, Latin America, the Far East, and South Asia. Cervical cancer is also prevalent in China. The incidence of cervical cancer among married women is as high as 1026/100,000 in Lueyang Municipality, Shanxi Province. Therefore, a safe and effective vaccine, especially against high-risk types such as HPV 16 and 18, would be an effective way to prevent cervical cancer and improve women's health.

[0006] A proteina HPV Ll, com peso molecular de 55-60kDa, é a proteina de capsideo principal do virus do papiloma humano e o alvo principal da vacina contra HPV. A proteina HPV Ll expressada em múltiplos sistemas de expressão diferentes pode formar partículas semelhantes a virus (VLP) que se assemelham morfologicamente às partículas de HPV nativas, sem a assistência da proteina L2. A VLP, que consiste de 721 pentâmeros das proteínas Ll, exibe simetria icosaédrica. Como as VLPs mantêm o epitopos das partículas virais, elas são altamente imunogênicas e podem induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra o HPV homólogo (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sei USA 89(24) : 12180-4) . Além disso, as VLPs são seguras e não têm risco carcinógeno em potencial já que elas não contêm DNA virai. Portanto, as vacinas de VLP tornam-se o candidato principal para uma vacina contra HPV.[0006] The HPV L1 protein, with a molecular weight of 55-60kDa, is the main capsid protein of the human papillomavirus and the primary target of the HPV vaccine. The HPV L1 protein expressed in multiple different expression systems can form virus-like particles (VLPs) that morphologically resemble native HPV particles, without the assistance of the L2 protein. The VLP, which consists of 721 pentamers of the L1 proteins, exhibits icosahedral symmetry. Because VLPs retain the epitopes of viral particles, they are highly immunogenic and can induce the generation of neutralizing antibodies against homologous HPV (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci USA 89(24): 12180-4). Furthermore, VLPs are safe and have no potential carcinogenic risk since they do not contain viral DNA. Therefore, VLP vaccines become the leading candidate for an HPV vaccine.

[0007] A chave para o desenvolvimento de uma vacina é produzir eficientemente vacinas de VLP de HPV em grande escala. Atualmente, os sistemas de expressão frequentemente mais usados são sistemas de expressão eucariótica e sistemas de expressão procariótica.[0007] The key to developing a vaccine is to efficiently produce HPV VLP vaccines on a large scale. Currently, the most frequently used expression systems are eukaryotic expression systems and prokaryotic expression systems.

[0008] Os sistemas eucarióticos frequentemente usados incluem poxvirus, baculovirus de insetos e vetores de levedura. A proteína HPV LI expressa em sistemas eucarióticos demonstra pouca diferença de adaptação daquela do vírus nativo e pode formar-se em VLPs. Deste modo, VLPs purificadas podem ser facilmente obtidas após centrifugação por gradiente de densidade. Isto traz grande conveniência ao trabalho de purificação. Porém, devido aos altos custos de culturas e o baixo nível de expressão, é bastante difícil produzir industrialmente em grande escala. A vacina contra HPV Gardasil®, que entrou no mercado recentemente, é mais cara do que as outras devido ao baixo nível de expressão e o alto custo de produção do sistema de expressão por Saccharomyces cerevisiae empregado na sua fabricação.[0008] Eukaryotic systems frequently used include poxviruses, insect baculoviruses, and yeast vectors. The HPV LI protein expressed in eukaryotic systems shows little difference in adaptation from that of the native virus and can form VLPs. Thus, purified VLPs can be easily obtained after density gradient centrifugation. This brings great convenience to purification work. However, due to the high costs of cultures and the low level of expression, it is quite difficult to produce industrially on a large scale. The HPV vaccine Gardasil®, which recently entered the market, is more expensive than others due to the low level of expression and the high cost of producing the Saccharomyces cerevisiae expression system used in its manufacture.

[0009] A expressão da proteína HPV LI em um sistema procariótico como o por E. coli foi relatado anteriormente. Banks, Matlashewski, et al. publicou um artigo referente à expressão de HPV 16 LI através de emprego de E. coli (Banks, L., G. Matlashewski, et al. (1987) . J Gen Virol 68 (Pt 12) : 3081-9) . Porém, a maior parte das proteínas HPV LI expressas por E. Coli perde sua configuração nativa e não podem induzir a geração de anticorpos protetores contra HPV. Por outro lado, embora as VLPs de HPV possam ser obtidas a partir de proteínas revestidas incorretamente por etapas como purificação a partir de corpos de inclusão e novo revestimento, é difícil aplicar este método à produção em grande escala, já que a proteína é perdida em grandes proporções durante o processo de novo revestimento e a levedura é baixa (Kelsall, S. R. and J. K. Kulski (1995) . J Virol Methods 53 (1) : 75-90) . Embora a proteína HPV LI possa ser expressa em uma forma solúvel, com uma configuração correta em E. coli, e dissolvida em suspensão de lisado de E. coli, o nivel de expressão é baixo. Além disso, como há um grande número e quantidade de proteinas impuras, é dificil isolar as proteinas em que estamos interessados das outras. Embora seja relatado que o nivel de expressão da proteina LI pode ser aumentado em suspensão por meio de expressão por fusão GST e a purificação da proteina em que estamos interessados é facilitada P. Cripe, et al. (1997) , J Virol 71 (4) : 2988-95), ainda não se pode aplicar a produção em grande escala devido às enzimas caras que são necessárias para clivar a proteina de fusão.[0009] The expression of HPV LI protein in a prokaryotic system such as E. coli has been previously reported. Banks, Matlashewski, et al. published an article concerning the expression of HPV 16 LI using E. coli (Banks, L., G. Matlashewski, et al. (1987). J Gen Virol 68 (Pt 12): 3081-9). However, most HPV LI proteins expressed by E. coli lose their native configuration and cannot induce the generation of protective antibodies against HPV. On the other hand, although HPV VLPs can be obtained from incorrectly coated proteins by steps such as purification from inclusion bodies and recoating, it is difficult to apply this method to large-scale production, since the protein is lost in large proportions during the recoating process and the yeast is low (Kelsall, S. R. and J. K. Kulski (1995). J Virol Methods 53 (1): 75-90). Although the HPV LI protein can be expressed in a soluble form, with a correct configuration in E. coli, and dissolved in E. coli lysate suspension, the expression level is low. Furthermore, since there is a large number and quantity of impure proteins, it is difficult to isolate the proteins we are interested in from the others. Although it is reported that the expression level of the LI protein can be increased in suspension by means of GST fusion expression and the purification of the protein we are interested in is facilitated (P. Cripe, et al.). (1997) , J Virol 71 (4) : 2988-95), large-scale production cannot yet be applied due to the expensive enzymes that are needed to cleave the fusion protein.

[0010] Portanto, uma proteina HPV L1 tendo um baixo custo de produção e capaz de induzir a geração de anticorpos protetores contra HPV e uma partícula semelhante a virus que consista do mesmo ainda são necessárias na área, para que possa ser possivel produzir vacinas para câncer cervical industrialmente em grande escala.[0010] Therefore, an HPV L1 protein that has a low production cost and is capable of inducing the generation of protective antibodies against HPV, and a virus-like particle consisting of the same, are still needed in the field so that it may be possible to produce cervical cancer vaccines industrially on a large scale.

Description of the Invention

[0011] Esta invenção tem como objetivo fornecer uma proteina HPV tipo 18 L1 original, as VLPs que consistem dela e uma vacina que inclui as VLPs.[0011] This invention aims to provide an original HPV type 18 L1 protein, the VLPs consisting of it, and a vaccine that includes the VLPs.

[0012] Durante a pesquisa, foi descoberto por acaso que o sistema de expressão por E. coli pode produzir uma proteina HPV 18 L1 que pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra HPV 18. Após a purificação, a proteina HPV 18 LI pode ser produzida em levedura alta, com pelo menos 50% de pureza. O tratamento adicional da proteina HPV LI purificada pode produzir VLPs, que podem induzir a produção de anticorpos neutralizantes. A invenção foi completada baseando-se no que foi dito acima.[0012] During the research, it was discovered by chance that the expression system by E. coli can produce an HPV 18 L1 protein that can induce the generation of neutralizing antibodies against HPV 18. After purification, the HPV 18 LI protein can be produced in high yeast, with at least 50% purity. Further treatment of the purified HPV LI protein can produce VLPs, which can induce the production of neutralizing antibodies. The invention was completed based on the above.

[0013] Portanto, o primeiro aspecto da invenção refere-se a proteinas HPV 18 Ll com 50, 55, ou 65- aminoácidos truncados em seu N-terminal quando comparado à proteina HPV 18 Ll do tipo natural. Preferencialmente, a proteina truncada tem a sequência disposta no SEQ ID NOs: 1, 2, ou 3, especialmente a sequência disposta no SEQ ID NO: 1.[0013] Therefore, the first aspect of the invention relates to HPV 18 Ll proteins with 50, 55, or 65 amino acids truncated at their N-terminus when compared to the natural type HPV 18 Ll protein. Preferably, the truncated protein has the sequence arranged in SEQ ID NOs: 1, 2, or 3, especially the sequence arranged in SEQ ID NO: 1.

[0014] Outro aspecto da invenção refere-se a um polinucleótido que codifica a proteina truncada de acordo com a invenção e um vetor que contém o polinucleótido.[0014] Another aspect of the invention relates to a polynucleotide encoding the truncated protein according to the invention and a vector containing the polynucleotide.

[0015] Outro aspecto da invenção refere-se a uma célula que compreende o vetor.[0015] Another aspect of the invention relates to a cell comprising the vector.

[0016] A invenção também se refere à composição que compreende a proteina truncada, o polinucleótido, o vetor ou a célula.[0016] The invention also relates to the composition comprising the truncated protein, the polynucleotide, the vector or the cell.

[0017] Outro aspecto da invenção refere-se à HPV 18 VLP, que contém ou consiste de proteinas HPV 18 Ll com 50, 55, ou 65 aminoácidos truncados no N-terminal, como proteinas HPV 18 Ll que têm sequência disposta nas SEQ ID NOs: 1, 2, ou 3.[0017] Another aspect of the invention relates to HPV 18 VLP, which contains or consists of HPV 18 Ll proteins with 50, 55, or 65 amino acids truncated at the N-terminus, such as HPV 18 Ll proteins that have sequences arranged in SEQ ID NOs: 1, 2, or 3.

[0018] Outro aspecto da descrição refere-se ao método para a obtenção da proteina HPV 18 Ll, que inclui a expressão de um fragmento de gene HPV 18 Ll truncado em um sistema de E. coli e a purificação subsequente da proteina da suspensão de lisados.[0018] Another aspect of the description refers to the method for obtaining the HPV 18 Ll protein, which includes the expression of a truncated HPV 18 Ll gene fragment in an E. coli system and the subsequent purification of the protein from the lysate suspension.

[0019] Na modalidade preferida da invenção, um método de obter proteína HPV 18 L1 tal como definida nas reivindicações 1 e 2 compreende:a) expressar o fragmento de gene HPV 18 LI truncado em sistema de expressão por E. coli; b) desfazer o E. coli, que expressou a proteína HPV 18 L1 truncada, em uma solução a uma concentração de sal de lOOmM a 600mM, e isolar a suspensão;c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de lOOmM a 0, inclusive, usando água ou uma solução com baixo sal, e coletar o precipitado; d) re-dissolver o precipitado de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de uma redução, e, em seguida, isolar a solução resultante em que a solução contenha a proteína HPV 18 LI com pureza a, pelo menos, 50%.[0019] In the preferred embodiment of the invention, a method of obtaining HPV 18 L1 protein as defined in claims 1 and 2 comprises: a) expressing the truncated HPV 18 L1 gene fragment in an E. coli expression system; b) dissolving the E. coli that expressed the truncated HPV 18 L1 protein in a solution at a salt concentration of 10mM to 600mM, and isolating the suspension; c) decreasing the salt concentration of the suspension from b) from 10mM to 0, inclusive, using water or a low-salt solution, and collecting the precipitate; d) re-dissolving the precipitate from c) in a solution at a salt concentration of 150mM to 2500mM, with the addition of a reduction, and then isolating the resulting solution in which the solution contains the HPV 18 L1 protein with a purity of at least 50%.

[0020] De forma mais geral, a invenção também se refere ao método de obtenção da proteína HPV Llcompreendendo:a) expressar gene HPV L1 que codifica a proteína HPV LI em um sistema de expressão em E. coli;b) desfazer o E. coli, que expressou a proteína HPV Ll, em uma solução a uma concentração de sal de lOOmM a 600mM, e isolar a suspensão;c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de lOOmM a 0, inclusive, usando água ou uma solução com baixo sal, e coletar o precipitado; d) re-dissolver o precipitado de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de uma redução, e, em seguida, isolar a solução resultante em que a solução contenha a proteina HPV LI com pureza a, pelo menos, 50%.[0020] More generally, the invention also relates to the method of obtaining the HPV L1 protein comprising: a) expressing the HPV L1 gene encoding the HPV L1 protein in an E. coli expression system; b) dissolving the E. coli that expressed the HPV L1 protein in a solution at a salt concentration of 10mM to 600mM, and isolating the suspension; c) decreasing the salt concentration of the suspension from b) to 0mM inclusive, using water or a low-salt solution, and collecting the precipitate; d) re-dissolving the precipitate from c) in a solution at a salt concentration of 150mM to 2500mM, with the addition of a reduction, and then isolating the resulting solution in which the solution contains the HPV L1 protein with a purity of at least 50%.

[0021] A invenção também se refere a uma vacina para a prevenção de câncer cervical, que inclui VLPs de proteinas HPV 18 L1 truncadas de acordo com a invenção, preferencialmente em uma quantidade eficaz para prevenir câncer cervical. Preferencialmente, a vacina também inclui pelo menos uma VLP de proteinas HPV16, 11, 6, 31, 33, 45, 52 ou 58 Ll, preferencialmente em uma quantidade eficaz para prevenir o câncer cervical ou a infecção causada pelos tipos de HPV correspondentes. Geralmente, a vacina também contém excipientes ou vetores para vacina.[0021] The invention also relates to a vaccine for the prevention of cervical cancer, which includes truncated HPV 18 L1 protein VLPs according to the invention, preferably in an amount effective to prevent cervical cancer. Preferably, the vaccine also includes at least one HPV16, 11, 6, 31, 33, 45, 52 or 58 L1 protein VLP, preferably in an amount effective to prevent cervical cancer or infection caused by the corresponding HPV types. Generally, the vaccine also contains vaccine excipients or vectors.

[0022] Preferencialmente, a vacina compreende VLPs de HPV 16 e VLPs de HPV 18, especialmente VLPs de HPV 16 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 7, VLPs de HPV 18 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 1. É ainda mais preferível que a vacina também compreenda VLPs de HPV 6 e VLPs de HPV 11, especialmente VLPs de HPV 6 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 8, VLPs de HPV 11 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 9.[0022] Preferably, the vaccine comprises HPV 16 VLPs and HPV 18 VLPs, especially HPV 16 VLPs that include or consist of the protein that has the amino acid sequence at SEQ ID NO: 7, HPV 18 VLPs that include or consist of the protein that has the amino acid sequence at SEQ ID NO: 1. It is even more preferable that the vaccine also comprises HPV 6 VLPs and HPV 11 VLPs, especially HPV 6 VLPs that include or consist of the protein that has the amino acid sequence at SEQ ID NO: 8, HPV 11 VLPs that include or consist of the protein that has the amino acid sequence at SEQ ID NO: 9.

[0023] Especialmente em uma modalidade preferida, a vacina compreende VLPs de HPV 16 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 7, VLPs de HPV 18 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 1, VLPs de HPV 6 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 8, VLPs de HPV 11 que incluam ou consistam da proteina que tem a sequência de aminoácidos disposta no SEQ ID NO: 9, preferencialmente, em uma quantidade eficaz para prevenir câncer cervical ou infecção causada pelos subtipos de HPV correspondentes.[0023] Especially in a preferred embodiment, the vaccine comprises HPV 16 VLPs that include or consist of the protein having the amino acid sequence at SEQ ID NO: 7, HPV 18 VLPs that include or consist of the protein having the amino acid sequence at SEQ ID NO: 1, HPV 6 VLPs that include or consist of the protein having the amino acid sequence at SEQ ID NO: 8, HPV 11 VLPs that include or consist of the protein having the amino acid sequence at SEQ ID NO: 9, preferably in an amount effective to prevent cervical cancer or infection caused by the corresponding HPV subtypes.

[0024] A invenção, além disso, refere-se ao uso da proteina HPV 18 Ll truncada ou aos VLPs dela na fabricação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical.[0024] The invention further relates to the use of truncated HPV 18 Ll protein or VLPs thereof in the manufacture of a vaccine for the prevention of cervical cancer.

[0025] A invenção também se refere a vacina compreendendo uma quantidade preventiva eficaz de proteina HPV 18 Ll tal como definida nas reivindicações 1 e 2, para o uso na prevenção do câncer cervical.[0025] The invention also relates to a vaccine comprising an effective preventive amount of HPV 18 Ll protein as defined in claims 1 and 2, for use in the prevention of cervical cancer.

[0026] A invenção envolve um método de obtenção de VLPs da proteina HPV 18 Ll, que compreende:e) purificação adicional da proteina HPV 18 Ll truncada com uma pureza de, pelo menos, 50% através de cromatografia;f) remoção da redução da proteina HPV 18 Ll obtida em e).[0026] The invention involves a method for obtaining VLPs from the HPV 18 Ll protein, comprising: e) further purification of the truncated HPV 18 Ll protein to a purity of at least 50% by chromatography; f) removal of the reduction of the HPV 18 Ll protein obtained in e).

[0027] Esta invenção envolve um método de preparação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical, que inclui combinação dos VLPs acima e, opcionalmente, um ou mais VLPs selecionados do grupo que consiste de VLPs de tipos de HPV 6, 11, 16, 31, 33, 45, 52 e 58, com vetores ou excipientes para as vacinas.[0027] This invention involves a method of preparing a vaccine for the prevention of cervical cancer, which includes a combination of the above VLPs and, optionally, one or more VLPs selected from the group consisting of VLPs of HPV types 6, 11, 16, 31, 33, 45, 52 and 58, with vectors or excipients for the vaccines.

Definitions of the terms of the present invention

[0028] De acordo com a invenção, o termo "sistema de expressão em E. coli" refere-se a um sistema de expressão que consiste de E. coli (estirpes) e vetores, no qual E. coli (estirpes) inclui, mas não está limitado a: GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3) e BLR (DE3), que estão disponíveis no mercado.[0028] According to the invention, the term "E. coli expression system" refers to an expression system consisting of E. coli (strains) and vectors, wherein E. coli (strains) includes, but is not limited to: GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3) and BLR (DE3), which are commercially available.

[0029] De acordo com a invenção, o termo "vetores" refere-se aos dispositivos de transporte de ácido nucléico que tenham o polinucleótido codificando certa proteina inserida no local e permitam a expressão da proteina O "vetor" pode ter o material qenético transportado expressado em uma célula hospedeira por transformação, transdução e transfecção dentro da célula hospedeira. Por exemplo, "vetores" incluem plasmideos, faqos, cosmideos e semelhantes.[0029] According to the invention, the term "vectors" refers to nucleic acid transport devices that have the polynucleotide encoding a certain protein inserted at the site and allow the expression of the protein. The "vector" may have the transported genetic material expressed in a host cell by transformation, transduction, and transfection within the host cell. For example, "vectors" include plasmids, phaqs, cosmids, and the like.

[0030] De acordo com a invenção, o termo "um fragmento de gene da proteína HPV 18 L1 truncada" refere-se aos ácidos nucléicos com nucleotídeo (s) que codifica um ou mais sequências de aminoácidos eliminados em 5' ou 3' terminal do gene HPV 18 LI natural (cDNA). A sequência inteira de gene do gene HPV 18 L1 natural pode ser encontrada nas, mas não limitado a, seguintes sequências do NCBI: AY262282.1, X05015.1, AY863156.1 e U89349.1.[0030] According to the invention, the term "a truncated HPV 18 L1 protein gene fragment" refers to nucleic acids with nucleotide(s) encoding one or more amino acid sequences deleted at the 5' or 3' terminus of the natural HPV 18 L1 gene (cDNA). The entire gene sequence of the natural HPV 18 L1 gene can be found in, but not limited to, the following NCBI sequences: AY262282.1, X05015.1, AY863156.1 and U89349.1.

[0031] O termo "proteína HPV 18 LI truncada" refere-se à proteína com 50, 55 ou 65 aminoácidos eliminados no N-terminal da proteína HPV 18 LI natural. A sequência inteira de gene do gene HPV 18 LI natural pode ser encontrada nas, mas não limitado a, proteínas L1 inteiras codificadas pelas seguintes sequências do NCBI: AY262282.1, X05015.1, AY863156.1 e U89349.1.[0031] The term "truncated HPV 18 LI protein" refers to the protein with 50, 55, or 65 amino acids deleted at the N-terminus of the natural HPV 18 LI protein. The entire gene sequence of the natural HPV 18 LI gene can be found in, but is not limited to, whole L1 proteins encoded by the following NCBI sequences: AY262282.1, X05015.1, AY863156.1, and U89349.1.

[0032] De acordo com a invenção, o termo "excipientes e vetores para vacinas" refere-se a um ou mais reagentes, incluindo, mas não limitado a: Reguladores de pH, surfactantes, adjuvantes e fortalecedores iõnicos. Por exemplo, os regulares de pH incluem, mas não estão limitados a, soluções-tampão fosfato; surfactantes incluem, mas não estão limitados a: surfactantes de ânion surfactantes de cátions, surfactantes não iõnicos (por exemplo, mas não limitado a, Tween-80); adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, hidróxido de aluminio e adjuvante completo de Freund; e fortalecedores iõnicos incluem, mas não estão limitados a, NaCl.[0032] According to the invention, the term "excipients and vectors for vaccines" refers to one or more reagents, including, but not limited to: pH regulators, surfactants, adjuvants and ionic strengtheners. For example, pH regulators include, but are not limited to, phosphate buffer solutions; surfactants include, but are not limited to: anion surfactants, cation surfactants, non-ionic surfactants (e.g., but not limited to, Tween-80); adjuvants include, but are not limited to, aluminum hydroxide and Freund's complete adjuvant; and ionic strengtheners include, but are not limited to, NaCl.

[0033] De acordo com a invenção, o termo "cromatografia" inclui, mas não está limitado a: cromatografia de troca iônica (por exemplo, cromatografia de troca de cátions), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia absorvente (por exemplo, cromatografia em hidroxiapatite), cromatografia em gel filtração (cromatografia de exclusão em gel) e cromatografia de afinidade.[0033] According to the invention, the term "chromatography" includes, but is not limited to: ion-exchange chromatography (e.g., cation-exchange chromatography), hydrophobic interaction chromatography, absorbent chromatography (e.g., hydroxyapatite chromatography), gel filtration chromatography (gel exclusion chromatography), and affinity chromatography.

[0034] De acordo com a invenção, as proteinas HPV 18 L1 truncadas podem ser obtidas, preferencialmente, pelos seguintes passos:a) desfazer E. coli, que expressa a proteina HPV 18 LI truncada, em uma solução-tampão que contenha 100-600mM de sal, preferencialmente 200-500mM;b) isolar a suspensão da solução rompida, em seguida, diminuir a concentração de sal da suspensão para 100 mM - 0M com água ou solução-tampão de baixo sal (geralmente, com uma concentração de sal menor do que aquela da solução-tampão para romper);c) separar o precipitado da suspensão com uma concentração de sal tão baixa quanto 100 mM-0; d) redissolver o precipitado em uma solução que contenha um redutor e tenha uma concentração de sal de 150-2000mM, preferencialmente maior do que 200mM;e) Isolar uma solução das proteinas HPV 18 Ll truncadas com pureza de, pelo menos, 50%, preferencialmente em, pelo menos, 70%, sendo mais preferivel, pelo menos, 80%.[0034] According to the invention, truncated HPV 18 L1 proteins can preferably be obtained by the following steps: a) breaking down E. coli, which expresses the truncated HPV 18 LI protein, in a buffer solution containing 100-600mM of salt, preferably 200-500mM; b) isolating the suspension from the broken solution, then decreasing the salt concentration of the suspension to 100 mM - 0M with water or a low-salt buffer solution (generally with a salt concentration lower than that of the buffer solution to break down); c) separating the precipitate from the suspension with a salt concentration as low as 100 mM - 0; d) Redissolve the precipitate in a solution containing a reducing agent and having a salt concentration of 150-2000mM, preferably greater than 200mM; e) Isolate a solution of truncated HPV 18 Ll proteins with a purity of at least 50%, preferably at least 70%, and more preferably at least 80%.

[0035] De acordo com a invenção, no método de obtenção das proteinas HPV 18 Ll, o termo "tampão" refere-se à solução que pode manter o valor de pH estável dentro de certa variação, incluindo, mas não limitado a: Soluções-tampão tris, soluções-tampão fosfato, soluções-tampão HEPES e soluções-tampão MOPS.[0035] According to the invention, in the method of obtaining HPV 18 Ll proteins, the term "buffer" refers to the solution that can maintain a stable pH value within a certain range, including, but not limited to: Tris buffer solutions, phosphate buffer solutions, HEPES buffer solutions and MOPS buffer solutions.

[0036] De acordo com a invenção, o rompimento da célula hospedeira procariótica pode ser realizado por métodos que incluem, mas não estão limitados a, um ou mais rompimentos homogenizadores, tratamento ultra-sônico, trituração, extrusão por pressão alta e tratamento por lisozima.[0036] According to the invention, the disruption of the prokaryotic host cell can be carried out by methods that include, but are not limited to, one or more homogenizing disruptions, ultrasonic treatment, grinding, high-pressure extrusion and lysozyme treatment.

[0037] De acordo com a invenção, no método de obtenção das proteinas HPV 18 Ll truncadas, os sais usados incluem, mas não estão limitados a: um ou mais dos sais neutros, especialmente sal de metal alcalino, sais de amónio, cloridratos, sulfatos, bicarbonatos, hidrogenofosfatos ou sais de fosfato, especialmente NaCl, KC1, NH4CI, (NH4)2SC>4. É preferível NaCl. A redução usada inclui, mas não está limitado a, DTT e 2-mercaptoetanol, em uma quantidade de, mas não limitado a, lO-lOOmM.[0037] According to the invention, in the method of obtaining truncated HPV 18 Ll proteins, the salts used include, but are not limited to: one or more of the neutral salts, especially alkali metal salts, ammonium salts, hydrochlorides, sulfates, bicarbonates, hydrogen phosphates or phosphate salts, especially NaCl, KCl, NH4Cl, (NH4)2SC4. NaCl is preferred. The reduction used includes, but is not limited to, DTT and 2-mercaptoethanol, in an amount of, but not limited to, 10-100 mL.

[0038] De acordo com a invenção, as VLPs das proteinas HPV 18 LI truncadas podem ser produzidas pelos seguintes passos: purificação adicional da proteina HPV 18 LI isolada truncada com pureza de, pelo menos, 50% a submetendo à cromatografia e, com isso, obtendo uma solução purificada de proteina HPV 18 L1 truncada; e remoção da redução da solução purificada de proteina HPV 18 L1 e, com isso, obtendo as VLPs HPV 18 L1 truncadas. Os métodos para a remoção da redução incluem, mas não estão limitados a, técnicas conhecidas na área, como diálise, ultrafiltração e cromatografia.[0038] According to the invention, truncated HPV 18 L1 protein VLPs can be produced by the following steps: further purification of isolated truncated HPV 18 L1 protein with a purity of at least 50% by subjecting it to chromatography, thereby obtaining a purified solution of truncated HPV 18 L1 protein; and removal of the reduction from the purified solution of HPV 18 L1 protein, thereby obtaining truncated HPV 18 L1 VLPs. Methods for removing the reduction include, but are not limited to, techniques known in the field, such as dialysis, ultrafiltration, and chromatography.

[0039] De acordo com a invenção, a proteina HPV L1 tem, preferencialmente, a sequência disposta no SEQ ID NO: 1.[0039] According to the invention, the HPV L1 protein preferably has the sequence arranged in SEQ ID NO: 1.

[0040] De acordo com a invenção, a vacina pode ser administrada em forma aceita pelo paciente, incluindo, mas não limitado a, oral e injeção, preferencialmente injeção.[0040] According to the invention, the vaccine can be administered in a form acceptable to the patient, including, but not limited to, oral and injection, preferably injection.

[0041] De acordo com a invenção, a vacina é usada, preferencialmente, em dose única. Cada dose contém 5-80μg de VLP de HPV 18 LI truncada, preferencialmente 20-40μg.[0041] According to the invention, the vaccine is preferably used in a single dose. Each dose contains 5-80μg of truncated HPV 18 LI VLP, preferably 20-40μg.

Beneficial Effects

[0042] Atualmente, os sistemas de expressão úteis à preparação de VLPs de HPV incluem sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.[0042] Currently, expression systems useful for preparing HPV VLPs include eukaryotic and prokaryotic expression systems.

[0043] As proteínas HPV LI expressas em sistemas de expressão eucarióticos mantêm sua configuração nativa e podem formar VLPs sozinhas. Na maioria dos casos, uma VLP com configuração correta pode ser obtida por purificação simples. No entanto, sistemas de expressão eucarióticos, como sistemas de expressão por baculovírus e levedura, são difíceis de serem aplicados em produção de grande escala industrial devido aos níveis baixos de expressão e aos altos custos.[0043] HPV LI proteins expressed in eukaryotic expression systems retain their native configuration and can form VLPs on their own. In most cases, a correctly configured VLP can be obtained by simple purification. However, eukaryotic expression systems, such as baculovirus and yeast expression systems, are difficult to apply in large-scale industrial production due to low expression levels and high costs.

[0044] Sistemas de expressão procarióticos, como sistemas em E. coli, têm a vantagens de ter altos níveis de expressão a um menor custo. Porém, quando expressos em um sistema procarióticos, a proteína HPV L1 normalmente perde sua configuração nativa e é expressa em uma forma de corpos de inclusão no precipitante. A renaturação da proteína a partir de corpos de inclusão ainda é um problema mundial. Devido à dificuldade e da ineficiência da renaturação, este método está limitado à pesquisa laboratorial em pequena escala e não pode ser aplicado em grande escala para obter VLP com configuração correta a partir dos corpos de inclusão. Embora a proteína HPV LI possa existir em sua configuração nativa na suspensão de lisado de E. coli, seus níveis de expressão são baixos. Além disso, é bastante difícil purificar a proteína HPV LI a partir das numerosas proteínas solúveis na suspensão de lisado de E. coli. Geralmente, a purificação é completada através de métodos, como expressão por fusão e cromatografia de afinidade, que não são viáveis para processos em escala industrial devido às enzimas caras empregadas nos métodos.[0044] Prokaryotic expression systems, such as those in E. coli, have the advantage of achieving high expression levels at a lower cost. However, when expressed in a prokaryotic system, the HPV L1 protein typically loses its native configuration and is expressed in the form of inclusion bodies in the precipitant. Renaturation of the protein from inclusion bodies remains a global challenge. Due to the difficulty and inefficiency of renaturation, this method is limited to small-scale laboratory research and cannot be applied on a large scale to obtain correctly configured VLPs from inclusion bodies. Although the HPV LI protein can exist in its native configuration in the E. coli lysate suspension, its expression levels are low. Furthermore, it is quite difficult to purify the HPV LI protein from the numerous soluble proteins in the E. coli lysate suspension. Generally, purification is completed through methods such as fusion expression and affinity chromatography, which are not viable for industrial-scale processes due to the expensive enzymes employed in these methods.

[0045] Nesta invenção, a proteina HPV 18 Ll N-truncada é expressa em sistema de expressão em E. coli e é precipitada seletivamente a partir da suspensão do lisado de E. coli sob condições amenas. A proteina HPV Ll é, em seguida, redissolvida em solução-tampão de sal para aprimorar significativamente sua pureza enquanto ainda mantém sua configuração nativa. A proteina redissolvida de interesse pode ser submetida imediatamente à cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica para se obter a proteina pura. A proteina HPV 18 Ll truncada purificada, obtida a partir destes passos, pode formar-se em VLPs com boa imunogenicidade e com a habilidade de induzir anticorpos neutralizantes de alto titulo contra HPV 18, que é uma boa vacina para a prevenção humana contra a infecção de HPV 18 . Além disso, a proteina HPV 18 Ll truncada usada na presente invenção é facilmente expressa em um sistema de expressão em E. coli e pode ser purificada de forma econômica sem o uso de enzimas caras, pois seu custo de produção é baixo. Ademais, como a proteina de interesse não é submetida aos procedimentos intensos de desnaturação e renaturação durante a purificação, o método pode ser aplicado industrialmente em grande escala devido à baixa perda.[0045] In this invention, the N-truncated HPV 18 Ll protein is expressed in an E. coli expression system and is selectively precipitated from the E. coli lysate suspension under mild conditions. The HPV Ll protein is then redissolved in a salt buffer solution to significantly improve its purity while still maintaining its native configuration. The redissolved protein of interest can be immediately subjected to ion-exchange or hydrophobic interaction chromatography to obtain the pure protein. The purified truncated HPV 18 Ll protein, obtained from these steps, can form VLPs with good immunogenicity and the ability to induce high-titer neutralizing antibodies against HPV 18, which is a good vaccine for human prevention against HPV 18 infection. Furthermore, the truncated HPV 18 Ll protein used in the present invention is readily expressed in an E. coli expression system and can be economically purified without the use of expensive enzymes, as its production cost is low. Moreover, since the protein of interest is not subjected to intensive denaturation and renaturation procedures during purification, the method can be applied industrially on a large scale due to the low loss.

[0046] A invenção será mais evidente após a consulta da seguinte descrição detalhada e os desenhos.[0046] The invention will become more apparent after consulting the following detailed description and drawings.

Description of the Drawings

[0047]A Fig. 1 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteina HPV18N65C-L1 em diferentes fases durante as etapas a)-d) do método de acordo com a invenção. M: Marcador de Peso Molecular; Rota 1: Suspensão de lisado 10 vezes diluida; Rota 2: proteina HPV18N65C-L1 precipitada por fluxo tangencial; Rota 3: HPV18N65C-L1 redissolvida em solução de re-suspensão. O resultado eletroforético mostra que a pureza da HPV1630C-L1 atingiu cerca de 70% após as etapas de precipitação e re-dissolução.A Fig. 2 mostra o resultado de SDS-PAGE de HPV18N65C-L1 que foi obtida na etapa d) e que foi também, purificada de acordo com a etapa e) . M: Marcador de Peso Molecular; Rota 1: HPV18N65C-L1 purificada de acordo com a etapa e), 5μL; Rota 2: HPV18N65C-L1 purificada de acordo com a etapa e), 25μL. O resultado mostra que HPV18N65C-L1 purificada de acordo com a etapa e) atingiu uma pureza de cerca de 98%.A Fig. 3 mostra a fotografia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das VLPs da HPV18N65C-V1 obtidas na etapa f) , tiradas em 100,000x de ampliação, bar representa O.lμm. Foram observadas muitas VLPs em um raio de por volta de 25 nm no campo visual, onde o tamanho das particulas era consistente com o tamanho teórico e as particulas eram homogêneas.A Fig. 4 mostra o resultado da medição de dispersão dinâmica de luz de VLPs de HPV18N65C-L1 obtidas na etapa f) . O resultado mostra que VLP de HPV18N65C-L1 tinha radio hidrodinâmico de 29.38nm e taxa de montagem de particular de 100%.A Fig. 5 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes em soro a diferentes estágios após a inoculação de cabra com VLPs de HPV18N65C-L1. Os momentos de vacinação são indicados com setas. O titulo de anticorpos neutralizantes aumentou rapidamente uma semana após a primeira vacinação e atingiu o nivel máximo de 107 após um reforçador.A Fig. 6 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes em soro a diferentes estágios após a inoculação de coelho com VLPs de HPV18N65C-L1. Os momentos de vacinação são indicados com setas. O titulo de anticorpos neutralizantes aumentou rapidamente após a primeira vacinação e atingiu o nivel máximo de 106 após um reforço.A Fig. 7 mostra os titulos de anticorpo imunoglobulina G (IgG) total contra HPV 18 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 8 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes contra HPV 18 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 9 mostra os titulos de anticorpo imunoglobulina G (IgG) total contra HPV 16 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. 0 titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 10 mostra os titulos de anticorpos neutralizantes contra HPV 16 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5 . A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O titulo de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.A Fig. 11 mostra as mudanças de titulos de anticorpos neutralizantes HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 após a inoculação de rato com vacina quadrivalente de HPV6/11/16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 2 semanas. O titulo de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 105-106 após um reforçador.[0047] Fig. 1 shows the SDS-PAGE result of the HPV18N65C-L1 protein at different stages during steps a)-d) of the method according to the invention. M: Molecular Weight Marker; Route 1: 10-fold diluted lysate suspension; Route 2: HPV18N65C-L1 protein precipitated by tangential flow; Route 3: HPV18N65C-L1 redissolved in resuspension solution. The electrophoretic result shows that the purity of HPV1630C-L1 reached approximately 70% after the precipitation and redissolution steps. Fig. 2 shows the SDS-PAGE result of HPV18N65C-L1 that was obtained in step d) and that was also purified according to step e). M: Molecular Weight Marker; Route 1: HPV18N65C-L1 purified according to step e), 5μL; Route 2: HPV18N65C-L1 purified according to step e), 25μL. The result shows that HPV18N65C-L1 purified according to step e) reached a purity of approximately 98%. Fig. 3 shows the transmission electron microscopy (TEM) photograph of the HPV18N65C-L1 VLPs obtained in step f), taken at 100,000x magnification, bar represents 0.lμm. Many VLPs were observed within a radius of approximately 25 nm in the visual field, where the particle size was consistent with the theoretical size and the particles were homogeneous. Fig. 4 shows the result of the dynamic light scattering measurement of HPV18N65C-L1 VLPs obtained in step f). The result shows that HPV18N65C-L1 VLPs had a hydrodynamic radius of 29.38 nm and a particle assembly rate of 100%. Fig. 5 shows the neutralizing antibody titers in serum at different stages after inoculation of goats with HPV18N65C-L1 VLPs. Vaccination times are indicated with arrows. Neutralizing antibody titers increased rapidly one week after the first vaccination and reached a maximum level of 10⁷ after a booster. Fig. 6 shows serum neutralizing antibody titers at different stages after inoculation of rabbits with HPV18N65C-L1 VLPs. Vaccination times are indicated with arrows. Neutralizing antibody titers increased rapidly after the first vaccination and reached a maximum level of 10⁶ after a booster. Fig. 7 shows serum total immunoglobulin G (IgG) antibody titers against HPV 18 at different times after inoculation of rhesus monkeys with bivalent HPV16/18 vaccine obtained in Example 5. The vaccine was administered at 0 and 4 weeks. Figure 8 shows the serum neutralizing antibody titers against HPV 18 at different times after inoculation of rhesus monkeys with the bivalent HPV16/18 vaccine obtained in Example 5. The vaccine was administered at 0 and 4 weeks. The total IgG antibody titer increased rapidly after the first vaccination, reaching 20,000 times the original value. Figure 9 shows the serum immunoglobulin G (IgG) antibody titers against HPV 16 at different times after inoculation of rhesus monkeys with the bivalent HPV16/18 vaccine obtained in Example 5. The vaccine was administered at 0 and 4 weeks. Figure 10 shows the serum neutralizing antibody titers against HPV 16 at different times after inoculation of rhesus monkeys with the bivalent HPV16/18 vaccine obtained in Example 5. The vaccine was administered at 0 and 4 weeks. The total IgG antibody titer increased rapidly after the first vaccination, reaching 20,000 times the original value. Figure 11 shows the changes in neutralizing antibody titers against HPV6, HPV11, HPV16, and HPV18 after inoculation of mice with the quadrivalent HPV6/11/16/18 vaccine obtained in Example 5. The vaccine was administered at 0 and 2 weeks. The neutralizing antibody titer against HPV6, HPV11, HPV16, and HPV18 increased rapidly after the first vaccination, reaching 10⁵-10⁶ after a booster.

LIST OF SEQUENCES

[0048]SEQ ID NO:1:1 MRPSDNTVYL PPPSVARWN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP AGGGNKQDIP61 KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL GVGLSGHPFY121 NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT ACKSRPLSQG181 DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD YLQMSADPYG241 DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP SPSGSIVTSD301 SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP GQYDATKFKQ361 YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT SLVDTYRFVQ421 SVAIACQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA GLRRKPTIGP 481 RKRSAPSATT ASKPAKRVRV RARKSEQ ID NO:2:1 MRNVNVFPIF LQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP61 YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG121 RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH181 WAKGTACKSR PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI241 CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS301 CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST361 QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP421 PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK481 FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:3:1 MFPIFLQMAL WRPSDNTVYL PPPSVARWN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP61 AGGGNKQDIP KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL121 GVGLSGHPFY NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT181 ACKSRPLSQG DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD241 YLQMSADPYG DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP301 SPSGSIVTSD SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP 361 GQYDATKFKQ YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT421 SLVDTYRFVQ SVAITCQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA 481 GLRRKPTIGP RKRSAPSATT SSKPAKRVRV RARKSEQ ID NO:4:1 MQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN61 KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS121 GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR181 PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS241 ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS301 IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA361 TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT421 YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK 481 PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:5:1 MTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY61 QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD121 TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR PLSQGDCPPL181 ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF241 CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN301 KPYWLHKAQGVHNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV361 EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT421 CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA 481 PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:6:1 ATGCGGCCT AGTGACAAT ACCGTATAT CTTCCACCT CCTTCTGTG GCAAGAGTT55 GTAAATACC GATGATTAC GTGACTCGC ACAAGCATA TTTTATCAT GCTGGCAGC109 TCTAGATTA TTAACTGTT GGTAATCCA TATTTTAGG GTTCCTGCA GGTGGTGGC163 AATAAGCAG GATATTCCT AAGGTTTCT GCATACCAA TATAGAGTA TTTAGGGTG217 CAGTTACCT GACCCAAAT AAATTTGGT TTACCTGAT ACTAGTATT TATAATCCT271 GAAACACAA CGTTTAGTG TGGGCCTGT GCTGGAGTG GAAATTGGC CGTGGTCAG325 CCTTTAGGT GTTGGCCTT AGTGGGCAT CCATTTTAT AATAAATTA GATGACACT379 GAAAGTTCC CATGCCGCC ACGTCTAAT GTTTCTGAG GACGTTAGG GACAATGTG 433 TCTGTAGAT TATAAGCAG ACACAGTTA TGTATTTTG GGCTGTGCC CCTGCTATT487 GGGGAACAC TGGGCTAAA GGCACTGCT TGTAAATCG CGTCCTTTA TCACAGGGC541 GATTGCCCC CCTTTAGAA CTTAAAAAC ACAGTTTTG GAAGATGGT GATATGGTA595 GATACTGGA TATGGTGCC ATGGACTTT AGTACATTG CAAGATACT AAATGTGAG649 GTACCATTG GATATTTGT CAGTCTATT TGTAAATAT CCTGATTAT TTACAAATG703 TCTGCAGAT CCTTATGGG GATTCCATG TTTTTTTGC TTACGGCGT GAGCAGCTT757 TTTGCTAGG CATTTTTGG AATAGAGCA GGTACTATG GGTGACACT GTGCCTCAA811 TCCTTATAT ATTAAAGGC ACAGGTATG CGTGCTTCA CCTGGCAGC TGTGTGTAT865 TCTCCCTCT CCAAGTGGC TCTATTGTT ACCTCTGAC TCCCAGTTG TTTAATAAA919 CCATATTGG TTACATAAG GCACAGGGT CATAACAAT GGTGTTTGC TGGCATAAT973 CAATTATTT GTTACTGTG GTAGATACC ACTCGCAGT ACCAATTTA ACAATATGT1027 GCTTCTACA CAGTCTCCT GTACCTGGG CAATATGAT GCTACCAAA TTTAAGCAG1081 TATAGCAGA CATGTTGAG GAATATGAT TTGCAGTTT ATTTTTCAG TTGTGTACT1135 ATTACTTTA AC TGC AG AT GTTATGTCC TATATTCAT AGTATGAAT AGCAGTATT1189 TTAGAGGAT TGGAACTTT GGTGTTCCC CCCCCGCCA ACTACTAGT TTGGTGGAT1243 ACATATCGT TTTGTACAA TCTGTTGCT ATTGCCTGT CAAAAGGAT GCTGCACCG1297 GCTGAAAAT AAGGATCCC TATGATAAG TTAAAGTTT TGGAATGTG GATTTAAAG1351 GAAAAGTTT TCTTTAGAC TTAGATCAA TATCCCCTT GGACGTAAA TTTTTGGTT1405 CAGGCTGGA TTGCGTCGC AAGCCCACC ATAGGCCCT CGCAAACGT TCTGCTCCA1459 TCTGCCACT ACGGCTTCT AAACCTGCC AAGCGTGTG CGTGTACGT GCCAGGAAG 1513 TAA[0048]SEQ ID NO:1:1 MRPSDNTVYL PPPSVARWN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP AGGGNKQDIP61 KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL GVGLSGHPFY121 NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT ACKSRPLSQG181 DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD YLQMSADPYG241 DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP SPSGSIVTSD301 SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP GQYDATKFKQ361 YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT SLVDTYRFVQ421 SVAIACQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA GLRRKPTIGP 481 RKRSAPSATT ASKPAKRVRV RARKSEQ ID NO:2:1 MRNVNVFPIF LQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP61 YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG121 RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH181 WAKGTACKSR PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI241 CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS301 CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST361 QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP421 PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK481 FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:3:1 MFPIFLQMAL WRPSDNTVYL PPPSVARWN TDDYVTRTSI FYHAGSSRLL TVGNPYFRVP61 AGGGNKQDIP KVSAYQYRVF RVQLPDPNKF GLPDTSIYNP ETQRLVWACA GVEIGRGQPL121 GVGLSGHPFY NKLDDTESSH AATSNVSEDV RDNVSVDYKQ TQLCILGCAP AIGEHWAKGT181 ACKSRPLSQG DCPPLELKNT VLEDGDMVDT GYGAMDFSTL QDTKCEVPLD ICQSICKYPD241 YLQMSADPYG DSMFFCLRRE QLFARHFWNR AGTMGDTVPQ SLYIKGTGMR ASPGSCVYSP301 SPSGSIVTSD SQLFNKPYWL HKAQGHNNGV CWHNQLFVTV VDTTRSTNLT ICASTQSPVP 361 GQYDATKFKQ YSRHVEEYDL QFIFQLCTIT LTADVMSYIH SMNSSILEDW NFGVPPPPTT421 SLVDTYRFVQ SVAITCQKDA APAENKDPYD KLKFWNVDLK EKFSLDLDQY PLGRKFLVQA 481 GLRRKPTIGP RKRSAPSATT SSKPAKRVRV RARKSEQ ID NO:4:1 MQMALWRPSD NTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN61 KQDIPKVSAY QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS121 GHPFYNKLDD TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR181 PLSQGDCPPL ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS241 ADPYGDSMFF CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS301 IVTSDSQLFN KPYWLHKAQG HNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA361 TKFKQYSRHV EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT421 YRFVQSVAIT CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK 481 PTIGPRKRSA PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:5:1 MTVYLPPPSV ARWNTDDYV TRTSIFYHAG SSRLLTVGNP YFRVPAGGGN KQDIPKVSAY61 QYRVFRVQLP DPNKFGLPDT SIYNPETQRL VWACAGVEIG RGQPLGVGLS GHPFYNKLDD121 TESSHAATSN VSEDVRDNVS VDYKQTQLCI LGCAPAIGEH WAKGTACKSR PLSQGDCPPL181 ELKNTVLEDG DMVDTGYGAM DFSTLQDTKC EVPLDICQSI CKYPDYLQMS ADPYGDSMFF241 CLRREQLFAR HFWNRAGTMG DTVPQSLYIK GTGMRASPGS CVYSPSPSGS IVTSDSQLFN301 KPYWLHKAQGVHNNGVCWHNQ LFVTWDTTR STNLTICAST QSPVPGQYDA TKFKQYSRHV361 EEYDLQFIFQ LCTITLTADV MSYIHSMNSS ILEDWNFGVP PPPTTSLVDT YRFVQSVAIT421 CQKDAAPAEN KDPYDKLKFW NVDLKEKFSL DLDQYPLGRK FLVQAGLRRK PTIGPRKRSA 481 PSATTSSKPA KRVRVRARKSEQ ID NO:6:1 ATGCGGCCT AGTGACAAT ACCGTATAT CTTCCACCT CCTTCTGTG GCAAGAGTT55 GTAAATACC GATGATTAC GTGACTCGC ACAAGCATA TTTTATCAT GCTGGCAGC109 TCTAGATTA TTAACTGTT GGTAATCCA TATTTTAGG GTTCCTGCA GGTGGTGGC163 AATAAGCAG GATATTCCT 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CAGTCTCCT GTACCTGGG CAATATGAT GCTACCAAA TTTAAGCAG1081 TATAGCAGA CATGTTGAG GAATATGAT TTGCAGTTT ATTTTTCAG TTGTGTACT1135 ATTACTTTA AC TGC AG AT GTTATGTCC TATATTCAT AGTATGAAT AGCAGTATT1189 TTAGAGGAT TGGAACTTT GGTGTTCCC CCCCGCCA ACTACTAGT TTGGTGGAT1243 ACATATCGT TTTGTACAA TCTGTTGCT ATTGCCTGT CAAAAGGAT GCTGCACCG1297 GCTGAAAAT AAGGATCCC TATGATAAG TTAAAGTTT TGGAATGTG GATTTAAAG1351 GAAAAGTTT TCTTTAGAC TTAGATCAA TATCCCCTT GGACGTAAA TTTTTGGTT1405 CAGGCTGGA TTGCGTCGC AAGCCCACC ATAGGCCCT CGCAAACGT TCTGCTCCA1459 TCTGCCACT ACGGCTTCT AAACCTGCC AAGCGTGTG CGTGTACGT GCCAGGAAG 1513 TAA

[0049] A descrição é ilustrada melhor juntamente com os Exemplos, onde não se limita aos Exemplos.[0049] The description is best illustrated together with the Examples, where it is not limited to the Examples.

Example: Expression of Truncated HPV18 LI Protein (SEQ ID NO. 1) Preparation of HPV18 LI Gene Fragments as a PCR Template

[0050] O DNA extraido da secreção vaginal de pacientes com câncer cervical da Cidade de Xiamen na provinda Fujian foi usado como modelo. O iniciador forward era 18H5430F: 5'-CCT CTT GGG ATG TGC CTG TAT AC-3' (SEQ ID NO: 10) e o iniciador reverse era 18H7190R: 5'-TACAAACAC AAC AAT AGATGT ATATA-3' (SEQ ID NO: 11) . A reação em cadeia da polimerase (PCR, em inglês) foi realizada em um termociclador Biometria T3 PCR com o uso dos seguintes parâmetros: [0050] DNA extracted from vaginal secretions of cervical cancer patients from Xiamen City in Fujian Province was used as a template. The forward primer was 18H5430F: 5'-CCT CTT GGG ATG TGC CTG TAT AC-3' (SEQ ID NO: 10) and the reverse primer was 18H7190R: 5'-TACAAACAC AAC AAT AGATGT ATATA-3' (SEQ ID NO: 11). Polymerase chain reaction (PCR) was performed on a Biometric T3 PCR thermocycler using the following parameters:

[0051] O produto de amplificação especifica, por volta de 1.6kb de extensão, foi usado como modelo para produzir fragmentos de DNA da proteina HPV18 L1 truncada nesta invenção.[0051] The specific amplification product, approximately 1.6kb in length, was used as a template to produce DNA fragments of the truncated HPV18 L1 protein in this invention.

Construction of a Non-Fusion Expression Vector for a Truncated HPV18 LI Gene

[0052] Os fragmentos de DNA (l.ôkb) produzidos no passo anterior foram usados como modelo para a próxima reação em PCR. 0 iniciador forward era 18N65F: 5'-CAT ATg CGG CCT AGT GAC AAT AC-3', no 5' terminal no qual o sitio de restrição da endonuclease Ndel foi introduzido. A sequência do sitio NedI era CAT ATG, onde ATG era o códon de iniciação no sistema de E. coli. 0 iniciador reverse era 18CR: 5' -CTC gAg TTA CTT CCT GGC ACG TAC ACG CAC A-3' , no 5' terminal no qual o sitio de restrição da endonuclease Xhol foi introduzido. A amplificação foi realizada em um termociclador Biometria T3 PCR com o uso dos seguintes parâmetros: [0052] The DNA fragments (l.ôkb) produced in the previous step were used as a template for the next PCR reaction. The forward primer was 18N65F: 5'-CAT ATg CGG CCT AGT GAC AAT AC-3', at the 5' terminus where the Ndel endonuclease restriction site was introduced. The Ndel site sequence was CAT ATG, where ATG was the initiation codon in the E. coli system. The reverse primer was 18CR: 5'-CTC gAg TTA CTT CCT GGC ACG TAC ACG CAC A-3', at the 5' terminus where the Xhol endonuclease restriction site was introduced. Amplification was performed on a Biometry T3 PCR thermocycler using the following parameters:

[0053] Os fragmentos de DNA, por volta de 1.5kb de extensão, foram obtidos após a amplificação. Os produtos de PCR foram ligados ao vetor pMD 18-T (Takara Biosciences). Após a digestão com Ndel/Xhol, identificou-se que as colônias positivas, onde o gene HPV18 L1 truncado foi inserido, foram obtidas, designadas como PMD 18-T-HPV18N65C-L1.[0053] DNA fragments, approximately 1.5kb in length, were obtained after amplification. The PCR products were ligated to the pMD 18-T vector (Takara Biosciences). After digestion with Ndel/Xhol, it was identified that the positive colonies, where the truncated HPV18 L1 gene was inserted, were obtained, designated as PMD 18-T-HPV18N65C-L1.

[0054] A sequência de nucleotídeos de interesse, que foi inserida no plasmideo pMD 18-T-HPV18N65C-L1, foi determinada como SEQ ID NO: 6 por Shanghai Boya Bio Co. através da utilização de iniciadores +/- M13. SEQ ID NO: 6 codifica a seqüência de aminoácidos disposta SEQ ID NO: 1, que corresponde a uma proteina HPV 18 L1 com 65 aminoácidos truncados em seu N-terminal e nenhum aminoácido truncado em seu C-terminal e foi designada como HPV18N65C-L1.[0054] The nucleotide sequence of interest, which was inserted into the pMD plasmid 18-T-HPV18N65C-L1, was determined as SEQ ID NO: 6 by Shanghai Boya Bio Co. using +/- M13 primers. SEQ ID NO: 6 encodes the amino acid sequence arranged as SEQ ID NO: 1, which corresponds to an HPV 18 L1 protein with 65 amino acids truncated at its N-terminus and no amino acids truncated at its C-terminus and was designated as HPV18N65C-L1.

[0055] Os fragmentos de gene HPV18N65C-L1 truncado foram obtidos por digestão Ndel/Xhol de plasmideo pMD 18-T-HPV18N65C-L1. Os fragmentos foram ligados ao vetor de expressão procariótica pTrxFus digerido com Ndel/Xhol (Invitrogen). Como a proteina de fusão foi clivada, a proteina de interesse foi expressa imediatamente após a iniciação da expressão do aminoácido Met, sem outras proteínas de fusão inclusas. As colônias foram selecionadas com digestão Ndel/Xhol. Colônias positivas contendo a inserção foram rotuladas com pTRX-HPV18N65C-Ll. lμL de plasmideo pTRX-HPV18N65C-Ll (0.15mg/ml) foi usado para transformar 40μL de E. coli GI698 competente (Invitrogen) preparado pelo método de cloreto de cálcio e, em seguida, revestido em meios CAA (dissolvendo 6g de Na2HPθ4, 3g de KH2PO4, 0.5g de NaCl, lgdeNHiCl, 20g de hidrolisado de caseina, 0.095 de MgC12, 1.5g de pó de ágar, 20 ml de 50% glicerina e 900 ml de água deionizada foram adicionados) contendo cloreto de benzila (a uma concentração final de 100 mg/ml, a mesma que a de baixo). As placas foram incubadas a 30°C por cerca de 10-12h até que se pudessem ser observadas claramente colônias únicas. As colônias únicas das placas foram transferidas para um tubo contendo 4ml de meio IMC liquido contendo cloreto de benzila. As culturas foram incubadas em uma incubadora com agitação a 220rpm por 10h a 25°C e, em seguida, 1 ml de solução bacteriana foi liofilizada e armazenada a -70°C.[0055] Fragments of truncated HPV18N65C-L1 genes were obtained by Ndel/Xhol digestion of the pMD 18-T-HPV18N65C-L1 plasmid. The fragments were ligated to the Ndel/Xhol-digested pTrxFus prokaryotic expression vector (Invitrogen). Because the fusion protein was cleaved, the protein of interest was expressed immediately after the initiation of Met amino acid expression, without other fusion proteins included. Colonies were selected by Ndel/Xhol digestion. Positive colonies containing the insertion were labeled pTRX-HPV18N65C-L1. 1 μL of pTRX-HPV18N65C-Ll plasmid (0.15 mg/ml) was used to transform 40 μL of competent E. coli GI698 (Invitrogen) prepared by the calcium chloride method and then coated on CAA media (dissolving 6 g of Na2HPθ4, 3 g of KH2PO4, 0.5 g of NaCl, 1 g of NHiCl, 20 g of casein hydrolysate, 0.095 g of MgC12, 1.5 g of agar powder, 20 ml of 50% glycerin and 900 ml of deionized water were added) containing benzyl chloride (to a final concentration of 100 mg/ml, the same as below). The plates were incubated at 30°C for about 10-12 h until single colonies could be clearly observed. Single colonies from the plates were transferred to a tube containing 4 ml of liquid IMC medium containing benzyl chloride. The cultures were incubated in a shaker incubator at 220 rpm for 10 hours at 25°C, and then 1 ml of bacterial solution was lyophilized and stored at -70°C.

Large-scale expression of HPV18N65C-L1

[0056] E. coli transformada com pTRX-HPV18N65C-Ll foi tirada da estirpe liofilizada a -70 °C e diluida com um pouco de água estéril e, em seguida, incubada em 50mL de meio IMC contendo amina benzila a 200 rpm e 30°C por 8h. Em seguida, as culturas foram transferidas para dez frascos (5 ml de culturas por frasco) , cada um contendo 500mL de meio LB, e foram incubadas em uma incubadora com agitação durante a noite a 200rpm e 30°C. As culturas eram as culturas iniciais.[0056] E. coli transformed with pTRX-HPV18N65C-Ll was taken from the lyophilized strain at -70 °C and diluted with a little sterile water and then incubated in 50 mL of IMC medium containing benzyl amine at 200 rpm and 30 °C for 8 h. The cultures were then transferred to ten flasks (5 mL of cultures per flask), each containing 500 mL of LB medium, and incubated in a shaker incubator overnight at 200 rpm and 30 °C. The cultures were the starter cultures.

[0057] Um fermentador de 50L feito pela Shanghai Baoxing Biological Ltd foi usado na incubação em grande escala. 0 eletrodo de pH foi calibrado. 30L de meio LB foram preparados e transferidos ao fermentador, esterilizados a 121°C por 30 minutos. O eletrodo de oxigênio dissolvido foi calibrado, onde o valor foi determinado como 0 antes da introdução de ar após a esterilização e como 100% antes da inoculação após a introdução de ar, agitando a lOOrpm no inicio.[0057] A 50L fermenter made by Shanghai Baoxing Biological Ltd was used for large-scale incubation. The pH electrode was calibrated. 30L of LB medium were prepared and transferred to the fermenter, sterilized at 121°C for 30 minutes. The dissolved oxygen electrode was calibrated, where the value was determined to be 0 before air introduction after sterilization and 100% before inoculation after air introduction, stirring at 100rpm initially.

[0058] Preparação da alimentação: 30g de hidrolisados de caseina foram dissolvidas em 100mL de água deionizada para preparar uma solução (30%) e 50g de glicose foram dissolvidas em lOOml de água deionizada para preparar uma solução de glicose (50%) . As duas misturas foram esterilizadas a 121°C por 20min.[0058] Feed preparation: 30g of casein hydrolysates were dissolved in 100mL of deionized water to prepare a solution (30%) and 50g of glucose were dissolved in 100ml of deionized water to prepare a glucose solution (50%). Both mixtures were sterilized at 121°C for 20min.

[0059] No segundo dia, as culturas iniciais nos dez frascos (para um total de 5L) foram transferidas para o fermentador. A 30°C e pH 7.0, o O2 dissolvido foi mantido a > 40% através de regulação da taxa de agitação ou de fornecimento de ar manualmente.[0059] On the second day, the initial cultures in the ten flasks (for a total of 5L) were transferred to the fermenter. At 30°C and pH 7.0, the dissolved O2 was maintained at > 40% by regulating the agitation rate or by manually supplying air.

[0060] Fluxo de alimentação: 50% de glicose e 30% de hidrolisados de caseina foram misturados a uma proporção de massa de 2:1.[0060] Feed flow: 50% glucose and 30% casein hydrolysates were mixed at a mass ratio of 2:1.

[0061] As taxas de fluxo foram as seguintes:lh: 5%2h: 10%3h: 20%4h: 40%5h até o fim: 60%[0061] The flow rates were as follows: 1h: 5% 2h: 10% 3h: 20% 4h: 40% 5h until the end: 60%

[0062] Quando ODeoo atingiu cerca de 10.0, a temperatura da cultura foi reduzida a 2°C e 4g de triptofânio foram adicionadas para iniciar uma indução da cultura de 4h. A fermentação foi interrompida quando ODÊOO atingiu cerca de 40. A cultura foi, então, centrifugada para obter estirpes (cerca de 3 kg).Meio IMC (1 litro): [0062] When ODeoo reached approximately 10.0, the culture temperature was reduced to 2°C and 4g of tryptophan were added to initiate a 4h culture induction. Fermentation was stopped when ODeoo reached approximately 40. The culture was then centrifuged to obtain strains (approximately 3 kg). IMC medium (1 liter):

Example 2: Preparation of HPV18N65C-L1 with a purity of approximately 70%

[0063] Estirpes de lg foram re-suspensos em lOml de tampão de lise (20mM de tampão tris com pH 7.2, 300mM de NaCl) . Estirpes foram interrompidas pela passagem através de um homogeneizador APV (Invensys Group) por cinco vezes a uma pressão de 600bar. O homogenato foi centrifugado a 30.000 g (13.500 rpm em rotor JA-14) por 15min. A suspensão foi submetida a SDS-PAGE em 10% de gel. Nesta fase, a HPV18N65C-L1 tinha uma pureza de cerca de 10%. A suspensão foi dialisada por um Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.) funcionando a uma pressão de 0.5psi, a uma taxa de fluxo de 500ml/min e a uma taxa de fluxo tangencial de 200ml/min, onde a retenção do peso molecular foi de 30kDa, o dialisato foi de lOmM de tampão de fosfato a pH 6.0, e o volume de diálise foi três vezes maior do que o volume da suspensão. Após a diálise completa, a mistura foi centrifugada a 12.000g (9500 rpm em rotor JA-10 (centrifuga de alta velocidade Beckman J25) ) por 20min e a precipitação foi coletada. A precipitação foi re-suspensa em lOmM de tampão de fosfato a pH 7.0 contendo lOmM de DTT e 300mM de NaCl, onde o volume do tampão foi 1/10 vezes maior do que o volume da suspensão. A mistura foi agitada por 30 min e centrifugada a 30.000g (13.500 rpm em rotor JA-14 (centrifuga de alta velocidade Beckman J25)) por 20 min. A suspensão passa através de uma membrana filtrante de 0.22μm. A amostra foi ainda submetida à cromatografia de troca catiônica. 30μL de 6x de tampão de carregamento foram adicionados a 150μL da suspensão filtrada e a solução resultante foi misturada. Depois de aquecer em banho-maria a 80°C, por lOmin, uma amostra foi submetida a SDS-PAGE em gel a 10% a 120V por 120 min. As bandas eletroforéticas foram tingidas por azul brilhante Coomassie. O resultado foi mostrado na Fig. 1. Segundo a análise de SDS-PAGE, a proteina HPV18N65C-L1 foi purificada e enriquecida após as etapas de precipitação e re-dissolução, com a pureza aumentada de cerca de 10% para cerca de 70%.[0063] Strains of lg were resuspended in 10 ml of lysis buffer (20 mM Tris buffer with pH 7.2, 300 mM NaCl). Strains were interrupted by passing them through an APV homogenizer (Invensys Group) five times at a pressure of 600 bar. The homogenate was centrifuged at 30,000 g (13,500 rpm on a JA-14 rotor) for 15 min. The suspension was subjected to SDS-PAGE on a 10% gel. At this stage, HPV18N65C-L1 had a purity of approximately 10%. The suspension was dialyzed using a Centrasette 5 Tangential Flow Filter (Pall Co.) operating at a pressure of 0.5 psi, a flow rate of 500 ml/min, and a tangential flow rate of 200 ml/min, where the molecular weight retention was 30 kDa, the dialysate was 10 mM phosphate buffer at pH 6.0, and the dialysis volume was three times greater than the suspension volume. After complete dialysis, the mixture was centrifuged at 12,000 g (9500 rpm in a JA-10 rotor (Beckman J25 high-speed centrifuge)) for 20 min, and the precipitation was collected. The precipitation was resuspended in 10 mM phosphate buffer at pH 7.0 containing 10 mM DTT and 300 mM NaCl, where the buffer volume was 1/10 times greater than the suspension volume. The mixture was stirred for 30 min and centrifuged at 30,000 g (13,500 rpm in a JA-14 rotor (Beckman J25 high-speed centrifuge)) for 20 min. The suspension passed through a 0.22 μm filter membrane. The sample was then subjected to cation-exchange chromatography. 30 μL of 6x loading buffer were added to 150 μL of the filtered suspension, and the resulting solution was mixed. After heating in a water bath at 80°C for 10 min, a sample was subjected to 10% gel SDS-PAGE at 120 V for 120 min. The electrophoretic bands were stained with Coomassie brilliant blue. The result was shown in Fig. 1. According to SDS-PAGE analysis, the HPV18N65C-L1 protein was purified and enriched after the precipitation and re-dissolution steps, with the purity increased from about 10% to about 70%.

Example 3: Purification by Chromatography of HPV18N65C-L1

[0064]Equipamento: Sistema de cromatografia liquida preparativa AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ou seja, a Amershan Pharmacia Co. original)Meios de cromatográfica: SP Sepharose 4 Fluxo RápidoVolume de Coluna: 5.5cmx20cmTampão: 20mM tampão de fosfato a pH 7.0, lOmM de DTT 2OiriM tampão de fosfato a pH 7.0, lOmM de DTT, 2M de NaClTaxa de Fluxo: 25mL/minDetector de Comprimento de Onda: 280nmAmostra: 3L de 70% de solução de HPV18N65C-L1 puraProtocolo de eluição: eluir proteinas indesejadas com 300mM de NaCl, eluir a proteina de interesse com 500mM de NaCl, coletar 500mM de elutato de NaCl e, finalmente, recolher cerca de 1000mL de amostra de HPV18N65C-L1 purificada.[0064]Equipment: AKTA Explorer 100 preparative liquid chromatography system (GE Healthcare, i.e., the original Amershan Pharmacia Co.)Chromatographic media: SP Sepharose 4 Fast FlowColumn Volume: 5.5cm x 20cmBuffer: 20mM phosphate buffer at pH 7.0, 10mM DTT, 20mM phosphate buffer at pH 7.0, 10mM DTT, 2M NaClFlow Rate: 25mL/minDetector Wavelength: 280nmSample: 3L of 70% pure HPV18N65C-L1 solutionElution protocol: elute unwanted proteins with 300mM NaCl, elute the protein of interest with 500mM NaCl, collect 500mM elute Finally, collect approximately 1000 mL of purified HPV18N65C-L1 sample using NaCl.

Purification of HPV18N65C-L1 by CHT-II Chromatography

[0065]Equipamento: Sistema de cromatografia liquida preparativa AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ouseja a Amershan Pharmacia Co. original)Meios de cromatografia: CHT-II (Bio-Rad)Volume de Coluna: 5.5cmx20cmTampão: lOmM tampão de fosfato a pH 7.0, lOmM de DTT, 0.5M de NaClTaxa de Fluxo: 20mL/minDetector de Comprimento de Onda: 280nmAmostra: 500mM de eluato de NaCl do SP Sepharose 4 Fluxo RápidoProtocolo de eluição: coleta direta do passante que contém a proteina de interesse.[0065]Equipment: AKTA Explorer 100 preparative liquid chromatography system (GE Healthcare, i.e., the original Amershan Pharmacia Co.)Chromatography media: CHT-II (Bio-Rad)Column volume: 5.5cm x 20cmBuffer: 10mM phosphate buffer at pH 7.0, 10mM DTT, 0.5M NaClFlow rate: 20mL/minWavelength detector: 280nmSample: 500mM NaCl eluate from SP Sepharose 4 Fast FlowElution protocol: direct collection of the pass-through containing the protein of interest.

[0066] O passante, que contém HPV18N65C-L1, foi coletado e cerca de 1100mL de HPV18N65C-L1 purificadas foram obtidos. 30μL de 6x do tampão de carregamento foram adicionados a 150μL da amostra de HPV18N65C-L1 purificada de acordo com o método do Exemplo e, em seguida, a solução resultante foi misturada completamente. Depois de aquecer a solução em banho-maria a 80°C por lOmin, uma amostra de 10uL foi submetida a SDS-PAGE em gel a 10% a 120V por 120min. As bandas eletroforéticas foram coradas por azul brilhante Coomassie. O resultado foi mostrado na Fig. 2. A concentração da proteina de interesse foi de cerca de 0,8 mg/ml e a pureza foi maior do que 98% de acordo com SDS-PAGE.[0066] The passant, containing HPV18N65C-L1, was collected and approximately 1100 mL of purified HPV18N65C-L1 was obtained. 30 μL of 6x loading buffer was added to 150 μL of the purified HPV18N65C-L1 sample according to the Example method, and then the resulting solution was thoroughly mixed. After heating the solution in a water bath at 80°C for 10 min, a 10 μL sample was subjected to 10% gel SDS-PAGE at 120 V for 120 min. The electrophoretic bands were stained with Coomassie brilliant blue. The result is shown in Fig. 2. The concentration of the protein of interest was approximately 0.8 mg/mL and the purity was greater than 98% according to SDS-PAGE.

Example 4: Assembly of HPV18N65C-L1 VLPs

[0067]Equipamento: Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.), MW 30kDa de retenção.Amostra: IlOOmL de HPV18N65C-L1 obtida no Exemplo 3Concentração da Amostra: A amostra foi concentrada a 800mL com a taxa de fluxo tangencial do sistema ajustada a 50mL/minRenaturação de Amostra: Renaturação de Amostra: O tampão da amostra foi trocado com 10L de tampão de renaturação (20mM de PB a pH 6.0, 2mM de CaCls, 2mM de MgCl∑, 0,5M de NaCl) completamente. Ao executar o Filtro de Fluxo Tangencial, a pressão era de 0,5psi e a taxa de fluxo tangencial era de lOml/min. Quando troca foi concluída, o tampão da amostra foi substituído por tampão de armazenamento (20L de PBS: 20mM de PB a pH 6.5, 0,5M de NaCl) • 0 volume de troca foi de 20L. A pressão em execução foi de 0.5psi e a taxa de fluxo tangencial foi de 25mL/min. Quando o liquido de troca foi finalizado, a amostra foi assepticamente filtrada com um filtro Pali (0,20 μm) . A amostra filtrada foi incubada em uma incubadora a 37 °C durante a noite. As VLPs de HPV18N65C-L1 incubadas foram armazenadas a 4 °C para uso adicional.[0067]Equipment: Centrasette 5 Tangential Flow Filter (Pall Co.), MW 30kDa retention.Sample: 110mL of HPV18N65C-L1 obtained in Example 3Sample Concentration: The sample was concentrated to 800mL with the tangential flow rate of the system set to 50mL/minSample Renaturation: The sample buffer was completely replaced with 10L of renaturation buffer (20mM PB at pH 6.0, 2mM CaCls, 2mM MgCl∑, 0.5M NaCl). When running the Tangential Flow Filter, the pressure was 0.5psi and the tangential flow rate was 10ml/min. When the exchange was complete, the sample buffer was replaced with storage buffer (20 L PBS: 20 mM PB at pH 6.5, 0.5 M NaCl). The exchange volume was 20 L. The running pressure was 0.5 psi and the tangential flow rate was 25 mL/min. When the exchange fluid was finished, the sample was aseptically filtered with a Pali filter (0.20 μm). The filtered sample was incubated in an incubator at 37 °C overnight. The incubated HPV18N65C-L1 VLPs were stored at 4 °C for further use.

Example 5: Determination of the Morphology and Immunogenicity of HPV18N65C-L1 VLPs Transmission Electron Microscopy (TEM) of HPV18N65C-L1 VLPs

[0068] 0 equipamento foi um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL lOOkV (lOO.OOOx de ampliação). As VLPs de HPV18N65C-L1 foram negativamente coradas com 2% de ácido fosfotúngstico a pH 7.0 e fixadas em uma grade de cobre. Os resultados foram mostrados na Fig. 3. Pôde-se ver que as VLPs obtidas no Exemplo 4 tinham um raio de cerca de 25nm e eram homogêneas e de forma oca.[0068] The equipment used was a JEOL 100kV Transmission Electron Microscope (100,000x magnification). HPV18N65C-L1 VLPs were negatively stained with 2% phosphotungstic acid at pH 7.0 and fixed on a copper grid. The results are shown in Fig. 3. It can be seen that the VLPs obtained in Example 4 had a radius of about 25 nm and were homogeneous and hollow in shape.

Dynamic light scattering measurement of HPV18N65C-L1 VLPs

[0069] Um instrumento de dispersão dinâmica de luz DynaPro MS/X (incluindo um controlador de temperatura) (US Protein Solutions Co.) foi utilizado para medições de dispersão de luz. 0 algoritmo de regulação foi usado nas medições. A amostra foi aquela obtida no Exemplo 4. A amostra foi passada através de uma membrana filtrante de 0.22μm antes da medição. Os resultados foram mostrados na Fig. 4. O resultado mostra que as VLPs de HPV18N65C-L1 tinham um raio Hidrodinâmico de 29.38nm.[0069] A DynaPro MS/X dynamic light scattering instrument (including a temperature controller) (US Protein Solutions Co.) was used for light scattering measurements. A regulation algorithm was used in the measurements. The sample was that obtained in Example 4. The sample was passed through a 0.22μm filter membrane before measurement. The results are shown in Fig. 4. The result shows that the HPV18N65C-L1 VLPs had a hydrodynamic radius of 29.38nm.

Establishing a Pseudo-virion Neutralization Analysis Model for HPV18

[0070] 0 HPV dificilmente pode ser cultivado in vitro e o hospedeiro do HPV tinha forte especificidade. Assim, dificilmente o HPV pode ser propagado em outros hospedeiros que não sejam humanos. Ou seja, não existia um modelo animal adequado ao HPV. Portanto, a fim de avaliar a produtividade imunológica da vacina contra HPV rapidamente, houve a necessidade de estabelecer um modelo eficiente para neutralização em ensaios in vitro.[0070] HPV can hardly be cultured in vitro and the HPV host had strong specificity. Thus, HPV can hardly be propagated in hosts other than humans. That is, there was no suitable animal model for HPV. Therefore, in order to quickly assess the immunological productivity of the HPV vaccine, there was a need to establish an efficient model for neutralization in in vitro assays.

[0071] Modelo de Infecção In Vitro de Pseudo-virion: De acordo com a característica de que a VLP de HPV pode acondicionar ácidos nucléicos não especificamente, o pseudo-virion de HPV foi formado pela expressão da proteina Ll e L2 do HPV em células e pelo acondicionamento de DNA virai do episome ou introdução de plasmideos repórteres de forma heterogênea. Os métodos incluem sistemas de expressão baseados em virus recombinantes e cotransfecção de multi-plasmideos (ver Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M. et al (2000) Virology (278) 570-7) .[0071] In Vitro Pseudo-virion Infection Model: Based on the characteristic that HPV VLPs can package nucleic acids non-specifically, HPV pseudo-virions were formed by expressing HPV L1 and L2 proteins in cells and by packaging viral episome DNA or introducing reporter plasmids heterogeneously. Methods include recombinant virus-based expression systems and multi-plasmid cotransfection (see Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M. et al (2000) Virology (278) 570-7).

[0072] A invenção utiliza cotransfecção de um sistema de multi-plasmideos. Algumas melhorias foram feitas da seguinte maneira. Um método otimizado de transfecção de fosfato de cálcio foi estabelecido para a linhagem celular 293FT, com uma eficiência de transfecção de acima de 90%, o que facilita a produção em grande escala. 0 plasmideo de expressão por códon otimizado resultante de proteina do HPV pode expressar o gene HPV Ll e L2 eficientemente em linhas de células de mamiferos, facilitando a montagem eficiente de pseudoviron.[0072] The invention utilizes cotransfection of a multi-plasmid system. Some improvements have been made as follows. An optimized calcium phosphate transfection method has been established for the 293FT cell line, with a transfection efficiency of over 90%, which facilitates large-scale production. The resulting optimized HPV protein expression plasmid can efficiently express the HPV L1 and L2 genes in mammalian cell lines, facilitating efficient pseudoviron assembly.

1. HPV Pseudoviron Construction:

[0073] P18Llh, pl8L2h e pN31-EGFP (doado pelo Professor T. Schiller da NIH) contêm genes para HPV18L1, HPV18L2 e GFP, respectivamente. Estes plasmideos foram purificados utilizando CsCl centrifugação em gradiente de densidade, conforme descrito em The Molecular Cloning Experiment Guide, (3a edição). 0 procedimento depurificação foi o seguinte:• Plasmideos foram usados para transformar E. coli DH5a;• Colônias únicas foram transferidos para meio de cultura LB de 500mL e incubadas em um frasco de agitação a 37°C por 16h;• 0 meio de cultura foi centrifugado a 9.000g durante 5min e as manchas foram coletadas;• As seguintes substâncias foram adicionadas sucessivamente às bactérias em cada 1000mL de LB: 40mL de solução I (50mM de glicose, 25mM de Tris-Cl a pH 8.0, lOmM de EDTA a pH 8.0) e 2ml de lμg/μL de RNase A), 40mL de solução II (0.2MdeNaOH, 1% de SDS) , e 48mL de solução III (60.0 de 5M de acetato de potássio , 11.5mL de ácido acético e 28.5mL de água deionizada);• Após colocar em gelo por lOmin, a mistura foi centrifugada a 15.000g por 20min a 4°C;• A suspensão foi misturada com 0,6 de volume de álcool isopropilico, em seguida, foi novamente centrifugada a 15.000g por 30min;• A suspensão foi decantada em residuos e a precipitação foi lavada com 70% de etanol;• A precipitação foi dissolvida em TE e o teor de DNA foi determinado;• CsCl foi dissolvido na solução de DNA (lg de DNA por 1.01g de CsCl) e, em seguida, lOOμL de lOmg/mL de solução EB também foi dissolvido em DNA;• A mistura foi centrifugada, usando uma centrifuga Beckman NVT65, a 62.000g por 10hr a 20°C;• A seção do DNA de circulo fechado foi obtida com o uso de um injetor cabeça de alfinete;• EB foi extraido com volume equivalente de álcool isoamilico repetidamente por quatro vezes;• Três volumes de água deionizada e oito volumes de etanol seco foram adicionados a um volume de solução de DNA e, em seguida, a mistura foi centrifugada a 20000G por 30min a 4°C;• A precipitação foi coletada e lavada com 75% de etanol e, em seguida, dissolvida em lmL de TE;• A concentração da solução de DNA foi determinada, em seguida, a solução foi armazenada em pequenas embalagens a -20°C.[0073] P18Llh, pl8L2h, and pN31-EGFP (donated by Professor T. Schiller of the NIH) contain genes for HPV18L1, HPV18L2, and GFP, respectively. These plasmids were purified using CsCl density gradient centrifugation, as described in The Molecular Cloning Experiment Guide (3rd edition). The purification procedure was as follows: • Plasmids were used to transform E. coli DH5a; • Single colonies were transferred to 500 mL LB culture medium and incubated in a shaker flask at 37°C for 16 h; • The culture medium was centrifuged at 9,000 g for 5 min and the spots were collected; • The following substances were successively added to the bacteria in each 1000 mL of LB: 40 mL of solution I (50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl at pH 8.0, 10 mM EDTA at pH 8.0) and 2 mL of 1 μg/μL RNase A), 40 mL of solution II (0.2 M NaOH, 1% SDS), and 48 mL of solution III (60 mL of 5 M potassium acetate, 11.5 mL of acetic acid and 28.5 mL of deionized water); • After placing on ice for 10 min, the mixture was centrifuged at 15,000 g for 20 min at 4°C; • The suspension was mixed with 0.6 volume of isopropyl alcohol, then centrifuged again at 15,000 g for 30 min; • The suspension was decanted into residue and the precipitate was washed with 70% ethanol; • The precipitate was dissolved in TE and the DNA content was determined; • CsCl was dissolved in the DNA solution (1 g of DNA per 1.01 g of CsCl) and then 100 μL of 10 mg/mL of EB solution was also dissolved in DNA; • The mixture was centrifuged, using a Beckman NVT65 centrifuge, at 62,000 g for 10 hr at 20°C; • The closed-loop DNA section was obtained using a pinhead injector; • EB was extracted with an equivalent volume of isoamyl alcohol repeatedly four times; • Three volumes of deionized water and eight volumes of dry ethanol were added to one volume of DNA solution, and then the mixture was centrifuged at 20000G for 30 min at 4°C; • The precipitation was collected and washed with 75% ethanol and then dissolved in 1 mL of TE; • The concentration of the DNA solution was determined, then the solution was stored in small containers at -20°C.

[0074] plδLlh, pl8L2h e células 293FT co-transfectadas pN31-EGFP 293FT (Invitrogen) purificadas cultivadas em uma placa de cultura de células de lOcm pelo método de fosfato de cálcio. 0 método de fosfato de cálcio foi descrito da seguinte forma. 40μg de plδLlh, 40μgdepl8L2h e 40μg de pN31-EGFP foram adicionados separadamente à mistura de lmL de solução HEPEs (125μL de 1M de HEPES/50mL de água deionizada, a pH 7.3 e 4°C;) e lmL de solução de 0,5 M de CaC12. Depois de misturar, 2mL de 2X da solução HeBS (0.28M de NaCl (16.36g), 0,05M de HEPES (11,9 g), 1.5mm de Na2HPC>4 (0.213g) , dissolvidos em 1000mL de água deionizada, a pH 6.96 e -70°C;), foram adicionados gota a gota. Após ficar em temperatura ambiente por 1 min, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 10cm, onde as células 293FT foram cultivadas. O meio de cultura original foi substituído por 10 ml de meio completo (Invitrogen Co.) 6 horas mais tarde. 48 horas após a transfecção, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram coletadas e contadas. Cada 108 de células foram suspensos em lmL de solução citolitica (0,25% de Brij58, 9.5mm de MgC12) . Após a lise, o lisado celular foi centrifugado a 5.000g por lOmin e a suspensão foi coletada A solução pseudo-virion foi obtida após a adição de 5M de NaCl à suspensão a uma concentração final de 850mM, em seguida, foi armazenada em pequenas embalagens a -20°C.[0074] Purified plδLlh, pl8L2h and 293FT co-transfected pN31-EGFP 293FT cells (Invitrogen) were cultured in a 10cm cell culture plate by the calcium phosphate method. The calcium phosphate method was described as follows: 40μg of plδLlh, 40μg of pl8L2h and 40μg of pN31-EGFP were added separately to a mixture of 1mL of HEPES solution (125μL of 1M HEPES/50mL of deionized water, at pH 7.3 and 4°C) and 1mL of 0.5M CaC12 solution. After mixing, 2 mL of 2X HeBS solution (0.28 M NaCl (16.36 g), 0.05 M HEPES (11.9 g), 1.5 mM Na2HPC>4 (0.213 g), dissolved in 1000 mL of deionized water, at pH 6.96 and -70°C) were added dropwise. After standing at room temperature for 1 min, the mixture was added to a 10 cm cell culture plate where 293FT cells were cultured. The original culture medium was replaced with 10 mL of complete medium (Invitrogen Co.) 6 hours later. 48 hours after transfection, the medium was decanted and the cells were washed twice with PBS. Then, the cells were collected and counted. Each group of 10⁸ cells was suspended in 1 mL of cytolytic solution (0.25% Brij58, 9.5 mM MgC12). After lysis, the cell lysate was centrifuged at 5,000 g for 10 min and the suspension was collected. The pseudo-virion solution was obtained after adding 5 M NaCl to the suspension to a final concentration of 850 mM, then stored in small containers at -20°C.

[0075] As células 293FT (Invitrogen) foram espalhadas em uma placa de cultura de células de 96 compartimentos (1.5X104 células/compartimento). A análise de neutralização foi realizada cinco horas mais tarde. As amostras de soro foram diluidas em série com 10% de DMEM metade a metade. Amostras diluidas de 50μL foram separadamente misturadas com 50μL de soluções de pseudo-virus diluídas com 10% de DMEM (moi = 0.1) . Após incubação a 4°C por lh, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 96 compartimentos espalhadas com células 293FT. A mistura foi então incubada por 72h a 37°C Títulos de neutralização das amostras foram avaliados pela observação de fluorescência. O percentual de infecção de células em cada compartimento foi verificado por citometria de fluxo (EPICS XL, American Beckman Coulter Co.) . Os títulos exatos de anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais foram calculados. O percentual de infecção foi a porcentagem de células na região positiva menos a células não infectadas na região positiva.[0075] 293FT cells (Invitrogen) were spread in a 96-compartment cell culture plate (1.5 x 10⁴ cells/compartment). Neutralization analysis was performed five hours later. Serum samples were serially diluted with 10% DMEM on a 50/50 basis. Diluted 50 μL samples were separately mixed with 50 μL of pseudovirus solutions diluted with 10% DMEM (mI = 0.1). After incubation at 4°C for 1 1h, the mixture was added to the 96-compartment cell culture plate spread with 293FT cells. The mixture was then incubated for 72 h at 37°C. Neutralization titers of the samples were assessed by fluorescence observation. The percentage of infected cells in each compartment was verified by flow cytometry (EPICS XL, American Beckman Coulter Co.). The exact titers of monoclonal or polyclonal antibodies were calculated. The infection percentage was the percentage of cells in the positive region minus the uninfected cells in the positive region.

[0076] A porcentagem de controle de infecção =(1 - porcentagem de infecção da célula de amostra/percentual de infecção de células negativas) X 100%[0076] Infection control percentage = (1 - sample cell infection percentage / negative cell infection percentage) X 100%

[0077] O título de neutralização foi definido como o múltiplo de diluição mais elevado através do qual a porcentagem de controle de infecção era um pouco acima de 50%. Anticorpos monoclonais e policlonais foram considerados como tendo capacidade de neutralização se a sua porcentagem de controle de infecção estivesse acima de 50% após diluições por 50 vezes.[0077] The neutralization titer was defined as the highest dilution multiple by which the percentage of infection control was slightly above 50%. Monoclonal and polyclonal antibodies were considered to have neutralizing capacity if their percentage of infection control was above 50% after 50-fold dilutions.

Immunological protection of animals inoculated with HPV18 VLPs:

[0078] Análise de 50% da Dose Eficaz (ED50) em Camundongo: As VLPs de HPV18N65C-L1 produzidas no Exemplo 4 foram adsorvidas em adjuvantes de hidróxido de alumínio e, em seguida, foram diluídas com diluentes da vacina a quatro diferentes concentrações, na proporção de 1:3 (ou seja, O.lμg/mL, 0.033μg/mL, 0.Oil μg/mL e 0.004μg/mL). Em cada grupo experimental, dez camundongos BALB/c foram inoculados com lml da vacina acima por injecção intraperitoneal. 0 soro foi coletado na quarta e na quinta semana após a injeção e os anticorpos neutralizantes de HPV foram avaliados pelas análises de neutralização de pseudo-viron pela EIA. Após a última coleta de soro, os camundongos foram sacrificados. 0 grupo de controle inclui dez camundongos BALB/c.[0078] Analysis of 50% of the Effective Dose (ED50) in Mice: The HPV18N65C-L1 VLPs produced in Example 4 were adsorbed onto aluminum hydroxide adjuvants and then diluted with vaccine diluents at four different concentrations in a 1:3 ratio (i.e., 0.1 μg/mL, 0.033 μg/mL, 0.01 μg/mL, and 0.004 μg/mL). In each experimental group, ten BALB/c mice were inoculated with 1 mL of the above vaccine by intraperitoneal injection. Serum was collected at the fourth and fifth weeks post-injection, and HPV neutralizing antibodies were assessed by pseudo-viron neutralization assays using EIA. After the last serum collection, the mice were sacrificed. The control group included ten BALB/c mice.

[0079] Valor de corte para EIA foi o valor negativo médio mais 0.16 (se o valor negativo médio estivesse abaixo do que 0.05, 0.05 foi usado no cálculo) . Antes da inoculação, todos os camundongos BALB/c tiveram resultado negativo nas análises de anticorpos neutralizantes de HPV, os resultados foram apresentados na Tabela 1.Tabela 1: resultado de ED50 de VLPs de HPV18N65C-L1 em camundongos BALB/c por Análise EIA [0079] The cutoff value for EIA was the mean negative value plus 0.16 (if the mean negative value was below 0.05, 0.05 was used in the calculation). Before inoculation, all BALB/c mice had negative results in HPV neutralizing antibody analyses; the results are presented in Table 1. Table 1: ED50 result of HPV18N65C-L1 VLPs in BALB/c mice by EIA Analysis

[0080] ED50 foi calculado de acordo com o método de Reed-Muench. Após a inoculação, foi coletado sangue para detectar ED50 na quarta e na quinta semana. As VLPs de HPV18N65C-L1 tinham um ED50 de 0.008μg na quarta semana e 0.008μg na quinta semana. Portanto, a imunização nestas doses pode induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes. A eficácia dessas doses foi muito menor do que a de O.lμg.[0080] ED50 was calculated according to the Reed-Muench method. After inoculation, blood was collected to detect ED50 at weeks four and five. HPV18N65C-L1 VLPs had an ED50 of 0.008μg at week four and 0.008μg at week five. Therefore, immunization at these doses can induce high levels of neutralizing antibodies. The efficacy of these doses was much lower than that of 0.1μg.

[0081] Os resultados da análise de neutralização de pseudo-viron só pode ser aceita quando mais de 20% das células do grupo de controle negativo e nenhuma das células do grupo de controle positivo produziu fluorescência. Foi considerado como resultado positivo quando menos de 50% das células no grupo de controle negativo produziu fluorescência. Os resultados foram apresentados na Tabela 2.Tabela 2: Resultado ED50 de VLPs de HPV18N65C-L1 VLP em camundongos Balb/c em Análise de Neutralização de Pseudo-viron [0081] The results of the pseudo-viron neutralization analysis could only be accepted when more than 20% of the cells in the negative control group and none of the cells in the positive control group produced fluorescence. A positive result was considered when less than 50% of the cells in the negative control group produced fluorescence. The results are presented in Table 2. Table 2: ED50 result of HPV18N65C-L1 VLPs in Balb/c mice in Pseudo-viron Neutralization Analysis

[0082] ED50 foi calculado de acordo com o método de Reed-Muench. Após a inoculação, foi coletado sangue para detectar ED50 na quarta e na quinta semana. As VLPs de HPV18N65C-L1 tinham um ED50 de O.Olδμg na quarta semana e 0.016μg na quinta semana. Portanto, a imunização nestas doses pode induzir altos niveis de anticorpos neutralizantes. A eficácia dessas doses foi muito menor do que a de O.lμg.[0082] ED50 was calculated according to the Reed-Muench method. After inoculation, blood was collected to detect ED50 at weeks four and five. HPV18N65C-L1 VLPs had an ED50 of 0.01μg at week four and 0.016μg at week five. Therefore, immunization at these doses can induce high levels of neutralizing antibodies. The efficacy of these doses was much lower than that of 0.1μg.

[0083] Coelhas (nivel geral) com 6-8 semanas de idade foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção à Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. As VLPs de HPV18N65C-L1, preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, as VLPs de HPV18N65C-L1 foram misturadas com adjuvante de Freund incompleto. As coelhas foram imunizadas através de injeção muscular, com lOOμg por coelha para a primeira imunização, e separadamente com 50μg por coelha para o reforço na semana 4, 10. Após a imunização, o sangue da veia externa foi coletado a cada semana e o soro foi separado e armazenado para detecção.[0083] Rabbits (general level) aged 6-8 weeks were acquired from the Guangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, where they were bred. HPV18N65C-L1 VLPs, prepared in Example 4, were mixed with an equal amount of complete Freund's adjuvant for the first immunization. For the booster, HPV18N65C-L1 VLPs were mixed with incomplete Freund's adjuvant. Rabbits were immunized by intramuscular injection, with 100μg per rabbit for the first immunization, and separately with 50μg per rabbit for the booster at week 4, 10. After immunization, external vein blood was collected weekly and the serum was separated and stored for detection.

[0084] Cabras (nível geral) com 6-8 semanas de idade foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção à Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. As VLPs de HPV18N65C-L1, como preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, as VLPs de HPV18N65C-L1 foram misturadas com adjuvante de Freund incompleto. As cabras foram imunizadas através de injeção muscular, com Img por cabra para a primeira imunização, e com 0.5 mg por cabra para o reforço separadamente nas semanas 4, 10 e 18. Após a imunização, o sangue foi coletado da veia externa e o soro foi separado e armazenado para detecção.[0084] Goats (general level) aged 6-8 weeks were acquired from the Guangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, where they were raised. HPV18N65C-L1 VLPs, as prepared in Example 4, were mixed with an equal amount of complete Freund's adjuvant for the first immunization. For the booster, HPV18N65C-L1 VLPs were mixed with incomplete Freund's adjuvant. Goats were immunized by intramuscular injection, with 1 mg per goat for the first immunization, and with 0.5 mg per goat for the booster separately at weeks 4, 10, and 18. After immunization, blood was collected from the external vein and the serum was separated and stored for detection.

[0085] Os títulos de neutralização dos anti-soros foram avaliados usando uma análise de modelo de célula de neutralisação a base de pseudo-víron. Como mostrado na Fig. 5 e 6, a vacina produzida pela mistura de VLPs de HPV18N65C-L1 preparadas no Exemplo 4 com adjuvantes de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório, além de adjuvantes de Freund, teve boa imunogenicidade, pôde induzir anticorpos neutralizantes com titulo elevado em animais e poderia ser uma vacina eficaz útil para a prevenção da infecção pelo HPV.[0085] The neutralization titers of the antisera were evaluated using a pseudoviron-based neutralization cell model analysis. As shown in Figs. 5 and 6, the vaccine produced by mixing HPV18N65C-L1 VLPs prepared in Example 4 with commercially available or laboratory-prepared aluminum hydroxide or aluminum phosphate adjuvants, in addition to Freund's adjuvants, had good immunogenicity, could induce high-titer neutralizing antibodies in animals, and could be an effective vaccine useful for the prevention of HPV infection.

Immune Response of Rhesus Monkeys Inoculated with Bivalent HPV16/18 Vaccine

[0086] As fêmeas de macacos rhesus (nivel geral) , 2 anos, foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção a Doenças da provinda de Guangxi, onde foram criadas. A HPV18N65C-L1 preparada no Exemplo 4 foi adsorvida em adjuvantes de hidróxido de aluminio e VLPs de HPV16N30C-L1 preparadas de acordo com o método semelhante ao do Exemplo 4 também foram adsorvidas em adjuvantes de hidróxido de aluminio. Em seguida, as duas foram misturados na proporção de 2:1 de peso para produzir uma vacina bivalente de HPV16/18 . Cada dose (0,5 ml) continha 40μg de VLPs de HPV16N30C-L1, 20μg de VLPs de HPV18N65C-L1 e 0,6 mg de hidróxido de aluminio. Foi administrado separadamente aos macacos Rhesus 5μg, 10μg e 20μg de HPV 18 por injecção no deltóide do membro superior (em triplicata). Todos os animais candidatos mostraram que os anticorpos IgG totais e os anticorpos neutralizantes contra HPV 18 eram negativos antes da imunização. A vacina foi administrada a 0 e 4 semanas. Os animais foram criados durante 9 semanas e o sangue foi coletado toda semana. As amostras de sangue foram armazenadas a 37°C por 1.5h e, em seguida, centrifugadas a lO.OOOrpmpor 5min. O soro foi coletado para dosagem de titulos de anticorpos IgG totais e de anticorpos neutralizantes contra HPV16 e HPV18. Métodos de análise semelhantes foram usados para os dois tipos de anticorpos.[0086] Female rhesus monkeys (general level), 2 years old, were acquired from the Center for Disease Control and Prevention in Guangxi, where they were raised. HPV18N65C-L1 prepared in Example 4 was adsorbed onto aluminum hydroxide adjuvants, and HPV16N30C-L1 VLPs prepared according to a method similar to that of Example 4 were also adsorbed onto aluminum hydroxide adjuvants. The two were then mixed in a 2:1 weight ratio to produce a bivalent HPV16/18 vaccine. Each dose (0.5 ml) contained 40 μg of HPV16N30C-L1 VLPs, 20 μg of HPV18N65C-L1 VLPs, and 0.6 mg of aluminum hydroxide. Rhesus monkeys were administered 5 μg, 10 μg, and 20 μg of HPV 18 separately by injection into the deltoid muscle of the upper limb (in triplicate). All candidate animals showed that total IgG antibodies and neutralizing antibodies against HPV 18 were negative before immunization. The vaccine was administered at 0 and 4 weeks. The animals were raised for 9 weeks, and blood was collected weekly. Blood samples were stored at 37°C for 1.5 h and then centrifuged at 10,000 μm for 5 min. Serum was collected for measurement of total IgG antibody titers and neutralizing antibodies against HPV16 and HPV18. Similar analytical methods were used for both antibody types.

[0087] Como mostrado na Fig. 7 e Fig. 8, as VLPs de HPV18N65C-L1 de acordo com a invenção puderam induzir altos titulos de IgG total e anticorpos neutralizantes, superior a 20.000 na 9a semana após a primeira imunização. As VLPs de HPV18N65C-L1 tiveram boa imunogenicidade e poderiam ser usadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV18. Além disso, as VLPs de HPV16N30C-L1 da Vacina Bivalente pôde induzir altos titulos de IgG total e anticorpos neutralizantes contra o HPV16, superior a 20.000 na 9a semana após a primeira imunização, como mostrado na Fig. 9 e Fig. 10. As VLPs de HPV16N30C-L1 tiveram boa imunogenicidade e poderiam ser usadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV18.[0087] As shown in Fig. 7 and Fig. 8, the HPV18N65C-L1 VLPs according to the invention were able to induce high titers of total IgG and neutralizing antibodies, greater than 20,000 at week 9 after the first immunization. The HPV18N65C-L1 VLPs had good immunogenicity and could be used as an effective vaccine for the prevention of HPV18 infection. Furthermore, the HPV16N30C-L1 VLPs of the Bivalent Vaccine were able to induce high titers of total IgG and neutralizing antibodies against HPV16, greater than 20,000 at week 9 after the first immunization, as shown in Fig. 9 and Fig. 10. The HPV16N30C-L1 VLPs had good immunogenicity and could be used as an effective vaccine for the prevention of HPV18 infection.

[0088] A Sequência de Aminoácidos de HPV16N30C-L1 é mostrada no N° ID SEQ 7 da seguinte maneira. Proteção imunológica de Camundongos inoculados comVacina Quadrivalente de HPV6/11/16/18[0088] The amino acid sequence of HPV16N30C-L1 is shown in ID SEQ 7 as follows. Immunological protection of mice inoculated with the quadrivalent HPV vaccine 6/11/16/18

[0089] Quatro camundongos SPF BALB/c de 4-5 semanas de idade foram utilizados. As VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1, preparadas de acordo com o método semelhante ao do Exemplo 4, foram misturadas na proporção de 1:2:2:1 (por peso), onde a concentração final deles foi 40μg/mL, 80μg/mL, 80μg/mL e 40μg/mL, respectivamente. A vacina foi misturada a uma quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização e foi misturada a uma quantidade igual de adjuvante de Freund incompleto para o reforço.[0089] Four 4-5 week old SPF BALB/c mice were used. HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 and HPV18N65C-L1 VLPs, prepared according to a method similar to that of Example 4, were mixed in a 1:2:2:1 ratio (by weight), where the final concentrations were 40μg/mL, 80μg/mL, 80μg/mL and 40μg/mL, respectively. The vaccine was mixed with an equal amount of complete Freund's adjuvant for the first immunization and with an equal amount of incomplete Freund's adjuvant for the booster.

[0090] Os camundongos foram imunizados por injeção muscular. A quantidade para a primeira imunização foi de 10μg de HPV6N5C-L1, 10μg de HPV18N65C-L1, 20μg de HPV11N4C-L1, e 20μg de HPV16N30C-L1 por camundongo. O reforço foi administrado a cada duas semanas. A quantidade para o reforço foi de 20μg de HPV6N5C-L1, 20μg de HPV18N65C-L1, 40μg de HPV11N4C-L1, e 40μg de HPV16N30C-L1 por camundongo.[0090] Mice were immunized by intramuscular injection. The amount for the first immunization was 10μg of HPV6N5C-L1, 10μg of HPV18N65C-L1, 20μg of HPV11N4C-L1, and 20μg of HPV16N30C-L1 per mouse. The booster was administered every two weeks. The amount for the booster was 20μg of HPV6N5C-L1, 20μg of HPV18N65C-L1, 40μg of HPV11N4C-L1, and 40μg of HPV16N30C-L1 per mouse.

[0091] Após a imunização, o sangue da veia externa foi coletado semanalmente e o soro foi separado. Os titulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 em camundongos imunizados foram separadamente determinados de acordo com o método do Exemplo 5.[0091] After immunization, external vein blood was collected weekly and the serum was separated. Neutralizing antibody titers against HPV6, HPV11, HPV16, and HPV18 in immunized mice were separately determined according to the method of Example 5.

[0092] Os resultados foram mostrados na Fig. 11, indicando que a vacina quadrivalente de HPV6/11/16/18, preparada pela combinação de VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 conforme preparadas nos Exemplos 1-4, teve boa imunogenicidade, puderam induzir anticorpos neutralizantes com titulo elevado contra HPV 6, HPV 11, HPV 16 e HPV 18 em animais, e poderia ser usada como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção por HPV6/HPV11/HPV16/HPV18 (além de adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, a vacina poderia ser preparada combinando as quatro VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 com adjuvantes de hidróxido de aluminio ou fosfato de aluminio disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório).[0092] The results were shown in Fig. 11, indicating that the quadrivalent HPV6/11/16/18 vaccine, prepared by combining HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 and HPV18N65C-L1 VLPs as prepared in Examples 1-4, had good immunogenicity, could induce high titer neutralizing antibodies against HPV 6, HPV 11, HPV 16 and HPV 18 in animals, and could be used as an effective vaccine for the prevention of HPV6/HPV11/HPV16/HPV18 infection (in addition to Freund's adjuvants used in the experiments, the vaccine could be prepared by combining the four HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 and HPV18N65C-L1 VLPs). HPV18N65C-L1 with commercially available or laboratory-prepared aluminum hydroxide or aluminum phosphate adjuvants.

[0093] A Sequência de Aminoácidos de HPV6N5C-L1 é mostrada no N° ID SEQ 8 da seguinte maneira. A Sequência de Aminoácidos de HPV11N4C-L1 é mostrada na SEQ ID NO:9: [0093] The amino acid sequence of HPV6N5C-L1 is shown in SEQ ID No. 8 as follows. The amino acid sequence of HPV11N4C-L1 is shown in SEQ ID NO:9:

[0094] A Sequência de Aminoácidos de VLP de HPV16N30C-L1 é mostrada no SEQ ID NO:7, conforme descrito acima.[0094] The HPV16N30C-L1 VLP Amino Acid Sequence is shown in SEQ ID NO:7, as described above.

[0095] Os resultados experimentais mostram que a vacina que foi formada VLPs de HPV18N65C-L1 preparadas no Exemplo 4 (além de adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, hidróxido de aluminio ou fosfato de aluminio adjuvantes disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório também poderiam ser usados), teve boa imunogenicidade, pôde induzir anticorpos neutralizantes com titulo elevado de animais e poderia ser uma vacina eficaz útil para a prevenção da infecção pelo HPV18.[0095] Experimental results show that the vaccine formed from HPV18N65C-L1 VLPs prepared in Example 4 (in addition to Freund's adjuvants used in the experiments, commercially available or laboratory-prepared aluminum hydroxide or aluminum phosphate adjuvants could also be used) had good immunogenicity, was able to induce high titer neutralizing antibodies in animals, and could be an effective vaccine useful for preventing HPV18 infection.

Example 6:

[0096] As proteínas HPV18L1 dispostas nos SEQ ID NOs: 2, 3, 4 e 5 foram preparadas de acordo com as técnicas usadas nos exemplos 1-5. Todas estas proteinas truncadas podem ser montadas em VLPs.[0096] The HPV18L1 proteins arranged in SEQ ID NOs: 2, 3, 4 and 5 were prepared according to the techniques used in examples 1-5. All of these truncated proteins can be assembled into VLPs.

Claims

1. HPV18 L1 protein characterized by containing the sequence established in SEQ ID Nos: 1, 2, or 3.

2. Protein, according to claim 1, characterized by containing the sequence established in SEQ ID No: 1.

3. Polynucleotide, characterized by containing the sequence established in SEQ ID NO: 6.

4. Vector, characterized by comprising the polynucleotide, as defined in claim 3.

5. Cell comprising the vector defined in claim 4, characterized in that the cell is a prokaryotic cell.

6. Composition characterized by containing the protein according to claim 1 or 2.

7. HPV18 virus-like particle (VLP), characterized by comprising or consisting of the HPV18 Ll protein, as defined in SEQ ID Nos: 1, 2, or 3.

8. Method for producing the HPV18 Ll protein, as defined in any one of claims 1 or 2, characterized by comprising: a) expressing an HPV Ll gene having the sequence defined in SEQ ID No. 6 or degenerate sequences thereof encoding the HPV18 Ll protein of SEQ ID No. 1 in an E. coli expression system; b) separating E. coli that expressed the HPV Ll protein in a saline solution with a concentration of 100 mM to 600 mM, and isolating the supernatant; c) reducing the saline concentration of the supernatant from b) 100 mM to 0, inclusive, using water or a low-concentration saline solution to produce a precipitate, and collecting the precipitate; ed) redissolve the precipitate from c) in a solution at a saline concentration of 150mM to 2500mM, adding a reducing agent to it, and then isolate the resulting solution, where the solution contains the HPV18 Ll protein with a purity of at least 50%.

9. The method of claim 8 characterized by comprising: e) further purifying the HPV18 Ll protein to a purity of at least 50% by chromatography; and f) removing the reducing agent from the HPV18 Ll protein obtained in e).

10. Vaccine for the prevention of cervical cancer, characterized by comprising: (1) HPV18 VLP, comprising or consisting of the HPV18 Ll protein, as defined in SEQ ID Nos: 1, 2, or 3, and (2) carriers or excipients useful for vaccines.

11. Vaccine, according to claim 10, characterized by comprising an HPV16 VLP comprising a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID No: 7, and an HPV18 VLP comprising a protein having an amino acid sequence set forth in SEQ ID No: 1; further comprising an HPV6 VLP comprising a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID No: 8, and an HPV11 VLP comprising a protein containing an amino acid sequence set forth in SEQ ID No: 9.

12. Use of the HPV18 Ll protein, as defined in either claim 1 or 2, or of the HPV18 VLP protein, as defined in claim 7, characterized by its application in the manufacture of a vaccine for the prevention of cervical cancer.

13. Vaccine for the prevention of cervical cancer characterized by containing an effective amount of the HPV18 Ll protein as defined in SEQ ID Nos: 1, 2 or 3 or HPV18 VLP comprising or consisting of the HPV18 Ll protein, as defined in SEQ ID Nos: 1, 2, or 3.

14. Method for producing a vaccine for the prevention of cervical cancer, characterized by comprising mixing HPV18 VLP, comprising or consisting of HPV18 Ll protein, as defined in SEQ ID Nos: 1, 2, or 3 with carriers or excipients useful for vaccines.