BRPI0815758B1 - PROCESSO PARA O ISOLAMENTO E A PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA-ALVO LIVRE DE PROTEÍNA PRÍON (PrPsc) - Google Patents
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Description
(54) Título: PROCESSO PARA O ISOLAMENTO E A PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA-ALVO LIVRE DE PROTEÍNA PRÍON (PRPSC) (51) Int.CI.: A61L 2/00; C07K 14/47; G01N 33/68; C07K 1/16 (30) Prioridade Unionista: 23/08/2007 EP 07 114856.3 (73) Titular(es): OCTAPHARMA AG (72) Inventor(es): GUSTAV GILLJAM; MATS JERNBERG; STEFAN WINGE; ANDRÉA NEISSERSVAE (85) Data do Início da Fase Nacional: 23/02/2010
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA O ISOLAMENTO E A PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA-ALVO LIVRE DE PROTEÍNA PRÍON (PrPsc).
A presente invenção refere-se a um processo de isolamento e purificação de uma proteína-alvo que é livre da doença associada à forma da proteína PrPsc.
Em tempos recentes, tem sido atribuída maior atenção no foco sobre inativação e remoção da PrPsc nos métodos de purificação para os fármacos derivados do plasma sanguíneo. A razão obviamente sendo o surto da doença da vaca louca etc. Mesmo o uso de linhagens celulares recombinantes para a produção de medicamentos biofarmacêuticos não é considerado totalmente seguro em relação à ocorrência das proteínas príons (Vorberg et al., The Journal of infectious diseases 2004; 189:431-9. Susceptibility of common fíbroblast cell Unes to transmissible spongiform encephalopathy agents). Durante o trabalho para definir um processo de purificação para as proteínas destinadas a medicamentos biofarmacêuticos, as diferentes etapas de purificação podem ser avaliadas como possíveis etapas de remoção da proteína príon (Foster PR, et al; Distribution of a bovine spongiform encephalopathy-derived agent over ion- exchange chromatography used in the preparation of concentrates of fibrinogen and factor VIII; Vox Sang. 2004 Feb;86(2):92-9; Trejo SR, et al, Evaluation of virus and prion reduction in a new intravenous immunoglobulin manufacturing process. Vox Sang. 2003 Apr;84(3): 176-87; Zeiler B, et al, Concentration and removal of prion proteins from biological Solutions; Biotechnol Appl Biochem. 2003 Apr, 37(Pt 2) : 17382; Foster et al. Studies on the removal of abnormal prion protein by processes used in the manufacture of human blood plasma products, Vox Sang. 2000, 78:86-95; Burnouf et al., Transfus Clin Biol. 2006 Nov; 13 (5): 320-8. Epub 2007 Jan 23, Current strategies to prevent transmission of prions by human plasma derivatives.
As resinas cromatográficas têm mostrado ser capaz de contribuir para a remoção da PrPsc em um processo de purificação (referência: 2-4, 67). Entretanto, tem sido declarado que o fato de que os fatores consistentes de depuração da PrPsc são encontrados em processos que usam resinas cromatográficas de estrutura e substituições químicas diferentes e sob sistemas tampão diferentes, suportam a ocorrência de ligação não-específica do agente infeccioso na superfície de suporte cromatográfico. Embora a remoção da PrPsc pareça reprodutível, a compreensão incompleta do mecanismo de remoção levanta questões, tais como (a) determinar a capacidade máxima do suporte cromatográfico de se ligar aos agentes TSE, (b) assegurar procedimentos de esterilização eficientes de géis reciclados e (c) garantir a remoção consistente da PrPsc ao longo dos ciclos de produção (Thyer J, Prion- removal capacity of chromatographic and ethanol precipitation steps used in the production of albumin and immunoglobulins; Vox Sang. 2006 Nov; 91(4): 292-300).
O WO-A-98/0041 descreve a remoção do prion de outras proteínas, por exemplo, a hemoglobina, por cromatografia de troca iônica. A preparação do meio cromatográfico de troca iônica revela a sílica gel derivatizada com (g- glicidoxipropil) trimetoxisilano e dimetanolamina para obter uma superfície (uniforme) de grupos de amônio quaternário.
O WO-A-03/105911 descreve um método de limpeza do plasma humano por meios convencionais de cromatografia de troca iônica usando um gradiente salino para lavagem.
O WO-A-94/08686 descreve um processo para a realização, de uma maneira consecutiva, de registros diferentes de separação cromatográfica em uma coluna de cromatografia líquida usando um único meio de separação.
D.B. Brimacombe et al. em Biochem. J. (1999) 342,605-613 descreve a purificação do recPrP por duas etapas cromatográficas sucessivas. A primeira etapa é uma cromatografia de troca catiônica (150-650 gradiente de NaCl) realizada em S-Sepharose. Os eluatos agrupados de interesse foram submetidos a uma segunda etapa cromatográfica (quelante de sepharose com carga de zinco; 0-100mM gradiente de imidazol).
P.R. Foster et al. Vox Sanguinis 2000; 78:86-95 descreve a remoção da proteína prion na produção de produtos plasmáticos por muitas etapas. Este método é composto por 4 cromatografias de troca iônica (Etapas 2, 11, 13 e 15) e uma cromatografia de afinidade (heparina imobilizada em sepharose-FF; etapa 12) realizadas em colunas diferentes em géis cromatográficos diferentes.
T. Burnouf et al. publica em Transfusion Clinique et Biologique 13 (2006) 320-328 a extensão da remoção do agente TSE durante as várias etapas cromatográficas dos fatores de coagulação derivados do plasma. A publicação enfoca (na maioria das vezes) diversas etapas cromatográficas de troca iônica usadas na produção de FVIII (DEAE-Toyopearl 650M), vWF (DEAE-Toyopearl 650M), fibrinogênio (DEAE-Toyopearl 650M), complexo da protrombina i FIX (DEAE-celulose), PCC (DEAE-Sepharose), FIX (DEAESepharose ou Heparina-Sepharose) e trombina (S-Sepharose). Todos esses sistemas foram investigados separadamente.
J. Thyer et al. em Vox Sanguinis (2006) 91, 292-300, relata sobre a redução da PrP na DEAE-Sepharose, na CM- Sepharose e nas colunas cromatográficas de Macro-Prep High Q (Materials and Methods: fig. 1, página 294; tabela I). Em outro experimento, o uso sequencial de uma coluna de DEAE-Sepharose e uma coluna de CM-Sepharose ou Macro-Prep é descrito.
Sumário da Invenção
Um objetivo da invenção era fornecer um processo cromatográfico que removesse a PrPsc durante os processos de fracionamento de fontes sendo potencialmente contaminadas pela PrPsc, tais como as fontes biologicamente derivadas. O processo deve evitar as desvantagens da técnica anterior. Outro objetivo era desenhar um processo que pudesse desenvolver um processo de purificação confiável e permitir a regeneração dos suportes cromatográficos.
Ainda outro objetivo da invenção era fornecer uma fração de proteínas depletadas de príon.
De acordo com a invenção, um processo de isolamento e purificação de uma proteina-alvo por cromatografia em que a cromatografia remove ou depleta os príons (PrPsc) é fornecido compreendendo as etapas de
- colocar uma amostra da PrPsc potencialmente contaminada compreendendo uma proteína-alvo em contato com um material cromatográfico multimodal;
- ajustar as condições de tampão para que a proteína-alvo seja ligada ao material cromatográfico multimodal e considerando que a PrPsc não seja vinculada ao material cromatográfico multimodal;
- seguido pela eluição da proteína-alvo, e
- recolher a proteína-alvo.
O processo da invenção fornece uma melhoria significativa, porque a resina cromatográfica liga a PrPsc menos forte permitindo a remoção da PrPsc da resina cromatográfica antes da proteína-alvo ser eluída.
De acordo com a invenção isolamento e purificação significa em processos específicos que são usados para pelo menos enriquecer qualquer substância semelhante à proteína desejada ou processos que depletam substâncias indesejadas. De acordo com a invenção, seria vantajoso produzir o produto desejado tão puro quanto possível.
O termo proteína-alvo significa uma proteína de interesse que deve ser isolada e/ou purificada livre de PrPsc. A proteína-alvo também pode ser ainda uma mistura de proteínas se assim for desejado, por exemplo, uma mistura de fatores diferentes com um efeito biológico quando se trabalha em conjunto.
Príons são substâncias proteináceas infecciosas.
Descrição Detalhada da Invenção
Surpreendentemente, verificou-se que uma única resina cromatográfica tem sido capaz de minimizar a ligação da PrPsc ao gel sob condições cromatográficas e, portanto, alcançar excelentes valores de redução para o produto que se liga a ela. Esta resina está disponível comercialmente e descrita, por exemplo, no WO-A-2004/024318. A descrição será incorporada por referência. A resina que tem demonstrado ter esse efeito em relação a PrPsc é chamada de resina multimodal (ou modo misto ou indução por carga hidrofóbica). Ao contrário, por exemplo, do meio cromatográfico padrão como as trocas iônicas e as resinas cromatográficas de interação hidrofóbica, que funcionam através de um único princípio, as resinas multimodais funcionam através de uma combinação de interações iônicas e interações hidrofóbicas. Exemplos de tais resinas são comercialmente disponíveis Capto® MMC e Capto® Adhere da empresa GE Healthcare, ou resinas MEP,
HEA ou PPA Hypercel® da empresa PALL. Os ligantes dessas resinas multimodais podem ser desenhados diferentemente; exemplos de ligantes diferentes são os seguintes:
o ...
•v.j- '.·· t ± í ,-N /'X ,N4 rfcC ! ‘04
HsC γ' L...
i Y| '
Ο OH / O
Ácido butanoico 2-(benzoilamino) N-benzil-2-hidróxi-N,N-dimetiletanoaminio
A:·, A·. ..OH w “A
,.-/-.. θ
KjC ' ' ' M4 ' A °\
Ácido benzoico 3-[{3-metil-5((tetrahidrofurano-2-ilmetil)amino)-fenil}amino] 10 O tipo de material cromatográfico multimodal é resumido a seguir.
A presente invenção fornece um substrato sólido que é um adsorvente efetivo para o uso na separação e no isolamento de uma variedade de substâncias biológicas. O substrato sólido dessa invenção pode ser usado, por exemplo, em técnicas preparatórias, como a cromatografia em colu15 na e, em dispositivos analíticos, tais como os biochips. Uma vantagem do presente substrato sólido descrito aqui é a sua alta seletividade e especificidade para substâncias biológicas, tais como imunoglobulinas, junto a isso evitar processos de limpeza caros e muitas vezes prejudiciais necessários para substratos da técnica anterior. Uma segunda vantagem é que o subs20 trato sólido dessa invenção é quase idealmente adaptado para o uso com amostras biológicas em pH fisiológico e força iônica, prevenindo assim a necessidade de regulação do pH e da adição de sais liotrópicos, tais como prescritos nas técnicas anteriores. Como a terceira vantagem pode ser considerada a elevada capacidade dos presentes substratos, o que tendo em vista o baixo custo dos reagentes utilizados para prepará-los apresenta ganhos econômicos significativos sobre o uso de adsorventes especializados da técnica anterior.
Ligantes de Modo Misto
Os substratos sólidos dessa invenção compreendem um suporte sólido e um ligante ligado ao suporte sólido. O ligante compreende um grupo cíclico que pode ser um grupo monocíclico ou um grupo policíclico, e um grupo de ligação que opcionalmente compreende um átomo de enxofre. O ligante que atrai analitos através de uma ação de modo misto está ligado a um suporte sólido.
O ligante compreende um grupo cíclico que pode ser um grupo monocíclico ou policíclico que é preso ao suporte sólido e que é substituído por um grupo sulfato, sulfonato, fosfato, ou fosfonato. Este grupo monocíclico ou policíclico pode ser um grupo aromático, que, conforme definido aqui, é um hidrocarboneto cíclico contendo apenas ligações insaturadas carbonocarbono para produzir um sistema aromático. Enquanto qualquer grupo aromático, em princípio, pode ser empregado na presente invenção, um adequado grupo aromático tipicamente inclui um, dois ou três anéis aromáticos. Assim, os grupos aromáticos ilustrativos são o fenila e seus derivados substituídos, tais como o tolila e o xililo. Grupos aromáticos bicíclicos fundidos compreendem anéis individuais fundidos, e incluem, mas não estão limitados ao naftila. Grupos aromáticos policíclicos incluem antracenila e fenantrenila, e grupos tais como o acenaftileno que contêm anéis fundidos de tamanhos diferentes. Se um grupo aromático é selecionado, é preferido embora não essencial que o grupo seja fundido a um grupo heterocíclico ou heteroaromático, como descrito abaixo.
Um heterociclo é um saturado a um anel parcialmente saturado contendo pelo menos um heteroátomo. Da mesma forma, um grupo heteroaromático é um grupo aromático no qual pelo menos um átomo de carbono é substituído por um heteroátomo. Na presente invenção, o heteroátomo de preferência é o N, S ou O. Também é preferível que o grupo heterocíclico ou heteroaromático seja um anel de cinco ou seis membros, como os reagentes que compõem esses grupos são obtidos de forma fácil e barata de fontes comerciais.
Quando um grupo de ligação, conforme definido abaixo, não contém o átomo de enxofre ambivalente, então é preferível que o grupo heterocíclico ou heteroaromático seja aquele que estabeleça ou contribua para o caráter tiofílico do substrato sólido e seja assim aquele que contenha pelo menos um átomo S.
Com o uso de outros grupos de ligação que contenham átomos de enxofre bivalentes, grupos heterocíclicos ou heteroaromáticos preferíveis podem incluir pelo menos um átomo N, ou combinações de átomos S e N.
Assim, grupos heterocíclicos e heteroaromáticos exemplares incluem tiazolina, tiazolidina, imidazol, imidazolina, tiazol, triazol, tetrazol, tiadiazol, imidazol, piridina e morfolina. Em uma modalidade preferida particular, um grupo heterocíclico ou heteroaromático adequado é fundido a um grupo aromático, como descrito acima. Neste contexto, o benzimidazol e o benzotiazol são os candidatos prontamente disponíveis, rendendo substratos sólidos superiores.
Como mencionado acima, o grupo monocíclico ou policíclico é substituído por um grupo sulfato, sulfonato, fosfato, ou fosfonato. Estes grupos são suficientemente ácidos para existir como metades carregadas dentro de uma ampla faixa de pH, por exemplo, de cerca de 2 a 12. Neste contexto, o suporte sólido é idealmente adequado para adsorver substâncias biológicas, tais como as imunoglobulinas em pH e força iônica fisiológicos.
O termo substituído, conforme usado aqui, refere-se à ligação direta ou indireta de um grupo sulfato, sulfonato, fosfato, ou fosfonato ao grupo monocíclico ou policíclico. A ligação indireta pode ocorrer através de um grupo espaçador, que é um grupo alquileno ramificado ou linear Ci.6. O grupo alquileno é opcionalmente interrompido por uma ou mais metades bivalentes que incluem, mas não estão limitados a -C(O)NH-, NHC(O)-, -O-, 5-, -5(0)-, -5(O)2-,-NH-, -C(O)O- e -OC(O)-. Assim, os grupos espaçadores ilustrativos incluem -CH2-,-CH2CH2-,-CH2-O-CH2- e -CH2C(O)NHCH2CH2.
O grupo monocíclico ou policíclico é preso ao suporte sólido por um grupo de ligação, que compreende uma porção contendo mercapto, éter, ou amino. Sujeito a considerações estruturais descritas abaixo é preferível que o grupo de ligação seja hidrofóbico, com isso conferindo caráter hidrofóbico ao suporte sólido em um pH onde a ligação de uma substância biológica ocorre através de interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Porções hidrofóbicas incluem, mas não estão limitadas a grupos alquilenos lineares e ramificados Ci-6, grupos alquenilenos C2-6 e grupos alquinilenoas C2-6· As porções particularmente úteis são o etileno e o propileno. Outras porções hidrofóbicas compreendem um grupo aromático, como descrito acima, para formar, por exemplo, o fenetileno. As porções precedentes são, portanto, interrompidas ou cobertas por pelo menos uma porções mercapto, éter, ou amino. Em modalidades onde o grupo monocíclico ou policíclico não compreende um átomo de enxofre, o grupo de ligação de preferência contém uma porção mercapto. Em relação a isso, o grupo de ligação confere características hidrofóbicas e tiofílicas ao substrato sólido. Um grupo de ligação preferido contendo o mercapto é representado pela fórmula:
A hidrofobicidade do grupo de ligação pode ser facilmente adaptada através da introdução de substituintes polares, tais como hidroxila, haleto, ou nitro; pela oxidação de uma porção mercapto por métodos conhecidos, mediante a incorporação de metades éter ou amino no grupo de ligação, ou combinações dos mesmos. Assim, tal grupo de ligação contendo mercapto que é facilmente acessado é representado pela fórmula:
Um grupo de ligação ilustrativo contendo amino é representado pela fórmula:
Preferencialmente, o substrato sólido compreendendo grupos de ligação contendo aminos, ou aqueles contendo porções mercapto oxidadas, também compreende grupos monocíclicos ou policíclicos que compreendem pelo menos um átomo S. A este respeito, o substrato sólido é capaz de reter alguma característica tiofílica.
Em outra modalidade preferida, o próprio grupo de ligação compreende um polissacarídeo como hidroxietil celulose, amido, amilose, ou agarose. Um polissacarídeo preferido neste contexto é o dextran. Assim, o suporte sólido é modificado com um polissacarídeo que pode ser derivatizado com um grupo de ligação, como descrito abaixo.
Sem limitar-se a qualquer teoria em particular, os inventores acreditam que o substrato sólido desta invenção opera através de modos mistos de interação entre o substrato sólido e uma substância biológica. Os grupos monocíclicos e policíclicos supracitados têm um valor pk inferior a 4 e, por conseguinte, são negativamente carregados dentro da faixa de uso do pH como descrito acima. Uma substância biológica, tal como uma imunoglobulina, é colocada em contato com o substrato sólido entre cerca de pH 4 e pH 6, nessa faixa a substância biológica produz uma carga positiva ou neutra líquida. Nesta faixa do pH, a substância biológica se liga ao substrato sólido, através de um ou mais tipos de interações com os grupos mono ou policíclicos. As interações incluem atrações coulômbicas e associações hidrofóbicas leves. Quando o pH é elevado acima de aproximadamente 8, a substância biológica ganha uma carga negativa líquida, criando assim repulsão eletrostática entre o substrato sólido carregado negativamente e a substância biológica carregada negativamente. Consequentemente, a substância biológica é liberada pela repulsão eletrostática do substrato sólido e pode, então, ser isolada. Acredita-se que essas forças iônicas repulsivas são maiores do que as forças atrativas mais fracas observadas acima.
Substratos sólidos
Esta invenção contempla um suporte sólido ao qual os ligantes de modo misto são anexados. Dois formatos diferentes são contemplados em particular. Em um formato, o suporte sólido é da forma tipicamente usada para o meio cromatográfico, isto é, um grânulo ou partícula. Estes grânulos ou partículas são derivatizados com o ligante de modo misto. Os grânulos ou partículas formam um meio cromatográfico que se pode usar para preencher a coluna. Em outro formato, o suporte sólido assume a forma de um chip, isto é, um suporte sólido que geralmente tem uma superfície plana a qual o ligante de modo misto pode ser ligado, covalentemente ou não. Os chips que são adaptados para acoplar uma interface de sonda de um dispositivo de detecção também são chamados sondas.
Grânulos e Partículas
De acordo com os ensinamentos desta invenção, o substrato sólido primeiro compreende um suporte sólido que pode compreender um material orgânico. Materiais orgânicos exemplares são polissacarídeos, tais com celulose, amido, ágar, agarose, e dextrano. Os polímeros sintéticos hidrofílicos são contemplados, incluindo poliacrilamidas substituídas ou nãosubstituídas, polimetacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polímeros hidrofílicos de polivinila, poliestireno, polissulfona, e copolímeros ou estireno e divinilbenzeno. Alternativamente, os materiais inorgânicos podem ser usados como material de suporte sólido. Tais materiais inorgânicos incluem, mas não estão limitados a materiais minerais porosos, tais como a sílica; sílica contendo hidrogel, zircônia, titânia, alumina; e outros materiais cerâmicos. Também é possível usar misturas destes materiais, ou materiais compósitos formados por copolimerização ou por uma rede de dois materiais interpenetrados, tais como aqueles divulgados nos US-A-5.268.097, US-A5.234.991, e US-A-5.075.371.
O suporte sólido pode estar na forma de grânulos ou partículas irregulares de cerca de 0,1 mm a cerca de 1.000 mm de diâmetro. Alternativamente, o suporte sólido pode estar na forma de fibras, membranas, ou materiais permeáveis semelhantes às esponjas com orifícios nos tamanhos de mícron a multimilímetro.
Os grupos monocíclicos ou policíclicos descritos acima são quimicamente imobilizados no suporte sólido formando ligações covalentes entre o suporte sólido e o grupo de ligação e entre o grupo de ligação e os grupos monocíclicos ou policíclicos. Em cenários típicos, o suporte sólido é o primeiro tratado com um reagente bifuncional que serve para introduzir, sobre o suporte sólido grupos reativos que formam parte ou todo o grupo de ligação. Para alguns suportes sólidos, como a celulose, os compósitos contendo um hidrogel, ou outros materiais apresentando grupos hidroxila muitas vezes é vantajoso para deprotonar os grupos hidroxila com uma fonte de hidróxido, por exemplo, antes da reação com um reagente bifuncional. O reagente bifuncional é capaz de reagir tanto com o suporte sólido como com os reagentes que contêm os grupos monocíclicos ou policíclicos. Os reagentes bifuncionais ilustrativos, que contêm o mesmo ou diferentes grupos funcionais, incluem, mas não estão limitados a epicloridrina, epibromidrina, dibromo- e dicloropropanol, dibromobutano, etileno glicol diglicidílico, butanodiol diglicidílico, divinil sulfona, alilglicidiléter e brometo de alilo.
Uma vez funcionalizado, o suporte sólido é então lavado extensivamente com um ou mais solventes para remover o reagente bifuncional que não reagiu, os subprodutos da reação, ou ambos. Um típico solvente usado nesse aspecto é a água.
Os grupos monocíclicos ou policíclicos são, então, introduzidos por meio de reagentes que contêm tais grupos substituídos com grupos mercapto, hidroxila, ou amino. Esses reagentes reagem com grupos funcionais presentes pelo suporte sólido funcionalizado como descrito acima.
O emparelhamento particular de um reagente bifuncional com um reagente monocíclico ou policíclico é orientado por químicas bem conhecidas. Por exemplo, os suportes sólidos que são funcionalizados com epóxidos podem sofrer reações com reagentes contendo mercapto, hidróxi, ou amino para fornecer um substrato com grupos de ligação contendo etileno. Outros suportes sólidos modificados com brometo alílico, por exemplo, apresenta grupos alqueno que podem reagir diretamente com reagentes contendo mercapto. Alternativamente, os grupos alquenos podem ser posteriormente bromados para fornecer adequadamente derivativos do bromo reativo.
A concentração do grupo monocíclico ou policíclico imobilizado pode variar entre uma fração de um micromol a várias centenas de micromols por mililitro de suporte sólido, dependendo da concentração de reagentes bifuncionais usados para fazer o suporte sólido.
As baixas concentrações do grupo imobilizado tipicamente resultam em baixa capacidade de separação do substrato sólido, enquanto as altas concentrações geralmente levam ao aumento da capacidade.
Conforme descrito acima, existem várias vantagens em ter uma resina de remoção PrPsc que principalmente não se liga a PrPsc sendo que é possível lavar extensivamente a resina com diferentes composições tampão antes da eluição do produto, o que torna possível pelo menos reduzir o número de PrPsc da composição bioquímica diferente a um nível muito baixo ou remover a PrPsc da composição. Por exemplo, é possível lavar a resina com diferentes tipos de tampões de lavagem, incluindo respectivamente tampões com alto e baixo teor de sal para interromper respectivamente a interação iônica e hidrofóbica na qual a menor quantidade de príons pode ser ligada à resina ou mesmo o produto antes da eluição do produto. Os detergentes, álcoois e aminoácidos também são exemplos que podem ser adicionados aos tampões de lavagem para alcançar uma pureza ideal antes da eluição do produto. É significativamente mais difícil executar a etapa de lavagem semelhante a outros tipos de meios cromatográficos padrão como, por exemplo, diferentes tipos de resinas de troca iônica, onde a PrPsc se liga à resina. Mesmo se a afinidade de ligação for mais significativa em relação ao produto, sempre haverá um risco de que a PrPsc até certo ponto irá coeluir da resina junto com o produto. Portanto, existe uma grande vantagem de usar uma resina em que o produto multimodal liga-se à resina considerando que a PrPsc têm uma afinidade relativamente baixa a resina, o que torna possível aplicar etapas adequadas da lavagem antes da eluição do produto.
De acordo com a invenção, a proteína-alvo é eluída após a eluição da PrPsc, por exemplo,
- corrigir a força iônica do tampão de eluição, aumentando ou diminuindo a força iônica,
- adicionando álcoois ao tampão de eluição - em particular, em solução aquosa - como mono ou di-hidroxialcanóis, por exemplo, álcoois alifáticos menores, tais como o metanol, o etanol, o propanol, e/ou
- corrigir o valor do pH do tampão de eluição, aumentando ou diminuindo o pH.
Também pode ser empregada uma combinação das técnicas de eluição descritas. Por exemplo, a invenção usa força iônica aumentada e quantidade de etilenoglicol aumentada.
Outras condições de eluição também podem ser usadas, tais como o aumento de concentração de aminoácidos, o aumento da concentração com sais específicos de acordo com série de Hofmeister.
A eluição da proteína-alvo depende da propriedade bioquímica da proteína-alvo. Por exemplo, é possível usar a coenzima da proteína-alvo ou outras substâncias com alto reconhecimento para a estrutura terciária da proteína-alvo, por exemplo, a antitrombina como proteína-alvo, que é eluída com um aumento da concentração de heparina.
A redução do valor da proteína príon na fração da proteína compreendendo a proteína-alvo é > 1 a 4 lg(10), conforme calculado da quantidade que foi inicialmente aplicado à resina. O valor analítico do príon na fração da proteína de interesse está abaixo do limite de detecção do ensaio de Western blot do príon.
Em uma modalidade da presente invenção, as condições cromatográficas compreendem pelo menos duas das seguintes etapas:
i) empregar um tampão de carregamento e equilíbrio contendo um solvente e/ou um detergente não-iônico;
ii) empregar um tampão de lavagem sem um solvente e/ou um detergente não-iônico;
iii) empregar um tampão de lavagem contendo um álcool e/ou um aminoácido;
iv) empregar um tampão de lavagem contendo uma alta concentração de sal;
v) empregar um tampão de lavagem contendo uma baixa concentração de sal;
vi) empregar um tampão contendo uma combinação de álcool e uma alta concentração de sal.
Em outra modalidade da presente invenção, as condições cromatográficas compreendem, pelo menos, duas das seguintes etapas:
i) empregar um tampão de carregamento e equilíbrio contendo um solvente e/ou um detergente não-iônico;
ii) empregar um primeiro tampão de lavagem, que é um tampão sem um solvente e um detergente não-iônico;
iii) empregar um segundo tampão de lavagem contendo um álcool e um aminoácido;
iv) empregar um terceiro tampão de lavagem contendo alta concentração de sal;
v) empregar um quarto tampão de lavagem contendo baixa concentração de sal;
vi) empregar um tampão de eluição contendo uma combinação de um álcool e alta concentração de sal.
Em ainda outra modalidade da invenção, os tampões empregados são como se segue:
i) tampão de equilíbrio e carregamento contendo tri-n-butilfosfato e/ou Triton X-100 em uma concentração que varia entre aproximadamente 0,1 a cerca de 10% (w/w);
ii) o segundo tampão de lavagem contém etilenoglicol e/ou lisina/arginina, variando de aproximadamente 5 a cerca de 30% (w/w) de etilenoglicol e de 0,2 a cerca de 1,5 M de lisina/arginina;
iii) o terceiro tampão de lavagem contém cloreto de sódio em uma concentração variando entre aproximadamente 0,5 a cerca de 4 M, em particular de aproximadamente 0,5 a cerca de 1,5 M;
iv) o quarto tampão de lavagem contém cloreto de sódio em concentração variando de aproximadamente 0,01 a cerca de 0,2, em particular de 0,01 a cerca de 0,1 M;
v) o tampão de eluição contém etilenoglicol e/ou cloreto de sódio variando na concentração de aproximadamente 25 a cerca de 75% (w/w), em particular de aproximadamente 25 a cerca de 50% de etilenoglicol e de aproximadamente 0,5 a cerca de 4 M de NaCl.
Em uma modalidade adicional da presente invenção, as condições cromatográficas compreendem pelo menos duas das seguintes etapas:
i) tampão de carregamento e equilíbrio contendo tri-n-bitilfosfato e/ou Triton X-100 em uma concentração variando de 0,3 - 5% (w/w);
ii) lavar com >10 volumes de coluna de um segundo tampão de lavagem contendo etilenoglicol e/ou lisina/arginina, variando de 10-25% (w/w) de EG e 0,3-1,0 M de lisina/arginina;
iii) lavar com >10 volumes de coluna de um terceiro tampão de lavagem contendo cloreto de sódio em uma concentração variando de 0,81,5 M;
iv) lavar com > 10 volumes de coluna de um quarto tampão de lavagem contendo cloreto de sódio em concentração variando de 0,03-0,15 M;
v) o tampão de eluição contém etilenoglicol e/ou cloreto de sódio variando em concentração de 35-65% (w/w) para EG e 0,8-3,0 NaCl.
Em outra modalidade da invenção os tampões são empregados como se segue:
i) tampão de carga e equilíbrio contendo tri-n-bitilfosfato e/ou Triton X-100 em uma concentração variando de 0,8-1,2% (w/w);
ii) lavar com > 20 volumes de coluna de um segundo tampão de lavagem contendo etilenoglicol e/ou lisina/arginina variando de 18-22% (w/w) de EG e 0,4-0,6 M de lisina/arginina;
iii) lavar com > 20 volumes de coluna de um terceiro tampão de lavagem contendo cloreto de sódio em uma concentração que varia de 0,81,2 M;
iv) lavar com > 20 volumes de coluna de um quarto tampão de lavagem contendo cloreto de sódio em uma concentração variando de 0,080,12 M;
v) o tampão de eluição contém etilenoglicol e/ou cloreto de sódio variando em concentração de 45-55% (w/w) para EG e 1,3-1,7 NaCl.
A vantagem de aplicar tampões de lavagem de tipos diferentes é que aumenta a possibilidade dos príons de tipos diferentes e que se ligam devido a interações diferentes à resina ou à proteína-alvo poderem ser removidos. Também aumentando a quantidade do respectivo tampão de lavagem (isto é, um volume de coluna é igual ao volume da resina) a segurança de qualquer príon de lenta ação (slowacting) restante no tampão aplicado pode ser aumentada.
O material multimodal cromatográfico pode conter:
i) um ligante N-benzil-N-metila etanolamina de carga positiva;
ii) um ligante ácido butanoico 2-(benzoilamino) de carga negativa;
iii) um ligante fenilpropila;
iv) um ligante N-hexila;
v) um ligante 4-mercapto-etil-piridina;
vi) um ligante ácido benzoico 3-[{3-metil-5((tetra-hidrofurano-2ilmetil)amino)-fenil}amino],
O assunto da presente invenção é também uma fração depletada de proteína príon de uma proteína isolada das fontes contendo proteína potencialmente infecciosa. A fração contém proteínas farmaceuticamente aplicáveis obtidas de acordo com o método da invenção.
Em proteína particular as frações são reivindicadas compreendendo proteínas plasmáticas, hormônios peptídicos, fatores de crescimento, citocinas e proteínas imunoglobulinas policlonais, proteínas plasmáticas selecionadas dos fatores de coagulação do sangue humano e de animal, incluindo fibrinogênio, protrombina, trombina, complexo de protrombina, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII e FXIIIa, fator de von Willebrandt, proteínas de transporte incluindo albumina, transferrina, ceruloplasmina, haptoglobina, hemoglobina e hemopexina, inibidores da protease incluindo β-antitrombina, α-antitrombina, a2-macroglobulina, Cl-inibidor, inibidor da via do fator tecidual (TFPI), cofator II da heparina, inibidor da proteína C (PAI-3), proteína C e proteína S, proteínas inibidoras de a-1 esterase, a-1 antitripsina, proteínas antiangionéticas incluindo antitrombina latente, proteínas altamente glicosiladas incluindo α-1-glicoproteína ácida, antiquimotripsina, inibidor da inter-a-tripsina, α-2-HS glicoproteína e proteína C-reativa e outras proteínas incluindo glicoproteína rica em histidina, lectina de ligação a mannmman, proteína C4 de ligação, fibronectina, GC-globulina, plasminogênio, fatores sanguíneos como eritromopoeitina, interferon, fatores tumorais, tPA, yCSF.
A invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos nãolimitantes.
Exemplos
Exemplo 1
Coluna e resina
Coluna Tricorn (GE Healthcare, Suécia, a área do corte transversal: 0,2cm2, diâmetro de 0,5 cm) foi preenchida com resina Capto MMC (GE Healthcare Cat. Não. 17-5317-10, lote N° 308581), 9 cm de altura do leito, volume da coluna: 1,8 ml.
Material de partida
Uma mistura de proteínas recombinantes derivadas de células HEK 293 e concentrada ao longo de uma etapa de coluna de captura foi usada como material de partida (número do lote: BPP 047 SP eluído, 117 pg de proteína/ml).
Composições tampão*
Tampão 1 (tampão de equilíbrio com S/D adicionado)
0,3 M de NaCI, 0,01 M de CaCI2 (2xH2O), 0,01 M de L-histidina, 1% w/w de Triton X-100, 0,3% w/w de TNBP, pH: 7,0 ± 0,1, condutividade: 29 ± 3 mS/cm2 a +25° C
Tampão 2 (tampão de equilíbrio sem S/D)
0,3 M de NaCI, 0,01 M de CaCI2 (2xH2O), 0,01 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, pH: 6,5 ± 0,1, condutividade: 31 ± 3 mS/cm2 a +25° C
Tampão 3 (Lavagem 1; Lisina & Etilenoqlicol (=EG))
0,3 M de NaCI, 0,01 M de CaCI2 (2xH2O), 0,01 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, 0,5 M de monocloreto de L-lisina, 20% (w/w) de etilenoglicol (=EG), pH: 6,5 ± 0,1, condutividade: 37 ± 3 mS/cm2 a +25° C. Tampão 4 (Lavagem 2; lavagem com alta concentração de sal)
1,0 M de NaCI, 0,05 M de CaCI2 (2xH2O), 0,05 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, pH: 6,5 ± 0,1, condutividade: 89 + 5 mS/cm2 a +25° C. Tampão 5 (Lavagem 3: lavagem com baixa concentração de sal)
0,1 M de NaCI, 0,01 M de CaCI2 (2xH2O), 0,01 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, pH: 6,5 ±0,1, condutividade: 13 + 3 mS/cm2 a +25° C. Tampão 6 (tampão de eluição)
1,5 M de NaCI, 0,02 M de CaCI2 (2xH2O), 0,02 M de L-histidina,
0,02% (w/w) de Tween 80, 50% (w/w) de etilenoglicol (EG), pH: 6,5 ± 0,1 (ajuste de pH antes da adição do EG), condutividade; 39 ± 3 mS/cm2 a 25° C, medida após a adição do EG.
Tampão 7 (tampão de regeneração)
1M de hidróxido de sódio
Para o ajuste do pH:
M de HCl * Os tampões foram preparados em uma relação de 1 kg de adição água ao invés de 1 L como um volume final. Isto terá um impacto pe10 queno nas molaridades finais, já que os aditivos aumentarão ligeiramente o volume final.
Condições cromatográficas:
Tabela 1: esquematizando as quantidades aproximadas do tampão aplicado, as taxas de fluxo expressadas em ml/min, bem como em cm/hora. O tempo necessário para cada etapa do tampão e tempo de contato com o gel para a solução proteica também é mostrado.
| Execução de Capto MMC | ||||||
| Volume da coluna =(ml) | 1,8 | |||||
| Bloco | N° VC | ml | Fluxo ml/min | Fluxo cm/h | Tempo (min) | Tempo de contato (min) |
| Tampão de equilíbrio+ SD | 5 | 9 | 1,00 | 306 | 9 | 1,8 |
| Feed da amostra | 27 | 48 | 1,00 | 306 | 48 | 1,8 |
| Equilíbrio - SD | 10 | 18 | 1,00 | 306 | 18 | 1,8 |
| Lisina + lavagem com EG | 20 | 35 | 0,60 | 183 | 59 | 2,9 |
| Lavagem com alta concentração de sal | 10 | 18 | 1,88 | 3,6 | 18 | 1,8 |
| Lavagem com baixa concentração de sal (começa fluxo ascendente) | 5 | 9 | 1,00 | 306 | 9 | 1,8 |
| Tampão de eluição, 1,5M de NaCl | 7 | 12 | 0,20 | 61 | 62 | 8,8 |
A resina MMC preenchida em uma coluna Tricorn com uma altura de leito de aproximadamente 9 cm. A etapa cromatográfica foi monitorada para condutividade e a 280nm. A carga proteica foi de aproximadamente 3mg em relação a 1 ml de resina.
Primeiro, a coluna foi devidamente equilibrada com tampão de equilíbrio contendo S/D químicos até ser obtida uma linha de base estável. O material de partida foi adicionado de S/D químicos na proporção de 14 g de estoque S/D por kg para obter a mesma concentração do tampão de equilíbrio, isso foi agitado por pelo menos 10 minutos antes da aplicação da solução proteica na coluna. As frações dos seguintes tampões foram coletadas e analisadas para a proteína total (e príons nos experimentos spiking da PrPsc). O perfil cromatográfico medido a uma absorbância de 280nm pode ser visto no apêndice 2:
• Flow through (Tampão 1 + proteínas) • Tampão 1 (tampão de detergente não-iônico alto; 0,3 M de NaCl, 0,01 M de CaCb, 0,01 M de L-histidina, 1% w/w de Triton X-100, 0,3% w/w de TNBP, pH: 7,0) • Tampão 2 (tampão de detergente não-iônico baixo; 0,3 M de NaCl, 0,01 M de CaCI2, 0,01 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80 pH 6,5) • Tampão 3 (tampão de aminoácido / álcool; 0,3 M de NaCl, 0,01 M de CaCI2, 0,01 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, 0,5 M de monocloreto de L-lisina, 20% (w/w) de etilenoglicol, pH 6,5) • Tampão 4 (tampão com alta concentração de sal; 1,0 M de NaCl, 0,05 M de CaCI2, 0,05 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, pH: 6,5) • Tampão 5 (tampão com baixa concentração de sal; 0,1 M de NaCl, 0,01 M de CaCI2, 0,01 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, pH: 6,5) • Tampão 6 (tampão com alta concentração de sal / álcool) 1,5 M de NaCl, 0,02 M de CaCI2, 0,02 M de L-histidina, 0,02% (w/w) de Tween 80, 50% (w/w) de etilenoglicol (EG), pH: 6,5 • Tampão 7 (tampão de regeneração; 2M de NaCl)
A coluna foi regenerada com 20 volumes de coluna de 1 M de
NaOH e armazenada em 20% (v/v) de etanol para uso posterior.
Resultados
Tabela 2 (detecção da proteína total no experimento sem príons)
| Amostra | Volume da amostra (ml) | Proteína total ug/ml | Proteína total mg | Proteína total % |
| Material de partida (amostra de carga) | 47 | 117 | 5,5 | 100 |
| Flow through (tampão 1) | 40 | na | na | na |
| Tampão 2 | 20 | na | na | na |
| Tampão 3 | 40 | 17,9 | 0,7 | 13% |
| Tampão 4 | 20 | 10,7 | 0,2 | 4% |
| Tampão 5 | 10 | 13,6 | 0,1 | 2% |
| Tampão 6 | 9 | 150 | 1,4 | 25% |
| Tampão 7 | 18 | na | na | na |
na = Não-analisado devido à interferência do tampão com o método analítico da proteína total
Exemplo 2 (experimento de adição do príon)
Para ser capaz de determinar a remoção da proteína príon do 10 procedimento cromatográfico descrito no exemplo 1, foi realizado um experimento de adição do príon. Foi usada a mesma coluna, resina, tampões e material de partida como no exemplo 1.
Infectividade da proteína príon do material de partida
Uma fração microssomal / citosólica da linhagem 263K do scrapie 15 adaptado do hamster foi usada neste experimento.
Aproximadamente 54 g do material de partida da proteína (o mesmo do exemplo 1; número do lote: BPP 047 SP eluato), contendo 117 ug/ml de proteína, foram descongelados em banho-maria a 25° C e aquecidos a uma temperatura de 24.0°C (alvo: 20-25°C). 51,12 g (alvo: 50 ± 2 g) do material de partida foram, então, pesados e adicionados (spiked) com
2,6 ml (alvo: 2,5 ± 0,2 ml) da fração microssomal / citosólica a uma concen21 tração final de 5,1%. O pH do material de partida adicionado foi verificado para ter 6,994 (alvo: 7,0 ± 0,1). Uma alíquota de 6 ml foi então removida, dividida em partes iguais e armazenados a <-60°C (material de partida da amostra adicionado - SSM).
1,955 g de Triton X-100 foram misturados com 0,582 g de TnBP (proporção alvo: 10 partes + 3 partes, determinação por peso) e agitados por 36 min. 0,665 g do reagente S/D foi então imediatamente adicionado ao restante 47,72 g do material de partida adicionado (proporção alvo: 14 g do reagente S/D por kg do material de partida adicionado) e agitados por 31 min. A temperatura do material de partida foi verificada para ter 24,5° C no início e 23,7° C no final da fase de agitação (faixa alvo: 18-25° C).
Etapa cromatográfica
A coluna de 1,8 ml Tricorn da GE Healthcare preenchida com resina Capto MMC (VC = 1,0 ml, altura do leito = 9 cm) foi equilibrada com 8,3 VC do tampão 1 (tampão de equilíbrio com S/D) a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min (alvo: 5 VC a 1,0 ml/min). 47,29 g do material de partida adicionado tratado com S/D foram então carregados na coluna, aplicando uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min (alvo: 45 ± 2 g a 1,0 ml/min). Seguindo o carregamento, a coluna foi lavada com 10,0 VC do tampão 2 (tampão de equilíbrio sem S/D) com uma taxa de fluxo de 0,8 ml/min (alvo: 10 VC a 1,0 ml/min). A coleta do flow through começou quando o sinal UV começou a subir e foi mantido até a absorbância começar a cair. O peso da fração do flow through foi determinado (peso real: 48,23 g), uma alíquota de 16 ml foi removida, dividida em partes iguais e armazenada a £-60°C (amostra flow through - FT). A fração de lavagem 1 foi coletada durante a lavagem com tampão 2. O peso real dessa fração foi determinado em 12,75 g e uma alíquota de 12 ml foi removida e armazenada a £-60 °C (amostra da lavagem 1-W1).
A coluna foi então lavada com 22,2 VC do tampão 3 (lavagem com lisina & etilenogiicol) a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min (alvo: 20 VC a 0,6 ml/min). Durante a lavagem com tampão 3, a fração de lavagem 2 foi coletada e o peso real dessa fração determinado em 40,35 g. Uma alíquota de 16 ml foi removida e armazenada a £-60 °C (amostra da lavagem 2-W2).
Durante a lavagem, a coluna com 10,0 VC de tampão 4 (lavagem com alta concentração de sal) a uma taxa de fluxo de 0,9 ml/min (alvo: 10 VC a 1,0 ml/min), a fração de lavagem 3 foi coletada. Um peso real de 18,48 g foi determinado, uma alíquota 16 ml foi então removida, dividida em partes iguais e armazenada a <-60°C (amostra de lavagem 3 - W3).
Durante a lavagem, a coluna com 5,0 VC de tampão 5 (lavagem com baixa concentração de sal) a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min (alvo: 5 VC a 1 ml/min), a fração de lavagem 4 foi coletada. O peso real dessa fração foi em 12,22 g. Uma alíquota de 11,5 ml foi removida e armazenada a <10 60 °C (amostra de lavagem 4-W4).
O produto foi então eluído com 8,3 VC de tampão 6 (tampão de eluição), aplicando uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min (alvo: 7 VC a 0,2 ml/min). A coleta do eluato foi realizada durante todo o período de lavagem da coluna com tampão 6. O peso real da fração do eluato foi determinado em 13,54 g, uma alíquota de 12,5 ml foi removida e armazenada a <-60°C (amostra do eluato - E).
Durante a regeneração da coluna com 9,4 VC de tampão 7 (tampão de regeneração) a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min (alvo: 20 VC a 0,6 ml/min), a fração de regeneração foi coletada. Um peso real de 17,97 ml foi determinado, uma alíquota de 16 ml removida e armazenada a <-60°C (amostra de regeneração - Reg).
Tabela 3 (Resultado do experimento de adição do príon)
| Amostra | Volume da amostra (ml) | Conteúdo da PrPsc Log10 | Conteúdo da Prpsc o/o |
| Material de partida (amostraSSM) | 54 | 4,67 | 100 |
| Flow through, tampão 1 (amostra- FT) | 48 | 4,68 | 102 |
| Tampão 2 (amostra- W1) | 13 | 3,61 | 9,5 |
| Tampão 3 (amostra- W2) | 40 | 2,61 | 0,9 |
| Amostra | Volume da amostra (ml) | Conteúdo da PrPsc Log10 | Conteúdo da PrPsc % |
| Tampão 4 (amostra- W3) | 18 | <1,27 | <0,04 |
| Tampão 5 (amostra- W4) | 12 | <1,09 | <0,03 |
| Tampão 6 (amostra- E) | 14 | <1,13 | <0,03 |
| Tampão 7 (amostra- Reg) | 18 | <1,26 | <0,04 |
Discussão
Como pode ser visto na tabela 3 e no apêndice 1 (figura 1-5) os valores de remoção excelentes da proteína príon podem ser vistos para as frações tampão 4-7. Assim, os produtos proteicos, que são eluídos dentro destas frações, teriam uma margem de segurança muito boa em relação à remoção da PrPsc. O que também é muito importante é que o equilíbrio de massa da proteína príon aplicada indica que nenhuma PrPsc pode ser encontrada em outras frações do que no flow through e no tampão de lavagem inicial. Para nosso conhecimento, isso não foi mostrado previamente na técnica anterior. Nos exemplos publicados de resinas cromatográficas, como etapa de remoção da proteína príon, mesmo que os valores de redução da proteína príon relativamente aceitáveis forem alcançados, as proteínas príon podem ser normalmente encontradas em várias frações, antes e depois de tomar cuidado da fração do produto, indicando um risco de contaminação cruzada.
Descrição da análise
Determinação da proteína total de acordo com Bradford A determinação da proteína de acordo com Bradford é baseada na observação que o máximo de absorbância de uma solução ácida de Coomassie Brilliant Blue G-250 muda de 465 nm a 595 nm, quando ocorre a ligação à proteína. Ambas as interações hidrofóbicas e iônicas estabilizam a forma aniônica do corante, causando uma mudança visível de cor. O ensaio é útil desde que o coeficiente de extinção de uma solução do complexo al24 bumina-corante seja constante em uma faixa de concentração de 10 vezes. Para mais informações ver também Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.
Ensaio de Western Blot para a detecção da PrPsc
O ensaio de Western blot é uma determinação semiquantitativa da proteína príon (PrPsc) associada a Scrapie resistente à proteinase K.
O ensaio de Western blot foi realizado como descrito por DC Lee et al., Journal of Virological Methods de 2000; 84:77-89.
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1. Processo de isolamento e purificação de uma proteína-alvo por cromatografia, em que a cromatografia remove ou depleta os príons (PrPsc), caracterizado por compreender as etapas de:5 - colocar uma amostra da PrPsc potencialmente contaminada compreendendo uma proteína-alvo em contato com uma única resina de cromatografia multimodal, em que a resina de cromatografia multimodal compreende um suporte sólido ao qual um ligante ácido butanoico 2(benzoilamino) carregado negativamente está ligado por um grupo de ligação, em10 que o grupo de ligação compreende um átomo de enxofre, e em que a única resina de cromatografia multimodal pode interagir com a proteína-alvo através de uma combinação de interações hidrofóbicas e iônicas, em que as interações hidrofóbicas podem ocorrer através do grupo benzoilamino do ligante ácido butanoico 2-(benzoilamino) carregado negativamente e/ou do grupo de ligação;15 - ajustar as condições do tampão para que a proteína-alvo seja ligada à única resina cromatográfica multimodal e considerando que a PrPsc não seja vinculada à única resina cromatográfica multimodal; e- seguido pela eluição da proteína-alvo a partir da única resina de cromatografia multimodal.
- 2 0 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proteína-alvo ser eluída após a eluição do príon- corrigindo a força iônica do tampão de eluição, aumentando ou diminuindo a força iônica,- adicionando álcoois ao tampão de eluição - em particular, em2 5 solução aquosa - como mono ou di-hidroxialcanóis, por exemplo, álcoois alifáticos menores, tais como o metanol, o etanol, o propanol, e/ou- corrigindo o valor do pH do tampão de eluição, aumentando ou diminuindo o pH.
- 3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações30 precedentes, caracterizado pelo valor de remoção da proteína príon na fração daPetição 870180053557, de 21/06/2018, pág. 10/15 proteína compreendendo a proteína-alvo ser > 1 a 4 lg(10), conforme calculado da quantidade que foi inicialmente aplicada à resina.
- 4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo valor analítico da proteína príon na fração da
- 5 proteína de interesse estar abaixo do limite de detecção do ensaio de Western Blot do príon.5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelas condições cromatográficas compreenderem pelo menos duas das seguintes etapas:10 i) empregar um tampão de carregamento e equilíbrio contendo um solvente e/ou um detergente não-iônico;ii) empregar um tampão de lavagem sem um solvente e/ou um detergente não-iônico;iii) empregar um tampão de lavagem contendo um álcool e/ou 15 um aminoácido;iv) empregar um tampão de lavagem contendo uma alta concentração de sal;v) empregar um tampão de lavagem contendo uma baixa concentração de sal;2 0 vi) empregar um tampão contendo uma combinação de álcool e uma alta concentração de sal.
- 6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelas condições cromatográficas compreenderem pelo menos duas das seguintes etapas:25 i) empregar um tampão de carregamento e equilíbrio contendo um solvente e/ou um detergente não-iônico;ii) empregar um primeiro tampão de lavagem, que é um tampão sem um solvente e um detergente não-iônico;iii) empregar um segundo tampão de lavagem contendo um álco30 ol e um aminoácido;Petição 870180053557, de 21/06/2018, pág. 11/15 iv) empregar um terceiro tampão de lavagem contendo alta concentração de sal;v) empregar um quarto tampão de lavagem contendo baixa concentração de sal;vi) empregar um tampão de eluição contendo uma combinação de um álcool e alta concentração de sal.
- 7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por:i) o tampão de equilíbrio e carregamento contendo tri-n-butil fosfato e/ou Triton X-100 em uma concentração de 0,1 a 10% (w/w);ii) o segundo tampão de lavagem contém etilenoglicol e/ou lisina/arginina, de 5 a 30% (w/w) de etilenoglicol e de 0,2 a 1,5 M de lisina/arginina;iii) o terceiro tampão de lavagem contém cloreto de sódio em uma concentração de 0,5 a 4 M, em particular de 0,5 a 1,5 M;iv) o quarto tampão de lavagem contém cloreto de sódio em uma concentração de 0,01 a 0,2, em particular de 0,01 a 0,1 M;v) o tampão de eluição contém etilenoglicol e/ou cloreto de sódio de 25 a 75% (w/w), em particular de 25 a 50% de etilenoglicol e de 0,5 a 4 M de NaCI.
- 8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pela proteína ser selecionada de um grupo que consiste em proteínas plasmáticas, hormônios peptídicos, fatores de crescimento, citocinas e proteínas imunoglobulinas policlonais, proteínas plasmáticas selecionadas dos fatores de coagulação do sangue humano e de animal, incluindo fibrinogênio, protrombina, trombina, complexo de protrombina, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII e FXIIIa, fator de von Willebrandt, proteínas de transporte incluindo albumina, transferrina, ceruloplasmina, haptoglobina, hemoglobina e hemopexina, inibidores da protease incluindo β-antitrombina, α-antitrombina, a2-macroglobulina, Cl-inibidor, inibidorPetição 870180053557, de 21/06/2018, pág. 12/15 da via do fator tecidual (TFPI), co-fator II da heparina, inibidor da proteína C (PAI3), proteína C e proteína S, proteínas inibidoras de α-1 esterase, α-1 antitripsina, proteínas antiangionéticas incluindo antitrombina latente, proteínas altamente glicosiladas incluindo α-1-glicoproteína ácida, antiquimotripsina, inibidor da inter-α5 tripsina, α-2-HS glicoproteína e proteína C-reativa e outras proteínas incluindo glicoproteína rica em histidina, lectina de ligação a mannmman, proteína C4 de ligação, fibronectina, GC-globulina, plasmino- gênio, fatores sanguíneos como eritromopoeitina, interferon, fatores tumorais, tPA, yCSF.Petição 870180053557, de 21/06/2018, pág. 13/15
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