BRPI0801906A2 - seqüência geneticamente modificada do antìgeno ts de trypanosoma cruzi, proteìna recombinante ts e vìrus geneticamente modificados que expressam o antìgeno ts recombinante - Google Patents

Abstract

SEQUêNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTìGENO TS DE TRYPANOSOMA CRUZI, PROTEìNA RECOMBINANTE TS E VìRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM O ANTìGENO TS RECOMBINANTE. A presente invenção diz respeito à construção de uma sequência geneticamente modificada do antígeno TS de Trypanosoma cruzi, uma proteína recombinante codificada pela referida sequência e vírus geneticamente modificados que expressam o antígeno TS recombinante. A invenção é útil para a imunização de mamíferos contra doença de Chagas.

Description

"SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO TS DETRYPANOSOMA CRUZI, PROTEÍNA RECOMBINANTE TS E VÍRUSGENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM O ANTÍGENO TSRECOMBINANTE"

A presente invenção diz respeito à construção de uma seqüênciageneticamente modificada do antígeno TS de Trypanosoma cruzi, uma proteínarecombinante codificada pela referida seqüência e vírus geneticamente modificadosque expressam o antígeno TS recombinante. A invenção é útil para a imunização dernamíferos contra doença de Chagas.

A infecção pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi causa a doença deChagas, uma doença negligenciada que afeta mais de 16 milhões de habitantes naAmérica Latina. Mais de 300.000 novos pacientes tornam-se infectados pelo T. cruzianualmente, apesar do uso de fármacos ter diminuído sensivelmente os índices demortalidade e morbidade associados a esta doença. Os fármacos utilizados para otratamento da doença de Chagas em indivíduos infectados cronicamente não sãoeficazes e parasitas naturalmente multiresistentes a quimioterapia já foram descritosem várias regiões da América Latina (URBINA. J.A. Specific treatment of Chagasdísease: Current status and new developments. Curr. Opin. Infect. Dis. 14, 733-741. 2001).

A proteção imunológica contra esse parasita parece ser altamente dependenteda indução das respostas das células T CD8+ e interferon gama (IFN-gama),similarmente ao encontrado para os estágios pré-eritrocíticos para espécies dePlasmodium ou para infecções causadas por Toxoplasma gondii. Células T CD4+ comperfil de secreção de citocinas de linfócitos T helper tipo 1 (Th1) e anticorpos tem sidodescritos como mediadores da proteção contra todas as doenças citadasantèriormente. Portanto, o desenvolvimento de uma vacina contra T. cruzi ajudaria naindução de ampla imunidade contra antígenos de parasitas (BRENER Z. andGAZZINELLI R.T. Immunological control of Trypanosoma cruzi infection andpathogenesis of Chagas disease. Int. Arch. Allergy Immunol. 1997. 114,103-110).

Vários estudos focalizaram o desenvolvimento de uma vacina utilizando-separasitas T. cruzi atenuados (MENEZES H. Active immunization of mice with the aviru-Ient Y strain of Trypanosoma cruzi against experimental infection of mice. Rev. Inst.Med. Trop. Sao Paulo. 1968. 10, 1-4) ou mortos (BASOMBRIO M.A. Trypanosomacruzi: Partial prevention of the natural infection of guinea pigs with a killed parasitevaccine. Exp. Parasitol. 1990. 71,1-8). Infelizmente, a maioria das imunizações só foicapaz de atrasar as manifestações da doença ou, na melhor das circunstâncias,diminuir a patologia associada. A proteção efetiva contra T. cruzi poderia seralcançada quando fossem utilizados adjuvantes que direcionassem uma resposta Th1(HOFT D.F. & EICKHOFF C.S. Type 1 immunity provides both optimal mucosal andsystemic protection against a mucosally invasive, intracellular pathogen. Infect. Immun.2005. 73, 4934-4940) e/ou vacinas de subunidades de DNA que codificassem certosantígenos do parasito (SEPULVEDA P., HONTEBEYRIE M., LIEGEARD P., MASCILLIA., NORRIS K.A. DNA-based immunization with Trypanosoma cruzi complementreguIatory protein elicits complement Iytic antibodies and confers protection againstTrypanosoma cruzi infection. Infect. Immun. 2000. 68, 4986-4991. SCHNAPP A.R.,EICKHOFF C.S., SCHARFSTEIN J.,HOFT D.F. Induction of B- and T-cell responses tocruzipain in the murine model of Trypanosoma cruzi infection. Microbes Infect. 2002. 4,805-813. FRALISH B.H. & TARLETON R.L. Genetic immunization with LYT1 or a poolof trans-sialidase genes protects mice from Iethal Trypanosoma cruzi infection.Vaccine. 2003. 21, 3070-3080).

Quando vacinas de DNA plasmidiais foram utilizadas, dois antígenos foramtestados com sucesso: trans-sialidase (TS) e proteína-2 de superfície amastigota(ASP-2) (COSTA F., FRANCHIN G., PEREIRA-CHIOCCOLA V.L., RIBEIRAOM. M.,SCHENKMAN S., RODRIGUES, M.M. Immunization with a plasmid DNA containingthe gene of trans-sialidase reduces Trypanosoma cruzi infection in mice. Vaccine.1998. 16, 768-774. FUJIMURA A.E., KINOSHITA S.S., PEREIRA-CHIOCCOLA V.L.,RODRIGUES M.M. DNA sequences encoding CD4+ and CD8+ T-cell epitopes areimportant for efficient protective immunity induced by DNA vaccination with aTrypanosoma cruzi gene. Infect. Immun. 2001. 69, 5477-5486. GARG. N. &TARLETON R.L. Genetic immunization elicits antigen-specific protective ímmuneresponses and decreases disease severity in Trypanosoma cruzi infection. Infect.Immun. 2002. 70, 5547-5555. BOSCARDIN S.B., KINOSHITA S.S., FUJIMURA A.E.,RODRIGUES M.M. Immunization with cDNA expressed by amastigotes ofTrypanosoma cruzi elicits protective immune response against experimental infection.Infect. Immun. 2003. 71, 2744-2757. FRALISH B.H. & TARLETON R.L. Geneticimmunization with LT1 or a pool of trans-sialidase genes protects mice from IethalTrypanosoma cruzi infection. Vaccine. 2003. 21, 3070-3080. VASCONCELOS J.R.,HIYANE M.I., MARINHO C.R., CLASER C., MACHADO. A.M., GAZZINELLI R.T.,BRUNA-ROMERO O., ALVAREZ J.M., BOSCARDIN S.B., RODRIGUES M.M.Protective immunity against Trypanosoma cruzi infection in a highly susceptible mousestrain after vaccination with genes encoding the amastigote surface protein-2 andtrans-sialidase. Hum. Gene Ther. 2004. 15, 878-886)

TS é um antígeno expresso na fase tripomastigota que catalisa a transferênciade ácidos siálicos de glicoconjugados do hospedeiro para o aceptor de moléculas namembrana plasmática do parasito (SCHENKMAN S., EICHINGER D., PEREIRA M.E.,NUSSEN-ZWEIG V. Structural and functional properties of Trypanosoma trans-sialidase. Annu. Rev. Microbiol. 1994. 48, 499-523).

Os vírus recombinantes têm se mostrado eficientes para o desenvolvimento devacinas. Testes clínicos com candidatos de vacinas baseados em vírus recombinantespara malária, tuberculose e AIDS demonstram níveis sem precedentes de respostaimunológica celular contra os produtos recombinantes expressos pelos vírus, quandoem comparação com formulações vacinais baseadas em proteínas recombinantespurificadas ou vacinas de DNA plasmidiais (ROCHA C., CAETANO B., MACHADO A.,BRUNA-ROMERO O. Recombinant viruses as tools to induce protective cellularimmunity against infectious diseases. Int. Microbiol. 2004. 7, 89-94).

Uma vantagem no uso de vírus recombinantes situa-se no fato de a própriapartícula viral desempenhar um efeito adjunto por ela mesma, o que permite evitar ouso de outros compostos adjuvantes ou citocinas. Portanto, adenovírusrecombinantes, vírus influenza, vírus vaccínia (MVA) destacam-se pela suaspropriedades imuno-modulatórias (GUILLOT L., LE GOFFIC R., BLOCK S., ESCRIOUN., AKIRA S., CHIGNARD. M. SITAHAR M. Involvement of toll-like receptor 3 in theimmune response of Iung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus.J. Biol. Chem. 2003. 280, 5571-5580).

O mecanismo de ação das vacinas baseadas em adenovírus recombinantesconsiste na infecção de células do hospedeiro, resultando na expressão dos antígenosheterólogos ao nível do citoplasma das células infectadas. O antígeno assim expressopoderá ainda ser secretado. Os adenovírus recombinantes são altamenteimunogênicos, devido à sua capacidade em infectar células imunes especializadas naapresentação de antígenos, como as células dendríticas, por exemplo. Soma-se aisso, o efeito imuno-estimulador exercido por algumas proteínas do capsídeo viral, oque resulta na potencialização da resposta imune, bem como num melhordirecionamento do perfil de citocinas produzidas pelas células efetoras para um tipoTh1, o que é importante na proteção contra agentes parasitários como o T. cruzi.

A grande maioria das técnicas de construção de poxvírus recombinantes, entreos quais se inclui o vírus MVA (Vírus Vaccinia Ankara Modificado), envolve arecombinação homóloga de DNA em células infectadas. De uma forma geral, aprodução de vírus recombinantes emprega vetores plasmidiais de transferênciacontendo um cassete de expressão onde o gene exógeno é controlado por umpromotor forte, normalmente precoce e tardio, dos poxvírus. Este cassete éflanqueado por seqüências de DNA homólogas a seqüências presentes no genoma dovírus, e servirão para dirigir a recombinação ao lócus desejado.

Em nossas construções, os plasmídeos de transferência dirigem a inserção dosgenes exógenos nos sítios denominados Região de Deleção Il e/ou Região deDeleção Ill do genoma do vírus MVA. Estas são regiões genômicas cujos genespresentes foram alterados, removidos ou mutados durante o processo de geração dovírus, a cerca de 40 anos atrás. Desta forma, estas regiões ditas naturalmentemodificadas (ou mutadas) são propícias para a inserção de cassetes de expressão degenes exógenos, uma vez que a inserção destes elementos não altera nenhumafunção vital do vírus MVA. A taxa de recombinação é relativamente alta, em torno de0,1%, e os vírus recombinantes podem ser selecionados, purificados em placa eamplificados.

A segurança do vetor vacinai baseado no MVA foi experimentalmentedemonstrada quando macacos artificialmente imuno-suprimidos foram inoculados comaltas doses do vírus (109 PFUs - uma quantidade 100 vezes superior à dosenormalmente usada para imunização por poxvírus). Durante todo período deacompanhamento os animais não demonstraram nenhuma anormalidadehematológica ou patológica. Estas características não-replicativas do MVA fazem comque o vírus possa ser trabalhado em condições de Biossegurança de Nível 1, etambém impedem que o vírus se espalhe para indivíduos não vacinados ou mesmopara o meio-ambiente. Apesar da extensa limitação replicativa em determinadascélulas, tais como as de mamíferos, o MVA manteve todas as características tãopeculiares que fazem dos Poxvírus atraentes vetores de expressão eucariota,incluindo-se sua enorme capacidade de acomodar DNA exógeno em seu genoma (até25 Kb); controle viral preciso da expressão de proteínas codificadas por genes viraisou recombinantes;absoluta ausência de persistência viral ou integração no genoma dohospedeiro; e facilidade para a produção de vetores e vacinas recombinantes.

Na presente invenção, os plasmídeos de transferência consistem basicamentede cDNAs codificantes das proteínas de interesse vacinai clonados no plasmídeopLW44 (Figura 1) ou similares. Ao seu lado, e em orientação oposta, está clonado ogene marcador que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). A co-expressãodesta proteína é usada para facilitar a seleção dos vírus recombinantes. Estes doisgenes são, por fim, flanqueados por seqüências de DNA do vírus MVA homólogas aosítio de inclusão no genoma do vetor viral, denominado Região de Deleção III.

Na figura 2, no sentido 5' - 3', o cassete de inserção consiste de: Seqüêncianucleotídica homóloga à porção 5'da Região de Deleção Il e/ou Região de Deleção Illdo genoma de MVA (1); Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (2); genecodificador de proteína marcadora - Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou proteínavermelha Fluorescente (RFP) (3); sítio de clonagem para o cDNA/Gene exógeno deinteresse (4), Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (5); nucleotídicahomóloga à porção 3'da Região de Deleção Il e/ou Região de Deleção Ill do genomade MVA (6). Embora tanto as regiões de Deleção Il e Ill do vírus MVA possam serigualmente utilizadas para a inserção de cassetes de expressão de genes exógenos,as construções descritas nesta patente foram criadas a partir da inserção de diferentescassetes de expressão apenas na região de Deleção III, ficando a inserção na região Ilcomo uma alternativa metodológica factível, a ser usada oportunamente.

A seguir, a presente invenção será descrita detalhadamente através deexemplos. É necessário frisar que a invenção não está limitada a esses exemplos,mas que também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais elafunciona.

EXEMPLO 01: Construção dos Plasmídeos de Transferência

A construção dos plasmídeos de transferência contendo o cDNA que codifica osegmento selvagem da neuraminidase (NA) do vírus WSN contém o segmento da NAclonado em orientação negativa no plasmídeo de transferência pPR7 entre aseqüência truncada do promotor da polimerase I humana (pol I) e a seqüência daribozima do vírus da hepatite δ. Este tipo de construção permite a síntese de umamolécula de vRNA sintética nas células transfectadas. O plasmídeo pPRNA38 foiconstruído a partir do plasmídeo pPRNA35. Ele codifica um segmento recombinanteda NA, na qual a ORF da NA é seguida pela duplicação da região promotora 3', umsítio de clonagem Xho\ / Nhe\, uma duplicação dos últimos 42 nucleotídeos da ORF daNA e a região promotora 5'original (Figura 03).

O plasmídeo de transferência pPRNA38-dTS foi construído para a expressãode um fragmento de 660 nucleotídeos do gene da TS, o qual contém os epítoposreconhecidos por linfócítos Β, T CD4+ e CD8+. Resumidamente, para a construção doplasmídeo pPRNA38-TS, o fragmento da TS foi obtido por PCR utilizando osoligonucleotídeos senso GGG CTC GAG CAT GGG GAA AAC AGT CGT TGG e anti-senso GGG GCT AGC TAA ATG GAT ACT TGC CCA ACG TTA TAA ATA CCG CCAAGA AAT TGA TTT GT. Este último contém a seqüência que codifica para os epítoposda TS reconhecidos pelos linfócitos T CD8+. O produto de amplificação obtido foipurificado e posteriormente clonado no plasmídeo pPRNA38, entre os sítios Xho\ eNhe I.

EXEMPLO 02: Produção dos vírus Influenza recombinantes por genéticareversa

A estratégia de expressão utilizada pelos pesquisadores da presente invençãofoi baseada nos estudos demonstraram que o complexo polimerase do vírus influenzaé capaz de reconhecer os promotores 3'e 5'mesmo quando estes se localizam nointerior de um pseudo-segmento viral. Desta forma, os pesquisadores da presenteinvenção exploraram essas observações para construir vírus influenza recombinantes,carregando de maneira estável um segmento bicistrônico da NA1 na qual umaseqüência heteróloga se encontra sob o controle de uma região promotora3'duplicada. Tais segmentos bicistrônicos podem ser transcritos e replicados de duasmaneiras distintas, após a interação da região promotora 5' com cada uma das duasregiões promotoras 3'. Neste tipo de construção, a região codificadora da NA seencontra na posição 3' proximal e a seqüência heteróloga está localizada próxima àextremidade 5'. Dessa forma, uma vez que a expressão da proteína NA é essencialpara a viabilidade viral, nós asseguramos que um segmento bicistrônico completo, foimantido ao longo da propagação dos vírus recombinantes. Os vírus influenza foramobtidos por genética reversa de acordo com a técnica descrita previamente por Fodore colaboradores (Figura 04).

Resumidamente, monocamadas sub-confluentes de células co-culturas decélulas MDCK e HEK 293T, cultivadas em meio mínimo modificado por Dulbecco(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) foram transfectadas pelosplasmídeos codificando o segmento selvagem ou recombinantes da NA, bem como osplasmídeos que codificam os demais 7 segmentos do vírus influenza, juntamente comos plasmídeos que codificam as quatro proteínas do complexo de replicação do vírusinfluenza (pcDNA-PB1, pcDNA-PB2, pcDNA-PA e pcDNAA-NP), utilizando o reagentede transfecção Fugene 6 (Roche) (Figura 05).

Desta forma, oito complexos ribonucleoprotéicos foram reconstituídos in vivopermitindo a transcrição e a replicação de todos os segmentos virais e a síntese denovos vírions. Após 24 horas de incubação a 35°C, as células transfectadas foramincubadas durante mais dois dias em DMEM suplementado 2% SFB. Os vírusrecombinantes assim obtidos foram amplificados uma vez em células MDCK epurificados duas vezes por placas de Iise em células MDCK1 antes de seremsubmetidos a uma amplificação final em células MDCK. Os estoques virais terão seustítulos infecciosos determinados em células MDCK pelo método de placas de Iise sobuma camada de agarose em meio DMEM com 2% de SFB. A presença da seqüênciaheteróloga no genoma viral foi analisada pelas técnicas de PCR e seqüenciamento.

EXEMPLO 03: Obtenção e caracterização de vírus influenza recombinantescarreando uma seqüência heteróloga.

Os vírus carreando um fragmento da proteína TS (vNA38-TS) de Trypanosomacruzi foram obtidos pela técnica de obtenção de vírus recombinantes inteiramente apartir de plasmídeos (conforme descrito na figura 01). Os genomas dos vírusportadores dos segmentos bicistrônicos acima mencionados foram analisados por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos que permitem analisar a região de inserção daseqüência heteróloga. Fragmentos de amplificação do tamanho esperado foramobtidos foram observados (dados não mostrados), indicando que os mesmos haviamconservado a seqüência heteróloga nos seus genomas.

EXEMPLO 04: Produção de um fragmento da proteína heteróloga TS emcélulas MDCK infectadas pelos vírus influenza recombinantes.

Monocamadas confluentes foram infectadas com 2 m.o.i do vírus selvagemvNA ou do dois clones vírus recombinante vNA38-TS. 24 horas após as infecções,extratos celulares foram preparados e a proteína TS foi analisada por western blot.Conforme apresentado na figura 05, níveis significativos das proteínas TS puderamser detectados nas células MDCK, demonstrando a capacidades dos vírus influenzarecombinantes em expressar essas seqüências heterólogas.

EXEMPLO 05: Produção dos Vírus Parentais e Recombinantes em cultivocelular.

A multiplicação dos vetores virais parentaís (MVA) ou recombinantes deve serfeita em células fibroblásticas de embriões de galinha (CEF), produzidos através docultivo primário de embriões de cerca de 10 dias de postura. Brevemente, os embriõessão dissecados em condições estéreis para retirada dos órgãos internos. Em seguidaas células são dispersas mecanicamente, através de passagem em seringas, etambém quimicamente, através da incubação com tripsina. As células são lavadaspara remoção de hemácias e outros contaminantes, e em seguida são suspensas esedimentadas em frascos plásticos contendo meio E-MEM ou DMEM suplementadoscom 10% de soro fetal bovino. A construção dos vetores poxvirais se baseia narecombinação homóloga dos vírus em células infectadas na presença de plasmídeosde transferência contendo os DNAS codificadores dos antígenos-alvo.

Em seguida, os recombinantes são gerados através da transfecção dosplasmídeos de transferência em células de embrião de galinha (CEF) previamenteinfectadas pelo vírus MVA. Resumidamente, CEFs são infectados com MOI de 0,1 a 1dos vírus MVA parentais. Após uma hora de adsorção, adiciona-se às célulasinfectadas uma solução contendo 2 pg do plasmídeo de transferência e 5μΙ do agentetransfectante Lípofectamina (Invitrogen, EUA). As células são incubadas por 5 horas,quando o meio de transfecção é removido e substituído por meio de cultivosuplementado com 2,5% de soro fetal bovino. As células são então incubadas pormais 48 horas e coletadas ao final do período. Os vírus recombinantes sãoselecionados e purificados em ciclos sucessivos de purificação de placa, através davisualização em microscópio da presença da proteína marcadora GFP (fluorescênciaverde). Cabe ressaltar que, através da maneira como o vetor de transferência foielaborado, somente vírus recombinantes contendo o cassete de expressão do geneexógeno deverão expressar também a proteína GFP. Após os ciclos de purificaçãodos clones recombinantes, estes têm seus títulos amplificados em ciclos sucessivosde infecção de número crescente de células. Quando títulos da ordem de 109 PFUs/mlsão alcançados, as suspensões virais são purificadas em colchão de sacarose ehomogeneizadas em Tris-HCI 10mM, sendo aliquotados e estocados a -70°C.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: A) Plasmídeo pLW44, vetor de transferência para construção dosvírus MVA recombinantes. O Sítio de clonagem do gene codificador da proteína deinteresse é clonado entre os sítios de restrição para as enzimas Smal e Xbal. O genecodificador da proteína GFP está representado. Os promotores não estãorepresentados. B) Exemplo de plasmídeo pronto para utilização, onde o genecodificador da proteína A2, por exemplo, de Leishmania, foi inserido.Figura 02 - (A) Plasmídeo de transferência para construção dos vírus MVArecombinantes. B) Detalhe do cassete de inserção e expressão contendo osseguintes elementos gênicos: Seqüência nucleotídica homóloga à porção 5'da Regiãode Deleção Il e/ou Região de Deleção Ill do genoma de MVA (1); Promotor modificadoprecoce/tardio do vírus Vaccínia (2); gene codificador de proteína marcadora -Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou proteína vermelha Fluorescente (RFP) (3); sítiode clonagem para o cDNA/Gene exógeno de interesse (4), Promotor modificadoprecoce/tardio do vírus Vaccínia (5); nucleotídica homóloga à porção 3'da Região deDeleção Il e/ou Região de Deleção Ill do genoma de MVA (6).

Figura 03: Representação esquemática dos plasmídeos de transferência parasíntese dos segmentos bicistronicos da NA derivados do vírus influenza A/WSN/33. Oplasmídeo pPR-NA35 é derivado do plasmídeo pPR-NA, o qual contém o cDNA dosegmento completo da NA em orientação negativa sob o controle do promotortruncado da polimerase I humana. Ele contém o cDNA do segmento recombinante daNA em orientação negativa, no qual a ORF da NA é seguida pela duplicação dopromotor 3', um sítio de clonagem Xhol/Nhel e o promotor 5'original. O plasmídeopPR-NA38 é derivado do plasmídeo pPR-NA35. Ele foi construído para conservar aintegridade da extremidade 5' ao longo dos seus últimos 70 nucleotídeos. Isto foiobtido pela inserção de uma duplicação dos últimos 42 nucleotídeos da ORF da NA(quadrado branco) os quais foram inseridos entre o promotor 5' e o "linker" Xhol/Nhel.pb: pares de base, SMC: sítio múltiplo de clonagem.

Figura 04: Genética reversa do segmento que codifica a neuraminidase dovírus A/WSN/33 sem vírus auxiliar (Plasmid only). Alternativamente, os vírusrecombinantes poderão ser obtidos por genética reversa. Assim, células HEK 293T(7x105 células em placas de 35 mm2, respectivamente) serão co-transfectadas com oplasmídeo que codifica o segmento da NA selvagem ou recombinante (500 ng), porcada um dos plasmídeos que codificam os demais segmentos do vírus influenza (500ng de cada plasmídeo); e pelos plasmídeos que permitem a expressão das proteínasdo complexo polimerase (PA, PB1 e PB2: 500 ng de cada) e da nucleoproteína NP(500 ng) em 10 μΙ de Fugene 6 (Roche), permitindo a reconstituição de 8 complexosribonucleoprotéicos funcionais in vivo e desta forma, a transcrição e a replicação dossegmentos virais. Os sobrenadantes serão coletados 72 horas após a transfecção.Após uma etapa de amplificação em células MDCK1 os vírus transfectantes serãoclonados e posteriormente amplificados em células MDCK. * 4 plasmídeos deexpressão das proteínas do complexo polimerase PA1 PB1 e PB2 e da nucleoproteínaNP. ** 8 plasmídeos de transferência dos segmentos do vírus influenza selvagem orecombinantes. *** vírus recombinantes.

Figura 05: Produção das proteínas TS em células MDCK infectadas com vírusinfluenza recombinantes. Monocamadas confluentes de células MDCK foraminfectadas com uma m.o.i superior a 1 dos vírus influenza recombinantes vNA38-TSou pelo vírus selvagem vNA. 48 horas após a infecção, extratos das células MDCKforam preparados em tampão de amostra para gel de proteína SDS. Após aeletroforese, as amostras foram transferidas para membranas de nitrocelulose eincubadas com um pool de soros de camundongos imunizados com as proteínasrecombinantes TS. Os anticorpos ligados às membranas foram detectados pelaincubação das membranas de imunoblot com anticorpos anti-lgG de camundongoconjugados com peroxidase. A reação de quimioluminescência foi visualizada com oreagente amplíficador de quimioluminescência, seguido de exposição em filmefotográfico.

Figura 06: Genética reversa para obtenção de um vírus influenza que codificapara um fragmento da trans-sialidase (TS) de T. cruzi. Os vírus recombinantes foramobtidos por genética reversa sem vírus auxiliar. Resumidamente, células HEK 293T(7x105 células em placas de 35 mm2, respectivamente) foram co-transfectadas com oplasmídeos pPRNA38-TS (500 ng), por cada um dos plasmídeos que codificam osdemais segmentos do vírus influenza (500 ng de cada plasmídeo); e pelos plasmídeosque permitem a expressão das proteínas do complexo polimerase (PA, PB1 e PB2:500 ng de cada) e da nucleoproteína NP (500 ng) em 10 μΙ de Fugene 6 (Roche). Ossobrenadantes das células foram coletados 72 horas após a transfecção. Os vírusforam submetidos a uma etapa de amplificação em células MDCK1 clonados por placade Iise e submetidos a uma amplificação complementar em células MDCK. Osresultados aqui representados ilustram os fenótipo de 2 clones virais independentes decada um dos vírus recombinantes.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ. ID N. 01 - Fragmento TS

1 ATG GGG AAA ACA GTC GTT GGG GCC AGT AGG ATG TTC TGG CTA ATG 45

Met Gly Lys Thr Val Val Gly Ala Ser Arg Met Phe Trp Leu Met4 6 TTT TTC GTG CCG CTT CTT CTT GCG CTC TGC CCC AGC GAG CCC GCG 90

Phe Phe Val Pro Leu Leu Leu Ala Leu Cys Pro Ser Glu Pro Ala91 CAT GCC CTG GCA CCC GGA TCG AGC CGA GTT GAG CTG TTT AAG CGG 135

His Ala Leu Ala Pro Gly Ser Ser Arg Val Glu Leu Phe Lys Arg

136 CAA AGC TCG AAG GTG CCA TTT GAA AAG GGC GGC AAA GTC ACC GAG 180 Gln Ser Ser Lys Val Pro Phe Glu Lys Gly Gly Lys Val Thr Glu 181 CGG GTT GTC CAC TCG TTC CGC CTC CCC GCC CTT GTT AAT GTG GAC 225 Arg Val Val His Ser Phe Arg Leu Pro Ala Leu Val Asn Val Asp 226 GGG GTG ATG GTT GCC ATC GCG GAC GCT CGC TAC GAA ACA TCC AAT 270 Gly Val Met Val Ala Ile Ala Asp Gly Arg Tyr Glu Thr Ser Asn 271 GAC AAC TCC CTC ATT GAT ACG GTG GCG AAG TAC AGC GTG GAC GAT 315 Asp Asn Ser Leu Ile Asp Thr Val Ala Lys Tyr Ser Val Asp Asp 316 GGG GAG ACG TGG GAG ACC CAA ATT GCC ATC AAG AAC AGT CGT GCA 360 Gly Glu Thr Trp Glu Thr Gln Ile Ala Ile Lys Asn Ser Arg Ala 361 TCG TCT GTT TCT CGT GTG GTG GAT CCC ACA GTG ATT GTG AAG GGC 405 Ser Ser Val Ser Arg Val Val Asp Pro Thr Val Ile Val Lys Gly 406 AAC AAG CTT TAC GTC CTG GTT GGA AGC TAC AAC AGT TCG AGG AGC 450 Asn Lys Leu Tyr Val Leu Val Gly Ser Tyr Asn Ser Cys Arg Ser 451 TAC TGG ACG TCG CAT GGT GAT GCG AGA GAC TGG GAT ATT CTG CTT 495 Tyr Trp Thr Ser His Gly Asp Ala Arg Asp Trp Asp Ile Leu Leu 496 GCC GTT GGT GAG GTC ACG AAG TCC ACT GCG GGC GGC AAG ATA ACT 540 Ala Val Gly Glu Asp Thr Lys Ser Thr Ala Gly Gly Lys Ile Thr 541 GCG AGT ATC AAA TGG GGG AGC CCC GTG TCA CTG AAG GAA TTT TTC 585 Ala Ser Ile Lys Trp Gly Ser Pro Val Ser Leu Lys Glu Phe Phe 586 CCG GCG GAA ATG GAA GGA ATG CAC ACA AAT CAA TTT CTT GGC GGT 630 Pro Ala Glu Met Glu Glu Met His Thr Asn Gln Phe Leu Gly Gly 631 ATT TAT AAC GTT GGG CAA GTA TCC ATT TAG 660 Ile Tyr Asn Val Gly Gln Val Ser Ile STOP

Claims (5)

1. "SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO TS DETRYPANOSOMA CRUZI caracterizada pela seqüência de nucleotídeos compreendera Seq. ID no(1).

2. PROTEÍNA RECOMBINANTE TS caracterizada pela seqüência deaminoácidos compreender a Seq. ID no(1).

3. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA O ANTÍGENOTS RECOMBINANTE caracterizado por compreender a Seq. ID no(1).

4. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA O ANTÍGENOTS RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 03, caracterizado pelo vírus serum adenovírus.

5. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA O ANTÍGENOTS RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 03, caracterizado pelo vírus serum vírus Ankara modificado (MVA).