BRPI0815008B1

BRPI0815008B1 - vacinas multiméricas com múltiplos epítopos contra influenza

Info

Publication number: BRPI0815008B1
Application number: BRPI0815008-7A
Authority: BR
Inventors: Ben-Yedidia Tamar; Singer Yossi
Original assignee: Biondvax Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2008-08-03
Publication date: 2019-11-19
Also published as: ES2539818T3; PL2173376T3; US20140286982A1; CN101795709B; EA201070219A1; EP2173376A2; EP2173376B1; HRP20150479T1; EA017887B1; HUE025149T2; CA2695399A1; MX2010001284A; BRPI0815008B8; JP5654345B2; AU2008281384A1; WO2009016639A3; US9353159B2; JP2010535026A; HK1142809A1; PT2173376E

Abstract

vacinas multiméricas com múltiplos epítopos contra influenza a presente invenção se refere a vacinas mul timéricas baseadas em peptídeos com múltiplos epítopos. em particular, a presente invenção se refere ao uso de vacinas multirnéricas baseadas em peptídeo com múltiplos epítopos que estimulam imunidade protetora contra influenza.

Description

MULTIMÉRICAS COM MÚLTIPLOS EPÍTOPOS CONTRA INFLUENZA

CAMPO DA INVENÇÃO

Ά presente invenção se refere à vacinas multiméricas baseadas em peptideos com múltiplos epitopos. Em particular, a presente invenção se refere ao uso de vacinas multiméricas baseadas em peptideos com múltiplos epitopos que estimulam imunidade protetora à influenza.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Vacinas com múltiplos epitopos

Sabe-se que epitopos de células B, epitopos de células T auxiliares e epitopos de linfócitos T citotóxicos exercem papéis importantes nessas duas respostas imunes. Obviamente, respostas humorais e celulares de amplo espectro e longa duração serão induzidas pela vacinação eficaz. Não existem vacinas de amplo espectro e eficazes contra virus com altas taxas de mutação, tais como o virus da influenza e virus da imunodeficiência humana.

Há uma relação intima entre a dose de antigeno e a eficiência da resposta de células B especifica. Estudos usando uma proteína veiculo quimicamente acoplada e um sistema peptídico de epítopo, consistindo de uma mesma quantidade de proteína veículo acoplada a quantidades variáveis de peptídeo de epítopo, mostraram que a densidade de epitopo afetou dramaticamente as respostas de IgG dependentes de células T auxiliares (Jegerlehner e colaboradores, Eur J Immunol. 2002, 32: 3305-14). Liu e colaboradores (Vaccine, 2004, 23(3): 366-71) observaram um efeito positivo da densidade de epitopo sobre a resposta humoral de camundongos e coelhos imunizados com proteínas de fusão de glutationa-S-transferase trazendo vários números de cópias do epitopo peptídico M2e (1, 2, 4, 8 e 16 cópias) da proteína M2 do vírus da influenza. No mesmo estudo, um ensaio de estimulação letal mostrou que a proteína de fusão com as maiores densidades de epitopo resultou em taxas de sobrevivência maiores e perdas de peso menores.

Vacinas com múltiplos epítopos, isto é, vacinas compreendendo mais de um epitopo, foram desenvolvidas para uma ampla variedade de aplicações. Uma lista não exaustiva de exemplos inclui, por exemplo, uma vacina multivalente recombinante para bactérias estreptocócicas divulgada na Pat. U.S. No. 6.063.386; uma vacina para o tratamento de malária, a qual compreende uma única proteína compreendendo peptídeos derivados de diferentes estágios do ciclo de vida do parasita Plasmodium falciparum, divulgada na Pat. U.S. No. 6.828.416; composições imunogênicas anti-tumor compreendendo um polipeptídeo compreendendo epítopos antigênicos de células tronco de próstata divulgadas no Pedido de Pat. US 2007/0056315; e vacinas anti-virais com múltiplos epitopos contra HIV (Publicação Internacional WO 01/24810), vírus da rubéola (veja Publicação Internacional 5 WO 93/14206) e vírus da Hepatite C (Publicação Internacional WO 01/21189).

A Publicação Internacional WO 2006/069262 divulga composições, proteínas de fusão e polipeptídeos compreendendo Padrões Moleculares Associados a Patógenos 10 (PAMP) e epitopos de proteínas virais de influenza usados para estimular respostas imunes em um indivíduo. PAPMs são motivos moleculares (por exemplo, proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, carboidratos, lipídios) encontrados em microorganismos os quais podem disparar uma resposta imune 15 inata em um hospedeiro, isto é, atuar como adjuvante. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão incluem múltiplas cópias do epítopo de influenza M2e. A Publicação Internacional WO 2006/078657 divulga proteínas de fusão similares e polipeptídeos compreendendo um ou mais PAMPs e 20 múltiplos epitopos de proteínas flavivirais.

Influenza

A influenza é uma doença causada por vírus de três subtipos principais, Influenza A, B e C, os quais são classificados de acordo com seus determinantes antigênicos.

O virion de influenza consiste de um genoma de RNA fita simples intimamente associado com uma nucleoproteina (NP) e

envolvido	por	um envelope	de	lipoproteína revestido por
proteína	de	matriz (Ml)	e	trazendo dois principais
antígenos	de	glicoproteína	na	superfície, hemaglutinina

(HA) e neuraminidase (NA) . As glicoproteinas HA e NA são mais suscetíveis à alterações; por exemplo, existem 16 classes imunes de HA e 9 diferentes classes de NA que proporcionam a base para os diferentes subtipos de vírus da influenza, tais como H1N1 ou H3N2. O vírus da influenza A tem uma glicoproteína transmembrana adicional, M2, a qual é altamente conservada entre os diferentes subtipos de HN. O gene de M2 codifica uma proteína tendo 96-97 aminoácidos que é expressa como um tetrâmero sobre a superfície celular do virion. Ela é composta de cerca de 24 aminoácidos extracelulares, cerca de 19 aminoácidos transmembrana e cerca de 54 resíduos citoplásmicos (Lamb e colaboradores, Cell. 1985; 40: 627-633).

Os vírus da influenza A e B são as causas mais comuns de influenza no homem. A influenza tem um enorme impacto sobre a saúde pública, com graves implicações econômicas, além de problemas de saúde devastadores, incluindo morbidade e mesmo mortalidade. A infecção pode ser branda, moderada ou grave, oscilando de assintomática até infecção do trato respiratório superior branda e traqueobronquite a pneumonia viral grave, ocasionalmente letal. Vírus da influenza têm duas características imunológicas importantes que representam um desafio ao preparo de uma vacina. A primeira se refere à alterações genéticas que ocorrem nas glicoproteínas na superfície a cada poucos anos, referida como variação antigênica. Essa alteração antigênica produz vírus que escapam da resistência estimulada pelas vacinas existentes. A segunda característica de grande preocupação para a saúde pública é que vírus da influenza, em particular o vírus da influenza A, podem trocar material genético e se misturar. Esse processo, conhecido como desvio antigênico, resulta em novas cepas diferentes de ambos os vírus parentais, as quais podem ser cepas pandêmicas letais.

Antigenos do virus da influenza e produção de vacina

A imunização contra o vírus da influenza é limitada pela variação antigênica do vírus e pela restrição da infecção às membranas mucosas respiratórias. As vacinas contra influenza atualmente disponíveis são baseadas em vírus inativo inteiro, sobre proteínas virais presentes sobre a superfície de células bacterianas ou sobre flagelina trazendo determinantes antigênicos virais. HA é um forte imunogênio e é o antígeno mais significativo na definição da especificidade sorológica das diferentes cepas virais.

A molécula de HA (75-80 kD) compreende uma pluralidade de determinantes antigênicos, vários dos quais estão em regiões que sofrem alterações de sequência em diferentes cepas (determinantes específicos de cepa) e outros em regiões as quais são conservadas em muitas moléculas de HA (determinantes em comum). Em virtude dessas alterações, vacinas contra a gripe precisam ser modificadas pelo menos a cada poucos anos.

Muitos antígenos de influenza e vacinas preparadas a partir dos mesmos são conhecidos na técnica. A Patente US 4.474.757 divulga uma vacina contra infecções pelo vírus da influenza consistindo de um peptídeo sintético correspondendo a um fragmento antigênico de HA preso a um veículo macromolecular adequado, tal como polímeros de aminoácidos ou toxóide do tétano.

A Publicação Internacional PCT WO 93/20846 para alguns dos inventores da presente invenção ensina uma vacina recombinante sintética contra uma pluralidade de diferentes cepas do vírus da influenza compreendendo pelo menos uma proteína recombinante compreendendo a sequência de aminoácido da flagelina e pelo menos uma sequência de aminoácido de um epítopo de HA ou NP do vírus da influenza ou um agregado da referida proteína quimérica. Seguindo essa abordagem, descobriu-se que uma vacina anti-influenza recombinante sintética baseada em três epítopos é altamente eficiente em camundongos. As vacinas exemplificadas incluíam quimeras de flagelina compreendendo o epítopo 91108 de HA, um epítopo de célula B da HA o qual é conservado em todas as cepas H3 e estimula anticorpos de neutralização anti-influenza, junto com um ou mais epítopos NP Tauxiliares ou CTL (NP 55-69 e NP 147-158, respectivamente), os quais induzem à respostas imunes restritas a MHC. Uma vacina compreendendo uma combinação das três quimeras mencionadas acima foi considerada como proporcionando a melhor proteção à infecção viral.

A Patente US No. 6.740.325 para alguns dos inventores da presente invenção ensina uma vacina contra influenza baseada em peptídeo sintético humano compreendendo pelo menos quatro epítopos do vírus da influenza, os referidos epítopos do vírus da influenza sendo reativos com células humanas, os referidos epítopos compreendendo:

(i) um epítopo de hemaglutinina (HA) de célula B; (ii) um epítopo de hemaglutinina (HA) ou nucleoproteína (NP) T-auxiliar que pode se ligar à muitas moléculas de HLA; e (iii) pelo menos dois epítopos de proteína da matriz (M) ou nucleoproteína (NP) de linfócito citotóxico (CTL) que estão restritos às moléculas de HLA mais prevalentes em diferentes populações humanas, em particular grupos étnicos ou raciais específicos. Os epítopos peptídicos de influenza podem ser expressos dentro da flagelina de Salmonella recombinante. Essa vacina requer o preparo complicado de pelo menos quatro polipeptídeos quiméricos.

A Publicação Internacional PCT WO 2007/066334, para alguns dos inventores da presente invenção, divulga uma vacina capaz de estimular proteção a longo prazo e cepacruzada compreendendo uma pluralidade de proteínas quiméricas compreendendo pelo menos dois epítopos peptídicos do vírus da influenza, em que pelo menos um epítopo é um epítopo peptídico de proteína da matriz M do vírus da influenza A e o segundo epítopo é um epítopo peptídico de hemaglutinina HA. Nessa caso também, os epítopos peptídicos da influenza podem ser expressos dentro da flagelina recombinante de Salmonella.

Mamíferos frequentemente têm respostas imunes adquiridas a antígenos flagelares. Contudo, dados clínicos mostraram que doses eficazes de flagelina recombinante em animais têm efeitos adversos em seres humanos, incluindo febre alta, provavelmente em virtude da alta proporção de flagelina/antígeno. Também se suspeita que altas concentrações de flagelina têm um efeito transitório sobre o coração.

Assim, há uma necessidade não reunida por uma vacina baseada em epitopo peptidico de influenza a qual pode induzir respostas humorais e celulares de longa duração com ampla especificidade. Há também a necessidade de uma vacina com processos de produção simplificados e processos de controle de qualidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona vacinas contra influenza que superam as deficiências de vacinas conhecidas contra a influenza, incluindo os efeitos adversos de alta proporção de veiculo para antigeno e alta proporção de adjuvante para antigeno. A vacina da presente invenção compreende polipeptídeos compreendendo múltiplas cópias de uma pluralidade de epitopos peptidicos do virus da influenza, proporcionando uma vacina com multi diversidade, de alta densidade. De acordo com a presente invenção, o polipeptideo multimérico com múltiplos epitopos pode ser produzido recombinantemente, como um polipeptideo isolado ou como uma proteína de fusão ou sinteticamente ligando uma pluralidade de peptídeos sintéticos ou pode ser misturada ou formulada com um adjuvante externo.

Polipeptídeos multiméricos da invenção contêm uma combinação de epitopos de célula B do vírus da influenza, epitopos T-auxiliares e epitopos de linfócito citotóxico (CTL). Os epitopos são, de preferência, selecionados de peptideos de hemaglutinina (HA), peptideos de proteína da matriz (Ml e M2) e peptideos de nucleoproteína (NP) . Os epitopos têm uma atividade de proteção cruzada demonstrável contra vários subtipos de influenza humana e são escolhidos com relação à sua capacidade aprimorada de induzir a uma resposta imune celular e humoral.

Surpreendentemente, descobriu-se que vários polipeptideos multiméricos de acordo com a invenção são ativos ao estimular uma resposta imune mesmo sem serem acoplados a ou sem serem parte de uma proteína veiculo. Além disso, em virtude da alta densidade e da variedade dos epitopos imunogênicos conferidos pelo polipeptídeo, a vacina estimula uma forte resposta imune, mesmo sem a necessidade de um adjuvante. Adicionalmente, a inclusão de um grande número de diferentes epitopos imunogênicos em um único polipeptídeo facilita procedimentos de produção e controle de qualidade.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo sintético ou recombinante compreendendo uma pluralidade de epitopos peptídicos do vírus da influenza presentes pelo menos duas vezes em um único polipeptídeo. Dentro do contexto da presente invenção, um polipeptídeo multimérico é um polipeptideo que contém uma pluralidade de repetições (pelo menos duas, tipicamente pelo menos três ou mais), não necessariamente adjacentes, de trechos de aminoácido do polipeptídeo. O termo múltiplos epítopos multiméricos, portanto, se refere a um polipeptídeo contendo uma pluralidade de repetições de uma pluralidade de epítopos.

De acordo com esse aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo com múltiplos epítopos de influenza sintético ou recombinante compreendendo múltiplas cópias de uma pluralidade de epítopos peptídicos do vírus da influenza dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada (XiX₂X₃...)_n ou em uma estrutura copolimérica em bloco (Χχ) _n (X2) η (X3) n· · · (Xm) n· polipeptídeo com múltiplos epítopos de influenza sintético ou recombinante de acordo com a presente invenção é selecionado do grupo consistindo de:

i. B (XiZX₂Z...X_m)_nB; e ii. B (Xi) _nZ (X₂) _nZ . . . (X_m)_nB;

em que B é uma sequência opcional de 1-4 resíduos de aminoácido; n é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 2-50; m é um número inteiro de 3-50; cada um de XI, X2...Xm é um epítopo peptídico de influenza consistindo de 4-24 resíduos de aminoácido; Z, em cada ocorrência, é um ligante ou espaçador de 1-4 resíduos de aminoácido; e em que o número máximo de resíduos de aminoácido no polipeptídeo é cerca de 100.

De acordo com algumas modalidades, n, em cada ocorrência é, independentemente, um número inteiro de 2-50; m é um número inteiro de 3-15; cada um de Xi-X_m é um epitopo peptídico de influenza selecionado do grupo consistindo de um epitopo do tipo célula B, um epitopo do tipo T-auxiliar (Th) e um epitopo do tipo linfócito citotóxico (CTL) consistindo de 4-24 resíduos de aminoácido; e o número máximo de resíduos de aminoácido no polipeptídeo é cerca de 600.

De acordo com outras modalidades, os epítopos peptídicos de influenza são selecionados do grupo consistindo de um peptídeo de hemaglutinina (HA), um peptídeo Ml, um peptídeo M2 e um peptídeo de nucleoproteína (NP) .

De acordo com algumas modalidades específicas, m é 9 e n é um número inteiro de 3-5.

De acordo com outras modalidades, os epítopos peptídicos de influenza são selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 82.

De acordo com algumas modalidades específicas, os epítopos peptídicos de influenza são selecionados dos epitopos E1-E9 de acordo com a tabela 1.

Tabela 1. Epitopos peptidicos El a E9 de influenza

Epítopo	Tipo de epítopo	Resíduos de proteína	Sequência de amínoácído	SEQ ID NO:
El	Célula B	HA 354-372	PAKLLKERGFFGAIAGFLE	82
E2	Célula B	HA 91-108	SKAYSNCYPYDVPDYASL	48
E3	Célula B & CTL	Ml 2-12	SLLTEVETYVL	25
E4	Célula B	HA 150-159	WLTGKNGLYP	52
E5	Célula B	HA 143-149	WTGVTQN	51
E6	T auxiliar	NP 206-229	FWRGENGRKTRSAYERMC NILKGK	64
E7	T auxiliar	HA 307-319	PKYVKQNTLKLAT	59
E8	CTL	NP 335-350	SAAFEDLRVLSFIRGY	69
E9	CTL	NP 380-393	ELRSRYWAIRTRSG	70

De acordo com modalidades mais específicas, os epitopos peptidicos de influenza consistem de: HA 354-372 5 (El, SEQ ID NO: 82), HA 91-108 (E2, SEQ ID NO: 48), Ml 2-12 (E3, SEQ ID NO: 25), HA 150-159 (E4, SEQ ID NO: 52), HA 143-149 (E5, SEQ ID NO: 51), NP 206-229 (E6, SEQ ID NO: 64), HA 307-319 (E7, SEQ ID NO: 59), NP 335-350 (E8, SEQ ID NO: 69) e NP 380-393 (E9, SEQ ID NO: 70).

De acordo ainda com outras modalidades, a sequência polipeptídica é selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 88.

De acordo com algumas modalidades, o polipeptideo compreende nove diferentes epitopos peptidicos do virus da influenza dispostos na seguinte estrutura polimérica sequencial alternada [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]_n, em que n é 3 ou 5; El é HA 354-372 (SEQ ID NO: 82), E2 é HA 91-108 (SEQ ID NO: 48), E3 é Ml 2-12 (SEQ ID NO: 25), E4 é HA 150-159 (SEQ ID NO: 52), E5 é HA 143-149 (SEQ ID NO: 51), E6 é NP 206229 (SEQ ID NO: 64), E7 é HA 307-319 (SEQ ID NO: 59), E8 é NP 335-350 (SEQ ID NO: 69) e E9 é NP 380-393 (SEQ ID NO: 70) .

De acordo com outras modalidades, o polipeptideo compreende três repetições de nove diferentes epitopos peptidicos do vírus da influenza dispostos na seguinte estrutura copolimérica em bloco [E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9], em que El é HA 354-372 (SEQ ID NO: 82), E2 é HA 91-108 (SEQ ID NO: 48), E3 é Ml 2-12 (SEQ ID NO: 25), E4 é HA 150-159 (SEQ ID NO: 52), E5 é HA 143-149 (SEQ ID NO: 51), E6 é NP 206-229 (SEQ ID NO: 64), E7 é HA 307-319 (SEQ ID NO: 59), E8 é NP 335-350 (SEQ ID NO: 69) e E9 é NP 380-393 (SEQ ID NO: 70).

De acordo com ainda outras modalidades, o polipeptídeo compreende seis repetições de cinco diferentes epitopos peptidicos de virus da influenza do tipo célula B dispostos na seguinte estrutura polimérica sequencial alternada [E1E2E3E4E5] ₆, em que El é HA 354-372 (SEQ ID NO:

82) ,	E2	é HA 91-108 (SEQ ID NO: 48), E3 é	Ml	2-12 (SEQ ID
NO:	25) ,	E4 é HA 150-159 (SEQ ID NO: 52),	E5	é HA 143-149
(SEQ	ID	NO: 51).
	De	acordo com outras modalidades,	o	polipeptídeo

compreende seis repetições de quatro diferentes epitopos peptidicos do virus da influenza do tipo célula T dispostos na seguinte estrutura polimérica sequencial alternada [E7E8E9E6]₆, em que E6 é NP 206-229 (SEQ ID NO: 64), E7 é HA 307-319 (SEQ ID NO: 59), E8 é NP 335-350 (SEQ ID NO: 69) e E9 é NP 380-393 (SEQ ID NO: 70).

De acordo com ainda outras modalidades, o polipeptídeo compreende quatro repetições de quatro epitopos peptidicos do vírus da influenza do tipo célula T dispostos na seguinte estrutura polimérica sequencial alternada: [E7E8E9E6]_n, onde n é 6 e em que E6 é NP 206-229 (SEQ ID NO: 64), E7 é HA 307-319 (SEQ ID NO: 59), E8 é NP 335-350 15 (SEQ ID NO: 69) e E9 é NP 380-393 (SEQ ID NO: 70) e em que o referido polipeptídeo multimérico é fundido a uma proteína veículo.

De acordo com modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende seis repetições de nove diferentes epitopos peptidicos do vírus da influenza dispostos na seguinte estrutura copolimérica em bloco [E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E66E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9], em que El é HA 354-372 (SEQ ID NO: 82), E2 é HA 91-108 (SEQ ID NO: 48), E3 é Ml 2-12 (SEQ ID NO: 25), E4 é HA 150-159 (SEQ ID NO: 52), E5 é HA 143-149 (SEQ ID NO: 51), E6 é NP 206-229 (SEQ ID NO: 64), E7 é HA 307-319 (SEQ ID NO: 59), E8 é NP 335-350 (SEQ ID NO: 69) e E9 é NP 380-393 (SEQ ID NO: 70).

Em várias modalidades, o polipeptideo compreende pelo menos duas repetições de cada epitopo, tipicamente pelo menos três repetições de cada epitopo, alternativamente pelo menos quatro repetições, alternativamente pelo menos cinco repetições, alternativamente pelo menos seis repetições de cada epitopo, no máximo pelo menos 50 repetições de cada epitopo. A fim de aprimorar a exposição dos epitopos ao sistema imune, os epitopos são, de preferência, separados por um espaçador o qual, de acordo com determinadas modalidades, consiste de um único aminoácido e, de acordo com outras modalidades, compreende pelo menos um aminoácido ou é um peptídeo. De preferência, o espaçador consiste de 1-4 resíduos de aminoácido neutros.

De acordo com modalidades específicas, o polipeptideo com múltiplos epitopos da influenza recombinante ou sintético consiste em múltiplas cópias de uma pluralidade de epitopos peptidicos do vírus da influenza dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada (ΧιΧ₂Χ3··.)_ηou em uma estrutura copolimérica em bloco (Xl)n(X₂)n(X₃)n. · · (Xm)n·

Em algumas modalidades desse aspecto da presente invenção, o polipeptídeo multimérico com múltiplos epítopos compreende pelo menos dois epítopos peptidicos de influenza, em que pelo menos um é selecionado do grupo consistindo de epítopos do tipo célula B, epítopos do tipo T-auxiliar (Th) e epítopos do tipo linfócito citotóxico (CTL) . Em algumas modalidades, os epítopos peptidicos de influenza são selecionados do grupo consistindo de epítopos peptidicos de hemaglutinina (HA), epítopos peptidicos de proteína da matriz (Ml ou M2) e epítopos peptidicos de nucleoproteína (NP) . Em determinadas modalidades preferidas, os epítopos peptidicos são selecionados do grupo consistindo de epítopos El a E9, de acordo com a Tabela 1.

Várias modalidades exemplificativas são proporcionadas compreendendo epítopos selecionados da Tabela 1, em que o número de repetições para cada epítopo é o mesmo ou diferente e em que o polipeptídeo pode estar disposto em uma estrutura polimérica sequencial alternada ou uma estrutura copolimérica em bloco. 0 termo estrutura polimérica sequencial alternada significa que uma única cópia de todos os epitopos contidos no polipeptídeo está disposta sequencialmente e essa disposição é repetida sequencialmente uma série de vezes igual ao número de repetições. Por exemplo, se o polipeptídeo multimérico com múltiplos epitopos compreende quatro repetições de três epitopos Xi, X₂ e X₃ em uma estrutura sequencial alternada, o polipeptídeo tem a seguinte estrutura polimérica: X1X2X3X1X2X3-X1X2X3-X1X2X3, também escrita [X1X2X3L·· 0 termo estrutura copolimérica em bloco significa que todas as cópias de um único epítopo contido no polipeptídeo estão dispostas adjacentemente. Por exemplo, um polipeptídeo multimérico com múltiplos epitopos similar compreendendo quatro repetições de três epitopos Χχ, X2 e X3 em uma estrutura copolimérica em bloco tem a seguinte estrutura: X1X1X1X1-X2X2X2X2-X3X3X3X3/ também escrita [A] 4- [B] 4-[C] ₄ .

De acordo com algumas modalidades, pelo menos um aminoácido do espaçador induz a uma conformação específica sobre um segmento do polipeptídeo (por exemplo, um resíduo de prolina).

De acordo com ainda outras modalidades, o espaçador compreende uma sequência de divagem. De acordo com uma modalidade, o espaçador clivável é clivado por enzimas intracelulares. De acordo com uma modalidade mais especifica, o espaçador clivável compreende uma sequência clivável específica de protease.

De acordo com algumas modalidades, o polipeptídeo multimérico, de preferência, é não conjugado e é desprovido de uma proteína veículo de fusão. Em outras modalidades, os polipeptídeos da presente invenção podem ainda compreender uma sequência veículo, isto é, os epítopos peptídicos são inseridos dentro de uma sequência de um polipeptídeo veículo ou são acoplados a uma sequência veículo. De acordo com algumas modalidades, os polipeptídeos multiméricos são produzidos como uma proteína de fusão recombinante compreendendo uma sequência veículo.

Em algumas modalidades específicas, a sequência veículo é uma flagelina bacteriana ou uma porção da mesma. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo com múltiplos epítopos é inserido dentro da região hipervariável da flagelina, desse modo, formando uma proteína de fusão de flagelina recombinante contendo o polipeptídeo multimérico com múltiplos epítopos. Em outras modalidades, o polipeptídeo é fundido a uma porção amino terminal ou carbóxi terminal da proteína veículo.

A presente invenção proporciona, de acordo com outro aspecto, sequências polinucleotídicas isoladas que codificam os polipeptideos com múltiplos epítopos de influenza.

De acordo com algumas modalidades, as sequências polinucleotídicas isoladas codificam uma sequência polipeptídica selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86 e SEQ ID NO: 88.

De acordo com modalidades específicas, as sequências polinucleotídicas isoladas compreendem uma sequência selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 87.

De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona composições de vacina para imunização de um indivíduo contra influenza compreendendo pelo menos um polipeptídeo com múltiplos epítopos de influenza sintético ou recombinante compreendendo múltiplas cópias de uma pluralidade de epítopos peptídicos do vírus da influenza dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada (XiX₂X3...)_n ou em uma estrutura copolimérica em blOCO (Xl)n(X₂)n(X₃)n-(Xm)n.

De acordo com algumas modalidades, a composição de vacina compreende pelo menos dois de tais polipeptídeos. De acordo com algumas modalidades, a vacina compreende dois polipeptídeos, em que um primeiro polipeptídeo compreende uma pluralidade de epitopes peptidicos do vírus da influenza do tipo célula B e um segundo polipeptídeo compreende uma pluralidade de epítopos peptidicos de vírus da influenza do tipo célula T. De acordo com uma modalidade específica, o primeiro polipeptídeo é o polipeptídeo

[E1E2E3E4E5] ₆,	em	que	El é	HA	354-372 (	SEQ ID NO: 82	) ,	E2 é
HA 91-108 (SEQ	ID	NO:	48) ,	E3	é Ml 2-12	(SEQ ID NO:	25)	, E4
é HA 150-159 (	SEQ	ID	NO:	52) ,	E5 é HA	143-149 (SEQ	ID	NO:

51); e o segundo polipeptídeo é o polipeptídeo [E7E8E9E6]e< em que E6 é NP 206-229 (SEQ ID NO: 64), E7 é HA 307-319 (SEQ ID NO: 59), E8 é NP 335-350 (SEQ ID NO: 69) e E9 é NP 380-393 (SEQ ID NO: 70) ou uma proteína veículo de fusão compreendendo o polipeptídeo [E7E8E9E6]_n, onde n é 6 e em

que	E6 é NP	206-229	(SEQ ID NO:	64), E7 é	HA 307-319	(SEQ
ID	NO: 59),	E8 é NP	335-350 (SEQ	ID NO: 69)	e E9 é NP	380-
393	(SEQ ID	NO: 70).
	Outro	aspecto	da presente	invenção	proporciona	uma

vacina para imunização de um indivíduo compreendendo um polipeptídeo multimérico com múltiplos epítopos compreendendo uma pluralidade de epítopos peptidicos do vírus da influenza. Em algumas modalidades, a vacina compreende pelo menos três repetições de cada epítopo, alternativamente pelo menos quatro repetições, alternativamente pelo menos cinco repetições, alternativamente pelo menos seis repetições de cada epitopo. Em algumas modalidades, os epítopos são separados por um espaçador, o qual pode ser um único aminoácido ou um peptídeo de pelo menos dois aminoácidos.

Em algumas modalidades, a vacina compreende pelo menos dois epítopos peptídicos da influenza, em que pelo menos um epitopo é selecionado do grupo consistindo em epítopos do tipo célula B, epítopos do tipo T-auxiliar (Th) e epítopos do tipo CTL. Em algumas modalidades, os epítopos peptídicos de influenza são selecionados do grupo consistindo de epítopos peptídicos de hemaglutinina (HA) , epítopos peptídicos Ml, epítopos peptídicos M2 e epítopos peptídicos de NP. Em modalidades preferidas, os epítopos peptídicos são selecionados do grupo consistindo dos epítopos El a E9 na Tabela 1 acima.

Em uma modalidade, a vacina compreende três repetições dos nove epítopos E1-E9, dispostos de acordo com a estrutura polimérica sequencial alternada [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]₃. Em outra modalidade, a vacina compreende cinco repetições dos nove epítopos dispostos de acordo com a estrutura polimérica sequencial alternada [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]₅. Em ainda outra modalidade, a vacina compreende três repetições dos nove epítopos dispostos de acordo com a estrutura copolimérica em bloco [EI]₃-[E2]₃23 [E3]3~[E4]3~[E5]3~[E6]3~[E7]3-[E8]3“[E9]3 · Em ainda outra modalidade, a vacina compreende seis repetições dos nove epitopos dispostos de acordo com a estrutura copolimérica em bloco [El]₆-[E2]₆-[E3]₆-[E4]₆-[E5]₆-[E6]₆-[E7]₆- [E8] ₆[E9] 6Outro aspecto da presente invenção proporciona uma vacina contra influenza compreendendo uma mistura de polipeptideos com múltiplos epitopos multiméricos, em que um primeiro polipeptídeo compreende uma pluralidade de epitopos peptídicos do vírus da influenza do tipo célula B e um segundo polipeptídeo compreende uma pluralidade de epitopos peptídicos do vírus da influenza do tipo célula T. Cada um dos polipeptideos com múltiplos epitopos pode ser parte de uma proteína de fusão com uma proteína veículo.

De acordo com algumas modalidades, as composições de vacina de acordo com a presente invenção não contêm um adjuvante. De acordo com outras modalidades, a vacina ainda compreende um adjuvante.

Adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, emulsão água em óleo, emulsão lipídica e lipossomas. De acordo com modalidades específicas, o adjuvante é selecionado do grupo consistindo de: Montanide®, alume, dipeptídeo de muramila, Gelvac®, micropartículas de quitina, quitosana, subunidade B de toxina do cólera, Intralipid® e Lipofundin®. De acordo com uma modalidade presentemente preferida, o adjuvante é Montanide®.

Em algumas modalidades, a vacina é formulada para distribuição intramuscular, intranasal, oral, intraperitoneal, subcutânea, tópica, intradérmica e transdérmica. Em ainda outras modalidades, a vacina é administrada intradermicamente.

A presente invenção proporciona, de acordo com uma outra modalidade, um método para indução de uma resposta imune e conferir proteção contra influenza em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma composição de vacina compreendendo pelo menos um polipeptídeo com múltiplos epítopos de influenza sintético ou recombinante compreendendo múltiplas cópias de uma pluralidade de epítopos peptídicos do vírus da influenza dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada (XiX₂X3...)_n ou em uma estrutura copolimérica em bloco (Xl)n(X₂)n(X₃)n. · · (X_m)n·

A via de administração da vacina é selecionada de distribuição intramuscular, intranasal, oral, intraperitoneal, subcutânea, tópica, intradérmica e transdérmica. De acordo com modalidades preferidas, a vacina é administrada intranasal, intramuscular ou intradermicamente.

Uso de um polipeptideo de acordo com a invenção para o preparo de uma composição de vacina para imunização contra influenza também está dentro do escopo da presente invenção, bem como uso de um polinucleot ideo isolado de acordo com a invenção para a produção de um polinucleotideo.

Todos os polipeptideos multiméricos divulgados na presente invenção podem ser produzidos como uma proteína recombinante, uma proteína de fusão e através de síntese química. Consequentemente, outro aspecto da presente invenção proporciona uma proteína recombinante compreendendo um polipeptideo multimérico com múltiplos epítopos compreendendo uma pluralidade de epítopos peptidicos do vírus da influenza. Em algumas modalidades, o polipeptideo é inserido dentro da região hipervariável de uma flagelina bacteriana.

Outro aspecto da presente invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um polipeptideo multimérico com múltiplos epítopos e pelo menos um polipeptideo adicional. Em algumas modalidades, o polipeptideo é fundido a uma flagelina bacteriana ou uma porção da mesma. Em uma modalidade específica, o polipeptideo compreendendo seis repetições dos nove epítopos, dispostos de acordo com a estrutura copolimérica em bloco [El] ₆-[E2] ₆-[E3] ₆-[E4 ] ₆-[E5] ₆-[E6] ₆-[E7 ] ₆-[E8 ] ₆-[E9] ₆é fundido a uma flagelina bacteriana ou uma porção da mesma.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um polipeptídeo multimérico sintético compreendendo uma pluralidade de epítopos peptidicos sintéticos ligados por um espaçador selecionado do grupo consistindo de: uma ligação, um aminoácido e um peptídeo compreendendo pelo menos dois aminoácidos.

Abrangidos pela presente invenção são também polipeptídeos multiméricos sintéticos para imunização contra influenza.

Outras modalidades e o escopo total de aplicabilidade da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada fornecida aqui depois. Contudo, deve ser entendido que a descrição detalhada e exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas da invenção, são fornecidos à guisa de ilustração apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir dessa descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras IA e 1B mostram um polipeptídeo multimérico compreendendo cinco repetições de nove epitopos peptidicos de influenza dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada: (HA354-372—HA91-108—Ml,212—HA150-159—HA143-149—NP206-229—HA307-319—NP335-350—NP380393) ₅. (A) Sequência de nucleotideo (SEQ ID NO: 83) do constructo usado para produzir um polipeptídeo multimérico;

(B) Sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 84) do polipeptídeo multimérico codificado pela sequência de nucleotideo de A. Os epitopos na primeira sequência de nove epitopos estão sublinhados.

As Figuras 2A e 2B mostram um polipeptídeo multimérico compreendendo três repetições de nove epitopos peptidicos de influenza dispostos em uma estrutura copolimérica em bloco (HA354-372)3—(HA91-108)3—(Ml,2-12)3— (HA150-159)₃—(HA143-149) ₃-(NP206-229)₃-(HA307-319)₃-(NP335350) 3—(NP380-393)3. (A) Sequência de nucleotideo (SEQ ID

NO: 85) do constructo usado para produzir o polipeptídeo.

(B) Sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 86) do polipeptídeo multimérico. As três repetições do primeiro epítopo estão sublinhadas.

As Figuras 3A e 3B mostram um polipeptídeo multimérico compreendendo três repetições de nove epitopos peptidicos de influenza dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada: (HA354-372—HA91-108—Ml,228

12—HA150-159—HA143-149—NP206-229— HA307-319-NP335-350ΝΡ380-393)3· (A) Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 87) do constructo usado para produzir o polipeptídeo. (B) Sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 88) do polipeptídeo multimérico. Os epitopos na primeira sequência de nove epitopos estão sublinhados.

A Figura 4 mostra a resposta imune celular à várias cepas de vírus da influenza de camundongos vacinados com duas vacinas multiméricas: #11 e #14. A resposta imune celular à duas diferentes concentrações de um vírus de estimulação foi medida e é mostrada como o índice de proliferação para linfócitos incubados com um vírus de estimulação.

A Figura 5 mostra o efeito protetor da vacina multimérica #14 contra uma dose altamente letal de uma cepa H3N2 do vírus da influenza adaptada de camundongo (A/Texas/1/77). O efeito protetor da vacina é demonstrado por uma redução significativa na titulação de vírus nos pulmões de camundongos vacinados comparado com camundongos de controle (PBS).

As Figuras 6A e 6B mostram a eficácia de várias vacinas multiméricas na proteção de camundongos contra um estímulo viral. O efeito protetor das vacinas multiméricas #11, #12 e #14 é demonstrado por uma maior taxa de sobrevivência (Fig. 6A) de camundongos vacinados comparado com camundongos de controle (PBS), após infecção com uma dose letal de uma cepa H3N2 de virus da influenza adaptada de camundongo (A/Texas/1/77) e por uma carga viral significativamente menor nos pulmões (Fig. 6B) de camundongos vacinados comparado com camundongos de controle (Gly/PBS a 50%).

A Figura 7 compara a eficácia de imunização de camundongos com diversas vacinas compreendendo constructos multiméricos em Glicerol em PBS a 50% (#11, #12 e #14) ou em emulsão com Adjuvants Incompleto de Freund ((#11-IFA, #12-IFA e #14-IFA). O efeito protetor das diferentes vacinas e o efeito do IFA são medidos pela taxa de sobrevivência de camundongos vacinados comparado com camundongos de controle após estímulo com a cepa H3N2 de vírus da influenza adaptada de camundongo (A/Texas/1/77).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona polipeptídeos com múltiplos epítopos multiméricos e vacinas baseadas nesses polipeptídeos compreendendo uma pluralidade de epítopos peptídicos do vírus da influenza. Um polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos duas repetições de cada epítopo. De preferência, um polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos três repetições de cada epitope. A presente invenção também proporciona vacinas baseadas em tais polipeptideos e métodos de uso das mesmas.

Epitopos peptidicos derivados de proteínas de influenza são úteis no preparo de vacinas contra influenza. Contudo, cada polipeptídeo isoladamente é quase invisível ao sistema imune, é degradado rapidamente e origina uma resposta imune insuficiente. Quando múltiplas cópias de peptídeos imunogênicos são apresentadas ao sistema imune como um único polipeptídeo, a magnitude da resposta imune epítopo-específica é intensificada. Por exemplo, vacinas baseadas em uma proteína de fusão de flagelina recombinante contendo uma única cópia de um epítopo peptídico de influenza proporcionam uma proporção de epítopo/flagelina de aproximadamente 1:28. Usando vacinas com múltiplos epitopos contendo uma pluralidade de epitopos em várias cópias cada, uma proporção de epítopo/flagelina de até 2:1 pode ser obtida. A presente invenção divulga polipeptideos com múltiplos epitopos multiméricos com imunogenicidade intensificada comparado com constructos e configurações conhecidos. Os polipeptideos contêm, cada um, uma pluralidade de epitopos, em que cada epítopo é repetido em múltiplas cópias. As múltiplas cópias ou repetições de cada epítopo podem ser contíguas como um bloco de cada epítopo.

Alternativamente, a pluralidade de epítopos pode aparecer em uma sequência predeterminada onde essa sequência é repetida uma série de vezes dentro do polipeptídeo. Agora, foi mostrado que ambos esses tipos de configurações dos múltiplos epítopos têm resultados inesperadamente superiores ao conferir imunidade contra influenza em um indivíduo.

Definições

Por conveniência, determinados termos empregados na especificação, exemplos e reivindicações são descritos aqui.

termo apresentação de antígeno significa a expressão de antígeno sobre a superfície de uma célula em associação com moléculas da classe I ou classe II do principal complexo de histocompatibilidade (MHC-I ou MHCII) de animais ou com a HLA-I e HLA-II de seres humanos.

termo imunogenicidade ou imunogênica se refere à capacidade de uma substância de estimular ou incitar uma resposta imune. A imunogenicidade é medida, por exemplo, determinando a presença de anticorpos específicos para a substância. A presença de anticorpos é detectada através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando um ensaio ELISA.

Epítopos de influenza podem ser classificados como do tipo célula B, do tipo célula T ou do tipo célula B e célula T, dependendo do tipo de resposta imune que eles estimulam. A definição de epítopo peptídico de célula B ou célula T não é inequívoca; por exemplo, um epítopo peptídico pode induzir à produção de anticorpo mas, ao mesmo tempo, esse epítopo pode possuir uma sequência que permite a ligação à molécula de HLA humana, tornando-a acessível a CTLs, consequentemente, uma classificação dupla de ceiuia d e célula T para esse eprtopo cm particular. CLT, células T assassinas ou células T citotóxicas é um grupo de células T diferenciadas que reconhece e submete à lise células alvo trazendo um antígeno estranho específico que funciona em defesa contra infecção viral e células cancerígenas. Célula T auxiliar ou Th é qualquer uma das células T que, quando estimuladas por um antígeno específico, libera citocinas que promovem a ativação e função de células B e células T assassinas.

O termo proteína de fusão de flagelina recombinante se refere a um polipeptídeo de flagelina compreendendo um epítopo peptídico ou um polipeptídeo multimérico com múltiplos epitopos incrustado dentro de sua sequência ou, alternativamente, a uma porção de um polipeptídeo de flagelina fundido a um epítopo peptídico ou um polipeptídeo multimérico com múltiplos epitopos em seu C- ou N-término.

Sequência de aminoácido, conforme usado aqui, se refere a uma sequência de oligopeptideo, peptideo, polipeptídeo ou proteína e fragmentos da mesma e à moléculas que ocorrem naturalmente ou sintéticas.

Na especificação e nas reivindicações, o termo espaçador denota qualquer composto químico o qual pode estar presente na sequência polipeptídica, em um dos términos ou entre dois epítopos. De preferência, o espaçador consiste de 1-4 resíduos de aminoácido. O espaçador pode compreender uma sequência que pode ser clivaa por meios enzimaticos ou pode se decompor espontaneamente. O espaçador pode forçar ou induzir à conformação benéfica do polipeptídeo. 0 espaçador pode opcionalmente compreender uma sequência clivável específica de protease.

Epítopos peptidicos úteis no preparo de uma vacina

De acordo com modalidades preferidas da presente invenção, epítopos peptidicos são derivados de proteínas de influenza selecionadas do grupo consistindo de HA, Ml, M2 e NP. Os epítopos podem também ser selecionados de acordo com seu tipo: tipo célula B, tipo Th e tipo CTL.

Deve ser notado que epítopos peptidicos listados aqui são fornecidos para fins ilustrativos apenas. As proteínas do vírus da influenza variam entre isolados, desse modo, proporcionando múltiplas sequências variantes para cada proteína de influenza. Consequentemente, a presente invenção abrange epitopos peptidicos tendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido.

A proteína de matriz Ml é um principal componente estrutural das partículas de vírus da influenza e forma uma camada interna do envelope derivado de células lipídicas. Dentro do virion e em células infectadas nos últimos estágios da replicação viral, a proteína Ml se associa com 10 as ribonucleoproteínas virais (vRNPs), as quais são compostas de moléculas de RNA viral, múltiplas cópias das nucleoproteínas e as três subunidades da polimerase viral contendo as extremidades dos RNAs virais. O domínio Nterminal da Ml se refere aos aminoácidos 1 a cerca do 15 aminoácido 20 da proteína Ml.

A proteína de matriz M2 é um canal de ions de hidrogênio que resulta em dissociação da matriz e complexo de nucleoproteína dentro de vacúolos. Esse canal de ions libera o genoma que permite que RNA viral entre no núcleo 20 da célula infectada e inicie a replicação viral.

Substâncias terapêuticas contra influenza, tais como amantadina e rimantadina, atuam bloqueando a atividade de

M2. Influenza B tem uma proteína de contra-parte conhecida como NB; embora não haja similaridade de sequência entre M2 e NB, elas são ambas proteínas transmembrana e podem compartilhar funções similares. 0 domínio extracelular da proteína M2, a qual é uma proteína transmembrana do vírus da influenza A, é quase invariável em todas as cepas de influenza A. 0 domínio N-terminal da M2 se refere à sequência de aminoácido N-terminal ao domínio transmembrana.

A Tabela 2 proporciona uma lista exemplificativa de epítopos peptidicos de Ml e M2 que podem ser usados para o 10 preparo dos polipeptídeos multiméricos de acordo com a presente invenção.

Tabela 2. Epítopos peptidicos Ml e M2

Tipo de Epitopo	Resíduos de proteína	Sequência de aminoácido	SEQ ID N°:
	M2 6-9	EVET	1
Th	M2 1-15	MSLLTEVETHTRNGW	2
	M2 10-18	PIRNEWGCR	3
	M2 8-15	ETPIRNEWGC	4
	M2 10-20	PIRNEWGCRCN	5
CTL	M2 3-11	LLTEVETPI	6
CTL	M2 2-10	SLLTEVETP	7
CTL	M2 2-11	SLLTEVETPI	8
CTL	M2 4-11	LTEVEPLT	9

Tipo de Epítopo	Resíduos de proteína	Sequência de amínoácído	SEQ ID N° :
Th	M2 1-15	MSLLTEVETPIRNEW	10
Th	M2 1-18	MSLLTEVETPIRNEWGCR	11
Th	M2 1-15	MSLLTEVETLTKNGW	12
Th	M2 1-15	MSLLTEVETLTRNGW	13
CTL	M2 4-12	LTEVETPIR	14
CTL	M2 4-13	LTEVETPIRN	15
CTL	M2 6-14	EVETPIRNE	16
CTL	M2 6-15	EVETPIRNEW	17
CTL	M2 4-14	LTEVETPIRNE	18
Th	M2 4-18	LTEVETPIRNEWGCR	19
Célula B	M2 6-13	EVETPIRN	20
Célula B	M2 1-18	MSLLTEVETPTRNEWECR	21
Célula B	M2 2-24	SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD	22
Célula B	M2 2-24	SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD	23
Célula B	M2 7-15	VETPIRNEW	24
Célula B	Ml 2-12	SLLTEVETYVL	25
CTL	Ml 2-12	SLLTEVETYVP	26
CTL	Ml 3-11	LLTEVETYV	27
CTL	Ml 13-21	SIVPSGPL	28
CTL	Ml 17-31	SGPLKAEIAQRLEDV	29
CTL	Ml 18-29	GLPKAEIAQRLE	30

Tipo cia EpitCE>o	Resíduos de proteína	Sequência de aminoácido	SEQ ID N°:
CTÊ	Ml 27-35	RLEDVFAGK	31
ctí	Ml 41-51	ALMEWLKTRPI	32
CTl	Ml 50-59	PILSPLTKGI	33
CT1	Ml 51-59	ILSPLTKGI	34
ct:l	Ml 55-73	LTKGILGFVFTLTVPSERG	35
CTZL	Ml 56-68	TKGILGFVFTLTV	36
CT1	Ml 57-68	KGILGFVFTLTV	37
cn	Ml 58-66	GILGFVFTL	38
CTLL	Ml 60-68	LGFVFTLTV	39
CTL	Ml 59-67	ILGFVFTLT	40
CTL.	Ml 128-135	ASCMGLIY	41
CTL,	Ml 134-142	RMGAVTTEV	42
CT L.	Ml 145-155	GLVCATCEQIA	43
Cl	Ml 164-172	QMVATTNPL	44
CTL	Ml 164-173	QMVATTNPLI	45
CTL	Ml 178-187	RMVLASTTAK	46
CTL	Ml 232-240	DLLENLQTY	47

M nucleoproteins (NP) é um dos grupos de antígenos especLÊic.os o qual distingue entre vírus da influenza A, B e C- Em contraste à HA, a NP é altamente conservada, sendo

94% conservada em todos os vírus de influenza A. anticorpo

NP de virus da influenza A-específico não tem atividade de neutralização de virus, mas a NP é um alvo importante para linfócitos T citotóxicos (CTL) os quais reagem cruzadamente com todos os virus do tipo A (Townsend, J Exp Med 1984 160(2): 552-63). CTLs reconhecem peptideos sintéticos curtos correspondendo à regiões lineares da molécula de NP de influenza.

Hemaglutinina (HA) é um trimero de glicoproteina COritluO Π.Ο SnVcjLopO do influenza. Είθ Θ rêSpOnSSVvl pola, fixação e penetração do vírus na célula hospedeira. Anticorpos à HA neutralizam a infectividade viral. Variações antigênicas dessa molécula são responsáveis pelos frequentes surtos de influenza e pelo pobre controle de infecção através de imunização (Ada e Jones, Curr Top Microbial Immunol 1986; 128: 1-54).

A RNA polimerase do vírus da influenza é um heterocomplexo composto das três proteínas de polimerase (P) PB1, PB2 e PA presentes em uma proporção de 1:1:1. Seu papel na virulência da influenza não foi totalmente esclarecido. Exemplos não limitativos de epítopos peptídicos de HA, NP, PB1 e PB2 são listados na tabela 3. Tabela 3: Epítopos peptídicos de HA, NP e PB

Tipo de Epitopo	Resíduos de proteína	Sequência de aminoácido	SEQ ID N° :
Célula Β	HA 91-108	SKAYSNCYPYDVPDYASL	48
Célula Β	HA 91-108	SKAFSNCYPYDVPDYASL	49
Célula Β	HÁ 107-124	STAYSNCYPYDVPDYASL	50
Célula Β	HA 143-149	WTGVTQN	51
Célula Β	HA 150-159	WLTGKNGLYP	52
Célula Β	HÁ 166-175	WLTEKEGSYP	53
Th	HA 306-324	PKYVKQNTLKLATGMRNVP	54
CTL	HA 521-531	GVKLESMGIYQ	55
CTL	HA 518-528	EISGVKLESMGNVKNLYEKVK	56
CTL	HA 458-467	NVKNLYEKVK	57
Th	HA 128-145	KVKILPKDRWTQHTTTGG	58
Th	HA 307-319	PKYVKQNTLKLAT	59
Th	NP 91-99	KTGGPIYRR	60
CTL	NP 44-52	CTELKLSDY	61
CTL	NP 82-95	HPSAGKDPKKTGGP	62
CTL	NP 82-94	HPSAGKDPKKTGG	63
Th	NP 206-229	FWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK	64
CTL	NP 265-273	ILRGSVAHK	65
CTL	NP 305-313	KLLQNSQVY	66
CTL	NP 335-349	SAAFEDLRVLSFIRG	67
CTL	NP 335-350	SAAFEDLRVSSFIRGT	68

Tipo de Epítopo	Resíduos de proteína	Sequência de amínoácído	SEQ ID N° :
CTL	NP 335-350	SAAFEDLRVLSFIRGY	69
CTL	NP 380-393	ELRSRYWAIRTRSG	70
CTL	NP 380-388	ELRSRYWAI	71
CTL	NP 383-391	SRYWAIRTR	72
CTL	NP 384-394	YWAIRTRSGG	73
CTL	NP 382-390	SRYWAIRTR	74
CTL	NP 418-426	LPFDKPTIM	75
CTL	PB1 591-599	VSDGGPNLY	76
CTL	PB1 571-579	RRSFELKKL	77
CTL	PB2 368-376	RRATAILRK	78
CTL (gripe B)	NP 30-38	RPIIRPATL	79
CTL (gripe B)	NP 263-271	ADRGLLRDI	80
Th (gripe B)	HA 308-320	PYYTGEHAKAIGN	81
B (gripe B)	HA 354-372	PAKLLKERGFFGAIAGFLE	82

Moléculas quiméricas ou recombinantes

Uma proteína quimérica, polipeptídeo quimérico ou proteína recombinante são usados permutavelmente e se referem a um polipeptídeo multimérico de influenza operativamente ligado a um outro polipeptídeo que não o polipeptídeo do qual o epítopo peptídico foi derivado. Os polipeptídeos com múltiplos epítopos multiméricos da presente invenção podem ser preparados através de expressão em um vetor de expressão per se ou como uma proteína quimérica. Os métodos para produzir uma proteína quimérica ou recombinante compreendendo um ou mais epítopos pcptldiCOS dê inf Ι'ιΙόΓιΖά, Sâü COnhêCldOS pd SpUCÍLêS habilitados na técnica. Uma sequência de ácido nucléico que codifica um ou mais epítopos peptidicos de influenza pode ser inserida em um vetor de expressão para o preparo de um constructo de polinucleotideo para propagação e expressão em células hospedeiras. Um constructo de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo compreendendo múltiplas repetições de vários epítopos, tal como um polipeptídeo multimérico com múltiplos epítopos, pode ser preparado através de ligação de constructos de polinucleotídeo menores trazendo sítios de restrição apropriados em suas extremidades 3' e 5 ' .

Em um exemplo não limitative, o polipeptídeo quimérico da presente invenção inclui quimeras de um epítopo peptídico de influenza com um dos seguintes polipeptídeos: flagelina, toxina do cólera, toxina do tétano, ovalbumina, proteína de choque térmico de tuberculose, toxóide de difteria, proteína G do vírus sincicial respiratório, proteína da membrana externa de Neisseria meningitid.es, nucleoproteína do vírus de estomatite vesicular, glicoproteína do vírus de estomatite vesicular, proteína rica em glutamato do antígeno de Plasmodium falsiparum, proteína 3 da superfície de merozoito ou proteínas do envelope viral.

Dc -hovmoc· ’’ττοΊ-ον' rio o w-χ r o o o 5 rx ⁿ ο Η P ΓΧΏΓΡ 7 7,7 Ω recombinante, conforme usado aqui, se referem a uma molécula de DNA, por exemplo, um plasmídeo, flagelina ou vírus, contendo sequências de ácido nucléico desejadas e apropriadas necessárias para a expressão dos epítopos peptídicos recombinantes para expressão em uma célula hospedeira em particular. Conforme usado aqui, operavelmente ligado se refere a uma ligação funcional de pelo menos duas sequências. Operavelmente ligado inclui a ligação entre um promotor e uma segunda sequência, por exemplo, um ácido nucléico da presente invenção, em que a sequência promotora inicia e média a transcrição da sequência de DNA correspondendo à segunda sequência.

As regiões regulatórias necessárias para transcrição dos epítopos peptídicos podem ser proporcionadas pelo vetor de expressão. A natureza precisa das regiões regulatórias necessárias para expressão gênica podem variar entre vetores e células hospedeiras. Geralmente, é requerido um promotor capaz de se ligar à RNA polimerase e promover a transcrição de uma sequência de ácido nucléico operavelmente associada. Regiões regulatórias podem incluir aquelas sequências de não-codificação 5' envolvidas no início de transcrição e tradução, tais como a caixa TATA, sequência de capping, sequência CAAT e sequência. A região de não-codificação 3' à sequência de codificação pode conter sequências regulatórias de término de transcrição, tais como terminadores e sítios de poliadenilação. Um códon de início de tradução (ATG) pode também ser proporcionado.

Para clonar as sequências de ácido nucléico no sítio de clonagem de um vetor, ligantes ou adaptadores que proporcionam os sítios de restrição compatíveis apropriados são adicionados durante síntese dos ácidos nucléicos. Por exemplo, um sítio de enzima de restrição desejado pode ser introduzido em um fragmento de DNA através de amplificação do DNA usando PCR com primers contendo o sítio de enzima de restrição desejado.

Um construct© de expressão compreendendo uma sequência de epitopo peptídico operavelmente associada à regiões regulatórias pode ser diretamente introduzido em células hospedeiras apropriadas para expressão e produção do polipeptideo multimérico com múltiplos epitopos per se ou como proteínas de fusão recombinantes. Os vetores de expressão que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, cosmídeos, fago, fagemídeos, flagelina ou vírus modificados. Tipicamente, tais vetores de expressão compreendem uma origem de replicação funcional

para	propagação	do	vetor	em	uma célula hospedeira
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marcadores de seleção.

O constructo de polinucleotídeo recombinante compreendendo o vetor de expressão e um polipeptideo multimérico, então, será transferido para uma célula hospedeira bacteriana, onde ele pode se reproduzir e ser expresso. Isso pode ser realizado através de métodos conhecidos na técnica. O vetor de expressão é usado com uma célula hospedeira procariota ou eucariota compatível, a qual pode ser derivada de bactérias, levedo, insetos, mamíferos e seres humanos.

De acordo com um exemplo não limitativo, o vetor de expressão é um vetor de flagelina, por exemplo, conforme divulgado na US 6.130.082. De acordo com outras modalidades específicas, o vetor de plasmídeo contém o gene fliC de flagelina com sítios de restrição únicos, em que o polipeptídeo multimérico é inserido dentro da região hipervariável da flagelina e a proteína de fusão recombinante de flagelina contendo o polipeptídeo com múltiplos epítopos é expressa em Salmonella ou E. coli mutante flagelos-deficiente. As células hospedeiras as quais expressam a proteína de fusão de flagelina recombinante podem ser formuladas como vacinas vivas.

Produção do polipeptídeo multimérico

Uma vez expresso pela célula hospedeira, o polipeptídeo multimérico pode ser separado dos componentes indesejados através de uma série de métodos de purificação de proteína. Um de tais métodos usa uma tag de polihistidina sobre a proteína recombinante. Uma tag de polihistidina consiste em pelo menos seis resíduos de histidina (His) adicionados a uma proteína recombinante, frequentemente no N- ou C-término. Tags de poli-histidina são frequentemente usadas para purificação por afinidade de proteínas recombinantes rotuladas com poli-histidina que são expressas em E. coli ou outros sistemas de expressão procariotas. As células bacterianas são coletadas através de centrifugação e a pelota de célula resultante pode ser submetida à lise através de meios físicos ou com detergentes ou enzimas, tal como lisozima. 0 lisato bruto contém, nesse estágio, a proteína recombinante entre várias outras proteínas derivadas das bactérias e é incubado com meios de afinidade, tais como NTA-agarose, resina HisPur ou resina Talon. Esses meios de afinidade contêm ions de metal ligados, seja níquel ou cobalto, aos quais a tag de polihistidina se liga com afinidade micromolar. A resina é, então, lavada com tampão de fosfato para remover proteínas que não interagem especificamente com o ion de cobalto ou níquel. A eficiência de lavagem pode ser aprimorada através da adição de imidazola a 20 mM o proteínas são, então, usualmente eluídas com imidazola a 150-300 mM. A tag de poli-histidina pode ser subsequentemente removida usando enzimas de restrição, endoproteases ou exoproteases. Kits para a purificação de proteínas rotuladas com histidina podem ser adquiridos, por exemplo, da Qiagen.

Outro método é através da produção de corpos de inclusão, os quais são agregados inativos de proteína que podem se formar quando um polipeptídeo recombinante é expresso em um procariota. Embora o cDNA possa codificar apropriadamente um mRNA passível de transcrição, a proteína que resulta pode não duplicar corretamente ou a hidrofobicidade dos epitopos peptidicos adicionados pode fazer com que o polipeptídeo recombinante se torne insolúvel. Corpos de inclusão são facilmente purificados através de métodos bem conhecidos na técnica. Vários procedimentos para a presente invenção de corpos de inclusão são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os corpos de inclusão são recuperados de lisatos bacterianos através de centrifugação e são lavados com detergentes e agentes de quelação para remover tanta proteína bacteriana quanto possível da proteína recombinante agregada. Para obter proteína solúvel, os corpos de inclusão lavados são dissolvidos em agentes de desnaturação e a proteína liberada é, então, reduplicada através de remoção gradual dos reagentes de desnaturação através de diluição ou diálise (conforme descrito, por exemplo, em Molecular cloning: a laboratory manual, 3^aedição, Sambrook, J. e Russell, D. W., 2001; CSHL Press).

Alternativamente, a proteína de fusão de flagelina recombinante retém a capacidade de formar flagelos intactos. Vários procedimentos para a purificação de flagelos intactos são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as moléculas de flagelina recombinantes expressas por uma cepa não móvel de bactérias flagelinadeficientes produzem flagelos funcionais.

Formulação de vacina

As vacinas da presente invenção compreendem um polipeptídeo com múltiplos epitopos ou uma proteína de fusão recombinante compreendendo um polipeptídeo com múltiplos epítopos e opcionalmente um adjuvante. A vacina pode ser formulada para administração em um de muitos diferentes modos. De acordo com uma modalidade da invenção, a vacina é administrada intranasalmente. A formulação de vacina pode ser aplicada ao tecido linfático do nariz de qualquer maneira conveniente. Contudo, é preferido aplicála como uma corrente líquida ou gotículas líquidas às paredes da passagem nasal. A composição intranasal pode ser formulada, por exemplo, na forma liquida como gotas nasais, spray ou adequada para inalação, como pó, como creme ou como emulsão. A composição pode conter uma variedade de aditivos, tais como adjuvante, excipiente, estabilizantes, tampões ou conservantes.

Para aplicação direta, a composição de vacina é, de preferência, fornecida em um vaso apropriado para distribuição do polipeptídeo ou proteína de fusão recombinante na forma de gotas nasais ou um aerossol. Em determinadas modalidades preferidas, a vacina é formulada para distribuição mucosal, em particular distribuição nasal (Arnon e colaboradores, Biologicals. 2001; 29(3-4): 237-42; Ben-Yedidia e colaboradores, Int Immunol. 1999; 11 (7) : 1043-51).

Em outra modalidade da invenção, a administração é oral e a vacina pode ser apresentada, por exemplo, na forma de um tablete ou encapsulada em uma cápsula de gelatina ou uma microcápsula.

Em ainda outra modalidade, a vacina é formulada para administração parenteral. Em algumas modalidades, a vacina é formulada para inoculação em massa, por exemplo, para uso com um injetor a jato ou um cartucho de uso único. De acordo com ainda outra modalidades, a administração é intramuscular.

De acordo com ainda outra modalidade, a administração é intradérmica. Agulhas especificamente criadas para depositar a vacina intradermicamente são conhecidas na técnica conforme divulgado, por exemplo, na 6.843.781 e 7.250.036, dentre outras. De acordo com outras modalidades, a administração é realizada com um injetor sem agulha.

A formulação dessas modalidades é geralmente conhecida por aqueles habilitados na técnica.

Lipossomas proporcionam outro sistema de distribuição para distribuição e apresentação de antigeno. lipossomas são vesículas com bicamadas compostas de fosfolipídios e outros esteróis que envolvem um centro tipicamente aquoso onde antigenos ou outros produtos podem ser encapsulados. A estrutura do lipossoma é altamente versátil com muitas faixas de tipo em tamanhos de nanômetro a micrômetro, de cerca de 25 nm a cerca de 500 μιη. Descobriu-se que lipossomas são eficazes na distribuição de agentes terapêuticos à superfícies dérmicas e mucosais. Lipossomas podem ainda ser modificados para distribuição objetivada, por exemplo, através de incorporação de anticorpos específicos à membrana da superfície ou alterada para encapsular bactérias, vírus ou parasitas. O tempo médio de sobrevivência ou meia vida da estrutura lipossômica intacta pode ser prolongada com a inclusão de determinados polímeros, por exemplo, polietileno glicol, permitindo a liberação prolongada in vivo. Lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares.

A composição de vacina pode ser formulada através de: encapsulação de um antígeno ou um complexo de antígeno/adjuvante em lipossomas para formar antígeno encapsulado em lipossoma e mistura do antígeno encapsulado em lipossoma com um veículo compreendendo uma fase contínua de uma substância hidrofóbica. Se um complexo de antígeno/adjuvante não é usado na primeira etapa, um adjuvante adequado pode ser adicionado ao antígeno encapsulado em lipossoma, à mistura de antígeno encapsulado em lipossoma e veículo ou ao veículo antes que o veículo seja misturado com o antígeno encapsulado em lipossoma. A ordem do processo pode depender do tipo de adjuvante usado. Tipicamente, quando um adjuvante tal como alume é usado, o adjuvante e o antígeno são misturados primeiro para formar um complexo de antígeno/adjuvante, seguido por encapsulação do complexo de antígeno/adjuvante com lipossomas. 0 antígeno encapsulado em lipossoma resultante é, então, misturado com o veículo. 0 termo antígeno encapsulado em lipossoma pode se referir à encapsulação do antígeno isoladamente ou à encapsulação do complexo de antígeno/adjuvante, dependendo do contexto. Isso promove o contato íntimo entre o adjuvante e o antígeno e pode, pelo menos em parte, responder pela resposta imune quando alume é usado como o adjuvante. Quando outro é usado, o antígeno pode ser primeiro encapsulado em lipossomas e o antígeno encapsulado em lipossoma resultante é, então, misturado no adjuvante em uma substância hidrofóbica.

Na formulação de uma composição de vacina substancialmente isenta de água, o antígeno ou complexo de antígeno/adjuvante é encapsulado com lipossomas e misturado com uma substância hidrofóbica. Na formulação de uma vacina em uma emulsão de água-em-uma substância hidrofílica, o antígeno ou complexo de antígeno/adjuvante é encapsulado com lipossomas em um meio aquoso, seguido por mistura do meio aquoso com uma substância hidrofóbica. No caso da emulsão, para manter a substância hidrofóbica na fase contínua, o meio aquoso contendo os lipossomas pode ser adicionado em alíquotas com mistura à substância hidrofóbica.

Em todos os métodos de formulação, o antígeno encapsulado em lipossoma pode ser liofilizado antes de ser misturado com a substância hidrofóbica ou com o meio aquoso, conforme possa ser o caso. Em alguns casos, um complexo de antígeno/adjuvante pode ser encapsulado por lipossomas após liofilização. Em outros casos, o antígeno pode ser encapsulado por lipossomas, seguido pela adição de adjuvante, então, liofilização, para formar um antígeno encapsulado em lipossoma liofilizado com adjuvante externo. Em outra possibilidade, o antígeno pode ser encapsulado por lipossomas, seguido por liofilização, antes da adição de adjuvante. Liofilização pode promover melhor interação entre o adjuvante e o antígeno, resultando em uma vacina mais eficaz.

Formulação do antígeno encapsulado em lipossoma em uma substância hidrofóbica pode também envolver o uso de um emulsificante para promover distribuição mais uniforme dos lipossomas na substância hidrofóbica. Emulsificantes típicos são bem conhecidos na técnica e incluem oleato de manídeo (Arlacel™ A), lecitina, Tween™ 80, Spans™ 20, 80, 83 e 85. O emulsificante é usado em uma quantidade eficaz para promover distribuição uniforme dos lipossomas.

Tipicamente, a proporção volumétrica (v/v) de substância hidrofóbica para emulsificante está na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 15:1.

Microparticulas e nanoparticulas empregam pequenas esferas biodegradáveis as quais atuam como depósitos para distribuição de vacina. A principal vantagem que microesferas poliméricas possuem com relação a outros adjuvantes que realizam depósito é que elas são

GXt I? θιΓιαιΓιθΓιυ Θ SêÇuiaS θ £θ±?αιΓι apIOVâdaS pela E*OOd and Administration nos EU para uso em medicina humana como suturas adequadas e para uso como um sistema de distribuição de fármaco biodegradável (Langer R. Science. 1990; 249(4976): 1527-33). As taxas de hidrólise de copolimero são muito bem caracterizadas o que, por sua vez, permite a fabricação de microparticulas com liberação sustentada de antigeno durante períodos de tempo prolongados (0'Hagen e colaboradores, Vaccine. 1993; 11(9): 965-9).

A administração parental de microparticulas estimulam imunidade duradoura, especialmente se elas incorporam características de liberação prolongada. A taxa de liberação pode ser modulada pela mistura de polímeros e seus pesos moleculares relativos, os quais serão hidrolisados durante períodos variados de tempo. Sem desejar estar preso à teoria, a formulação de partículas de diferentes tamanhos (1 μτη a 200 gm) pode também contribuir para respostas imunológicas duradouras, uma vez que grandes partículas devem ser rompidas em partículas menores antes de se tornarem disponíveis para captação por macrófagos. Dessa maneira, uma vacina para uma única injeção poderia ser desenvolvida através de integração de vários tamanhos de partícula, desse modo, prolongando a apresentação de antigeno e benef iciando gxaxioemente prooutores cie animais de criação.

Em algumas aplicações, um adjuvante ou excipiente pode ser incluído na formulação de vacina. Montanide™ (Adjuvante Incompleto de Freund) e alume, por exemplo, são adjuvantes preferidos para uso humano. A escolha do adjuvante será determinada em parte pelo modo de administração da vacina. Por exemplo, vacinação não injetada levará a uma melhor conformidade global e menores custos globais. Um modo preferido de administração é administração intramuscular. Outro modo preferido de administração é administração intranasal. Exemplos não limitativos de adjuvantes intranasais incluem pó de quitosana, microesferas de PLA e PLG, QS-21, nanopartículas de fosfato de cálcio (CAP) e mCTA/LTB (toxina do cólera mutante El de 12K com subunidade B pentamérica de enterotoxina sensível ao calor).

O adjuvante usado pode também ser, teoricamente, qualquer um dos adjuvantes conhecidos para vacinas baseadas em peptídeo ou proteína. Por exemplo: adjuvantes inorgânicos na forma de gel (hidróxido de alumínio/fosfato de alumínio, Warren e colaboradores, 1986; fosfato de cálcio, Relyvelt, 1986); adjuvantes bacterianos, tal como monofosforil lipídio A (Ribi, 1984; Baker e colaboradores, 1988) e dipeptideos de muramrla (Ellouz e colaboradores, 1974; Allison e Byars, 1991; Waters e colaboradores, 1986); adjuvantes em .partícula, tais como os assim denominados ISCOMS (complexos imuno-estimulatórios, Mowat e Donachie, 1991; Takahashi e colaboradores, 1990; Thapar e colaboradores, 1991), lipossomas (Mbawuike e colaboradores, 1990; Abraham, 1992; Phillips e Emili, 1992; Gregoriadis, 1990) e microesferas biodegradáveis (Marx e colaboradores, 1993); adjuvantes baseados em emulsões oleosas e emulsificantes, tal como IFA (Adjuvante Incompleto de Freud (Stuart-Harris, 1969; Warren e colaboradores, 1986), SAF (Allison e Byars, 1991), saponinas (tal como QS-21; Newman e colaboradores, 1992), esqualeno/esqualano (Allison e Byars, 1991); adjuvantes sintéticos, tais como copolímero em bloco não-iônicos (Hunter e colaboradores, 1991), análogos de peptídeo de muramila (Azuma, 1992), lipídio A sintético (Warren e colaboradores, 1986; Azuma, 1992), polinucleotídeos sintéticos (Harrington e colaboradores, 1978) e adjuvantes policatiônicos (WO 97/30721).

Adjuvantes para uso com imunogênios da presente invenção incluem sais de alumínio ou cálcio (por exemplo, sais de hidróxido ou fosfato). Um adjuvante particularmente preferido para uso aqui é um gel de hidróxido de alumínio, tal como Alhydrogel™. Nanopartículas e fosfato de cálcio (\ á um u vs.nt θ sstá sondo do sen vo 1 vi do ^olo. Biosante, Inc (Lincolnshire, Ill) . 0 imunogenio de interesse pode ser revestido no exterior das partículas ou encapsulado dentro do interior [He e colaboradores (Novembro de 2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7(6): 899903] .

Outro adjuvante para uso com um imunogênio da presente invenção é uma emulsão. Uma emulsão considerada pode ser uma emulsão óleo-em-água ou uma emulsão água-emóleo. Além das partículas quiméricas imunogênicas, tais emulsões compreendem uma fase oleosa de esqualeno, esqualano, óleo de amendoim ou semelhante conforme bem conhecido e um agente de dispersão. Agentes de dispersão não-iônicos são preferidos e tais materiais incluem mono- e di-ésteres de C12-C24 ácido graxo de sorbitan e manídeo, tal como mono-estearato de sorbitan, mono-oleato de sorbitan e mono-oleato de manideo.

Tais emulsões são, por exemplo, emulsões água-em-óleo que compreendem esqualeno, glicerol e um tensoativo, tal como mono-oleato de manideo (Arlacel™ A), opcionalmente com esqualano, emulsificado com as partículas de proteína quimérica em uma fase aquosa. Componentes alternativos da fase oleosa incluem alfa-tocoferol, di- e tri-glicerídeos de cadeia misturada e sorbitan ésteres. Exemplos bem mnhQciHnc πθ 31.s sinulsõss inclusm Montsnids™ TSA~720 Θ Montanide™ ISA 703 (Seppic, Castres, França). Outros adjuvantes de emulsão óleo-em-água incluem aqueles divulgados no WO 95/17210 e EP 0 399 843.

O uso de adjuvantes de pequena molécula é também considerado aqui. Um tipo de adjuvante de pequena molécula útil aqui é um derivado de 8-oxo ou 8-sulfo-guanosina 7substituído descrito na Pat. U.S. No. 4.539.205, Pat. U.S. No. 4.643.992, Pat. U.S. No. 5.011.828 e Pat. U.S. No. 5.093.318. Foi mostrado que 7-alil-8-oxoguanosina (loxoribina) é particularmente eficaz na indução de uma resposta antígeno-(imunogênio)-específica.

Um adjuvante útil inclui monofosforil lipídio A (MPL®), 3-deacil monofosforil lipídio (3D-MPL®), um adjuvante bem conhecido fabricado pela Corixa Corp, of Seattle, formalmente Ribi Immunochem, Hamilton, Mont. O adjuvante contém três componentes extraídos de bactérias: monofosforil lipídio A (MPL) , dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS) (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão a 2% de esqualeno/Tween™ 80. Esse adjuvante pode ser preparado através dos métodos ensinados no GB 2122204B.

Outros compostos são estruturalmente relacionados ao adjuvante MPL® denominados fosfatos de monoalquil glicosamida (AGPs), tais como aqueles disponíveis da Corixa Corp sob a designação adjuvante RC-529 {2—[(R)-3—tetradecanoilóxitetradecanoilamino]-etil-2-deóxi-4-0-fosfono-3

0-[(R)-3-tetradecanoilóxitetra-decanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoilóxitetradecanoil-amino]-p-D-glicopiranosídeo, sal de trietilamônio}. Um adjuvante RC-529 está disponível em uma emulsão de esqualeno vendida como RC-529SE e em uma formulação aquosa como RC-529AF disponíveis da Corixa Corp, (veja Pat. U.S. No. 6.355.257 e Pat. U.S. No. 6.303.347; Pat. U.S. No. 6.113.918; e Publicação U.S. No. 03-0092643).

Outros adjuvantes considerados incluem adjuvante de oligonucleotideo sintético contendo o motivo de nucleotídeo CpG uma ou mais vezes (mais sequências de flanqueamento) disponíveis do Coley Pharmaceutical Group. O adjuvante designado QS-21, disponível da Aquila Biopharmaceuticals, Inc., é uma fração de saponina imunologicamente ativa tendo capacidade adjuvante derivada da casca da árvore Sul

Americana Quillaja Saponaria Molina (por exemplo, Quil™ A) e o método de sua produção é divulgado na Pat. U.S. No. 5.057.540. Derivados de Quil™ A, por exemplo, QS21 (urn derivado de fração purificado por HPLC de Quil™ A, também conhecido como QA21) e outras frações, tal como QA17, também são divulgados. Derivados sintéticos e semisintéticos de saponinas de Quillaja Saponaria Molina são também úteis, tais como aqueles descritos na Pat. U.S. No. 5.977.081 e Pat. U.S. No. 6.0S0.725. O adjuvante denominado MF59, disponível da Chiron Corp., é descrito na Pat. U.S. No. 5.709.879 e Pat. U.S. No. 6.086.901.

Adjuvantes de dipeptídeo de muramila são também considerados e incluem N-acetil-muramil-L-treonil-Disoglutamina (thur-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-Disoglutamina [CGP 11637, referido como nor-MDP] e Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(r-2'dipalmitoil-s-n-glicero-3-hidróxifosforilóxi)etilamina [(CGP) 1983A, referido como MTP-PE]. Os análogos de dipeptídeo de muramila são descritos na Pat. U.S. No. 4.767.842.

Outras misturas de adjuvante incluem combinações de 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 Bl), emulsões óleo-em-água compreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, PCT/EP98/05714), 3D-MPL formulado com outros veículos (EP 0 689 454 Bl) ,

QS21 formulado em lipossomas contendo colesterol (WO 96/33739) ou oligonucleotídeos imuno-estimulatórios (WO 96/02555). 0 adjuvante SBAS2 (agora AS02), disponível da SKB (agora Glaxo-SmithKline) contém QS21 e MPL em uma emulsão óleo-em-água é também útil. Adjuvantes alternativos incluem aqueles descritos no WO 99/52549 e suspensões não em partículas de polioxietileno éter (Pedido de Patente do Reino Unido No. 9807805.8).

O uso de um adjuvante que contém um ou mais agonistas para o receptor-4 toll-semelhante (TLR-4), tal como adjuvante MPL® ou um composto estruturalmente relacionado, tal como adjuvante RC-529® ou um mimético de Lipídio A, isoladamente ou junto com um agonista para TLR-9, tal como um oligo deóxinucleotídeo não metilado contendo o motivo CpG, também é opcional.

Outro tipo de mistura de adjuvante compreende uma emulsão água-em-óleo estável ainda contendo fosfatos de aminoalquil glicosamina, tal como descrito na Pat. U.S. No. 6.113.918. Dos fosfatos de aminoalquil glicosamina, a molécula conhecida como RC-529 10 {(2—[(R)—3— tetradecanoilóxitetradecanoilamino]etil-2-deóxi-4-Ofosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoilóxi-tetradecanoil]-2-[(R)-

3-tetradecanoilóxitetradecanoilamino]-p-D-glicopiranosideo, sal de trietilamônio)} é a mais preferida. Uma emulsão água-em-óleo preferida é descrita no WO 9956776.

Adjuvantes são utilizados em uma quantidade adjuvante, a qual pode variar com o adjuvante, animal hospedeiro e imunogênio. Quantidades típicas podem variar de cerca de 1 pg a cerca de 1 mg por imunização. Aqueles habilitados na técnica sabem que concentrações ou quantidades apropriadas podem ser prontamente determinadas.

Composições de vacina compreendendo um adjuvante baseado em emulsão óleo em água são também incluídas dentro do escopo da presente invenção. A emulsão água em óleo pode compreender um óleo metabolizável e uma saponina tal como, por exemplo, conforme descrito na US 7.323.182. O óleo e uma saponina estão presentes, por exemplo, em uma proporção de entre 1:1 e 200:1.

De acordo com várias modalidades, as composições de vacina de acordo com a presente invenção podem conter um ou mais adjuvantes caracterizado pelo fato de que eles estão presentes como uma solução ou emulsão a qual é substancialmente isenta de ions de sal inorgânico, em que a referida solução ou emulsão contém uma ou mais substâncias solúveis em água ou emulsificáveis em água as quais são capazes de tornar a vacina isotônica ou hipotônica. As substâncias solúveis em água ou emulsificáveis em água podem ser, por exemplo, selecionadas do grupo consistindo de: maltose, frutose, galactose, sacarose, álcool de açúcar, lipidio e combinações dos mesmos.

As formulações da presente invenção podem opcionalmente compreender um agente de intensificação de distribuição mucosal tal como, por exemplo, um peptideo de permeabilização que intensifica reversivelmente o transporte paracelular epitelial mucosal através de modulação da estrutura e/ou fisiologia juncional epitelial, ~ no onn/i /nmnc/in

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Os polipeptídeos com múltiplos epítopos multiméricos da presente invenção compreendem, de acordo com várias modalidades específicas, um adjuvante de proteassoma. O adjuvante de proteassoma compreende um preparado purificado de proteínas da membrana externa de meningococos e preparados similares de outras bactérias. Essas proteínas são altamente hidrofóbicas, refletindo seu papel como proteínas transmembrana e porinas. Em virtude de suas interações proteína-proteína hidrofóbicas, quando apropriadamente isoladas, as proteínas formam estruturas multi-moleculares consistindo de cerca de 60-100 mm de diâmetro inteiras ou vesículas de membrana fragmentadas. Esse estado físico semelhante a lipossoma permite que o adjuvante de proteassoma atue como uma proteína veículo e também atue como um adjuvante.

O uso de adjuvante de proteassoma foi descrito na técnica anterior e é revisto por Lowell GH em New Generation Vaccines, Segunda Edição, Marcel Dekker Inc, New York, Basel, Hong Kong (1997), páginas 193-206. Vesículas adjuvantes de proteassoma são descritas como comparáveis, quanto ao tamanho, a determinados vírus os quais são hidrofóbicos e seguros para uso humano. A revisão descreve a formulação de composições compreendendo complexos não covdisnLes entre vários antigenos e vesículas adjuvantes de proteassoma os quais são formados quando detergente de solubilização é seletivamente removido usando a tecnologia de diálise exaustiva.

Os polipeptídeos da presente invenção formam, opcionalmente, um complexo com as vesículas de antígeno de proteassoma através de porções hidrofóbicas. Por exemplo, um antígeno é conjugado a uma porção lipídica, tal como um grupo acila graxo. Tal porção hidrofóbica pode ser ligada diretamente ao polipeptídeo multimérico ou, alternativamente, um espaçador curto, por exemplo, de um, dois, três ou quatro, até seis ou dez aminoácidos podem ser usados para ligar o polipeptídeo multimérico ao grupo graxo. Essa âncora hidrofóbica interage com a membrana hidrofóbica das vesículas adjuvantes de proteassoma, ao mesmo tempo em que apresentam o peptídeo antigênico geralmente hidrofilico.

Em particular, uma âncora hidrofóbica pode compreender um grupo acila graxo preso ao amino término ou próxima do carbóxi término do polipeptídeo multimérico. Um exemplo é a cadeia de lauroíla com doze carbonos (CH₃ (CH) i₀CO) , embora qualquer grupo acila graxo que serve a uma função similar incluindo, mas não limitado a, grupos acila que têm comprimentos de cadeia de oito, dez, catorze, dezesseis, dezoito ou vinte carbonos também podem servir como âncoras hidrofóbicas. A âncora pode ser ligada ao antígeno peptídico usando um espaçador de imuno-potencialização. Tal ligante pode consistir de 1-10 aminoácidos, os quais podem auxiliar na manutenção da estrutura conformacional do peptideo.

Os dois componentes, isto é, o polipeptídeo multimérico e o adjuvante de proteassoma, podem ser formulados através de mistura dos componentes em uma solução selecionada de detergente(s) e, então, remoção do(s) detergente(s) através de métodos de diafiltração/ultrafiltração. Em geral, a proporção de adjuvante de proteassoma para polipeptídeo multimérico contidos na composição é, de preferência, maior do que 1:1 e pode ser, por exemplo, 1:2, 1:3, 1:4 até 1:5, 1:10 ou 1:20 (em peso). As soluções baseadas em detergente dos dois componentes podem conter o mesmo detergente ou diferentes detergentes e mais de um detergente pode estar presente na mistura submetida à ultrafiltração/diafiltração. Detergentes adequados incluem Triton, Empigen e Mega-10. Outros detergentes adequados também podem ser usados. Os detergentes servem para solubilizar os componentes usados para preparar a composição.

Vacinas compreendendo diferentes polipeptídeos multiméricos podem ser produzidas através de mistura de uma série de diferentes peptideos antigênicos com adjuvante de proteassoma. Alternativamente, duas ou mais composições de peptideo antigênico/adjuvante de proteassoma podem ser produzidas e substancialmente misturadas.

Embora uma vacina contra influenza comercial que é produzida em ovos induza à alergia em indivíduos que são sensíveis a ovos de galinha, a vacina multimérica não estimula tais respostas, conforme manifestado pela titulação de IgE antes e após imunização.

teor de antigeno é melhor definido pelo efeito biológico que ele provoca. Naturalmente, antigeno suficiente deverá estar presente para provocar a produção de quantidades mensuráveis de anticorpo protetor. Um teste conveniente para a atividade biológica de vírus envolve a capacidade do material antigênico que está sofrendo testagem para produzir um anti-soro positivo conhecido de seu anticorpo protetor. 0 resultado é reportado no log negativo da LD₅₀(dose letal, 50%) para camundongos tratados com organismos virulentos os quais são pré-tratados com várias diluições do material antigênico que está sendo avaliado. Um alto valor, portanto, reflete um alto teor de material antigênico, o qual está relacionado a anticorpos no antisoro conhecido, assim, reduzindo ou eliminando o efeito do anti-soro sobre o organismo virulento que torna uma pequena dose letal. É preferido que o material antigênico presente na formulação final esteja em um nivel suficiente para aumentar o log negativo da LD50 em pelo menos 1, de preferência 1,4 comparado com o resultado do organismo virulento tratado com anti-soro não tratado. Os valores absolutos obtidos para o controle de anti-soro e material de vacina adequado são, naturalmente, dependentes do organismo virulento e padrões de anti-soro selecionados.

método a seguir pode também ser usado para obter a formulação de vacina ideal: começando a partir de um antigeno definido, o qual se destina a provocar a resposta imune desejada, em uma primeira etapa, um adjuvante compatível com o antigeno é encontrado, conforme descrito na literatura especializada, particularmente no WO 97/30721. Em uma próxima etapa, a vacina é otimizada através da adição de várias substâncias que a torna isotônica, conforme definido na presente invenção, de preferência açúcares e/ou álcoois de açúcar, em uma concentração isotônica ou ligeiramente hipotônica, à mistura de antigeno e adjuvante, com a composição sendo de outro modo idêntica e ajuste da solução para um pH fisiológico na faixa de pH de 4,0 a 10,0, particularmente 7,4. Então, em uma primeira etapa, as substâncias ou a concentração das mesmas a qual aprimorará a solubilidade da composição de antigeno/adjuvante comparado com uma solução salina tamponada convencional, é determinada. O aprimoramento nas características de solubilidade por uma substância candidata é uma primeira indicação de que essa substância é capaz de levar a um aumento na atividade imunogênica da vacina.

Uma vez que um dos possíveis pré-requisitos para um aumento na resposta imune celular é ligação aumentada do antigeno à APCs (células que apresentam antigeno), em uma próxima etapa, uma investigação pode ser feita para ver se a substância leva a um aumento desse tipo. O procedimento usado pode ser análogo àquele descrito na definição do adjuvante, por exemplo, incubação das APCs com peptideo ou proteína rotulada por fluorescência, adjuvante e substância que a torna isotônica. Uma captação ou ligação aumentada do peptídeo à APCs obtida pela substância pode ser determinada comparando com células as quais foram misturadas com peptídeo e adjuvante apenas ou com uma composição de peptídeo/adjuvante a qual está presente em solução salina tampão convencional, usando citometria de fluxo.

Em uma segunda etapa, as substâncias candidatas podem ser investigadas in vitro para ver se e até que ponto sua presença é capaz de aumentar a apresentação de um peptídeo a APCs; a concentração oe MHc sobre as células pode ser medida usando os métodos descritos no WO 97/30721 para testagem de peptídeos.

Outra possível forma de testagem da eficiência de uma formulação é usando um sistema modelo in vitro. Nesse, APCs são incubadas junto com adjuvante, peptídeo e substância candidata e a ativação relativa de um clone de célula T o qual reconhece especificamente o peptídeo é medida (Coligan e colaboradores, 1991; Lopez e colaboradores, 1993).

A eficiência da formulação pode, opcionalmente, também ser demonstrada pela resposta imune celular detectando-se uma reação de hiper-sensibilidade do tipo retardado (DTH) em animais imunizados.

Finalmente, a atividade imunomodulatória da formulação é medida em testes com animais.

Os peptídeos multimericos e polipeptídeos da presente invenção podem ser sintetizados quimicamente usando métodos conhecidos na técnica para síntese de peptídeos, multimeros de peptídeo e polipeptídeos. Esses métodos contam, em geral, com princípios conhecidos de síntese de peptídeo; mais convenientemente, os procedimentos podem ser realizados de acordo com os princípios conhecidos de síntese de peptídeo em fase sólida.

Conforme usado aqui, peptídeo indica uma sequência de umlnoacidos ligada através de ligações peptidicas. Os peptídeos de acordo com a presente invenção compreendem uma sequência de 4 a 24 resíduos de aminoácido. Polipeptídeos multimericos compreendem pelo menos duas repetições e um máximo de 50 repetições dos epitopos peptidicos.

Análogos de peptídeo e peptidomiméticos são também incluídos dentro do escopo da invenção, bem como sais e ésteres dos peptídeos da invenção são abrangidos. Um análogo de peptídeo de acordo com a presente invenção pode compreender opcionalmente pelo menos um aminoácido não natural e/ou pelo menos um grupo de bloqueio no C-término ou N-término. Sais dos peptídeos da invenção são sais orgânicos e inorgânicos fisiologicamente aceitáveis. O design de análogos apropriados pode ser auxiliado por computador.

O termo peptidomimético significa que um peptídeo de acordo com a invenção é modificado de uma forma tal que ele inclui pelo menos uma ligação não peptidica tal como, por exemplo, ligação de ureia, ligação de carbamato, ligação de sulfonamida, ligação de hidrazina ou qualquer outra ligação covalente. 0 design de peptidomiméticos apropriados pode ser auxiliado por computador.

Sais e ésteres dos peptideos da invenção são abrangidos dentro do escopo da invenção. Sais dos peptideos da invenção sao sais orgânicos e inorgânicos fisiologicamente aceitáveis. Derivados funcionais dos peptideos da invenção abrange derivados os quais podem ser preparados a partir dos grupos funcionais os quais ocorrem como cadeias laterais sobre resíduos ou grupos C- ou N-terminais, através de meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invenção, na medida em que eles permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, eles não destroem a atividade do peptídeo e não conferem propriedades tóxicas sobre as composições que os contêm. Esses derivados podem, por exemplo, incluir ésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos grupos carboxila produzidas através de reação com amônia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados de N-acila dos grupos amino livre de resíduos de aminoácido formados através de reação com porções acila (por exemplo, grupos alcanoíla ou aroíla carbocíclicos) ou derivados de 0-acila do grupo hidroxila livre (por exemplo, aquele de resíduos de serila ou treonila) formados através de reação com porções acila.

O termo aminoácido se refere a compostos os quais têm um grupo amino e um grupo ácido carboxílico, de preferência em um padrão de substituição 1,2-, 1,3- ou 1,4- sobre a parte principal de carbono, α-aminoácidos são mais preferidos e incluem os 20 aminoácidos naturais (os quais são Laminoácidos, exceto quanto à glicina) os quais são encontrados em proteínas, os D-aminoácidos correspondentes, os N-metil aminoácidos correspondentes, aminoácidos com cadeia lateral modificada, os aminoácidos biossinteticamente disponíveis os quais não são encontrados em proteínas (por exemplo, 4-hidróxi-prolina, 5-hidróxilisina, citrulina, ornitina, canavanina, ácido djencólico, β-cianoalanina) e α-aminoácidos sinteticamente derivados, tais como ácido amino-isobutírico, norleucina, norvalina, homocisteína e homoserina. β-alanina e ácido γ-amino butírico são exemplos de 1,2 e 1,4-ams, respectivamente e muitos outros são bem conhecidos na técnica. Isosteres semelhantes à estatina (um dipeptídeo compreendendo dois aminoácidos, em que a ligação CONH é substituída por CHOH), isosteres de hidróxietileno (um dipeptídeo compreendendo dois aminoácidos, em que a ligação CONH é substituída por CHOHCH₂) , isosteres de amida reduzidos (um dipeptídeo compreendendo dois aminoácidose, em que a ligação COH é substituída por uma ligação CH₂NH) e isosteres de tioamida

(um dipeptídeo	compreendendo	dois	aminoácidos,	em	que a
ligação CONH é	substituída por	uma	ligação CSNH)	são	também
resíduos úteis	para a presente	invenção.
Os aminoácidos	usados na presente	invenção são	aqueles os
	._____ Ί___J__—1 J__	X			X

kqu.cid-S cSlqO C ΟιιιΘ x C <3. _ι_ιαθ 1Ί L-Θ LilSyOniVeiS Ou cSuâO ulSpOnlVclS através de métodos sintéticos de rotina. Determinados resíduos podem requerer métodos especiais para incorporação no peptídeo e abordagens sintéticas sequenciais, divergentes ou convergentes à sequência peptídica são úteis na presente invenção. Aminoácidos naturais codificados e seus derivados são representados pelos códigos de três letras de acordo com as convenções da IUPAC. Quando não há indicação, o L isômero foi usado.

Substituições conservativas de aminoácidos, conforme conhecido por aqueles habilitados na técnica, estão dentro do escopo da presente invenção. Substituições conservativas de aminoácido incluem substituição de um aminoácido por outro tendo o mesmo tipo de grupo funcional ou cadeia lateral, por exemplo, alifáticos, aromáticos, positivamente carregados, negativamente carregados. Essas substituições podem intensificar a biodisponibilidade oral, penetração no sistema nervoso central, objetivação à populações de células específicas e semelhantes. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que substituições, deleções ou adições individuais à sequência peptídica, polipeptídica ou de proteína as quais alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou um pequeno percentual de aminoácidos na sequência codificada é uma variante conservativamente modificada, onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica.

Os seis grupos a seguir contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas uns pelos outros:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) ; e

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Os exemplos a seguir são apresentados de forma a ilustrar mais completamente algumas modalidades da invenção. Eles não deverão, de forma alguma, ser construídos, contudo, como limitando o amplo escopo da invenção. Aqueles habilitados na técnica podem criar prontamente muitas variações e modificações dos princípios divulgados aqui sem se desviar do escopo da invenção.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos

Polipeptideos com múltiplos epítopos multiméricos: Exemplos de polipeptídeos com múltiplos epítopos multiméricos compreendendo várias repetições dos epítopos peptídicos El a E9 do vírus da influenza listados na Tabela 1 são apresentados. Os polipeptídeos incluem aminoácidos e peptídeos curtos como espaçadores. Os polipeptídeos estão dispostos em uma estrutura polimérica sequencial alternada ou uma estrutura copolimérica em bloco. Os polipeptídeos são preparados através de expressão em um vetor de expressão a partir de um constructo de polinucleotídeo compreendendo vários sítios de restrição para manipulação adicional do polipeptídeo. O constructo de polinucleotídeo é fornecido de uma fonte comercial.

Vacinas: Vacinas preparadas a partir dos polipeptídeos com múltiplos epítopos multiméricos apresentados nos exemplos 1-3 foram usados para estudos de imunização de várias cepas de camundongo. Exemplos de diversas vacinas produzidas e testadas são:

Multimérica #11 é feita a partir do polipeptídeo multimérico compreendendo cinco repetições de nove epítopos peptídicos de influenza dispostos na estrutura polimérica sequencial alternada: [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]₅ apresentada no exemplo 1.

Multimérica #12 é feita a partir do polipeptídeo multimérico compreendendo três repetições de nove epítopos peptídicos de influenza dispostos na estrutura polimérica sequencial alternada: [Ε1Ε2Ε3Ξ4Ε5Ξ6Ξ7Ε8Ε9]3 apresentada no exemplo 3.

Multimérica #14 é feita a partir do polipeptídeo multimérico compreendendo três repetições de nove epítopos peptídicos de influenza dispostos na estrutura copolimérica em bloco [El]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3 apresentada no exemplo 2.

Estudos de imunização: três cepas de camundongo: uma cepa exogâmica (ICR), uma cepa endogâmica (BALB/c) e uma cepa transgênica para moléculas HLA A* 0201 humanas (HLA A*0201), foram usadas para estudos de imunização, bem como coelhos em alguns experimentos. Vírus usados incluíam os seguintes: A/Texas/1/77, A/Wisconsin/67/05 (WISC), A/WSN/33 (WSN), B/Malaysia/2506/04 (MAL), A/California/07-2007, A/New Caledonia20/99 (NC) e outros. Todos os estudos foram conduzidos com administração intramuscular de 150 meg de polipeptideo multimérico com múltiplos epítopos em 100 microlitros, administrados igualmente a ambas as patas traseiras.

Exemplo 1: Polipeptideo multimérico com cinco repetições de uma unidade contendo nove epítopos diferentes dispostos em uma estrutura sequencial alternada

Esse é um exemplo de um polipeptídeos multimérico compreendendo cinco repetições de nove epítopos peptidicos oe inf jLuenza dispostos na estrutura polimerica alternada [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5. 0 peso molecular estimado é de 80 kD.

A sequência de aminoácido desse polipeptideos multimérico, incluindo a tag de histidina, é mostrada na Figura IB. A sequência de DNA do constructo de polinucleotídeo usado para preparar esse peptídeo multimérico é mostrada na Figura IA.

Exemplo 2: Polipeptideos multimérico com três repetições de cada um de nove epítopos dispostos em uma estrutura copolimérica em bloco

Nesse exemplo, a sequência de DNA de um constructo de polinucleotídeo usado para preparar um peptídeo multimérico compreendendo três repetições de nove epítopos peptidicos de influenza dispostos na estrutura copolimérica em bloco [El]₃-[E2]₃-[E3]₃-[E4]₃-[E5]₃-[E6]₃-[E7]₃-[E8]₃-[E9]3 θ mostrada na Figura 2A e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na Figura 2B. O peso molecular estimado é de 48 kD.

Exemplo 3: Polipeptídeo multimérico com três repetições de uma unidade contendo nove epitopos dispostos em uma estrutura sequencial alternada

Esse é um exemplo de um polipeptídeo multimérico compreendendo três repetições de nove epitopos peptídicos de influenza dispostos na estrutura polimérica sequencial alternada [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]₃. 0 peso molecular estimado é de 48 kD.

A sequência de aminoácido desse polipeptídeo multimérico é mostrado na Figura 3B. A sequência de DNA do constructo de polinucleotídeo usado para preparar esse peptídeo multimérico é mostrado na Figura 3A.

Exemplo 4: Resposta imune celular

As respostas imunes celulares à duas diferentes concentrações de um vírus da influenza de estimulação das cepas A/Texas/1/77, A/WisxWisc/67/05, A/California/07-2007 e B/Malaysia/2506/04 foram avaliadas. Camundongos transgênicos (transgenes para HLA A*0201) foram vacinados uma vez com duas vacinas multiméricas: #11 e #14, emulsifiçadas dentro de IFA (Adjuvante Incompleto de Freund) . 7-10 dias após a imunização, seus baços e nódulos linfáticos (LN) foram removidos e ainda incubados com os vírus mencionados acima. A proliferação foi medida através de captação de timidina e é mostrada na Figura 4, como o índice de proliferação para linfócitos incubados com o vírus de estimulação. A proliferação foi associada à secreção de IFN-gama, na faixa de 300-1300 pg/ml. Essa resposta indica uma resposta imune mediada por célula Thl à vacina, a qual pôde conferir uma imunidade mais sólida à

Exemplo 5: Reconhecimento do antigeno de imunização de virus pelo soro imune

Camundongos ICR foram imunizados com o polipeptídeo multimérico com múltiplos epítopos compreendendo cinco repetições de nove epítopos dispostos na estrutura polimérica sequencial alternada [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]₅(Multimérica #11) ou com o polipeptídeo multimérico com múltiplos epítopos compreendendo três repetições de nove epítopos dispostos na estrutura copolimérica em bloco [El]3-[E2]₃-[E3]3-[E4]3-[E5]₃~[E6]₃-[E7]₃~[E8]₃-[E9]₃(Multimérica #14) suspensa em glicerol em PBS a 50% ou suspensa em IFA como um adjuvante ou com glicerol em PBS a 50% como um controle de veículo. O reconhecimento de epítopos protetores de influenza HA 91-108 e M2 2-12 e de vários vírus da influenza (WISC, WSN, NC, and MAL) pelos soros de camundongos imunizados com polipeptídeo antigênico (#11 e #14, respectivamente) foi determinado através de

ELISA e os resultados são resumidos nas Tabelas 4a e 4b. Um reconhecimento significativo é definido como uma elevação de pelo menos 4 vezes na titulação entre os soros préimunes e os soros após três imunizações IM em intervalos de 2-3 semanas.

Tabela 4a: Vezes de elevação na titulação a vários antígenos de soros pré—imunes e soros após 3 imunizações 10 com polipeptídeo multimérico com múltiplos epitopos em glicerol em PBS a 50%

Imunização	#11 em glicerol em PBS a 50%	#14 em glicerol em PBS a 50%
Camundongos	ICR	BALB/c	ICR	BALB/c	C57Bl/6j	Coelhos
Ab a #11	15	—	64	—	—	—
Ab à #14	256	—	1024	—	—	—
Ab ao HA91- 108	1	1	64	200	1600	10
Ab ao M2 1- 18	1	2	64	5	3	1,5
- Ab ao wise	-	2	-	8	2	2

Imunização	#11 em glicerol em PBS a 50%	#14 em glicerol em PBS a 50%
Ab ao WSN	—	4	—	4	2	2
Ab ao NC	—	ND	—	8	8	2
Ab ao MAL	—	2	—	4	2	2

Tabela 4b: Vezes de elevação na titulação a vários antigenos de soros pré-imunes e soros após 3 imunizações com polipeptídeo multimérico com múltiplos epitopos em IFA como um adjuvante

Imunização	#11 em adjuvante	#14 em adjuvante
Camundongos	BALB/c	BALB/c	C57Bl/6j	Coelhos
Ab ao WISC	4	8	4	8
Ab ao WSN	4	8	2	16
Ab ao NC	ND	8	2	8
Ab ao MAL	2	4	2	8

Ambos os grupos mostram alto reconhecimento do antígeno de imunização, os peptídeos HA91-108 and M2 2-18 foram reconhecidos apenas pelos soros de camundongos imunizados com #14, mas não com soros de camundongos imunizados com. #11.

Soros humanos normais puderam reconhecer candidatos à vacina multimérica, indicativo de que respostas de memória potenciais são estimuladas após imunização de seres humanos com essa vacina. Titulações médias de 4 soros humanos à #11 e #14 foram de 6000 e 6400, respectivamente.

Exemplo 6: Proteção contra um estimulo altamente letal com H3N2 A/Texas/1/77

Grupos de oito camundongos transgênicos foram imunizados três vezes, em intervalos de 3 semanas, intramuscularmente com a vacina Multimérica #14 ou com PBS. Uma infecção de estímulo com uma dose altamente letal (LD₅₀de 300) de H3N2 A/Texas/1/77 foi fornecida três semanas após o último reforço. Os camundongos foram sacrificados cinco dias pós-infecção. Uma redução significativa na titulação do vírus em pulmões de camundongos foi observada, conforme descrito na Figura 5, a despeito da grande quantidade de vírus usada para infecção.

Exemplo 7: Estudos de eficácia in vivo

Duas versões de vacina foram avaliadas in vivo: o polipeptídeo multimérico suspenso em glicerol em PBS a 50% ou em Adjuvante Incompleto de Freund.

A vacina purificada é usada em vários modelos de camundongo para estabelecer sua eficácia, mecanismo de ação e dados de toxicologia preliminares antes da toxicologia de dose repetida. A resposta humoral, bem como estudos farmacodinâmicos, são realizados em vários gêneros de camundongo. Um modelo animal que é empregado para a avaliação da vacina é o camundongo transgênico para HLA A* 0201. Esse modelo é usado para determinação da dose ótima, bem como para parâmetros celulares da resposta imune a fim de revelar seu mecanismo de ação.

Exemplo 8:

A eficácia da vacina foi demonstrada em dois estudos preliminares usando camundongos ICR e transgênicos (HLA A* 0201). Os camundongos foram vacinados intramuscularmente três vezes com intervalo de 3 semanas com uma dose de 150 mcg/camundongo das vacinas #11, #12 e #14 com e sem adjuvante (TEA). Três a quatro semanas após a última imunização, os camundongos foram infectados com uma LD50 de 300 de uma cepa H3N2 do vírus da influenza adaptada de camundongo (A/Texas/1/77) . Cinco dias pós-infecção, a taxa de sobrevivência foi monitorada. Grupos tratados e de controle imunizados com glicerol em PBS a 50% com e sem IFA foram comparados.

A taxa de sobrevivência (Figura 6A) após infecção com LD50 de 300 em camundongos ICR foi de 100% enquanto que, nos grupos de controle (glicerol em PBS a 50%), uma taxa de sobrevivência de 20% foi demonstrada.

A carga viral em seus pulmões é detalhada na Figura

6B para as vacinas #11 e #14 apenas. A carga viral nos grupos onde 100% de sobrevivência é encontrada é significativamente menor do que a carga viral nos grupos de controle (p < 0,05). Em virtude do pequeno número de camundongos por grupo (5 camundongos), a análise estatística foi feita usando Teste Exato de Fisher Twosided. Um p valor de 5% ou menos é considerado

estatisticamente significativo. Os dados	foram	analisados
usando o SAS®	versão 9	.1 (SAS Institute,	Gary,	Carolina	do
Norte).
Conforme	para	a sobrevivência	em	camundongos
transgênicos	(Figura	7) imunizados com a	vacina	em
glicerol/PBS	a 50%,	usando os mesmos	procedimentos	de
vacinação e	infecção	mencionados acima, as	taxas	de

sobrevivência foram de 80% e 60% à vacinação com #11 e #14, respectivamente, quando comparado a 20% no grupo de controle. A vacina #12 não foi prognostica nesse modelo de camundongo, bem como as vacinas adjuvantadas testadas (IFA). Parece que, nesse modelo animal ou pelo menos nesse estudo, a adição de adjuvante foi desnecessária e mesmo reduziu o potencial protetor da vacina.

Exemplo 9: Toxicologia com dose repetida

Ensaios de toxicologia com dose repetida são realizados com a vacina #14 (Vacina multimérica em três repetições em bloco suspensa em glicerol em PBS a 50% ou em

Adjuvante Incompleto de Freund, de acordo com um protocolo baseado em:

http://www3.niaid.nih.gov/daids/vaccine/Science/VRTT/06 Saf etyTest.htm.

Um estudo preliminar de toxicologia relacionada à dose é realizado em camundongos exogâmicos ICR. Três animais por sexo por dose para cada ponto de tempo de sacrifício são empregados para testar a histocompatibilidade de seus principais órgãos após administração intramuscular da vacina uma, duas e três vezes.

Ά maior dose destinada a uso clínico é empregada em uma dosagem repetida de 6 semanas contendo três vacinações quinzenais é provavelmente suficiente para avaliar a toxicidade do produto e permitir duas repetições. Os estudos incluem monitoramento do estágio em-vida, seguido por uma faixa completa de parâmetros toxicológicos, incluindo necrópsia e exame histopatológico completo de todos os principais órgãos de 2 em 2 dias e 2 semanas pósimunização de forma a demonstrar que quaisquer efeitos toxicológicos observados durante o período de tratamento eram reversíveis.

Exemplo 10: Ensaio clinico em Fase I/IIa

O objetivo primário desse estudo clínico é examinar a segurança da vacina anti-influenza preventiva após uma única ou dupla administração intramuscular. 0 estudo é conduzido sob um ambiente clínico controlado entre voluntários saudáveis com idade de 18 a 49 anos de idade. O objetivo secundário é estimar a imunogenicidade induzida através de administração da vacina multimerica. Esse estudo em fase I/II avalia os efeitos adversos agudos mais comuns e examina o tamanho de doses que pacientes podem tomar seguramente sem uma alta incidência de efeitos colaterais.

Exemplo 11: Resposta antiviral em soro de camundongos imunizados com vacina comercial contra influenza seguido por imunização com vacina multimérica

Camundongos transgênicos para HLA A* 0201 foram imunizados com a vacina comercial inativada contra influenza (virion dividido) BR Vaxigrip® três vezes, nos

dias 0, 60,	81 ou com	Vaxigrip®	uma ve z,	no	dia 0 e 2
imunizações	adicionais	(nos dias	60 e 81)	com	as vacinas
multiméricas	#11, #12	and #14.	A coleta	de	sangue foi

realizada antes da imunização (pré-imune) e após a última imunização. Anticorpos à várias cepas de influenza foram determinadas em soros empoçados: H3N2: A/Wisconsin/67/05, A/Texas/1/77, A/Calífornía/07/2007 , A/Fujian/411/2002, A/Moscow/10/99 and A/Panama/2007/99; H1N1: A/New

Caledonia/20/99, A/WSN/33, A/PR8/34B: B/Malaysia/2506/04 , B/Lee/40.

Após a primeira imunização com Vaxigrip®, a qual se destina a uma única imunização em seres humanos, não houve elevação significativa nas titulações a todos os vírus (exceto quanto à elevação de 4x na titulação de A/California).

Os resultados são mostrados nas tabelas 5A e 5B. Com as formulações multiméricas, imunização prévia com

Vaxigrip® não elevou significativamente a resposta aos vírus quando comparado com outros dados a partir de estudos de imunização onde respostas humorais similares foram demonstradas. Uma elevação máxima de 8 vezes nas titulações pós/pré-imune foi observada após duas imunizações com a 15 vacina multimérica. O grupo de controle administrado com PBS foi negativo para todos os vírus. Na comparação das diferentes variantes multiméricas, #14 foi o melhor candidato em termos de resposta humoral a vírus.

Tabela 5A. H3N2

Tratamento	Imuni- dade	wise	Texas	Cali- for	Fujian	Moscou	Panamá
t	f	t	f	t	f	t	f	t	f	t	f

lx Vaxigr ip + 2x Multi# 11	0	200		200		800		400		400		400
1	400	2	400	2	800	1	800	2	800	2	800	2
2 +	800	4	400	2	3200	4	800	2	800	2	1600	2
lx Vaxigr ip + 2x Multi# 12	0	400		200		400		400		800		800
1	800	2	400	2	1600	4	400	1	800	1	800	1
2 +	800	2	400	2	3200	8	1600	4	1600	2	3200	4
lx Vaxigr ip + 2x Multi# 14	0	200		200		800		400		400		800
1	800	4	400	2	1600	2	800	2	1600	4	3200	4
2 +	1600	8	1600	8	3200	4	1600	4	3200	8	6400	8
PBS	1	200		100		200		200		200		200
2 +	200	1	100	1	200	1	200	1	200	1	400	2

Tabela 5B. H1N1 e influenza B

Tratamento

Imunidade

NC

WSN

PR8/34

B/Malásia

B/Lee

		t	f	t	f	t	f	t	f	t	f
lx Vaxigrip + 2x Multi# 11	0	100		200		400		400		200
1	400	4	400	2	800	2	1600	4	400	2
2 +	400	4	800	4	800	2	1600	4	400	2
lx Vaxigrip + 2x Multi# 12	0	200		200		200		800		100
1	400	2	400	2	400	2	800	1	400	4
2 +	400	2	800	4	400	2	800	1	400	4
lx Vaxigrip + 2x Multi# 14	0	100		200		100		200		200
1	400	4	800	4	400	4	400	2	400	2
2 +	400	4	1600	8	400	4	1600	8	400	2
PBS	1	100		100		100		100		100
2 +	100	1	200	2	200	2	200	2	100	1

Exemplo 12: Síntese de peptídeo

Peptídeos e peptideos multiméricos foram sintetizados usando síntese de peptídeo em fase sólida típica com os seguintes materiais: aminoácidos protegidos, 95 fluorenilmetilóxicarbonil-N-hidróxi-succinimida (Fmoc-OSu), hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidona-fosfônio (PyBrop), resinas de poliestireno metilbenzidrilamina de Rink (MBHA) e muitos suportes orgânicos para síntese de peptídeo em fase sólida (SPPS) foram adquiridos da Nova Biochemicals (Laufelfingen, Suíça). Bis(triclorometil)carbonato (BTC) foi adquirido da Lancaster (Lancashire, Inglaterra), ácido trifluoroacético (TFA) e solventes para cromatograf ia de líquido de alto desempenho (HPLC) foram adquiridos da Βίο-Lab (Jerusalém, Israel).

Solventes para química orgânica foram adquiridos da Frutarom (Haifa, Israel). Os espectros de ressonância magnética nuclear (NMR) foram registrados sobre um espectrômetro Bruker AMX-300 MHz. Os espectros de massa foram realizados sobre um espectrômetro de massa de retenção de ions Finnigan LCQ DUO. Cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada sobre lâminas de gel de silica Merck F245 60 (Darmstadt, Alemanha) . Análise por HPLC foi realizada usando uma coluna RP analítica Vydac (C18, 4,6 X 250 mm, catálogo número 201TP54) e foi realizada sobre uma bomba Merck-Hitachi L-7100 e um detector de comprimento de onda variável Merck-Hitachi L-7400 operando a 215 nm. A fase móvel consistia de um sistema de gradiente, com solvente A correspondendo à água com TFA a 0,1% e solvente B correspondendo a acetonitrilo (ACN) com TFA a 0,1%. A fase móvel começou com 95% de A de 0 a 5 min, seguido por um gradiente linear de 5% de B a 95% de B de 5 a 55 min. O gradiente permaneceu a 95% de A durante mais 5 min para obter equilíbrio da coluna. A taxa de fluxo da fase móvel foi de 1 mL/min. Purificação de peptídeo foi realizada através de HPLC de fase reversa (RP-HPLC) (sobre uma bomba 5 L-6200A, Merck-Hitachi, Japão), usando uma coluna RP preparativa Vydac (C8, 22 x 250 mm, catálogo número

218TP1022). Toda HPLC preparativa foi realizada usando um sistema de gradiente com solvente A, correspondendo à água com TFA a 0,1% e solvente B, correspondendo a ACN com TFA a 10 0,1%.

Embora a presente invenção tenha sido particularmente descrita, aqueles habilitados na técnica apreciarão que muitas variações e modificações podem ser feitas. Portanto, a invenção não deve ser construída como restrita às 15 modalidades particularmente descritas e o escopo e conceito da invenção serão mais prontamente entendidos através de referência às reivindicações as quais seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídio multimérico com múltiplos epítopos caracterizado pelo fato de compreender múltiplas cópias de uma pluralidade de epítopos peptídicos do vírus da influenza dispostos em uma configuração selecionada de uma estrutura polimérica sequencial alternada (X₁X2X₃...X9)_n e uma estrutura copolimérica em bloco (X₁)_n(X2)_n(X₃)_n...(X9)_n, em que n é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 3-5, e cada um dos X₁-X9 é um epítopo peptídico de influenza selecionado do grupo consistindo em HA 354-372 correspondente ao E1 de SEQ ID NO: 82, HA 91-108

correspondente ao E2 de SEQ ID NO: 48 , M1 2-12 correspondente ao E3 de SEQ ID NO: : 25, HA 150-159 correspondente ao E4 de SEQ ID NO: : 52, HA 143-149 correspondente ao E5 de SEQ ID NO: : 51, NP 206-229 correspondente ao E6 de SEQ ID NO: : 64, HA 307-319 correspondente ao E7 de SEQ ID NO: : 59, NP 335-350 correspondente ao E8 de SEQ ID NO: 69 e NP 380-393 correspondente ao E9 de SEQ ID NO : 70
2. Polipeptídio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo em:

i. nove diferentes epítopos peptídicos de vírus influenza dispostos na seguinte ordem polimérica sequencial

Petição 870190081530, de 21/08/2019, pág. 72/79

2/3 alterna: [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]_n, onde n é 3 ou 5; e ii. três repetições de nove diferentes epítopos peptídicos de vírus influenza dispostos na seguinte estrutura de copolímero em bloco: [E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9].
3. Polipeptídio, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 86 e SEQ ID N° 88.
4. Polipeptídio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma sequência carreadora.
5. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de codificar um polipeptídio com múltiplos epítopos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
6. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de codificar uma

sequência de polipeptídio selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 86 e SEQ ID N° 88, ou compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 85 e SEQ ID N° 87. 7. Vacina para imunização de um indivíduo contra

influenza caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um polipeptídio definido na reivindicação 1.

Petição 870190081530, de 21/08/2019, pág. 73/79

3/3
8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender um adjuvante.
9. Uso de um polipeptídio conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo fato de ser para preparar uma composição de vacina para imunização contra influenza.