BRPI0809209A2 - Anticorpos il-12 anti-humanos cristalinos - Google Patents

Description

“ANTICORPOS IL-12 ANTI-HUMANOS CRISTALINOS” REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica prioridade com relação ao Pedido Provisório US número de série 60/920.608, depositado em 29 de março de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método de cristalização em batelada para cristalização de um anticorpo, que permite a produção do anticorpo em uma escala industrial; cristais de anticorpo, especificamente conforme obtidos de acordo com o método revelado; e composições contendo os cristais, bem como métodos de uso dos cristais e composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

a) Cristais de Anticorpo

O mercado de mAb é considerado um dos mercados biofarmacêuticos mais promissores, com cerca de 100 anticorpos monoclonais (mAbs) correntemente sendo avaliados nas fases de estudo clínico 2 ou 3. Uma vez que estes grupos são liberados em doses simples frequentemente excedendo 100 mg, existe uma necessidade urgente de se encontrar estratégias de formulação apropriadas que satisfaçam a estabilidade, segurança e adequação ao paciente. Contudo, formulações de mAb líquido altamente concentradas mostram viscosidade aumentada, o que dificulta o uso de seringa de agulhas finas menos agressivas aos pacientes. Adicionalmente, a tendência das moléculas de mAb de se agregarem em tais concentrações altas aumenta exponencialmente quando comparada às soluções moderadamente concentradas. Isto é inaceitável, com relação à segurança e requisitos de estabilidade.

Assim, a liberação de doses de mAb altas é reservada para volumes grandes, que geralmente devem ser liberados através da infusão. Este modo de dosagem é caro e reduz significativamente a adequação ao paciente.

Portanto, suspensões de cristais de mAb de volume baixo, farmaceuticamente aplicáveis para injeção subcutânea seriam altamente desejáveis. Teoricamente, vias de degradação que influenciam a integridade de mAb seriam significativamente desaceleradas devido à rigidez de uma grade de cristal, onde movimentos na estrutura da proteína são impedidos. Além disto, um aumento na viscosidade seria significativamente reduzido quando comparado às suspensões de cristal altamente concentradas com formulações líquidas. Com relação à liberação prolongada, pode ser possível gerar ou alterar os cristais de proteína, tal que, eles dissolvam lentamente quando colocados no corpo de um paciente. Isto seria um modo muito eficaz de liberar uma formulação de liberação prolongada, uma vez que o uso extensivo dos excipientes e processos que prejudicam a estrutura de mAb não seriam utilizados.

A despeito do grande potencial para emprego de cristais de proteína como uma substância medicamentosa, algumas tentativas foram feitas para avaliar sistematicamente esta estratégia.

Um exemplo bem conhecido é a insulina, que foi sucessivamente cristalizada por décadas atrás. Atualmente, o uso das suspensões de cristal da insulina é bem descrito, ofe5 recendo formulações estáveis e de longa duração, sendo bem estabelecidas no mercado. A discrepância entre o desenvolvimento dos cristais de insulina e a cristalização de todas as outras proteínas pode estar relacionada ao fato de que os agregados de insulina ordenados são formados de forma nativa no pâncreas. Assim, os cristais de insulina são facilmente obtidos quando a insulina é colocada em contato com um excesso de íons zinco. A maioria 10 das outras proteínas tende a formar precipitados desordenados ao invés de cristais e, portanto, encontrar condições de cristalização para uma proteína é uma tarefa não rotineira e consumidora de tempo.

A despeito de um grande interesse na colheita de cristais de proteína para análise de difração de raio x, a obtenção de condições de cristalização apropriadas ainda é uma 15 ciência empírica, como, em princípio, qualquer proteína se comporta de forma diferente. Até o presente, nenhuma regra geral foi encontrada que possa prever de forma confiável uma condição de cristalização de sucesso para escolha de uma proteína. Assim, a obtenção de cristais de uma dada proteína sempre é referida como “o estreitamento” de qualquer aplicação pretendida que for planejada posteriormente.

Anticorpos são especialmente difíceis de serem cristalizados, devido à flexibilidade

da molécula. Não obstante, exemplos de cristais de imunoglobulina são conhecidos há muito tempo. O primeiro exemplo dos cristais de imunoglobulina foi descrito 150 anos atrás por um médico inglês, Henry Bence Jones; ele isolou cristais de um dímero de cadeia leve Ig anormal da urina de um paciente com mieloma (Jones, Η. B. (1848) Philosophical Transacti25 ons of the Royal Society, Londres 138: 55-62). Tais Igs anormais são conhecidas como proteínas de Bence Jones. Em 1938, a cristalização espontânea de uma Ig anormal distinta do soro de um paciente de mieloma foi descrita (von Bonsdorf, B. e outros (1938) Folia Haematologia 59: 184-208), aparentemente como um oligômero de cadeia pesada de Ig (MW (peso molecular) de 200 kDa).

Imunoglobulinas humanas cristalinas da estrutura normal (duas cadeias pesadas li

gadas a duas cadeias leves) foram descritas nos trinta anos, novamente, a maior parte isolada de pacientes com mieloma (Putnam, F. W. (1955) Science 122: 275-7). Davies e colaboradores foram os primeiros a caracterizar a estrutura de um anticorpo de mieloma humano intacto, denominado “Dob” usando cristalografia de raio x (Terry, W. D. e outros (1968) 35 Nature 220(164): 239-41), e determinaram sua estrutura tridimensional em 1971 (Sarma, V. R. e outros (1971 ) J. Biol. Chem. 246 (11): 3753-9). Seu trabalho de pioneirismo foi seguido pelos outros, rendendo as estruturas de cristal de IgG “Kol” (Huber, R. e outros (1976) Nature 264(5585): 415-20), a IgG “Mcg”( Rajan, S. S. e outros (1983) Mol. Immunol. 20(7): 787- 99), e uma lgG2a de Iinfoma canino (Harris, L. J. e outros (1992 Nature 360(6402): 369-72).

Os cristais de imunoglobulinas mantêm suas atividades imunológicas distintas quando da redissolução. Nisonoff e outros reportaram em 1968 um anticorpo anti-p5 azobenzoato de coelho, “X4”, que foi facilmente cristalizado (Nisonoff, A. e outros (1968) Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 32: 89-93). O anticorpo X4 foi extensivamente caracterizado antes da cristalização, bem como após a redissolução dos cristais. Foi verificado que [125l]-p-iodobenzoato se liga específica e potencialmente ao X4 redissolvido; os cristais redissolvidos também exibiram múltiplas reações específicas de imunodifusão 10 Ouchterlony típicas do soro de coelho não purificado (Nisonoff e outros, 1968). Connell e colaboradores descreveram uma gama-imunoglobulina-1-capa de mieloma humano (IgG-K) denominada “Tem”, que cristalizou espontaneamente do soro em temperaturas frias (Connell, G. E. e outros (1973) Canad. J. Biochem. 51(8): 1137-41). Foi verificado que os cristais Tem são bem formados e possuíam simetria romboédrica. O soro contendo “Tem” foi exten15 sivamente caracterizado por técnicas de imunodifusão de agarose. A eletroforese e imunodifusão de uma solução redissolvida dos cristais “Tem” mostrou que os mesmos são idênticos ao material obtido do soro por crioprecipitação e com a proteína de mieloma isolada (Connell e outros, 1973).

Mills e colaboradores reportaram em 1983 uma cristalocrioglobulinemia incomum resultando de anticorpos monoclonais humanos para albumina (Mills, L. E. e outros (1983) Annals of Internai Med 99(5): 601-4). Aqui, cristais cubóides muito semelhantes foram isolados de dois pacientes. A redissolução dos cristais seguida de eletroforese e imunoeletroforese indicou que os cristais eram compostos de dois componentes de proteína, uma IgGIambda monoclonal e albumina de soro humana em uma taxa de 1:2 (Jentoft, J. E. e outros (1982) Biochem. 21(2): 289-294). Os componentes foram separados na escala de preparação por dissolução dos cristais originais, seguido por cromatografia de coluna. Embora, nenhum componente cristalizado tenha propriamente se separado, quando da recombinação, o complexo bipartite original foi reformado e então recristalizou. Estudos adicionais das características de sedimentação distintas e reatividade imunológica da IgG redissolvida e separada e seu fragmento Fab com albumina de soro humano indicaram que a reassociação dos dois componentes redissolvidos, separados era de natureza imunológica, isto é, que o anticorpo cristalino uma vez redissolvido ainda possuía suas características de ligação altamente especificas (para albumina de soro humano) (Mills e outros 1983).

Recentemente, Margolin e colaboradores reportaram os usos terapêuticos em potencial dos anticorpos cristalinos (Yang, M.X. e outros (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. 100(12): 6934-6939). Eles verificaram que o anticorpo monoclonal terapêutico trastuzumab (Herceptin(R)) seria cristalizado (Shenoy, B. e outros (2002) Pedido Internacional PCT W0/2002/072636, (Altus Biologies Inc., USA), página 173). As suspensões trastuzumab cristalinas foram terapeuticamente eficazes em um modelo de tumor de camundongo, assim demonstrando retenção da atividade biológica pelo trastuzumab cristalino (Yang e outros, 2003).

b) Técnicas de Cristalização

A cristalização de diversas proteínas não pode ser realizada sucessivamente usando métodos definidos ou algoritmos. Certamente, têm havido grandes avanços técnicos nos últimos 20-30 anos, conforme observado pelo expert mundialmente renomado em cristalização de proteína, A. McPherson. McPherson prove detalhes extensivos sobre táticas, estra10 tégias, reagentes e dispositivos para cristalização de macromoléculas. (McPherson, A. (1999) Crystallization of Biologicai Macromolecules. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 159). Contudo, ele não provê um método para garantir que qualquer macromolécula possa, na realidade, ser cristalizada por uma pessoa versada na técnica com uma expectativa razoável de sucesso. McPherson afirma, por exemplo: 15 "Qualquer que seja o procedimento, nenhum esforço deve ser realizado no refino e otimização dos parâmetros do sistema, ambos solvente e soluto, para encorajar e promover interações de ligação específicas entre as moléculas e estabilizar as mesmas uma vez que tenham se formado. Este último aspecto do problema geralmente depende das propriedades químicas e físicas da proteína específica ou ácido nucléico sendo cristalizado”.

É amplamente aceito pelos versados na técnica da cristalização da proteína que

não existe algoritmo para obtenção de uma nova proteína de interesse, aplicação das etapas de processo definidas e pelo que, obtenção dos cristais desejados.

Vários sistemas de classificação se encontram disponíveis comercialmente (por exemplo, Hampton 1 e 2, Wizzard I e II) que permitem, em uma escala de micro litros, classi25 ficar condições de cristalização potencialmente apropriadas para uma proteína específica. Contudo, resultados positivos obtidos em tal sistema de classificação não permitem necessariamente a cristalização de sucesso em escala de batelada maior, industrialmente aplicável. A conversão de experimentos de cristalização em escala de micro litros para dimensões industriais é descrita como sendo uma tarefa desafiante (vide Jen, A., Merkle, Η. P. (2001) 30 Pharm. Res. 18, 11, 1483).

Baldock e outros reportaram uma comparação de micro batelada e difusão de vapor para classificação inicial das condições de cristalização (Baldock, P. e outros (1996) J. Crystal Growth 168(1-4): 170-174. Seis proteínas comercialmente disponíveis foram classificadas usando um conjunto de soluções de cristalização. As classificações foram realizadas usando 35 o método de difusão de vapor mais comum e três variantes de um método de cristalização de micro batelada incluindo uma nova técnica de evaporação. Das 58 condições de cristalização identificadas, 43 (74%) foram identificadas por micro batelada, enquanto 41 (71%) foram identificadas por difusão de vapor. Vinte e seis condições foram verificadas por ambos os métodos e 17 (29%) teriam sido perdidas se a micro batelada não tivesse sido utilizada. Isto mostra que a técnica de difusão por vapor, que é a mais comumente empregada nas classificações de cristalização iniciais não garante resultados positivos.

c) Cristais de Anticorpo IL-12 Anti-humano

IL-12 humano desempenha um papel importante na patologia associada às várias doenças envolvendo resposta imunes e inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, doença de Crohn e psoríase. Existe, portanto, uma grande necessidade de métodos apropriados para o tratamento de tais transtornos relacionados ao IL-12 humano. Uma abordagem 10 terapêutica promissora compreende a administração de doses farmaceuticamente eficazes de anticorpos IL-12 humanos.

Devido ao papel do IL-12 humano em uma grande variedade de transtornos humanos, as estratégias terapêuticas foram projetadas para inibirem ou desativarem a atividade do IL-12. Especificamente, os anticorpos que se ligam e neutralizem IL-12 vêm sendo bus15 cados como um meio para inibir a atividade de IL-12. Alguns dos anticorpos anteriores eram os anticorpos monoclonais de murinos (mAbs), secretados por hibridomas preparados por linfócitos de camundongos imunizados com IL-12 (vide, por exemplo, WO 97/15327). Estes anticorpos IL-12 de murino são, contudo, limitados quanto ao seu uso in vivo devido aos problemas associados à administração dos anticorpos de murinos em humanos, Átis como, 20 meia vida curta no soro e incapacidade de desencadear determinadas funções efetoras humanas e promover uma resposta imune indesejada contra o anticorpo de camundongo em um ser humano (a reação de “anticorpo anticamundongo em seres humanos” (HAMA).

Em geral, tentativas de superar os problemas associados ao uso de anticorpos plenos de murino em seres humanos, envolveram engenharia genética dos anticorpos para 25 serem mais “semelhantes aos humanos”. Por exemplo, foram preparados anticorpos quiméricos, nos quais as regiões variáveis das cadeias de anticorpo são derivadas de murino e as regiões constantes das cadeias de anticorpo são derivadas de seres humanos. Contudo, uma vez que estes anticorpos quiméricos e humanizados ainda mantêm algumas sequencias de murino, eles ainda podem promover uma reação imune indesejada, a reação do anti30 corpo anti-quimérico humano (HACA), especialmente quando administrados por períodos prolongados.

A Patente US número 6.914.128 revela anticorpos humanos, preferivelmente anticorpos humanos recombinantes, que se ligam especificamente à interleucina-12 humana (hlL-12). Anticorpos preferidos revelados na patente possuem alta afinidade para hIL-12 e 35 neutralizam a atividade de hIL-12 in vitro e in vivo . Os anticorpos ou porções de anticorpos são úteis para detectar hIL-12 e para inibir atividade de hlL-12, por exemplo, em um indivíduo humano que sofre de um transtorno no qual a atividade de hIL-12 é prejudicial. Ácidos nucléicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos humanos recombinantes da invenção e métodos de sintetização dos anticorpos humanos recombinantes também são apresentados. Formas cristalinas dos anticorpos anti hIL-12 ou métodos para preparação dos mesmos não são especificamente descritos na patente ‘128.

O problema a ser resolvido de acordo com a presente invenção, portanto, é desenvolver condições de cristalização apropriadas, especificamente condições de cristalização em batelada, para anticorpos anti-IL-12, e estabelecer condições de processo de cristalização aplicáveis aos volumes relevantes para produção industrial do cristal de anticorpo. Ao mesmo tempo, um processo de cristalização é estabelecido, o qual não utiliza agentes tóxicos que podem afetar negativamente a aplicabilidade farmacêutica de tais anticorpos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O problema mencionado acima foi resolvido, de modo surpreendente, pela verificação de que é possível obter-se cristais de um anticorpo IL-12 anti-humano integral em volumes de cristalização em batelada acima da escala de micro litros, por aplicação de polialquiIeno polióis fisiologicamente aceitáveis como o agente de indução de cristalização. Em um primeiro aspecto, a invenção provê um método de cristalização em batelada para cristalização de um anticorpo IL-12 anti-humano, compreendendo as etapas de:

(a) provisão de uma solução aquosa do anticorpo IL-12 em mistura com pelo menos um agente de cristalização do tipo polialquileno poliol, conforme definido em mais detalhes a seguir, por exemplo polialquileno glicol; por exemplo, por mistura de uma solução aquosa do anticorpo, onde o anticorpo está presente, preferivelmente, na forma dissolvida, com uma solução de cristalização aquosa compreendendo pelo menos um polialquileno glicol como agente de cristalização na forma dissolvida, ou alternativamente, por adição do agente de cristalização na forma sólida;

(b) e incubação da mistura de cristalização aquosa até os cristais do anticorpo serem formados.

De acordo com uma modalidade adicional, o método da presente invenção também pode ser realizado, tal que, a mistura de cristalização obtida na etapa a) possa ser suplementada com uma quantidade apropriada de cristais pré-existentes de anticorpo IL-12 antihumano como cristais em semente a fim de iniciar ou auxiliar a cristalização.

O método de cristalização da invenção é realizado, de modo geral, em um pH da mistura de cristalização aquosa na faixa de cerca de pH 4 a cerca de 6,5, especificamente cerca de 4,5 a cerca de 6,0, cerca de 5,0 a cerca de 5,8 ou cerca de 5,3 a cerca de 5,7, tal como, por exemplo, 5,4, 5,5 ou 5,6.

Além disto, a mistura de cristalização aquosa pode conter pelo menos um tampão. O tampão pode compreender um componente de acetato como um componente principal, especialmente um sal de metal alcalino do mesmo, por exemplo um sal de sódio ou potássio, tal como acetato de sódio. O sal é ajustado por adição de um ácido, especificamente ácido acético, ao pH necessário. Em uma modalidade preferida do método de cristalização, a concentração do tampão (acetato total) na mistura de cristalização aquosa é cerca de 0 a cerca de 0,5 M, ou cerca de 0,02 a cerca de 0,5 M, como, por exemplo, cerca de 0,05 a cerca de 0,3 M, ou cerca de 0,07 a cerca de 0,2 M, ou cerca de 0,09 a cerca de 0,12 M.

Um "agente de cristalização do tipo polialquileno poliol" é definido em mais detalhes

a seguir:

Um versado na técnica reconhecerá que o termo deve ser entendido amplamente e compreende polialquileno polióis bem como derivados do mesmo.

IO Um "polialquileno poliol" conforme empregado de acordo com a invenção é um po

lialquileno poliol C2-C6 de cadeia linear ou ramificada, especificamente de cadeia linear. O poliéter é formado de pelo menos um tipo de um álcool alifático polifuncional portando 2 a 6,

2 a 4 e especificamente 2 ou 3, preferivelmente grupos vicinais, hidróxi e possuindo 2 a 6, especificamente 2, 3 ou 4 átomos de carbono, preferivelmente formando uma estrutura de carbono linear. Exemplos não Iimitantes são etileno-1 2-diol (glicol), propileno-1,2-diol, propileno-1 3- diol, e n-butileno-1,3-diol e n-butileno-1,4-diol. Um diol especificamente preferido é glicol.

Os polialquileno polióis da invenção podem ser compostos de um tipo simples de poliol ou misturas de pelo menos dois polióis diferentes, que podem ser polimerizados aleaÍ0 toriamente ou podem estar presentes como copolímeros de bloco.

Adicionalmente, o termo “polialquileno poliol" também compreende derivados dos mesmos. Exemplos não Iimitantes são ésteres e éteres alquila, especificamente éteres monoalquila e éteres dialquila. “Alquila” é definida, especificamente como resíduo alquila Ci-C6 de cadeia linear ou ramificada, especificamente, metila, etila, n ou i-propila, n, i, sec, ou tbutila ou i-pentila; e n-hexila.

Os polialquileno polióis, especificamente os polialquileno glicóis, conforme empregados de acordo com a invenção são adicionalmente caracterizados por uma ampla faixa de pesos moleculares. A faixa de peso molecular, declarada como peso molecular médio em peso ou peso molecular médio numérico tipicamente está na faixa de 400 a 10.000, como, 50 por exemplo, 1.000 a 8.000 ou 2.000 a 6.000, 3.000 a 6.000 ou 3.200 a 6.000, como, por exemplo, 3.350 a 6,000, 3.350 a 5000 ou 3.800 a 4.200, especificamente cerca de 4.000.

Polialquileno polióis específicos são, polietileno glicóis (PEGs) e polipropileno glicóis (PPGs) e copolímeros de bloco e aleatórios correspondentes. Exemplos específicos de polióis apropriados são PEG 2.000, PEG 3.000, PEG 3.350, PEG 4.000, PEG 5.000 e PEG 55 6.000.

Especificamente, a concentração de polialquileno poliol, especificamente a concentração de polietileno glicol, na mistura de cristalização está na faixa de cerca de 5 a cerca de 30% (peso/volume), como, por exemplo, cerca de 7 a cerca de 15 % (peso/volume) ou cerca de 9 a cerca de 16 % (peso/volume) ou cerca de 10 a cerca de 14 % (peso/volume) ou cerca de 11 a cerca de 13 % (peso/volume). Preferivelmente, polietileno glicol com um peso molecular médio de cerca de 4.000 é empregado em uma concentração na mistura de cristalização de cerca de 11 a cerca de 13 % (peso/volume).

Em uma modalidade preferida da invenção, a solução de proteína de anticorpo e a solução de cristalização são combinadas em uma razão de cerca de 1:1. Assim, molaridades dos agentes de tamponamento/agentes de cristalização na solução de cristalização original são tão altas quanto duplas na mistura de cristalização.

Tipicamente, o método de cristalização é realizado em um volume de batelada na faixa de cerca de 1 ml_ a cerca de 20.000 Lou 1 mLa cerca de 15.000 L ou 1 mL a cerca de

12.000 L, ou cerca de 1 mL a cerca de 10,000 L, ou 1 mL a cerca de 6.000 L ou 1 mL a cerca de 3.000 L ou 1 mL a cerca de 1.000 L, ou 1 mL a cerca de 100 L como, por exemplo, cerca de 50 mL a cerca de 8.000 mL, ou cerca de 100 mL a cerca de 5.000 mL, ou cerca de

1.000 mL a cerca de 3.000 mL; ou cerca de 1 L a cerca de 1.000 L; ou cerca de 10 L a cerca de 500 L.

Além disso, o método de cristalização da invenção pode ser realizado, de modo que pelo menos uma das seguintes condições de cristalização adicional possa ser obtida:

a) a incubação é realizada entre cerca de 1 hora a cerca de 250 dias, ou 1 a 250 dias ou 13 a 250 dias, por exemplo cerca de 1 a cerca de 30 dias, ou cerca de 2 a 10 dias;

b) a incubação é realizada a uma temperatura entre cerca de 0°C e cerca de 50°C, por exemplo cerca de 4°C e cerca de 37°C ou cerca de 15°C e cerca de 25°C;

c) a concentração do anticorpo (isto é, a concentração da proteína) na mistura de cristalização está na faixa de cerca de 0,5 a 280 mg/mL ou cerca de 1 a 200 mg/mL ou 1 a 100 mg/mL, por exemplo 1,5 a 20 mg/mL, especificamente na faixa de cerca de 2 a 15 mg/mL, ou 5 a 10 mg/mL. A concentração da proteína pode ser determinada de acordo com procedimentos padrão para determinação da proteína.

Em uma modalidade preferida, o método de cristalização, por exemplo, com o polietileno glicol como o agente de cristalização, é realizado, tal que a incubação é realizada entre cerca de 13 a 60 dias a uma temperatura de cerca de 20°C e a uma concentração de anticorpo de cerca de 5 a 10 mg/mL.

De acordo com um método especificamente preferido, a cristalização é realizada sob as condições de mistura de cristalização que se seguem:

Polialquileno glicol: PEG 4000 10 a 15 % (peso/volume)

Tampão: acetato de sódio, 0 a 0,3 M, (acetato total)

pH: 5,3 a 5,8

Concentração de anti-hlL-12 3 a 10 mg/mL Temperatura: Voluma da batelada: Agitação: Duração:

cerca de 1 a 60 dias

18 a 24°C

Nenhuma

1 a 100 L

As misturas de cristalização conforme citadas acima são geralmente obtidas por adição de um agente de cristalização na solução ou como sólido à solução de proteína. Ambas soluções podem ser, porém não precisam ser tamponadas. A concentração do agente de cristalização e molaridade do tampão na solução de cristalização original são geralmente superiores na mistura de cristalização, uma vez que são “diluídas” com a solução de proteína.

Em uma modalidade adicional, o método de cristalização da invenção pode compreender, adicionalmente, a etapa de secagem dos cristais obtidos. Métodos de secagem adicionais compreendem secagem evaporativa, secagem por aspersão, liofilização, secagem a vácuo, secagem em leito fluido, secagem em congelamento por aspersão, secagem próxima à crítica, secagem supercrítica e secagem com gás nitrogênio.

Em uma modalidade adicional, o método de cristalização da invenção pode compreender, adicionalmente, a etapa de troca do licor principal de cristalização por um líquido diferente ou um tampão tamponado, por exemplo, um líquido ou tampão contendo um polialquileno poliol diferente daquele usado para cristalização com uma massa molar na faixa de cerca de 300 a 8.000 Daltons ou misturas de tais polióis, por exemplo, por centrifugação, diafiltração, ultrafiltração ou outras técnicas de troca de tampão usadas de modo geral. O líquido ou tampão diferente pode também ser designado como um “líquido principal artificial” que difere do líquido principal de cristalização “natural” dos cristais e previne a dissolução dos cristais formados.

A presente invenção também se refere a um cristal ou anticorpo anti-hlL-12 que pode ser obtido por um método de cristalização conforme definido acima e, em geral, aos cristais de um anticorpo anti-hlL-12.

Os cristais da invenção podem apresentar uma forma diferente. A forma geralmente é designada como “semelhante à espada”. Especificamente, o termo também compreende, “plaquetas”, “agulhas” ou “cachos de agulhas” (vide, semelhante a ouriço-do-mar). Por exemplo, os cristais da invenção podem ser caracterizados por uma morfologia semelhante à agulha com um comprimento máximo (I) de cerca de 2 - 500 //m ou cerca de 100 - 300 μνη e um a razão de comprimento/diâmetro (l/d) de cerca de 1 a 100. A altura de tais cristais semelhantes à agulha está grosseiramente na dimensão do diâmetro.

As plaquetas da invenção podem apresentar as seguintes dimensões: Um comprimento máximo (I) de cerca de 2 - 500 //m ou cerca de 100 - 300 yc/m e uma razão de comprimento/diâmetro (l/d) de cerca de 1 a 100. A altura de tais plaquetas é consideravelmente menor que o diâmetro.

Os cachos de agulhas da invenção podem ter as dimensões que se seguem. Um comprimento máximo I de cerca de 2 - 200 μιτι ou cerca de 10 - 100 μνη e uma razão de comprimento/diâmetro (l/d) de cerca de 1 a 3.

O cristal pode ser obtido de um anticorpo policlonal ou preferivelmente um anticorpo

monoclonal.

Especificamente, o anticorpo é selecionado do grupo consistindo em anticorpos não quiméricos ou quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos não glicosilados, anticorpos humanos e anticorpos de camundongos. Especificamente, o anticorpo a ser cristalizado é um anticorpo não quimérico, humano opcional e adicionalmente processado para aperfeiçoar a ligação e/ou eficácia do antígeno.

Preferivelmente, os cristais são obtidos de um anticorpo IgG, tal como, por exemplo, um anticorpo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Especificamente, o anticorpo é um anticorpo IL12 anti-humano integral do grupo IgGL.

Em uma modalidade preferida, os cristais são preparados de um anticorpo humano

isolado, que se dissocia de hIL-12 com Kd de 1 x10"10 M ou menos e uma constante de taxa koff de 1 x 10'3 s"1 ou menos, conforme determinado por ressonância de plasmônio de superfície.

Especificamente, os cristais podem ser preparados de um anticorpo humano isolado com uma região variável de cadeia leve (LCVR) em comparação à sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia pesada (HCVR) em comparação à sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

Os anticorpos humanos preferidos são descritos, por exemplo, na Patente US número 6.914.128.

Os cristais mais preferidos são preparados do anticorpo ABT-874.

Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a uma composição farmacêutica sólida, líquida ou semissólida, compreendendo: (a) cristais de um anticorpo anti-hlL-12 conforme definido acima e (b) pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, estável, mantendo os cristais do anticorpo.

Outro aspecto desta invenção se refere a uma composição farmacêutica sólida, lí

quida ou semissólida compreendendo: (a) cristais de um anticorpo anti-hlL-12 conforme definidos no presente documento e (b) pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável encapsulando ou embutindo os cristais de anticorpo. A composição pode compreender, adicionalmente (c) pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, estável, mantendo 35 os cristais de anticorpo. Além disto, o encapsulamento e embutimento podem ser implementados em conjunto.

Especificamente, as composições da invenção podem apresentar uma concentração de cristal de anticorpo superior a cerca de 1 mg/mL, especificamente cerca de 200 mg/mL ou mais, por exemplo cerca de 200 a cerca de 600 mg/mL, ou cerca de 300 a cerca de 500 mg/mL.

Os excipientes podem compreender, pelo menos, um veículo polimérico, opcionalmente biodegradável ou pelo menos um óleo ou veículo lipídico.

O veículo polimérico pode ser um ou mais polímeros selecionados do grupo consistindo em: poli(ácido acrílico), poli (cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anidridos), poli(despsipetídeo), poli(ésteres), poli(ácido lático), poli(ácido lático-co-glicólico) ou PLGA, poli(/?-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona); poli(etileno glicol), poli(hidroxipropil)metacrilamida, poli(organo)fosfazeno, poli(orto ésteres), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de éter alquil vinílico anidrido maléico, polióis plurônicos, albumina, alginato, celulose e derivados de celulose, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurônico, oligossacarídeos, glicaminoglicanos, polissacarídeos sulfatados, combinações e copolímeros dos mesmos.

O óleo (ou líquido oleoso) pode ser um ou mais óleos (ou líquido oleoso) selecionados do grupo consistindo em óleo de amêndoas oleaginoso, óleo de milho, óleo de semente de milho, oleato de etila, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, óleo mineral, óleo mineral leve, octildodecanol, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo pérsico, óleo de mamona, óleo de soja, esqualeno, triglicerídeos líquidos, ceras líquidas e alcoóis superiores.

O veículo lipídico pode ser um ou mais lipídeos selecionados do grupo consistindo em ácidos graxos e sais de ácidos graxos, alcoóis graxos, aminas graxas, mono, di e triglicerídeos de ácidos graxos, fosfolipídos, glicolipídeos, esteróis e ceras e substâncias semelhantes correlatas. As ceras são adicionalmente classificadas em produtos naturais e sintéticos. Materiais naturais incluem ceras obtidas de fontes vegetais, animais ou minerais, tais como, cera de abelha, carnaúba ou cera montanha. Naftalenos clorados e polímeros etilênicos são exemplos de produtos de cera sintética.

Em uma modalidade preferida, a composição é uma composição injetável compreendendo cristais de anticorpo anti-hlL-12 conforme definidos acima e apresentando uma concentração de cristal de anticorpo na faixa de cerca de 10 a cerca de 400 mg/mL ou cerca de 50 a cerca de 300 mg/mL.

Em um aspecto adicional a invenção se refere a uma pasta de cristal compreendendo cristais de anticorpo anti-hlL-12 conforme definidos acima apresentando uma concentração de cristal de anticorpo superior a cerca de 100 mg/mL, por exemplo cerca de 150 a cerca de 600 mg/mL, ou cerca de 200 a cerca de 400 mg/mL.

A presente invenção também se refere a um método para tratamento de um mamífero compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de cristais de anticorpo anti-hlL-12 integral conforme definidos acima ou uma quantidade eficaz de uma composição conforme definida acima. Preferivelmente, a composição é administrada por via parenteral, vira oral ou por injeção.

Adicionalmente, a presente invenção se refere a um método para tratamento de um transtorno relacionado ao hlL-12 em um indivíduo que compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de cristais de anticorpo conforme definidos acima.

Especificamente, o transtorno relacionado ao hlL-12 é selecionado dentre: artrite reumatóide, osteoartrite, artrite juvenil crônica, artrite de Lyme, artrite psoriática, artrite reativa, espondiloartropatia, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença do intestino inflamado, diabetes melito insulinodependente, tireoidite, asma, doenças 10 alérgicas, psoríase, escleroderma dermatite, dermatite atópica, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição ao transplante de órgão, doença imune aguda ou crônica associada ao transplante de órgão, sarcoidose, aterosclerose, coagulação intravascular disseminada, doença de Kawasaki, doença de Grave, síndrome nefrótica, síndrome de fadiga crônica, granulomatose de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculite microscópica dos rins, 15 hepatite ativa crônica, uveíte, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de septicemia, caquexia, doenças infecciosas, doenças parasitárias, síndrome da imunodeficiência adquirida, mielite transversa aguda, coréia de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, acidente vascular, cirrose biliar primária, anemia hemolítica, malignidades, falência cardíaca, infarto do miocárdio, doença de Addison, deficiência poliglandular do tipo I e 20 deficiência poliglandular do tipo Il esporádica, síndrome de Schmidt, síndrome de angústia respiratória do adulto (aguda), alopecia, alopecias em áreas, artropatia soronegativa, artropatia, doença de Reiter, artropatia psoriática, artropatia colítica ulcerativa, sinovite enteropática, artropatia associada à clamídia, yersinia e salmonela, espondiloatropatia, doença ateromatosa/arteriosclerose, alergia atópica, doença autoimune bolhosa, pênfigo comum, pên25 figo foliáceo, penfigóide, doença de IgA linear, anemia hemolítica autoimune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalite miálgica/doença Royal Free, candidíase mucocutânea crônica, arterite de célula gigante, hepatite esclerosante primária, hepatite criptogênica autoimune, AIDS, doenças relacionadas à imunodeficiência adquirida, hepatite C, imunodeficiência comum variada (hipogama30 globulinemia variável comum), cardiomiopatia dilatada, infertilidade feminina, falência ovariana, falência ovariana prematura, doença fibrótica pulmonar, alveolite fibrosante criptogênica, doença pulmonar intersticial pós-inflamatória, pneumonite intersticial, doença pulmonar intersticial associada à doença do tecido conjuntivo, doença pulmonar associada à doença do tecido conjuntivo misto, doença pulmonar intersticial associada à doença esclerose sis35 têmica, doença pulmonar intersticial associada à artrite reumatóide, doença pulmonar associada ao lúpus eritematoso sistêmico, doença pulmonar associada à dermatomiosite/polimiosite, doença pulmonar associada à doença de Sjodgren, doença pulmonar associada à espondilite ancilosante, doença pulmonar difusa vasculítica, doença pulmonar associada à hemosiderose, doença pulmonar intersticial induzida por medicamento, fibrose por radiação, bronquiolite obliterante, pneumonia eosinófila, doença pulmonar infiltrativa linfocítica, doença pulmonar intersticial pós-infecciosa, artrite gotosa, hepatite autoimune, hepatite 5 autoimune do tipo 1 (hepatite autoimune clássica ou lupóide), hepatite autoimune do tipo 2 (hepatite de anticorpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoimune, resistência à insulina tipo B com acanthose nigricans, hipoparatiroidismo, doença imune aguda associada ao transplante de órgão, doença imune crônica associada ao transplante de órgão, osteoartrose, colangite esclerosante primária, Ieucopenia idiopática, neutropenia autoimune, doença renal 10 NOS, glomerulonefrite, vasculite microscópica dos rins, doença de Lyme, lúpus eritematoso discóide, infertilidade masculina idiopática ou NOS, autoimunidade do esperma, esclerose múltipla (todos subtipos), diabete melito insulinodependente, oftalmia simpática, hipertensão pulmonar secundária em doença de tecido conjuntivo, síndrome de Goodpasture, manifestação pulmonar de poliarterite nodosa, febre reumática aguda, espondilite reumatóide, do15 ença de Still, esclerose sistêmica, doença de Takayasu/arterite, trombocitopenia autoimune, trombocitopenia idiopática, doença da autoimune da tireóide, hipertiroidismo, hipotireoidismo autoimune bocioso (doença de Hashimoto), hipotireoidismo autoimune atrófico, mixoedema primário, uveíte facogênica, vasculite primária e vitiligo. Os anticorpos humanos e porções de anticorpos da invenção podem ser usados para tratar doenças autoimunes, especifica20 mente aquelas associadas à inflamação, incluindo, espondilite reumatóide, alergia, diabetes autoimune, uveíte autoimune.

Além disto, a presente invenção se refere ao uso dos cristais de anticorpo anti-hlL12 integral conforme definidos acima para preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença relacionada ao hlL-12 conforme definida acima.

Finalmente, a presente invenção provê cristais de anticorpo anti-hlL-12 conforme

definidos acima para uso na medicina.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS

Os objetivos precedentes e outros, aspectos e vantagens da presente invenção, bem como a invenção propriamente serão mais plenamente entendidos da descrição das modalidades preferidas que se segue, quando da leitura em conjunto com os desenhos anexos, onde:

A figura 1 apresenta uma micrografia em Iuz dos cristais de ABT-874 na cristalização.

As figuras 2-5 apresentam SEMs dos cristais de ABT-874 em aumentos diferentes; a figura 2 apresenta 1.250x; a figura 3 apresenta 10.000x; a figura 4 apresenta 3.227x e a figura 5 apresenta 15.000x.

A figura 6 apresenta os resultados dos Experimentos de Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF) com ABT-874; A) tampão de cristal de ABT-874 e marcadores pl 8,4, 8,5, 10,1 e 10,4; B) cristais de ABT-874; algum marcador pl e sinal ABT-874 característico em pl = 9,29; C) Padrão de Referência, o mesmo marcador pl e sinal ABT-874 característico a pl = 9,29.

A figura 7 apresenta fotos de cristal microscópicas em Iuz (cachos de agulhas) obtidas de acordo com o Exemplo 28 (cristalização com agitação).

A figura 8 apresenta fotos de cristal microscópicas em Iuz (agulhas) obtidas de acordo com o Exemplo 32 (cristalização sem agitação).

A figura 9 apresenta fotos de cristal microscópicas em Iuz (agulhas) obtidas de acordo com o Exemplo 33 (cristalização sem agitação).

A figura 10 apresenta fotos de cristal microscópicas em Iuz (agulhas) obtidas de acordo com o Exemplo 34 (cristalização sem agitação).

A figura 11 apresenta segundos espectros derivados de IR de amostras de ABT874. A figura 11A mostra espectros de suspensão de cristal registrados com uma célula BioATR. A figura 11B mostra espectros de cristais redissolvidos gravados com uma célula AquaSpec. Linhas cheias representam amostras de ABT-874 cristalino, linhas pontilhadas representam padrão líquido. Um desvio entre a amostra e o padrão foi inserido para melhor ilustração.

A figura 12 apresenta segundos espectros derivados de IR de amostras de ABT874, 50 mg/mL de proteína cristalina em tampão PEG 4.000 a 22% em um tampão de acetato de sódio 0,1 M, pH 5,5, armazenado por 3 meses a 25°C. A figura 11A apresenta espectros da suspensão de cristal registrada com uma célula BioATR. A figura 11B apresenta espectros de cristais redissolvidos registrados com uma célula AquaSpec. Um desvio entre a amostra e o padrão foi inserido para melhor ilustração.

Figura 13: 40 mL de cristalização em batelada de ABT-874 com e sem semeadura (por exemplo, usando proteína cristalizada a 3,25% como material de semeadura em relação à massa de ABT-874 da batelada). R2 é 0,9711 para não semeado e 0,9763 para a batelada semeada, respectivamente.

DESCRICÀO DETALHADA DA INVENÇÃO

A. Definições

Um "método de batelada de cristalização” compreende a etapa de adição da solução de cristalização compreendendo o agente de cristalização, preferivelmente na forma dissolvida, à solução do anticorpo a ser cristalizada.

Um "método de cristalização em micro escala", que pode ter como base, por exemplo, difusão em vapor, compreende as etapas de mistura de um volume pequeno da solução de anticorpo na faixa de micro litros com um tampão de reservatório contendo um agente de cristalização; colocação de uma gotícula da mistura em um recipiente vedado adjacente a uma alíquota do tampão de reservatório; permitindo a troca do solvente entre a gotícula e o reservatório por difusão em vapor, durante o que o teor do solvente na gotícula troca e a cristalização pode ser observada se as condições de cristalização apropriadas forem alcançadas.

Um "agente de cristalização", por exemplo, um polietileno glicol, favorece a forma

ção do cristal de anticorpo a ser cristalizado.

Uma "solução de cristalização" contém um agente de cristalização na forma dissolvida. Preferivelmente a solução é um sistema aquoso, isto é, os seus constituintes líquidos consistem, predominantemente em água. Por exemplo, 80 a 100% em peso ou 95 a 100% em peso ou 98 a 100% em peso podem ser de água.

“Cristais” de anticorpo são uma forma do estado sólido da matéria da proteína, que é distinta de uma segunda forma sólida, isto é, o estado amorfo, que existe essencialmente como um sólido heterogêneo, não organizado. Os cristais possuem uma estrutura tridimensional regular, tipicamente referida como uma grade. Um cristal de anticorpo compreende 15 uma fileira tridimensional regular de moléculas de anticorpo (vide, Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a edição, páginas 1-16, Oxford University Press, New York (1999)).

Um anticorpo anti-hlL-12 “integral” ou “intacto” quando cristalizado de acordo com esta invenção é um anticorpo funcional que é capaz de reconhecer e se ligar ao seu antígeno humano IL-12 in vitro e/ou in vivo . O anticorpo pode iniciar reações subsequentes do sistema imune de um paciente associadas à ligação do anticorpo ao seu antígeno, especificamente Citotoxicidade Direta, Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) e Citotoxicidade Dependente de Anticorpo (ADCC). A molécula de anticorpo possui uma estrutura composta de duas cadeias pesadas idênticas (MW de cada uma de cerca de 50 kDa) covaIentemente ligadas uma a outra e duas cadeias leves idênticas (MW de cada uma de cerca de 25 kDa), cada uma ligada covalentemente a uma das cadeias pesadas. As quatro cadeias são dispostas em um motivo Ύ” clássico. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões de VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), dispersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de términos amino para términos carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A molécula de anticorpo complete possui dois sítios de ligação de antígeno, isto é, “bivalentes”. Os dois sítios de ligação de antígeno são específicos para um antígeno hlL-12, isto é, o anticorpo é “especifico para mono”.

"Anticorpos monoclonais" são anticorpos que são derivados de um clone simples dos linfócitos B (células B), e reconhecem o mesmo determinante antigênico. Anticorpos monoclonais integrais são aqueles que possuem a mesma estrutura molecular clássica mencionada acima que inclui duas cadeias pesadas completas e duas cadeias leves completas. Anticorpos monoclonais são rotineiramente produzidos por focalização da célula B produtora de anticorpo com uma célula de mieloma imortal para gerar hibridomas de célula B que produzem continuamente anticorpos monoclonais na cultura de célula. Outros métodos de produção estão disponíveis, por exemplo, expressão de anticorpos monoclonais na cultura de célula bacteriana, de levedura, de inseto ou de mamífero usando tecnologia de exibição de fago; produção in vivo em animais geneticamente modificados, tais como, vacas, cabras, porcos, coelhos, galinhas ou em camundongos transgênicos que foram modificados para conter e expressar todo o genoma da célula B humana; ou produção em plantas geneticamente modificadas, tais como, tabaco e milho. Anticorpos anti-hlL-12 de todas tais fontes podem ser cristalizadas de acordo com esta invenção.

Os anticorpos monoclonais a serem cristalizados de acordo com a invenção include anticorpos anti-hlL-12 “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga em relação às sequencias correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo com relação às sequencias nos anticorpos derivados de outras espécies ou pertencendo a outra classe de anticorpos ou subclasse. Por exemplo, uma quimera de camundongo/humano contém as porções de antígeno de ligação variáveis de um anticorpo de murino e as porções constantes derivadas de um anticorpo humano.

Formas “humanizadas” de anticorpos anti-hlL-12 não humanos (por exemplo, murinos) são também englobadas pela invenção. Anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos que contêm sequencia mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Para a maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas, nas quais os resíduos de uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou laços hipervariáveis (HVLs) de imunoglobulina humana são substituídos por resíduos de uma CDR ou HVL de espécies não humanas, tais como, camundongo, rato, coelho ou primata não humano, possuindo a funcionalidade desejada. Os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana podem ser substituídos por resíduos não humanos correspondentes para aperfeiçoar a afinidade de ligação do antígeno. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nas porções de anticorpo humanas e nem nas não humanas correspondentes. Estas modificações podem ser necessárias para aperfeiçoar a eficácia adicional do anticorpo.

Um “anticorpo humano” ou “anticorpo completamente humano” é um que possui uma sequencia de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um 5 humano ou que é produzida recombinantemente. O termo “anticorpo humano” conforme usado no presente documento se destina a incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequencias de imunoglobulina germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequencias de imunoglobulina germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas aleatoriamente ou 10 mutagênese específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e especificamente CDR3. Contudo, o termo “anticorpo humano” conforme empregado no presente documento não se destina a incluir anticorpos nos quais as sequencias da CDR derivadas da germinal de outras espécies de mamíferos, tais como, camundongo, foram enxertadas nas sequencias da estrutura humana.

O termo “anticorpo humano recombinante” conforme empregado no presente do

cumento se destina a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como, anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca humana combinatória, recombinante, anticorpos isolados de um ani20 mal (por exemplo, camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor, L.D. e outros (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva recomposição das sequencias de gene de imunoglobulina humana para outras sequencias de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem variáveis e regiões constantes deri25 vadas de sequencias de imunoglobulina de germinal humana. Em determinadas modalidades, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou quando sequencias Ig de um animal transgênico para humano são usadas, em mutagênese somática in vivo) e assim, as sequencias de aminoácido das regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequencias que, embora derivadas e relacionadas às se50 quencias de VH e VL de germinal humano não podem existir naturalmente dentro do repertório de germinal de anticorpo humano in vivo .

Um “anticorpo neutralizante” conforme usado no presente documento (ou um “anticorpo que neutralizou atividade hlL-12”) se refere a um anticorpo cuja ligação à hIL-12 resulta em inibição da atividade biológica de hIL-12. Esta inibição da atividade biológica de hlL-12 J5 pode ser avaliada in vitro ou in vivo por medição de um ou mais indicadores da atividade biológica de hlL-12, tal como, proliferação da célula induzida por hlL-12 e ligação de hlL-12 aos receptores de hlL-12 ou diminuição induzida por hlL-12 dos leucócitos in vivo . Estes indicadores da atividade biológica de hlL-12 podem ser avaliados por um ou mais dos ensaios padrão severos in vitro ou in vivo conhecidos na técnica. Preferivelmente, a capacidade de um anticorpo de neutralizar atividade de hlL-12 é avaliada por inibição da proliferação da célula induzida por hlL-12 nos blastos de fitoemaglutinina e células 2D6 de murino.

Um anticorpo anti-hlL-12 de “afinidade amadurecida” é um com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis, o que resulta em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo para antígeno, em comparação ao anticorpo de origem. Os anticorpos de afinidade amadurecida apresentarão valores de afinidades nanomolares ou mesmo pi10 comolares para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade amadurecida são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks e outros (1992) Bio/Technology 10:779-783 descreve afinidade amadurecida por embaralhamento dos domínios VH e VL. A mutagênese aleatória dos resíduos de estrutura e/ou CDR é descrito por Barbas e outros (1994) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 91:3809-3813 (1994); Scier e outros (1995) Gene 169:147-155; Yelton 15 e outros (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson e outros (1995) J. Immunol. 154(7):3310-9; and Hawkins e outros (1992) J. Mol Biol. 226:889-896.

Um “anticorpo isolado” conforme usado no presente documento se refere a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos apresentando especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente hlL-12 é substancialmente isento de anticorpos que especificamente ligam antígenos que não hlL

12). Um anticorpo isolado que liga especificamente hlL-12 pode, contudo, possuir reatividade cruzada com outros antígenos, tais como, moléculas de hIL-12 de outras espécies. Além disto, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou substâncias químicas.

A frase “interleucina 12 humana” (abreviada no presente documento como hlL-12

ou IL-12), conforme usada no presente documento, inclui uma citocina humana que é secretada primariamente por macrófagos e células dendríticas. O termo inclui uma proteína heterodimérica compreendendo uma subunidade de 35 kD (p35) e uma subunidade de 40 kD (p40) que são ambas ligadas em conjunto com uma ponte de dissulfeto. A proteína hetero30 dimérica é referida como uma “subunidade p70”. A estrutura da IL-12 humana é descrita adicionalmente, por exemplo, em Kobayashi, e outros (1989) J. Exp Med. 170:827- 845; Seder, e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90:10188-10192; Ling, e outros (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, e outros (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237. O termo IL-12 pretende incluir IL-12 humana recombinante (rh IL-12), que pode ser preparada por 35 métodos de expressão recombinante padrão.

O termo "k0ff", conforme usado no presente documento pretende se referir à taxa constante para dissociação de um anticorpo do complexo de anticorpo/antígeno. O termo "kd", conforme usado no presente documento, se refere à constante de dissociação de uma interação específica de anticorpo-antígeno.

Um “equivalente funcional” de um anticorpo anti-hlL-12 de “origem” específico conforme cristalizado de acordo com a invenção é um que mostra a mesma especificidade para antígeno, porém difere com relação à composição molecular do anticorpo “de origem” no nível de aminoácido ou nível de glicosilação. As diferenças podem ser poucas, tal que, as condições de cristalização não se desviem das faixas de parâmetro conforme reveladas no presente documento.

"Encapsulamento" de cristais de anticorpo se refere a uma formulação onde os cristais incorporados são individualmente revestidos por pelo menos uma camada de um material de revestimento. Em uma modalidade preferida, tais cristais revestidos podem apresentar uma taxa de dissolução prolongada.

"Embutimento" de cristais de anticorpo se refere a uma formulação onde os cristais, que podem ser encapsulados ou não, são incorporados a um veículo sólido, líquido ou semissólido em um modo disperso. Tais moléculas de anticorpo cristalizadas embutidas podem ser liberadas ou dissolvidas em um modo controlado, prolongado a partir do veículo.

B. Método de Cristalização

O método de cristalização da invenção é um princípio aplicável a qualquer anticorpo anti-hlL-12. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou, preferivelmente, um anticorpo monoclonal. O anticorpo pode ser constituído de anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos ou não humanos, cada um na forma glicosilada ou não glicosilada. Especificamente, o método é aplicável ao ABT-874 e equivalentes funcionais do mesmo.

Preferivelmente o anticorpo anti-hlL-12 é um anticorpo IgG, especificamente um anticorpo IL-12 anti-humano do grupo IgGI.

A menos que de outra forma declarado, o método de cristalização da invenção faz uso de equipamento técnico, substâncias químicas e metodologias bem conhecidos na técnica. Contudo, como explicado acima, a presente invenção se baseia na verificação surpreendente de que a seleção de condições de cristalização específicas, especialmente a seleção de agentes de cristalização específicos, opcional e adicionalmente combinados com condições de pH específicas e/ou faixas de concentração dos agentes correspondentes (tampão, anticorpo, agente de cristalização) permite pela primeira vez, a preparação reproduzível e em grande escala de cristais de anticorpo estáveis, especificamente anticorpos humanos não quiméricos, direcionados contra hlL-12, que podem ser adicionalmente processados para formar um ingrediente ativo de composição farmacêutica superior, altamente vantajosa.

O material de partida para realização do método de cristalização normalmente compreende uma solução concentrada de anticorpo a ser cristalizada. A concentração da proteína pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 5 a cerca de 300 mg/mL, preferivelmente cerca de 5 a cerca de 200 mg/mL, preferivelmente cerca de 5 a cerca de 75 mg/mL. A solução pode conter aditivos estabilizando o anticorpo dissolvido e pode ser recomendável remover os aditivos com antecedência. Isto pode ser obtido por realização de uma etapa de troca de tampão.

Preferivelmente, o material de partida para realização da cristalização contém o anticorpo em uma solução aquosa, possuindo um pH ajustado na faixa de cerca de 3,2 a cerca de 8,2 ou cerca de 4,0 a cerca de 8,0, especificamente cerca de 4,5 a cerca de 6,5, preferivelmente cerca de 5,0 a cerca de 5,5. O pH pode ser ajustado por meio de um tampão apropriado aplicado em uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 500 mM, especificamente cerca de 1 a cerca de 100 mM ou 1 a cerca de 10 mM. A solução pode conter aditivos, como, por exemplo, em uma proporção de cerca de 0,01 a cerca de 15, ou cerca de 0,1 a cerca de 5, ou cerca de 0,1 a cerca de 2% em peso, com base no peso total da solução, tal como, sais, açúcares, alcoóis de açúcar e agentes tensoativos, a fim de estabilizar adicionalmente a solução. Os excipientes são preferivelmente selecionados dos compostos fisiologicamente aceitáveis, rotineiramente aplicados nas preparações farmacêuticas. Como exemplos não limitantes, os excipientes incluem sais, tais como, NaCI; agentes tensoativos, tais como, polissorbato 80 (Tween 80), polissorbato 20 (Tween 20); açúcares, tais como, sacarose, trealose, alcoóis de açúcar, tais como, manitol, sorbitol e agentes de tampão, tais como, sistemas tampão à base de fosfato, tampões fosfato hidrogenado de sódio e potássio conforme definidos acima, tampão acetato, tampão fosfato, tampão citrato, tampão TRIS, tampão maleato ou tampão succinato, tampão histidina; aminoácidos, tais como, histidina, arginina e glicina.

A troca do tampão pode ser realizada por meio de métodos de rotina, por exemplo, diálise, diafiltração ou ultrafiltração.

A concentração de proteína inicial da solução aquosa usada como material de partida estaria na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 200 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/mL.

Dependendo do tamanho da batelada inicial pretendida (que pode estar na faixa de

1 mL a 20.000 litros) um volume inicial da solução de anticorpo aquoso é colocado em um recipiente apropriado (como, por exemplo, um recipiente, garrafa ou tanque) fabricado de material inerte, como por exemplo, vidro, polímero ou metal. O volume inicial da solução aquosa pode corresponder a cerca de 30 a 80%, normalmente cerca de 50% do tamanho da batelada final.

Caso necessário, a solução após ter sido enchida no recipiente será trazida para as condições padronizadas. Especificamente, a temperatura será ajustada na faixa de cerca de 4°C a cerca de 37°C. Então, a solução de cristalização contendo o agente de cristalização em uma concentração apropriada, opcionalmente pré-condicionada da mesma forma que a solução de anticorpo é adicionada à solução de anticorpo.

A adição da solução de cristalização é realizada contínua ou descontinuamente, opcionalmente sob agitação branda, a fim de facilitar a mistura dos dois líquidos. Preferivelmente, a adição é realizada sob condições onde a solução de proteína é provida sob agitação e a solução de cristalização (ou agentes em sua forma sólida) é/são adicionada(s) de um modo controlado.

A formação dos cristais de anticorpo é iniciada por aplicação de um polialquileno 10 poliol conforme definido acima, especificamente um polialquileno glicol e preferivelmente um polietileno glicol (PEG), ou uma mistura de pelo menos dois polialquileno glicóis diferentes, conforme definidos acima, como o agente de cristalização. A solução de cristalização contém o agente em uma concentração, que é suficiente para fornecer uma concentração final do polialquileno poliol na mistura de cristalização na faixa de cerca de 5 a 30% (pe15 so/volume).

Preferivelmente, a solução de cristalização contém, adicionalmente, um tampão ácido, por exemplo, diferente daquele da solução de anticorpo, em uma concentração apropriada para permitir o ajuste do pH da mistura de cristalização na faixa de cerca de 4 a 6.

Após ter terminado a adição da solução de cristalização, a mistura obtida pode ser adicionalmente incubada por cerca de 1 hora a cerca de 250 dias a fim de obter um rendimento máximo dos cristais de anticorpo. Caso apropriado, a mistura pode ser agitada, brandamente rotacionada, laminada ou de outra forma movimentada.

Finalmente, os cristais obtidos podem ser separados por métodos conhecidos, por exemplo, filtração ou centrifugação, como, por exemplo, por centrifugação a cerca de 200 20.000 rpm, preferivelmente 500 - 2.000 rpm, a temperatura ambiente ou 4°C. O líquido principal remanescente pode ser descartado ou adicionalmente processado.

Caso necessário, os cristais isolados podem ser lavados e subsequentemente secos ou o licor principal pode ser trocado por um sistema solvente diferente apropriado para armazenamento e/ou uso final dos anticorpos suspensos no mesmo.

Os cristais de anticorpo formados de acordo com a presente invenção podem variar

em sua forma, conforme já explicado acima. Para administração terapêutica, o tamanho dos cristais variará dependendo da via de administração, por exemplo, para administração subcutânea, o tamanho dos cristais pode ser maior que para administração intravenosa.

A forma dos cristais pode ser alterada por acréscimo de aditivos à mistura de cristalização, como foi descrito anteriormente para ambos cristais de proteína e cristais de moléculas orgânicas e inorgânicas de peso molecular baixo.

Caso necessário, pode ser verificado que os cristais são de fato cristais do anticorpo. Os cristais de um anticorpo podem ser analisados microscopicamente por birrefringência. Em geral, os cristais, a menos que os de simetria interna cúbica girarão o plano de polarização da Iuz polarizada. Ainda em outro método, os cristais podem ser isolados, lavados, ressolubilizados e analisados por SDS-PAGE e, opcionalmente, coloridos com um anticorpo 5 de receptor anti-Fc. Opcionalmente, o anticorpo ressolubilizado também pode ser testado para ligação ao seu hlL-12 usando ensaios padrão.

Os cristais conforme obtidos de acordo com a invenção podem também ser reticuIados um no outro. Tal reticulação pode melhorar a estabilidade dos cristais. Os métodos para reticulação dos cristais são descritos, por exemplo, na Patente US número 5.849.296. 10 Os cristais podem ser reticulados usando um reagente bifuncional, tal como, glutaraldeído. Uma vez reticulados, os cristais podem ser Iiofilizados e armazenados para uso, por exemplo, em aplicações de diagnóstico ou terapêuticas.

Em alguns casos, pode ser desejável secar o cristal. Os cristais podem se secos por meio de gases inertes, como gás nitrogênio, secagem em forno a vácuo, liofilização, evaporação, secagem em bandeja, secagem em leito fluido, secagem por aspersão, secagem a vácuo ou secagem em laminador. Os métodos apropriados são bem conhecidos.

Os cristais formados de acordo com a invenção podem ser mantidos na solução de cristalização original ou podem ser lavados e combinados com outras substâncias, como veículos inertes ou ingredientes para formar composições ou formulações compreendendo cristais da invenção. Tais composições ou formulações podem ser usadas, por exemplo, nas aplicações terapêuticas e de diagnóstico.

Uma modalidade preferida é combinar um veícuio ou ingrediente apropriado com cristais da invenção, de tal modo que os cristais da formulação sejam embutidos ou encapsulados por um excipiente. Veículos apropriados podem ser tomados do grupo não Iimitante 25 de: poli (ácido acrílico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anidridos), poli (depsipeptídeo), poli (ésteres), poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) ou PLGA, poli (βhidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etileno glicol), poli (hidroxipropil) metacrilamida, poli (organo) fosfazeno, poli (orto ésteres), poli (álcool vinílico), poli (vinilpirrolidona), copolímeros éter vinílico alquil anidrido maléico, polióis plurônicos, albumina, algina30 to, celulose e derivados de celulose, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurônico, oligossacarídeos, glicaminoglicanos, polissacarídeos sulfatados, combinações e copolímeros das mesmas, SAIB, ácidos graxos e sais de ácidos graxos, alcoóis graxos, aminas graxas, mono, di e triglicerídeos de ácidos graxos, fosfolipídeos, glicolipídeos, esteróis e ceras e substâncias semelhantes correlatas. Ceras são adicionalmente classificadas em produtos natu35 rais e sintéticos. Materiais naturais incluem ceras obtidas de fontes vegetais, animais ou minerais, tais como, cera de abelha, carnaúba e cera montanha. Naftalenos cloratos e polímeros etilênicos sã exemplos de produtos cerosos sintéticos. C. Composições

Outro aspecto da invenção se refere às composições/formulações compreendendo cristais de anticorpo anti-hlL-12, em combinação com pelo menos um veículo/excipiente.

As formulações podem ser sólidas, semissólidas ou líquidas.

As formulações da invenção são preparadas em uma forma apropriada para arma

zenamento e/ou uso, por mistura do anticorpo possuindo o grau necessário de pureza com um aditivo fisiologicamente aceitável, como veículo, excipiente e/ou estabilizador (vide, por exemplo, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de suspensões, Iiofilizadas ou secas em outro modo. Opcionalmente, ingredientes ativos 10 adicionais, como por exemplo, anticorpos diferentes, biomoléculas, moléculas de peso molecular baixo química ou enzimaticamente sintetizadas podem ser incorporadas.

Aditivos aceitáveis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas. Exemplos não Iimitantes dos mesmos incluem:

- Agentes acidificantes, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido clorídrico, ácido maléico, ácido fosfórico, ácido fosfórico diluído, ácido sulfúrico, ácido tartári

co.

- Propelentes para aerossol, tais como, butano, diclorodifluormetano, diclorotetrafluoretano, isobutano, propano, tricloromonofluormetano.

- Deslocamentos de ar, tais como dióxido de carbono, nitrogênio:

- Desnaturantes alcoólicos, tais como metil isobutil cetona, octacetato de sacarose;

- Agentes alcalinizantes, tais como solução de amônia, carbonato d amônio, dietanolamina, diisopropanolamina, hidróxido de potássio, bicarbonato de sódio, borato de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, trolamina;

- Agentes antiespumantes, tais como dimeticona, simeticona.

- Preservantes antimicrobianos, tais como cloreto de benzalcônio, solução de clore

to de benzalcônio, cloreto de benzeltônio, ácido benzóico, álcool benzílico, butilparabeno, cloreto de cetilpiridínio, clorobutanol, clorocresol, cresol, ácido desidroacético, etilparabeno, metilparabeno, metilparabeno sódio, fenol, álcool feniletílico, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, benzoato de potássio, sorbato de potássio, propilparabeno, propilparabeno 30 sódio, benzoato de sódio, desidroacetato, propionato de sódio, ácido sórbico, timerosal, timol.

- Antioxidantes, tais como ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, gaiato de propila, sulfoxiIato de aldeído fórmico sódio, metiabissulfito de sódio, tiossulfato de sódio, dióxido de enxo

fre, tocofenol, excipiente de tocoferol;

- Agentes de tamponamento, tais como, ácido acético, carbonato de amônio, fosfato de amônio, ácido bórico, ácido cítrico, ácido lático, ácido fosfórico, citrato de potássio, metafosfato de potássio, fosfato de potássio monobásico, acetato de sódio, citrato de sódio, solução de Iactato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, histidina.

- Agentes quelantes, como, edetato dissódio, ácido etilenodiamina tetraacético e sais, ácido edético;

- Agentes de revestimento, tais como carboximetilcelulose de sódio, acetato de ce

lulose, acetato ftalato de celulose, etilcelulose, gelatina, esmalte farmacêutico, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, ftalato hidroxipropil metilcelulose, copolímero de ácido metacrílico, metilcelulose, polietileno glicol, ftalato de acetato de polivinila, ftalato, gomalaca, sacarose, dióxido de titânio, cera de carnaúba, cera microcristalina, zeína, poli aminoácidos, outros polímeros como PLGA, etc., e SAIB.

- Agentes corantes, tais como óxido férrico.

- Agentes complexantes, tais como, ácido etilenodiamina tetraacético e sais (EDTA), ácido edético, etanolamida do ácido gentísico, sulfato de oxiquinolina.

- Dissecantes, como cloreto de cálcio, sulfato de cálcio, dióxido de silício.

- Agentes emulsionantes e/ou solubilizantes, tais como acácia, colesterol, dietano

Iamina (adjuvante), monoestearato de glicerila, alcoóis de lanolina, lecitina, mono e diglicerídeos, monoetanolamina (adjuvante), ácido oléico (adjuvante), álcool oleíla (estabilizante), poloxâmero, estearato de polioxietileno 50, óleo de rícino polioxila 35, óleo de rícino hidrogenado poliooxila 40, éter oleílico polioxila 10, éter cetoestearílico polioxila 20, estearato 20 polioxila 40, polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80, diacetato de propileno glicol, monoestearato de propileno glicol, Iauril sulfato de sódio, estearto de sódio, monolaurato sorbitano, monooleato sorbitano, monopalmitato sorbitano, monoestearato sorbitano, ácido esteárico, trolamina, cera emulsionante.

- Coadjuvantes de filtração, tais como, celulose em pó, terra silícea purificada.

- Aromatizantes e perfumes, tais como anetol, benzaldeído, etil vanilina, mentol, sa

Iicilato de metila, glutamato de monossódio, óleo de flor de laranjeira, hortelã-pimenta, óleo de hortelã-pimenta, óleo de rosa, água de rosas mais forte, timol, tintura de bálsalmo-detolu, baunilha, tintura de baunilha, vanilina.

- Deslizantes e/ou agentes anti-bolo, tais como silicato de cálcio, silicato de magnésio, dióxido de silício coloidal, talco.

- Umectantes, tais como, glicerina, hexileno glicol, propileno glicol, sorbitol;

- Bases de unguento, tais como lanolina, lanolina anidra, unguento hidrófilo, unguento branco, unguento amarelo, unguento de polietileno glicol, petrolato, petrolato hidrófi

lo, petrolato branco, unguento de base de rosas, esqualeno.

- Plastificantes, tais como, óleo de rícino, lanolina, óleo mineral, petrolato, formato

de benzil benila, clorobutanol, ftalato de dietila, sorbitol, monoglicerídeos diacetilados, ftalato de dietila, glicerina, glicerol, monoglicerideos mono e diacetilados, polietileno glicol, propileno glicol, triacetina, citrato de trietila, etanol.

- Polipeptídeos, tais como os de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos);

Proteínas, tais como, albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas;

- Membranas poliméricas, tais como, membranas de acetato de celulose.

- Solventes, tais como, acetona, álcool, álcool diluído, hidrato de amileno, benzoato de benzila, álcool butílico, tetracloreto de carbono, clorofórmio, óleo de milho, óleo de semente de algodão, acetato de etila, glicerina, hexileno glicol, álcool isopropílico, álcool metílico, cloreto de metileno, metil isobutil cetona, óleo mineral, óleo de amendoim, polietileno

glicol, carbonato de propileno, propileno glicol, óleo de gergelim, água para injeção, água estéril para irrigação, água purificada, triglicerídeos líquidos, ceras líquidas, alcoóis superiores.

- Sorventes, tais como celulose em pó, carvão, terra silícea purificada, sorventes de dióxido de carbono, cal de hidróxido de bário, cal de soda.

- Agentes de enrijecimento, tais como óleo de rícino hidrogenado, álcool cetoestea

rílico, álcool cetílico, cera de ésteres cetílicos, gordura dura, parafina, excipiente de polietileno, álcool estearílico, cera emulsionante, cera branca, cera amarela.

- Bases para supositório, tais como, manteiga de cacau, gordura dura, polietileno

glicol;

- Agentes para suspensão e/ou aumento de viscosidade, tais como, acácia, ágar,

ácido algínico, monoestearato de alumínio, bentonita, bentonita purificada, bentonita magma, carbômero 934p, carboximetilcelulose cálcio, carboximetilcelulose sódio, carboximetilceIulose sódio 12, carragenana, carboximetilcelulose sódio celulose e microcristalina, dextrina, gelatina, goma guar, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose,

silicato de alumínio magnésio, metilcelulose, pectina, óxido de polietileno, álcool de polivinila, povidona, alginato de propileno glicol, dióxido de silício, dióxido de silício coloidal, alginato de sódio, tragacanto, goma xantano;

- Agentes adoçantes, tais como aspartame, dextratos, dextrose, dextrose excipiente, frutose, manitol, sacarina, sacarina cálcio, sacarina sódio, sorbitol, sorbitol em solução,

sacarose, açúcar compressível, açúcar de confeiteiro, xarope;

- Ligantes para comprimidos, tais como acácia, ácido algínico, carboximetilcelulose de sódio, celulose microcristalina, dextrina, etilcelulose, gelatina, glicose líquida, goma guar, hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, óxido de polietileno, povidona, amido prégelatinizado, xarope.

- Diluentes para comprimidos e/ou cápsulas, tais como carbonato de cálcio, fosfato

de cálcio dibásico, fosfato de cálcio tribásico, sulfato de cálcio, celulose microcristalina, celulose em pó, dextranos, dextrina, excipiente dextrose, frutose, caulim, lactose, manitol, sorbitol, amido, amido pré-gelatinizado, sacarose, açúcar compressível, açúcar de confeiteiro;

- Desintegrantes de comprimido, tais como, ácido algínico, celulose microcristalina, croscarmelose sódio, corspovidona, polacrilina potássio, glicolato de sódio amido, amido, amido pré-gelatinizado.

- Comprimido e/ou lubrificantes em cápsula, tais como, estearato de cálcio, behena

to de glicerila, estearato de magnésio, óleo mineral leve, polietileno glicol, estearil fumarato de sódio, ácido esteárico, ácido esteárico purificado, talco, óleo vegetal hidrogenado, estearato de zinco;

- Agente de tonicidade, tal como dextrose, glicerina, manitol, cloreto de potássio, veículo cloreto de sódio: elixir aromático aromatizado e/ou adoçado, elixir benzaldeído composto, elixir isoalcoólico, água de hortelã-pimenta, solução de sorbitol, xarope, xarope de bálsamo-de-tolu.

- Veículos, tais como, óleo de amêndoa oleaginosa, óleo de milho, óleo de semente de algodão, oleato de etila, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, óleo mineral, óleo

mineral leve, álcool miristílico, octildodecanol, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo pérsico, óleo de gergelim, óleo de soja, esqualeno; esfera de açúcar em veículo sólido; água bacteriostática estéril para injeção, água para injeção bacteriostática de cloreto de sódio; triglicerídeos líquidos, ceras líquidas, alcoóis superiores.

- Agentes repelentes de água, tais como, ciclometicona, dimeticona, simeticona;

- Agentes umectantes e/ou solubilizantes, tais como, cloreto de benzalcônio, cloreto

de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio, sódio docusato, nonoxinol 9, nonoxinol 10, octoxinol

9, poloxâmero, óleo de rícino polioxila 35, polioxila 40, óleo de rícino hidrogenado, estearato de polioxila 50, éter oleílico polioxila 10, polioxila 20, éter cetoestearílico, estearato de polioxila 40, polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80, Iauril sulfato de sódio, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano e tiloxapol.

Os cristais podem ser combinados com um veículo polimérico para prover estabilidade e/ou liberação prolongada. Tais polímeros incluem polímeros biocompatíveis e biodegradáveis. Um veículo polimérico pode ser um tipo de polímero simples ou pode ser composto de uma mistura de tipos de polímero. Exemplos não Iimitantes de veículos poliméricos já foram declarados acima.

Exemplos de ingredientes preferidos ou excipientes incluem;

- sais de aminoácidos, tais como, glicina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, asparagina, glutamina, prolina, histidina;

- monossacarídeos, tais como, glicose, frutose, galactose, manose, arabinose, xilo

se, ribose;

- dissacarídeos, tais como, lactose, trealose, maltose, sacarose; - polissacarídeos, tais como, maltodextrinas, dextranos, amido, glicogênio; - alditóis, tais como, manitol, xilitol, lactitol, sorbitol;

- ácido glicurônico, ácido galacturônico;

- ciclodextrinas, tais como, metil ciclodextrina, hidroxipropil-(3-ciclodextrina);

- sais inorgânicos, tais como, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, fosfatos de sódio e potássio, ácido bórico, carbonato de amônio e fosfato de amônio;

- sais orgânicos, tais como, acetatos, citrato, ascorbato, lactato;

- agentes emulsionantes ou solubilizantes, tais como, acácia, dietanolamina, monoestearato de glicerila, lecitina, monoetanolamina, ácido oléico, álcool oleílico, poloxâmero, polissorbatos, Iauril sulfato de sódio, ácido esteárico, monolaurato de sorbitano, monoestearato de sorbitano e outros derivados de sorbitano, derivados de polioxila, cera, derivados de polioxietileno, derivados de sorbitano; e

- reagentes para aumento de viscosidade, tais como, ágar, ácido algínico e seus sais, goma guar, pectina, álcool polivinílico, óxido de polietileno, celulose e seus derivados de carbonato propileno, polietileno glicol, hexileno glicol e tiloxapol.

As formulações descritas no presente documento também compreendem uma quantidade eficaz do anticorpo cristalino. Especificamente, as formulações da invenção podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de cristais de anticorpo da invenção. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” dos cristais de anticorpo pode variar de acordo com fatores, tais como, estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e capacidade do anticorpo de promover uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo são contrabalançados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada nos indivíduos antes ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Dosagens apropriadas podem ser prontamente determinadas usando metodologia padrão. O anticorpo é apropriadamente administrado ao paciente de uma vez ou em uma série de tratamentos. Dependendo dos fatores mencionados acima, cerca de 1 //g/kg a cerca de 50 mg/kg, como, por exemplo, 0,1-20 mg/kg de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária ou semanal típica pode variar de cerca de 1 //g/kg a cerca de 20 mg/kg ou mais, dependendo da condição, o tratamento sendo repetido até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em alguns casos, as formulações compreendem uma concentração de anticorpos de pelo menos 1 g/L ou mais, quando ressolubilizadas. Em outras modalidades, a concentração de anticorpos é de pelo menos cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L, quando ressolubilizada.

Os cristais de um anticorpo ou formulações compreendendo tais cristais podem ser administrados sozinhos ou como parte de uma preparação farmacêutica. Eles podem ser administrados por vias parenterais, orais ou tópicas. Por exemplo, eles podem ser administrados por via oral, pulmonar, nasal, aural, anal, dérmica, ocular, intravenosa, intramuscular,

intraarterial, intraperitoneal, mucosal, sublingual, subcutânea, transdérmica, tópica ou via intracraniana ou na cavidade bucal. Exemplos específicos de técnicas de administração compreendem inalação pulmonar, aplicação intralesional, injeção por agulha, inalação de pó seco, eletroporação na pele, distribuição por aerossol e tecnologias de injeção sem agulha, incluindo administração subcutânea sem agulha.

A presente invenção será explicada agora em mais detalhes por meio dos exem

plos ilustrativos não Iimitantes que se seguem. Guiado pela parte geral da descrição e com base no seu conhecimento geral, um versado na técnica será capaz de prover modalidades adicionais à invenção, sem experimentação indevida.

Exemplificacão A. Materiais

a) Proteína

Anticorpo monoclonal congelado (mAb) ABT-874 foi obtido na Abbott Laboratories. Todos os experimentos foram realizados em um lote de produto, onde a concentração de mAb original era de 64 mg/mL.

b) Química Fina

Acetato de sódio foi obtido na Grüssing GmbH, Filsum. Polietileno glicóis de classificações diferentes de polimerização foram obtidos na Clariant GmbH, Sulzbach. Adicionalmente, crivos de cristalização comercial e reagentes (Hampton Research, Nextal Biotechnologies) foram usados para determinados experimentos em micro escala. Todas as outras substâncias químicas foram obtidas na Sigma-Aldrich, Steinheim ou Merck, Darmstadt.

B. Métodos Gerais

a) Descongelamento da substância medicamentosa ABT-874 ABT-874 foi descongelada a 25°C em banhos de água agitados.

b) Troca de tampão - Método A

Uma alíquota de solução de ABT-874 foi pipetada em um concentrador de 30 KDa

MWCO Vivaspin 20 (Vivascience). A amostra da proteína foi diluída com o novo tampão em uma taxa de 1:10 e por centrifugação a 5.000 x g a 4°C (Sigma 4 k 15 centrífuga de laboratório), o volume da amostra foi trazido de volta para o volume da amostra inicial. As etapas de diluição/centrifugação foram repetidos uma vez, resultando em uma diluição de 1:100 do tampão de amostra original. Após ajuste da concentração da proteína, a solução foi filtrada e esterilizada através de uma unidade de filtro acionada por seringa de 0,2 μηη.

b) Troca de Tampão - Método B

Uma alíquota da solução de ABT-874 foi colocada em um cassete de diálise SLIDEA-LYZER (Pierce Biotechnology Inc.). O cassete de diálise foi colocado em um béquer contendo o tampão escolhido e a troca de tampão foi realizada a 4°C por toda noite com agitação. Após ajuste da concentração da proteína, a solução foi filtrada e esterilizada através de uma unidade de filtro acionada por seringa de 0,2 μη\.

c) OD280 - medições da concentração de proteína

Um dispositivo ThermoSpectronics UV1 foi empregado para avaliar a concentração da proteína a um comprimento de onda de 280 nm, aplicando um coeficiente de extinção de 1,42 cm2 mg"1. Para este fim, alíquotas de cristalização foram centrifugadas a 14.000 rpm e a concentração da proteína residual foi determinada no sobrenadante.

d) Medições de pH

As medições foram conduzidas usando um medidor de pH Mettler Toledo MP220. Foram utilizados 413 eletrodos Inlab e 423 micro eletrodos Inlad.

e) Métodos de Cristalização

e1) Cristalização em micro escala - Difusão de Vapor em Gota em Repouso Hydra

Il

Filtrações de cristalização inicial foram realizadas usando robô de cristalização Hydra Il e placas de 96 poços Greiner (poços de três gotas, Hampton Research). Após ajustes das placas, os poços foram vedados com película Clearseal (Hampton Research).

e2) Cristalização em micro escala - Difusão de Vapor em Gota Pendente

Experimentos de difusão de vapor em gota pendente foram conduzidos usando placas VDX (com vedante, Hampton Research) e lâminas de revestimento plásticas OptiCIear (quadradas, Hamp-ton Research) ou lâminas de revestimento de vidro siliconizado (circulares, Hampton Research), respectivamente. Após preparação das soluções de reservatório, 30 uma gota da solução de reservatório foi misturada com uma gota da solução de proteína sobre uma lâmina de revestimento e o poço foi vedado com a lâmina de revestimento invertida, de modo que a gota ficasse pendente acima do reservatório.

e3) Cristalização em Batelada - Método A (placa de 24 poços)

A cristalização em batelada foi realizada por mistura da solução de proteína com uma quantidade igual do tampão de cristalização (500 μΐ.) em um poço. O poço foi subsequentemente vedado com fita adesiva para prevenir evaporação da água.

e4) Cristalização em batelada - Método B (Tubo de Reação Eppendorff) A cristalização em batelada foi realizada por mistura da solução de proteína com uma quantidade igual do tampão de cristalização em um tubo de reação Eppendorff de 1,5 mL ou 2 mL.

e5) Cristalização em batelada - Método C (Tubos Falcon, sem agitação)

A cristalização em batelada foi realizada por mistura da solução de proteína com

uma quantidade igual do tampão de cristalização em um tubo Falcon de 15 mL ou 50 mL.

e6) Cristalização em batelada - Método D (Tubos Falcon, com agitação)

A cristalização em batelada foi realizada por mistura da solução de proteína com uma quantidade igual do tampão de cristalização em um tubo Falcon de 15 mL ou 50 mL. Imediatamente após fechamento, o tubo foi colocado em um agitador de laboratório (GFL 3013 ou GFL 3015) ou foi alternativamente agitado por tombamento. Aplicando-se estes métodos, a introdução dos agitadores na amostra foi evitada.

f) SDS-PAGE

Amostras foram preparadas por ajuste da concentração da proteína para 8 /vg/20 15 μί.. As amostras foram diluídas com um tampão de SDS/Tris/glicerina contendo azul de bromofenol. Análise SDS PAGE qualitativa foi realizada usando Géis Invitrogen NuPage BisTris a 10%, Tampão de Operação NuPae SDS e Padrão de Proteína de Faixa Ampla Markl 2. Vinte micro litros da amostra foram pipetados em uma bolsa de gel. Após operar o gel e fixação com reagente de ácido acético/metano, coloração foi realizada usando o kit 20 Novex Coloidal Blue Stain. Os géis foram secos usando solução de secagem Invitrogen GelDry.

g) Microscopia em Iuz

Os cristais foram observados usando um microscópio Zeiss 25 ou Nikon Labophot.

O último foi equipado com um conjunto de filtros de polarização e uma câmara de vídeo JVC TK C1380 colorida.

h) SE-HPLC

Níveis de agregação das amostras de ABT-874 foram avaliados por SE-HPLC. Uma bomba Dionex P680, autoamostrador ASI-100 e dispositivo UVD170U foram usados. Espécies agregadas foram separadas do monômero por uma coluna de filtração de gel Amersham Bioscience Superdex 200 10/300 GL, aplicando um protocolo padrão Abbott validado (A-796874,0 - ABT 874, J 695).

C. Experimentos de Cristalização de Difusão de Vapor

Os valores de concentração fornecidos nos exemplos que se seguem são valores iniciais com referência à solução de anticorpo e a solução de reservatório antes da mistura das duas soluções.

Todos os valores de pH, se não descritos de outra forma, se referem ao pH de uma solução mestra de tampão de acetato antes da mesma ser combinada com outras substâncias, como o agente de cristalização.

Todas as molaridades do tampão, caso não descritas de outra forma, se referem às concentrações de acetato de sódio em uma solução mestra antes do ajuste do pH, tipicamente realizada usando ácido acético glacial.

Exemplo 1 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Modo de Difu

são de Vapor de Gota Pendente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas

foram empregadas. 500 μ\- de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q (completamente dessalinizada e opcionalmente pré-destilada) em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 15 variou de cerca de 6% peso/volume a cerca de 28% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μ\- de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram 20 armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 2 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Modo de Difu

são de Vapor em Gota Pendente. Concentração diferente de proteína

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 em concentração diferente de proteína. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 50 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μί. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a 35 cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 6% peso/volume a cerca de 28% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΐ da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μί. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classi5 ficadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados os cristais foram observados em uma concentração de PEG 4.000 de cerca de 16%. Os cristais mostraram morfologia semelhante à agulha ou cacho de agulhas.

Exemplo 3 - Filtracão por Grade de PEG 400/Acetato de Sódio no Modo de Difusão

de Vapor em Gota Pendente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 400. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de PEG usando solução de PEG 400 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida 20 constante a cerca de 0,1 Me PEG 400 variou de cerca de 30% peso/volume a cerca de 40% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Gada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de

1 μί. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de 25 gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 12 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 4 - Filtracão por Grade de PEG 400/Acetato de Sódio no Modo de Difusão

de Vapor em gota Pendente. Concentração diferente de proteína

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 em concentração diferente de proteína. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 50 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de PEG usando solução de PEG 400 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 400 variou de cerca de 30% peso/volume a cerca de 40% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de

1 μ\_ de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 12 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 5 - Filtracão por Grade de PEG 400/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Concentração diferente de proteína e Aiuste

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando concentração diferente de proteína e um ajuste diferente. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 50 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução PEG 400 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 M1 e PEG 400 variou de cerca de 30% peso/volume a cerca de 40% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,7 ou 6,7, respectivamente. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μΥ. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiClear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os vinte e um dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 6 - Filtracão por Grade de PEG 10.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 10.000. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL. Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 10.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 10.000 variou de cerca de 4% peso/volume a cerca de 14% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 //L da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μΥ. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 12 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 7 - Filtracão por Grade de PEG 10.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Concentração diferente de proteína

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 10.000 e em concentração diferente de proteína. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 50 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 10.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 10.000 variou de cerca de 4% peso/volume a cerca de 14% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μΥ. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 12 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 8 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Aiuste Diferente Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000 e um ajuste diferente. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas

foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 22% peso/volume a cerca de 28% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 4,2, 4,7, 5,2, 5,7, 6,2 e 6,7, respectivamente. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μ\_ da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μί de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados. RESULTADOS: Nos 48 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 9 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Aiuste Diferente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000 e outro ajuste. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas

foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 8% peso/volume a cerca de 14% pe30 so/volume em etapas de 2%. O pH foi de cerca de 5,7, 6,2 e 6,7, respectivamente. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μΥ. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Micros35 copia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados. RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados, os cristais foram observados em uma concentração de PEG 4.000 de cerca de 10 a 14% em os todos pHs incluídos neste exemplo. Os cristais mostraram morfologia semelhante à agulha ou cacho de agulhas.

Exemplo 10 - Filtracão por Grade de PEG 400 Combinado com PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 400 com 4.000/Acetato de sódio. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas

foram empregadas. 500 /vL de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 8% peso/volume a cerca de 12% pe15 so/volume em etapas de 2%. Simultaneamente, PEG 400 foi trazido para PEG 4.000/ soluções de acetato em concentrações de cerca de 26% peso/volume, 28% peso/volume, 30% peso/volume e 32% peso/volume, respectivamente. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 //L da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 //L de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de 20 revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi reaiizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados não foram observados cristais.

Exemplo 11 - Filtracão por Grade de PEG 400 Combinado com PEG 4.000/ Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Concentração diferente de proteína

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 400 com 4.000/Acetato de sódio com concentrações diferentes de proteína. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 50 mg/mL Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 4% peso/volume a cerca de 8% peso/volume em etapas de 2%. Simultaneamente, PEG 400 foi trazido para PEG 4.000/ soluções de acetato e concentrações de cerca de 30% peso/volume, 32% peso/volume, 34% peso/volume e 36% peso/volume, respectivamente. O pH foi de cerca de 5,2 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μί da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μί de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os trinta dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados, não foram observados cristais.

Exemplo 12 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Tampão de Proteína Diferente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000 com tampões de proteína diferentes. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 μί de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 4% peso/volume a cerca de 26% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de 5,5 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μί da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μί de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os cinco dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados, os cristais foram observados em uma concentração de PEG 4.000 de cerca de 12% peso/volume, 18% peso/volume, 20% peso/volume, 22% peso/volume e 24% peso/volume, respectivamente. Os cristais mostraram morfologia semelhante à agulha ou cacho de agulhas.

Exemplo 13 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Concentração diferente de proteína

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000 com concentrações diferentes de proteína. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 5 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 //L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 4% peso/volume a cerca de 26% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de 5,5 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 //L da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 u L de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os cinco dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados, os cristais foram observados em uma concentração de PEG 4.000 de cerca de 10% peso/volume e 14% peso/volume, respectivamente. Os cristais mostraram morfologia semelhante a cacho de agulhas.

Exemplo 14 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Tampão de Proteína Diferente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de sódio com tampão de proteína diferente. ABT874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 20 mg/mL.

Uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento plástico OptiCIear quadradas foram empregadas. 500 //L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me PEG 4.000 variou de cerca de 4% peso/volume a cerca de 26% peso/volume em etapas de 2%. O pH foi de 5,5 do começo ao fim. Cada condição foi avaliada em duplicata. Cerca de 1 μί. da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μί. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento plástico OptiCIear quadrada e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada várias vezes durante os cinco dias seguintes. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nos 24 poços avaliados, os cristais foram observados em uma concentração de PEG 4.000 de cerca de 10% peso/volume, 14% peso/volume, 16% peso/volume, 20% peso/volume e 22% peso/volume, respectivamente. Os cristais mostraram morfologia semelhante à agulha ou cacho de agulhas.

Exemplo 15 - Classificação Ampla das Condições no Modo de Difusão de Vapor

Uma classificação ampla do método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizada em ABT-874. ABT-874 foi tamponado em um tampão de 20 mM HEPES/150 mM de cloreto de sódio em pH 7,4. A concentração da proteína foi ajustada 10 para 10 mg/mL. Em outro caso, a concentração da proteína foi ajustada para 5 mg/mL. Em outro caso, a concentração da proteína foi ajustada para 20 mg/mL. Empregando o robô de cristalização Hydra II, as placas Greiner de 96 poços foram ajustadas a temperatura ambiente, empregando vários filtros de cristalização disponíveis comercialmente. A solução de proteína e o agente de cristalização foram misturados em uma razão de cerca de 1:1, preferi15 velmente 1:1. Os filtros que se seguem foram empregados. Hampton Crystal Screen 1 & 2. Hampton Index Screen, Hampton SaItRX Screen (todos da Hampton Research), Nextal The Classics, The Classics Lite, The PEGs, The Anions, The pH clear and The Ammonium sulphate (todos da Nextal Biotechnologies).

Após adição da proteína ao agente de cristalização (três gotas por adição, contendo 20 as três concentrações diferentes de proteína descritas acima), as placas foram vedadas com película Clearseal. Qualquer placa foi ajustada em quadruplicata e armazenada a temperatura ambiente, 4°C, 27°C e 37°C, respectivamente. Microscopia das gotas foi realizada após seis dias. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais s gotas contendo misturas de espécies e cristais precipita25 dos.

RESULTADOS: Dentre as 10.368 condições testadas, 4 renderam cristais. As condições compreenderam a seguinte concentração de proteínas e agentes de cristalização, conforme declarado pelos fabricantes:

- temperatura ambiente, ABT-874 a cerca de 20 mg/mL, 0,2M sulfato de amônio, 30% peso/volume PEG 8,000 (Hampton Crystal Screen, C6)

- 4°C, ABT-874 a cerca de 5 mg/mL, 0,1 M HEPES pH 7,5, 5% peso/volume de PEG 8,000 (Nextal The Classics Lite, F4)

- 4°C, ABT-874 a cerca de 10 mg/mL, 0,1 M HEPES pH 7,5, 5% peso/volume de PEG 6,000, 2,5% volume/volume MPD (Nextal The Classics Lite, H9)

- 4°C, ABT-874 a cerca de 20 mg/mL, 0,1 M HEPES, 5% peso/volume de PEG

6.000, pH 7,00 (Nextal pH límpido, C4)

Os cristais mostraram morfologias semelhantes à agulha ou semelhantes a cachos. Exemplo 16 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Aiuste Diferente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 400 com 4.000/Acetato de sódio com um ajuste diferente. ABT874 foi tamponado em um tampão de 20 mM HEPES/150 mM de cloreto de sódio em pH 7,4. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL. Em outro caso, a concentração da proteína foi ajustada para 5 mg/mL.

Foram empregados uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento de vidro siliconizado circulares. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 Me concentração de PEG 4.000 foi empregada a cerca de 12% peso/volume, 18% peso/volume, 24% peso/volume e 30% peso/volume, respectivamente. O pH variou de cerca de 3,6 a cerca de 5,6 em 0,2 etapa, gerando 48 condições diferentes. Qualquer condição foi ajustada com as duas concentrações de proteína conforme descritas acima. Cerca de 1 μΥ. da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μΥ. de uma solução de reservatório específica sobre uma lâmina de revestimento de vidro siliconizado e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada após seis dias. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nas 96 condições testadas, foram observados cristais com a forma de cachos de agulha com 5 mg/mL de ABT-874 e cerca de 24% de PEG 4.000 em pH cerca de 5,6.

Exemplo 17 - PEG 4.000/Filtracão por Grade de Citrato de Sódio no Modo de Difusão de Vapor em Gota Pendente. Aiuste Diferente

Um método de cristalização de difusão de vapor em gota pendente foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Citrato de Sódio com um ajuste diferente. ABT-874 foi tamponado em um tampão de 20 mM HEPES/150 mM de cloreto de sódio em pH 7,4. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL. Em outro caso, a concentração da proteína foi ajustada para 5 mg/mL.

Foram empregados uma placa VDX engraxada e lâminas de revestimento de vidro siliconizado circulares. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura tampão de citrato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de citrato foi mantida constante a cerca de 0,1 M, e a concentração de PEG 4.000 foi empregada a cerca de 12% peso/volume, 18% peso/volume, 24% peso/volume ou 30% peso/volume. O pH variou de cerca de 4,2 a cerca de 6,4 em 0,2 etapa, gerando 48 condições diferentes. Qualquer condição foi ajustada com as duas concentrações de proteína conforme descritas acima. Cerca de 1 μΙ_ da solução de proteína foi misturado com cerca de 1 μί de uma solução de reservatório específica lâmina de revestimento de vidro siliconizado e o poço foi vedado com a lâmina invertida gerando um experimento de gota pendente. As placas foram armazenadas em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada após seis dias. As condições foram classificadas em gotas límpidas, gotas contendo precipitação aleatória, gotas contendo cristais e gotas contendo misturas de espécies e cristais precipitados.

RESULTADOS: Nas 96 condições testadas não foram observados cristais.

D. Experimentos de Cristalização em Batelada

Um método de cristalização em batelada foi realizado em ABT-874. Os valores de concentração fornecidos nos exemplos que se seguem são valores iniciais com referência à solução de anticorpo e solução de cristalização antes da mistura das duas soluções.

Todos os valores de pH, se não descritos de outra forma, se referem ao pH de uma solução mestra de tampão de acetato antes de ser combinada com outras substâncias, como o agente de cristalização.

Todas as molaridades de tampão, se não descritas de outra forma, se referem às concentrações de acetato de sódio em uma solução mestra antes do ajuste do pH, tipicamente realizado usando ácido acético glacial.

Exemplo 18 - PEG 4.000/Condicão de Acetato de Sódio em Volume de Batelada de

1 mL

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de sódio em volume ue bateiada de 1 mL. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH of cerca de 5,2. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 500 μ\_ da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo de reação Eppendorff de 1,5 mL. 500 μΥ. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de 0,1 M, e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 6,7. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 14% peso/volume. O tubo de reação foi armazenado a temperatura ambiente. Microscopia da alíquota de 1 μί. foi realizada após 16 dias.

RESULTADOS: Não foram observados cristais após 16 dias.

Exemplo 19 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Modo de Volume de Batelada de 300 uL

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um modo de volume de batelada de 300 μΙ_. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/ml_

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 150 μΐ_ da solução 5 de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um poço. A placa de poço foi subsequentemente vedada com fita adesiva para prevenir evaporação da água. 150 /;L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 M, e o pH 10 do tampão de acetato foi de cerca de 5,5 do começo ao fim. PEG 4.000 variou de cerca de 12% peso/volume a cerca de 34% peso/volume em etapas de 2%. Qualquer condição foi avaliada in triplicata. A placa foi armazenada em temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada durante nos dois dias seguintes.

RESULTADOS: Nos 36 poços examinados foram observados cristais nos experimentos, os quais foram ajustados entre 22% peso/volume e 26% peso/volume de PEG 4.000.

Exemplo 20 - Condição de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 1 mL. Concentrações Diferentes de PEG 4.000

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 1 mL empregando concentrações diferentes de PEG 4.000. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH of cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura da cerca de 500 //L da solução 25 de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo de reação Eppendorff de 1,5 mL. 500 //L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de 0,1 M, e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% 30 peso/volume. O experimento foi ajustado em quadruplicata. Os tubos de reação foram armazenados a temperatura ambiente. Microscopia de alíquotas de 1 /vL foi realizada várias vezes durante os 78 dias seguintes. Adicionalmente, o rendimento de cristal foi conforme determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm, e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada apareceram após sete dias. Ne

nhuma espécie precipitada foi observada durante os meses seguintes de armazenamento. O rendimento do cristal conforme determinado por OD28Q a partir da concentração de proteína residual no sobrenadante estava entre 50 e 70% após sessenta dias.

Exemplo 21 - Condição de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 1 mL. Concentrações Diferentes de PEG 4.000

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 1 mL empregando concentrações diferentes de PEG 4.000. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 500 //L da solução 10 de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo de reação Eppendorff de 1,5 mL. 500 //L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 26% pe15 so/volume. O tubo de reação foi armazenado a temperatura ambiente. Microscopia de uma alíquota de 1 μ\_ foi realizada várias vezes durante os meses seguintes.

RESULTADOS: Após um dia, foram observadas espécies precipitadas. Cristais semelhantes à espada , além do precipitado, foram observados após cinco dias.

Exemplo 22 - Condição de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 1 mL. Concentrações Diferentes de PEG 4.000

Um método de cristalização foi realizado no ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em volume de batelada de 1 mL empregando concentrações diferentes de PEG 4.000. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 500 /vL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo de reação Eppendorff de 1,5 mL. 500 //L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q. 30 Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de 0,1 M, e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 24% peso/volume. O tubo de reação foi armazenado a temperatura ambiente. Microscopia da alíquota de 1 /vL foi realizada várias vezes durante os meses que se seguem. Adicionalmente, o rendimento do cristal foi conforme determinado por OD 280. Uma alíquota da suspen35 são foi centrifugada a 14.000 rpm, e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes a cacho de agulhas apareceram após um dia. Após cinco dias, cristais semelhantes à agulha e plaquetas foram observados além dos cristais semelhantes a cacho de agulhas. O rendimento do cristal conforme determinado por OD280 a partir da concentração de proteína residual no sobrenadante estava entre 60 e 70% após treze dias.

Exemplo 23 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio Em Modo de Volume de Batelada de 1 mL. Concentração diferente de proteína

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 1 mL empregando concentrações diferentes de proteína. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 500 μΐ. da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um poço. A placa de poço foi subsequentemente vedada com fita adesiva para prevenir evaporação da água. 500 //L de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5 do começo ao fim. PEG 4.000 variou de cerca de 12% peso/volume a cerca de 34% peso/volume em etapas de 2%. Qualquer condição foi avaliada em duplicata. A placa foi armazenada a temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada durante o mês seguinte.

RESULTADOS: Nos 24 poços examinados foram observados cristais semelhantes à espada nos experimentos que foram ajustados com cerca de 24% peso/volume e 26% peso/volume de PEG 4.000.

Exemplo 24 - Filtracão por Grade de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Modo de Volume de Batelada de 1 mL. Aiuste Diferente

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 1 mL empregando ajuste diferente. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 500 μΥ. da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um poço. A placa de poço foi subsequentemente vedada com fita adesiva para prevenir evaporação da água. 500 μί. de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em cada poço. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi mantida constante a cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 4,1 , 4,6 e 5,1, respectivamente. PEG 4.000 variou de cerca de 20% peso/volume a cerca de 28% peso/volume em etapas de 2%. A placa foi armazenada a temperatura ambiente. Microscopia das gotas foi realizada durante os quatro dias seguintes.

RESULTADOS: Nos 18 poços examinados, cristais semelhantes à espada foram observados nos experimentos o qual foi ajustado com 28% peso/volume de PEG 4.000 e tampão de acetato de sódio em pH 5,1.

Exemplo 25 - Condição de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 2 mL. Temperatura Diferente

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de sódio em um volume de batelada de 2 mL empregando temperaturas diferentes. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL. A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 1 mL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo de reação Eppendorff de 2 mL. 1 mL de uma solução de reservatório específica foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de 0,1 M, e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% peso/volume. O tubo de reação foi armazenado a 4-8°C. Microscopia da alíquota de 1 //L foi realizada várias vezes durante o mês seguinte.

RESULTADOS: Espécies precipitadas foram observadas após armazenamento por toda noite.

Exemplo 26 - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Bateiaaa de 10 mL. Com Agitação Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG

4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL e com agitação. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL de uma so30 lução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo Falcon de 50 mL. 5 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no tubo. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 24% peso/volume. 35 O tubo foi armazenado a temperatura ambiente, agitando a batelada em um agitador de laboratório. Microscopia da alíquota de 1 μΐ da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada apareceram após seis dias, porém foram quase que completamente absorvidos na superfície do recipiente. Poderia ser concluído da microscopia que a batelada estava livre de espécies precipitadas. O licor de cristalização estava quase que completamente límpido.

Exemplo 27 - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 10 mL. Sem Agitação

Um método de cristalização foi realizado on ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL sem agitação. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo Falcon de 50 mL. mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no tubo. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de

5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 24% peso/volume. O tubo foi armazenado a temperatura ambiente. Microscopia da alíquota de 1 /vL da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento de cristal foi conforme determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes a cacho de agulhas apareceram após um dia. Após quatro dias, cristais semelhantes à agulha foram observados além dos cristais semelhantes a cacho de agulhas. O rendimento do cristal conforme determinado por OD280 a partir da concentração de proteína residual no sobrenadante estava entre 30 e 40% após sete dias.

Exemplo 28 - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 10 mL. Com Agitação. Material de Recipiente Diferente

Urn método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL empregando agitação e materiais de recipiente diferentes. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um frasco de vidro de 50 mL de classe I. 5 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q em um frasco. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 24% peso/volume. O frasco foi armazenado a temperatura ambiente, agitando a batelada em um agitador de laboratório. Microscopia da alíquota de 1 //L da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento do cristal foi conforme 5 determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada foram observados após dezoito dias. O rendimento do cristal conforme determinado por OD280 a partir da concentração de proteína residual no sobrenadante estava entre 40 e 50% após dezoito dias. Uma foto microscópica em Iuz dos cachos de agulhas (largura da foto correspondendo a um comprimento de 450 //m) é mostrada na figura 7.

Exemplo 29 - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 10 mL. com Agitação. Material de Recipiente Diferente e Influência de Polissorbato 80

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG

4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL, com agitação, materiais de recipiente diferentes e influência de polissorbato 80. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL of a solução

de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um frasco de vidro de 50 mL de ciasse i. 5 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no frasco. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de ace25 tato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 24% peso/volume. Adicionalmente, polissorbato 80 em uma concentração de 0,1% foi adicionado ao tampão. O frasco foi armazenado a temperatura ambiente, agitando a batelada em um agitador de laboratório. Microscopia da alíquota de 1 //L da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento do cristal foi conforme 30 determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada foram observados após dezoito dias. Nenhuma diferença foi observada entre a forma do cristal neste exemplo e no Exemplo 28 (sem adição de polissorbato 80). O rendimento do cristal conforme determinado por OD280 a partir da concentração de proteína residual no sobrenadante estava entre 25 e 35% após dezoito dias.

Exemplo 30 - Condições Diferentes de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em volume de batelada de 10 mL e Comparação de Bateladas Agitadas e Não Agitadas

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL empregando uma comparação de bateladas agitadas e não agitadas. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um frasco de vidro de 50 mL de classe I. 5 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão 10 de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no frasco. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% peso/volume e 24% peso/volume. Os frascos foram armazenados a temperatura ambiente, tanto sem agitação quanto agitando a batelada por tombamento . Microscopia da alíquota de 15 1 //L da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento de cristal de uma batelada foi conforme determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Em ambas bateladas agitadas, as espécies precipitadas foram ob20 servadas após 26 dias. A batelada não agitada com o tampão de cerca de 22% peso/volume de PEG 4.000 continha cristais semelhantes à espada após 26 dias, porém o rendimento de cristai foi julgado baixo como a suspensão já estava quase que macroscopicamente límpida. A batelada não agitada com o tampão de cerca de 24% peso/volume de PEG 4.000 continha cristais semelhantes à espada após 26 dias. O rendimento, conforme determinado do 25 sobrenadante após 70 dias estava entre 65 e 75%.

Exemplo 31 - Influência da Semeadura

A influência da semeadura no rendimento do cristal de ABT-874 foi examinada. A batelada não agitada com o tampão de cristalização contendo cerca de 22% peso/volume de PEG 4.000 do Exemplo 30 mostrou rendimento de cristal muito baixo após 26 dias. Portanto, a batelada foi incubada com cerca de 100 μΥ. da batelada não agitada com o tampão de cristalização contendo cerca de 24% peso/volume de PEG 4.000 do mesmo exemplo.

RESULTADOS: Nenhuma extensão de rendimento óbvio resultou da incubação com cristais em semente.

Exemplo 32 - Condições de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 10 mL. Concentração Diferente de Proteína. Comparação de Batelada Agitada e Não Agitada

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL empregando concentrações diferentes de proteína e uma comparação de batelada agitada e não agitada. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 5 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL da solução

de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um frasco de vidro de 15 mL de classe I. 5 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no frasco. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de ace10 tato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% peso/volume, 24% peso/volume e 26% peso/volume. Os frascos foram armazenados a temperatura ambiente, tanto sem agitação quanto agitando a batelada em um agitador de laboratório. Microscopia da alíquota de 1 /vL da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento de cristal de uma batelada foi conforme 15 determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: As bateladas contendo o tampão com cerca de 22% peso/volume e cerca de 24% peso/volume de PEG 4.000 foram límpidas após 65 dias. Embora a batelada agitada contendo o tampão de cristalização com cerca de 26% peso/volume de PEG 4.000 20 contivesse espécies precipitadas após 4 dias, a batelada não agitada do mesmo tampão de cristalização continha cristais semelhantes à espada após 4 dias. O rendimento de cristal desta batelada específica conforme determinado do sobrenadante após 26 dias estava entre 40 e 50%. Uma foto microscópica em Iuz dos cristais (largura da foto correspondendo a um comprimento de 225 /vm) obtida sem agitação é mostrada na figura 8.

Exemplo 33 - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volu

me de Batelada de 10 mL. Aiuste Diferente

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 10 mL empregando um ajuste diferente. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 5 mL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo Falcon de 15 mL. mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no tubo. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de

5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% peso/volume. O tubo foi armazenado a temperatura ambiente. Microscopia da alíquota de 1 /vL da solução foi reaIizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento de cristal da batelada foi conforme determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada foram observados após 11 dias. O rendimento de cristal desta batelada conforme determinado do sobrenadante após 26 dias estava entre 40 e 50%. Uma foto microscópica em Iuz dos cristais (largura da foto correspondendo a um comprimento de 450 /ym) obtido sem agitação após 26 dias é mostrado na figura 9.

Exemplo 34a - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 50 mL

Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG 4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 50 mL. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 25 mL da solução

de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em um tubo Falcon de 50 mL. 25 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, 50% peso/volume de solução de PEG 4.000 e água Milli Q no tubo. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 20 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% peso/volume. O tubo foi armazenado a temperatura ambiente. Microscopia da alíquota de 1 //L da solução foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes. Adicionalmente, o rendimento de cristal da batelada foi conforme determinado por OD 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada foram observados após 3 dias. O

rendimento de cristal desta batelada conforme determinado do sobrenadante após 16 dias estava entre 50 e 60%.

Exemplo 34b - Condição de Cristalização de PEG 4.000/Acetato de Sódio em Volume de Batelada de 700 mL Um método de cristalização foi realizado em ABT-874 empregando PEG

4.000/Acetato de Sódio em um volume de batelada de 700 mL. ABT-874 foi tamponado dentro de um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 350 mL da solução de proteína com um volume igual do tampão de cristalização em uma garrafa de polipropileno de 1 L. 350 mL do tampão de cristalização foram preparados por mistura de tampão de acetato, PEG 4.000 e água Milli Q. Neste exemplo, a molaridade do tampão de acetato foi de cerca de 0,1 M, e o pH do tampão de acetato foi de cerca de 5,5. PEG 4.000 foi empregado a uma concentração de cerca de 22% peso/volume. A garrafa foi armazenada a temperatura ambiente. Microscopia da alíquota de 1 /vL da solução foi realizada após 40 dias. Adicionalmente, o rendimento de cristal da batelada foi conforme determinado por OD 5 280. Uma alíquota da suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm e a concentração da proteína no sobrenadante foi avaliada.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada foram observados após 40 dias. O rendimento de cristal desta batelada conforme determinado do sobrenadante após 40 dias estava entre 50 e 60%. Uma foto microscópica em Iuz dos cristais (largura da foto correspondendo a um comprimento de 450 /vm) obtida após 40 dias sem agitação é mostrada na figura 10.

As condições experimentais dos experimentos de batelada acima são resumidas na Tabela 1 que se segue:

Tabela 1: Experimentos de Batelada

Ex Vol. Tampão de cristaliza¬ Agi Cristais PH PH Conc. Tempe¬ Dia em ba¬ ção (conc. iniciais ta- (rendi¬ Ta Fi¬ final ratura do pio tela¬ çã mento, mp nal prote¬ con¬ da, 0 %) ão ína, trole mL mg/m visual L 18 1 14%1 PEG 4.000, 0,1 M 6,7 5 ambi¬ 16° NaAc ente dia 2 22% PEG 4.000, 0,1 M Preeip 5,5 5,6 5 4-8°C 1o dia NaAc 19 0,3 22%-26% PEG 4.000, +(n.d.) 5,5 5 ambi¬ 2o dia 0,1 M NaAc ente 1 22% PEG 4.000, 0,1 M +(50- 5,5 5,6 5 ambi¬ 7o dia NaAc 70) ente 21 1 26% PEG 4.000, 0,1 M +(n.d.) 5,5 5,6 5 ambi¬ 5o dia NaAc ente 22 1 24% PEG 4.000, 0,1 M +(60- 5,5 5,6 5 ambi¬ 1o dia NaAc 70) ente (13d) 23 1 24%-26% PEG 4.000, +(n.d.) 5,5 5,6 2,5 ambi¬ 2o dia 0,1 M NaAc ente 24 1 28% PEG 4.000, 0,1 M +(n.d.) 5,1 5,2 ambi¬ NaAc ente 5,3 26 10 24% PEG 4.000, 0,1 M + +(n.d.) 5,5 5,6 5 ambi¬ 4° dia NaAc ente 27 10 24% PEG 4.000, 0,1 M +(30- 5,5 5,6 5 ambi¬ 6° dia NaAc 40) ente 28 10 24% PEG 4.000, 0,1 M + +(40- 5,5 5,6 5 ambi¬ 1° dia NaAe 50) ente 29 10 24% PEG 4.000, 0,1 M + +(25- 5,5 5,6 5 ambi¬ 18° NaAe 35) ente dia 0,1% polissorbato 80 10 22% PEG 4.000, 0,1 M +(n.d.) 5,5 5,6 5 ambi¬ 26° NaAe ente dia 22% PEG 4.000, 0,1 M + precip NaAe 24% PEG 4.000, 0,1 M +(65- 26° NaAe 75)(70d dia ) 24% PEG 4.000, 0,1 M + precip NaAe 32 10 22% PEG 4.000, 0,1 M ne¬ 5,5 5,6 2,5 ambi¬ 64° NaAe nhum ente dia 24% PEG 4.000, 0,1 M ne¬ 64° NaAe nhum dia 26% PEG 4.000, 0,1 M +(40- 4° dia NaAe 50) 26% PEG 4.000, 0,1 M + precip 4° dia NaAe 33 10 22% PEG 4.000, 0,1 M +(40- 5,5 5,6 5 ambi¬ 11° NaAe 50)(26d ente dia ) 34 50 22% PEG 4.000, 0,1 M +(50- 5,5 5,6 5 ambi¬ 3° dia a NaAe 60)(16d ente ) 34 700 22% PEG 4.000, 0,1 M +(50- 5,5 5,6 5 ambi¬ 40° b NaAe 60)(40d ente dia ) 1 % (peso/volume). E. Métodos Para Processamento e Análise do Cristal Exemplo 35 - Lavagem dos Cristais

Após a formação dos cristais, uma etapa de lavagem sem redissolução dos cristais pode ser favorável. Após o processo de cristalização haver terminado, a pasta de cristal foi transferida para um tubo de centrifugação e centrifugada a 500 x 1.000 x g por vinte minutos. A centrifugação foi realizada a 4°C ou em temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi decantado e as microesferas de cristal foram facilmente ressuspensas em um tampão contendo cerca de 24% peso/volume de PEG 4.000 em cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH cerca de 5,5. Não o correu nehuma solubilidade medida dos cristais de ABT-874 em tal tampão de lavagem, conforme analisado por OD280. As etapas de centrífugação/ressuspensão foram subsequentemente repetidas por uma a três vezes e após este procedimento de lavagem, as microesferas foram suspensas e armazenadas em tal tampão.

Exemplo 36 - Análise dos cristais por SDS PAGE

De modo a confirmar o caráter protéico dos cristais, os mesmos foram lavados com um tampão de lavagem conforme descrito no Exemplo 32. Após certificação por emprego de OD280 de que não havia mais proteína dissolvida no licor, os cristais foram centrifugados, o sobrenadante foi decantado e os cristais foram subsequentemente dissolvidos em água destilada. A medição de OD280 desta solução revelou que a proteína agora estava presente como a absorvência da amostra era agora significativamente maior como no tampão de lavagem residual. Análise SDS PAGE desta solução de cristais redissolvidos, quando comparada a uma amostra ABT-874 original, mostrou o mesmo padrão.

Exemplo 37 - Análise dos cristais por SE-HPLC

De modo a avaliar o teor de espécies agregadas dos cristais de ABT-874, uma alíquota dos cristais lavados foi centrifugada e redissolvida no tampão de operação SE-HPLC (92 mM fosfato hidrogenado de dissódio/211 mM de sulfato dissódio, pH 7,0). Imediatamente a pós o final do processo de cristalização, neste exemplo, 16 dias em temperatura ambiente, o teor do agregado tipicamente aumentou ligeiramente de cerca de 0,9% para cerca de 1,6-1,7%. Não está claro ainda se tais agregados estão contidos nos cristais ou em suas superfícies e não foram apropriamente removidos pelo processo de lavagem.

F. Exemplos Diversos

Os valores de concentração fornecidos nos exemplos que se seguem são valores iniciais com referência à solução de anticorpo e solução de cristalização antes da mistura das duas soluções.

Todos valores de pH, se não descritos de outra forma, se referem ao pH de uma solução mestra de tampão de acetato antes da mesma ser combinada com outras substâncias, como o agente de cristalização. Todas as molaridades do tampão, se não descritas de outra forma, se referem às concentrações de acetato de sódio em uma solução mestra antes do ajuste do pH, tipicamente realizado usando ácido acético gIacial.

Exemplo 38 - Agente Sólido de Cristalização

ABT-874 foi tamponado em um tampão contendo cerca de 0,1 M acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5. A concentração da proteína foi ajustada para 10 mg/mL.

A cristalização em batelada foi realizada por mistura de cerca de 500 //L da solução de proteína com cerca de 380 //L tampão de acetato (0,1 M, pH 5,5) em um tubo de reação Eppendorf de 2 mL. Subsequentemente, polietileno glicol sólido foi adicionado a uma concentração final de 12% m/v (120 mg/mL). O tubo foi subsequentemente fechado e agitado até a dissolução completa do agente de cristalização. O tubo foi armazenado a temperatura ambiente sem agitação. Microscopia das alíquotas da mistura de cristalização foi realizada várias vezes durante as semanas seguintes.

RESULTADOS: Cristais semelhantes à espada foram observados após sete dias.

Exemplo 39 - Protocolo Diferente de Preparação de Tampão e Preparação de Cristais

Neste exemplo, os tampões de acetato foram preparados conforme descrito a seguir: 60 g de ácido acético glacial foram diluídos com cerca de 840 mL de água purificada. O pH foi ajustado com solução de hidróxido de sódio e o volume ajustado para 1.000 mL. Neste caso, a quantidade de acetato total foi fixada em 1 M (100 mM na solução de proteína, no tampão de cristalização e na mistura de cristalização).

A cristalização foi realizada de acordo com o Exemplo 34a; cristais semelhantes à espada foram observados após três dias.

Exemplo 40 - Preparação de Cristais Encapsulados

Os cristais conforme obtidos no Exemplo 34 eram carregados positivamente conforme determinado através de medição de potencial zeta empregando Malvern Instruments Zetasizer nano. Os cristais foram lavados e suspensos em um tampão contendo excipientes que conservaram a cristalização e que possuíam um pH que manteve os cristais carregados. Subsequentemente, um agente de encapsulamento apropriado foi adicionado à suspensão de cristal. Neste contexto, um agente de encapsulamento apropriado é uma substância (polimérica) com toxicidade baixa, capacidade de biodegradação e caráter contraiônico. Devido ao seu caráter contraiônico, a substância é atraída pelos cristais e permite revestimento. Com esta técnica, a dissolução dos cristais é preferivelmente prolongada nos meios que não contêm qualquer outro excipiente mantendo a cristalinidade.

Exemplo 41 - Preparação dos Cristais Encapsulados/Embutidos

Os cristais são obtidos conforme descrito no Exemplo 34. Os cristais são lavados e suspensos em um tampão contendo excipientes que conservam a cristalinidade. Os cristais podem então ser embutidos por secagem dos mesmos e combinação destes cristais secos com um veículo, por exemplo, por compressão, dispersão por fusão, etc.

- encapsulados/embutidos por combinação de suspensão de cristal com uma solução veículo que não é miscível com água. O veículo precipita após remoção do solvente do

veículo. Subsequentemente, o material é seco.

- encapsulados/embutidos por combinação de uma suspensão de cristal com uma solução veículo miscível em água. O veículo precipita conforme seu limite de solubilidade é excedido na mistura.

- embutidos por combinação dos cristais secos ou uma suspensão de cristal com

uma solução veículo miscível em água.

- embutidos por combinação dos cristais secos com uma solução veículo que não é miscível em água.

Exemplo 42 - Investigação do ABT-874 Precipitado a) Precipitação

Tampão de acetato foi preparado por dissolução de 1 mol de acetato de sódio em água e ajuste do pH para 5,5 com ácido acético (100%). A solução mestra foi diluída 1:10 com água para troca de tampão. A solução de PEG 4.000 foi preparada por dissolução de g de PEG 4.000 em 5 mL de 1 M acetato de sódio, pH do tampão 5,5 e água. Após dissolução, o volume foi ajustado para 50 mL com água. 5 mL dos 10 mg/mL de ABT874 (em

0,1 M tampão acetato de sódio, pH 5,5) (tampão original trocado por diafiltração) foram misturados com 5 mL de PEG 4.000 a 40% em 0,1 M tampão acetato de sódio, pH 5,5.

A batelada precipitada foi mantida a temperatura ambiente por toda noite sem agitação. Não houve formação de partículas birefringentes na grandeza de aproximadamente 1-10 /ym.

b) Lavagem do precipitado

2 mL da pasta de precipitados foram colocados em uma centrífuga e centrifugados a 500 x g por 20 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e as microesferas foram ressuspensas em 2 mL de PEG 4.000 a 40% em 0,1 M tampão acetato de sódio, pH de 5,5 (preparado de acordo com o procedimento acima). A concentração da proteína da suspensão final foi determinada por OD28Ü como sendo de 3,9 mg/mL.

G. Caracterização do Cristal

A seção que se segue resume os experimentos que foram realizados para determinar se o anticorpo monoclonal cristalino ABT-874 mantém a característica de bioatividade de ABT-874 nunca cristalizado mediante redissolução do material cristalino.

G1. Teste de Bioatividade por Determinação da Produção de IFN-v das Células NK

92 a)Método Geral

A atividade biológica dos cristais de ABT-874 dissolvidos foi medida por um ensaio à base de células que monitora a produção de IFN-γ das células de NK-92, em resposta à estimulação por IL-12. Antes da análise, as amostras foram diluídas primeiro para 30 /yg/rnL 5 no meio de cultivo de célula (meio σ-ΜΕΜ com FCS a 20% e 200 mM de L-glutamina). Subsequentemente as amostras foram adicionalmente diluídas em 11 etapas de 3 //g/mL a 0,1 ng/ml_. A solução de IL-12 foi diluída para 10 ng/mL no meio de cultura de célula e adicionada às amostras de ABT-874. As misturas foram então incubadas a 37°C e CO2 a 5% por 1 hora.

Uma suspensão de células NK-92 (2,0 x 106 células/mL) foi pipetada em uma mi

croplaca de 96 poços, as misturas ABT-874/IL-12 foram adicionadas às células e as microplacas foram então incubadas a 37°C e CO2 a 5% por cerca de 20 horas. Após incubação as microplacas foram centrifugadas a 1.000 rpm e 5°C por 10 minutos e 50 //L do sobrenadante de cada poço foram usados para medir a quantidade de IFN-γ produzido pelas células por um ELISA (ELISA Kit Human lnterferon-γ, Pierce, Cat. No. EHIFNG).

A solução de anticorpo anti-IFN-γ biotinilado foi pipetada na microplaca prérevestida de 96 poços e os sobrenadantes de cultura de célula foram adicionados (4 fileiras para cada uma de ambas as amostras). Após incubação da microplaca por 2 horas a temperatura ambiente, ela foi lavada. Após isto, a solução de Streptavidin-HRP foi adicionada e a 20 microplaca foi incubada por mais 30 minutos e então lavada. Após o substrato de TMB ter sido adicionado, a microplaca foi incubada a temperatura ambiente por cerca de 20 minutos no escuro e a reação foi então parada por adição da solução de parada.

Finalmente, a absorção foi medida dentro dos próximos 5 minutos em um leitor de microplaca a 450 nm (comprimento de onda de correção de 550 nm) e os resultados mos25 trados em gráfico versus a concentração de ABT-874. Os valores de IC50 foram então avaliados usando um ajuste de curva não linear de 4 parâmetros e a atividade biológica reativa da amostra foi calculada por divisão do valor de IC50 do padrão de referência pelo valor de IC50 da amostra e multiplicando por 100%.

b)Atividade Relativa Para Cristais de ABT-874

O teste foi realizado como uma comparação da atividade biológica da amostra para

aquela de um padrão de referência. As quantidades de IFN-γ produzidas pelas células foram medidas por um kit ELISA disponível comercialmente e foram reportadas como unidades de absorção em um cumprimento de onda de 450 nm. Estes valores, colocados em gráfico versus a concentração de ABT-874 e avaliados por uma regressão não linear de 4 parâmetros, 35 relevaram os valores de IC50 para a inibição do efeito de IL-12 por ABT-874. Uma vez que ambas as amostras foram operadas em quatro repetições em uma microplaca, isto resulta em quatro valores de IC50 para padrão de referência de ABT-874 e a amostra, respectivamente. Subsequentemente, a média dos valores de IC50 do padrão de referência foi calculada e a atividade relativa de cada repetição da amostra foi avaliada por divisão do valor IC50 médio do padrão de referência pelo valor de IC50 relevante da amostra e multiplicado por 100%.

O teste da amostra (suspensão do cristal 2,9 mg/mL) relevou uma atividade biológi

ca relativa de 98%. Assim, a amostra pode ser considerada como completa e biologicamente ativa.

G2. Caracterização Microscópica

Os dados de caracterização microscópica dos cristais de ABT-874 serão apresentados a seguir:

a)Análise óptica das amostras de batelada de cristal mAb

Após homogeneização, alíquotas de 1 a 10 μί. de volume de amostra foram pipetados em uma placa prendedora de objeto e foram cobertas com uma lâmina de revestimento de vidro. As preparações de cristal foram avaliadas usando microscópio de Iuz 15 invertida Zeiss Axiovert 25 equipado com oculares E-Pl 10x e objetivas de 10x, 20x e 40x, respectivamente. As fotos foram realizadas usando uma câmara digital (Sony Cybershot DSC S75).

b) Caracterização de Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM) de Cristais de ABT-874

De modo a formar a imagem dos cristais de proteína com um microscópio eletrôni

co, eles devem estar secos, ser eletricamente condutores e estáveis o suficiente para tolerar alto vácuo e a energia de um feixe de elétrons. Este protocoio separa os cristais de seu tampão por filtração, estabiliza os cristais por fixação química dos mesmos com um fixador à base de glutaraldeído, desidrata os mesmos através de uma série graduada de etanol, seca 25 os mesmos por método de ponto crítico e reveste o plasma dos mesmos com ouro para torná-los eletricamente condutores.

b1) Materiais

- 0,2 M Tampão fosfato de Sorensen (SPB) - 0,15 M fosfato dissódio, 0,05 M fosfato potássio monobásico, pH 7,3

- fixador de Karnovsky - glutaraldeído a 2,5 %, aldeído parafórmico a 1,5%, 0,1 M

SPB

- etanol a 50%, 75%, 95% e 100%

- amostra de cristal de ABT-874 em tampão de cristalização (do Exemplo 34, armazenada em tampão de lavagem do Exemplo 35)

- tampão de cristalização de ABT-874 (tampão de lavagem do Exemplo 35)

- montagem de filtro de aço inoxidável Millipore para anexação às membranas de filtro de 13 mm para seringas - membranas de filtro de policarbonato de 0,4 μπ\ (Nucleopore, Cat# 110407) b2) Equipamento

- Secador de Ponto Crítico (CPD) - Baltec Modelo CPD030, Asset

LC978501

- Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM) - microscópio eletrônico de

varredura de emissão de campo XL30 Phillips

- Borrifador de revestimento - Borrifador de revestimento Denton Desk II,

Asset LC827847

b3) Procedimento

As etapas 3-12 foram realizadas por lavagem de solução através da montagem do

filtro e mantendo a seringa na montagem de filtro por um tempo de espera predeterminado.

1. Carregue o prendedor do filtro da seringa com filtro de policarbonato;

2. Misture 0,1 mL da amostra de cristal com 0,4 mL do tampão de cristal na seringa de 1,0 mL;

3. Dispense da solução de cristal diluído através da montagem de filtro;

4. Dispense 1 mL do tampão de cristal e aguarde 2 minutos;

5. Dispense 1 mL de do tampão de fixação a 50%, tampão de cristal a 50% e aguarde 2 minutos;

6. Dispense 1 mL do fixador a 100% e aguarde 2 minutos;

7. Dispense 1 mL de SPB e aguarde 2 minutos;

8. Dispense 1 mL de SPB e aguarde 2 minutos, novamente;

9. Dispense 1 mL de etanol a 50% e aguarde 2 minutos;

10. Dispense 1 mL de etanol a 75% e aguarde 2 minutos;

11. Dispense 1 mL de etanol a 95% e aguarde 2 minutos;

12. Dispense 1 mL de etanol a 100% e aguarde 2 minutos, repita a etapa 3 vezes;

13. Transfira a membrana do filtro com os cristais anexados para CPD enchido com etanol a 100%;

14. Processe o filtro através do CPD como se segue:

a. cinco trocas de CO2 líquido a 10°C, misturando por 5 minutos por troca;

b. aqueça a 40°C, pressão de 8.000 kPa; e

c. vaze lentamente para a atmosfera por 20 minutos;

15. Monte a membrana do filtro no suporte do SEM;

16. Borrife o revestimento com ouro por 60 segundos;

17. Exame com o SEM.

c) Resultados

As figuras 1 a 5 anexas ilustram as fotos representativas dos cristais de ABT-874.

A figura 1 mostra uma micrografia em Iuz dos cristais de ABT-74 no tampão de cristalização (do Exemplo 34, armazenados no tampão de lavagem do Exemplo 35) obtidos de acordo com o Exemplo 34. O hábito do cristal é semelhante ao hábito dos cristais secos fixos mostrados nas figuras 2 a 5. Os cristais exibiram birrefringência.

As figuras 2 a 5 mostram SEMs em ampliações diferentes dos cristais de ABT-874 obtidas de acordo com o Exemplo 34.

G3. Birrefringência

Os cristais conforme gerados de todos os experimentos de batelada exibiram birrefringência.

G4. Capacidade de Uso em Seringa Uma suspensão do cristal de ABT-874 de 150 mg/mL de proteína incorporada aos

cristais e formulada em um tampão de lavagem do Exemplo 35 pode ser utilizada em seringa através de uma agulha de 27G.

H. Experimentos de Focalizacão Isoelétrica Capilar (clEF) com ABT-874

a) Equipamento

O analisador ÍCE280 (Convergent Bioscience) foi empregado para a análise. Siste

ma ID 1054 (IS número 2785).

b) Material

O capilar empregado apresentava 50 mm de comprimento, coluna ID de 100 μπ\, revestida (Convergent, Catálogo número 101700. Os Eletrólitos empregados foram - Anólito 20 (80 mM H3PO4) e Católito (100 mM NaOH). (Convergent, Catálogo número 101800). O anfóIito veículo é o Pharmalyte a 4% (8-10,5), (GE Healthcare, Catálogo número 17-0455-01. O aditivo era metil celulose (0,35%), (Convergent, Catálogo número 101876). Os marcadores pl internos eram mistura de marcadores pl da BioRad (8,4, 8,5, 10,1 e 10,4 - BioRad, Catálogo número 148-2100, Lote número 482-511).

Volume (μL) Marcador Pl 8,4 2,5 Marcador Pl 8,5 2,5 Marcador Pl 10,1 2,5 Marcador Pl 10,4 2,5 Agua 40 Total 50 c) Métodos

O tempo de focalização foi de 2 minutos a 1.500V e 20 minutos a 3.000V. Procedimento de preparação de amostra - cristais Mab, precipitado Mab e padrão de referência foram todos diluídos a cerca de 1 mg/mL em água Milli-Q. Procedimento de preparação de amostra (com uréia).

Volume (jjL) Agua Milli-Q 92 Metil celulose 1% 70 Veículo - Pharmalyte 8 Amostra (1 mg/mL) 30 Mistura de marcador Pl (Tabela 1) 16 Total 216 As amostras foram misturadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, conforme mostrado na tabela acima. A uréia foi então adicionada (20 mg) para fornecer uma concentração final de cerca de 1,6 M. Os tubos de centrífuga foram então vortexados, centrifugados por 10 minutos e então cuidadosamente transferidos aos frascos para análise, d) Resultados

As amostras que se seguem foram analisadas:

Tampão de cristal ABT-874 (tampão de lavagem do Exemplo 35)

Cristais de ABT-874 (obtidos de acordo com o Exemplo 33, no tampão de lavagem do Exemplo 35)

Padrão de Referência (Amostra líquida de ABT-874)

Os resultados são mostrados nas figuras 6A a C anexas.

Exemplo 43: Retenção da Estrutura Secundária Nativa Mediante Cristalizacão/Redissolucão de Cristais

Espectros de infravermelho foram registrados com um sistema Confocheck em um Tensor Bruker Optics 27 de acordo com as instruções do fabricante. Amostras líquidas foram analisadas usando uma célula MicroBioIytics AquaSpec. As medições das suspensões de proteína foram realizadas com uma célula Harrick BioATRIl™. Cada amostra foi avaliada por realização de pelo menos duas medições de 120 a 500 varreduras a 25°C. Espectros de tampão em bruto foram subtraídos dos espectros de proteína, respectivamente. Espectros do segundo derivado de proteína foram gerados por transformação Fourier e o vetor normalizado a partir de 1.580-1.720 cm"1 para comparação relativa.

A redissolução dos cristais foi realizada como se segue. As suspensões de cristal foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e a microesfera de cristal foi dissolvida em 0,1 M de tampão acetato de sódio, pH 5,5 a uma concentração de proteína de 10 mg/mL.

A figura 11 ilustra espectros do segundo derivado de FT-IV das suspensões de ABT-874 cristalinas que foram cristalizadas seguindo-se o processo conforme descrito no Exemplo 34b, lavadas seguindo-se o procedimento introduzido no Exemplo 35 e redissolvidas. Os espectros demonstram que nenhuma alteração significativa da estrutura secundária foi observada, tanto no estado sólido cristalino quanto após redissolução.

Exemplo 44: Dados de Estabilidade (Morfoloaia de SE HPLC. FT-IV)

ABT-874 foi cristalizado empregando o procedimento de cristalização descrito no Exemplo 34b. Os cristais foram lavados conforme descrito no Exemplo 35, com um tampão de dispersão contendo PEG 4.000 a 22% e 0,1 M acetato de sódio e o pH foi ajustado para 5,5 com ácido acético glacial. Subsequentemente, os cristais foram concentrados para 5 mg/mL e 50 mg/mL de proteína por centrifugação, respectivamente e armazenados a 2-8°C.

Os dados de estabilidade de 5 mg/mL e 50 mg/mL de ABT-874 cristalino em 3 me

ses de armazenamento a 2-8°C indicaram retenção acima de 90% do monômero. tel SE-HPLC

Tabela 2 - Dados de Estabilidade de 5 mg/mL de ABT-874 cristalino após redissolução

Ponto de Tempo Agregados (%) Monômero (%) Fragmentos (%) TO 3,9 95,8 0,3 1 mês 5,7 94,0 0,3 3 meses 8,7 91,0 0,3 10

Tabela 3 - Dados de Estabilidade de 50 mg/mL de ABT-874 cristalino após redisso

15

20

25

lução

Ponto de Tempo Agregados (%) Monômero (%) Fragmentos (%) TO 3,8 96,0 0,2 1 mês 4,6 95,0 0,4 3 meses 6,3 93,4 0,3 Um sistema HPLC Dionex (bomba P680, autoamostrador ASI 100, UVD170U) foi empregado para medir a estabilidade do anticorpo de ABT-874. Amostras de ABT-874 foram separadas em uma coluna GE Superdex® 200, aplicando uma taxa de fluxo de 0,75 mL/minuto. A detecção foi realizada em um comprimento de onda de 214 nm. O tampão de operação consistia em 0,2 M de sulfato dissódio em tampão de fosfato de sódio de 0,09 M, pH 7,0.

(b) FT-IV

Espectros de infravermelho foram registrados com um sistema Confocheck em um Tensor Bruker Optics 27. Amostras líquidas foram analisadas usando uma célula MicroBioIytics AquaSpec. As medições das suspensões de proteína foram realizadas com uma célula Harrick BioATRII™. Cada amostra foi avaliada por realização de pelo menos duas medições de 120 a 500 varreduras a 25°C. Espectros de tampão em bruto foram subtraídos dos espectros de proteína, respectivamente. Espectros do segundo derivado de proteína foram gerados por transformação Fourier e o vetor normalizado a partir de 1.580-1.720 cm'1 para comparação relativa.

A redissolução dos cristais foi realizada como se segue. As suspensões de cristal foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e a microesfera de cristal foi dissolvida em

0,1 M de tampão acetato de sódio, pH 5,5 a uma concentração de proteína de 10 mg/mL. A figura 2 ilustra espectros do segundo derivado de FT-IV das suspensões de ABT874 cristalinas (amostras de estabilidade em prateleira de 50 mg/mL, preparadas conforme descrito acima e armazenadas por 3 meses a 25°C) e após redissolução de tais cristais prétratados. Os espectros demonstram que nenhuma alteração significativa da estrutura secundária foi observada quando do armazenamento a 25°C por três meses, tanto no estado sólido cristalino quanto após redissolução.

(c) Morfoloaia

Após 3 meses de armazenamento a 2-8°C, nenhuma alteração morfológica significativa foi observada na análise microscópica em Iuz dos cristais. Alíquotas de 1 a 10 μΥ. do volume da amostra foram pipetadas em uma placa prendedora do objeto, diluídas com tampão de formulação (PEG a 22%) e cobertas com uma lâmina de revestimento de vidro. As preparações foram avaliadas usando microscópio de Iuz invertida Zeiss Axiovert 25 equipado com oculares E-Pl 10x e objetivas de 10x, 20x e 40x, respectivamente.

Exemplo 45 - Extensão do Rendimento do Processo de Cristalização O ponto final de um processo de cristalização pode ser definido como o ponto de tempo quando medições OD2eo das alíquotas do sobrenadante da pasta de cristalização são constantes, por exemplo, por três dias subsequentes. Uma extensão do rendimento é possível por acréscimo de uma determinada quantidade adicional de PEG 4.000 (solução 50% peso/volume de cerca de 0,1 M tampão acetato de sódio em um pH de cerca de 5,5) ao sobrenadante da pasta de cristalização. Os cristais que são semelhantes à primeira colheita se formam durante os dias que se seguem. Com a aplicação deste procedimento, o rendimento total se eleva facilmente além de 90%, sem a introdução de precipitação.

Por exemplo, a concentração de PEG 4.000 é elevada de cerca de 11% peso/volume para cerca de 22% peso/volume, cerca de 20% peso/volume, cerca de 18% peso/volume, cerca de 16% peso/volume ou cerca de 14% peso/volume, nas alíquotas do sobrenadante do Exemplo 34b. Após armazenamento por vários dias a temperatura ambiente (por exemplo, entre cerca de 20 e cerca de 25°C), espécies precipitadas são observadas em determinadas concentrações de PEG 4.000, por exemplo, cerca de 22% peso/volume, cerca de 20% peso/volume ou cerca de 18% peso/volume de PEG 4.000. Os cristais sem precipitação concomitante são encontrados em concentrações de PEG 4.000 inferiores, por exemplo, cerca de 16% peso/volume e cerca de 14% peso/volume de PEG 4.000. Por adição de PEG 4.000 a uma concentração total de, por exemplo, cerca de 14% peso/volume ao sobrenadante residual da pasta de cristalização, o rendimento total do cristal é elevado de 60% a cerca de 70% e a 90% em alguns dias.

Exemplo 46: Extensão do Rendimento Aplicando-se um Processo Contínuo Neste exemplo, precipitante adicional e/ou proteína são “titulados” em uma batelada de cristalização (contendo opcionalmente uma determinada quantidade de agente de cristalização) em uma taxa predeterminada. A cristalização contínua com o tempo é induzida, resultando finalmente em rendimento de cristal de 90%.

Exemplo 47 - Semeadura de Bateladas de Cristalização de ABT-874

A nucleação espontânea é por natureza estatística. As sementes, que podem consistir da mesma proteína (semeadura homogênea) ou outra substância (semeadura heterogênea) em relação a que está sendo cristalizada, fornecem um gabarito no qual moléculas adicionais podem ser montadas. Assim, a semeadura pode desta forma acelerar a cristalização.

Uma batelada de cristalização de ABT-874 foi preparada conforme descrito no E10 xemplo 34b. Após mistura da solução de proteína com o tampão de cristalização, a mistura foi semeada por semeadura homogênea com cristais de ABT-874. Por exemplo, uma alíquota de uma suspensão de crista! preparada conforme descrito no Exemplo 34b, exibindo cerca de 50 a 60% de rendimento de cristal foi adicionada, por exemplo, em uma taxa de 1/20 (volume/volume) á batelada de cristalização. Aplicando-se esta estratégia, os rendimentos 15 de cristal e os períodos de duração do processo totais foram adicionalmente otimizados na direção de rendimentos maiores em períodos de tempo de processo mais curtos.

Em resumo, uma mistura de cristalização de ABT-874 (5 mg/mL de proteína e PEG 4.000 a 11% em 0,1 M tampão acetato, pH 5,5) foi preparada e dividida em duas alíquotas de 40 mL. A primeira batelada foi armazenada a temperatura ambiente sem procedimentos adicionais e a segunda batelada foi semeada por adição de 2 mL de uma mistura de cristalização da mesma composição que já exibia 65% de rendimento de cristal (6,5 mg de sementes, calculado com base na proteína cristalizada, em comparação com 200 mg de ABT-874 na batelada). Os gráficos mostrados na figura 13 ilustram que se aplicando esta abordagem de semeadura, o rendimento total foi estendido em cerca de 15% em 80 dias, considerandose que a progressão da curva paralela sugeria que os tempos de processo para alcançar o rendimento máximo não foram significativamente reduzidos. A figura 13 sugere que embora a batelada não semeada alcançasse uma máxima de rendimento após cerca de 80 dias, o rendimento teoricamente possível pode ser tão alto quanto para a batelada semeada, significando que a semeadura reduziu a duração do processo de cristalização ao invés de estender o rendimento.

Incorporação como Referência

O conteúdo de as todas referências citadas (incluindo referências de literatura, patentes, pedidos de patente e web sites) através de todo este pedido é incorporado ao presente documento expressamente como referência em sua totalidade e constitui as referên35 cias citadas. A prática da presente invenção empregará, a menos que de outra forma indicado, técnicas convencionais de cristalização e formulação que são bem conhecidas na técnica. Equivalentes

A invenção pode ser concretizada em outras formas específicas, sem com isto fugir de seu espírito ou características essenciais. As modalidades precedentes, portanto devem ser consideradas em todos pontos como não limitando a invenção descrita no presente do5 cumento. O escopo da invenção é assim indicado pelas reivindicações apensas e não pela descrição precedente e todas as alterações que se encontram dentro do significado e faixa de equivalência das reivindicações são, portanto, abrangidas pelo presente documento.

Claims (44)

1. Método de cristalização em batelada para cristalização de um anticorpo IL-12 anti-humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) provisão de uma solução aquosa do anticorpo em mistura com pelo menos um polialquileno glicol como agente de cristalização; e (b) incubação da mistura de cristalização aquosa até os cristais do anticorpo serem formados.

2. Método de cristalização, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH da mistura de cristalização aquosa está na faixa de cerca de pH 4 a cerca de 6,5.

3. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de cristalização aquosa compreende um tampão.

4. Método de cristalização, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o tampão compreende um tampão de acetato.

5. Método de cristalização, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o tampão compreende acetato de sódio.

6. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração do tampão na mistura de cristalização aquosa é de até cerca de 0,5 M.

7. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o polialquileno glicol apresenta um peso molecular médio na faixa de cerca de 400 a cerca de 10.000.

8. Método de cristalização, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polialquileno glicol é polietileno glicol.

9. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de polialquileno glicol na mistura de cristalização está na faixa de cerca de 5 a 30% (peso/volume).

10. Método de cristalização, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o polialquileno glicol é polietileno glicol.

11. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das condições de cristalização adicional é satisfeita: a) a incubação é realizada entre cerca de 1 hora a cerca de 250 dias; b) a incubação é realizada a uma temperatura entre cerca de 4°C e cerca de 37°C; c) a concentração do anticorpo está na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 280 mg/mL.

12. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de compreende, adicionalmente, a etapa de secagem dos cristais.

13. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, adicionalmente, a etapa de troca do licor principal de cristalização por um licor principal artificial.

14. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume da batelada está na faixa de cerca de 1 mL a cerca de 20.000 litros.

15. Cristal, CARACTERIZADO pelo fato de que é de um anticorpo IL-12 antihumano.

16. Cristal de anticorpo IL-12 anti-humano, CARACTERIZADO pelo fato de que é obtido por um método de cristalização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

17. Cristal, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o cristal possui uma morfologia semelhante à espada.

18. Cristal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.

19. Cristal, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo em um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo não glicosilado, um anticorpo humano e um anticorpo de camundongo.

20. Cristal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de IgG.

21. Cristal, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo em um anticorpo de IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4.

22. Cristal, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IL-12 anti-humano do grupo IgGI.

23. Cristal, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o cristal é preparado de um anticorpo humano isolado que se dissocia do IL-12 humano com uma Kd de 1 x10'10 M ou menos e uma constante de taxa koff de 1 x 10"3 ou menos, ambas determinadas por ressonância de plasmônio de superfície.

24. Cristal, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o cristal é preparado de um anticorpo humano isolado com uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO:2 e uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo a sequencia de aminoácido da SEQ ID ΝΟ:1.

25. Cristal, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que é preparado do anticorpo ABT-874.

26. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) cristais de um anticorpo IL-12 anti-humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, e (b) pelo menos um excipiente farmacêutico; onde a composição é provida como um sólido, um semissólido ou uma formulação líquida, cada formulação contendo o anticorpo na forma cristalina.

27. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) cristais de um anticorpo IL-12 anti-humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, e (b) pelo menos um excipiente farmacêutico, que embute ou encapsula os cristais.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição possui uma concentração de anticorpo superior a cerca de 1 mg/mL.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição possui uma concentração de anticorpo superior a cerca de .200 mg/mL.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 26 e 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelo menos um veículo selecionado do grupo consistindo em um veículo biodegradável polimérico, um veículo não biodegradável polimérico, um veículo oleoso e um veículo lipídico.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o veículo polimérico é um polímero selecionado de um ou mais grupos consistindo em: poli (ácido acrílico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anidridos), poli (depsipeptídeo), poli (ésteres), poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) ou PLGA, poli (β-hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etileno glicol), poli (hidroxipropil) metacrilamida, poli (organo) fosfazeno, poli (orto ésteres), poli (álcool vinílico), poli (vinilpirrolidona), copolímeros éter vinílico alquil anidrido maléico, polióis plurônicos, albumina, alginato, celulose e derivados de celulose, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurônico, oligossacarídeos, glicaminoglicanos, polissacarídeos sulfatados, combinações e copolímeros das mesmas.

32. Composição líquida injetável, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende cristais de anticorpo IL-12 anti-humano de acordo com as reivindicações .15 a 25 e apresenta uma concentração de anticorpo na faixa de cerca de 10 a cerca de 400 mg/mL.

33. Composição de pasta de cristal, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende cristais de anticorpo de IL-12 anti-humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, apresentando uma concentração de anticorpo superior a cerca de 100 mg/mL.

34. Método para tratamento de um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de cristais de anticorpo IL-12 anti-humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25.

35. Método para tratamento de um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 33.

36. Método, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada por uma via parenteral, via oral ou por injeção.

37. Método para tratamento de um transtorno relacionado ao IL-12 em um indivíduo, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz e cristais de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno relacionado ao IL-12 é selecionado do grupo consistindo em artrite reumatóide, osteoartrite, artrite juvenil crônica, artrite de Lyme, artrite psoriática, artrite reativa, espondiloartropatia, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença do intestino inflamado, diabetes melito insulinodependente, tireoidite, asma, doenças alérgicas, psoríase, escleroderma dermatite, dermatite atópica, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição ao transplante de órgão, doença imune aguda ou crônica associada ao transplante de órgão, sarcoidose, aterosclerose, coagulação intravascular disseminada, doença de Kawasaki, doença de Grave, síndrome nefrótica, síndrome de fadiga crônica, granulomatose de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculite microscópica dos rins, hepatite ativa crônica, uveíte, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de septicemia, caquexia, doenças infecciosas, doenças parasitárias, síndrome da imunodeficiência adquirida, mielite transversa aguda, coréia de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, acidente vascular, cirrose biliar primária, anemia hemolítica, malignidades, falência cardíaca, infarto do miocárdio, doença de Addison, deficiência poliglandular do tipo I e deficiência poliglandular do tipo Il esporádica, síndrome de Schmidt, síndrome de angústia respiratória do adulto (aguda), alopecia, alopecias em áreas, artropatia soronegativa, artropatia, doença de Reiter, artropatia psoriática, artropatia colítica ulcerativa, sinovite enteropática, artropatia associada à clamídia, yersinia e salmonela, espondiloatropatia, doença ateromatosa/arteriosclerose, alergia atópica, doença autoimune bolhosa, pênfigo comum, pênfigo foliáceo, penfigóide, doença de IgA linear, anemia hemolítica autoimune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalite miálgica/doença Royal Free, candidíase mucocutânea crônica, arterite de célula gigante, hepatite esclerosante primária, hepatite criptogênica autoimune, AIDS, doenças relacionadas à imunodeficiência adquirida, hepatite C, imunodeficiência comum variada (hipogamaglobulinemia variável comum), cardiomiopatia dilatada, infertilidade feminina, falência ovariana, falência ovariana prematura, doença fibrótica pulmonar, alveolite fibrosante criptogênica, doença pulmonar intersticial pós-inflamatória, pneumonite intersticial, doença pulmonar intersticial associada à doença do tecido conjuntivo, doença pulmonar associada à doença do tecido conjuntivo misto, doença pulmonar intersticial associada à doença esclerose sistêmica, doença pulmonar intersticial associada à artrite reumatóide, doença pulmonar associada ao lúpus eritematoso sistêmico, doença pulmonar associada à dermatomiosite/polimiosite, doença pulmonar associada à doença de Sjodgren, doença pulmonar associada à espondilite ancilosante, doença pulmonar difusa vasculítica, doença pulmonar associada à hemosiderose, doença pulmonar intersticial induzida por medicamento, fibrose por radiação, bronquioIite obliterante, pneumonia eosinófila, doença pulmonar infiltrativa linfocítica, doença pulmonar intersticial pós-infecciosa, artrite gotosa, hepatite autoimune, hepatite autoimune do tipo 1 (hepatite autoimune clássica ou lupóide), hepatite autoimune do tipo 2 (hepatite de anticorpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoimune, resistência à insulina tipo B com acanthose nigricans, hipoparatiroidismo, doença imune aguda associada ao transplante de órgão, doença imune crônica associada ao transplante de órgão, osteoartrose, colangite esclerosante primária, Ieucopenia idiopática, neutropenia autoimune, doença renal NOS, glomerulonefrite, vasculite microscópica dos rins, doença de Lyme, lúpus eritematoso discóide, infertilidade masculina idiopática ou NOS, autoimunidade do esperma, esclerose múltipla (todos subtipos), diabete melito insulinodependente, oftalmia simpática, hipertensão pulmonar secundária em doença de tecido conjuntivo, síndrome de Goodpasture, manifestação pulmonar de poliarterite nodosa, febre reumática aguda, espondilite reumatóide, doença de Still, esclerose sistêmica, doença de Takayasu/arterite, trombocitopenia autoimune, trombocitopenia idiopática, doença da autoimune da tireóide, hipertiroidismo, hipotireoidismo autoimune bocioso (doença de Hashimoto), hipotireoidismo autoimune atrófico, mixoedema primário, uveíte facogênica, vasculite primária e vitiligo. Os anticorpos humanos e porções de anticorpos da invenção podem ser usados para tratar doenças autoimunes, especificamente aquelas associadas à inflamação, incluindo, espondilite reumatóide, alergia, diabetes autoimune, uveíte autoimune.

39. Uso de cristais de anticorpo IL-12 anti-humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença relacionada ao IL-12 de acordo com a reivindicação 37.

40. Cristais de anticorpo IL-12 anti-humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que são para uso na medicina.

41. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, adicionalmente, a etapa de extensão do rendimento dos cristais por adição de polialquileno glicol.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o polialquileno glicol é polietileno glicol.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o polialquileno glicol é adicionado continuamente.

44. Método de cristalização, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, adicionalmente, a etapa de semeadura da reação com ABT-874.