BRPI0806475A2 - produção de enzima em meio de cultura compreendendo glicerol bruto - Google Patents

Abstract

PRODUçãO DE ENZIMA EM MEIO DE CULTURA COMPREENDENDO GLICEROL BRUTO. A presente invenção refere-se a um método de produção de proteínas desejadas de uma célula hospedeira crescida em um meio de cultura compreendendo glicerol bruto como uma fonte de carbono.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO DE ENZIMA EM MEIO DE CULTURA COMPREENDENDO GLICEROL BRUTO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisó- rio dos Estados Unidos N0 60/879.904, depositado em 11 de janeiro de 2007, que é, desse modo, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao uso de glicerol bruto como uma fonte de carbono para crescimento de células na cultura, e produção de proteínas em tais culturas de célula.

ANTECEDENTES

Em certos métodos de biotecnologia molecular, as células são crescidas no meio de cultura e usadas para produzir proteínas desejadas. A proteína desejada que é produzida pode ser recuperada e usada em uma variedade de aplicações industriais e médicas. Por exemplo, a proteína de- sejada pode ser usada como uma proteína terapêutica, tal como um anticor- po ou uma enzima, e usada em aplicações industriais, tal como aplicações de limpeza (por exemplo, detergentes de lavanderia, aplicações de fabrica- ção de papel, aplicações de alimentação de animal, aplicações de cozimen- to, métodos para hidrólise de amido e outros métodos que requerem gran- des quantidades de uma enzima particular).

A produção de grandes quantidades de proteína usando células recombinantes ou células não-recombinantes, freqüentemente requer que as células sejam cultivadas em um meio contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e outros nutrientes, por exemplo, aminoácidos, vitami- nas, minerais, etc., requeridas para crescimento daquelas células. Muitas culturas de célula incorporam glicose ou uma combinação de glicose, e ou- tros substratos como uma fonte de carbono na cultura de célula, ou como uma alimentação de substrato na cultura de célula.

Esta invenção refere-se a uma fonte de carbono alternativa para uso em culturas de célula. Os inventores aqui descobriram que a adição de glicerol bruto a um meio de nutriente ou como uma fonte de carbono única, ou em combinação com outros açúcares (por exemplo, glicose), pode ser usada como um carbono para a produção de proteínas desejadas pelo cres- cimento de células nas culturas. O uso de glicerol bruto na cultura de células 5 seria de grande benefício comercial.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um meio de cultura contendo glicerol bruto é provido. Em certas concretizações, o glicerol bruto pode ser a fonte de carbono única do meio. Em outras concretizações, o meio de cultura pode conter, em adição ao gli- cerol bruto, uma ou mais fontes de carbono secundárias tais como 6 açúca- res de carbono incluindo, mas não limitada a, glicose, galactose, frutose, sorbose e manose, ou uma combinação de 6 açúcares de carbono, tais co- mo glicose e frutose (sacarose), celulose, Iactose e similares. Em outras concretizações, o meio de cultura pode conter, em adição ao glicerol bruto, uma ou mais fontes de carbonos secundárias, tais como fontes de proteína (por exemplo, soja e/ou milho).

Uma cultura de célula compreendendo o meio de cultura con- tendo glicerol bruto objeto é provida. Em certas concretizações, a cultura de célula compreende: a pluralidade de células que, em concretizações particu- lares, pode compreender um ácido nucleico recombinante para produção de uma proteína desejada, e um meio de cultura compreendendo glicerol bruto. Em certas concretizações, as células da cultura de célula podem ser células bacteriais células de fungo. O ácido nucleico recombinante pode conter um cassete de expressão compreendendo, em ligação operável: a) uma região promotora, b) uma região de codificação de uma proteína desejada; e c) uma região terminadora.

A proteína produzida pelas células recombinantes pode ser nati- va às células ou heteróloga às células e, em certas concretizações, a proteí- na pode ser intracelular ou secretada a partir das células no meio de cultura. A proteína, por exemplo, pode ser uma enzima industrial, uma proteína tera- pêutica, uma proteína relatora, um marcador selecionável, um aditivo de ali- mentação, ou um gênero alimentício. Também provido é um método de produção de proteína. Em termos gerais, este método compreende manutenção da cultura de célula antes descrita para proporcionar produção de uma proteína desejada. Em certos casos, a proteína pode ser recuperada do meio de cultura.

O meio de cultura contendo glicerol bruto acima descrito pode ser produzido por combinação, por exemplo, mistura, de glicerol bruto com outros componentes requeridos para crescimento de célula, por exemplo, uma fonte de nitrogênio, e outros nutrientes, e água.

Em algumas concretizações, a cultura de célula acima descrita pode ser produzida por combinação, por exemplo, mistura: a) de um glicerol bruto e b) uma cultura de células compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico recombinante) para produção da proteína dese- jada. Em outras concretizações, a cultura de célula acima descrita pode ser produzida por combinação (por exemplo, inoculação) de um meio de cultura de célula compreendendo glicerol bruto com células que compreendem um ácido nucleico recombinante para produção da proteína. Os métodos de cul- tura podem ser batelada, alimentado por batelada, ou métodos de cultura contínuos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 representa a massa celular de células recombinantes de Streptomyces Iividans crescidas em cultura de batelada com o tempo (DCW; gramas de células/kg), cultivadas em meio contendo glicerol bruto ou glicose, conforme descrito no Exemplo 1.

Figura 2 representa a quantidade de celulase secretada por S- treptomyces Iividans crescida em cultura de batelada com o tempo, cultivada em meio contendo glicerol bruto ou glicose (% de aumento sobre glicose máxima), conforme descrito no Exemplo 1. Todos os pontos de dados são representados como relativos ao nível mais alto de proteína produzida no meio de glicose, que é ajustado em 100%.

Figura 3 representa a massa de célula de células recombinantes de Streptomyces Iividans crescidas em cultura alimentada por batelada com o tempo (DCW; gramas de células/kg), cultivada em meio contendo glicerol bruto ou glicose, conforme descrito rio Exemplo 2.

Figura 4 representa a quantidade de celulase secretada por S- treptomyces Iividans crescida em cultura alimentada por batelada com o tempo, cultivada em meio contendo glicerol bruto ou glicose (% de aumento sobre glicose máximo), conforme descrito no Exemplo 2. Todos os pontos de dados são representados como relativos ao nível mais alto de proteína pro- duzida no meio com glicose, que é ajustado para 100%.

Figura 5 representa a massa de célula de células recombinantes de Bacillus subtilis crescidas em cultura de batelada com o tempo (densida- de ótica a 550 nm), cultivada em meio contendo glicerol bruto ou glicose, conforme descrito no Exemplo 3.

Figura 6 representa a quantidade de protease secretada por Bacillus subtilis crescido em cultura de batelada com o tempo, cultivado em meio contendo glicerol bruto ou glicose (% de aumento sobre glicose máxi- ma), conforme descrito no Exemplo 3. Todos os pontos de dados são repre- sentados como relativos ao nível mais alto de proteína produzida no meio com glicose, que é ajustado a 100%.

Figura 7 representa a massa de célula de células recombinantes de Bacillus subtilis crescidas em cultura alimentada por batelada com o tem- po (densidade ótica a 550 nm), cultivada em meio contendo glicerol bruto ou glicose, conforme descrito no Exemplo 4.

Figura 8 representa a quantidade de protease secretada por Bacillus subtilis crescido em cultura alimentada por batelada com o tempo, cultivado em meio contendo glicerol bruto ou glicose (versadex) (% de au- mento sobre versadex máximo), conforme descrito no Exemplo 4. Todos os pontos de dados são representados como relativos ao nível mais alto de pro- teína produzido no meio versadex, que é ajustado em 100%.

Figura 9 representa a massa de célula de células não- recombinantes de Aspergillus niger crescidas em cultura de batelada com o tempo (DCW; gramas de células/kg), cultivadas em meio contendo glicerol bruto ou maltose, conforme descrito no Exemplo 6.

Figura 10 representa a quantidade de glucoamilase secretada por Aspergillus niger crescida em cultura de batelada com o tempo, cultivada em meio contendo glicerol bruto ou maltose (% de aumento de maltose má- xima), conforme descrito no Exemplo 6. Todos os pontos de dados são re- presentados como relativos ao nível mais alto de proteína produzido no meio com maltose, que é ajustado em 100%.

Figura 11 representa a massa de célula de células recombinan- tes de Streptomyces rubigenosis crescidas em cultura de batelada com o tempo (DCW; gramas de células/kg), cultivadas em meio contendo glicerol bruto ou glicose, conforme descrito no Exemplo 7.

Figura 12 representa a quantidade de glicose isomerase intrace- lular secretada por Streptomyces rubigenosis crescido em cultura de batela- da com o tempo, cultivado em meio contendo glicerol bruto ou glicose (% de aumento sobre glicose máxima), conforme descrito no Exemplo 7. Todos os pontos de dados são representados como relativos ao nível mais alto de pro- teína produzido no meio com glicose, que é ajustado em 100%.

Figura 13 representa a massa de célula de células recombinan- tes de Hansenula polymorpha crescidas em cultura de batelada com o tem- po (densidade ótica a 550nm), cultivadas em meio contendo glicerol bruto ou destilado, conforme descrito no Exemplo 8.

Figura 14 representa a quantidade de Iipase secretada por Han- senula polymorpha crescida em cultura de batelada com o tempo, cultivado em meio contendo glicerol bruto ou destilado (% de aumento sobre glicerol máximo), conforme descrito no Exemplo 8. Todos os pontos de dados são representados como relativos ao nível mais alto de proteína produzida no meio com glicerol destilado, que é ajustado a 100%.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições

A menos que de outro modo aqui definido, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comu- mente compreendido por um versado na técnica ao qual esta invenção per- tence. Singleton1 et ai, Dictionary of Microbiology ε Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley e Sons, New York (1994), e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporciona um técnico com dicionários gerais de muitos dos termos usados nesta in- venção. Também referência é feita a Atkinson e outros, Biochemical Engine- ering e Biotechnology Handbook, segunda edição, Stockton Press (1991) como uma referência geral. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos.

Todas as patentes e publicações, incluindo todas as seqüências descritas dentro de tais patentes e publicações, referidas aqui são expres- samente incorporadas por referência.

Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; as seqüências de aminoáci- do são escritas da esquerda para a direita na orientação carbóxi, respecti- vãmente.

Os títulos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou concretizações da invenção que podem ser por referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos imediatamente de- finidos abaixo são mais totalmente definidos por referência ao relatório des- critivo como um todo.

"Glicerol" refere-se a (C3H8O3) 1,2,3-propano, também conhecido como 1,2,3-tri-hidroxipropano. O termo é também usado permutavelmente com "glicerin" e "glicerina".

O termo "gücerol bruto" é definido aqui como uma solução aquo- sa tendo uma % de pureza de menos do que 99% (v/v), por exemplo, pelo menos 25%, e menos do que 95% de glicerol (v/v), 95% a 98% de glicerol (v/v), 95% a 99% de glicerol (v/v), ou 98% a 99% de glicerol (v/v).

O termo "glicerol refinado", conforme aqui usado, significa "glice- rol bruto" tendo menos do que 1% de sal (w/v).

O termo "glicerol destilado" é definido aqui como uma solução aquosa tendo uma % de pureza de 95% ou maior de glicerol (v/v) (maior do que cerca de 95%, e até 100% de glicerol (v/v)). O termo "meio de cultura" é definido aqui como uma composição produzida pelo homem, ou líquida ou sólida, que contém uma fonte de car- bono, uma fonte de nitrogênio, e outros nutrientes, por exemplo, aminoáci- dos, vitaminas, minerais, etc., requerida para cultura de células. Um meio de cultura não contém células. Um meio de cultura pode ser inoculado com cé- lulas para produzir uma cultura de célula que contém células e o meio de cultura.

Os termos "cultura de célula" e "cultura de células" são usados permutavelmente para descrever uma composição líquida contendo células vivas, tipicamente de um tipo simples, e um meio de cultura. Culturas de cé- lula podem ser produzidas por inoculação de um meio de cultura com célu- las. As células de uma cultura de célula são metabolicamente ativas, contu- do, elas podem ou não podem ser ativamente crescidas ou divididas. A cul- tura de célula existe in vitro.

O termo "batelada" descreve uma cultura de célula de batelada a qual substrato, na forma ou sólida ou líquida concentrada, é adicionado inici- almente no começo de um curso de fermentação. Uma cultura de batelada é iniciada por inoculação de células ao meio de cultura com nenhum influxo subsequente de nutrientes. As concentrações dos nutrientes e metabolitos no meio de cultura são dependentes das concentrações iniciais dentro da batelada e da alteração subsequente das composições da alimentação de nutriente devido a ação de fermentação celular. O termo "alimentado por batelada" descreve uma cultura de célula em batelada a qual substrato, na forma líquida ou sólida concentrada, é adicionado, ou periodicamente ou continuamente, durante um curso de fermentação. Uma cultura alimentada por batelada é iniciada por inoculação de células ao meio, mas existe um influxo subsequente de nutrientes tal como por uma alimentação de nutriente concentrada. Contudo, não existe remoção sistemática de fluido de cultura ou células.

O termo "cultura de célula contínua" ou "cultura contínua" signifi- ca uma cultura caracterizada por ambos um influxo contínuo de uma alimen- tação de nutriente líquido e um escoamento líquido contínuo. O termo "vaso" significa qualquer recipiente adequado para cul- tura de células, incluindo, mas não limitados a, cubas, garrafas, frascos, sa- cos, bioreatores, e qualquer outro receptáculo adequado para condução dos métodos da presente invenção.

O termo "promotor" é aqui definido como um ácido nucleico que direciona transcrição de um polinucleotídeo a jusante em uma célula. Em certos casos, o polinucleotídeo pode conter uma seqüência de codificação e o promotor pode direcionar a transcrição da seqüência de codificação no RNA transladável.

O termo "isolado", conforme aqui definido, significa um compos- to, uma proteína, célula, seqüência de ácido nucleico ou de aminoácido que é removida de pelo menos um componente com o qual ela é naturalmente associada.

O termo "seqüência de codificação" é definido aqui como um ácido nucleico que, quando colocado sob o controle de seqüências de con- trole apropriadas incluindo um promotor, é transcrito em mRNA que pode ser transladado em um polipeptídeo. Uma seqüência de codificação pode conter uma estrutura de leitura aberta simples, ou várias estruturas de leitura aberta separadas por íntrons, por exemplo. Uma seqüência de codificação pode ser cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou DNA recombinante, por exemplo. Uma seqüência de codificação geralmente começa em um códon de partida (por exemplo, ATG) e termina em um códon de parada (por exemplo, UAA, UAG e UGA).

O termo "recombinante" refere-se a polinucleotídeo ou polipeptí- deo que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Uma molécula recombinante pode conter duas ou mais seqüências que ocorrem natural- mente que são Iigadasjuntas em um modo que não ocorrem naturalmente.

O termo "heterólogo" refere-se a elementos que não estão nor- malmente associados entre si. Por exemplo, se uma célula hospedeira re- combinante produz uma proteína heteróloga, esta proteína não é produzida em uma célula hospedeira tipo selvagem do mesmo tipo, um promotor hete- rólogo é um promotor que na está presente no ácido nucleico que é endóge- no a uma célula hospedeira tipo selvagem, e um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de codificação heteróloga é um promotor que é ope- ravelmente ligado a uma seqüência de codificação que não é usualmente operavelmente ligada e em uma célula hospedeira tipo selvagem.

O termo "operavelmente ligado" refere-se a um arranjo de ele- mentos que permite que os mesmos sejam funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma seqüência de codifica- ção se ele controla a transcrição da seqüência, e um seqüência de sinal é operavelmente ligada a uma proteína se a seqüência de sinal direciona a proteína através do sistema de secreção de uma célula hospedeira.

O termo "ácido nucleico" envolve DNA1 RNA1 de trançado duplo ou simples, modificação destes. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotí- deo" podem ser usados aqui permutavelmente.

O termo "construção de DNA", conforme aqui usado, significa uma seqüência de ácido nucleico que compreende pelo menos dois frag- mentos de polinucleotídeo de DNA.

Conforme aqui usado, o termo "relator" refere-se a uma proteína que é facilmente detectada e medida. Em certos casos, um relator pode ser oticamente detectável, por exemplo, fluorescente, Iuminescente ou colorigê- nica.

Conforme aqui usado, o termo "marcador selecionável" refere-se a um biopolímero, ou um polipeptídeo ou polinucleotídeo que permite que as células hospedeiras que contêm o biopolímero sejam selecionadas sobre outras células que não contêm o biopolímero. Os marcadores selecionáveis proporcionam resistência a compostos tóxicos, tais como antibióticos, herbi- cidas, e similares.

O termo "seqüência de sinal" ou "peptídeo de sinal" refere-se a uma seqüência de aminoácidos na porção N-terminal de uma proteína, que facilita a secreção da forma madura da proteína fora da célula. A forma ma- dura da proteína extracelular carece da seqüência de sinal que é clivada du- rante o processo de secreção.

O termo "vetor" é definido aqui como um polinucleotídeo desig- nado para conduzir seqüências de ácido nucleico a serem introduzidas em um ou mais tipos de célula. Os vetores incluem vetores de clonagem, veto- res de expressão, vetores de lançadeira, plasmódios, fago ou partículas de vírus, construções de DNA1 cassetes e similares. Vetores de expressão po- dem incluir seqüências regulatórias como promotores, seqüências de sinal, seqüências de codificação, e terminadores de transcrição.

Um "vetor de expressão", conforme aqui usado, significa uma construção de DNA compreendendo uma seqüência de codificação que é operavelmente ligada a seqüências de controle adequadas capazes de efe- tuar expressão de uma proteína em um hospedeiro adequado. Tais seqüên- cias de controle podem incluir um promotor para efetuar transcrição, uma seqüência operadora opcional para controlar transcrição, uma seqüência que codifica locais de ligação de ribossoma, intensificadores e seqüências que controlam terminação de transcrição e translação.

Conforme aqui usado, os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados permutavelmente, e incluem referência a um polímero de qualquer número de resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um análogo quí- mico adicional de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente, bem como a polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente. Os termos também aplicam-se a polímeros contendo substituições de aminoácido con- servativas, tal como o polipeptídeo que permanece funcional. "Peptídeos" são polipeptídeos tendo menos do que 50 resíduos de aminoácidos.

Uma "célula hospedeira" refere-se a um hospedeiro adequado para um vetor de expressão compreendendo uma construção de DNA que codifica uma proteína desejada. Uma célula hospedeira pode ser de qual- quer tipo.

O termo "fungo filamentoso" refere-se a todas as formas filamen- tosas da subdivisão Eumycotina (Ver, Alexopoulos, C. J. (1962), INTRO- DUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York). Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede de célula composta de quitin, glucans, e outros polissacarídeos de complexo. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente, e geneticamente distintos das leveduras. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é por alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbi- co.

Uma cepa "não-patogênica" é uma cepa que não é patogênica a humanos.

Meio de cultura

Conforme notado acima, um meio de cultura contendo glicerol bruto é provido. O meio de cultura pode conter uma fonte de nitrogênio, gli- cerol bruto, e outros nutrientes, por exemplo, aminoácidos, vitaminas, mine- rais, etc., requeridos para cultura de células. O glicerol bruto pode ser usado como uma fonte de carbono por células que crescem no meio de cultura.

Em certas concretizações, o meio de cultura pode compreender uma fonte de carbono adicional, por exemplo, um açúcar, para crescimento das células. Consequentemente, em certas concretizações, glicerol bruto pode ser a única fonte de carbono para as células. Em outras concretiza- ções, o glicerol bruto pode estar presente com uma ou mais fontes de car- bono secundárias para as células.

Nas concretizações exemplares, glicerol bruto no meio de cultu- ra pode ter uma percentagem de pureza de glicerol de 25% a 85% (v/v); também 25% a 50% (v/v); também 50% a 75% (v/v); também 75% a 85% (v/v); também 85% a 90% (v/v), ou também 90% a menos do que 95% (v/v). Em algumas concretizações, o glicerol bruto pode ter uma pureza de glicerol de 95% a 98% (v/v). Em algumas concretizações, o glicerol bruto pode ter uma pureza de glicerol de menos do que 99% (v/v).

Em certas concretizações, glicerol bruto pode conter sal (por e- xemplo, KCI ou NaCI; sulfato de sódio ou de potássio, fosfato ou nitrato) a uma concentração de até 12% (p/v), por exemplo, na faixa de 1% a 10% (p/v); 1% a 5% (l/v); 5% a 8% (p/v) ou 8% a 12% (p/v). Glicerol refinado con- tém menos do que 1% de sala (p/v), por exemplo, sal a uma concentração na faixa de 0,01% a 0,1% (p/v), 0,1% a 0,5% (p/v) ou 0,5% a menos do que 1% (p/v). Em uma concretização, o glicerol bruto compreende substancial- mente nenhum sal (O a 0,01%, ou O a 0,001% de sal).

Enquanto em concretizações preferidas, glicerol bruto é usado no meio de cultura e cultura de célula, glicerol destilado pode ser usado em certas concretizações. Em algumas concretizações, glicerol destilado, que é definido como tendo uma pureza de 95% ou maior, pode ter uma pureza de pelo menos 95% e menos do que 99,5% (v/v), por exemplo, maior do que 95% a 97% de glicerol (v/v), 97% a 99% de glicerol (v/v), ou 99% a menos do que 99,5% de glicerol (v/v). Em algumas concretizações, o glicerol desti- lado que é usado nos métodos envolvidos pela invenção terá uma pureza de pelo menos 99,5%, por exemplo, de pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, ou pelo menos 99,9% de glicerol (v/v). O glicerol tendo uma % de pureza dentro das faixas definidas acima pode ser referido como glicerol de grau técnico (por exemplo, maior do que 95% a menos do que 99,5%), e glicerol de grau farmacêutico (por exemplo, pelo menos 99,5% de glicerol a pelo menos 99,9% de glicerol (v/v).

A quantidade de glicerol bruto presente em um meio de cultura pode variar grandemente dependendo dos métodos de crescimento usados, por exemplo, se as células são crescidas em cultura de batelada (for exem- plo, em um frasco oscilador), cultura contínua, ou cultura alimentada por ba- telada. Em certas concretizações, o meio de cultura pode compreender 0,1% a 75% de glicerol bruto (v/v), por exemplo, 0,5% a 2% de glicerol bruto (par- ticularmente se a cultura de célula é crescida sob métodos contínuos ou ali- mentados por batelada em que a fonte de carbono é rapidamente usada por células cultivadas no meio, 2% a 5% de glicerol bruto, 5% a 10% de glicerol bruto, 10% a 30% de glicerol bruto, 30% a 50% de glicerol bruto, ou 50% a 75% de glicerol bruto. Em algumas concretizações, a concentração de glice- rol bruto é qualquer de cerca de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, ou 25% (v/v) a cer- ca de 50, 55, 60, 65, 70, 75, ou 80% (v/v). Em algumas concretizações, as células são crescidas em um processo de fermentação de batelada, e o meio de cultura compreende cerca de 1% a cerca de 5% de glicerol bruto (v/v). Em algumas concretizações, as células são crescidas em um processo de fermentação alimentada em batelada e o meio de cultura compreende cerca de 20% a cerca de 50% de glicerol bruto (v/v).

Se uma fonte de carbono secundária está presente no meio de cultura, a fonte de carbono secundária pode ser açúcar, por exemplo, glico- se, galactose, frutose, maltose, xilose, arabinose, dextrose ou sacarose, etc.

Se uma fonte de carbono secundária está presente no meio de cultura, a fonte de carbono secundária e o glicerol bruto podem estar presentes a uma concentração molar relativa na faixa de 1:99 (por exemplo, 1 molécula da fonte de carbono secundária a 99 moléculas de glicerol) a 99:1 (por exem- plo, 99 moléculas da fonte de carbono secundária a 1 molécula de glicerol). Por exemplo, a fonte de carbono secundária e o glicerol bruto podem estar presentes a uma concentração molar relativa na faixa de 1:99 a 1:10, 1:10 a 1:2, 1:2 a 2:1, 10:1 a 2:1, ou 10:1 a 99:1, por exemplo. Em algumas concreti- zações preferidas, a fonte de carbono secundária será glicose e, em particu- lar, quando uma cultura de célula compreende célula de fungos alguma gli- cose será provida como uma fonte de carbono. Em algumas concretizações preferidas, a proporção de glicerol bruto para glicose estará na faixa de 1:4 a 4:1, e também 2:1 a 1:2.

A identidade e concentrações adequadas de outros componen- tes que podem ser empregados no meio de cultura de célula objeto, por e- xemplo, a fonte de nitrogênio e outros nutrientes, etc., geralmente dependem do tipo de células sendo crescidas no meio de cultura. Tais componentes são geralmente conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3a edição, Wiley & Sons, 1995; Sam- brook, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.; Talbot, Molecular and Cellular Biology of Fi- Iamentous Fungi: A Practical Approach, Oxford University Press, 2001; Kin- ghorn e Turner, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Cambrid- ge University Press, 1992; and Bacillus (Biotechnology Handbooks) by Colin R. Harwood, Plenum Press, 1989; Bacillus subtilis: From Genes to Células, Sonenshein, A.L., Hoch, J.A. and Losick, R ASM (2001), bem como, por e- xemplo, Ilmen e outros, Appl. Environ. Microbiol. 1997 63:1298-1306; O1Her- rin e outros Hum. Immunol. 1996 51:63-72; Westers e outros, J. Biotechnol. 2006 123:211-24 and Yang e outros, Biochim. Biophys. Acta 2004 1703:43- 51). As condições de cultura para um dado tipo de célula pode também ser encontradas na literatura científica e/ou a partir da fonte dos fungos, tal co- mo a American Type Cultura Collection (ATCC) e Fungai Genetics Stock Center.

Os componentes exemplares que podem ser empregados no meio de cultura incluem, mas não estão limitados a: um extrato de células microbiais, animais ou de planta, por exemplo, farinha de soja, proteína de soja, concentrado de soja, milho macerado, farinha de milho, glúten de mi- lho, extrato de levedura, farinha de soja, farinha de algodão, farinha de a- mendoim, proteína de batata, soro de leite, farinha de peixe, bacto-triptona, bacto-peptona, etc., sais, por exemplo, KH2PO4, MgSO4, CaCI2, NaCI, FeCI3, MgCI2, MnCI2, outros compostos, por exemplo, cloreto de tiamina, biotin, vi- tamina B12, NaH2PO4 H3B03, ZnSO4, Na2MoO4 e CuSO4, e, opcionalmente, uma ou mais fontes de carbono secundárias, conforme discutido acima. Em certos casos, a fonte de carbono de um meio de cultura conhecido pode ser substituída por glicerol (por exemplo, glicerol bruto). Meios de cultura con- tendo glicerol bruto são exemplificados abaixo.

Conforme será descrito em maiores detalhes abaixo, o meio de cultura pode ser empregado para cultura de células que contêm um ácido nucleico recombinante para expressar uma proteína. Desde que, em certas concretizações, o ácido nucleico recombinante pode conter um marcador selecionável de modo a selecionar células contendo o ácido nucleico recom- binante, o meio de cultura pode também conter um agente de seleção, por exemplo, um antibiótico, tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina, higro- micina, bleomicina, cloroanfenicol, estreptomicina ou fleomicina ou um herbi- cida, ao qual o marcador selecionável das células proporciona resistência. Em certos casos, o meio de cultura pode também conter proteína secretada a partir das células. Conforme será descrito em maiores detalhes abaixo, a proteína pode ser endógena às células, ou não-endógena às células.

Em concretizações particulares, o meio de cultura pode ser es- pecificamente formulado para células particulares de cultura (por exemplo, células hospedeiras que contêm um ácido nucleico recombinante para pro- dução de uma proteína). Conforme será descrito em maiores detalhes abai- xo, tais células hospedeiras incluem, mas não estão limitadas a, certas célu- la hospedeiras de bactérias e fungos.

O glicerol (por exemplo, glicerol bruto) presente em um meio de cultura objeto pode ser de qualquer fonte. Em concretizações particulares, o glicerol (por exemplo, glicerol bruto) presente em um meio de cultura objeto pode ser um subproduto de métodos de produção biodíesel ou sabão, isto é, como um subproduto da produção de alquil ésteres combustíveis por tran- sesterificação de triglicerídeos vegetal e/ou animal, ou como um subproduto da produção de sais de ácido graxo por saponificação de triglicerídeos vege- tal e/ou animal. Fontes comerciais de glicerol são disponíveis, por exemplo, de Novance (France), Reidel-de Haen (Germany), Sigma-AIdrich, e ADM.

O meio de cultura-objeto pode ser produzido usando-se qualquer método conveniente. Em uma concretização, todos os componentes do meio de cultura, incluindo o glicerol bruto e água, podem ser combinados e esteri- lizados, por exemplo, autoclavados ou filtrados antes do uso. Em outra con- cretização, glicerol bruto pode ser adicionado aos outros componentes do meio de crescimento antes do uso. O meio pode conter agar ou outro agente de solidificação se o meio é um meio sólido. Cultura de células

Uma cultura de célula compreendendo: a) uma pluralidade de células hospedeiras e b) o meio de cultura acima descrito é provido. Em cer- tas concretizações, as células podem conter um ácido nucleico recombinan- te para produção de uma proteína.

Em concretizações particulares, uma célula hospedeira objeto pode ser uma célula bacterial incluindo células bactérias gram-positiva e gram negativa das seguintes espécies: sp. Bacillus, incluindo, mas não limi- tado a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophi- lus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. mega- terium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, e thuríngiensis; sp. Streptomy- ces, incluindo, mas não limitados a, S. lividans, S. carbophilus, S. rubigeno- sus, e S. helvaticus; Pantoea sp., incluindo P. citrea; Gluconobacter sp.; Er- winia sp.; e E. coli.

Em outras concretizações, a célula hospedeira-objeto pode ser uma célula de fungo das seguintes espécies: sp. Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei (anteriormente classificada como T. longibrachiatum, e atualmente também conhecida como Hypocrea jecorina), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, e Trichoderma harzianum)); sp. Penicillium, Humicola sp. (por exemplo, Humieola insolens e Humicola grisea); sp. Chrysosporium (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exem- pio, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus kawachi, Aspergillus aculeatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus sojae, e Aspergillus awamori), sp. Fusarium, sp. Mucor, sp. Neurospora, sp. Hypo- crea, ou sp. Emericella, entre outros.

Métodos para cultura de tais células, incluindo componentes de meio de cultura adequados que podem ser usados para cultura daquelas células, são conhecidos.

Conforme notado acima, as células da cultura de célula podem conter um ácido nucleico recombinante para expressar uma proteína. Em certas concretizações, o ácido nucleico recombinante pode compreender um cassete de expressão para expressar a proteína, isto é, um promotor, uma seqüência de codificação (isto é, um polinucleotídeo que codifica a proteína), e um terminador, onde o promotor, seqüência de codificação e terminador estão operavelmente ligados, tal que a seqüência de codificação é transcrita para produzir um RNA, e que o RNA é traduzido para produzir a proteína. Cada um do promotor, seqüência de codificação e terminador podem ser, independentemente, endógenos (isto é, nativos) ou não-endógenos às célu- las hospedeira. Do mesmo modo, a proteína pode ser endógena (isto é, na- tiva), ou não-endógena, à célula hospedeira. Em certas concretizações, a seqüência de codificação pode ser de códon otimizado para expressão da proteína em uma célula hospedeira particular. Desde que tabelas de uso de códon listando o uso de cada códon em muitas células são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Nakamura et al, Nucl. Acids Res. 2000 28: 292), ou prontamente deriváveis, tais ácidos nucleicos podem ser prontamente designados dando a seqüência de aminoácido de uma proteína a ser ex- pressa.

A proteína codificada pode ser uma enzima, uma proteína tera- pêutica, uma proteína relatora, um marcador selecionável, um aditivo de ali- mentação, ou um gênero alimentício, ou similares.

Em uma concretização, a proteína pode ser uma enzima tal co- mo uma carbo-hidrase, tal como uma α-amilase, uma β-amilase, uma celula- se; uma dextranase, uma α-glucosidase, uma α-galactosidase, uma glucoa- milase, uma hemicelulase, uma pentosanase, uma xilanase, uma invertase, uma lactase, uma naringanase, uma pectinase, ou uma pululanase; uma protease tal como uma protease ácida, uma protease alcalina, bromelaina, ficina, uma protease neutra, papaína, pepsina, uma peptidase, renete, reni- na, quimosina, subtilisina, termolisina, uma proteinase aspártica, ou tripsina; uma Iipase ou esterase, tal como trigliceridase, uma fosfolipase, uma estera- se pregástrica, uma foafatase, uma fitase, uma amidase, uma iminoacilase, uma glutaminase, uma lisozime, ou uma penicilina acilase; uma isomerase, tal como glicose isomerase; uma oxidoreductases, por exemplo, um aminoá- cido oxidase, uma catalase, uma cloroperoxidase, uma glicose oxidase, uma de-hidrogenase hidroxiesteroide, ou uma peroxidase; uma Iiase tal como um acetolactato decarboxilase, um aspártico β-decarboxilase, uma fumarase ou uma histadase; uma transferase tal como ciclodextrina glicosiltranferase; ou uma ligase, por exemplo. Em concretizações particulares, a proteína pode ser uma aminopeptidase, uma carboxipeptidase, uma quitinase, uma cutina- se, uma deoxiribonuclease, uma α-galactosidase, uma β-galactosidase, uma β-glucosidase, uma lacase, uma manosidase, uma mutanase, uma enzima pectinolítica, uma polifenoloxidase, ribonuclease ou transglutaminase, por exemplo.

Em outras concretizações, a proteína pode ser uma proteína te- rapêutica (isto é, uma proteína tendo uma atividade biológica terapêutica). Exemplos de proteínas terapêuticas adequadas incluem: eritropoietin, cito- quinas tais como α-interferona, β-interferona, γ-interferona, o-interferona, e granulócito-CSF, GM-CSF, fatores de coagulação, tais como fator Vlll1 fator IX1 e proteína humana C, antitrombina El, trombina, receptor solúvel IgE de cadeia a, IgG1 fragmentos de IgG1 fusões de IgG, IgM, IgA1 interleukins, uro- quinase, quimase, e inibidor de uréia tripsin, proteína de ligação de IGF, fator de crescimento epidermal, fator de liberação de hormônio de crescimento, proteína de fusão anexin V, angiostatin, fator de crescimento endotelial vas- cular-2, fator inibitório de progenitor de miolóide-1, osteoprotegerin, a-1- antitripsin, α-feto proteínas, DNase II, kringle 3 de plasminogen humano, glucocerebrosidase, proteína de ligação de TNF 1, hormônio de estimulação de folículo, linfócito T citotóxico associado a antígeno 4-lg, ativador de transmembrana e modulador de cálcio e Iigante de ciclofilin, receptor solúvel de TNF de fusão Fc, proteína 1 similar a glucagon e agonístico de receptor IL-2. Proteínas de anticorpo, (polipeptídeos compreendendo uma região de estrutura de um gene de imunoglobulina fragmentos desta que se ligam es- pecificamente e reconhecem um antígeno (por exemplo, anticorpos mono- clonais que podem ser humanizados), são de interesse particular.

Em uma concretização adicional, a proteína pode ser uma prote- ína relatora. Tais proteínas relatoras podem ser oticamente detectáveis ou colorigênicas, por exemplo. Nesta concretização, a proteína pode ser uma β- galactosidase (IacZ), β-glucuronidase (GUS), luciferase, fosfatase alcalina, sintase nopalina (NOS), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou uma proteína verde-fluorescente, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), ou um derivado destes.

Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, marcadores que conferem resistência antimicrobial (por exem- plo, resistência à higromicina, bleomicina, cloroanfenicol ou fleomicina), e proteínas que conferem vantagem metabólica, por exemplo, amdS, argB e pyr4. Marcadores selecionáveis são adicionalmente descritos em Kelley e outros, (1985) EMBO J. 4: 475 - 479; Penttila e outros, (1987) Gene 61:15 5 -164 and Kinghorn et al (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Aeademic and Professional, Chapman e Hall, London.

Em certas concretizações, a seqüência de codificação pode co- dificar uma proteína de fusão. Em algumas destas concretizações, a proteí- na de fusão pode proporcionar secreção da proteína a partir da célula hos- pedeira na qual ela é expressa e, como tal, pode conter uma seqüência de sinal operavelmente ligada ao N-terminal da proteína, onde a seqüência de sinal contém uma seqüência de aminoácidos que direcionam a proteína para o sistema secretório da célula hospedeira, resultando em secreção da prote- ína a partir da célula hospedeira no meio no qual a célula hospedeira está crescendo. A seqüência de sinal é clivada a partir da proteína de fusão antes da secreção da proteína. A seqüência de sinal empregada pode ser endóge- na ou não-endógena à célula hospedeira e, em certas concretizações, pode ser seqüência de sinal de uma proteína que é conhecida para ser altamente secretada de uma célula hospedeira. Em concretizações particulares, a se- qüência de sinal da proteína pode ser qualquer seqüência de sinal que facili- ta a secreção da proteína de uma célula hospedeira filamentosa fungai (por exemplo, Trichoderma ou Aspergillus), ou uma célula hospedeira bacterial (por exemplo, Bacillus ou Streptomyces). Tal seqüência de sinais inclui, mas não são limitadas a: a seqüência de sinal de celobio-hidrolase I, celobio- hidrolase II, endoglucanases I, endoglucanases II, endoglucanases III, a- amilase, aspartil proteases, glucoamilase, mananase, glicosidase e endo- peptidase B de cevada (ver Saarelainen, Appl. Environ. Microbiol. 1997 63: 4938-4940), por exemplo. Outras seqüências de sinal são aquelas que se originam de gene de amiloglucosidase fungai (AG) (glaA), o gene de fator α (leveduras, por exemplo Saccharomyces, Kluyveromyces e Hansenula), ou o gene de α amilase {Bacillus). Em certas concretizações, portanto, o ácido nucleico recombinante objeto pode compreender: uma seqüência de sinal que codifica ácido nucleico operavelmente ligado a um ácido nucleico que codifica proteína, onde translação do ácido nucleico em uma célula hospe- deira produz uma proteína de fusão compreendendo uma proteína tendo uma seqüência de sinal N-terminal para secreção da proteína a partir da cé- lula hospedeira.

Em concretizações particulares, a proteína de fusão pode conter uma "proteína veículo", que é uma porção de uma proteína que é endógena a e altamente secretada pela célula hospedeira. Proteínas transportadoras adequadas incluem aquelas de T. reesei mananase I (Man5A, ou MANI), T. reesei celobio-hidrolase Il (Cel6A, ou CBHII) (ver, por exemplo, Paloheimo et al Appl. Environ. Microbiol. Dezembro de 2003; 69(12): 7073-7082) ou T. reesei celobio-hidrolase I (CBHI). Em uma concretização, a proteína trans- portadora é uma proteína truncada de T. reesei CBH1 que inclui a região de núcleo CBHI e parte da região Iigadora CBHI. Uma proteína de fusão con- tendo, de amino-terminal a carbóxi-terminal, uma seqüência de sinal, uma proteína transportadora e uma proteína objeto em ligação operável é, portan- to, provida, bem como um ácido nucleico que codifica a mesma.

Um ácido nucleico recombinante-objeto pode estar presente em um vetor, ou integrado no genoma de uma célula hospedeira. O ácido nucle- ico recombinante pode estar presente em um vetor, por exemplo, um fago, plasmídeo, vetor viral, ou retroviral, que replica autonomamente na célula hospedeira. Vetores para expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica (Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, e outros, Molecular Cloning: A La- boratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

Desde que o meio de cultura descrito acima contém glicerol bru- to, que, em certas concretizações, pode ser o subproduto contendo glicerol das reações usadas para produzir biodíesel ou sabão, o meio de cultura po- de, em certas concretizações, conter traço, quantidades detectáveis, por e- xemplo, menos do que 1%, menos do que 0,5%, menos do que 0,2%, me- nos do que 0,1%, menos do que 0,05%, menos do que 0,01%, menos do que 0,005%, menos do que 0,001%, ou menos do que 0,0005% (v/v) de componentes usados em, ou outros produtos ou subprodutos daquelas rea- ções. Por exemplo, em certas concretizações, um meio de cultura objeto pode conter quantidades traços de alquil ésteres ou sais de alquila dos áci- dos graxos encontrados nos triglicerídeos de óleos de planta, por exemplo, os óleos de colza, óleo de soja, tiol mustarda, palma, cânhamo, jatrofa, óleo de cozimento de despejo ou gorduras animais, por exemplo, sebo, banha de porco, banha amarela ou óleo de peixe, sabão, um catalisador de reação, por exemplo, metóxido de sódio ou silicato de sódio, ou um álcool, por e- xemplo, etanol ou metanol, ácido graxo, cinza, sulfatos, fosfatos, acetatos e e-metóxi, 1,2-propanodiol, dependendo da reação empregada para produzir o glicerol bruto.

Métodos

A cultura de célula acima descrita pode ser produzida usando-se uma variedade de métodos diferentes. Por exemplo, em certas concretiza- ções, um meio de cultura contendo glicerol bruto pode ser produzido, por exemplo, por mistura de todos os componentes do meio de cultura juntos em água, adição do glicerol bruto, e, em seguida, inoculação do meio de cultura com célula hospedeiras. A cultura de célula pode ser mantida sob condições estáveis para crescimento das células em um vaso (por exemplo, em um incubador de oscilação a uma temperatura adequada, tal como temperatura ambiente, 30°C ou 37°C em bioreatores).

Em outras concretizações, o glicerol bruto pode ser adicionado a (por exemplo, misturado com) uma cultura de células. Nestas concretiza- ções, o glicerol bruto pode ser combinado com a cultura de célula rapida- mente, por exemplo, por uns poucos segundos, ou gradualmente, por exem- plo, por uns poucos minutos ou horas. Como tal, em certas concretizações, os métodos-objetos podem incluir culturas de células na ausência de glicerol bruto (isto é, usando uma fonte de carbono que não é glicerol bruto), e, em seguida, adição do glicerol bruto às células. Em outras concretizações, as células são cultivadas na presença do glicerol bruto por um período de tem- po (por exemplo, minutos ou horas) e, em seguida, outra fonte de carbono é adicionada à cultura. Conforme notado acima, o glicerol bruto pode ou não pode ser uma fonte de carbono única para as células da cultura de célula.

Em concretizações particulares, o glicerol bruto pode ser recebi- do de uma localização remota, por exemplo, uma facilidade de fabricação de sabão ou biodíesel que está em uma localização que é remota à localização da cultura de célula, por exemplo, uma cidade ou estado diferente, antes de uso. O glicerol bruto pode ser armazenado e esterilizado antes do uso.

Métodos de uso da cultura de célula acima descrita para produ- zir uma proteína são também providos. Em certas concretizações, os méto- dos de produção de proteína-objeto incluem: manutenção da cultura de célu- la acima descrita para proporcionar produção da proteína. Em certas concre- tizações e conforme discutido acima, a proteína pode ser secretada no meio de cultura. Como tal, certas concretizações do método incluem a etapa de recuperação da proteína a partir do meio de cultura. A proteína produzida pelas células pode ser empregada em uma variedade de métodos.

Em algumas concretizações, uma célula pode ser cultivada sob condições de fermentação em batelada ou contínua. Métodos de fermenta- ção em batelada clássicos usam um sistema fechado, onde o meio de cultu- ra é esterilizado antes do começo do curso de fermentação, o meio é inocu- Iado com o(s) organismo(s) desejado(s), e a fermentação ocorre sem a adi- ção subsequente de quaisquer componentes ao meio. Em certos casos, o pH e teor de oxigênio, mas não o teor de fonte de carbono do meio de cres- cimento, podem ser alterados durante os métodos de batelada. Os metaboli- tos e biomassa de célula do sistema de batelada mudam constantemente até o momento da fermentação ser parado. No sistema de batelada, as célu- las usualmente progridem através de uma fase de Iog estática para uma fase de Iog de alto crescimento e, finalmente, para a fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não-tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrem. Em termos gerais, as células em fases de Iog e estacionária produzem mais proteína.

Uma variação no sistema de batelada-padrão é o sistema de "fermentação alimentada por batelada". Neste sistema, nutrientes (por e- xemplo, uma fonte de carbono, tal como glicerol bruto, fonte de nitrogênio, sais, 02, ou outro nutriente), são adicionados quando sua concentração na cultura cai abaixo de um limite. Os sistemas alimentados por batelada são úteis quando repressão de catabólito está apta a inibir o metabolismo das células, e onde é desejável ter quantidades limitadas de nutrientes no meio. A medição da concentração de nutriente atual nos sistemas alimentados por batelada é estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases de despejo tal como C02. Fermentações em batelada e alimentada por batelada são co- muns e conhecidas na técnica.

A fermentação continua é um sistema aberto onde um meio de cultura definido contendo glicerol bruto é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simul- taneamente para processamento. A fermentação continua geralmente man- tém as culturas em uma densidade alta constante onde células estão princi- palmente em fase de crescimento log.

A fermentação continua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetem o crescimento da célula, e/ou a con- centração do produto final. Por exemplo, em uma concretização, um nutrien- te limitante, tal como a fonte de carbono (glicerol bruto), ou fonte de nitrogê- nio, é mantido a uma taxa fixa, e todos os outros parâmetros são permitidos moderarem. Em outros sistemas, um número de fatores que afetam o cres- cimento pode ser alterado continuamente, enquanto a concentração da célu- la, medida por turbidez do meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos esforçam-se para manter condições de crescimento em estado constante. Desse modo, a perda de célula devido ao meio ser retirado pode ser equili- brada contra a taxa de crescimento da célula na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fer- mentação contínuos, bem como técnicas para maximização da taxa de for- mação de produto, são conhecidos.

A reação de fermentação é um processo aeróbico em que oxi- gênio molecular pode ser suprido por, por exemplo, gás contendo oxigênio molecular, tais como ar ou ar enriquecido de oxigênio. Embora a faixa aera- ção possa variar sobre uma faixa considerável, a aeração é geralmente con- duzida como uma taxa que está na faixa de cerca de 0,5 a 10, preferivel- mente cerca de 0,5 a 7, volumes (na pressão empregada a 25°C) de gás contendo oxigênio por volume de líquido no fermentador por minuto. Esta quantidade é baseada no ar de teor de oxigênio normal sendo suprido ao reator, e, em termos de oxigênio puro, a faixa respectiva seria cerca de 0,1 15 a 1,7 volumes (na pressão empregada e a 25°C) de oxigênio por volume de líquido no fermentador por minuto. A faixa de pressão empregada para o processo de conversão microbial pode variar amplamente. As pressões ge- ralmente estão dentro da faixa de cerca de 0 a 345 kPa (0 a 50 psi).

A temperatura de fermentação pode variar um tanto, mas para fungos filamentosos e bactérias, a temperatura geralmente estará dentro da faixa de 20°C a 45°C, dependendo da cepa e organismo.

A fonte de nitrogênio que é requerida pelos micro-organismos pode ser qualquer composto contendo nitrogênio, ou compostos capazes de liberarem nitrogênio em uma forma adequada para utilização metabólica pe- Io micro-organismo. Conquanto uma variedade de compostos de fontes de nitrogênio orgânicos, tais como proteína de hidrolisatos possam ser usadas, usualmente compostos contendo nitrogênio poucos custosos, tais como a- mônia, hidróxido de amônia, uréia sulfato de amônia, fosfato de amônia, clo- reto de amônia, e outros compostos de amônia, são utilizados. Gás de amô- nia pode ser usado para operações de grande escala, e pode ser emprega- do por borbulhamento através do meio de fermentação aquoso. A faixa de pH em uma fermentação microbial aquosa deve ser na faixa e- xemplar de pH 2,0 a 8.0. Para alguns micro-organismos, o pH estará na fai- xa de pH 3,5 a 6,0 e para outros micro-organismos, o pH preferido será pH 6,0 a 7,5. Conquanto o tempo de fermentação médio varie grandemente de- pendendo do tipo de cultura ou fermentação que é contemplado, em geral o tempo de operação será entre 12 e 400 horas.

O tipo de fermentador empregado não é crítico, embora, por e- xemplo, um Biolafitte de 15L (Saint-Germain-en-Laye-, France) possa ser usado. Em algumas concretizações, o caldo da fermentação conterá geral- mente refugos celulares, incluindo células e vários sólidos suspensos, e po- tencialmente outros contaminantes de biomassa, bem como a proteína dese- jada. A proteína pode ser recuperada do meio de crescimento por qualquer método conveniente, por exemplo, por precipitação, centrifugação, afinidade, filtração, ou qualquer outro método conhecido na técnica.

Em algumas concretizações, a fermentação incluirá uma compo- sição de alimentação de indução para estimular a expressão de proteínas desejadas em certas células hospedeiras. Por exemplo, quando Trichoder- ma é a célula hospedeira e, particularmente, quando Trichoderma é usado como uma célula hospedeira para a produção dos genes de celulase, uma composição de alimentação de indução pode ser utilizada, e referência é feita a WO 04/035070, publicado em 29 de abril de 2004.

Em algumas concretizações, o uso de meio de cultura contendo glicerol bruto proporciona uma quantidade maior de massa de célula e/ou proteína secretada do que outro meio de cultura que somente contém uma fonte de carbono baseada em açúcar. Por exemplo, em certas concretiza- ções, as células cultivadas no meio de cultura contendo glicerol bruto podem produzir pelo menos 2% mais de proteína, pelo menos 5% mais de proteína, pelo menos 10% mais de proteína, pelo menos 50% mais de proteína, pelo menos 100% mais de proteína, ou pelo menos 1000% mais de proteína do que uma cultura equivalente contendo uma fonte de carbono baseada em açúcar (por exemplo, sacarose ou glicose), isto é, uma cultura de célula con- tendo as mesmas células, cultivada em um meio contendo açúcar equivalen- te sob as mesmas condições para a mesma quantidade de tempo. Mais es- pecificamente, uma cultura de célula compreendendo glicerol bruto como a única fonte de carbono pode produzir pelo menos 5% mais proteína do que uma cultura equivalente compreendendo um açúcar de 6 carbonos (por e- xemplo, glicose), ou uma mistura de 6 açúcares de carbono (por exemplo, sacarose, glicose, frutose) como a única fonte de carbono. Em algumas con- cretizações, a massa de célula será a mesma ou maior para células cresci- das em um meio contendo glicerol bruto, conforme comparado a células crescidas equivalentes em uma fonte de carbono baseada em açúcar (por exemplo, glicose ou sacarose, sem glicerol). Por exemplo, a massa de célula conforme medida por gramas de células/kg pode ser 1%, 2%, 3% 5% 10%, 20% ou maior para células crescidas com uma alimentação de glicerol, con- forme comparada a uma alimentação de glicose quando medida no mesmo período de tempo (por exemplo, a 20, 30 ou 40 horas).

EXEMPLOS

De modo a ilustrar adicionalmente a presente invenção e vanta- gens desta, os seguintes Exemplos específicos são dados com a compreen- são que eles estão sendo oferecidos para ilustrar a presente invenção, e não devem ser construídos, de qualquer modo, como limitando seu escopo.

Materiais e métodos adequados para a manutenção e cresci- mento de culturas bacteriais são bem conhecidos na técnica. Técnicas ade- quadas para uso nos Exemplos seguintes podem ser encontradas em Ma- nual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood1 Noel R. Krieg1 and G. Briggs Phillips, eds.), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) ou Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Mi- crobiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass. Todos os reagentes e materiais usados para crescimento e manuten- ção de células bacteriais foram obtidos de Sigma Aldrich (St. Louis, Mo.), GD (Franklin Lakes, NJ), ou QBiogene (Irvine, CA), a menos que, de outro mo- do, especificado.

Na seção de descriçção e experimental que se segue, as se- guintes abreviações aplicam-se: 0C (graus Centígrados); rpm (revoluções por minuto); H20 (água); dh^O (água deionizada); dlhhO (água deionizada, Milli-Q filtration); aa ou AA (aminoácido); bp (par base); kb (par de kilobase); kD (kilodaltons); g ou gm (gramas); pg (microgramas); mg (miligramas); μΙ_ (microlitros); ml e mL (mililitros); mm (milímetro); pm (micrômetro); M (molar); mM (milimolar); μΜ (micromolar); V (volts); MW (peso molecular); seg(s) ou s(s) (segundo/segundos); min(s) ou m(s) (minuto/minutos); hr(s) ou h(s) (ho- ra/horas); DIFCO (DIFCO Laboratories); m/v (massa/volume); e v/v (volu- me/volume); OUR (quantidade de oxigênio usada para respiração por micro- organismos por volume de fermentador unitário na unidade de tempo); D0% (quantidade de oxigênio dissolvido no caldo de fermentação relativa a quan- tidade solúvel máxima conforme medida pela sonda da membrana).

As fontes de glicerol bruto usadas nos Exemplos abaixo são providas na Tabela 1. Tabela 1

<table>table see original document page 28</column></row><table>

M.O.N.G. - Matéria Orgânica Diferente de Glicerol

N.A. - informação não disponível

Exemplo 1

Streptomyces Iividans crescidos em cultura de batelada

Células de Streptomyces Iividans que expressam uma celulase neutral de Cellulomonas foram cultivadas sob condições submersas aeróbi- cas por fermentação em batelada convencional em frascos de sacudir de 500 ml_ com 50mL de volume de operação. O meio de nutriente contém ex- trato de levedura (Biospringer B), sulfato de amônia, ácido cítrico, e sulfato de magnésio, na forma sólida e uma solução de ácido bórico, ácido cítrico, sulfato ferroso, cloreto de manganês, sulfato de zinco, e ou 1% (p/v) de gli- cose ou glicerol bruto.

Referência específica é feita a Patente dos Estados Unidos N0 7.135.309 no Exemplo 16, e Pedido PCT N0. WO 06/071598A1 no Exemplo 2 para uma descrição detalhada de uma cultura e meio de produção que foi usado para cultura de células. Em breve, as culturas em frascos sacudidos de meio rico são iniciadas por inoculação de placas TSA de dois dias de ida- de (tripticase soja agar, BBL N0 11043). Outros meios ricos são ou TSB (cal- do de tripticase soja; BBL N0 11768), Caldo Líquido (que contém por litro: 16g de triptona, 10 g de extrato de levedura, e 5 g de NaCI), meio B (TSB suplementado com por L: 10,0 g de glicerol, 2 mL de Solução de Elemento de Traço Balch Modificada em que NTA é substituído por ácido cítrico, A composição de Solução de Elemento de Traço de Balch Modificada pode ser encontrada em Methods for General e Molecular Bacteriology (P. Gerhardt e outros, eds, p. 158, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994)). As culturas em frascos sacudidos de meio mínimos são iniciadas por inoculação de culturas de TSB líquidas de dois dias de idade usando-se um material usado em inoculação 1/30 (v/v). Os meios mínimos são ou: MM322 (que contém por litro: 12,0 g de glicerol, 11,3 g de K2HPO4, I1O g de (NH4)2SO4l 0,2 g de extrato de levedura Difco, 0,1 g de NaCI, e 10 mL de Solução de Elemento de Traço de Balch Modificada conforme acima, pH final de 6.7 (HCI)); meio D (meio MM322 suplementado com 2 g de Na2C03/L, pH final 7,2); ou meio E (Meio Dm, pH final 6,4). Meios B e C e os meios mínimos são esterilizados por filtro, os outros meios são autoclava- dos.

Em adição, condições de cultura adequadas podem ser encon- tradas na literatura científica, tal como Sambrook (1989), supra; Kieser e ou- tros (2000) Practical Streptomyces Genetics, John Innes Foundation, Nonwich1 UK; e a partir de American Type Cultura Collection (ATCC)1 www.atcc.orq.

Os frascos de sacudir foram incubados a 30°C e sacudidos vigo- rosamente. As amostras foram tomadas com o decorrer do tempo de 5 dias e crescimento de célula (DCW) e produção de proteína foram analisados por ensaio de atividade de celulase. DCW foi medido usando-se OMNIMARK pWave (Omnimark Instruments Corporation, Tempe, AZ). A atividade de ce- lulase foi determinada de acordo com técnicas padrões (ver o ensaio de pla- ca de microtitulação descrito nos Pedidos PCT Nos. PCT/US2005/045859 e WO 06/071598). Os resultados são apresentados nas figuras 1 e 2.

Exemplo 2

Streptomyces Iividans crescido em cultura alimentada em bate- lada

Streptomyces Hvidans expressando uma celulase neutral de Cel- lulomonas foi cultivado sob condições submersas aeróbicas por fermentação alimentada em batelada convencional em um meio de nutriente que é descri- to acima no Exemplo 1. 14 L de fermentações em batelada foram alimenta- dos com uma alimentação de glicose 60% peso/peso (Cargill DE99 dextro- se), ou os 60% peso/peso de glicerol bruto equivalente. A alimentação foi iniciada em taxa de levantamento de oxigênio (OUR em mmol/L-h). A taxa de alimentação foi elevada por várias horas. A taxa de alimentação foi ajus- tada em uma base de carbono igual para alimentação de glicerol. O pH foi controlado em pH 7,0 usando-se 28% p/v de hidróxido de amônia. A tempe- ratura de fermentação foi controlada a 32°C e agitada vigorosamente. Vários outros parâmetros, tais como pH, DO%, fluxo de ar, e pressão foram monito- rados através de todo processo. A % de DO foi mantida acima de 30. As amostras foram tomadas com o curso de tempo de 5 dias, e analisadas para crescimento de célula (DCW) e produção de proteína. Os gráficos das figu- ras 3 e 4 mostram os resultados destes experimentos.

Exemplo 3

Bacillus subtilis crescido em cultura em batelada

Células do micro-organismo Bacillus subtilis que expressam uma protease de serina de B. amyloliquefaciens foram cultivadas sob condições submersas aeróbicas por fermentação em batelada convencional em frascos de sacudir de 500mL com 50 mL de volume de operação. Os meios de nutri- entes continham 7 g/l de farinha de soja (Cargill), 0,03 g/l de sulfato de mag- nésio, 0,22 g/l de fosfato de potássio dibásico, 21 g/l de fosfato de sódio di- básico, e 16 g/l dibásico na forma sólida, e uma solução de 3,6 g/l de uréia, glicose ou glicerol bruto a 5%. O pH após autoclave foi 7,5. Glicose ou glice- rol foi adicionado após esterilização da farinha de soja e meio de sal incluin- do uréia. Outras receitas de meio incluem aquelas descritas em Arbige e outros, Fermentation of Bacillus, páginas 871 - 891 e Ferrari e outros, Com- mercial Production of Extracellular Enzimas, páginas 917 - 937, ambas em Sonenshein e outros, Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bactéria: Bio- chemistry, Physiology and Molecular Genetics, (1993) American Society for Microbiology. Referência específica é feita à Patente dos Estados Unidos N0 7.135.309 no Exemplo 17 para uma descrição da cultura e meio de produção que podem ser usados.

O frasco de sacudir foi colocado a 37°C e sacudido a 170 rpm (acionar agitador 2").

As amostras foram tomadas com o curso do tempo de 2 dias e analisadas para crescimento de célula (densidade ótica a 550 nm; OD550") e produção de proteína. A densidade ótica foi medida usando-se Spectronic Genesys 2 a 550 nm (Sprectronic Analytical Instruments, Garforth, West Yorkshire, UK). A densidade ótica (OD) pode também ser medida por técni- cas que são bem-conhecidas na técnica, por exemplo, conforme descrito em Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Mur- ray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg, e G. Briggs Phillips, eds.). A produção de proteína também determinada con- forme descrito em Estell e outros (1985) J. BioL Chem. 260(11):6518-21. Os gráficos das figuras 5 e 6 mostram os resultados deste experimento.

Exemplo 4

BaciUus subtilis crescido cultura alimentada em batelada

O micro-organismo Bacillus subtilis. que expressam uma protea- se de serina de B. amyloliquefaciens serina foi cultivada sob condições sub- mersas aeróbicas por fermentação alimentada em batelada convencional essencialmente conforme descrito por K. Anstrup (1974) Industrial Aspects of Biochemistry, B. Spencer, ed., pp. 23-46, em um meio de nutriente con- tendo 0-15% de farinha de soja (Cargill), 5-25 g/l de fosfato de sódio e de potássio, 0,5-4 g/l de sulfato de magnésio e uma solução de 5-15 g/l de áci- do cítrico, cloreto férrico e cloreto de manganês. Antes da fermentação, o meio foi macerado por 90 minutos usando-se uma mistura de enzimas inclu- indo celulases, hemicelulases e pectinases (ver, W095/04134). 14 L de fer- mentações em batelada foram alimentados com 60% peso/peso de alimen- tação de glicose (Cargill DE99 dextrose), versadex verdes ou açúcar de in- versão ou os 60% peso/peso de glicerol bruto equivalente (Biodiesel By- Product). A alimentação foi iniciada quando glicose ou glicerol em batelada foram não-detectáveis. A taxa de alimentação foi elevada por várias horas. A taxa de alimentação foi ajustada para adicionar glicerol bruto em uma base de carbono igual. O pH foi controlado em 7 usando-se 28% p/v de hidróxido de amônia. No caso de espumamento, agente anti-espuma foi adicionado ao meio (Mazu DF 204, 1-3 g/L). A temperatura de fermentação foi controlada a 37°C e agitada a 750rpm. Vários outros parâmetros tais como pH, D0%, fluxo de ar, e pressão foram monitorados através de todo o processo. A % de DO% foi mantida acima de 20. As amostras foram tomadas sobre o curso de tempo de 2 dias e analisadas para crescimento de célula (QD550nm) e produção de proteína. O crescimento da célula e produção de proteína foi medido conforme descrito no Exemplo 3. Os gráficos das figuras 7 e 8 mos- tram os resultados destes experimentos.

Exemplo 5

T. reesei crescido em cultura em batelada

Células de Trichoderma reesei que expressam um Trichoderma glucoamilase são cultivadas por fermentação em batelada em frasco de sa- cudir. Os transformantes foram mantidos em meio mínimo de Vogel (Davis e outros, (1970) Methods in Enzymology 17A, págima 79 - 143 e Davis, Ro- wland, Neurospora, Contributions of a Model Organism, Oxford University Press (2000)). Frascos de sacudir com chicanas com 50 mL de ou Iactose ou meio Proflo são inoculados com blocos de ágar de cultura de fungos. O frasco de sacudir é incubado a 30°C e sacudido a 170 rpm (acionar agitador 2"). As amostras são tomadas sobre o curso de tempo de 4 dias e analisa- das para crescimento de célula (peso de célula seco) e atividade de enzima. O peso de célula seco (DCW) é determinado de acordo com o método pa- drão por medição do peso antes e após o processo de secagem em g/kg (MVEVIARK Instrument Corporation μ\Λ/8νβ).

O meio de Iactose consiste em: 10 g/L de lactose; 2 g/L de pep- tona; Ig/L de extrato de levedura; 15g/L de KH2 PO4; 2g/L de (NH4)2 S04; 0,3g/L de MgS04*7H20; 0,3g/L de CaCI2*2H20; ImL/L de solução de estoque de metal de traço.

O meio Proflo é composto de: 22,5g/L de Proflo; 30g/L de lacto- se; 6,5g/L de (NH4)2SO4; 2g/L de KH2 PO4; 0,3g/L de MgS04*7H20; 0,2g/L de CaCI2; 0,72g/L de CaCO3; I ml_/L de solução de estoque de metal de traço e 2 mL/L de 10% de Tween 80.

A solução de estoque de metal de traço de T. reesei usada em ambos os meios tem 5g/L de FeS04*7H20; MnS04*H20 1,6; 1,4g/L de ZnS04*7 H2O; 2,8 g/L de CoCI2*6 H2O.

Em ambos os meios o pH é ajustado para 5,5 usando-se 28% p/v de hidróxido de amônia ou 5N HC1. Glicose ou glicerol bruto são adicio- nados a 1,5% da concentração final a qualquer meio como fonte de carbono adicional suportando crescimento.

Exemplo 6

A. niger crescido em cultura em batelada

Células do fungo Aspergillus niger que expressam um Aspergil- lus glucoamilase foram cultivadas sob condições submersas aeróbicas por fermentação em batelada convencional em frascos de sacudir contendo 50 mL de A. niger em um meio de nutriente adequado por 5 dias. O meio con- tém uma fonte de carbono, por exemplo, maltose ou glicerol bruto, uma fonte de nitrogênio, e sais inorgânicos, usando-se procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas, por exem- plo, em catálogos da American Type Cultura Collection, ou conforme descri- to em Ward e outros Bio/Technology 8:435-440 (1990), na Patente dos Es- tados Unidos N0 5.360.732, ou na Patente dos Estados Unidos N0 7.135.309B1 nos Exemplos 22 e 23.

O meio de nutriente usado neste estudo continha promosoy 100 (concentrado de soja de gordura total, Central Soya Co., Chicago, IL; ver Patente dos Estados Unidos N0 3.971.856) e sulfato de amônia, sulfato de magnésio anidro, (tri) citrato de sódio, fosfato de sódio, conforme descrito em Ward e outros (2004) Appi Environ. Microbioi 70(5):2567-76 e 5% (p/v) de maltose ou glicerol bruto como uma substituição igual. O pH ajustado pa- ra 4,8 com HCI 5 Ν. O meio foi tamponado a pH 4,5 com fosfato de sódio. 1- 3 g/l de Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, Inc., Gurnee, 111.) foi usado como antiespuma. As células foram crescidas por 5 dias a 30°C a 170 rpm (acio- nar agitador 2") com agitação vigorosa. As amostras foram tomadas sobre o curso de tempo de 5 dias e analisadas para crescimento de célula (DCW) e produção de glucoamilase por ensaios padrões (ver Ward e outros (2004) Appi Environ. Microbioi 70(5):2567-76). Os resultados são apresentados nas figuras 9 e 10.

Exemplo 7

Streptomyces rubiginosis crescido em cultura em batelada

Células de Streptomyces rubiginosis que expressam uma glicose isomerase de Streptomyces rubiginosis foram cultivadas sob condições sub- mersas aeróbicas por fermentação em batelada convencional em frascos de sacudir de 500 mL com um volume de operação de 50 mL. Os frascos foram iniciados com 10% de material usado na inoculação de um frasco de semen- te de 24 horas e cultivados em um meio de nutriente adequado por 5 dias. O meio de nutriente continha 4 g/l de extrato de levedura (BD), 2,2 g/l de Cere- lose, 6 g/l de amido de dextrose de batata, 0,5 g/l de ágar técnico e 3,5 g/l de sulfato de amônia e ou 1,4% (p/v) de glicose ou glicerol bruto foi adicionado ao frasco. O pH foi ajustado para 6 com 5 NHCI.

Em adição, condições de cultura adequadas podem ser encon- tradas na literatura científica, tais como Sambrook, (1982) supra; T. Kieser, MJ. Bibb, MJ. Buttner, KF Chater, e D.A. Hopwood, e outros, (2000) PRAC- TICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich UK; e/ou da American Type Cultura Collection (ATCC; www.atcc.oraV

Os frascos sacudidos foram incubados a 30°C e agitados vigo- rosamente. 1 gota por litro de Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, Inc., Gurnee, 111.) foi usada como antiespuma. As amostras foram tomadas sobre o curo de tempo de 30 horas e crescimento de célula (DCW) e produção de proteí- na foram analisadas por ensaio de atividade de glicose isomerase. A ativida- de de glicose isomerase foi determinada de acordo com técnicas-padrão (Patente dos Estados Unidos N°s 4.610.965, 5.384.257, 5.310.665). Os re- sultados são apresentados nas figuras 11 e 12.

Exemplo 8

Hansenula polymorpha crescido em cultura em batelada Hansenula polymorpha expressando uma Iipase fungai recombi- nante (Pedido PCT N0 WO 2005/087918) foi crescido em condições submer- sas aeróbicas por fermentação em batelada convencional em meio YPD (DIFCO). As células foram cultivadas em um frasco de sacudir fernbach com chicanas de 2,8 litros com 0,75 litro de volumes de operação. O meio foi a- justado para pH 6,1 com NaOH ou H2S04. As culturas foram incubadas a 26°C e vigorosamente sacudidas a 170 rpm (acionar agitador 2"). Uma gota por litro Mazu DF204 foi adicionada para controlar espumamento. As amos- tras foram tomadas sobre um curso de tempo de 6 dias e crescimento de célula (C)D550nm) e produção de proteína foram analisados. A atividade de Iipase foi determinada de acordo com o "ensaio TIPU" (Pedido PCT No. WO 2005/087918). Os resultados são apresentados nas figuras 13 e 14.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e Exemplos para proposta de clareza de compreensão, será aparente àqueles versados na técnicas que certas mu- danças e modificações podem ser praticadas sem fugir do espírito e escopo da invenção. Portanto, a descrição não deve ser construída como limitando e escopo da invenção, que é delineada pelas reivindicações em anexo.

Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente aqui cita- dos são, desse modo, incorporados por referência em suas totalidades para todas as propostas, e para a mesma extensão como se cada publicação in- dividual, publicação, patente, ou pedido de patente fossem especificamente e individualmente indicados para serem, assim, incorporados por referência.

Claims (13)

1. Método para produção de uma proteína em uma célula hos- pedeira, compreendendo cultura de referida célula hospedeira em um meio de cultura que compreende glicerol bruto como uma fonte de carbono, no qual referida célula hospedeira compreende um ácido nucleico recombinante que codifica referida proteína.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido gli- cerol bruto é provido como a fonte de carbono única no meio de cultura.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o meio de cultura compreende adicionalmente um carboidrato como uma fonte de car- bono em adição a referido glicerol bruto.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida cé- lula hospedeira é uma célula bacterial.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referida cé- lula bacterial é selecionada de Streptomyces lividans, Bacillus subtilis, e S- treptomyces rubiginosis.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida cé- lula hospedeira é uma célula de fungo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual referida cé- lula de fungo é Aspergillus niger ou Hansenula polymorpha.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida proteína é uma enzima.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a célula hospedeira é cultivada sob batelada, batelada alimentada, ou condições de fermentação contínua.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida proteína é nativa à referida célula hospedeira.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida proteína é heteróloga à referida célula hospedeira.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida proteína é secretada no meio de cultura, e no qual o método compreende adicionalmente recuperação da proteína a partir do meio de cultura.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido glicerol bruto está presente no referido meio de cultura a uma concentração de 0,1 % a 75% (v/v).