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BRPI0806715A2 - fab peguilado para abeta - Google Patents

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BRPI0806715A2
BRPI0806715A2 BRPI0806715-5A BRPI0806715A BRPI0806715A2 BR PI0806715 A2 BRPI0806715 A2 BR PI0806715A2 BR PI0806715 A BRPI0806715 A BR PI0806715A BR PI0806715 A2 BRPI0806715 A2 BR PI0806715A2
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BR
Brazil
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molecule
antibody
seq
antibody fragment
variable region
Prior art date
Application number
BRPI0806715-5A
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English (en)
Inventor
Kelly Renne Bales
Thomas Frank Bumol
Chi-Kin Chow
Ronald Bradley Demattos
Ryan John Hansen
Uma Kuchibhotla
Jirong Lu
Peter Colon Mcdonnell
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39332186&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0806715(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
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Abstract

FAB PEGUILADO PARA ABETA. A presente invenção refere-se a um método para tratar condições associadas à atividade do peptídeo A<225> profilática e terapeuticamente é descrito, O método emprega fragmentos de anticorpo humanizados que especificamente se ligam ao peptídeo A<225> humano entre as posições de aminoácido 13-28, em que os fragmentos de anticorpo são covalentemente ligados a uma molécula de polietileno glicol (PEG).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FAB PEGUI- LADO PARA ABETA".
A presente invenção refere-se a um fragmento de anticorpo que se liga ao peptídeo beta amilóide (Αβ) e é covalentemente ligado a uma ou mais moléculas de polietileno glicol (PEG).
O peptídeo Αβ em forma circulante é composto de 39-43 amino- ácidos (principalmente 40 ou 42 aminoácidos) resultantes da clivagem de uma proteína precursora, proteína precursora do amilóide (APP). Conversão de Αβ de formas solúveis para insolúveis com conteúdo de folha β alto e sua deposição como placas neuríticas e cerebrovasculares no cérebro parece estar associado às várias condições e doenças, incluindo doença de Alzhei- mer, síndrome de Down, e angiopatia amilóide cerebral (CAA). Prevenção e/ou reversão da deposição de Αβ pode tratar condições associadas com o peptídeo Αβ.
Agentes terapêuticos que afetam a deposição de Αβ incluem an- ticorpos para peptídeo Αβ, tais como os anticorpos humanizados e fragmen- tos debatidos em WO 2001/62801, WO 2004/071408 e Tamura, Y., et al, NeurobioL of Dis. (2005) 20:541-545.
Embora muitos anticorpos e seus derivados possam ser úteis na 1 - 20 diagnose e terapia, a farmacocinética ideal de anticorpos freqüentemente não é alcançada para uma aplicação particular. Anticorpos terapêuticos vi- sados no combate de várias condições e doenças associadas ao peptídeo Αβ são em geral imunoglobulinas com regiões Fc intactas. Regiões Fc são responsáveis para prolongar a meia-vida do anticorpo no plasma. Porém, esta prolongação pode ser uma desvantagem visto que impede o anticorpo que está ligado ao peptídeo alvo de ser eficazmente limpado, resultando no complexo de antígeno-anticorpo estando presente na circulação de plasma por quantidades estendidas de tempo. Administração subsequente do anti- corpo leva à acumulação também do complexo indesejado no plasma. A porção Fc de um anticorpo pode ter certas funções efetoras indesejadas e pode necessitar ser modificada para eliminar tais funções. Também, a por- ção Fc adiciona tamanho substancial à terapêutica geral que freqüentemente cria problemas associados à rota de liberação, dispositivos de liberação, e processos de fabricação em escala.
Fragmentos de anticorpo sem uma porção Fc1 incluindo Fabs, foram estudados in vivo para determinar se tais fragmentos poderiam ser terapêuticas potenciais. Porém, estudos sugerem que a utilidade das terapi- as que envolvem fragmentos tais como Fabs é limitada devido a uma taxa de liberação rápida e uma meia-vida curta. Portanto, há uma necessidade por uma molécula de anticorpo de peptídeo anti-Αβ terapêutica ativa com farmacocinética e farmacodinâmica que permitem um regime de doseamen- to melhorado ao mesmo tempo evitando os efeitos colaterais potenciais que podem ser criados através da formação de complexo no plasma e funções efetoras potenciais.
A presente invenção supera vários problemas associados aos anticorpos terapêuticos ou fragmentos de anticorpo que podem ser alvejados para peptídeo Αβ. Os compostos da presente invenção abrangem um frag- mento de anticorpo que se liga a Αβ e é covalentemente ligado a uma ou mais moléculas de polietileno glicol (PEG). Estes compostos podem ser pro- duzidos em sistemas de células bacterianas ou de levedura, que elimina vá- rios problemas associados à produção de anticorpos em linhagens celulares mamíferas tais como problemas de custo, problemas de purificação, e pro- blemas de contaminação de antígeno endogenamente produzido. Além dis- so, os compostos da presente invenção podem ser administrados subcuta- neamente e têm um perfil ideal de farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD) ao mesmo tempo preservando a afinidade e seletividade do fragmento de anticorpo para Αβ.
Totalmente imprevisível e inesperadamente, os requerentes também descobriram que covalentemente ligando moléculas de PEG à regi- ão de determinação de complementaridade (CDR) do fragmento de anticor- po não alterou a atividade, afinidade ou seletividade do fragmento de anti- corpo para Αβ.
Esta invenção fornece uma molécula compreendendo um frag- mento de anticorpo que especificamente se liga ao peptídeo Αβ humano en- * tre as posições de aminoácido 13-28, em que o fragmento de anticorpo é covalentemente ligado a uma molécula de PEG. Preferivelmente1 o fragmen- to de anticorpo é um fragmento Fab.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula com- preendendo um fragmento de anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende regiões de CDR com as seqüências de aminoácido a seguir: CDRL1: SSSQSLIYSDGNAYLH (SEQ ID NO: 6), CDRL2: KVSN- RFS (SEQ ID NO: 7) e CDRL3: TQSTHSPWT (SEQ ID NO: 8) e em que a região variável de cadeia pesada compreende regiões de CDR com as se- qüências de aminoácido a seguir: CDRH1: GYTFSRYSMS (SEQ ID NO: 9), CDRH2: QINIRGCNTYYPDTVKG (SEQ ID NO: 10) ou QINIRGNNTYYPDT VKG (SEQ ID NO: 11), e CDRH3: GDF (SEQ ID NO: 12). Preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada ou à região variável de cadeia pesada ou à região variável de cadeia leve do fragmento de anticorpo. Mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada a uma CDR. Até mesmo mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada a um resíduo de cisteína dentro da CDR. O mais pre- ferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalente- mente ligada a uma CDRH2: QINIRGÇNTYYPDTVKG (SEQ ID NO: 10) da região variável de cadeia pesada do fragmento de anticorpo.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula com- preendendo um fragmento de anticorpo que tem uma região variável de ca- deia leve da SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada ou à região variável de cadeia pesada ou à região variável de cadeia leve do fragmento de anticorpo. Mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada a uma CDR de uma região variável de cadeia pesada do fragmento de anti- corpo. Até mesmo mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada a um resíduo de cisteína dentro da CDR de uma região variável de cadeia pesada do fragmento de anticorpo. O mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada à cisteína na posição de aminoácido 56 da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula com- preendendo um fragmento Fab ou um fragmento ScFv1 em que o fragmento Fab ou fragmento ScFv é covalentemente ligado a uma molécula de PEG e tem uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1, e uma região vari- ável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada à cisteína na posi- ção de aminoácido 56 da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2. Também preferivelmente, em uma tal molécula o peso molecular do PEG é cerca de 0,5 kD a cerca de 30 kD, mais preferivelmente 20 kD.
Em outra modalidade a invenção fornece uma molécula com- preendendo um fragmento de anticorpo com uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2, em que o dito fragmento de anticorpo é covalentemente ligado a uma molécula de PEG de 20 kD na posição 56 da região variável de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, em uma tal molécula a molécula de PEG é covalentemente ligada por meio de uma ligação de maleimida.
Em outra modalidade a invenção fornece uma molécula com- preendendo um fragmento de anticorpo que especificamente se liga ao pep- tídeo Αβ humano entre as posições de aminoácido 13-28, em que o frag- mento de anticorpo é covalentemente ligado a uma molécula de PEG e tem uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada à região de dobradiça do fragmento de anticorpo. Mais preferivelmente, a PEG é covalentemente ligado à região de dobradiça por meio de uma ligação de maleimida.
A invenção também inclui uma molécula compreendendo frag- mentos de anticorpo, preferivelmente fragmentos de anticorpo humanizado em que uma molécula de PEG é covalentemente ligada ao fragmento de anticorpo que resulta em uma molécula terapêutica ativa com farmacocinéti- ca e farmacodinâmica que permitem regime de doseamento semanal, ao mesmo tempo minimizando os efeitos colaterais potenciais que podem ser criados através de formação de complexo no plasma e preservando ou me- Ihorando a atividade, afinidade e seletividade do fragmento de anticorpo para Αβ.
A invenção também inclui métodos de tratar, prevenir, ou rever- ter condições e doenças associadas ao peptídeo Αβ, incluindo doença de Alzheimer pré-clínica e clínica, síndrome de Down, e angiopatia amilóide ce- rebral pré-clínica e clínica (CAA), déficit cognitivo, acidente vascular cere- bral, hemorragia cerebral, e debilitação mental geral. Estes métodos com- preendem administrar a um sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula descrita e reivindicada aqui.
Esta invenção fornece uma molécula compreendendo um frag- mento de anticorpo que especificamente se liga ao peptídeo Αβ entre as po- sições de aminoácido 13-28, em que o fragmento de anticorpo é covalente- mente ligado a uma molécula de PEG. Descobriu-se que ligando covalente- mente uma molécula de PEG a um fragmento de anticorpo que liga Αβ não altera negativamente a atividade, afinidade ou seletividade do fragmento de anticorpo para Αβ. Mais surpreendentemente, descobriu-se que ligando co- valentemente uma molécula de PEG tendo um peso molecular até 20 kD a uma CDR de um fragmento de anticorpo que liga Αβ também não altera ne- gativamente a atividade, afinidade ou seletividade do fragmento de anticorpo para peptídeo Αβ. Estes fragmentos de anticorpo podem ser administrados subcutaneamente e têm um perfil de PK/PD melhorado para uso terapêutico que suporta um regime de doseamento flexível. Além disso, estes fragmen- tos de anticorpo podem ser produzidos em sistemas de células bacterianas ou célula de levedura que eliminam vários problemas associados à produção de anticorpo de cumprimento total em células mamíferas. Os fragmentos de anticorpo peguilado desta invenção oferecem a oportunidade para impedir e tratar, profilática e terapeuticamente, condições em humanos associadas ao peptídeo Αβ. Um anticorpo de cumprimento total como existe naturalmente é uma molécula de imunoglobulina compreendida de quatro cadeias de peptí- deo, duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50-70 kDa quando comprimento total) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 kDa quando comprimento total) interconectadas através de ligações de dissulfeto. A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100-110 ou mais ami- noácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante prima- riamente responsável pela função efetora.
Cadeias leves são classificadas como capa ou Iambda e carac- terizam-se por uma região constante particular. Cada cadeia leve é compre- endida de uma região variável de cadeia leve N-terminal (aqui "LCVR") e uma região constante de cadeia leve compreendida de um domínio, CL. Ca- deias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e define o isótipo do anticorpo como IgG1 IgM, IgA, IgD, e IgE1 respectivamen- te e vários destes podem ser também divididos em subclasses (isótipos), por exemplo, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e IgA2. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante particular. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada N-terminal (aqui "HCVR") e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios (CH1, CH2, e CH3) para IgG, IgD, e IgA; e 4 domínios (CH1, CH2, CH3, e CH4) para IgM e IgE.
As regiões de HCVR e LCVR podem ser também subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade ("CDRs"), entremeadas com as regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura ("FRs"). Cada HCVR e LC- VR é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do término amino ao término carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Aqui as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como "CDRH1, CD- RH2, e CDRH3" e as 3 CDRs da cadeia leve são referidas como "CDRL1, CDRL2 e CDRL3". As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno. A numeração e posicionamento dos resíduos de aminoácido de CDR dentro das regiões HCVR e LCVR são de acordo com a convenção de numeração de Kabat bem conhecida.
A região variável de cada par de cadeia leve-pesada forma um sítio de ligação de antígeno do anticorpo. Como aqui usado, a "porção de ligação de antígeno" ou "região de ligação de antígeno" ou "domínio de liga- ção de antígeno" ou "sítio de ligação de antígeno" referem-se alternadamen- te àquela porção de uma molécula de anticorpo que contém os resíduos de aminoácido que interagem com um antígeno e conferem no anticorpo sua especificidade e afinidade pelo antígeno. Esta porção de anticorpo inclui os resíduos de aminoácido de "estrutura" necessárias para manter a conforma- ção apropriada dos resíduos de ligação de antígeno. Preferivelmente1 as regiões de estrutura dos anticorpos da invenção são de origem humana ou substancialmente de origem humana (pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de origem humana) e segue a numeração de Kabat. Alternativamente, a região de ligação de antígeno pode ser derivada de se- qüência humana.
Como aqui usado, o termo "fragmento de anticorpo" refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a habilidade para especi- ficamente ligar a um antígeno (por exemplo, Αβ). Exemplos de moléculas abrangidas dentro do termo "fragmento de anticorpo" de um anticorpo inclu- em (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos do- mínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação em ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo, e (v) um fragmento dAb (Ward, e outros, (1989) Nature 341:544-546) que consiste em um domínio VH. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinan- tes, por um Iigador sintético que os permite serem feitos como uma cadeia de proteína simples na qual as regiões VL e VH paream-se para formar mo- léculas monovalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird e outros (1988) Science 242:423-426: e Huston e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples são também intencionados ser abrangidos dentro do termo "frag- mento de anticorpo". Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos, são também abrangidas pelo termo "fragmento de anticor- po". Diacorpos são proteínas Iigadoras bivalentes, biespecíficas em que os domínios VH e VL são expressados em uma cadeia de polipeptídeo simples, mas usando um Iigador que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, assim forçando os domínios parearem-se com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de liga- ção de antígeno (vide por exemplo, Holliger, P., e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., e outros (1994) Structure 2:1121-1123).
Ainda também, um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo pode fazer parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não-covalente do anticorpo ou fragmento de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de núcleo de estreptavi- dina para fazer uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., e ou- tros (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resí- duo de cisteína, um peptídeo marcador e um marcador de poli-histidina C- terminal para fazer as moléculas de scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriya- nov, S. M., e outros (1994) Mol. Immunoi. 31:1047-1058). Fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparados de anticorpos inteiros usando técnicas convencionais, tais como digestão com papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, anticorpos, fragmentos de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinante padrões, como são bem co- nhecidas na técnica. Anticorpos, fragmentos de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ou podem não ser glicosiladas e ainda enquadrar-se nos limites da invenção. Preferivelmente, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab. O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo que é parcial ou completamente composto de seqüências de aminoácido derivadas de uma linhagem germinal de anticorpo humana ou uma seqüência rearran- jada e feita alterando a seqüência de um anticorpo que tem as CRDs não- humanas. As regiões de estrutura das regiões variáveis podem ser substituí- das por regiões de estrutura humana correspondentes. As regiões de estru- tura humana incluem regiões de estrutura genômica, como também aquelas contendo uma ou mais substituições de aminoácido. Em particular, tais subs- tituições incluem mutações em que um aminoácido em uma posição particu- lar na estrutura humana é substituído com o aminoácido da posição corres- pondente da estrutura natural para a CDR não-humana. Por exemplo, um anticorpo humanizado tendo CDRs de camundongo pode conter uma ou mais substituições que substituem um aminoácido de estrutura humana par- ticular com o aminoácido de estrutura de camundongo correspondente. Re- ferências também descrevendo os métodos envolvidos na humanização de um anticorpo de camundongo que podem ser usados são, por exemplo, Queen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869, 1991; Pat. U. S. 5.693.761; Pat. U. S. 4.816.397; Pat. U. S. 5.225.539; programas de compu- tação ABMOD e ENCAD como descritos em Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595- 620, 1983; humanização pode ser essencialmente executada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones e outros, Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann e outros, Nature, 332:323-327, 1988; Verhoeyen e outros, Science, 239:1534-1536, 1988). Preferivelmente, um anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo humanizado. Mais preferivelmente, um anticor- po da invenção é um fragmento Fab de anticorpo humanizado.
A presente invenção também inclui fragmentos de anticorpo que são covalentemente ligados a uma ou mais moléculas de PEG. É intencio- nado que os termos "polietileno glicol" e "PEG" sejam usados alternadamen- te e refiram-se a polietileno glicol ou um derivado do mesmo como conheci- do na técnica (vide, por exemplo, Patentes U. S.: 5.445.090; 5.900.461; 5.932.462; 6.436.386; 6.448.369; 6.437.025; 6.448.369; 6.495.659; 6.515.100 e 6.514.491). Preferivelmente, PEG é covalentemente ligado a um ou mais resíduos de lisina ou cisteína do fragmento de anticorpo. Mais prefe- rivelmente, PEG é covalentemente ligado a um ou mais resíduos de lisina ou cisteína na região variável de cadeia pesada do fragmento de anticorpo. Até mesmo mais preferivelmente, PEG é covalentemente ligado a um ou mais resíduos de lisina ou cisteína dentro da CDR do fragmento de anticorpo. O mais preferivelmente, PEG é ligado a um resíduo de cisteína na posição de aminoácido 56 da região variável de cadeia pesada da dita SEQ ID NO: 2. Alternativamente, as moléculas de PEG podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo por meio de um ligador ou molécula espaçadora à região de do- bradiça do fragmento de anticorpo. Adição de ligadores e moléculas espaça- doras às regiões de dobradiça é bem conhecida na técnica. Além disso, um PEG pode ser covalentemente ligado a aminoácidos não-naturais modifica- dos do fragmento de anticorpo por técnicas bem conhecidas na técnica.
Em sua forma típica, "PEG" é um polímero linear com grupos hidroxila terminais e tem a fórmula HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH onde η é de cerca de 8 a cerca de 4000. O hidrogênio terminal pode ser substituído com um grupo protetor tal como um grupo alquila ou alcanol (M- PEG). Preferivelmente, PEG tem pelo menos um grupo hidróxi, mais preferi- velmente é um grupo hidróxi terminal. É este grupo hidróxi que é preferivel- mente ativado para reagir com o peptídeo. Uma variedade de modificações químicas é usada para preparar um derivado de PEG ativo com um grupo funcional, tal como carbonato ativo, éster ativo, aldeído, tresilato, ou usando PEG-propionaldeído adequado para acoplar a uma molécula alvo dado. O derivado de PEG ativado é depois covalentemente ligado a um grupo reativo no fármaco de polipeptídeo. Há muitas formas de PEG úteis para a presente invenção. Numerosos derivados de PEG existem na técnica e são adequa- dos para o uso na invenção. A molécula de PEG covalentemente ligada a um fragmento de anticorpo da presente invenção não é intencionada ser li- mitada a um tipo ou tamanho particulares. O peso molecular do PEG é pre- ferivelmente de cerca de 0,5 quilodáltons (kD) a cerca de 100 kD e mais pre- ferivelmente de cerca de 5 kD a cerca de 30 kD e o mais preferivelmente de cerca de 1 kD a cerca de 20 kD. PEG pode ser linear ou ramificado e o fragmento de anticorpo de peptídeo anti-Αβ da invenção pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 moléculas de PEG ligadas ao peptídeo. É muito preferível que haja um fragmento de anticorpo de molécula de PEG; porém, quando mais de uma molécula de PEG por molécula de peptídeo estiver presente, prefere-se que haja não mais que seis. Contempla-se também que ambas as extremidades da molécula de PEG podem ser adaptadas para reticular duas ou mais mo- léculas de fragmento de anticorpo de peptídeo anti-Αβ junto. Métodos de ligar moléculas de PEG a proteínas, anticorpos e fragmentos dos mesmos, são bem conhecidos na técnica.
O termo "Kd", como aqui usado, é intencionado referir-se à constante de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular. É calculada pela fórmula:
Kd = koff/kon (medida em M)
O termo "kon" como aqui usado é intencionado referir-se à cons- tante de taxa de associação, ou taxa de reação específica, da reação direta, ou formadora de complexo, medida em unidades: M"1sec"1. O termo "k0ff", como aqui usado, é intencionado referir-se à constante de taxa de dissocia- ção, ou taxa de reação específica, para dissociação de um anticorpo do complexo de anticorpo/antígeno, medida em unidades: sec"1.
O termo "especificamente liga" como aqui usado refere-se à si- tuação em que um membro de um par de ligação específico não liga signifi- cativamente às moléculas diferentes de seu(s) par(es) de ligação específi- co(s). O termo é também aplicável onde, por exemplo, um domínio de liga- ção de antígeno de um anticorpo da invenção é específico para um epitopo particular que é carregado por vários antígenos em cujo caso o anticorpo específico que carrega o domínio de ligação de antígeno poderá ligar aos vários antígenos que carregam o epitopo. Consequentemente, uma molécula da invenção especificamente liga-se ao peptídeo Αβ enquanto especifica- mente não se liga à APP. Além disso, uma molécula da invenção especifi- camente liga-se entre um epitopo Αβ linear, não-linear ou conformacional compreendendo os aminoácidos HHQKLVFFAEDVGSNK (13-28) (SEQ ID NO: 4). O termo "atividade" em referência a uma molécula da presente invenção inclui, mas não é limitado a, afinidade e especificidade de epito- po/antígeno, habilidade para neutralizar ou antagonizar uma atividade de peptídeo Αβ in vivo ou in vitro, IC5o, estabilidade in vivo do anticorpo e as propriedades imunogênicas do anticorpo. Outras propriedades ou caracterís- ticas biológicas identificáveis de um anticorpo reconhecidas na técnica inclu- em, por exemplo, reatividade cruzada, (isto é, com homólogos não-humanos do peptídeo alvejado, ou com outras proteínas ou tecidos, em geral), e habi- lidade para preservar níveis de expressão altos da proteína nas células ma- míferas. As propriedades ou características acima mencionadas podem ser observadas, medidas ou avaliadas usando as técnicas reconhecidas na téc- nica incluindo, mas não limitadas a, ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plasmon de superfície Biacore ou KinExA, ensaios de neu- tralização in vitro ou in vivo sem limite, ligação de receptor, produção e/ou secreção de citocina ou de fator de crescimento, transdução de sinal e imu- noistoquímica com seções de tecido de fontes diferentes incluindo humana, primata, ou qualquer outra fonte.
Os termos "indivíduo", "sujeito", e "paciente", usados alternada- mente aqui, referem-se a um mamífero, preferivelmente humano. Em uma certa modalidade, o sujeito é também caracterizado com uma doença ou distúrbio ou condição que se beneficiaria de uma atividade diminuída do peptídeo Αβ.
Como aqui usado, as expressões "célula hospedeira", "linhagem de célula hospedeira", e "cultura de célula hospedeira" são usadas alterna- damente e incluem uma célula individual ou cultura de células que é um re- cipiente de qualquer polinucleotídeo isolado da invenção ou qualquer ve- tores) recombinante(s) compreendendo uma seqüência que codifica uma HCVR, LCVR ou anticorpo monoclonal da invenção. Células hospedeiras incluem progênie de uma célula hospedeira simples. A progênie pode não ser completamente idêntica, em morfologia ou em complemento de DNA to- tal, à célula-pai original devido à mutação e/ou alteração natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transformadas, transdu- zidas ou infetadas com um vetor recombinante ou um polinucleotídeo que expressa um fragmento de anticorpo da invenção ou uma cadeia leve ou cadeia pesada do mesmo. Uma célula hospedeira compreendendo um vetor recombinante da invenção, um estavelmente incorporado no cromossomo hospedeiro ou não, pode também ser referida como uma "célula hospedeira recombinante". Células preferidas para gerar células hospedeiras da inven- ção são células CHO (por exemplo, ATCC CRL-9096), células NSO, células SP2/0, células COS (ATCC, por exemplo, CRL-1650, CRL-1651) e HeLa (ATCC CCL-2). Células hospedeiras adicionais para o uso na invenção in- cluem células de planta, células de levedura, outras células mamíferas e cé- lulas procarióticas. Mais preferivelmente, as células para o uso na invenção são células de levedura ou procarióticas.
O termo "condição ou doença relacionada ao peptídeo Αβ" ou "condições associada à doença com atividade de Αβ" é significado incluir todas as condições, distúrbios e doenças que são associados a: 1) o desen- volvimento de placas β-amilóides no cérebro, 2) a síntese de formas anor- mais de Αβ, 3) a formação de formas particularmente tóxicas de Αβ, ou 4) taxas anormais de síntese, degradação, ou liberação de Αβ. Condições e doenças tais como doença de Alzheimer, síndrome de Down, angiopatia amilóide cerebral, certas demências vasculares, e prejuízo cognitivo mode- rado são conhecidas ou suspeitadas de ter uma tal relação a Αβ.
Esta invenção fornece uma molécula compreendendo um frag- mento de anticorpo que especificamente liga-se ao peptídeo Αβ entre as po- sições de aminoácido 13-28, em que o fragmento de anticorpo é covalente- mente ligado a uma molécula de PEG. O fragmento de anticorpo é preferi- velmente um fragmento de anticorpo humanizado, tal como fragmento Fab e/ou fragmento scFv. O mais preferivelmente o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab. Ligação específica das moléculas da invenção ao peptídeo Αβ permite usar as ditas moléculas como uma terapêutica para doenças e distúrbios associados ao peptídeo Αβ, isto é, condições, doenças ou distúr- bios que se beneficiam da inibição de uma atividade biológica do peptídeo Αβ. Em uma modalidade da invenção, o fragmento de anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve compreende regiões de CDR com as seqüências de aminoácido a seguir: CDRL1: SSSQSLIYSDGNAYLH (SEQ ID NO: 6), CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 7) e CDRL3: TQS- THSPWT (SEQ ID NO: 8) e/ou em que a região variável de cadeia pesada compreende regiões de CDR com as seqüências de aminoácido a seguir: CDRH1: GYTFSRYSMS (SEQ ID NO: 9), CDRH2: QINIRGÇNTYYPDTVKG (SEQ ID NO: 10) ou QlNIRGNNTYYPDTVKG (SEQ ID NO: 11), e CDRH3: GDF (SEQ ID NO: 12). Preferivelmente, as seis CDRs de um fragmento de anticorpo da invenção existem junto. A composição compreendendo uma CDR da invenção em geral será uma seqüência de cadeia pesada ou leve de anticorpo ou uma porção substancial da mesma em que a CDR está loca- lizado em uma localização consistente com a numeração de Kabat. As três regiões de CDR para cada cadeia, pesada e luz, são fornecidas em uma região de estrutura como uma seqüência contígua representada pela fórmula a seguir: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. A cadeia pesada ou ca- deia leve FR1, FR2, FR3 e FR4 se combinam para formar a região de estru- tura completa de um fragmento de anticorpo quando disposta como uma seqüência contígua com as CDRs na ordem declarada. Preferivelmente, as regiões de estrutura de um anticorpo da invenção são de origem humana ou substancialmente de origem humana (isto é, mais que cerca de 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97%).
Preferivelmente, o fragmento de anticorpo da invenção compre- ende uma LCVR compreendendo um peptídeo da seqüência a seguir:
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCSSSQSLIYSDGNAYLHWYLQ KPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCT QSTHSPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 1)
e uma HCVR compreendendo um peptídeo com uma seqüência selecionada do grupo que consiste nas seqüências a seguir:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSRYSMSWVRQAP GKGLEWVGQINIRGCNTYYPDTVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTA VYYCTTGDFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSRYSMSWVRQAP GKGLEWVGQINIRGNNTYYPDTVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTA VYYCTTGDFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3)
Alternativamente, o fragmento de anticorpo compreende um LCVR compreendendo um peptídeo com uma seqüência que consiste na SEQ ID NO: 1 e uma HCVR compreendendo um peptídeo com uma seqüên- cia selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, em que a HCVR e LCVR existem junto em um fragmento de anticorpo. O artesão versado apreciará que os fragmentos de anticorpo da invenção não são limitados às seqüências específicas de HCVR e LCVR1 mas também incluem variantes destas seqüências que, quando presentes em uma molé- cula da invenção, retêm ou melhoram sob habilidade de ligação do antígeno e pelo menos uma outra propriedade funcional do anticorpo-pai, por exem- pio, especificidade do epitopo, habilidade para competir com o anticorpo-pai para ligar ao peptídeo Αβ, valores de IC50 e/ou K0 ou koff para ligar ao peptí- deo Αβ.
Em outra modalidade da invenção, toda ou uma porção da regi- ão variável é limitada por uma seqüência de LCVR particular como mostrada por uma SEQ ID NO: 1 e HCVR como mostrada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 e é também caracterizado por antagonizar ou neutralizar pelo me- nos uma atividade do peptídeo Αβ in vivo ou in vitro. Um anticorpo da inven- ção, em que toda ou uma porção da região variável é limitada por uma se- qüência particular como mostrada por uma LCVR SEQ ID NO: 1 e HCVR SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 é aqui também caracterizado por especifi- camente ligar ao peptídeo Αβ humano mas não ligando à APP humana.
Em um aspecto da presente invenção, PEG (ou um derivado do mesmo) é covalentemente ligado a um ou mais resíduos de lisina, cisteína ou de aminoácidos modificados não-naturais de um fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a molécula de PEG é covalentemente ligada ou à região variável de cadeia pesada ou à região variável de cadeia leve do fragmento de anticorpo. Mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada a uma CDR de uma região variável de cadeia pesada do fragmento de anticorpo. O mais preferivelmente, uma tal molécula tem uma molécula de PEG que é covalentemente ligada à cisteína na posição de aminoácido 56 da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2. Alternativamente, as moléculas de PEG podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo Fab de peptídeo anti-Αβ por meio de um Iigador ou molécula espaçadora à região de dobradiça do fragmento de anticorpo.
Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de PEG é covalentemente ligada a um ou mais resíduos de lisina, cisteína ou de a- minoácidos modificados não-naturais engenheirados do anticorpo da presen- te invenção para substituir uma glicosilação presente nas moléculas de anti- corpo sem significativamente afetar a afinidade e a seletividade do fragmen- to de anticorpo para Αβ. Preferivelmente, a molécula de PEG substitui o sinal de glicosilação na região variável de cadeia pesada ou na região variável de cadeia leve do fragmento de anticorpo. Mais preferivelmente, a molécula de PEG substitui o sinal de glicosilação na CDR de uma região variável de ca- deia pesada do fragmento de anticorpo. O mais preferivelmente, a molécula de PEG substitui o sinal de glicosilação na posição 56 da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.
A molécula de PEG covalentemente ligado a um anticorpo na presente invenção não é intencionada a ser limitada a um tipo ou tamanho particulares. O peso molecular de PEG é preferivelmente de cerca de 0,5 kD a cerca de 100 kD, e mais preferivelmente de cerca de 0,5 kD a cerca de 30 kD, e o mais preferivelmente de cerca de 1 kD a cerca de 20 kD. Alternati- vãmente o peso molecular do PEG pode ser selecionado de um grupo que consiste em cerca de 0,5 kD, cerca de 1 kD, cerca de 5 kD, cerca de 10 kD e cerca de 20 kD. PEG pode ser linear ou ramificado e o anticorpo de peptídeo anti-Αβ PEGuiIados da invenção pode ter mais que uma molécula de PEG ligada ao peptídeo. Preferivelmente, há uma molécula de PEG por anticorpo de peptídeo anti-Αβ PEGuilados.
O mais preferivelmente, a molécula de anticorpo desta invenção compreende um fragmento de anticorpo com uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2, em que o dito fragmento de anticorpo é covalentemente ligado a uma molécula de PEG de 20 kD na posição 56 da região variável de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 2.
O epitopo de peptídeo Αβ antigênico, entre os quais os anticor- pos da invenção se ligam, é um epitopo linear, não-linear ou conformacional compreendendo aminoácidos HHQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 4). An- ticorpos que se ligam ao dito epitopo, específica e preferencialmente se li- gam ao peptídeo Αβ quando comparado a sua APP ligante. Os anticorpos monoclonais da invenção se ligam ao peptídeo Αβ pelo menos 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 vezes mais (por exemplo, maior afinidade ou maior especificidade) que se ligariam à APP humana; mais preferivelmen- te pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ou 600 vezes mais que se ligariam à APP1 até mesmo mais preferivelmente não se ligam à APP em níveis maiores que os níveis de base como determinado, por exem- plo, pelo ensaio de ELISA, ensaio de ELISA de competição ou valores de K0 em um ensaio Biacore ou KinExA.
Os fragmentos de anticorpo da invenção se ligam a um epitopo entre os aminoácidos HQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5) pelo menos 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 vezes mais (por exemplo, maior afinidade ou maior especificidade) que um epitopo não compreendendo os aminoácidos HQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5). Mais preferivelmente, pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ou 600 vezes mais que com um epitopo não compreendendo os aminoácidos HQKLVFFA- EDVGSNK (SEQ ID NO: 5), até mesmo mais preferivelmente não se liga a um epitopo não compreendendo os aminoácidos HQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5) em níveis maiores que os níveis de base como determinado, por exemplo, pelo ensaio de ELISA, ensaio de ELISA de competição ou va- lores de Kd em um ensaio Biacore ou KinExA.
Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um fragmen- to de anticorpo que possui uma afinidade de ligação forte para o peptídeo Αβ, isto é, liga-se ao peptídeo Αβ, ou uma porção do mesmo, compreenden- do a seqüência HQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5) [isto é, anticorpo contata o polipeptídeo de HQKLVFFAEDVGSNK], com uma afinidade de ligação (K0) para peptídeo Αβ humano de menos que cerca de 200 pM, 100 pM, 50 pM, 40 pM ou 30 pM, preferivelmente menos que cerca de 20 pM quando medido pelo método de KinExA. Alternativamente, a afinidade de ligação (K0) para o peptídeo Αβ humano é entre 0,1 pM - 200 pM. Afinidades de anticorpo podem ser determinadas como descrito nos exemplos aqui a- baixo e outros métodos disponíveis na técnica.
A rota de administração de um anticorpo da presente invenção pode ser oral, parenteral, através de inalação, ou tópica. Preferivelmente, os anticorpos da invenção podem ser incorporados em uma composição farma- cêutica adequada para administração parenteral. O termo parenteral como aqui usado inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, re- tal, vaginal, ou intraperitoneal. Liberação sistêmica periférica por injeção in- travenosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida. Mais preferivelmen- te, a rota de administração de um anticorpo da presente invenção é por meio de injeção subcutânea. Veículos adequados para tais injeções são óbvios na técnica.
O fragmento de anticorpo da presente invenção tem uma meia- vida mais curta que o anticorpo de cumprimento total de peptídeo anti-Αβ correspondente no plasma e é limpado mais rapidamente do plasma que o anticorpo de cumprimento total de peptídeo anti-Αβ correspondente. Alterna- tivamente, o anticorpo da presente invenção tem uma meia-vida plasmática mais longa que o fragmento Fab de peptídeo anti-Αβ correspondente, que não está covalentemente ligado a uma molécula de PEG, e é limpado menos rapidamente do plasma que o fragmento Fab de peptídeo anti-Αβ corres- pondente que não está covalente ligado a uma molécula de PEG (Exemplos 1, 2 e 3). O termo "correspondente" em referência a um anticorpo como aqui usado refere-se a um anticorpo com as mesmas LCVR e HCVR. Por exem- pio, o anticorpo de cumprimento total correspondente em referência a um fragmento Fab de anticorpo tendo uma LCVR da SEQ ID NO: 1 e uma HC- VR que consiste na SEQ ID NO: 2 teria a mesma LCVR da SEQ ID NO: 1 e uma HCVR que consiste na SEQ ID NO: 2 junto com um domínio de Fc in- tacto.
Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a polinu- cleotídeos recombinantes que codificam anticorpos que, quando expressos, compreendem a LCVR da SEQ ID NO: 1 e uma HCVR que consiste na SEQ ID NO: 2. Devido à degeneração de códon, outras seqüências de polinucleo- tídeo podem ser facilmente substituídas por aquelas seqüências. Polinucleo- tídeos particularmente preferidos da presente invenção codificam anticorpos que quando expressos, compreendem as CDRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 6-8, e CDRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9, 10 ou 11, e 12, ou quaisquer das regiões variáveis da SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3. Exemplos de seqüências de polinucleotídeo que codificam para LCVR da SEQ ID NO: 1 e HCVR da SEQ ID NO: 2 são representados na SEQ ID NO: 13 (LCVR) e SEQ ID NO: 14 (HCVR), respectivamente.
Os polinucleotídeos tipicamente também incluirão uma seqüên- cia de polinucleotídeo de controle de expressão operavelmente ligada às seqüências humanizadas de codificação de imunoglobulina, incluindo regi- ões de promotor naturalmente associado ou heterólogo. Preferivelmente, as seqüências de controle de expressão serão sistemas de promotor eucarióti- co em vetores capazes de transformar ou transfeccionar células eucarióti- cas, mas seqüências de controle para células procarióticas podem também ser usados. Uma vez o vetor foi incorporado na linhagem de célula hospe- deira apropriada, a célula hospedeira é propagada sob condições adequa- das para expressar as seqüências de nucleotídeo, e, como desejado, a cole- tânea e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesada ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina podem seguir.
As seqüências de ácido nucléico da presente invenção capazes de por fim expressar os anticorpos desejados ou fragmentos de anticorpo podem ser formadas de uma variedade de polinucleotídeos diferentes (oli- gonucleotídeos genômicos ou cDNA, RNA, sintéticos, etc.) e componentes (por exemplo, regiões V, J, D, e C), usando qualquer de uma variedade de técnicas bem conhecidas. Unir as seqüências genômicas e sintéticas apro- priadas é um método comum de produção, mas seqüências de cDNA podem também ser utilizadas.
Seqüências de DNA de região constante humana podem ser isoladas, de acordo com os procedimentos bem conhecidos, de uma varie- dade de células humanas, mas preferivelmente de células B imortalizadas. Células fontes adequadas para as seqüências de polinucleotídeo e células hospedeiras para expressão e secreção da imunoglobulina podem ser obti- das de várias fontes bem conhecidas na técnica.
Além dos anticorpos humanizados ou fragmentos de anticorpo especificamente descritos aqui, outros anticorpos "substancialmente homó- logos" modificados podem ser facilmente projetados e produzidos utilizando várias técnicas de DNA recombinante bem conhecidas àqueles versados na técnica. Por exemplo, as regiões de estrutura podem variar das seqüências nativas no nível de estrutura primária por várias substituições de aminoácido, adições e deleções terminais e intermediárias, e similares. Além disso, uma variedade de regiões de estrutura humanas diferentes pode ser usada isola- damente ou em combinação como uma base para os anticorpos humaniza- dos da presente invenção. Em geral, as modificações dos genes podem ser facilmente realizadas por uma variedade de técnicas bem conhecidas, tais como mutagênese dirigida.
Como previamente declarado, os polinucleotídeos serão ex- pressados nos hospedeiros após as seqüências terem sido operavelmente ligadas (isto é, posicionadas para assegurar o funcionamento de) uma se- quência de controle de expressão. Estes vetores de expressão são tipica- mente replicáveis nas células hospedeiras ou como epissomas ou como uma parte integrante do DNA cromossômico hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraci- clina ou neomicina, para permitir detecção daquelas células hospedeiras transformadas com as seqüências de DNA desejadas. Vetores de expressão para estas células podem incluir seqüências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um intensificador, e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribossoma, sítios de splice de RNA, sítios de poliadenilação, e seqüências terminadoras transcricionais. Seqüências de controle de expressão preferi- das são promotores derivados dos genes de imunoglobulina, SV40, Adeno- vírus, Vírus de Papiloma Bovino, citomegalovírus e similares.
Os vetores que contêm as seqüências de polinucleotídeo de in- teresse (por exemplo, as seqüências de codificação de cadeia pesada e leve e as seqüências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, variando dependendo do tipo de célula. Uma variedade de hospedeiros pode ser empregada para ex- pressar os anticorpos da presente invenção usando as técnicas bem conhe- cidas na técnica. Linhagens celulares preferidas incluem COS, CHO, SP2/0, NSO (disponíveis de repositórios públicos tais como ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA) e linhagens celulares de levedura. Prefe- rivelmente, uma célula hospedeira da invenção compreende um ou mais ve- tores ou construtos compreendendo uma molécula de ácido nucléico da pre- sente invenção. A célula hospedeira da invenção é uma célula à qual um vetor da invenção foi introduzido, o dito vetor compreendendo um polinucleo- tídeo que codifica uma LCVR da invenção e/ou um polinucleotídeo que codi- fica uma HCVR da invenção. A invenção também fornece uma célula hospe- deira à qual dois vetores da invenção foram introduzidos; um compreenden- do um polinucleotídeo que codifica uma LCVR de um anticorpo da invenção e um compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma HCVR presente em um anticorpo da invenção e cada operavelmente ligado a uma seqüência de promotor. Os tipos de célula incluem células mamíferas, bacterianas, ve- getais e de levedura. Preferivelmente, a célula é uma célula CHO, uma célu- la COS, uma célula SP2/0, uma célula NSO, uma célula de levedura ou um derivado ou progênie de qualquer tipo de célula preferido.
Uma vez expressos, os anticorpos intactos, seus dímeros, ca- deias leves e pesadas individuais, ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrões da técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio, permuta de íons, afinidade, fase reversa, cromatografia de coluna de interação hidrofóbi- ca, eletroforese em gel e similares. Imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90%, 92%, 94% ou 96% de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99% ou mais homogeneidade sendo mais preferido, para usos farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou para homogenei- dade conforme desejado, os peptídeos podem ser depois usados terapêutica ou profilaticamente, como direcionado aqui.
Vários sintomas que resultam em déficits cognitivos, acidente vascular cerebral, hemorragia cerebral, e debilitação mental geral parecem estar associados às placas neuríticas e cerebrovasculares no cérebro con- tendo o peptídeo Αβ. Entre estas condições estão doença de Alzheimer pré- clínica e clínica, síndrome de Down, e angiopatia amilóide cerebral pré- clínica e clínica (CAA). As placas amilóides são formadas de peptídeo Αβ. Estes peptídeos circulam no sangue e no fluido cérebro-espinhal (CSF), tipi- camente em forma complexada com as lipoproteínas. O peptídeo Αβ em forma circulante é composto de 39-43 aminoácidos (principalmente 40 ou 42 aminoácidos) sendo o resultado da clivagem de uma proteína precursora comum, proteína precursora do amilóide, freqüentemente designada APP. Algumas formas de AP solúvel são por si só neurotóxicas e podem determi- nar a severidade da neurodegeneração e/ou declínio cognitivo (McLean, C. A., e outros, Ann. Neturoi (1999) 46:860-866; Lambert, M. P., e outros (1998) 95:6448-6453; Naslund, J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571).
Portanto, uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula da invenção pode ser útil para o tratamento ou prevenção de con- dições em que a presença de peptídeo Αβ causa ou contribui para os efeitos patológicos indesejáveis ou diminuição da atividade de peptídeo Αβ tem um benefício terapêutico em mamíferos, preferivelmente humanos, incluindo, mas não limitados a, doença de Alzheimer clínica ou pré-clínica, síndrome de Down, angiopatia amilóide clínica ou pré-clínica (CAA), Alzheimer pro- drômica, prejuízo cognitivo moderado (MCI) e déficits cognitivos, acidente vascular cerebral, hemorragia cerebral, e debilitação mental geral parecem estar associados às placas neuríticas e cerebrovasculares no cérebro con- tendo o peptídeo Αβ. O uso de uma molécula da presente invenção para tra- tar ou prevenir pelo menos um dos distúrbios acima mencionados em que a atividade do peptídeo Αβ é prejudicial ou que se beneficia com níveis diminu- ídos do peptídeo Αβ bioativo é contemplado aqui. Adicionalmente, o uso de uma molécula da presente invenção para uso na fabricação de um medica- mento para o tratamento de pelo menos um dos distúrbios acima menciona- dos é contemplado.
Como aqui usado, os termos "tratamento", "tratando", e simila- res, referem-se a obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à progressão da doença. "Tratamento", como aqui usado, inclui administração de um composto, particularmente a um humano, e inclui: (a) inibir a doença, isto é, deter seu desenvolvimento; ou (b) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença ou distúrbio ou aliviar os sintomas ou complicações do mesmo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados pa- ra fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêuti- ca ou profiláctica). Por exemplo, um bolo simples pode ser administrado, vá- rias doses divididas podem ser administradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica.
Uma molécula da invenção pode ser incorporada nas composi- ções farmacêuticas adequadas para administração a um sujeito. As molécu- las da invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com um veículo, diluente, e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, em do- ses únicas ou múltiplas. As composições farmacêuticas para administração são projetadas para ser apropriadas para o modo selecionado de adminis- tração, e diluente, veículo, e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, conservantes, agen- tes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes e outros são usados quando apropriado (Vide, por exemplo, Exemplo 14 aqui). As ditas composições são projetadas de acordo com as técnicas convencionais como, por exemplo, em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton1 PA 1995, que for- nece um compêndio de técnicas de formulação como são em geral conheci- das aos praticantes.
Uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula da presente invenção pode ser administrada a um sujeito em risco ou apre- sentando patologias como descritas aqui usando técnicas de administração padrões incluindo administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutâ- nea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou supositório. Preferivelmente, uma molécula da presente invenção pode ser administrada a um sujeito em risco ou apresentando as patologias como descritas aqui por administração subcutânea.
Uma composição farmacêutica da invenção preferivelmente é uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilatica- mente eficaz" de uma molécula da invenção. Uma "quantidade terapeutica- mente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico dese- jado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade da molécula para suscita uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial da molécula, é excedido em valor pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente efi- caz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profiláctico desejado. Tipica- mente, uma vez que uma dose profiláctica é usada em sujeitos antes ou em um estágio mais prematuro da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
Uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz é pelo menos a dose mínima, mas menos que uma dose tóxica, de um agente ativo que é necessário para dar benefício terapêutico a um sujeito. Declarado de outro modo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula da invenção é uma quantidade que, em mamíferos, preferivelmente humanos, diminui a atividade do peptídeo Αβ, por exemplo, ligando ao peptídeo Αβ, em que a presença do peptídeo Αβ causa ou contribui para os efeitos patológi- cos indesejáveis ou diminuição no peptídeo Αβ resulta em um efeito terapêu- tico benéfico em um mamífero, preferivelmente um humano.
A rota de administração de uma molécula da presente invenção pode ser oral, parenteral, através de inalação, ou tópica. Preferivelmente, os anticorpos da invenção podem ser incorporados em uma composição farma- cêutica adequada para administração parenteral. O termo parenteral como aqui usado inclui administração intravenosa intramuscular, subcutânea retal, vaginal, ou intraperitoneal. Liberação sistêmica periférica por injeção intrave- nosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida. Injeção subcutânea é a mais preferida. Veículos adequados para tais injeções são óbvios na técnica.
A composição farmacêutica tipicamente deve ser estéril e está- vel sob as condições de fabricação e armazenamento no recipiente forneci- do, incluindo por exemplo, um frasco vedado ou seringa. Portanto, as com- posições farmacêuticas podem ser filtradas estéreis após fazer a formula- ção, ou do contrário feitas microbiologicamente aceitáveis. Uma composição típica para infusão intravenosa poderia ter um volume de até 250-1000 ml de fluido, tal como a solução de Ringer estéril, solução salina fisiológica, solu- ção de dextrose e solução de Hank e uma dose terapeuticamente eficaz, (por exemplo, 1 a 100 mg/ml, ou mais) do agente terapêutico para liberar as dosagens típicas listadas abaixo. A dose pode variar, dependendo do tipo e severidade da doença. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer sujeito depende de muitos fatores, incluindo o ta- manho do paciente, área de superfície do corpo, idade, o composto particu- lar a ser administrado, sexo, tempo e rota de administração, saúde geral, e outros fármacos que são administrados simultaneamente. Uma dose típica pode ser, por exemplo, na faixa de 0,001 a 1000 μg; porém, doses abaixo ou acima desta faixa exemplar são visadas, especialmente considerando os fatores acima mencionados. O regime de dosagem diariamente parenteral pode ser cerca de 0,1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg do peso do corpo total, preferivelmente de cerca de 0,3 μg/kg a cerca de 10 mg/kg e mais preferi- velmente de cerca de 1 pg/kg a 1 mg/kg, até mesmo mais preferivelmente de cerca de 0,5 a 10 mg/kg do peso do corpo por dia. Progresso pode ser moni- torado por avaliação periódica. Para administrações repetidas durante vários dias ou muito mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é repetido até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. Porém, outros regimes de dosagem podem ser úteis e não são excluídos. A dosagem de- sejada pode ser liberada por uma administração única de bolo, por adminis- trações múltiplas de bolo, ou por administração de infusão contínua da mo- lécula, dependendo do padrão de decadência farmacocinética que o médico quer alcançar.
Estes quantidades sugeridas das moléculas da invenção estão sujeitas a muita discrição terapêutica. O fator chave em selecionar uma dose e programação apropriados é o resultado obtido. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero parti- cular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do anticorpo, o tipo particular de anticorpo, o método de administração, a programação de administração, e outros fatores conhecidos aos médicos.
Os agentes terapêuticos da invenção podem ser gelados ou Iio- filizados para armazenamento e podem ser reconstituídos em um veículo estéril adequado antes do uso. Liofilização e reconstituição podem levar a graus variados de perda de atividade do anticorpo. Dosagens podem ter que ser ajustadas para compensar.
Os exemplos a seguir são intencionados a ilustrar mas não Iimi- tar a invenção. Os exemplos aqui abaixo empregam, entre outros, um anti- corpo monoclonal murino designado "266" (m266) que foi preparado origi- nalmente através de imunização com um peptídeo composto dos resíduos 13-28 de peptídeo Αβ humano e um fragmento Fab do anticorpo monoclonal murino designado 266 (m266-Fab). O anticorpo é confirmado para imunorre- agir com este peptídeo. A preparação de m266 foi previamente descrita. Pa- ra covalentemente ligar uma molécula de PEG a m266-Fab, o Fab pode ser mutado para introduzir um resíduo de cisteína em CDR2 (N56C) da variável de cadeia pesada e PEGuilados de uma maneira mostrada abaixo (Exemplo 4). Como os exemplos aqui descrevem experimentos conduzidos em siste- mas murinos, o uso de anticorpos monoclonais murinos é satisfatório. Po- rém, nos métodos de tratamento da invenção intencionados para o uso hu- mano, formas humanizadas dos anticorpos da presente invenção, ou frag- mentos dos mesmos, são preferidas. O 1 Al-Fab referido nos exemplos a- baixo é um fragmento Fab de anticorpo humanizado compreendendo LCVR da SEQ ID NO: 1 e HCVR da SEQ ID NO: 2.
EXEMPLO 1
ESTUDOS DE PK/PD SUBCUTÂNEOS DE PEG DE m266-FAB EM CA- MUNDONGOS PDAPP
Camundongos PDAPP transgênicos jovens (3 meses de idade) são usados para investigar a resposta da farmacocinética/farmacodinâmica plasmática de anticorpo e complexo de anticorpo-Αβ. Vários anticorpos são investigados incluindo 266 Fab de camundongo (m266-Fab), PEG de m266- Fab+5KD, PEG de m266-Fab+10KD, PEG de m266-Fab+20KD, e anticorpo de IgG de m266 de comprimento total intacto. Camundongos PDAPP+/- são injetados subcutaneamente com 1 mg/kg de anticorpo e o plasma é subse- qüentemente isolado nos pontos de tempo a seguir: 1, 4, 8, 24, 48, 96, 168, e 240 horas pós-dose. Os animais recebendo o anticorpo de m266-Fab são analisados com pontos de tempo prematuros adicionais devido ao rápido gira desta metade. Os pontos de tempo para o m266-Fab são como segue: 1, 4, 8, 12, 16, 24, e 48 horas pós-dose. Um total de cinco animais é anali- sado por anticorpo por ponto de tempo. Sangue total é obtido por meio de furo cardíaco com agulhas de calibre 23 conectadas a às seringas 1CC que tinham sido previamente enxaguadas com 0,5 M de EDTA. As amostras de sangue são incubadas em gelo durante o procedimento de isolamento e subseqüentemente centrifugadas a 14.000 RPM em uma microcentrífuga refrigerada em 4 graus durante 15 minutos. As amostras de plasma resultan- tes são aliquotadas e armazenadas a -80 graus.
A. Metodologia para análises de PK de Fab Concentrações de Fab plasmática são determinadas usando uma captura de antígeno ELISA. Brevemente, as placas são revestidas com conjugado de Λβ-BSA durante a noite a 4°C ou 1 hora a 37°C depois blo- queados com tampão de caseína Pierce. Padrões, amostras de controle, e amostras de estudo são adicionados às placas seguido por uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Um HRP de anticamundongo de cabra é usado para detecção e uma resposta colorimétrica é desenvolvida com substrato de OPD. As placas são lidas a uma absorbância de A493 com uma referência de A700. Concentrações de imunorreatividade das amostras de plasma são determinadas das curvas padrões preparadas de quantida- des conhecidas de m266 Fab em plasma de camundongo usando um algo- ritmo de 4/5 parâmetros. A faixa de ensaio para o m266 Fab tem 0,05 a 0,5 pg/ml. A faixa para os Fabs PEGuiIados é 0,075 a 0,8 pg/ml.
As concentrações de imunorreatividade das amostras de plasma são determinadas das curvas padrões preparadas de quantidades conheci- das de m266 Fab em plasma de camundongo usando um algoritmo de 4/5 parâmetros. A faixa de ensaio para o 266 Fab é 0,05 a 0,5 pg/ml. A faixa para os Fabs PEGuiIados é 0,075 a 0,8 pg/mL. Resultados demonstram cla- ramente que adição de uma molécula de PEG e aumentando o tamanho da molécula de PEG aumentam a retenção do Fabs PEGuiIados no plasma (2545 ng/ml após 8 horas para 20K m266-Fab Peguilado) quando compara- do aos m266-Fabs não-PEGuilados (350 ng/ml após 8 horas).
B. Ensaio de ELISA de Αβ de m266
Para medir a quantidade de Αβ no plasma na ausência ou pre- sença de anticorpo terapêutico (comprimento total ou fragmento Fab) um ensaio de ELISA é desenvolvido e utilizado. Os peptídeos de Αβ sendo me- didos nestes ensaios são Αβ1-40 ou Αβ1-42 de comprimento total. Placas de ELISA de 96 poços Immulon 4HBX 96 poços (ThermoLabsystems) são re- vestidas durante a noite a 4 graus com o anticorpo de captura C-terminal (m2G3 para placas de Αβ40 ou m21F12 para placas de Αβ42) a 10 pg/ml em PBS (100 μl por poço). As placas de teste são vedadas para impedir evapo- ração durante a incubação de noite. No dia seguinte, a solução do poço é removida e os poços são lavados três vezes com PBS (400 μΙ por poço) com uma lavadora de placa de 96 poços de Labsystems. Tampão de bloqueio (360 μL de 1% de leite-PBS) é adicionado e as placas incubadas a 37 graus durante uma hora. As amostras são preparadas diluindo o plasma nos dilu- entes de amostra para render o seguinte: 20% de plasma, 0,5 M de guanidi- na, 5 mM de Tris pH 8,0, 0,5X coquetel de inibidor de protease, 25 pg/ml de m266, e PBS. O volume de plasma usado no ensaio pode necessitar ser diminuído para certos pontos de tempo devido aos níveis altos de peptídeo Αβ presente, e nestas circunstâncias, o volume de plasma residual é ajusta- do com plasma de rato (porcentagem de volume final é mantida em 20%). Os padrões de Αβ são gerados com concentrações que variam de 250 pg/ml a 3,9 pg/ml em diluente padrão (20% de plasma de rato, 0,5 M de guanidina, 5 mM de Tris pH 8,0, e 0,5X coquetel de inibidor de protease Completa ED- TA-free (Roche Diagnostics), 25 pg/ml de m266, e PBS). A incorporação de 25 pg/ml de m266 intacto na amostra e diluentes padrões é requerida para neutralizar qualquer interferência negativa que os níveis variáveis dos anti- corpos de domínios centrais podem exercer no ensaio. Após bloquear, as placas são lavadas 4 vezes com PBS. As amostras e padrões são carrega- dos em triplicata (100 μΙ por poço) e a placa é vedada e incubada durante a noite a 4 graus. Na manhã seguinte, as placas são lavadas 4 vezes com PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) e os poços incubados com o anticorpo se- cundário biotinilado m3D6 (100 μL por poço diluído em 0,5% de BSA/PBS-T) durante 2 horas em temperatura ambiente. Após as placas serem lavadas 4 vezes com PBS-T, elas são incubadas com estreptavidina-polyHRP (1:5000 em 0,5% de BSA/PBS-T) durante 1,5 hora em temperatura ambiente. As placas são lavadas 4 vezes com PBS-T e 100 μΙ por poço de substrato de TMB (Sigma) são adicionados. A progressão colorimétrica é monitorada a 650 nm em 15, 30, e 60 minutos. Tabela 1. Resultados farmacodinâmicos: Concentração de Plasma Média
para Αβ 40 (pg/ml)
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Além de um programa de doseamento mais flexível que pode ser manipulado com base no tamanho de PEG, os resultados demonstram que o complexo Fab-antígeno Peguilado não se acumula na circulação de plasma por quantidades estendidas de tempo como o anticorpo intacto (m266 intacto). O anticorpo intacto prolonga a meia-vida do anticorpo no plasma e resulta no complexo de antígeno:anticorpo estando presente na circulação de plasma por quantidades estendidas de tempo (> 240 horas). Os Fabs nativos (m266 Fab) por outro lado têm uma taxa de liberação rápida e uma meia-vida curta (< 24 horas) que os limita como uma terapia. Em con- traste, como demonstrado na Tabela 1, os Fabs PEGuiIados proporcionam uma molécula de anticorpo com farmacocinética e farmacodinâmica que permitem regime de doseamento melhorado.
EXEMPLO 2
ESTUDOS DE PK/PD SUBCUTÂNEOS PEG DE 1A1-Fab EM CAMUN- DONGOS PDAPP
Estudos são executados em camundongos PDAPP transgênicos jovens (3-meses de idade) para investigar a resposta farmacocinéti- ca/farmacodinâmica plasmática do anticorpo e complexo de anticorpo-Αβ. Vários anticorpos são investigados incluindo 1Al-Fab humanizado, 1A1- Fab+5KD PEG, 1A1-Fab+10KD PEG, e 1A1-Fab+20KD PEG. Camundon- gos PDAPP+/- são injetados subcutaneamente com 1 mg/kg de anticorpo e plasma é subseqüentemente isolado em pontos de tempo diferentes depen- dendo do grupo de injeção de anticorpo. Os pontos de tempo a seguir são usados para os vários anticorpos:
1 Al-Fab são sangrados a 1, 4, 8, 12, 18, 24, e 48 horas pós- dose
1 Al-Fab+ 5KD PEG são sangrados em 1, 4, 8, 24, 48, 96, e 168 horas pós-dose
1 Al-Fab+ 10KD PEG são sangrados em 1, 4, 8, 24, 48, 96, e 168 horas pós-dose
1 Al-Fab+ 20KD PEG são sangrados em 1, 8, 24, 48, 96, 168, e 240 horas pós-dose
Um total de cinco animais é analisado por anticorpo por ponto de tempo. As amostras de plasma resultantes são aliquotadas e armazena- das a -80-graus.
A. Metodologia para análise de PK de Fab
Concentrações de 1A1 Fab no plasma para 1A1 Fab são deter- minadas usando um ELISA em sanduíche. As placas são revestidas com lgG capa anti-humano de cabra, padrões, amostras de controle, e amostras de estudo são adicionados às placas depois incubadas durante uma hora em temperatura ambiente. Uma IgG anti-humana de cabra é usado para de- tecção seguida por OPD para uma resposta colorimétrica. As placas são Ii- das a uma absorbância de A493 com uma referência de A700.
Concentrações das amostras no plasma são determinadas das curvas padrão preparadas com quantidades conhecidas de 1A1 Fab no plasma de camundongo usando um algoritmo de 4/5 parâmetros; a faixa pa- ra o ensaio de Fab e Fab-5K PEG é 0,003 a 0,3 ug/ml; as faixas para os en- saios de PEG de Fab-1OK PEG são 0,006 a 0,2 e 0,04 a 0,4 ug/ml; as faixas para os ensaios de Fab 20K PEG são 0,02-0,4 e 0,04-0,4 ug/ml. Os resulta- dos demonstram claramente que a adição de uma molécula de PEG e au- mentando o tamanho da molécula de PEG aumenta a retenção dos Fabs PEGuiIados no plasma (77 ng/ml após 96 horas para 1A1 Fab Peguilado de 20K) quando comparado ao 1A1 Fab não Peguilado (não detectável após 24 horas).
B. Ensaio de ELISA 1A1 Αβ
O ELISA é essencialmente igual ao descrito acima para m266. As amostras são preparadas diluindo o plasma nos diluentes de amostra para render o seguinte: 20% de plasma, 0,5 M de guanidina, 5 mM de Tris pH 8,0, 0,5X coquetel de inibidor de protease, 20 pg/ml de 1A1, e PBS. Os peptídeos Αβ sendo medidos nestes ensaios são Αβ1-40 ou Αβ1-42 de comprimento total. A progressão colorimétrica é monitorada a 650 nm em 15, 30, e 60 minutos. Os resultados estão apresentados na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2. Resultados farmacodinâmicos: Concentração de Plasma Média para Αβ 40 (pg/ml)
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De uma maneira similar aos m266 Fabs no Exemplo 1, os dados da Tabela 2 demonstram que Fabs humanizados que estão covalentemente ligados a uma molécula de PEG também fornecem um perfil de PK/PD ideal que permite um programa de doseamento flexível ao mesmo tempo preve- nindo o complexo de anticorpo-antígeno de acumular-se na circulação de plasma por quantidades estendidas de tempo. EXEMPLO 3
PURIFICAÇÃO DE ANÁLOGOS DE Fab 266 MURINO E 1A1 HUMANIZA- DO
Sobrenadantes da cultura de células transfeccionadas com 266 Fab de camundongo ou 1A1 Fab humanizado e análogos são purificados usando uma estratégia de cromatografia de duas etapas que consiste na cromatografia de permuta de cátion seguida por cromatografia por exclusão de tamanho usando a resina Superdex 75 (GE Healthcare). Seguindo a cole- ta, o sobrenadante da cultura é concentrado usando TFF e submetido à diá- lise junto a um volume de excesso de 20 vezes de 10 mM pH 5 de acetato de sódio durante a noite a 4°C. Precipitado é removido através de centrifu- gação e o sobrenadante é carregado em um leito acumulado de SP sefarose (GE Healthcare) carregado com 10 mM pH 5 de acetato de sódio. A coluna é sucessivamente lavada com 10 mM pH 5 de acetato de sódio contendo quantidades maiores de NaCI até que o fragmento Fab eluísse, em cerca de 90 a 110 mM de NaCI. As frações de coluna contendo Fab ativo são identifi- cadas e agrupadas. O volume é reduzido e tampão trocado (PBS) usando um dispositivo de concentração centrífuga (Millipore). O volume final é ajus- tado para 13 ml e carregado em uma coluna de tamanho Superdex 75. As frações contendo Fab eluindo em aproximadamente 50 kD são identificadas e agrupadas para outra caracterização e PEGuilação.
EXEMPLO 4
PEGUILAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO IN VITRO
Cisteína de N56C em 1 Al-Fab purificados de cultura de célula é bloqueada para PEGuilação. Contas Reduce-lmm® Immobilized Reductant de Pierce são usadas para seletivamente reduzir a Cisteína de N56C. São contas redutoras são extraídas da coluna fornecida pelo fabricante e usadas em um modo em lote. ~4 ml de contas são ativados primeiro com 8 ml de 10 mM de DTT em tampão de Equilibração Reduce-IMM #1 (fosfato de sódio + EDTA1 pH 8,0) por 30 m. As contas são depois lavadas 3 vezes com PBS. 18 ml de 1A1 N56C Fab a 1,7 mg/ml em PBS pH 7,4 são adicionados às contas e 10 mM de EDTA são adicionados à mistura. A mistura é girada e incubada em temperatura ambiente durante 4-5 horas. Fab é separado das contas usando separadores resina Handee™ e as contas são lavadas com PBS. Fab e as lavagens são combinadas, e reagidas com 5 vezes de exces- so molar de Peg-maleimida (20kPEG de NOF; IOkPEG de Sunbio; 5kPEG de Nektar) durante uma hora. A mistura de reação é submetida à diálise jun- to de 4L de 10 mM de tampão de acetato de sódio pH 5,0 de forma que o Fab e Fab-PEG pode ser capturado em um coluna de sefarose SP que é equilibrada com 10 mM de tampão de acetato de sódio pH 5,0. Fab não- reagido e Fab-PEG são eluídos com um gradiente de sal. Eles são eluídos em 50 mM a 70 mM de NaCI. A proteína é também purificada por cromato- grafia por exclusão de tamanho (coluna de Superdex75, GE Healthcare) com PBS como a fase móvel. A reação de redução pode ser graduada para cima e para baixo. Métodos similares podem ser usados para preparar 266 Fab N56C murino Peguilado.
As amostras são analisadas com cromatografia por exclusão de tamanho para confirmar a adição de PEG ao Fab. Cromatografia por exclu- são de tamanho é executada com coluna de TSK G3000PW XL (Tosoh Bi- oscience). A coluna é operada a 0,5 ml/min com PBS mais 0,35 M NaCI em pH 7,4 usando uma HPLC analítico série Agilent HP1100 operando a 214 nm. Além disso, as amostras são analisadas com SDS-PAGE. 10 pg de ma- terial purificado são carregados em um Gel de 4-12% de NuPage® Bis-Tris e tingidos com SimplyBlue® SafeStain.
EXEMPLO 5
MEDINDO AS CONSTANTES DE CINÉTICA COM BIACORE
Instrumento de Biacore® 2000 é também usado para medir a ci- nética de ligação. O Biacore® utiliza as propriedades ópticas de ressonância de plasmon de superfície para detectar a alteração na concentração de pro- teína das moléculas interagentes dentro de uma matriz de biossensor de dextrana. Exceto como observado, todos os reagentes e materiais são com- prados de Biacore® AB (Upsala, Suécia). Todas as medições são executa- das as 25°C. As amostras são dissolvidas em tampão de HBS-EP (150 mM de cloreto de sódio, 3 mM de EDTA1 0,005% (p/v) de tensoativo P-20, e 10 mM de HEPES1 pH 7,4). Anticorpo capa anti-humano de cabra é imobilizado nas células de fluxo 1 a 4 de um circuito integrado de sensor CM5 a um nível de 8000 unidades de resposta (Ru) usando um kit de acoplamento de amina.
Ligação é avaliada usando ciclos analíticos múltiplos. Cada ciclo é executado a uma taxa de fluxo de 50 pL/minuto e consiste nas etapas a seguir: injeção de ~20 μL de uma composição de ligação de anticorpo a 10 pg/ml visando em uma captura de 400-500 Rus, injeção de 250 μL de Abeta Humano (1-40) (iniciando a 200 nM e usando diluições seriais de duas vezes durante cada ciclo) seguido por 20 minutos para dissociação, e regeneração usando ~30 μL de 10 mM de cloridrato de glicina, pH 1,5. As taxas de asso- ciação e dissociação avaliadas durante cada ciclo usando um modelo "de ligação 1:1 (Langmuir)" no software BIAevaIuation. Resultados mostram que PEGuilação no sítio de N56C tem pequeno impacto na afinidade da ligação de Fab a Abeta humano.
EXEMPLO 6
MEDINDO AS CONSTANTES DE EQUILÍBRIO COM KinExa
Análise de KinExA é usada como um método ortogonal para medir a afinidade de ligação através da análise de ligação de equilíbrio devi- do à taxa-off lenta do complexo de antígeno-Fab. Um instrumento de KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) é usado para medir a cinética de ligação. Breve- mente, o antígeno é covalentemente acoplado às contas de sefarose e a ligação de Fab livre/Fab-PEG às contas é detectada no instrumento. Para medir Kd, os tubos individuais contendo Fab/Fab-PEG (20 pM ou 500 pM para 1A1-Fab-20kPEG, 5 pM ou 50 pM para 1A1 Fab) com Abeta solúvel humano de antígeno serialmente diluído decrescente (1-40) (0-10 nM), são incubados por 30-50 h a 37°C em PBS contendo 1 mg/ml de BSA para as- segurar realização do equilíbrio. Após a incubação, Fab/Fab-PEG livre em cada amostra equilibrada é determinado no KinExA 3000 de acordo com as instruções do fabricante. Valores Kd são determinados por Análise de n- Curva usando o software KinExA 3000. Os resultados demonstram que 1A1 Fab liga firmemente a Abeta humano (19 pM), com ~10 vezes de afinidade mais alta comparado ao 266 Fab murino (240 pM). Além disso, ligação cova- lente de 20K PEG no sítio de N56C não tem nenhum impacto na afinidade de 1A1-Fab (12 pM).
EXEMPLO 7
ANÁLISE DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA PRECURSORA DO AMILÓIDE (APP) USANDO ELISA COM BASE EM CÉLULA
Para avaliar a reatividade cruzada de 266 Fabs/mAbs com pre- cursor de Abeta APP1 células HEK 293 estavelmente expressando APP (aa 1-751) são usadas. Estas células são criadas clonando o gene de APP (1- 751) em um plasmídeo contendo o marcador de resistência de neomicina. O plasmídeo recombinante é transfeccionado em HEK 293 e as células são selecionadas em 200 pg/ml de G418 para gerar uma linhagem celular está- vel supraexpressa. Para ensaios de ligação, 75.000 células de APP 751 são banhadas em cada poço de uma placa de 96 poços revestida com PDL. Se- guindo incubação durante 2 dias em meios de crescimento (DMEM F12, 5% de FBS, 10 mM de Hepes pH 7,5, 200 pg/ml de G418), o líquido é removido e 20 pg/ml de Fab ou mAb são adicionados em PBS (com Ca/Mg) contendo 10 mg/ml de BSA. Ligação prossegue durante 2 horas em 4°C e as células são lavadas 3X com 10 mg/ml de BSA. Um anticorpo secundário (cadeia leve anticapa conjugada com peroxidase de raiz-forte (hrp)) específico para cadeia leve humana ou de camundongo é adicionado em PBS/BSA (Sou- thern Biotech). Uma diluição de 1:5000 em PBS/BSA é usada para cadeia leve anti-humana e 1:2000 para cadeia leve anticamundongo. Seguindo in- cubação de uma hora a 4°C, as células são lavadas 5X com BSA/PBS. Ati- vidade de Hrp, como uma função de ligação de Fab/mAb à APP, é medida adicionando o substrato TMB durante 10 minutos. As reações são transferi- das para uma placa de 96 poços clara e absorbância a 650 nm é medida. Dados indicam que o 1A1-Fab e m266-Fab Peguilados (5 kD, 10 kD, e 20 kD) conferem seletividade para peptídeo Abeta em APP. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Eli Lilly and Company Bales, Kelly R Bumol, Thomas F Chow, Chi-Kin
Demattos, Ronald B Hansen, Ryan Kuchibholta, uma Lu, Jirong McDonnell, Peter
<120> FAB Peguilado para ABeta <130> X17087 <150> US 60/885439 <151> 2007-01-18 <160> 14
<170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construção sintética <400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu ser Leu ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile ser Cys ser ser ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys vai ser Asn Arg Phe ser Gly vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp vai Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Ser
85 90 95
Thr His Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construção sintética <400> 2 Glu vai Gln Leu 1
Ser Leu Arg Leu
Ser Met ser Trp 35
Gly Gln Ile Asn 20 50
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
Thr Thr Gly Asp
100
<210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construção sintética
vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Lys Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe ser Arg Tyr
25 30
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
lie Arg Gly Cys Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asp ser Lys Asn Thr Leu Tyr
70 75 80
Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser ser 105 110 <400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Gln lie Asn Ile Arg Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Thr Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu vai Thr vai Ser ser 100 105 110
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp vai Gly Ser Asn Lys 1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Construção sintética
<400> 6
Ser ser ser Gln Ser Leu Ile Tyr ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His 1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Construção sintética
<400> 7
Lys Val Ser Asn Arg Phe ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construção sintética
<400> 8
Thr Gln ser Thr His ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construção sintética
<400> 9
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Ser Met Ser < 1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Construção sintética
<400> 10
Gln Ile Asn Ile Arg Gly Cys Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Construção sintética
<400> 11
Gln Ile Asn Ile Arg Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Construção sintética
<400> 12
Gly Asp Phe 1
<210> 13
<211> 657
<212> DNA <213> Artificial <220>
<22Β> Construção sintética <400> 13
gacatcgtta tgactcagac tccattgtcc ttgtctgtta ctccaggtca accagcttct 60
atttcctgtt cctcctccca atctttgatc tactccgacg gtaacgctta cttgcactgg 120
tacttgcaaa agcctggtca atccccacaa ttgttgatct acaaggtttc caacagattc 180
tctggtgttc ctgacagatt ttctggttcc ggttccggta ctgacttcac tttgaagatc 240
tccagagttg aagctgagga tgttggtgtt tactactgta ctcagtccac tcattcccca 300
tggacttttg gtggtggtac taaggttgag atcaagagaa ctgttgctgc tccatccgtt 360
ttcattttcc caccatccga cgaacaattg aagtctggta ctgcttccgt tgtttgtttg 420
ttgaacaact tctacccaag agaggctaag gttcagtgga aggttgacaa cgctttgcaa 480
tccggtaact cccaagaatc cgttactgag caagactcta aggactccac ttactccttg 540
tcctccactt tgactttgtc caaggctgat tacgagaagc acaaggttta cgcttgtgag 600
gttacacatc agggtttgtc ctccccagtt actaagtcct tcaacagagg agagtcc 657 <210> 14 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Construção sintética <400> 14
gaggttcagt tggttgaatc tggtggtgga ttggttaagc ctggtggttc tttgagattg 60
tcctgtgctg cttccggtta cactttctcc agatactcca tgtcctgggt tagacaagct 120
ccaggaaagg gattggagtg ggttggtcaa atcaacatca gaggttgtaa cacttactac 180
ccagacactg ttaagggaag attcactatc tccagagatg actccaagaa cactttgtac 240
ttgcagatga actccttgaa aactgaggac actgctgttt actactgtac tactggtgac 300
ttttggggac agggaacttt ggttactgtt tcctccgctt ctactaaggg accatccgtt 360
tttccattgg ctccatcctc taagtctact tccggtggta ctgctgcttt gggatgtttg 420
gttaaggact acttcccaga gccagttact gtttcttgga actccggtgc tttgacttct 480
ggtgttcaca ctttcccagc tgttttgcaa tcttccggtt tgtactcctt gtcctccgtt 540
gttactgttc catcctcttc cttgggtact cagacttaca tctgtaacgt taaccacaag 600
ccatccaaca ctaaggttga caagaaggtt gaaccaaagt cctctgacaa gactcac 657

Claims (19)

1. Molécula compreendendo um fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao peptídeo Αβ humano entre as posições de aminoá- cido 13-28, em que o dito fragmento de anticorpo é cova lente mente ligado a uma molécula de polietileno glicol.
2. Molécula de acordo com a reivindicação 1, em que o frag- mento de anticorpo é um fragmento Fab.
3. Molécula de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.
4. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -3, em que a molécula de polietileno glicol é covalentemente ligada à região variável de cadeia pesada do fragmento de anticorpo.
5. Molécula de acordo com a reivindicação 4, em que a molécu- la de polietileno glicol é covalentemente ligada a uma CDR da região variá- vel de cadeia pesada do fragmento de anticorpo.
6. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 3- -5, em que a molécula de polietileno glicol é covalentemente ligada à cisteína na posição de aminoácido 56 da região variável de cadeia pesada da dita SEQ ID NO: 2.
7. Molécula de acordo com a reivindicação 1 ou 2 compreen- dendo uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3.
8. Molécula de acordo com a reivindicação 7, em que a molécu- la de polietileno glicol é covalentemente ligada à região de dobradiça do fragmento de anticorpo.
9. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -8, em que a molécula de polietileno glicol tem um peso molecular de cerca de 0,5 kD a cerca de 30 kD.
10. Molécula de acordo com a reivindicação 9, em que a molé- cula de polietileno glicol tem um peso molecular de cerca de 20 kD.
11. Molécula que consiste em um fragmento de anticorpo que especificamente liga-se ao peptídeo Αβ humano entre as posições de ami- noácido 13-28, em que o dito fragmento de anticorpo é covalentemente liga- do a uma molécula de polietileno glicol.
12. Molécula compreendendo um fragmento de anticorpo com uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2, em que o dito fragmento de anticorpo é covalentemente ligado a uma molécula de polietileno glicol de 20 kD na po- sição 56 da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.
13. Composição compreendendo a molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1-12.
14. Composição de acordo com a reivindicação 13 adicional- mente compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Método de tratar ou prevenir uma condição associada com atividade do peptídeo Αβ, compreendendo administrar a um sujeito humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1-12.
16. Método de tratar uma condição selecionada de um grupo que consiste na doença de Alzheimer clínica ou pré-clínica, síndrome de Down, ou angiopatia amilóide clínica ou pré-clínica (CAA)1 déficit cognitivo, acidente vascular cerebral, hemorragia cerebral, e debilitação mental geral, compreendendo administrar ao sujeito humano uma quantidade eficaz de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1-12.
17. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -12, para o uso como um medicamento.
18. Uso de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1-12 na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição associado à atividade do peptídeo Αβ.
19. Uso de uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1-12 na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição selecionada de um grupo que consiste na do- ença de Alzheimer clínica ou pré-clínica, síndrome de Down, angiopatia ami- lóide clínica ou pré-clínica (CAA), déficit cognitivo, acidente vascular cere- bral, hemorragia cerebral, e debilitação mental geral.
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