BRPI0720192A2

BRPI0720192A2 - Método para gerar ou aumentar uma resistência a pelo menos um fungo biotrófico em uma planta ou uma parte de uma planta, seqüência de polipeptídio artificial, seqüência de ácido nucléico artificial, cassete de expressão recombinante, vetor recombinante, e, microorganismo recombinante

Info

Publication number: BRPI0720192A2
Application number: BRPI0720192-3A
Authority: BR
Inventors: Holger Schultheiss; Markus Frank; Caroline Hoefle
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2013-12-31
Also published as: ES2389689T3; WO2008049865A3; EP2081954B1; WO2008049865A2; US8373022B2; CA2660439C; CA2660439A1; EP2081954A2; US20100088777A1

Description

“MÉTODO PARA GERAR OU AUMENTAR UMA RESISTÊNCIA A PELO MENOS UM FUNGO BIOTRÓFICO EM UMA PLANTA OU UMA PARTE DE UMA PLANTA, SEQÜÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO ARTIFICIAL, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO ARTIFICIAL, CASSETE DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, VETOR RECOMB IN ANTE, E, MICROORGANISMO RECOMBINANTE”

A presente invenção se refere a métodos para gerar ou aumentar resistência a pelo menos um patógeno biotrófico em uma planta ou uma parte de uma planta aumentando a quantidade de proteína ou função de pelo menos uma proteína, inibidor de Bax-I (BI-1), em pelo menos uma parte da planta. Além disso, a invenção se refere a seqüências de polipeptídeos e seqüências de ácidos nucleicos que codificam para uma proteína BIl, e o cassetes de expressão, vetores e organismos que compreendem tais seqüências ou uma tal proteína, em particular a plantas recombinantes, a culturas, partes ou material de propagação recombinante derivado destes, e ao uso dos mesmos para a produção de gêneros alimentícios, rações, grãos, produtos farmacêuticos ou químicos finos.

O cultivo de plantas cultiváveis agrícolas serve principalmente para a produção de gêneros alimentícios para humanos e rações para animais. Os últimos 25 anos viram aumentos de produção pronunciados em produção de culturas. Este foi o resultado de uma boa combinação de técnicas alteradas de produção, variedades recentemente desenvolvidas, fertilização e, finalmente, mas não menos importante, proteção aumentada de culturas. À luz de uma sempre crescente população mundial, salvaguardar produção de alimentos ganha importância progressivamente. Foi estimado que 7 bilhões de pessoas vão habitar a Terra em 2010. Para alimentar todas essas pessoas, sem crescer a proporção de pessoas subnutridas, produção de alimentos teria que ser aumentada em 60% (Entrup N.L. et al., Lehrbuch des Pflanzenbaues [Textbook of crop production], Thomas Mann Verlag, Gelsenkirchen, 2000). Proteção eficiente de cultura é um fator decisivo neste contexto. Monoculturas em particular, que são a regra hoje em dia, são altamente susceptíveis a uma propagação tipo epidérmica de doenças. O resultado são produções marcadamente reduzidas. Até o momento, os organismos patogênicos foram controlados principalmente usando pesticidas. Hoje em dia, em contraste, a possibilidade de modificar diretamente a disposição genética de uma planta ou patógeno é aberta ao homem.

Fungos são distribuídos ao redor do mundo de forma que eles podem formar um grupo heterogêneo com uma variedade de espécies. Eles são eucariotos, não contêm clorofila e, portanto são heterotróficos. Por conseguinte, eles recorrem a fontes externas de carbono que eles exploram como parasitas, saprófitos ou simbiontes. Saprófitos vivem exclusivamente em material vegetal morto. Fungos parasíticos se alimentam de tecido vivo devem concluir seu desenvolvimento antes da planta morrer. Parasitas facultativos podem se alimentar tanto de tecido vivo como morto. Simbiontes, tal como micorriza, vivem em estreita associação com as plantas. Fungos têm um ou mais núcleos por célula e são homocarióticos ou heterocarióticos. Fungos têm uma parede celular firme durante pelo menos um estágio em sua história de vida. Esta parede celular normalmente consiste de quitina ou, em alguns casos tal como os Oomycota, de celulose. A parte vegetativa do fungo (talo) normalmente é haplóide, em raros casos diplóide. O talo de fungos inferiores (Myxomycota, entre outros) consiste de células amebóides ou plasmódios (protoplasma polinuclear nu). Eumycota têm células germinativas, como no caso de leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), ou formam um micélio que consiste de hifas parecidas com fios. Como o resultado de agregação de hifas, órgãos específicos para propagação (corpos de frutificação) ou para sobreviver a condições ambientais desfavoráveis (esclerótia) podem ser formados. Propagação e multiplicação normalmente é como forma de esporos; assexualmente por meio de conídios, uredósporos, esporangiósporos, clamidósporos e zoósporos, e sexualmente com oósporos, ascósporos, zigósporos e basidiósporos.

Aproximadamente 100 000 diferentes espécies fungicas são conhecidas até o momento. Dentre estas, entretanto, apenas 5% são patógenos vegetais. Os Basidiomycota são uma divisão dos fungos verdadeiros que são caracterizados pelo desenvolvimento de uma estrutura particular, o basídio, na qual os basidiósporos amadurecem. Os Basidiomycota também incluem os cogumelos geralmente conhecidos. Os Basidiomycota são predominantemente heterotálicos e auto-estéreis. Reprodução ocorre por somatogamia. Durante somatogamia, dois micélios ou esporídios mononucleares haplóides compatíveis coalescem. O micélio dicariótico resultante constitui a fase dominante do ciclo de vida por um período prolongado. Os únicos dois gêneros fitopatogênicos dos Basidiomycota são as fuligens (Ustilages) e as ferrugens (Uredinales). Fuligens atacam apenas angiospermas e costumam ser de grande importância econômica. Hoje em dia elas são controladas de forma bem sucedida por substâncias ativas adequadas e rígido controle de grãos. As ferrugens são ainda de alguma maneira mais importantes hoje em dia. Elas são biotróficas e podem ter um ciclo de desenvolvimento complicado com até cinco diferentes estágios de esporos (espermácio, aecidiósporo, uredósporo, teleutósporo e basidiósporo). Ferrugens que desenvolvem todos os estágios de esporos são referidas como ferrugens macrocíclicas. Se alguns estágios estão ausentes, estas ferrugens são referidas como sendo macrocíclicas. "Ferrugens imperfeitas" carecem dos basidiósporos. Algumas ferrugens mudam seus hospedeiros durante seu desenvolvimento. Estas são referidas como heteroécias. Altemação de hospedeiro pode estar ligada a altemação de fase nuclear. Em contraste, ferrugens autoécias completam todo o seu desenvolvimento em um hospedeiro. Um exemplo tradicional de uma ferrugem macrocíclica heteroécia é ferrugem negra de cereais, Puccinia graminis. P. graminis, em seu estágio dicariótico, ataca predominantemente trigo. O haplonte é patogênico para bérberis (Bõmer H., Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz [Plant disease and plant protection], Ulmer Verlag Stuttgart, 1997; Sitte P. et al., Strasburger - Lehrbuch der Botanik [Textbood of Botany], Gustav Fischer

5 Verlag, Stuttgart, 1998; Entrup N.L. et al., Lehrbuch des Pflanzenbaues [Textbook of crop production], Thomas Mann Verlag, Gelsenkirchen, 2000).

Durante a infecção de plantas por fungos patogênicos, diferentes fases são normalmente observadas. As primeiras fases da interação entre fungos fitopatogênicos e suas plantas hospedeiras potenciais são 10 decisivas para a colonização da planta pelo fungo. Durante o primeiro estágio da infecção, os esporos se tomam acoplados à superfície das plantas, germinam, e o fungo penetra na planta. O acoplamento dos esporos requer ou um metabolismo ativo, o que é o caso em Colletotrichum graminicola, ou ele é passivo, como é o caso com Magnaporthe grisea. No último caso, umidade 15 leva à secreção de um "adesivo de mucilagem", por meio do qual o esporo se acopla (Howard R.J. et al., Annu. Rev. Microbiol. 50, 491 (1996))- Germinação de esporo é induzida ou por indutores inespecíficos tal como água, nutrientes, etileno ou, mais raramente, como é o caso em Phyllosticta ampelicida, por superfícies hidrofóbicas (Kuo K. et al., Fungai Genet. Biol.

20, 18 (1996)). Alguns fungos desenvolvem dois tubos germinativos, como é o caso em oídio de cereais, Blumeria graminis, enquanto que outros fungos desenvolvem apenas um tubo germinativo (Green J.R. et al., The powdery mildews, a comprehensive treatise; The formation and function of infection and feeding structures, APS Press, 2002). Fungos podem penetrar na planta

através de portas existentes tal como estômatos, lenticelas, hidatódios e lesões, ou ainda eles penetram na epiderme vegetal diretamente como o resultado da força mecânica e com o auxílio de enzimas que digerem parede celular. Estruturas específicas de infecção são desenvolvidas para penetração da planta. Estes órgãos de pressão são referidos como apressórios e permitem que o fungo estabeleça uma alta pressão acima de um ponto distinto. É estimado que apressório de M. grisea atinja uma pressão de 80 bar (Howard RJ. et al., Annu. Rev. Microbiol. 50, 491 (1996)). A maioria das ferrugens, em contraste, penetra na planta através dos estômatos. A ferrugem de soja Phakopsora pachyrhizi penetra diretamente na epiderme vegetal e, portanto parece oídio de cereais, B. graminis, em seu comportamento de penetração (Koch E. et al., Phytopath. p. 106, 302 (1983); Tucker S.L. et al., Annu. Rev. Phytopathol. 39, 385 (2001); Green J.R. et al., The powdery mildews, a comprehensive treatise; The formation and function of infection and feeding structures, APS Press, 2002).

Fungos fitopatogênicos nem sempre colonizam toda a planta; em contraste, algumas vezes são apenas áreas ou tecidos específicos que são colonizados. Seguindo a invasão bem sucedida da planta, fungos fitopatogênicos seguem diferentes estratégias nutricionais. Patógenos pertotróficos ou necrotróficos matam as células hospedeiras por meio de enzimas ou toxinas extracelulares e se alimentam degradando as células mortas. Alguns gêneros com nutrição pertotrófica são os Fusaria sp., Alternaria sp. e Cochliobolus. A maioria dos fungos usa esta estratégia de alimentação. Os fungos fitopatogênicos biotróficos, tal como mofo e muitas ferrugens, dependem, para sua nutrição, no metabolismo de células vivas. Uma posição intermediária é ocupada pelos fungos patogênicos hemibiotróficos, os quais incluem os gêneros Phythophtora e Peronospora. A maioria destes é biotrofo no começo de seu desenvolvimento e apenas mudam para um estilo de vida pertotrófico durante os estágios tardios de seu desenvolvimento (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen [Interactions between plants and phytopathogenic fungi], Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996). As plantas desenvolveram mecanismos de defesa para evitar infecção. Outra posição intermediária é ocupada, por exemplo, por ferrugem da soja, que penetra na epiderme diretamente, em conseqüência do que a célula penetrada se toma necrótica; depois da penetração, o fungo muda para um estilo de vida obrigatoriamente biotrófico. O subgrupo dos patógenos fúngicos biotróficos que segue essencialmente uma tal estratégia de infecção irá, para os propósitos da presente descrição, ser referido como sendo "heminecrotrófico".

Deve ser enfatizado que plantas, durante seu desenvolvimento, são expostas a ataque constante por um grande número de organismos fitopatogênicos. Contudo, colonização da planta por organismos fitopatogênicos é a exceção ao invés da regra. Antes que um patógeno possa atacar a planta, ele tem que superar uma série de barreiras. Freqüentemente, o patógeno desenvolveu fatores específicos de patogenicidade que são adaptados à planta, conhecidos como fatores de virulência, a fim de superar estas barreiras. Em um tal caso, a planta se toma uma planta hospedeira para o patógeno, i.e. o último é virulento na planta. Existe uma compatibilidade básica entre a planta e o patógeno. Isto significa que os pré-requisitos fisiológicos e bioquímicos que são requeridos para a colonização já estão em existência ou foram produzidos (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen [Interactions between plants and phytopathogenic fungi], Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996). No caso de interação compatível, o patógeno se desenvolve às custas da planta, assim causando a formação de sintomas de doença tal como emurchecimento, necroses e cloroses. Entretanto, se compatibilidade básica existe, a planta pode ainda se defender contra o patógeno quando uma mutação de resistência ocorreu na planta. A resistência da planta, assim adquirida, é referida como resistência de hospedeiro. Se é dirigida apenas contra um certo patógeno individual e pode ser superada prontamente pelo último. Os patógenos em questão são principalmente, mas não sempre, patógenos biotróficos. Resistência de patógeno pode ser subdividida em resistências horizontais não específicas para raça que, na maioria dos casos, envolve diversos genes, e resistência específica para raça. A última é efetiva apenas contra certas raças individuais de um patógeno, enquanto que a planta se defende a priori contra a maioria de patógenos. Este fenômeno é referido como incompatibilidade básica ou resistência de não hospedeiro. Em contraste a resistência de hospedeiro, resistência de não hospedeiro é baseada em uma série de causas e não em genes individuais. Primeiramente, o patógeno pode carecer dos fatores de patogenicidade necessários, ou ainda a planta é capaz de reconhecer, e se defender com sucesso, contra o patógeno. Outro termo que é importante em particular para agricultura é tolerância. Uma planta é tolerante a um patógeno quando ela pode ser atacada, mas o ataque não leva ao desenvolvimento de sistemas de doença e redução de produção (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen [Interactions between plants and phytopathogenic fungi], Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996). Para os propósitos da descrição da presente invenção, gerar, ou aumentar, uma resistência deve compreender um aumento ou geração de qualquer tipo de resistência, mas também de tolerância, i.e. em particular todos os casos de uma tolerância ou resistência aumentada que podem levar a perdas reduzidas de produção como causadas pelo patógeno.

Em conexão com respostas de resistência de plantas, o termo fatores de resistência inclui estruturas, substâncias e processos que previnem ou inibem ataque da planta por patógenos potenciais. Se os fatores de resistência já estão constitutivamente presentes na planta, eles são referidos como fatores de resistência pré-formados. Fatores de resistência induzidos são apenas formados quando uma resposta de reconhecimento entre a planta e o patógeno potencial ocorreu. Reconhecimento pode ser descrito como uma resposta sinal/sensora (modelo elicitor/receptor, Keen N.T. et al., Phytopathology 62, 768 (1972)). O sinal são substâncias vegetais ou substâncias produzidas pelo patógeno, conhecidas como elicitores, que se ligam a um sensor ou receptor que é específico para o elicitor em questão. Esta ligação desperta um ou mais efetores, que podem ser, por exemplo, cadeias de transdução de sinal e induzem a resposta de resistência. Uma série completa de substâncias atuam como elicitores. Estas incluem proteínas, glicoproteínas, glucanas e lipídios (Garcia Brugger et al., MPMI 19, 711 (2006)). Produtos de degradação de parede celular vegetal que são liberados por enzimas do patógeno ou ainda por lesão da planta também podem induzir uma resposta de resistência. Neste contexto, um fator de avirulência do patógeno e o gene de resistência correspondente da planta é freqüentemente mencionado ("Gene-for-gene hypothesis", Flor, J. Agric. Res. 74, 241 (1947)). O patógeno pode prevenir reconhecimento pela planta por meio de modificações estruturais do elicitor, mascaramento da seqüência de reconhecimento ou por competição com outra substância pelos sítios de ligação no elicitor ou receptor.

Fatores de resistência pré-formados formam a primeira defesa contra colonização por organismos patogênicos. Estes fatores podem ser fatores morfológicos ou ainda substâncias do metabolismo secundário da planta (fitoanticipinas). Fatores morfológicos que previnem colonização são folhas peludas, densidade estomatal e formato, e a natureza da cutícula e da parede celular.

Reconhecimento, do patógeno, pela planta também pode levar à indução de fatores de resistência, i.e. respostas de resistência morfológicas e

fisiológicas. Muitas destas respostas são o resultado de uma cascata de sinais.

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Moléculas sinais tal como Ca , NO, compostos reativos de oxigênio e fitormônios tal como etileno e jasmonato estão envolvidos nas cascatas e contribuem para a reticulação das vias de sinalização. Respostas de resistência nas quais estruturas morfológicas na célula vegetal são modificadas são a formação de aposições da parede celular (papilas), camadas de cortiça e abscisão, tilas e a impregnação da parede celular. O começo de penetração por um fungo patogênico pode desencadear a formação de papilas. Lignina, calose, suberina e proteínas ricas em hidroxiprolina são depositadas na parede celular interior oposta ao sítio potencial de penetração e são reticuladas com uma outra. Calose pode ser corada pela intercalação de anilina azul. Em adição, a papila formada acumula fenóis, espécies reativas de oxigênio e hidrolases (Hückelhoven R. et al., Plant Physiol. 119, 1251 (1999); Assaad F.F. et al., Mol. Biol. of the Cell, 15, 5118 (2004)). O desenvolvimento de papilas leva a uma parede celular substancialmente espessada e pode prevenir penetração do fungo patogênico. Processos fisiológicos que contribuem para resistência induzida são despolarização da membrana celular, o metabolismo oxidativo, a reação hipersensível, a formação de fitoalexinas e a expressão de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR). Uma das primeiras respostas para entrar em contato com um elicitor é a despolarização da membrana celular. Isto resulta em um efluxo pronunciado de íons Cl" e K+, ligado com perda pronunciada de água. É assumido que despolarização desencadeia uma concentração aumentada de Ca2+, que é uma molécula sinal importante (Ward J.M. et al., Plant Cell 7, 833 (1995)) e desempenha um papel na reação hipersensível (HR) (Wendehenne D. et al., Plant Cell 14, 1937 (2002)). HR em plantas é uma forma de morte celular programada. Ela permite que a planta pare o fungo mesmo depois de penetração do último negando a este uma fonte de nutrientes. O curso de HR parece depender da combinação de planta e patógeno. Entretanto, biossíntese de proteínas, um citoesqueleto intacto e ácido salicílico parecem ser necessários para induzir HR (Heath M., Plant Mol. Biol. 44, 321 (2000)).

Uma resposta muito rápida ao patógeno é o metabolismo oxidativo, a formação de espécies reativas de oxigênio, tal como o ânion superóxido O2", o radical hidroxila OH e peróxido de hidrogênio. Estes compostos são formados por várias oxidases. O radical hidroxila atua localmente, enquanto que H2O2 pode se difundir através das membranas. Ambos oxidam ácidos graxos poliinsaturados e podem assim destruir membranas (Grant J.J. et al., Plant Physiol. 124, 21 (2000)). H2O2 também é suspeito de realizar uma função em regulação gênica. Em adição, os compostos auxiliam as respostas de defesa reticulando os componentes de parede celular, aumentando lignificação e exercendo um efeito tóxico em patógenos (Garcia-Brugger A. et al., MPMI 19, 711 (2006)). Finalmente mas não menos importante, o ataque de patógeno leva à expressão de genes que codificam para proteínas PR e para fitoalexinas. Proteínas PR são um grupo heterogêneo de proteínas que têm um efeito tóxico em fungos penetrantes. O termo fitoalexinas se refere a substâncias antimicrobianamente ativas de baixo peso molecular cuja síntese é desencadeada por estresse biótico ou abiótico (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen [Interactions between plants and phytopathogenic fungi], Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996; van Loon L.C. et al., Physiol. Mol. Plant Physiol. 55, 85 (1999)). As respostas descritas procedem parcialmente não apenas quando o patógeno interage com uma planta hospedeira, mas também quando ele reage com uma planta não hospedeira. Decisiva para defesa de patógeno é a qualidade do reconhecimento e a quantidade e velocidade da resposta de resistência (Thordal-Christensen H., Current Opinion in Plant Biology 6, 351 (2003)).

Uma doença vegetal que se tornou crescentemente importante em tempos recentes é ferrugem da soja. A doença é causada pelas ferrugens patogênicas Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur). Elas pertencem à classe Basidiomycota, ordem Uredinales, família Phakopsoraceae. As duas espécies são muito intimamente relacionadas uma com a outra. As seqüências intergênicas de seus genes de rRNA mostram 80% de similaridade (Frederick R.D. et al., Phytopathology 92, 217 (2002)). As espécies são distinguidas por características morfológicas dos teliósporos (Ono Y. et al., Mycol. Res. 96, 825 (1992)). Ambas as ferrugens infectam um amplo espectro de plantas hospedeiras. P. pachyrhizi, também referida como ferrugem da soja Asiática, é o patógeno mais agressivo em soja (Glycine max), e é, portanto, pelo menos atualmente, de grande importância para agricultura. P. pachyrhizi é capaz de infectar 31 espécies de 17 famílias de Leguminosae em condições naturais e é capaz de crescer em 60 espécies adicionais em condições controladas (Sinclair et al. (eds.), Proceedings of the soybean rust workshop (1995), National Soybean Research Laboratory, Publication No. 1 (1996); Rytter J.L. et al., Plant Dis. 87, 818 (1984)). P. meibomiae foi encontrado na Bacia do Caribe e em Porto Rico, e não causou dano substancial ainda.

P. pachyrhizi foi originalmente descoberto no Japão em 1902. A partir de então, P. pachyrhizi se espalhou por grandes partes da Ásia e pela índia e Austrália e, finalmente, atingiu África em 1996. Em 2001, o fungo chegou à América do Sul e atingiu os Estados Unidos da América pela primeira vez em 2004 (Sconyers E.L. et al., www.ers.usda.gov/Features/SoyBeanRust/ (2005)). Na América do Sul em particular, P. pachyrhizi causou grandes perdas de produção de até 80%. É estimado que 1,5 milhão de toneladas da colheita de 2005/2006 de soja Brasileira apenas tenham sucumbido à infecção com ferrugem da soja. P. pachyrhizi é uma ferrugem cíclica que forma três tipos de esporos. A formação de teliósporos foi observada na Ásia na direção do fim do período de vegetação (Yeh C.C. et al., Phytopathology 71, 1111 (1981)). A formação de basidiósporos, em contraste, é conhecida apenas em condições laboratoriais. A forma de esporo mais importante são os uredósporos, que são formados pelo período inteiro de vegetação e que servem para espalhar a doença. Estes esporos são formados em grandes quantidades são capazes de se espalhar por amplas distâncias com o auxílio de vento e chuva. P. pachyrhizi é um biotrofo obrigatório. Se um uredósporo chega a um hospedeiro adequado, ele germina com um único tubo germinativo. Na extremidade deste tubo germinativo, um apressório se desenvolve e rapidamente atinge o tamanho do esporo. Com o apressório, o fungo é capaz de estabelecer uma grande pressão e de penetrar nas células epidérmicas diretamente com o auxílio de uma hifa de penetração. A hifa de penetração de P. pachyrhizi cresce através da célula epidérmica e, uma vez que ela atinge o espaço intracelular na folha, forma o primeiro septo. Ela agora continua a crescer na folha como uma hifa primária. Tão cedo quanto 24-48 h depois da infecção, a primeira célula-mãe haustorial é dividida por um septo, e um haustório saciforme é formado em uma célula de mesófilo da folha. A parede celular da célula de mesófilo é penetrada, mas o plasmalema é apenas dobrado, de forma que a célula permanece viva e pode atuar como uma fonte de nutrientes. Os nutrientes vão da membrana da célula hospedeira viva através da matriz extrahaustorial até o haustório. A célula epidérmica que foi penetrada no começo se torna necrótica logo depois de penetração. Esta maneira de infecção de um patógeno biotrófico, como é usado por P. pachyrhizi, portanto será referida como "heminecrotrófica" para os propósitos da descrição da presente invenção. Os primeiros uredósporos são encontrados apenas 11-12 dias depois da infecção, e o ciclo pode começar mais uma vez (Koch E. et al., Phytopath, p. 106, 302 (1983)).

A planta cultivável soja Glycine max (L.) Merr. pertence à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, gênero Glycine Willd. e subgênero soja (Moench). Soja é plantada em mais do que países. Algumas das áreas de produção mais importantes estão localizadas nos Estados Unidos da América, China, Coréia, Argentina e Brasil. Ela é considerada como sendo uma das plantas cultiváveis mais antigas e foi domesticada pela primeira vez na China entre os séculos 11 e 17 (Hymowitz T., Econ. Bot. 24, 408 (1970)). Ela foi introduzida nos Estados Unidos da América em 1765; os Estados Unidos da América são atualmente uma das maiores áreas de produção de soja. Espécies selvagens de soja podem ser encontradas na China, Coréia, Japão, Taiwan e na antiga URSS. Evidência morfológica, citológica e molecular sugere que G. soja é o ancestral da forma cultivada G. max. Sendo uma planta subtropical, sojas preferem uma temperatura anual média de 5,9-27°C; elas não são resistentes a congelamento (OECD, Consensus document on the biology of Gycine max (L.) Merr. (Soybean); Series on harmonization of regulatory oversight in biotechnology No. 15, ENV/JM/MONO(2000)9). Sojas são atualmente uma importante fonte de óleo e proteína. Este uso extensivo de soja em produção de alimentos realça a importância de controle eficiente de ferrugem da soja.

Plantas de soja são infectadas por P. pachyrhizi por uredósporos dispersos pelo vento. Os primeiros sintomas discerníveis são pequenas lesões amarelo a marrom avermelhado na superfície superior da folha, que depois se espalham mais até que toda a folha finalmente se torna clorótica e morre. Mediante infecção avançada, as lesões são encontradas em toda a planta. Os primeiros urédios têm um diâmetro de 100-200 μιη e são encontrados na parte de baixo da folha 10-14 dias depois da infecção; eles podem produzir esporos por três a seis semanas. Télios são formados subepidermicamente e ocorrem principalmente na periferia das lesões. Os esporos primeiro são amarelos a marrons e depois se tornam pretos. Os primeiros sintomas freqüentemente são primeiro observados nas folhas mais velhas. O rápido desenvolvimento da doença se correlaciona com o começo de florescimento (RI+) e finalmente destrói toda a folhagem. O fato de que a maioria da área fotossinteticamente ativa é destruída e de que água e nutrientes são extraídos pelo fungo leva a produtividade reduzida da planta (Sconyers E.L. et al., www.ers.usda.gov/Features/SoyBeanRust/ (2005)).

A fim de germinar, P. pachyrhizi requer umidade na forma de orvalho ou os semelhantes na superfície superior da folha. O fungo é encorajado em particular por chuva freqüente e temperaturas de entre 15 e 29°C (Sconyers E.L. et al., www.ers.usda.gov/Features/SoyBeanRust/ (2005)). Freqüentemente, a doença começa em localizações distintas e subseqüentemente se espalha rapidamente pelo campo inteiro. O fungo é autoécio, i.e. ele não requer nenhuma alternação de hospedeiro para seu desenvolvimento, e ele pode persistir prontamente em suas numerosas plantas hospedeiras alternativas. Nos Estados Unidos da América, videira Kudzu (Pueraria lobata), que se origina no Japão, é considerada como sendo uma planta hospedeira potencial na qual P. pachyrhizi pode hibernar e fornecer inóculo novo na próxima primavera.

P. pachyrhizi pode ser atualmente controlado no campo apenas por meio de fungicidas. Plantas de soja com resistência ao espectro inteiro dos isolados não estão disponíveis. Ao buscar por plantas resistentes, quatro genes dominantes Rpp 1-4, que mediam resistência de soja a P. pachyrhizi, foram descobertos; entretanto, esta resistência é apenas específica de isolado (Hartwig E.E. et al., Crop Science, 23, 237 (1983); Hartwig E.E., Crop Science 26, 1135 (1986)). Uma vez que a resistência foi apenas baseada em genes individuais, ela foi perdida rapidamente. Apenas a resistência mediada por Rpp4 até agora foi derrubada apenas em condições de casa de vegetação (Posada-Buitrago M.L. et al., Fungai Genetics and Biology 42, 949 (2005). A utilização de fontes potenciais de resistência de representantes do subgênero de soja perene é limitada (Hartman G.I. et al., Plant Disease 76, 396 (1992)). Até agora, todos os cruzamentos levaram apenas a progênie estéril (Singh R. et al., Wendl. Theor. Appl. Genet. 74, 391 (1987).

O controle eficiente de ferrugem da soja com fiingicidas requer pouca aplicação na folhagem das plantas, uma vez que infecção ocorre primeiro nas folhas inferiores. Um tratamento duplo mostrou ser efetivo. Uma desvantagem dos fungicidas usados é que, como o resultado de seu mecanismo específico de ação, resistências podem se desenvolver prontamente. Uma alternativa potencial ao uso de fungicidas é o uso de plantas de soja resistentes a glifosato. Em um experimento em casa de vegetação, plantas de soja foram tratadas com o herbicida três dias antes de inoculação, e uma redução de lesões causadas por ferrugem de 46-70% foi observada (Feng C.C.P. et al., PNAS 102, 17290 (2005)). Se este efeito também será mantido em experimentos de campo permanece por ser visto.

Nos anos recentes, P. pachyrhizi ganhou em importância como peste em produção de soja. Houve, portanto uma demanda na arte anterior por desenvolver métodos de controlar o fungo. Agora, não pode ser esperado que melhoramento vegetal contribua uma vez que as fontes disponíveis de resistência não estão acessíveis. Tratamento com fungicidas tem uma eficiência limitada e é efetivo apenas quando a doença ainda está para invadir. Isto é porque em particular o patossistema soja/P. pachyrhizi é o método de escolha para uma abordagem recombinante. Para que uma abordagem seja bem sucedida, é inicialmente importante ter conhecimento detalhado do curso de infecção e da resposta da planta, em particular durante os primeiros estágios da infecção. Genes candidatos potenciais que conferem resistência devem ser identificados, e seu efeito na interação entre planta e patógeno deve ser caracterizado. A transformação estável de plantas é muito consumidora de tempo e custosa, que é o porquê transformação transiente, que torna possível uma caracterização da interação planta/patógeno no nível celular, é preferida. O método de escolha aqui é a transformação transiente de folhas com a pistola de genes. Em plantas, resistência de não hospedeiro é particularmente efetiva e durável e baseada no fato de que quantidade e velocidade da resposta de resistência é aumentada em comparação com a resposta de compatibilidade. Assim, a caracterização de genes decisivos em resistência de não hospedeiro pode servir para identificar genes candidatos potenciais para a geração de plantas resistentes. Assim, para também estudar a resposta de uma planta não hospedeira a ferrugem da soja, o sistema cevada (Hordeum vulgare)/P. pachyrhizi foi escolhido uma vez que cevada é uma planta modelo que foi descrita em detalhe. Além disso, o patossistema cevada/ com Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) e com Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt), que é incompatível, foi estudado em grande detalhe. Embora Bgh e P. pachyrhizi difiram em alguns respeitos, eles compartilham pelo menos fenotipicamente algumas etapas no começo do processo de infecção. Assim, a análise em cevada pode fornecer informação sobre os mecanismos da resistência de não hospedeiro a P. pachyrhizi em comparação com a resistência de hospedeiro de cevada. Assim, genes candidatos foram testados em folhas de cevada transientemente transformadas para seu efeito na resistência a P. pachyrhizi. A transformação transiente com a pistola de genes fornece um método de estudar, no patossistema cevada/P. pachyrhizi, uma série de genes que podem estar envolvidos na resposta de resistência.

Morte celular programada (PCD) é um processo importante no desenvolvimento e resposta a estresse de plantas e animais. Algumas mudanças morfológicas e bioquímicas na célula, tal como condensação de cromatina, contração do citoplasma e fragmentação de DNA, parecem ser compartilhadas por plantas e animais (Lam E. et al., Nature 411, 848 (2001)). Uma clara distinção entre PCD e HR, que é causada por estresse biótico ou abiótico, não é possível (Heath M., Plant Mol. Biol. 44, 321 (2000)). Um ativador de PCD em animais é ΒΑΧ. BAX desenvolve canais na membrana mitocondrial externa e causa a liberação de citocromo c. Isto desencadeia uma cascata de caspase, e assim a proteólise de proteínas a qual a célula necessita para sobreviver (Green D.R. et al., Science 281, 1309 (1998). A superexpressão de BAX em tabaco (N. tabacum, Lacomme C. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 96, 7956 (1999)) e Arabidopsis thaliana (Kawai-Yamada M. et al., Plant Cell 16, 21 (2004)) causa PCD e assim sugere mecanismos similares em plantas e animais. Entretanto, nenhum homólogo de BAX foi identificado em plantas. Entretanto, um regulador antagonístico de BAX de PCD, o inibidor de Bax-I (BI-1), é conservado em plantas, animais e outros organismos tal como levedura. Proteínas similares foram identificadas desde então em A. thaliana, H. vulgare, Brassica napus, Brassica oleracea, Oryza sativa e Ν. tabacum (Hückelhoven R., Apoptosis 9, 299 (2004)). Em experimentos com proteínas de fusão BI-l/GFP, uma localização de BI-I na membrana do retículo endoplasmático (ER) e na membrana nuclear foi observada (Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). A proteína tem um tamanho de 25-27 kDa e tem 6-7 domínios transmembrana. A extremidade C-terminal, que provavelmente está localizada no citoplasma (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)), é essencial para a função de BI-I (Kawai-Yamada et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). E possível que os domínios de transmembrana formem um canal iônico (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)). Assim, BI-I pode ter uma função em regular o nível citosólico de Ca2+ e/ou o estado redox da célula como o resultado da função de armazenamento de ER para Ca2+ (Xu Q. et al., Mol. Cell 18, 1084 (1998); Balduc N. et al., FEBS Lett. 532, 111 (2003); Hückelhoven R. et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 29, 5555 (2003); Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)). Em células animais, não existe nenhuma interação física direta entre BI-I e Bax. Entretanto, BI00-1 interage com outros reguladores de PCD (Xu Q. et al., Mol. Cell 18, 1084 (1998)). É provável que BI-I, em plantas, também interaja com outros reguladores de PCD, assim influenciando as respostas de resistência. Em Arabidopsis, BI-1 é capaz de suprimir BAX e o H2O2 induziu PCD (Baek et al., Plant Mol. Biol. 56, 15 (2004); Kawai-Yamada M. et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). Portanto, ele provavelmente regula os processos em um nível menor do que a resposta a estresse oxidativo (Kawai-Yamada M. et al., Plant Cell 16, 21 (2004)).

A expressão de BI-I é induzida por estresse biótico e abiótico tal como ataque por patógenos ou ferimento, mas também em tecidos de envelhecimento (Balduc N. et al., FEBS Lett. 532, 111 (2003); Hückelhoven R., Apoptosis 9, 299 (2004)). Em Arabidopsis, os níveis de mRNA de BI-I são aumentados depois de choque térmico (Watanabe N. et al., Plant J. 45, 884 (2006)). Expressão de BI-I é induzida em tomate (Lycopersicum esculentum) por H2O2, e em Arabidopsis por H2O2 e ácido salicílico (Hückelhoven R., Apoptosis 9, 299 (2004); Kawai-Yamada M. et al., Plant Cell 16, 21 (2004)). Isto sugere que BI-I tem uma função em defesa de patógeno, pois isto é onde ambas as substâncias desempenham um papel importante (Prell H.H., Interaktionen von Pflanzen und phytopathogenen Pilzen [Interactions between plants and phytopathogenic fungi], Gustav Fischer Verlag, Jena, 1996).

Por conseguinte, a infecção de cevada com Bgh ou Bgt desperta uma expressão aumentada de BI-I (Hückelhoven R. et al., Plant Mol. Biol. 47, 739 (2001); Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). Em arroz, a expressão é bifásica depois de infecção com M. grisea. Primeiro ela é levemente aumentada, mas é reduzida 12 horas depois da infecção apenas para subir de novo (Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)). A expressão aumentada de BI-I em células de Arabidopsis depois de tratamento com fumonisina Bl (Watanabe N. et al., Plant J. 45, 884 (2006)), e a redução da expressão de BI-I depois do tratamento de células de arroz com extrato elicitor de M. grisea, demonstra que os padrões de expressão podem diferir consideravelmente, dependendo do fator indutor e da planta. Os padrões de expressão sugerem um papel de BI-I na regulação do PCD ou HR induzido por estresse e na resposta de resistência a patógenos. A influência no HR pode aumentar a resistência de uma planta, especialmente se os patógenos são fungos pertotróficos ou hemibiotróficos. Superexpressão de BI-I em cenoura (Daucus carota ssp. sativa) leva a resistência das plantas a Botrytis cinerea (Imani J. et al., Mol. Plant Physiol. in press). Em tomates, a expressão do inibidor de PCD p35 protege contra Alternaria alternata, Colletotrichum coccodes e Pseudomonas syringae (Lincoln J.E. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 99, 15217(2002)).

Contra este histórico, houve uma demanda contínua na arte anterior por plantas cultiváveis com uma resistência aumentada a patógenos. Há apenas poucas abordagens que conferem, a plantas, uma resistência a um espectro mais amplo de patógenos, especialmente patógenos fungicos. Resistência sistêmica adquirida (SAR) - um mecanismo de defesa em várias interações planta/patógeno- pode ser conferida por aplicação de substâncias mensageiras endógenas tal como jasmonato (JA) ou ácido salicílico (SA) (Ward J.M. et al., Plant Cell 3, 1085 (1991); Uknes et al., Plant Cell 4(6), 645 (1992)). Efeitos similares também podem ser causados por compostos sintéticos tal como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (DCINA) ou éster S-metil do ácido benzo(l,2,3)tiadiazole-7-carbotióico (BTH; Bion®) (Friedrich et al., Plant J. 10(1), 61 (1996); Lawton et al., Plant J. 10, 71 (1996)). Também, expressão de proteínas "relacionadas à patogênese" (PR), que foi aumentada no contexto de SAR, pode causar parcialmente resistência a patógenos.

Em cevada, o locus Mlo foi descrito como um regulador negativo de defesa de patógeno. A perda, ou perda de função, do gene Mlo causa uma resistência aumentada inespecífíca para raça para um grande número de isolados de mofo (Büschges R. et al., Cell 88, 695 1997); Jorgensen J.H., Euphytica 26, 55 (1997); Lyngkjaer M.F. et al., Plant Pathol 44, 786(1995)).

O gene Mio foi descrito (Büschges R. et al., Cell 88, 695 (1997); Patente Internacional 98/04586; Schulze-Lefert P. et al., Trends Plant Sei. 5, 343 (2000)). Vários homólogos de Mlo de outras espécies de cereal foram isolados. Métodos usando estes genes para obter resistência a patógeno foram descritos (Patente Internacional 98/04586; Patente Internacional 00/01722; Patente Internacional 99/47552). A desvantagem é que plantas deficientes em Mlo também iniciam o mecanismo de defesa mencionado acima na ausência de um patógeno, que se manifesta na morte espontânea de células vegetais (Wolter M. et al., Mol. Gen. Genet. 239, 122 (1993)). Como o resultado, plantas resistentes a mio sofrem uma perda de produção de até 5% (Jõrgensen J.H. Euphytica 63, 141 (1992)). A morte espontânea das células foliares, além disso, causa uma hipersusceptibilidade desvantajosa a patógenos necrotróficos e hemibiotróficos tal como Magnaporthe grisea (M. grisea) ou Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B. et al., Mol Plant Microbe Interact. 12, 508 (1999); Kumar J. et al., Phytopathology 91, 127(2001)).

Apoptose, também referida como morte celular programada, é um mecanismo essencial para manter homeostase de tecido, e, como tal, age contra divisão celular como um mecanismo negativamente regulador. No organismo multicelular, apoptose é um componente natural de ontogênese, e envolvida, entre outras coisas, em desenvolvimento de órgãos e na remoção de células senescentes, infectadas ou mutadas. Como o resultado de apoptose, células indesejadas são eliminadas de uma maneira eficiente. Interferência com, ou inibição de, apoptose contribui para a patogênese de uma variedade de doenças, dentre as quais carcinogênese. Os principais efetores de apoptose são cisteína proteases específicas de aspartato, que são conhecidas pelo nome de caspases. Elas geralmente podem ser ativadas por pelo menos duas vias de sinal apoptótico: primeiramente pela ativação da família de receptor de TNF (fator de necrose tumoral); secundariamente, as mitocôndrias desempenham um papel central. Ativação da via de sinal de apoptose mitocondriana é regulada por proteínas da família Bcl-2. Esta família de proteínas consiste de proteínas antiapoptóticas e proapoptóticas tal como, por exemplo, Bax. No caso de um estímulo apoptótico, a proteína Bax passa por uma mudança de conformação alostérica, que leva ao ancoramento da proteína na membrana mitocondrial externa, e a sua oligomerização. Como o resultado destes oligômeros, moléculas proapoptóticas são liberadas das mitocôndrias no citosol e causam uma cascata de sinal apoptótico e, no final das contas, a degradação de substratos celulares específicos, resultando em morte celular. O inibidor de Bax-I (BIl) foi isolado através de sua propriedade de inibir o efeito proapoptótico de BAX (Xu Q. et al., Mol Cell 1(3), 337 (1998)). BIl é uma proteína altamente conservada. Ela é encontrada predominantemente como um constituinte integral de membranas intracelulares. BIl interage com bcl-2 e bcl-xl. A superexpressão de BIl em células de mamíferos suprime o efeito proapoptótico de ΒΑΧ, etoposida e estaurosporina, mas não de antígeno Fas (Roth W. et al., Nat. Med. 8, 216 (2002)). A inibição de BIl por RNA antisentido, em contraste, induz apoptose (Xu Q. et al., Mol Cell 1(3), 337 (1998)). Os primeiros homólogos vegetais de BIl foram isolados de arroz e Arabidopsis (Kawai et al., FEBS Lett 464, 143 (1999); Sanchez et al., Plant J. 21, 393 (2000)). Estas proteínas vegetais suprimem a morte celular induzida por BAX em levedura. A homologia de seqüência de aminoácidos com BIl humano é aproximadamente 45%. Em plantas recombinantes, o homólogo de Arabidopsis AtBIl é capaz de suprimir o efeito proapoptótico de BAX murino (Kawai-Yamada M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98(21), 12295 (2001)). O homólogo de BIl de arroz (Oryza sativa) OsBIl é expresso em todos os tecidos vegetais (Kawai et al., FEBS Lett 464, 143(1999)). Além disso são descritos genes de BIl de cevada (Hordeum vulgare; GenBank Acc.-No.: AJ290421), arroz (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927), tabaco (GenBank Acc.-No.: AF390556) e colza (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N. et al., Planta 216, 377-386 (2003)). A expressão de BIl em cevada é aumentada como o resultado de infecção com mofo (Hückelhoven R. et al., Plant Mol. Biol. 47(6), 739 (2001)).

Patente Internacional WO 00/26391 descreve a superexpressão, em plantas, dos genes antiapoptóticos Ced-9 de C. elegans, sflAP de Spodoptera frugiperda, bcl-2 de humanos e bcl-xl de galinha para aumentar a resistência a fungos necrotróficos ou hemibiotróficos. Homólogos vegetais de BIl não são descritos. Expressão está sob o controle de promotores constitutivos. Além disso, é descrita a expressão de uma proteína BIl de Arabidopsis sob o promotor constitutivo forte 35S CaMV em células de arroz e uma resistência por meio disto induzida para substâncias indutoras de morte celular de Magnaporthe grisea (Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)).

Originalmente, a arte anterior descreveu que expressão constitutiva de um inibidor da morte celular programada em plantas pode causar resistência a fungos necrotróficos.

Entretanto, a pessoa versada na arte foi defrontada em particular com o problema de fornecer métodos para a defesa de patógeno em plantas, em particular contra patógenos biotróficos.

Surpreendentemente, o problema é resolvido pelos métodos inventivos, seqüências peptídicas, seqüências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão, vetores e organismos definidos nas principais reivindicações, usando uma proteína BI1. As reivindicações dependentes definem formas de uso específicas, especialmente preferidas da presente invenção.

O papel de BI-I foi testado em três experimentos independentes no sistema de transformação transiente. No controle, 53% (média dos experimentos) das células transformadas que interagiram com P. pachyrhizi foram penetradas, enquanto que apenas 37% das células transformadas BI-I foram penetradas (FIG. 8; Tabela FIG. 10). Os dados foram baseados em três experimentos independentes. Folhas de cevada foram transformadas com a construção de gene repórter pGY I-GFP e o vetor branco a fim de atuarem como controles. A taxa de penetração nas células transformadas BI-I difere significativamente do WT (P<0,05). Depois da avaliação, as células que foram transientemente transformadas com BI-1, portanto surpreendentemente mostram uma resistência à penetração significativamente aumentada para P. pachyrhizi (P< 0,05; Fig. 8; Tabela FIG. 10). Um aspecto notável da observação no microscópio foi que as células formadoras de BI-I tiveram uma aparência marcadamente mais vital do que células, que expressaram GFP ou ADF3. Assim, mesmo a superexpressão transiente do inibidor de morte celular BI-I em cevada revelou, surpreendentemente, a tendência a uma resistência aumentada das células vegetais a penetração por ferrugem da soja. Para confirmar isto, a interação entre plantas transgênicas de cevada cv.

"Golden Promise" (GP) que contêm uma construção de superexpressão de GFP-BI-I foi estudada sob o microscópio em comparação com tipo selvagem (WT) desta variedade. Para gerar as plantas transgênicas, uma fusão GFP-BI-I sob o controle do promotor constitutivo CaMV 35S foi usada, assim assegurando expressão suficiente da proteína. Em experimentos preliminares, folhas do WT cv. "Golden

Promise" e da linhagem transgênica de cevada (cv. "Golden Promise") #6(1)E8L1(T1)' foram inoculadas com P. pachyrhizi e, 24 horas depois da inoculação, fixadas em solução descolorante. Depois de descoloração ter sido completada, as folhas foram coradas com anilina azul. Anilina azul intercala na estrutura de calose e assim cora preferencialmente papilas onde calose passa por acúmulo e reticulação com outras substâncias poliméricas. Células que, como o resultado de uma resposta hipersensível (HR), passaram por um processo similar como apoptose em células de mamíferos, depois de marcação com anilina azul, também mostram uma fluorescência de luz. O número de esporos, os esporos germinados com tubos germinativos que já haviam formado um apressório e, como resposta celular, os apressórios com papilas subjacentes e a HR foram contados nas folhas de cevada inoculadas. Aglomerações de esporos maiores onde uma partilha dos apressórios para os esporos não foi mais possível não foram incluídas. Tanto quanto possível, pelo menos 100 esporos com apressórios foram contados por folha. Mesmo neste experimento, uma formação significativamente aumentada de papilas e uma HR significativamente diminuída das células foi observada na linhagem transgênica (P<0,01; Tabela FIG. 11 A/B, FIG. 12).

Tanto Bgh (Hückelhoven R., FEMS Microbiol. Letters 245, 9(2005)) como Ρ. pachyrhizi (Koch Ε. et al., Phytopath, p. 106, 302 (1983)) são patógenos biotróficos. Uma HR das células infectadas pode, portanto parar o desenvolvimento dos fungos uma vez que ela os desprove de sua fonte de alimento. Se a HR é prevenida, as células podem se tornar mais sensíveis a infecção por patógenos biotróficos. Apesar disto, células de cevada que foram transientemente transformadas com uma construção de superexpressão de BI-I surpreendentemente mostram uma resistência aumentada à penetração por P. pachyrhizi. Isto é surpreendente porque uma sensibilidade aumentada ao fungo biotrófico teria sido esperada. Entretanto, a HR não é a única reação de resistência na resistência de cevada e trigo ao patógeno incompatível P. pachyrhizi, e talvez não aquela decisiva. Assim, a defesa de trigo contra P. pachyrhizi é formação de papilas (Hoppe H.H. et al., Pro. Intern. Congress of SABRAO (Bangkok 1985) 1986). Cevada responde com formação de papilas e com HR das células infectadas, dependendo da variedade. Além disso, cevada com o alelo mlo5 responde com formação aumentada de papilas. A defesa de cevada a Bgt também é afetada por formação de papilas, mas principalmente por uma HR de células infectadas (Hückelhoven R. et al., Mol. Plant Pathol. 2, 199 (2001). Em contraste a P. pachyrhizi, a superexpressão transiente de BI-I em cevada leva a uma taxa aumentada de penetração das células por Bgt (Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). Da mesma maneira, plantas de cevada com o alelo mlo5, que confere ampla resistência a Bgh demonstram, no caso de superexpressão transiente de BI-1, maior sensibilidade das células a penetração por Bgh (Hückelhoven R. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 29, 5555 (2003). Embora a resistência de cevada com o alelo mlo5 seja baseada não em uma HR das células infectadas, mas em uma mais eficiente acumulação de compostos antimicrobianos, H2O2 e uma formação aumentada de papilas, a inibição da HR também parece afetar as outras respostas de resistência (Hückelhoven R. et al., Plant Physiol. 119, 1251 (1999)). Sem causar limitação por teoria, estas observações de uma resistência reduzida à penetração como o resultado de inibição de HR sugere que regulação reticulada das respostas de resistência. A suspeita de que as respostas de resistência são sujeitas a regulação reticulada é confirmada pela análise microscópica de plantas transgênicas de cevada que foram inoculadas com P. pachyrhizi. Estas plantas de cevada contêm uma construção de superexpressão de BI-I e respondem a infecção com formação aumentada de papilas. Enquanto que apenas 16-26% das células infectadas mostram HR nas folhas das plantas transgênicas, HR foi observada em aproximadamente 50% das células infectadas nas folhas WT. Conseqüentemente, na variedade de cevada "Golden Promise", a HR das células também parece ser um importante mecanismo de resistência contra P. pachyrhizi, que é um biotrofo, embora P. pachyrhizi não utilize as células epidérmicas como uma fonte de alimento, pelo menos não em soja, mas apenas forme haustórios no mesófilo (Koch E. et al., Phytopath, p. 106, 302 (1983)). Em geral, entretanto, o fungo não atingiu este estágio na planta não hospedeira cevada. Inibição da HR torna possível para Bgt penetrar nas células, e o fungo pode se estabelecer com sucesso (Eichmann R. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 17, 484 (2004)). Fatores específicos de fungo adicionais parecem ser necessários para este processo. Parece que estes fatores específicos de Bgt são capazes de suprimir ou a resposta de resistência alternativa da célula vegetal ou o reconhecimento pela última. Estes fatores provavelmente estão ausentes em P. pachyrhizi. Assim, a célula vegetal talvez seja capaz de reconhecer P. pachyrhizi e, uma vez que BI-I suprime a HR, capaz de induzir uma resposta de resistência alternativa, formação de papilas. Reconhecimento de P. pachyrhizi pela planta é confirmado pela observação de formação aumentada de papilas em cevada com o alelo mlo5. Entretanto, a razão pela qual a planta é capaz de reconhecer o patógeno P. pachyrhizi, que é especializado para plantas hospedeiras de uma ordem completamente diferente, permanece inexplicada (Sinclair J. B. et al. (eds.), Proceedings of the soybean rust workshop (1995), National Soybean Research Laboratory, Publieation No. 1 (1996)). A "característica de reconhecimento" de P. pachyrhizi pode ser um elicitor inespecífico ('padrões moleculares associados à patogênese' PAMP) tal como o INFl de P. infestans, que desencadeia uma HR em Nicotiana sp. (Kamoun S. et al., Plant Cell 10, 1413 (1998)). PAMPs são reconhecidos pela planta como moléculas exógenas e desencadeiam uma resposta de resistência. Nem todas as folhas da planta transgênica mostram formação aumentada de papilas, embora a construção de gene BI-I tenha sido identificada nelas por meio de PCR. Isto pode ser uma conseqüência de um tipo de inserção desfavorável da construção, que previne uma expressão efetiva de BI-I e/ou leva a efeitos antagonísticos por outros genes. Uma vez que a identificação foi realizada no nível de DNA, nenhum comentário pode ser feito sobre a expressão de BI-1. Também deve ser lembrado que mesmo pequenos danos aos grãos ou às folhas podem ter um efeito decisivo, ou prevenir, o desenvolvimento da planta. Assim, alguns grãos da linhagem #6(2)E15L7P2 (T2) não germinaram.

Conseqüentemente, um primeiro assunto da invenção se refere a um método de gerar ou aumentar uma resistência na planta, ou uma parte de uma planta, a um patógeno que é preferivelmente um biotrofo. O método compreende uma etapa na qual a quantidade de uma proteína, inibidor de Bax-I (BI-1), ou sua função na planta ou pelo menos uma parte de uma planta é aumentada. Uma parte de uma planta é compreendida como significando a planta inteira, um ou mais de seus órgãos, um tecido ou pelo menos uma célula. O método, além disso, compreende a etapa de selecionar uma planta ou uma parte de uma planta na qual a proteína BIl ou sua função tenha sido aumentada de uma maneira tal que ela mostra resistência aumentada em comparação com uma planta inicial, na qual o aumento na quantidade de função da proteína BIl em comparação com a planta inicial ou sua parte é aumentada. Em uma forma de realização preferida, a resistência é uma resistência a pelo menos um patógeno biotrófico, preferivelmente um fungo biotrófico, e especialmente preferivelmente um fungo heminecrotrófico como definido neste lugar. Em formas de realização preferidas da presente invenção, o fungo biotrófico é selecionado a partir do grupo Basidiomycota, preferivelmente os Uredinales (fuligens), especialmente preferivelmente os Melompsoraceae, e em particular o gênero Phacopsora. Em formas de realização especialmente preferidas, o patógeno é Phacopsora pachyrhizi e/ou P. meibomiae (juntos também referidos como "ferrugem da soja" ou "ferrugem da fava da soja"). Preferência sendo dada ao primeiro. Quando o patógeno é selecionado a partir do grupo dos patógenos ou fungos biotrófícos, é preferido em algumas formas de realização que o patógeno seja outro do que oídio ou míldio.

Em formas de realização preferidas, a etapa de aumentar a quantidade ou função da proteína BIl é realizada por métodos biotecnológicos. O termo métodos "biotecnológicos" compreende, entre outras coisas, a expressão recombinante da proteína em uma célula, preferivelmente em ligação operável com, e dirigida por, um promotor heterólogo. O aumento mencionado acima, entretanto, também pode ser realizado, por exemplo, substituindo apenas o promotor endógeno ou, por exemplo, o silenciamento de fatores que geralmente inibem a expressão da proteína BIl endógena. Por conseguinte, o termo "método biológico" compreende todos os métodos que são abertos a biologia molecular moderna, em particular os métodos de tecnologia de gene recombinante, que são conhecidos pelo trabalhador versado e que serão discutidos em maior detalhe no percurso da descrição.

A planta na qual a resistência é gerada é preferivelmente selecionada a partir do grupo das plantas monocotiledôneas, em particular compreendendo trigo, aveia, milheto, cevada, centeio, milho, arroz, sorgo, triticale, espelta ou cana-de-açúcar; ou do grupo das plantas dicotiledôneas, em particular compreendendo Arabidopsis, algodão, trigo sarraceno, batata, repolho, agrião, linhaça, colza, tomate, berinjela, pimentão, girassol, tabaco, Tagetes, alface, Calendula, melão, abóbora/moranga, abobrinha, beterraba açucareira, ornamentais, árvores e legumes. Uma vez que ferrugem da soja ataca mais do que 70 espécies leguminosas, a planta é especialmente preferivelmente selecionada, entre os legumes, pelo menos em casos onde o patógeno é um patógeno heminecrotrófíco ou um patógeno de ferrugem ou ferrugem da soja.

Conseqüentemente, a planta é selecionada especialmente preferivelmente entre os legumes, compreendendo plantas do gênero Phaseolus (compreendendo feijão francês, feijão anão, feijão trepador (Phaseolus vulgaris), feijão de lima (Phaseolus lunatus L.), feijão tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray), feijão da Espanha (Phaseolus coccineus)); o gênero Glycine (compreendendo Glycine soja, soja (Glycine max (L.) Merill)); ervilha (Pisum) (compreendendo ervilhas-forrageiras (Pisum sativum L. convar. sativum), também chamadas ervilhas lisas ou tortas; ervilha medulosa (Pisum sativum L. convar. medullare Alef. emend. C.O. Lehm), ervilha doce (Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C.O. Lehm), também chamada ervilha de cheiro, ervilha de vagem ou ervilha de quebrar, (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium)); amendoim (Arachis hypogaea), trevo (Trifolium spec.), Iuzerna (Medicago), videira Kudzu (Pueraria lobata), luzerna comum, alfafa (M. sativa L.), grão- de-bico (Cicer), lentilhas (Lens) (Lens culinaris Medik.), tremoços (Lupinus); ervilhacas (Vicia), favarola, fava (Vicia faba), ervilha-do-campo (Lathyrus) (compreendendo chícharo (Lathyrus sativus), chícharo selvagem (Lathyrus tuberosus)); gênero Vigna (compreendendo vigna (Vigna aconitifolia (Jacq.) Maréchal), feijão azuki (Vigna angularis (Willd.) Ohwi & H. Ohashi), feijão rajado (Vigna mungo (L.) Hepper), feijão mungo (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), amendoim bambarra (Vigna subterrane (L.) Verde.), feijão arroz (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp., nas três subspecies feijão-aspargo, caupi, feijão de corda)); feijão guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.), o gênero Macrotyloma (compreendendo amendoim de geocarpa (Macrotyloma geocarpum (Harms) Maréchal & Baudet), faveira (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verde.)); feijão alado (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.), feijão inhame Africano (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), feijão preto egípcio, dólico, Iabe Iabe (Lablab purpureus (L.) Sweet), feijão jacatupé (Pachyrhizus), feijão-guar (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.); e o gênero Canavalia (compreendendo feijão de porco (Canavalia ensiformis (L.) DC.), feijão espada (Canavalia gladiata (Jacq.) DC.)).

Em qualquer das formas de realização da presente invenção que são descritas neste lugar, é especialmente preferido que a quantidade ou função da proteína BIl seja aumentada pelo menos na epiderme, preferivelmente essencialmente de uma maneira tecido específica na epiderme; em particular, é preferido que a quantidade ou função da proteína BIl seja especificamente aumentada na epiderme e/ou essencialmente não aumentada no mesófilo. Por epiderme, o trabalhador versado quer dizer o tecido

epidérmico predominante de partes vegetais aéreas primárias, por exemplo, do broto, das folhas, flores, frutos e grãos. As células epidérmicas secretam exteriormente uma camada água-repelente, a cutícula. As raízes são circundadas pela rizoderme, que, de muitas maneiras, parece a epiderme, mas também mostra diferenças pronunciadas. Enquanto que a camada mais externa do meristema apical dá origem à epiderme, a formação da rizoderme é muito menos clara. Dependendo da espécie, ela pode ser considerada, em termos filogenéticos, ou como parte da caliptra ou como parte do córtex primário. A epiderme tem diversas funções: ela protege a planta contra dessecação e regula a taxa de transpiração. Ela protege a planta contra uma ampla variedade de influências externas químicas e físicas, contra ser ingerida por animais e contra ataque por parasitas. Ela está envolvida em troca gasosa, na secreção de certo metabólitos e na absorção de água. Ela compreende receptores para estímulos luminosos e mecânicos. Ela assim atua como um transformador de sinal entre o ambiente e a planta. Em conformidade com suas várias funções, a epiderme compreende diversas células diferenciadas diferentemente. A isto devem ser adicionadas variantes espécie-específicas e diferentes organizações das epidermides nas partes individuais de uma planta. Essencialmente, ela consiste de três categorias de células: as células epidérmicas "atuais", as células dos estômatos e dos tricomas (Grego: trichoma, pêlo), apêndices epidérmicos de variados formatos, estruturas e funções.

As células epidérmicas "atuais", i.e. as menos especializadas, respondem pelo volume das células do tecido epidérmico. Em vista de topo, elas parecem ou poligonais (forma de chapa ou placa) ou alongadas. As paredes entre elas freqüentemente são onduladas ou sinuosas. Não se sabe o que induz este formato durante desenvolvimento; hipóteses existentes oferecem apenas explicações insatisfatórias para tal. Células epidérmicas alongadas podem ser encontradas em órgãos ou partes de órgãos que são eles mesmos alongados, assim, por exemplo, em caules, pecíolos, veias foliares e nas folhas da maioria das monocotiledôneas. A superfície superior e superfície inferior de laminas podem ser cobertas em epidermides com diferentes estruturas, sendo possível para o formato das células, a espessura da parede e a distribuição e número de células especializadas (estômatos e/ou tricomas) por unidade de área variar. Um alto grau de variação também é encontrado dentro de famílias individuais, por exemplo, na Crassulaceae. Na maioria dos casos, a epiderme consiste de uma única camada, embora epidermides de múltiplas camadas armazenando água tenham sido encontradas entre espécies de uma pluralidade de famílias (Moraceae: a maioria das espécies de Ficus; Piperaceae: Peperonia, Begoniaceae, Malvaceae e os semelhantes). Células epidérmicas, entretanto secretam uma cutícula do lado de for a que cobre todas as superfícies epidérmicas como uma película ininterrupta. Ela pode ser ou lisa ou estruturada por saliências, protuberâncias, pregas e sulcos. Entretanto, o dobramento da cutícula, que pode ser observado ao olhar a superfície, nem sempre é causado por protuberâncias cuticulares. De fato, há casos onde dobramento cuticular é meramente a expressão das saliências subjacentes da parede celular. Apêndices epidérmicos de várias formas, estruturas e funções são referidos como tricomas e, no presente contexto, da mesma maneira vêm sob o termo "epiderme". Eles ocorrem na forma de pêlos protetores, pêlos de sustentação e pêlos glandulares na forma de escamas, diferentes papilas e, no caso de raízes, como pêlos absorventes. Eles são formados exclusivamente por células epidérmicas. Freqüentemente, um tricoma é formado por apenas uma tal célula, entretanto, ocasionalmente, mais do que uma célula está envolvida em sua formação.

O termo "epiderme" da mesma maneira compreende papilas. Papilas são saliências da superfície epidérmica. O exemplo de livro texto são as papilas em superfícies florais de amor-perfeito (Viola tricolor) e as superfícies superiores das folhas de muitas espécies de florestas pluviais tropicais. Elas concedem uma consistência tipo veludo à superfície. Algumas células epidérmicas podem formar depósitos de água. Um exemplo típico são as vesículas de água nas superfícies de muitas espécies de Mesembryanthemum e outras suculentas. Em algumas plantas, por exemplo, no caso de campânula (Campanula persicifolia), as paredes externas da epiderme são espessadas como uma lente.

O volume de todos os tecidos é o parênquima. Os tecidos parenquimáticos incluem o mesófilo que, em folhas, pode ser diferenciado em parênquima paliçádico e parênquima esponjoso.

Por conseguinte o trabalhador versado entende, por mesófílo, um tecido parenquimático. Células parenquimáticas estão sempre vivas, na maioria dos casos isodiamétricas, raramente alongadas. A seiva dos brotos, os tecidos de armazenamento dos frutos, grãos, a raiz e outros órgãos subterrâneos também são parênquimas, como é o mesófílo.

Nas folhas da maioria das samambaias e fanerógamas, especialmente no caso das dicotiledôneas e muitas monocotiledôneas, o mesófílo é subdividido em parênquima paliçádico e parênquima esponjoso. Uma folha "típica" é de organização dorsoventral. Na maioria dos casos, o parênquima paliçádico está na superfície superior da folha imediatamente abaixo da epiderme. O parênquima esponjoso preenche o espaço fundamental. Ele é entremeado por um sistema intercelular volumoso cujo espaço gasoso está em contato direto com o espaço externo através dos estômatos.

O parênquima paliçádico consiste de células cilíndricas alongadas. Em algumas espécies, as células são irregulares, ocasionalmente bifurcadas (formato de Y: parênquima paliçádico ramificado). Tais variantes são encontradas em samambaias, coníferas e algumas angiospermas (por exemplo, em espécies de Ranunculaceae e Caprifoliaceae [exemplo: sabugueiro]). Além da forma de organização mais espalhada que acabou de ser descrita, as seguintes variantes foram encontradas:

parênquima paliçádico na superfície abaxial da folha. Particularmente notável em folhas escamosas. Exemplo: árvore-da-vida (Thuja), e nas folhas de alho selvagem (Allium ursinum).

parênquima paliçádico em ambas as superfícies foliares (adaxial e abaxial). Freqüentemente em plantas que crescem em habitats secos (xerófitas). Exemplo: alface-brava-menor (Lactuca serriola);

parênquima paliçádico plicado: Em folhas organizadas cilindricamente e em acículas de coníferas. A variabilidade das células do parênquima esponjoso, e a própria organização do parênquima esponjoso, são ainda mais variados do que aqueles do parênquima paliçádico. Ele é mais freqüentemente referido como aerênquima uma vez que ele compreende uma multiplicidade de espaços intercelulares interconectados.

O mesófilo pode compreender o que é conhecido como o tecido de assimilação, mas os termos mesófilo e tecido de assimilação não são para serem usados sinonimicamente. Há folhas livres de cloroplasto cuja organização difere apenas em um pequeno grau de folhas verdes comparáveis. Como uma conseqüência, elas compreendem mesófilo, mas assimilação não ocorre; inversamente, assimilação também ocorre em, por exemplo, secções do broto.

Na presente descrição, a epiderme é caracterizada em termos bioquímicos. Em uma forma de realização preferida, a epiderme pode ser caracterizada pela atividade de um ou mais dos seguintes promotores:

WIR5 (=GstAl); acc. X56012; Dudler & Schweizer, GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998),

GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999);

Prx7, acc. AJ003141, Kristensen B.K., Ammitzbõll H., Rasmussen S.K. e Nielsen K.A., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001);

GerA, acc. AF250933; Wu S., Druka A., Horvath H., Kleinhofs A., Kannangara G. e von Wettstein D., Plant Phys Biochem 38, 685 (2000);

OsROC 1, acc. AP004656

RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Klõti A., Henrich C., Bieri S., He X., Chen G., Burkhardt P.K., Wünn J., Lucca P., Hohn T., Potrykus I. e Fiitterer J., PMB 40, 249 (1999);

Promotor ChtC2 de quitinase de batata (Ancillo et al., Planta. 217(4), 566, (2003));

Promotor AtProT3 (Grallath et al., Plant Physiology.

137(1), 117(2005))

Promotores SHN de Arabidopsis (Fatores de transcrição AP2/EREBP envolvidos em produção de cutina e cera) (Aarón et al., Plant Cell. 16(9), 2463 (2004));

GSTAl de trigo (Dudler et al., WP2005306368 e Altpeter et al., Plant Molecular Biology. 57(2), 271 (2005)).

Em formas de realização preferidas, a epiderme é caracterizada pelo fato de que todos os promotores mencionados acima estão ativos no tecido ou na célula. Em outras formas de realização preferidas, a epiderme é caracterizada pelo fato de que apenas alguns dos promotores estão ativos, por exemplo, preferivelmente 2, 3, 5 ou mais preferivelmente 7 ou mais, mas pelo menos a partir de apenas um daqueles detalhados acima.

Em uma forma de realização preferida, o mesófilo é caracterizado em termos bioquímicos. O mesófilo pode ser caracterizado pela atividade de um ou mais dos seguintes promotores:

PPCZml (=PEPC); Kausch A.P., Owen T.P., Zachwieja S.J., Flynn A.R. e Sheen J., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001);

OsrbcS, Kyozuka et al., PlaNT Phys 102, 991 (1993); Kyozuka J., McElroy D., Hayakawa T., Xie Y., Wu R. e Shimamoto K., Plant Phys. 102, 991 (1993);

OsPPDK, acc. AC099041;

TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999);

TaFBPase, acc. X53957;

TaWIS 1, acc. AF467542; Patente Norte-Americana 200220115849;

HvBIS 1, acc. AF467539; Patente Norte-Americana

200220115849;

ZmMIS 1, acc. AF467514; Patente Norte-Americana

200220115849;

HvPRla, acc. X74939; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interacti. 7 (2), 267 (1994);

HvPRlb, acc. X74940; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 7(2), 267 (1994); - HvBl,3gluc; acc. AF479647;

HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001);

HvPAL, acc. X97313; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).

Em formas de realização preferidas, o mesófilo é caracterizado pelo fato de que todos os promotores mencionados acima estão ativos no tecido ou na célula. Em outra forma de realização, o mesófilo compreende o fato de que apenas alguns dos promotores estão ativos, por exemplo, preferivelmente 2, 3, 5 ou especialmente preferivelmente 7 ou mais, mas pelo menos a partir de apenas um daqueles detalhados acima.

Em formas de realização preferidas, todos os promotores mencionados acima estão ativos em uma planta usada ou produzida em conformidade com a invenção ou na epiderme e no mesófilo em uma planta de acordo com a invenção. Em uma forma de realização, apenas alguns dos promotores mencionados acima estão ativos, por exemplo, preferivelmente 2, 5, ou especialmente preferivelmente 7 ou mais; entretanto, pelo menos um dos promotores detalhados acima está ativo em cada caso.

Em formas de realização preferidas, o aumento na quantidade de proteína ou função da proteína BIl ocorre de uma maneira constitutiva ou tecido-específica. Em formas de realização especialmente preferidas, um aumento essencialmente tecido-específico na quantidade de proteína ou função protéica ocorre de uma maneira essencialmente epiderme-específica, por exemplo, por expressão recombinante de uma seqüência de ácidos nucleicos codificando para dita proteína BI sob o controle de um promotor específico para epiderme. Em particular, o aumento na a expressão ou função da proteína BIl ocorre na epiderme, onde, entretanto, a expressão da proteína BI-I no mesófilo permanece essencialmente não modificada, ou ela é reduzida, e onde outros tecidos não são afetados.

Como descrito no presente texto, em uma forma de realização, a expressão ou função da proteína de acordo com a invenção ou do BI-I caracterizada no presente texto é aumentada pelo menos na epiderme de uma planta. Um aumento em expressão pode ser atingido como descrito a seguir. Por expressão ou função aumentada, o presente texto significa tanto a ativação como melhoria da expressão ou função da proteína endógena incluindo uma expressão de novo, mas também um aumento em ou melhoria como o resultado da expressão de uma proteína ou fator transgênico.

Em uma forma de realização especialmente preferida, o aumento na quantidade de proteína ou função de pelo menos uma proteína BIl vegetal pode ser combinado com um fenótipo mlo-resistente ou com a inibição ou redução, em comparação com uma planta de controle, da expressão de MLO, RacB e/ou NaOx na planta ou uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número considerável das células epidérmicas, e/ou com o aumento na expressão ou função de PEN2 e/ou PENl na planta, por exemplo, constitutivamente, ou uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou em um número considerável de células epidérmicas, com a condição de que a expressão de uma proteína BIl vegetal na epiderme foliar permaneça essencialmente não modificada, ou seja, reduzida.

O locus Mlo foi descrito em cevada como regulador negativo de defesa de patógeno. A perda, ou perda de função, do gene Mlo causa uma resistência não específica de raça aumentada para diversos isolados de mofo (Büschges R. et al., Cell 88, 695 (1997); Jorgensen J.H., Euphytica 26, 55 (1977); Lyngkjaer M.F. et al., Plant Pathol. 44, 786 (1995)). Um fenótipo mlo-resistente pode ser obtido como descrito na arte anterior. Métodos usando estes genes para obter uma resistência a patógenos são descritos, entre outras coisas, em Patente Internacional 98/04586; Patente Internacional 00/01722; Patente Internacional 99/47552.

Em uma forma de realização da presente invenção, a atividade, expressão ou função de MLO, RacB e/ou NaOx na planta ou uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas, pode ser vantajosamente inibida ou reduzida em comparação com uma planta de controle ou uma parte desta. Reduzindo a atividade ou função de MLO, RacB e/ou NaOx na planta ou uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas, é preferido para aumentar a resistência, ou força de resistência, a patógenos biotróficos em plantas produzidas em conformidade com a invenção. A atividade ou função de MLO, RacB e/ou NaOx pode ser reduzida ou inibida analogamente àquela que foi descrita para MLO em Patente Internacional 98/04586; Patente Internacional 00/01722; Patente Internacional 99/47552 e nas outras publicações mencionadas a seguir, cujo conteúdo é com isto expressamente incorporado na presente descrição, em particular para descrever a atividade e inibição de MLO. A descrição das publicações mencionadas acima descreve processos, métodos e especialmente formas de realização preferidas para reduzir ou inibir a atividade ou função de MLO; os exemplos detalham especificamente como isto pode ser realizado.

A redução da atividade ou função, se apropriado a expressão, de RacB é descrita em detalhe em Patente Internacional 2003/20939, que é com isto expressamente incorporada na presente descrição.

A descrição da publicação mencionada acima descreve processos e métodos para reduzir ou inibir a atividade ou função de proteínas; os exemplos detalham especificamente como isto pode ser realizado. É especialmente preferido realizar a redução ou inibição da atividade ou função de RacB como descrito nas formas de realização e nos exemplos que são especialmente preferidos em Patente Internacional 2003/20939 e nos organismos especificados nesta como sendo especialmente preferidos, em particular em uma planta ou uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas. A redução da atividade ou função, se apropriado a expressão, de RacB é descrita em detalhe em Patente Internacional 2003/20939. Em Patente Internacional 2003/20939, o trabalhador versado pode encontrar as seqüências que codificam para proteínas RacB e também pode identificar RacB por meio do método fornecido em Patente Internacional 2003/20939.

A redução da atividade ou função, se apropriado da expressão, de NaOX é descrita em detalhe em Patente Internacional 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589) que é com isto expressamente incorporada na presente descrição. A descrição da publicação mencionada acima descreve processos e métodos para reduzir ou inibir a atividade ou função de NaOx; os exemplos detalham especificamente como isto pode ser realizado. É especialmente preferido realizar a redução ou inibição da atividade ou função de NaOx como descrito nas formas de realização e nos exemplos que são especialmente preferidos em Patente Internacional 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589) e nos organismos especificados nesta como sendo especialmente preferidos, em particular em uma planta ou uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas. Em Patente Internacional 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589), o trabalhador versado pode encontrar as seqüências que codificam para proteínas NaOx e também pode identificar NaOx por meio do método fornecido em Patente Internacional 2004/09820 (= PCT/EP/03/07589).

Em uma forma de realização da presente invenção, a atividade, expressão ou função de PENl, PEN2 e/ou SNAP34 pode ser vantajosamente aumentada na planta, por exemplo, constitutivamente, ou em uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas. O aumento em atividade, que também compreende uma expressão de novo, de PEN1, PEN2 e/ou SNAP34 na planta, por exemplo, constitutivamente, ou em uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas preferivelmente irá aumentar a resistência ou força de resistência a patógenos biotróficos nas plantas produzidas em conformidade com a invenção. O aumento na atividade ou função, se apropriado na expressão, de PEN2 é descrito em detalhe em Patente Internacional 03/074688, que é com isto expressamente incorporada na presente descrição. A descrição da publicação mencionada acima descreve processos e métodos para reduzir ou inibir a atividade ou função de PEN2; os exemplos detalham especificamente como isto pode ser realizado. A redução ou inibição da atividade ou função de PEN2 é especialmente preferivelmente realizada em conformidade com as formas de realização e exemplos que são especialmente preferidos em Patente Internacional 03/074688 e nos organismos detalhados nesta como sendo especialmente preferidos, em particular em plantas, por exemplo, constitutivamente, ou em uma parte desta, por exemplo, em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou uma parte considerável das células epidérmicas. Em Patente Internacional 03074688, o trabalhador versado irá encontrar as seqüências que codificam para proteínas PEN2 e também pode identificar PEN2 por meio do método fornecido em Patente Internacional 03/074688.

A expressão de PENl e SNAP34 pode ser aumentada analogamente aos métodos descritos em Patente Internacional 03/074688. Devido a seu conhecimento especializado geral e à arte anterior com a qual ele é familiar, o trabalhador versado pode isolar e superexpressar seqüências de ácidos nucleicos e seqüências protéicas de PENl e SNAP34. SEQ ID No: 39 descreve a seqüência de ácidos nucleicos que codifica para PENl de cevada; a seqüência protéica é descrita em SEQ ID No: 40. SEQ ID No: 41 descreve as seqüências de ácidos nucleicos que codificam para PENl de Arabidopsis thaliana; a seqüência protéica é descrita em SEQ ID No: 42. PENl de Arabidopsis thaliana é publicado sob os números de acesso NM 202559 e NM 112015. O homólogo de cevada é descrito em números de acesso AY246907 e AY246906 como ROR2. Eles são membros da família bastante grande das proteínas sintaxina. Assim, o trabalhador versado pode usar comparações simples de homologia para identificar proteínas sintaxina adicionais que são expressas como genes potenciais de resistência no método de acordo com a invenção.

SEQ ID No: 43 descreve a seqüência de ácidos nucleicos que codifica para SNAP34 de cevada; a seqüência protéica é descrita em SEQ ID No: 44. O homólogo de SNAP-34 de cevada também é publicado como AY 247208 (SNAP-34). Homólogos cuja função é desconhecida e que podem desempenhar um papel na resistência são publicados como AY 247209 (SNAP-28) e AY 247210 (SNAP-25). Os seguintes genes de Arabidopsis mostram um grau maior de homologia com SNAP34 de cevada do que SNAP-28 de cevada ou SNAP-25 para SNAP-34 e podem ser assim vantajosamente co-superexpressos como genes mediadores de resistência potenciais:

AAM 62553 - Arabidopsis SNAP25a NP 200929 - Arabidopsis SNAP33b NP 172842 - Arabidopsis SNAP30 NP 196405 - Arabidopsis SNAP29

Por conseguinte, a invenção também se refere a uma planta na qual um polipeptídeo que é codificado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo as seqüências mostradas em SEQ ID No: 39, 41 ou 43 ou uma das seqüências mostradas nas publicações de bancos de dados mencionadas acima ou que compreende uma das seqüências de aminoácidos mostradas nas publicações de bancos de dados mencionadas acima ou em SEQ ID No: 40, 42 ou 44, ou que é um equivalente funcional deste ou que tem pelo menos 50%, preferivelmente 70%, mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 90%, 95% ou mais homologia com as seqüências mencionadas acima no nível de molécula de ácido nucleico codifícante ou, preferivelmente, no nível de aminoácido é superexpresso pelo menos além disso na epiderme, ou se refere a uma planta na qual o polipeptídeo caracterizado acima é ativado, ou sua atividade ou função aumentada, constitutivamente ou em uma parte, por exemplo em um tecido, mas especialmente vantajosamente pelo menos na epiderme ou um número substancial de células epidérmicas.

Uma redução da expressão ou atividade de uma proteína pode ser causada pelos métodos com os quais o trabalhador versado é familiar, por exemplo, mutagênese, por exemplo, EMS, se apropriado TILLING, iRNA; ribozima, silenciamento, nocaute, e os semelhantes. Métodos de redução são descritos em particular em Patente Internacional 2003/20939, métodos podem ser prontamente adaptados às seqüências descritas nesta, que é a causa do conteúdo de Patente Internacional 2003/20939 ser explicitamente incorporado neste lugar.

A diminuição ou redução da expressão de uma proteína, da atividade ou da função pode ser realizada de muitas maneiras.

"Diminuição", "diminuir", "redução" ou "reduzir" é para ser entendido no amplo sentido em conexão com a presente invenção e compreende a prevenção ou bloqueio parcial ou essencialmente completo da funcionalidade de uma proteína, como o resultado de diferentes mecanismos biológicos celulares.

Uma redução para os propósitos da invenção também compreende uma redução quantitativa de uma proteína até uma ausência essencialmente completa da proteína (i.e. carecendo de detectabilidade de atividade ou função ou carecendo de detectabilidade imunológica da proteína). Neste contexto, a expressão de uma certa proteína ou da atividade, ou função, em uma célula ou um organismo é preferivelmente reduzida em mais do que 50%, especialmente preferivelmente em mais do que 80%, muito especialmente preferivelmente em mais do que 90%.

Os métodos de dsRNAi, co-supressão por meio de RNA sentido e "VIGS" ("silenciamento gênico induzido por vírus") são também referidos como "silenciamento gênico pós transcricional" (PTGS). Métodos de PTGS, como a redução da função ou atividade com variantes negativas dominantes, são especialmente vantajosos, pois os requerimentos para homologia entre o gene endógeno a ser suprimido e a seqüência de ácidos nucleicos recombinantemente expressa sentido ou dsRNA (ou entre o gene endógeno e sua variante negativa dominante, respectivamente) são menores do que, por exemplo, no caso de uma abordagem antisentido tradicional. Tais critérios de homologia são mencionados na descrição do método de dsRNAi e geralmente podem ser aplicados a métodos de PTGS ou abordagens negativas dominantes. "Introdução" compreende, dentro do contexto da presente invenção, todos os métodos que são capazes de introduzir um composto, diretamente ou indiretamente, na epiderme ou em uma parte substancial das células epidérmicas, compartimento ou tecidos das mesmas, ou que são adequados para gerá-los nestas. Isto compreende métodos diretos e indiretos. A introdução pode levar a uma presença transiente de um composto (por exemplo, um dsRNA) ou ainda a uma presença estável. Introduzir compreende, por exemplo, métodos tal como transfecção, transdução ou transformação.

Em construções de expressão da presente invenção, uma

molécula de ácido nucleico descrita neste lugar, cuja expressão (transcrição e, se apropriado, tradução) gera uma molécula de ácido nucleico correspondente, está preferivelmente em ligação operável com pelo menos um elemento de controle genético (por exemplo, um promotor) que assegura expressão em um organismo, preferivelmente em plantas, preferivelmente uma expressão epiderme-específíca. Se a construção de expressão deve ser introduzida diretamente na planta, elementos de controle genético específicos de planta (por exemplo, promotores) são preferidos, onde, como pode ser visto a partir do que foi dito acima, a atividade epiderme-específíca do promotor é obrigatória para a maioria das formas de uso, como descrito neste lugar acima.

Ligação operável é compreendida como significando, por exemplo, o arranjo seqüencial de um promotor e a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa e, se apropriado, elementos reguladores adicionais tal como, por exemplo, um terminador, de uma maneira tal que cada um dos elementos reguladores pode cumprir sua função na expressão recombinante da seqüência de ácidos nucleicos, dependendo do arranjo das seqüências de ácidos nucleicos para fazer RNA sentido ou RNA antisentido. Isto não necessariamente requer ligação direta no sentido químico. Seqüências de controle genético tal como, por exemplo, seqüências acentuadoras, também podem exercer sua função na seqüência alvo a partir de posições que são de alguma maneira distantes, ou de fato a partir de outras moléculas de DNA (localização eis ou trans). Arranjos preferidos são aqueles nos quais a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa recombinantemente está posicionada depois da seqüência que atua como promotor, de forma que as duas seqüências são covalentemente ligadas uma com a outra. A distância entre a seqüência de promotor e a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa recombinantemente é preferivelmente menor do que 200 pares de bases, especialmente preferivelmente menor do que 100 pares de bases, muito especialmente preferivelmente menor do que 50 pares de bases.

A geração de uma ligação operável pode ser realizada por meio de técnicas atuais de recombinação e clonagem, como é a geração de um cassete de expressão. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Maniatis T., Fritsch E.F. e Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) (1989), em Silhavy T.J., Berman M.L. e Enquist L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) (1984), em Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) e em Gelvin et al. in Plant Molecular Biology Manual (1990). Entretanto, também é possível posicionar, entre as duas seqüências, seqüências adicionais que têm, por exemplo, a função de um ligante com certos sítios de clivagem de enzima de restrição, ou de um peptídeo sinal. A inserção de seqüências também pode levar à expressão de proteínas de fusão. Preferivelmente, o cassete de expressão, consistindo de uma ligação de promotor e seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa, pode existir como integrada em um vetor e pode ser inserida em um genoma vegetal, por exemplo, por transformação. Os elementos de controle preferivelmente mediam uma expressão epiderme-específica. Para os propósitos da presente invenção, "aproximadamente" em conexão com números ou tamanhos significa um intervalo de números ou tamanhos ao redor do valor numérico ou do tamanho. Em geral, o termo "aproximadamente" significa um intervalo de em cada caso 10% acima e abaixo do valor detalhado.

Para os propósitos da presente invenção, "planta" significa todos os gêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do reino vegetal. O termo inclui as plantas maduras, grãos, frutos e plântulas, e partes, material de propagação, órgãos vegetais, tecido, protoplastos, calo e outras culturas, por exemplo, culturas celulares, derivadas a partir destes, e quaisquer outros tipos de associações de células vegetais para as unidades funcionais ou estruturais. Plantas maduras significam plantas em qualquer estágio de desenvolvimento depois do estágio de plântula. Plântula significa uma planta imatura jovem em um estágio de desenvolvimento inicial. "Planta" compreende todas as plantas anuais e perenes,

monocotiledôneas e dicotiledôneas e inclui como forma de exemplo, mas não por limitação, aquelas dos gêneros Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianassim, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea e Populus.

O termo "planta" preferivelmente compreende as plantas cultiváveis monocotiledôneas e dicotiledôneas. Preferidas dentro do escopo da invenção são plantas que são empregadas como gêneros alimentícios ou rações, muito especialmente preferidas são gêneros e espécies agricolamente importantes de monocotiledôneas e dicotiledôneas, como detalhado nas reivindicações.

"Resistência a patógeno" significa a redução ou diminuição de sintomas de doença de uma planta como o resultado de ataque por pelo menos um patógeno. Os sintomas podem ser múltiplos na natureza, mas preferivelmente compreendem aqueles que levam diretamente ou indiretamente a um efeito negativo em qualidade de planta, quantidade de produção, a adequabilidade para uso como gênero alimentício ou ração, ou ainda que tornam semeadura, plantio, colheita ou processamento da cultura mais difícil. Para os propósitos da presente invenção, "tolerância a patógeno" é, em particular, para ser considerada como sendo compreendida por "resistência a patógeno".

"Conferir", "existir", "gerar" ou "aumentar" uma resistência significa que os mecanismos de defesa de uma espécie ou variedade particular de planta apresenta resistência aumentada para um ou mais patógenos, como o resultado da aplicação do método de acordo com a invenção, em comparação com tipo selvagem da planta ("planta inicial") à qual este método de acordo com a invenção não foi aplicado, em condições de outra maneira essencialmente idênticas (tal como, por exemplo, condições climáticas, condições de cultura, tipo de estresse, espécie de patógeno e os semelhantes). Neste contexto, a resistência aumentada preferivelmente se manifesta em uma manifestação reduzida dos sintomas de doença, onde sintomas de doença — em adição aos efeitos adversos mencionados acima - também compreendem, por exemplo, a eficiência de penetração de um patógeno na planta ou células vegetais, ou a eficiência de proliferação nas mesmas. Neste contexto, os sintomas de doença são preferivelmente reduzidos em pelo menos 5%, 10% ou pelo menos 20%, especialmente preferivelmente em pelo menos 40% ou 60%, muito especialmente preferivelmente em pelo menos 70% ou 80%, mais preferivelmente em pelo menos 90% ou 95%. "Seleção" significa, em relação a plantas onde - ao contrário de, ou em comparação com, a planta inicial - resistência a pelo menos um patógeno existe ou é aumentada, todos aqueles métodos que são adequados para reconhecer uma resistência a patógeno existente ou crescente. Isto pode ser, por exemplo, sintomas da infecção com patógeno (por exemplo, desenvolvimento de necroses no caso de infecção fungica), mas também pode compreender os sintomas descritos acima, que afetam a qualidade da planta, a quantidade da produção, a adequabilidade para uso como ração ou gênero alimentício, e os semelhantes.

Para os propósitos da invenção, "patógeno" significa como forma de exemplo, mas não por limitação, vírus ou viróides, bactérias, fungos, pestes animais tal como, por exemplo, insetos ou nematóides. Fungos, em particular fungos biotróficos ou heminecrotróficos como definido neste lugar, são especialmente preferidos. Entretanto, pode ser assumido que a expressão mesófilo-específica de uma proteína BIl também cause uma resistência a outros patógenos uma vez que uma resistência a fatores de estresse em total está sendo gerada.

Patógenos que podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não por limitação, são os seguintes:

1. Patógenos fungicos de patógenos tipo fungo: Patógenos fungicos ou patógenos tipo fungo (tal como, por exemplo, Chromista) preferivelmente pertencem ao grupo compreendendo Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycete s, Zygomycetes, Basidiomycota e Deuteromycetes (Fungos imperfeitos). Patógenos que podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não por limitação, são aqueles detalhados em Tabelas 1 a 4, e as doenças que estão associadas com eles. Tabela 1: Doenças causadas por fungos fitopatogênicos biotróficos Doença Patógeno Ferrugem da folha Puccinia recôndita Ferrugem amarela P. striiformis Oídio Erysiphe graminis / Blumeria graminis Ferrugem (milho comum) Puccinia sorghi Ferrugem (Southern corn) Puccinia polysora Mancha foliar do fiimo Cercospora nicotianae Ferrugem (soja) Phakopsora pachyrhizi, P. meibomiae Ferrugem (milho tropical) Physopella pallescens, P. zeae = Angiopsora zeae

Tabela 2:_Doenças causadas por fungos necrotrófícos e/ou

hemibiotróficos e Oomycetes

Doença Patógeno Mancha de gluma Septoria (Stagonospora) nodorum Mancha foliar Septoria tritici Fusarioses de espiga Fusarium spp. Mancha ocular Pseudocercosporella herpotrichoides Fuligem (inóculo de carvão) Ustilago spp. Requeima Phytophthora infestans Cárie Tilletia caries Mal-do-pé Gaeumannomyces graminis Antraenose foliar Antracnose do colmo Colletotrichum graminicola (teleomorfo: Glomerella graminicola Politis); Glomerella tucumanensis (anamorfo: Glomerella falcatum Went) Podridão de espigas e grãos de Aspergillus Aspergillus flavus Mela e mancha das bainhas ("Wurzeltõter") Rhizoctonia solani Kuhn = Rhizoctonia microsclerotia J. Matz (telomorfo: Thanatephorus cucumeris) Podridão negra dos feixes vasculares Acremonium strictum W. Gams = alosporium acremonium Auct. non Corda Podridão preta do grão Lasiodiplodia theobromae = Botryodiplodia theobromae Bordo branco Marasmiellus sp. Mancha marrom (mancha preta, podridão do colmo) Physoderma maydis Podridão de grãos de Cephalosporium Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium Podridão de carvão Macrophomina phaseolina Podridão de espigas de Corticium Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii Mancha foliar de Curvularia Curvularia clavata, C. eragrostidis, = C. maculans (teleomorfo: Cochliobolus eragrostidis), Curvularia inaequalis, C. intermedia (teleomorfo: Cochliobolus intermedius), Curvularia lunata Doença Patógeno (teleomorfo: Cochliobolus lunatus), Curvularia pallescens (teleomorfo: Cochliobolus pallescens), Curvularia senegalensis, C. tuberculata (teleomorfo: Cochliobolus tuberculatus) Mancha foliar de Didymella Didymella exitalis Podridão de espigas e do colmo de Diplodia Diplodia frumenti (teleomorfo: Botryosphaeria festucae) Podridão de espigas e do colmo de Diplodia, podridão de grãos e queima de plântulas Diplodia maydis = Stenocarpella maydis Mancha ou listra foliar de Diplodia Stenocarpella macrospora = Diplodialeaf macrospora Míldio penugento marrom Sclerophthora rayssiae var. zeae Míldio de pendão louco Sclerophthora macrospora = Sclerospora macrospora Míldio verde de espiga (míldio de graminicola) Sclerospora graminicola Podridão seca de espigas (podridão de sabugo, grãos e do colmo) Nigrospora oryzae (teleomorfo: Khuskia oryzae) Podridões das espigas (menores) Alternaria alternata = A. tenuis, Aspergillus glaucus, A. niger, Aspergillus spp., Botrytis cinerea (teleomorfo: Botryotinia fuckeliana), Cunninghamella sp., Curvularia pallescens, Doratomyces stemonitis = Cephalotrichum stemonitis, Fusarium culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus Tiegh., R. stolonifer = R. nigricans, Scopulariopsis brumptii Ergotismo (dente do cavalo) Claviceps gigantea (anamorfo: Sphacelia sp.) Mancha ocular Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae Podridão de espiga e do colmo de Fusarium Fusarium subglutinans = F. moniliforme var.subglutinans Podridão de grão, raiz e do colmo de Fusarium, prodridão de semente e queima de plântulas Fusarium moniliforme (teleomorfo: Gibberella fujikuroi) Podridão do colmo de Fusarium, podridão de raízes de plântulas Fusarium avenaceum (teleomorfo: Gibberella avenacea) Podridão de espiga e do colmo de Gibberella Gibberella zeae (anamorfo: Fusarium graminearum) Podridão cinzenta de espiga Botryosphaeria zeae = Physalospora zeae (anamorfo: Macrophoma zeae) Cercosporiose (mancha foliar de Cercospora) Cercospora sorghi = C. sorghi var. maydis, C. zeae-maydis Podridão de raiz de Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium Doença Patógeno Helminthosporium pedicellatum (teleomorfo: Setosphaeria pedicellata) Podridão de espiga de Hormodendrum (podridão de Cladosporium) Cladosporium cladosporioides = Hormodendrum cladosporioides, C. herbarum (teleomorfo: Mycosphaerella tassiana) Manchas foliares, menores Alternaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae = Helminthosporium victoriae (teleomorfo: Cochliobolus victoriae), C. sativus (anamorfo: Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum), Epicoccum nigrum, Exserohilum prolatum = Drechslera prolata (teleomorfo: Setosphaeria prolata) Graphium penicillioides, Leptosphaeria maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha, (anamorfo: Scolecosporiella sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. zeina Queima foliar do milho do norte (helmintosporiose, podridão da coroa, risca) Setosphaeria turcica (anamorfo: Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum) Mancha foliar do milho do norte podridão de espigas de Helminthosporium (raça 1) Cochliobolus carbonum (anamorfo: Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum) Podridão de espiga de Penicillium (olho azul, mofo azul) Penicillium spp., P. chrysogenum, P. expansum, P. oxalicum Podridão do colmo e de raiz de Phaeocytostroma Phaeocytostroma ambiguum, = Phaeocytosporella zeae Mancha foliar de Phaeosphaeria Phaeosphaeria maydis = Sphaerulina maydis Podridão de espiga de Physalospora (podridão de espiga de Botryosphaeria) Botryosphaeria festucae = Physalospora zeicola (anamorfo: Diplodia frumenti) Bainha foliar violeta Bactérias e fungos hemiparasíticos Podridão do colmo e de raiz de Pyrenochaeta Phoma terrestris = Pyrenochaeta terrestris Podridão de raiz de Pythium Pythium spp., P. arrhenomanes, P. graminicola Podridão do colmo de Pythium Pythium aphanidermatum = P. butleri L. Mancha avermelhada dos grãos (bolor de espiga, podridão das folhas e sementes) Epicoccum nigrum Podridão de espiga de Rhizoctonia (podridão de esclerócio) Ihizoctonia zeae (teleomorfo: Waitea circinata) Podridão de raiz e do colmo de Rhizoctonia ^hizoctonia solani, Rhizoctonia zeae Doença Patógeno Podridões de raiz (menores) Alternaria alternata, Cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acuminatum (teleomorfo: Gibberella acuminata), F. equiseti (teleomorfo: G. intricans), F. oxysporum, F. pallidoroseum, F. poae, F. roseum, G. cyanogena, (anamorfo: F. sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucor sp., Periconia circinata, Phytophthora cactorum, P. drechsleri, P. nicotianae var. parasitica, Rhizopus arrhizus Mancha foliar de Rostratum (doença foliar de Helminthosporium, podridão de espiga e podridão do colmo) Setosphaeria rostrata, (anamorfo: xserohilum rostratum = Helminthosporium rostratum) Míldio de Java Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis Míldio das Filipinas Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis Míldio de sorgo Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi Míldio espontâneo Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spontanea Míldio de cana-de-açúcar Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari Podridão de espiga de Sclerotium (murcha do sul) Sclerotium rolfsii Sacc. (teleomorfo: Athelia rolfsii) Podridão de sementes-queima de plântulas Bipolaris sorokiniana, B. zeicola = Helminthosporium carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicillatum, Exserohilum turcicum Helminthosporium turcicum, Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, Gibberella zeae (anamorfo: F. graminearum), Macrophomina phaseolina, Penicillium spp., Phomopsis sp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, R. zeae, Sclerotium rolfsii, Spicaria sp. Mancha foliar de Selenophoma Selenophoma sp. Mal do pé Gaeumannomyces graminis Podridão da casca Myrotheeium gramineum Bolor da silagem Monascus purpureus, M ruber Carvão comum Ustilago zeae = U. maydis Carvão falso Ustilaginoidea virens Carvão do topo Sphacelotheca reiliana = Sporisorium holcisorghi Queima foliar e podridão do colmo de milho do sul Cochliobolus heterostrophus (anamorfo: Bipolaris maydis = Helminthosporium maydis) Mancha foliar do Sul Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora Podridões do colmo (menores) Cercospora sorghi, Fusarium episphaeria, F. merismoides, F. oxysporum Schlechtend, F. poae, F. roseum, F. solani (teleomorfo: Nectria iaematococca), F. tricinctum, Mariannaea elegans, Mucor sp., Rhopographus zeae, Spicaria Doença Patógeno sp. Podridões de órgãos de armazenamento Aspergillus spp., Penicillium spp. und weitere Pilze Mancha de piche Phyllachora maydis Podridão de espiga e podridão de raiz de Trichoderma Trichoderma viride = T. Iignorum teleomorfo: Hypocrea sp. Podridão branca de espiga, podridão de raiz e do colmo Stenocarpella maydis = Diplodia zeae Queima foliar amarela Ascochyta ischaemi, Phyllosticta maydis (teleomorfo: Mycosphaerella zeae-maydis) Mancha foliar zonada Gloeocercospora sorghi

Tabela 4:_Doenças causadas por fungos e Oomycetes com classificação

imprecisa considerando comportamento biotrófico, hemibiotrófico ou

necrotrófico

Doença Patógeno Mancha foliar de Hyalothyridium Hyalothyridium maydis Murcha tardia Cephalosporium maydis

Os seguintes são especialmente preferidos:

- Plasmodiophoromycota tal como Plasmodiophora brassicae

(hérnia das crucíferas), Spongospora subterranea, Polymyxa graminis,

- Oomycota tal como Bremia lactucae (míldio de alface), Peronospora (míldio) em boca-de-dragão (P. antirrhini), cebola (P. destructor), espinafre (P. effiisa), soja (P. manchurica), tabaco ("mofo azul";

P. tabacina) alfafa e trevo (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (míldio de lúpulo), Plasmopara (míldio em videiras) (P. viticola) e girassol (P. halstedii), Sclerophthora macrospora (míldio em cereais e gramíneas), Pythium (por exemplo tombamento de beterraba Beta causado por P. debaryanum), Phytophthora infestans (requeima em batata e em tomate e os

semelhantes), Albugo spec.

- Ascomycota tal como Microdochium nivale (molde da neve de centeio e trigo), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (esterilidade parcial de espiga principalmente em trigo), Fusarium oxysporum (murcha de Fusarium de tomate), Blumeria graminis (oídio de cevada (f.sp. hordei) e trigo

(f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (oídio de ervilha), Nectria galligena (Nectria canker de árvores frutíferas), Uncinula necator (oídio de videira), Pseudopeziza tracheiphila (bronzeamento das bagas de videira), Claviceps purpurea (ergotismo em, por exemplo, centeio e gramíneas), Gaeumannomyces graminis (mal-do-pé em trigo, centeio e outras gramíneas), Magnaporthe grisea, Pyrenophora graminea (estria foliar de cevada), Pyrenophora teres (mancha reticular de cevada), Pyrenophora tritici-repentis (queima foliar de trigo), Venturia inaequalis (sarna da maça), Sclerotinia sclerotium (podridão de esclerotínia, podridão do caule), Pseudopeziza medicaginis (mancha foliar de alfafa, trevo branco e vermelho).

- Basidiomycetes tal como Typhula incarnata (queima de molde cinzento da neve em cevada, centeio, trigo), Ustilago maydis (carvão coberto em milho), Ustilago nuda (carvão nú em cevada), Ustilago tritici (carvão nú em trigo, espelta), Ustilago avenae (carvão nú em aveia), Rhizoctonia solani (podridão de raiz de rhizoctonia de batata), Sphacelotheca spp. (carvão do topo de sorgo), Melampsora Iini (ferrugem de linhaça), Puccinia graminis (ferrugem do colmo de trigo, cevada, centeio, aveia), Puccinia recôndita (ferrugem da folha em trigo), Puccinia dispersa (ferrugem marrom em centeio), Puccinia hordei (ferrugem da folha de cevada), Puccinia coronata (ferrugem da folha de aveia), Puccinia striiformis (ferrugem amarela de trigo, cevada, centeio e um grande número de gramíneas), Uromyces appendiculatus (ferrugem marrom de feijão), Sclerotium rolfsii (podridões de raiz e do colmo de muitas plantas).

Deuteromycetes (Fungos imperfeitos) tal como Septoria (Stagonospora) nodorum (septoriose das glumas) de trigo (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (mancha ocular de trigo, cevada, centeio), Rynchosporium secalis (mancha foliar em centeio e cevada), Alternaria solani (pinta preta de batata, tomate), Phoma betae (pé negro em beterraba Beta), Cercospora beticola (mancha foliar em beterraba Beta), Alternaria brassicae (mancha preta em colza, repolho e outras crucíferas), Verticillium dahliae (murcha de vertieílio), Colletotrichum lindemuthianum (antracnose do feijão), Phoma lingam (pé negro de repolho e colza), Botrytis cinerea (mofo cinzento de videira, morango, tomate, lúpulo e os semelhantes).

Especialmente preferidos são patógenos biotróficos, dentre os quais em particular patógenos heminecrotróficos, i.e. Phakopsora pachyrhizi e/ou aqueles patógenos que têm um mecanismo de infecção essencialmente similar como Phakopsora pachyrhizi, como descrito neste lugar. Particularmente preferidos são patógenos do grupo Uredinales (ferrugens), dentre os quais em particular os Melompsoraceae. Especialmente preferidos são Phakopsora pachyrhizi e/ou Phakopsora meibomiae. 2. Patógenos bacterianos:

Os patógenos e as doenças associadas com eles que são mencionados em Tabela 5 podem ser mencionados como forma de exemplo mas não por limitação. Tabela 5: Doenças bacterianas

Doença Patógeno Queima foliar e podridão bacteriana do colmo Pseudomonas avenae subsp. avenae Mancha foliar bacteriana Xanthomonas campestris pv. holcicola Podridão bacteriana do colmo Enterobacter dissolvens = Erwinia dissolvens Podridão bacteriana e podridão do topo Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi pv. zeae Risca bacteriana Pseudomonas andropogonis Mancha chocolate Pseudomonas syringae pv. coronafaciens Murcha bacteriana de Goss e queima (sardas foliares e murcha) Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis = Corynebacterium michiganense pv.andnebraskense Mancha de Holcus Pseudomonas syringae pv. syringae Bainha foliar violeta Bactérias hemiparasíticas Podridão de semente-queima de plântulas Bacillus subtilis Murcha de Stewart (murcha bacteriana) Pantoea stewartii = Erwinia stewartii Enfezamento do milho (enfezamento pálido, enfezamento do milho, enfezamento do milho de Mesa Central ou Rio Grande) Spiroplasma kunkelii

3. Patógenos virais: "Patógenos virais" inclui todos os vírus de plantas tal como, por exemplo, vírus do mosaico de tabaco ou pepino, vírus da mancha anelar, vírus da necrose, vírus do mosaico do milho e os semelhantes.

Os patógenos e doenças associadas com eles que são mencionados em Tabela 6 podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não por limitação.

Tabela 6: Doenças virais

Doença Patógeno Estriado do trigo americano (mosaico estriado do trigo) Vírus do mosaico estriado do trigo americano (AWSMV) Mosaico estriado da cevada Vírus do mosaico estriado da cevada (BSMV) Nanismo amarelo da cevada Vírus do nanismo amarelo da cevada (BYDV) Mosaico do capim bromo Vírus do mosaico do capim bromo (BMV) Mancha clorótica de cereal Vírus da mancha clorótica de cereal (CCMV) Bandeamento clorótico de nervura do milho (mosaico do milho brasileiro) Vírus do bandeamento clorótico de nervura do milho (CCVBV) Necrose letal do milho Complexo viral de Vírus da mancha clorótica do milho (MCMV) e Vírus do mosaico do milho (MDMV) A ou B ou Vírus do mosaico estriado do trigo (WSMV) Mosaico do pepino Vírus do mosaico do pepino (CMV) Listra clorótica de Cynodon Vírus da listra clorótica de Cynodon (CCSV) Mosaico de Johnsongrass Vírus do mosaico de Johnsongrass (JGMV) Enfezamento vermelho do milho Associado a organismo tipo Mycoplasma (MLO) Nanismo clorótico do milho Vírus do nanismo clorótico do milho (MCDV) Mancha clorótica do milho Vírus da mancha clorótica do milho (MCMV) Mosaico do nanismo do milho Vírus do mosaico do nanismo do milho (MDMV) linhagens A, D, E e F Mancha foliar do milho Vírus da mancha foliar do milho (MLFV) Mosaico em desenho do milho Vírus do mosaico em desenho do milho (MLV) Mosaico do milho (estria foliar de milho, nanismo estriado) Vírus do mosaico do milho (MMV) Enfezamento pálido e mosqueado do milho Vírus do enfezamento pálido e mosqueado do milho Mancha anelar clara de milho Vírus da mancha anelar clara de milho (MPRV) Estria grossa do milho Vírus da estria grossa do milho (MRGV) Risca do milho (doença do listrado fino) Vírus da risca do milho (MRFV) Vermelhão e estria vermelha do milho Molicute Estria vermelha do milho Vírus da estria vermelha do milho (MRSV) Mancha anelar do milho Vírus da mancha anelar do milho (MRMV) Mal do rio IV do milho Vírus do mal do rio cuarto (MRCV) Nanismo rugoso do milho Vírus do nanismo rugoso do milho (MRDV) (nanismo rugoso) (Vírus da doença do perfilhamento de cereal) Nanismo esterilizante do milho Vírus do nanismo esterilizante do milho (linhagens de vírus do estriado amarelo da cevada) Listrado do milho Vírus do listrado do milho (MSV) Listrado do milho (listra clorótica do milho, folha branca do milho) Vírus do listrado do milho Enfezamento do milho Vírus do enfezamento do milho Aborto do pendão do milho Vírus do aborto do pendão do milho (MTAV) Enação das nervuras do milho Vírus da enação das nervuras do milho (MVEV) Orelha do wallaby do milho Vírus da orelha do wallaby do milho (MWEV) Mancha branca da folha do milho Vírus da mancha branca da folha do milho Mosaico das linhas brancas do milho Vírus do mosaico das linhas brancas do milho (MWLMV) Vermelhão do milheto Vírus do vermelhão do milheto (MRLV) Mosaico do norte de cereal Vírus do mosaico do norte de cereal (NCMV) Pseudo-roseta da aveia (zakuklivanie) Vírus da pseudo-roseta da aveia Nanismo esterilizante da aveia Vírus do nanismo esterilizante da aveia (OSDV) Nanismo do arroz Vírus do nanismo do arroz (RBSDV) Estriado do arroz Vírus do estriado do arroz (RSV) Mosaico do sorgo Vírus do mosaico do sorgo (SrMV) (auch: vírus do mosaico da cana-de-açúcar (SCMV) Stãmme Η, I e M) Doença de Fiji da cana de açúcar Vírus da doença de Fiji da cana de açúcar (FDV) Mosaico da cana-de-açúcar Vírus do mosaico da cana-de-açúcar (SCMV) linhagens A, B, D, E, SC, BC, Sabi e MB (anteriormente MDMV-B) Mosaico manchado do trigo Vírus do mosaico manchado do trigo (WSMV)

4. Pestes animais

4. !Insetos patogênicos:

Os seguintes podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não por limitação: insetos tal como, por exemplo, besouros, lagartas, piolhos ou ácaros.

Insetos preferidos são aqueles dos gêneros Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc. Especialmente preferidos são insetos coleópteros e lepidópteros tal como, por exemplo, a broca do milho europeu (ECB), Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata, Diabrotica virgifera, Agrotis ipsilon, Crymodes devastator, Feltia ducens, Agrotis gladiaria, Melanotus spp., Aeolus mellillus, Aeolus mancus, Horistonotus uhlerii, Sphenophorus maidis, Sphenophorus zeae, Sphenophorus parvulus, Sphenophorus callosus, Phyllogphaga spp., Anuraphis maidiradicis, Delia platura, Colaspis brunnea, Stenolophus lecontei e Clivinia impressifrons.

Outros exemplos são: besouro da folha da cevada (Oulema melanopus), cloropídeo (Oscinella frit), larva rosca (Agrotis lineatus) e afídeos (tal como, por exemplo, o pulgão da aveia Rhopalosiphum padi, o pulgão da amora preta Sitobion avenae).

4.2. Nematóides:

Os patógenos e as doenças associadas com eles mencionados em Tabela 7 podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não por limitação.

Tabela 7: Nematóides parasíticos

Lesão Nematóide patogênico Broca Dolichodorus spp., D. heterocephalus Doença de nematóide de bulbos e caules; nematóide de bulbos Ditylenchus dipsaci Nematóide cavernícola Radopholus similis Doença de nematóide de cisto Heterodera avenae, H. zeae, Punctodera chalcoensis Nematóide adaga Xiphinema spp., X. americanum, X. mediterraneum Galha falsa Nacobbus dorsalis Nematóide da flecha de Columbia Hoplolaimus columbus Nematóide da flecha Hoplolaimus spp., H. galeatus Lesão Pratylenchus spp., P. brachyurus, P. crenatus, P. hexincisus, P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thornei, P. zeae Nematóide de estilete Longidorus spp., L. breviannulatus Nematóide anelado Criconemella spp., C. ornata Doença de galha Meloidogyne spp., M. chitwoodi, M. incógnita, M. javanica Nematóide espiralado Helicotylenchus spp. Nematóide sting Belonolaimus spp., B. Iongicaudatus Nematóide das raízes em coto Paratrichodorus spp., P. christiei, P. minor, Quinisulcius acutus, Trichodorus spp. Enfezamento Tylenchorhynchus dubius

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Muito especialmente preferidos são Globodera rostochiensis e G. pallida (nematóide de cisto em batata, tomate e outras Solanaceae), Heterodera schachtii (nematóide da beterraba em beterraba açucareira e forragem, colza, repolho e os semelhantes), Heterodera avenae (nematóide de cisto de aveia em aveia e outras espécies de cereal), Ditylenchus dipsaci (nematóide dos caules ou bulbos, nematóide dos caules de centeio, aveia, milho, trevo, tabaco, beterraba), Anguina tritici (nematóide dos grãos, nematóide da galha de trigo (espelta, centeio), Meloidogyne hapla (nematóide da galha de cenoura, pepino, alface, tomate, batata, beterraba açucareira, luzerna).

Exemplos de patógenos fungicos ou virais preferidos para as variedades individuais são:

1. Cevada:

Patógenos fungicos, bacterianos e virais: Puccinia graminis f.sp. hordei, vírus do nanismo amarelo da cevada (BYDV),

Insetos/nematóides patogênicos: Ostrinia nubilalis (broca do milho europeu); Agrotis ipsilon; Schizaphis graminum; Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare; Euschistus servus; Deliaplatura; Mayetiola destructor; Petrobia latens.

2. Soja:

Patógenos fungicos, bacterianos ou virais: Phytophthora megasperma fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, vírus do mosaico da soja, ferrugem da soja, Glomerella glycines, vírus da mancha anelar do fumo, vírus do listrado do tabaco, Phakopsorapachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, vírus do vira cabeça do tomateiro, Heterodera glycines Fusarium solani; particularmente ferrugem da soja.

Insetos/nematóides patogênicos: Pseudoplusia incluedens;

Anticarsia gemmatalis; Plathypena scabra; Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Spodoptera exigua; Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Epilachna varivestis; Myzus persicae; Empoasca fabae; Acrosternum hilare; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Hylemya platura; Sericothrips variabilis; Thrips tabaci; Tetranychus turkestani; Tetranychus urticae;

3. Colza:

Patógenos fungicos, bacterianos ou virais: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.

4. Alfafa:

Patógenos fungicos, bacterianos ou virais: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae. 5· Trigo:

Patógenos fungicos, bacterianos ou virais: Pseudomonas

syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminieola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puecinia graminis f.sp. tritici, Pueeinia recôndita f.sp. tritici, Puceinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria (Stagonospora) nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, vírus do nanismo amarelo da cevada, vírus do mosaico do capim bromo, vírus do mosaico do trigo transmitido pelo solo, vírus do mosaico estriado do trigo, vírus do mosaico estriado fusiforme do trigo, vírus do mosaico estriado do trigo americano, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, vírus das planícies altas, vírus do mosaico estriado do trigo europeu, Puccinia graminis f.sp. tritici (ferrugem do colmo do trigo), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (oídio do trigo).

Insetos/nematóides patogênicos: Pseudaletia unipunctata; Spodoptera, frugiperda; Elasmopalpus lignosellus; Agrotis orthogonia; Elasmopalpus Zignosellus; Oulema melanopus; Hypera punctata; Diabrotica undecimpunctata howardi; pulgão do trigo russo; Schizaphis graminum; Macrosiphum avenae; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Melanoplus sanguinipes; Mayetiola destructor; Sitodiplosis mosellana; Meromyza americana; Hylemya coarctata; Frankliniella fusca; Cephus cinctus; Aceria tulipae; 6. irassol:

Patógenos fungicos, bacterianos ou virais: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Amarelamento do Áster, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum ρ.ν. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.

Insetos/nematóides patogênicos: Suleima helianthana; Homoeosoma electellum; Zygogramma exclamationis; Bothyrus gibbosus; Neolasioptera murtfeldtiana; 7. Milho:

Patógenos fungicos, bacterianos ou virais: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenoearpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Maerophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoderma viride, vírus do mosaico do milho A & B, vírus do mosaico estriado do trigo, vírus do nanismo clorótico do milho, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, vírus da mancha clorótica do milho, vírus das planícies altas, vírus do mosaico do milho, vírus da risca do milho, vírus do listrado do milho (MSV), vírus do listrado do milho, vírus do nanismo rugoso do milho.

Insetos/nematóides patogênicos: Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Helicoverpa zea; Spodoptera frugiperda; Diatraea grandiosella; Elasmopalpus lignosellus; Diatraea saecharalis; Diabrotica virgifera; Diabrotiea longieornis barberi; Diabrotiea undecimpunctata howardi; Melanotus spp.; Cyeloeephala borealis; Cyclocephala immaculata; Popillia japonica; Chaetoenema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Anuraphis maidiradicis; Blissus leucopterus leucopterus; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus sanguinipes; Hylemva platura; Agromyza parvicornis; Anaphothrips obscrurus; Solenopsis milesta; Tetranyehus urticae. 8. Sorgo:

Patógenos fungicos, baeterianos ou virais: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cereospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Aseoehyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Pueeinia purpurea, Maerophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, mosaico de cana-de-açúcar H, vírus do mosaico do milho A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola.

Insetos/nematóides patogênicos: Chilo partellus; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Elasmopalpus lignosellus; Feltia subterranea; Phvllophaga crinita ; Eleodes, Conoderus und Aeolus spp.; Oulema melanopus; Chaetocnema pulicaria; Sphenophorus maidis; Rhopalosiphum maidis; Siphaflava; Blissus leucopterus leucopterus; Contarinia sorghicola; Tetranychus cinnabarinus; Tetranyehus urtieae.

9. Algodão:

Insetos/nematóides patogênicos: Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Spodoptera exigua; Peetinophora gossypiella; Anthonomus grandis grandis; Aphis gossypii; Pseudatomoscelis seriatus; Trialeurodes abutilonea; Lygus lineolaris; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Thrips tabaci (traça da cebola); Franklinkiella fusca; Tetranychus cinnabarinus; Tetranyehus urtieae.

10. Arroz:

Insetos/nematóides patogênicos: Diatraea saccharalis; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Colaspis brunnea; Lissorhoptrus oryzophilus; Sitophilus oryzae; Nephotettix nigropictus; Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare.

11. Colza:

Insetos/nematóides patogênicos: Brevicoryne brassicae; Phyilotreta cruciferae; Mamestra conjgurata; Plutella xylostella; Delia ssp..

Os processos e métodos de acordo com a invenção primeiramente se referem por preferência à soja, partes vegetais, células e/ou sementes desta. Igualmente, os processos e métodos de acordo com a invenção se referem por preferência à ferrugem da soja.

Para os propósitos da invenção, "proteína BIl" significa polipeptídeos que têm pelo menos uma seqüência com pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 80%, especialmente preferivelmente pelo menos 90%, muito especialmente preferivelmente pelo menos 95% e especialmente preferivelmente 100% de homologia com um motivo consenso de BIl selecionado a partir do grupo consistindo de a) H(L/I)KXVY b) AXGA(Y/F)XH c) NIGG d) P(V/P)(Y/F)E(E/Q)(R/Q)KR e) (E/Q)G(A/S)S(V/I)GPL f) DP(S/G)(L/I)(I/L) g) V(G/A)T(A/S)(L/I)AF(A/G)CF(S/T) h) YL(Y/F)LGG, preferivelmente EYLYLGG i) L(L/V)SS(G/W)L(S/T)(I/M)L(L/M)W j) DTGX(W)(W)E.

Especialmente preferido neste contexto é o motivo consenso de BI f) YL(Y/F)LGG, muito especialmente preferido é (EYLYLGG). Este motivo é característico para proteínas BIl vegetais. Seqüências com homologia para pelo menos 2 ou 3 destes motivos (aaj) são especialmente preferivelmente encontradas em uma proteína BI1, muito especialmente preferivelmente pelo menos 4 ou 5, mais preferivelmente todos os motivos a a j. Ademais motives de seqüência típica de BIl podem ser derivados pelo trabalhador versado sem dificuldade a partir do alinhamento de seqüências de proteínas BIl como mostrado em FIG. 1 ou 6.

Especialmente preferidas para o uso nos métodos descritos neste lugar são proteínas BIl que são codificadas por um polipeptídeo que compreende pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo de:

a) as seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46;

b) seqüências com pelo menos 50%, mais preferivelmente 60%, 70%, 80%, 85% ou 90%, especialmente preferivelmente 95, 97 ou 99% ou mais identidade com uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46; e

c) seqüências que compreendem pelo menos uma seqüência parcial de pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos de uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46,

d) e/ou que compreendem pelo menos uma seqüência parcial de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, onde a seqüência parcial tem 80%, preferivelmente 85% ou 90%, especialmente preferivelmente 95, 97 ou 99% ou mais identidade com a seqüência parcial correspondente de uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46.

Compreendidas em conformidade com a invenção pelo termo proteína BI são em particular mutações naturais ou artificiais dos polipeptídeos BIl como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 38 e em particular 46, e polipeptídeos homólogos ou similares de outros organismos, preferivelmente plantas, que além disso têm propriedades essencialmente idênticas. Mutações compreendem substituições, adições, deleções, inversões ou inserções de um ou mais resíduos de aminoácidos.

Também são assim compreendidas formas de uso utilizando proteínas BIl de organismos não vegetais tal como por exemplo humanos (GenBank Acc.-No.: P55061), rato (GenBank Acc.-No.: P55062) ou Drosophila (GenBank Acc.-No.: Q9VSH3). Motivos que são conservados entre proteínas BIl vegetais e não vegetais podem ser prontamente identificados por alinhamentos de seqüências (cf. alinhamento em Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003); Fig. 1 e 6).

Assim, a presente invenção também compreende por exemplo aqueles polipeptídeos que são obtidos por modificação de um polipeptídeo como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 38 e 46.

As seqüências de outras plantas que são homólogas às seqüências de BI1 descritas dentro do escopo da presente invenção podem ser encontradas por exemplo por a) busca em banco de dados em bibliotecas de organismos cuja seqüência genômica ou cDNA é conhecida por completo ou em parte, usando as seqüências de BIl fornecidas como seqüência de busca, ou

b) triagem de bibliotecas gênicas ou bibliotecas de cDNA usando as seqüências de BIl fornecidas como sonda.

Triagem de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas (por exemplo usando uma das seqüências de ácidos nucleicos descritas sob SEQ ID NO: 1,3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25, 27, 29, 31,37 e 45 ou partes destas como sonda) é um método de identificar seqüências homólogas ou similares ou idênticas, cujo método é conhecido pelo trabalhador versado. Neste contexto, as sondas derivadas das seqüências de ácidos nucleicos como mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 37 e 45 têm um comprimento de pelo menos 20 bp, preferivelmente pelo menos 50 bp, especialmente preferivelmente pelo menos 100 bp, muito especialmente preferivelmente pelo menos 200 bp, mais preferivelmente pelo menos 400 bp. Uma fita de DNA que é complementar às seqüências descritas sob SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 37 e 45 também pode ser empregada para triar as bibliotecas.

Homologia entre duas seqüências de ácidos nucleicos é compreendida como significando, no presente contexto, a identidade da seqüência de ácidos nucleicos sobre em cada caso o comprimento inteiro da seqüência que, por sua vez, é calculado por alinhamento com o auxílio do algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et ai., Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)) estabelecendo os seguintes parâmetros:

Peso de lacuna: 50 Peso de comprimento: 3

Pareamento médio: 10 Mal pareamento médio: 0

Por exemplo uma seqüência que tem pelo menos 80% de homologia com seqüência SEQ ID NO: 1 no nível de ácido nucleico é compreendida como significando uma seqüência que, mediante alinhamento com a seqüência SEQ ID NO: 1 pelo algoritmo de programa acima com o ajuste de parâmetros acima, tem pelo menos 80% de homologia.

Homologia entre dois polipeptídeos é compreendida como significando a identidade da seqüência de aminoácidos sobre em cada caso o comprimento inteiro da seqüência que é calculado por alinhamento com o auxílio do algoritmo de programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), estabelecendo os seguintes parâmetros:

Peso de lacuna: 8 Peso de comprimento: 2

Pareamento médio: 2,912 Mal pareamento médio:-2,003

Por exemplo uma seqüência que tem pelo menos 80% de homologia com seqüência SEQ ID NO: 2 no nível de proteína é compreendida como significando uma seqüência que, mediante comparação com a seqüência SEQ ID NO: 2 pelo algoritmo de programa acima com o ajuste de parâmetros acima, tem pelo menos 80% de homologia.

Proteínas BIl também compreendem aqueles polipeptídeos que são codificados por seqüências de ácidos nucleicos que hibridizam em condições padrão com uma das seqüências de ácidos nucleicos de BU descritas por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 37 e 45, a seqüência de ácidos nucleicos que é complementar a estas ou partes das acima, e que têm propriedades essencialmente idênticas que as proteínas descritas sob SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 38 e 46.

"Condições de hibridização padrão" é para ser entendido no amplo sentido e significa condições estringentes de hibridização ou ainda menos estringentes. Tais condições de hibridização são descritas, entre outros, por Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. et al., em Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) ou em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ν. Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, as condições durante a etapa de lavagem podem ser selecionadas a partir do intervalo de condições delimitado por condições de baixa estringência (aproximadamente 2X SSC a 50°C) e condições de alta estringência (aproximadamente 0,2X SSC a 50°C, preferivelmente a 65°C) (20X SSC: 0,3M de citrato de sódio, 3M de NaCl, pH 7,0). Em adição, a temperatura durante a etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência em temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, para condições de maior estringência a aproximadamente 65°C. Ambos os parâmetros concentração salina e temperatura podem ser variados simultaneamente, ou ainda um dos dois parâmetros pode ser mantido constante enquanto apenas o outro é variado. Desnaturantes, por exemplo formamida ou SDS, também podem ser empregados durante a hibridização. Na presença de formamida a 50%, hibridização é preferivelmente efetuada a 42°C.

"Propriedades essenciais" significa, em relação a uma proteína BI, uma ou mais das seguintes propriedades:

a) Conferir ou aumentar a resistência a patógeno para pelo menos um patógeno enquanto aumentando a quantidade de proteína ou função de dita proteína BI em pelo menos um tecido da planta, preferivelmente pelo menos na epiderme da planta.

b) Não aparecimento de uma morte celular induzida espontaneamente quando aumentando a quantidade de proteína ou a função de dita proteína BI.

c) A propriedade de inibir significativamente a apoptose induzida por BAX no caso de cotransfecção transiente de Bax com dita proteína BIl, por exemplo em células HEK293. Métodos adequados foram descritos (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003)).

d) A presença de cinco a sete domínios transmembrana putativos dentro de dita proteína BI. e) Localização preferencial em membranas celulares, em particular na membrana nuclear, na membrana ER e/ou na membrana tilacóide.

Neste contexto, a manifestação quantitativa de ditas propriedades de uma proteína BIl pode desviar para cima ou para baixo em comparação com o valor obtido para a proteína BIl como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 38 ou 46.

Para os propósitos da presente invenção, o termo "aumentar a quantidade ou função de proteína BIl" é para ser entendido no amplo sentido e pode ser baseado em diferentes mecanismos biológicos da célula.

"Quantidade de proteína" significa a quantidade de uma proteína BIl no organismo, tecido, célula ou compartimento celular detalhado.

"Aumentar a quantidade de proteína" significa o aumento quantitativo da quantidade de uma proteína BIl no organismo, tecido, célula ou compartimento celular detalhado, por exemplo por meio de um dos métodos descritos a seguir, em comparação com o tipo selvagem do mesmo gênero e espécie, ao qual este método não foi aplicado, mas nas condições de outra maneira idênticas (tal como, por exemplo, condições de cultura, idade das plantas e os semelhantes). Neste contexto, o aumento eqüivale a pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 30% ou pelo menos 50%, especialmente preferivelmente pelo menos 70% ou 100%, muito especialmente preferivelmente pelo menos 200% ou 500%, mais preferivelmente pelo menos 1000%. A quantidade de proteína pode ser determinada por meio de uma variedade de métodos com os quais o trabalhador versado é familiar. Exemplos que podem ser mencionados, mas não por limitação, são: o método do micro-biureto (Goa J., Scand J. Clin. Lab. Invest. 5, 218 (1953)), o método de Folin-Ciocalteu (Lowry O.H. et al., J Biol Chem 193, 265 (1951)) ou a medida da absorção de CBB G-250 (Bradford Μ.Μ., Analyt. Biochem. 72, 248 (1976)). Além disso, uma quantificação pode ser realizada através de métodos imunológicos tal como, por exemplo, Western blot. A geração de anticorpos BIl adequados e o procedimento de Western blots de BIl é descrito (Bolduc N. et al., FEBS Lett 532, 111 (2002)). Uma quantificação indireta pode ser realizada através de Northern blots, onde, como uma regra, a quantidade de mRNA se correlaciona bem com a quantidade de proteína resultante. Métodos adequados foram descritos (Bolduc N. et al., Planta 216, 377 (2003); Matsumura H. et al., Plant J. 33, 425 (2003)).

"Função" preferivelmente significa a propriedade de uma proteína BIl de reduzir a morte celular induzida espontaneamente e/ou a propriedade de inibir o efeito indutor de apoptose de Bax. Tais funções estão entre as propriedades essenciais de uma proteína BI1.

Dentro do escopo da presente invenção, "aumentar" a função significa, por exemplo, o aumento quantitativo do efeito inibidor na morte celular apoptótica induzida por Bax, que pode ser determinada quantitativamente por métodos com os quais o trabalhador versado é familiar (veja neste lugar acima). Neste contexto, o aumento eqüivale a pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 30% ou pelo menos 50%, especialmente preferivelmente pelo menos 70% ou 100%, muito especialmente preferivelmente pelo menos 200% ou 500%, mais preferivelmente pelo menos 1000%. Métodos de aumentar a função compreendem, além do método descrito acima de aumentar a quantidade de proteína (que, como uma regra, também aumenta a função) além disso - como forma de exemplo, mas não por limitação - em particular a introdução de mutações em uma proteína BI1 ou a inibição de um inibidor putativo de BI1, e os semelhantes.

A quantidade de proteína BIl pode ser aumentada por exemplo, mas não por limitação, por um dos métodos seguintes:

a) expressão recombinante ou superexpressão de uma proteína BI1 introduzindo um cassete de expressão recombinante compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos codificando para uma proteína BIl sob o controle de um promotor específico de tecido, onde dito promotor tem atividade preferivelmente essencialmente especificamente na epiderme foliar e/ou na atividade no mesófilo.

b) modificação (por exemplo substituição) das regiões regularas (por exemplo a região promotora) de um gene BIl endógeno, por exemplo substituição por um promotor específico de tecido por meio de recombinação homóloga, onde dito promotor tem atividade preferivelmente essencialmente especificamente na epiderme foliar e/ou nenhuma atividade no mesófilo.

c) inserção de uma seqüência de ácidos nucleicos, codificando para uma proteína BI1, no genoma vegetal depois de um promotor específico de tecido por meio de recombinação homóloga, onde dito promotor tem atividade preferivelmente essencialmente especificamente na epiderme foliar e/ou nenhuma atividade no mesófilo.

d) aumentar a expressão de uma proteína BIl endógena introduzindo um fator de transcrição (por exemplo fator de transcrição artificial da classe das proteínas dedo de zinco) que é adequado para induzir a expressão de dita proteína BI. É preferida a introdução de um cassete de expressão recombinante compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos codificando para dito fator de transcrição sob o controle de um promotor específico de tecido, onde dito promotor tem atividade preferivelmente essencialmente especificamente na epiderme foliar e/ou nenhuma atividade no mesófilo.

Para os propósitos da presente invenção, o termo "introduzir/introdução" geralmente compreende todos os métodos que são adequados para transferir o composto a ser introduzido, ou diretamente ou indiretamente, para uma planta ou para uma célula, compartimento, tecido, órgão ou grão desta, ou gerá-lo nesta. Isto compreende métodos diretos e indiretos. A introdução pode levar a uma presença transiente de dito composto ou ainda a uma presença estável ou induzível. "Introduzir" compreende por exemplo métodos tais como transfecção, transdução ou transformação.

Nos cassetes de expressão recombinante que são empregadas dentro do escopo da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico (por exemplo codificando para uma proteína BI1) está em ligação operável com pelo menos um promotor específico de tecido, onde dito promotor tem atividade preferivelmente essencialmente especificamente na epiderme foliar e/ou nenhuma atividade no mesófilo, e onde o promotor é heterólogo em relação à seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa, i.e. não ocorre naturalmente em combinação com a mesma. Os cassetes de expressão recombinante de acordo com a invenção podem compreender opcionalmente elementos de controle genético adicionais.

Ligação operável deve ser entendida como significando, por exemplo, o arranjo seqüencial de dito promotor com a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa e, se apropriado, elementos reguladores adicionais tal como, por exemplo, um terminador de uma maneira tal que cada um dos elementos reguladores pode cumprir sua função quando a seqüência de ácidos nucleicos é expressa recombinantemente. Para esta finalidade, ligação direta no sentido químico não é necessariamente requerida. Seqüências de controle genético tais como, por exemplo, seqüências acentuadoras, também podem exercer sua função na seqüência alvo a partir de posições que são mais afastadas, ou efetivamente a partir de outras moléculas de DNA. Arranjos preferidos são aqueles nos quais a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa recombinantemente está posicionada depois da seqüência atuando como promotor, de forma que as duas seqüências são covalentemente ligadas uma a outra. A distância entre a seqüência de promotor e a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa recombinantemente é preferivelmente menor do que 200 pares de bases, especialmente preferivelmente menor do que 100 pares de bases, muito especialmente preferivelmente menor do que 50 pares de bases. Ligação operável, e um cassete de expressão recombinante, podem ser geradas por meio de técnicas costumeiras de recombinação e clonagem como são descritas acima. Entretanto, seqüências adicionais que, por exemplo, atuam como um ligante com sítios de clivagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptídeo sinal, também podem ser posicionadas entre as duas seqüências. A inserção de seqüências também pode levar à expressão de proteínas de fusão.

Preferivelmente, o cassete de expressão, consistindo de uma ligação de promotor e seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa, pode existir em uma forma integrada em vetor e ser inserida em um genoma vegetal, por exemplo por transformação.

Entretanto, um cassete de expressão recombinante também denota aquelas construções nas quais o promotor está posicionado antes de um gene BIl endógeno, por exemplo por meio de recombinação homóloga, assim controlando a expressão da proteína BI1. Analogamente, a seqüência de ácidos nucleicos a ser expressa (por exemplo codificando para uma proteína BI1) pode ser colocada depois de um promotor endógeno de uma maneira tal que o mesmo efeito é manifestado. Ambas as abordagens levam o cassetes de expressão recombinantes inventivas.

Por "promotor específico de tecido com atividade essencialmente especificamente na epiderme foliar" deve geralmente ser entendido, para os propósitos da presente invenção, aqueles promotores que são adequados para assegurar ou aumentar expressão recombinante de uma seqüência de ácidos nucleicos em pelo menos um tecido vegetal com a condição de que

a) a expressão é manifestada pelo menos na epiderme e preferivelmente não no mesófilo, ou permanece essencialmente não modificada no mesófilo, onde tecidos outros do que os dois tecidos mencionados não são levados em consideração, e

b) a expressão recombinante sob o controle de dito promotor em dito tecido vegetal eqüivale a pelo menos cinco vezes, preferivelmente pelo menos dez vezes, especialmente preferivelmente pelo menos cem vezes, a expressão de uma planta comparativa.

Seqüências de controle genético além disso também abrangem as regiões 5' não traduzidas, íntrons ou região 3' não codificante genes, tal como, por exemplo, o íntron de actina-1, ou os íntrons de Adhl-S 1, 2 e 6 (referência geral: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Foi demonstrado que elas podem desempenhar um papel significante na regulação de expressão gênica. Assim, foi demonstrado que seqüências 5' não traduzidas podem acentuar a expressão transiente de genes heterólogos. Exemplos de acentuadores de tradução que podem ser mencionados são a seqüência líder 5' do vírus do mosaico do tabaco (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15, 8693 (1987)) e as semelhantes. Além disso, elas podem promover especificidade de tecido (Rouster J. et al., Plant J 15, 435 (1998)).

O cassete de expressão recombinante vantajosamente pode compreender uma ou mais daqueles que são conhecidos como seqüências acentuadoras, operavelmente ligada(s) ao promotor, o que torna possível uma expressão recombinante aumentada da seqüência de ácidos nucleicos. Seqüências vantajosas adicionais, tal como elementos reguladores adicionais ou terminadores, também podem ser inseridas na extremidade 3' das seqüências de ácidos nucleicos a serem expressas recombinantemente. Uma ou mais cópias das seqüências de ácidos nucleicos a serem expressas recombinantemente podem estar presentes na construção gênica.

Sinais de poliadenilação que são adequados como seqüências de controle são sinais de poliadenilação vegetais, preferivelmente aqueles que correspondem essencialmente a sinais de poliadenilação de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, em particular o terminador OCS (octopina sintase) e o terminador NOS (nopalina sintase).

Seqüências de controle são além disso para serem entendidas como aquelas que tornam possível recombinação homóloga ou inserção no genoma de um organismo hospedeiro ou que permite remoção do genoma. No caso de recombinação homóloga, por exemplo o promotor natural de um gene BI1 pode ser trocado por um dos promotores tecido-específicos. Métodos tal como a tecnologia cre/lox permitem uma remoção tecido-específica, se apropriado induzível, do cassete de expressão recombinante do genoma do organismo hospedeiro (Sauer B., Methods. 14(4), 381 (1998)). Neste método, seqüências flanqueadoras específicas (seqüências lox), que posteriormente permitem remoção por meio de cre recombinase, são acopladas ao gene alvo.

Um cassete de expressão recombinante e os vetores derivados destas podem compreender elementos funcionais adicionais. O termo elemento funcional é para ser entendido no amplo sentido e se refere a todos aqueles elementos que têm um efeito na geração, amplificação ou função dos cassetes de expressão recombinante, vetores ou organismos recombinantes de acordo com a invenção. Os seguintes podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não por limitação:

a) Marcadores de seleção que conferem uma resistência a um inibidor de metabolismo tal como 2-desoxiglicose-6-fosfato (Patente Internacional 98/45456), antibióticos ou biocidas, preferivelmente herbicidas, tal como, por exemplo, canamicina, G 418, bleomicina ou higromicina, ou ainda fosfinotricina e os semelhantes. Especialmente preferidos marcadores de seleção são aqueles que conferem resistência a herbicidas. Exemplos que podem ser mencionados são: seqüências de DNA que codificam para fosfinotricina acetiltransferases (PAT) e que inativam inibidores de glutamina sintase (genes bar e pat), genes de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (genes de EPSP sintase), que conferem resistência a Glyphosat® (N- (fosfonometil)glicina), o gene gox, que codifica enzimas degradadoras de Glyphosat® (Glifosato oxidoredutase), o gene deh (codificando a desalogenase que inativa Dalapon®), e genes bxn, que codificam enzimas nitrilase degradadoras de bromoxinil, o gene aasa, que confere resistência ao antibiótico apectinomicina, o gene de estreptomicina fosfotransferase (SPT), que possibilita resistência a estreptomicina, o gene de neomicina fosfotransferase (NPTII), que confere resistência a canamicina ou geneticidina, o gene de higromicina fosfotransferase (HPT), que media resistência a higromicina, o gene de acetolactato sintase (ALS), que confere resistência a herbicidas de sulfoniluréia (por exemplo variantes mutadas de ALS com, por exemplo, a mutação S4 e/ou Hra), e o gene de acetolactato sintase (ALS), que confere resistência a herbicidas de imidazolinona.

b) Genes repórteres que codificam para proteínas prontamente quantificáveis e, através de sua cor ou atividade enzimática, tornam possível uma verificação da eficácia de transformação, o sítio de expressão ou o tempo de expressão. Muito especialmente preferidos neste contexto são genes codificando para proteínas repórteres (Schenbom E., Groskreutz D., Mol. Biotechnol. 13(1), 29 (1999)) tal como a proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant Journal 8(5), 777 (1995); Haseloffet al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94(6), 2122 (1997); Reichel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93(12), 5888 (1996); Tian et al., Plant Cell Rep. 16, 267 (1997); WO 97/41228; Chui W.L. et al., Curr. Biol. 6, 325 (1996); Leffel S.M. et al., Biotechniques 23(5), 912 (1997)), cloranfenicol transferase, uma luciferase (Ow et al., Science 234, 856 (1986); Millar et al., Plant Mol. Biol. Rep. 10, 324 (1992)), o gene de aequorina (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126(3), 1259 (1985)), β-galactosidase, gene de locus R (codificando uma proteína que regula a produção de pigmentos antocianina (coloração vermelha) em tecido vegetal e assim torna possível a análise direta da atividade de promotor sem adição de substâncias auxiliares adicionais ou substratos cromogênicos; Dellaporta et al. in Chromosome Structure and Function: Impaet of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11 (1988)), com β-glucuronidase sendo muito especialmente preferida (Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901 (1987)).

c) Origens de replicação, que asseguram amplificação dos cassetes de expressão recombinante ou vetores de acordo com a invenção em, por exemplo, E. coli. Exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicação de DNA), a pBR322 ori ou a Pl 5A ori (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

d) Elementos que são necessários para transformação vegetal mediada por Agrobacterium, tal como, por exemplo, a borda direita ou esquerda do T-DNA ou a região vir.

Para selecionar células que passaram com sucesso por recombinação homóloga, ou ainda para selecionar células transformadas, é, como uma regra, necessário introduzir adicionalmente um marcador selecionável que confere resistência a um biocida (por exemplo herbicida), um inibidor de metabolismo tal como 2-desoxiglicose-6-fosfato (Patente Internacional 98/45456) ou um antibiótico para as células que passaram com sucesso por recombinação. O marcador de seleção permite a seleção das células transformadas a partir de umas não transformadas (McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81 (1986)).

A introdução de um cassete de expressão recombinante de acordo com a invenção em um organismo ou células, tecidos, órgãos, partes ou grãos deste (preferivelmente em plantas ou células vegetais, tecido, órgãos, partes ou grãos) pode ser efetuada vantajosamente usando vetores que compreendem os cassetes de expressão recombinante. O cassete de expressão recombinante pode ser introduzida no vetor (por exemplo um plasmídeo) através de um sítio de clivagem de restrição adequado. O plasmídeo formado é primeiro introduzido em E. coli. E. coli corretamente transformadas são selecionadas, cultivadas, e o plasmídeo recombinante é obtido pelos métodos familiares ao trabalhador versado. Análise de restrição e seqüenciamento podem servir para verificar a etapa de clonagem.

Exemplos de vetores podem ser plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus ou ainda agrobactérias. Em uma forma de realização vantajosa, o cassete de expressão é introduzida por meio de plasmídeos vetores. Vetores preferidos são aqueles que tomam possível integração estável do cassete de expressão recombinante no genoma hospedeiro.

A geração de um organismo transformado (ou de uma célula ou tecido transformado) requer introduzir Vt DNA, RNA ou proteína em questão na célula hospedeira relevante.

Diversos métodos estão disponíveis para este procedimento, que é referido como transformação (ou transdução ou transfecção) (Keown et al., Methods Enzymol. 185, 527 (1990); Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by Kung S.D. and Wu R., Academic Press, p. 128-143 (1993), e em Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991)).

Por exemplo, o DNA ou RNA pode ser introduzido diretamente por microinjeção ou por bombardeamento com micropartícuias revestidas com DNA. Também, a célula pode ser permeabilizada quimicamente, por exemplo usando polietilenoglicol, de forma que DNA pode entrar na célula por difusão. O DNA também pode ser introduzido por fusão de protoplastos com outras unidades contendo DNA tais como minicélulas, células, lisossomos ou lipossomos. Outro método adequado de introduzir DNA é eletroporação, onde as células são permeabilizadas reversivelmente por um pulso elétrico. Métodos adequados foram descritos (por exemplo por Bilang et al., Gene 100, 247 (1991); Scheid et al., Mol. Gen. Genet. 228, 104 (1991); Guerche et al., Plant Science 52, 111 (1987); Neuhause et al., Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987); Klein et al., Nature 327, 70 (1987); Howell et al., Science 208, 1265 (1980); Horsch et al., Science 227, 1229 (1985); DeBlocketal., Plant Physiol 91, 694 (1989)).

Em plantas, os métodos descritos acima de transformar e regenerar plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais são explorados para transformação transiente ou estável. Métodos adequados são especialmente transformação de protoplasto por absorção de DNA induzida por polietilenoglicol, o método biolístico com a pistola de genes, que é conhecido como o método de bombardeamento de partículas, eletroporação, incubação de embriões secos em solução contendo DNA, e microinjeção.

Em adição a estas técnicas de transformação "diretas", transformação também pode ser efetuada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. A Transformação mediada por Agrobacterium é melhor adequada para células vegetais dicotiledôneas. Os métodos são descritos, por exemplo, por Horsch R.B. et al., Science 225, 1229 (1985).

Quando agrobactérias são usadas, o cassete de expressão deve ser integrada em plasmídeos específicos, ou em um vetor bifuncional ou intermediário, ou em um vetor binário. Se um plasmídeo Ti ou Ri é para ser usado para a transformação, pelo menos a borda direita, mas na maioria dos casos a borda direita e esquerda, do T-DNA de plasmídeo Ti ou Ri está ligada à cassete de expressão a ser introduzida na forma de uma região flanqueadora.

Vetores binários são preferivelmente usados. Vetores binários são capazes de replicação tanto em E. coli como em Agrobacterium. Como uma regra, eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante flanqueado pela seqüência de borda direita e esquerda de T-DNA. Eles podem ser transferidos diretamente para Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)). O gene marcador de seleção permite uma seleção de agrobactérias transformadas e é, por exemplo, o gene nptll, que confere resistência a canamicina. A agrobactéria que atua como organismo hospedeiro neste caso deve já conter um plasmídeo com a região vir. O último é requerido para transferir o T-DNA para a célula vegetal. Uma agrobactéria transformada desta maneira pode ser usada para transformar células vegetais. O uso de T-DNA para transformar células vegetais foi estudado e descrito intensivamente (Patente Européia 120 516; Hoekemain: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Anet al., EMBO J. 4, 277 (1985)). Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais estão disponíveis comercialmente tais como, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984); Clontech Laboratories, Inc. USA). Promotores adicionais que estão disponíveis para expressão em plantas foram descritos (Rogers et al., Methods Enzymol. 153, 253 (1987); Schardl et al., Gene 61, 1(1987); Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 8402 (1989)).

Técnicas de transformação diretas são adequadas para qualquer organismo e tipo celular. O plasmídeo usado não precisa satisfazer quaisquer requerimentos particulares no caso da injeção ou eletroporação de DNA ou RNA em células vegetais. Plasmídeos simples tais como aqueles da série pUC podem ser usados. Se plantas completas estão para ser regeneradas a partir das células transformadas, é necessário para um gene marcador selecionável adicional estar localizado no plasmídeo.

Células estavelmente transformadas, i.e. aquelas que compreendem o DNA introduzido integrado no DNA da célula hospedeira, podem ser selecionadas a partir de células de não transformadas quando um marcador selecionável é parte do DNA introduzido. Exemplos de genes que podem atuar como marcadores são todos aqueles que são capazes de conferir resistência a antibióticos ou herbicidas (tal como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfinotricina) (veja acima). Células transformadas que expressam tais genes marcadores são capazes de sobreviver na presença de concentrações de um antibiótico ou herbicida correspondente que mata um tipo selvagem não transformado. Exemplos de marcadores de seleção adequados são mencionados acima. Logo que uma célula vegetal transformada foi gerada, uma planta completa pode ser obtida usando métodos conhecidos pelo trabalhador versado. Material inicial neste contexto é, por exemplo, culturas de calo. O desenvolvimento de broto e raiz pode ser induzido de uma maneira conhecida nestas biomassas celulares até agora indiferenciadas. As plântulas obtidas podem ser cultivadas e reproduzidas. O trabalhador versado é familiar com métodos de regenerar partes vegetais de plantas inteiras começando de células vegetais. Por exemplo, métodos descritos por Fennell et al., Plant Cell Rep. 11, 567 (1992); Stoeger et al., Plant Cell Rep. 14, 273 (1995); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89, 525 (1994) são usados neste contexto. As plantas obtidas podem ser reproduzidas e/ou hibridizadas de uma maneira costumeira. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas a fim de assegurar que a integração genômica seja estável e hereditária.

O método de acordo com a invenção pode ser vantajosamente combinado com métodos adicionais que causam resistência a patógeno (por exemplo a insetos, fungos, bactérias, nematóides e os semelhantes), resistência a estresse ou outra melhoria das propriedades vegetais. Exemplos são mencionados, entre outros, por Dunwell J.M., J. Exp. Bot. 51 (Spec No), 487 (2000).

Em relação a, por exemplo uma seqüência de ácidos nucleicos, um cassete de expressão ou um vetor compreendendo dita seqüência de ácidos nucleicos ou um organismo transformado com dita seqüência de ácidos nucleicos, cassete de expressão ou vetor, o termo "recombinante" significa todas aquelas construções que são o resultado de métodos recombinantes e nos quais ou a) a seqüência de ácidos nucleicos de BIl ou

b) uma seqüência de controle genético, por exemplo promotor, que é operavelmente ligado com a seqüência de ácidos nucleicos de BIl, ou

c) (a) e (b)

não estão localizadas em seu ambiente genético natural ou foram modificadas por métodos recombinantes, um exemplo da modificação sendo uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos. Ambiente genético natural se refere ao locus cromossômico natural no organismo de origem, ou à presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência de ácidos nucleicos é preferivelmente mantido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácidos nucleicos pelo menos em um lado e tem uma seqüência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp, especialmente preferivelmente pelo menos 1000 bp, muito especialmente preferivelmente pelo menos 5000 bp, de comprimento. Um cassete de expressão naturalmente ocorrente - por exemplo a combinação naturalmente ocorrente do promotor de BIl com o gene BIl correspondente - se torna um cassete de expressão recombinante quando ela é modificada por métodos não naturais sintéticos "artificiais" tal como, por exemplo, mutagenização. Tais métodos foram descritos (Patente Norte- Americana 5.565.350; Patente Internacional 00/15815; veja também acima).

A invenção também se refere a organismos recombinantes transformados com pelo menos uma das seqüências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, cassete de expressão de acordo com a invenção ou vetor de acordo com a invenção, e a células, culturas celulares, tecidos, partes - tal como, por exemplo, folhas, raízes e os semelhantes no caso de organismos vegetais - ou material de propagação derivado de tais organismos. O termo organismo é para ser entendido no amplo sentido e se refere a organismos procarióticos e eucarióticos, preferivelmente bactérias, leveduras, fungos, organismos animais e organismos vegetais. Organismos hospedeiros ou iniciais que são preferidos como organismos recombinantes são principalmente plantas em conformidade com a definição acima.

A invenção além disso se refere ao uso dos organismos recombinantes de acordo com a invenção e das células, culturas celulares, partes - tal como, por exemplo, raízes, folhas e os semelhantes no caso de organismos vegetais recombinantes - derivados destes, e a material de propagação recombinante tal como grãos ou frutos, para a produção de gêneros alimentícios ou rações, produtos farmacêuticos ou químicos finos.

Além disso é uma molécula de ácido nucleico que é antisentido para o ácido nucleico de acordo com a invenção, um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao polipeptídeo de acordo com a invenção, e um fungicida que compreende o ácido nucleico de acordo com a invenção, o vetor de acordo com a invenção, em particular um vetor infeccioso, por exemplo viral, de acordo com a invenção, o polipeptídeo de acordo com a invenção em uma forma que é adequada para aplicação a plantas, por exemplo em forma encapsulada ou em um organismo infeccioso que é preferivelmente adequado para transferir ácidos nucleicos ou para expressar genes em uma célula, tal como uma agrobactéria ou um vírus.

Em uma forma de realização, a invenção se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico codificando BI-I ou de uma proteína BI-I para a geração de uma planta resistente a patógeno, preferivelmente para a geração de uma planta resistente a fungo ou para a geração de um fungicida que causa isto, ou para controlar ou tratar plantas que são atacadas, ou sujeitas a serem atacadas, por patógenos.

Seqüências

1. SEQ ID NO: 1 Seqüência de ácidos nucleicos codificando para uma proteína BIl de cevada (Hordeum vulgare 2. SEQ ID NO: 2 Seqüência de aminoácidos codificando para uma proteína BIl de cevada (Hordeum vulgare). 3. SEQ ID NO: 3 Seqüência de ácidos nucleicos codificando para uma proteína BIl de Arabidopsis thaliana. 4. SEQ ID NO: 4 Seqüência de aminoácidos codificando para uma proteína BIl de Arabidopsis thaliana. 5. SEQ ID NO: 5 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para uma proteína BIl de tabaco. 6. SEQ ID NO: 6 : Seqüência de aminoácidos codificando para uma proteína BIl de tabaco. 7. SEQ ID NO: 7 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para uma proteína BIl de arroz. 8. SEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos codificando para uma proteína BIl de arroz. 9. SEQ ID NO: 9 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para uma proteína BI1 de colza. 10. SEQ ID NO: 10: Seqüência de aminoácidos codificando para uma proteína BIl de colza. 11. SEQ ID NO: 11: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de soja. 12. SEQ ID NO: 12: Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de soja. 13. SEQ ID NO: 13: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de soja. 14. SEQ ID NO: 14: Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de soja. 15. SEQ ID NO: 15: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de trigo. 16. SEQ ID NO: 16: Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de trigo. 17. SEQ ID NO: 17: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 18. SEQ ID NO: 18: Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 19. SEQ ID NO: 19: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de trigo. 20. SEQ ID NO: 20 : Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de trigo. 21. SEQ ID NO: 21: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 22. SEQ ID NO: 22 : Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 23. SEQ ID NO: 23: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 24. SEQ ID NO: 24 : Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 25. SEQ ID NO: 25 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de trigo. 26. SEQ ID NO: 26 : Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de trigo. 27. SEQ ID NO: 27 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 28. SEQ ID NO: 28 : Seqüência de aminoácidos codificando para parte de uma proteína BIl de milho. 29. SEQ ID NO: 29 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o promotor de patatina de batata. 30. SEQ ID NO: 30 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o promotor Germin 9f-3.8 de trigo. 31. SEQ ID NO: 31 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o promotor CAB-2 de Arabidopsis 32. SEQ ID NO: 32 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o promotor PPCZml de milho. 33. SEQ ID NO: 33 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o vetor de expressão recombinante pUbiBI-1 34. SEQ ID NO: 34 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o vetor de expressão recombinante pLol 14UbiBI-l 35. SEQ ID NO: 35 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o vetor de expressão recombinante pOXoBI-1 36. SEQ ID NO: 36 : Seqüência de ácidos nucleicos codificando para o vetor de expressão recombinante pLol 140XoBI-l 37. SEQ ID NO: 37: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para proteína BI-I de trigo 38. SEQ ID NO: 38: Seqüência de aminoácidos codificando para proteína BI-I de trigo 39. SEQ ID NO: 39: Seqüência de ácidos nucleicos para PENl (= ROR2) de cevada 40. SEQ ID NO: 40: Seqüência de aminoácidos codificando para PENl (= ROR2) de cevada 41. SEQ ID NO: 41: Seqüência de ácidos nucleicos para PENl (= R0R2) de Arabidopsis thaliana 42. SEQ ID NO: 42: Seqüência de aminoácidos codificando para PENl (= R0R2) de Arabidopsis thaliana 43. SEQ ID NO: 43: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para SNAP34 de cevada 44. SEQ ID NO: 44: Seqüência de aminoácidos codificando para SNAP34 de cevada 45. SEQ ID NO: 45: Seqüência de ácidos nucleicos codificando para BI-I de soja 46. SEQ ID NO: 46: Seqüência de aminoácidos codificando para BI-I de soja 47. SEQ ID NO: 47: Iniciador GFP 1 (veja neste lugar abaixo) 48. SEQ ID NO: 48: Iniciador GFP 2 (veja neste lugar abaixo)

Figuras

1. Fig. la-d: Alinhamento de seqüências protéicas de várias proteínas BI-I de plantas. AtBI-1: Arabidopsis; BnBI-1: Brassica napus (colza); GmBI2: Glycine max (soja; variante 1); GmBI3: Glycine max (soja; variante 2); HVBI-I: Hordeum vulgare (cevada); NtBI-I: Nicotiana tabacum (tabaco); OsBI-1: Oryza sativa (arroz); TaBIl 1: Triticum aestivum (trigo, variante 1); TaBIl8: Triticum aestivum (trigo, variante 2); TaBI5 neu: Triticum aestivum (trigo, variante 3); ZmBI14: Zea mays (milho, variante 1); ZmBI 16: Zea mays (milho, variante 2); ZmBI33: Zea mays (milho, variante 3); ZmBI8: Zea mays (milho, variante 4); Consenso: seqüência consenso derivada do alinhamento.

2. Fig. 2: Mapa de vetor para o vetor pUbiBI-1 (Ubi: promotor de ubiquitina; seqüência de ácidos nucleicos de BI-I codificando para proteína BIl de cevada; ter: terminador de transcrição). Também é indicada a localização dos sítios de clivagem de várias enzimas de restrição.

3. Fig. 3: Mapa de vetor para o vetor pLOl 14UbiBI-l (Ubi: promotor de ubiquitina; seqüência de ácidos nucleicos de BI-I codificando para proteína BIl de cevada; ter: terminador de transcrição). Também é indicada a localização dos sítios de clivagem de várias enzimas de restrição.

4. Fig. 4: Mapa de vetor para o vetor pOxoBI-1 (Oxo: promotor TaGermin 9f-2.8; seqüência de ácidos nucleicos de BI-I codificando para proteína BIl de cevada; ter: terminador de transcrição). Também é indicada a localização dos sítios de clivagem de várias enzimas de restrição.

5. Fig. 5: Mapa de vetor para o vetor pLOl 140xoBI-l (Oxo: promotor TaGermin 9f-2.8; seqüência de ácidos nucleicos de BI-I codificando para proteína BIl de cevada; ter: terminador de transcrição). Também é indicada a localização dos sítios de clivagem de várias enzimas de restrição.

6. Fig. 6: Alinhamento das seqüências protéicas de proteínas BI-I de cevada (Hordeum vulgare, GenBank Acc.-No.: CAC37797), arroz (Oryza sativa, GenBank Acc.-No.: Q9MBD8), Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: Q9LD45) e humanos (Homo sapiens, GenBank Acc.-No.: AAB87479). Aminoácidos mostrados contra o fundo negro são idênticos em todas as espécies. Aminoácidos mostrados contra um fundo cinza são apenas idênticos em plantas. Barras indicam os sete domínios transmembrana previstos em HvBI-1.

7. Fig. 7: Diagrama da taxa de transformação como uma função das condições durante a transformação de folhas de soja (A) e folhas de cevada (B) com a pistola de genes.

Para a transformação, em cada caso 1,6 μg de DNA foram usados por bombardeamento; partículas de diâmetro 0,6 μιη foram usadas para folhas de cevada e com diâmetro de 1 μιη para soja. O número de células transformadas foi determinado 24 horas depois da transformação. 8. Fig. 8: Diagrama da taxa de penetração de P. pachyrhizi em células de cevada que foram transientemente transformadas com uma construção de superexpressão de BI-I em comparação com o controle. Os dados foram baseados em três experimentos independentes.

Como forma de controle, folhas de cevada foram transformadas com a construção de gene repórter pGY I-GFP e com o vetor branco. Nas células transformadas com BI-1, a taxa de penetração difere significativamente do WT (P<0,05).

9. Fig. 9: PCR para detector a construção de GFP-BI-1 nas linhagens transgênicas de cevada #6(1)E4L3P5 (T2), 1#6(2)E15L7P1

(T2), #6(2)E15L7P2 (T2) e #6(1)E8L1(T1) ('Golden Promise'). O PCR foi realizado com DNA genômico das plantas com os iniciadores específicos para GFP. Em plantas transgênicas positivas, o GFP inteiro, que é de 740 bp em tamanho é amplificado. O controle negativo usado foi DNA genômico do WT 'Golden Promise' (WT) ou água (NTC). O GFP de plasmídeo pGY I-GFP foi amplificado como o controle positivo (PC).

10. Fig. 10: Dados obtidos para a taxa de penetração de P. pachyrhizi em células de cevada que foram transientemente transformadas com uma construção de superexpressão de BI-1. Os dados mostrados são

aqueles de Fig. 8 (veja também exemplos a seguir).

11. Fig. 11 A/B:Esporos contados e respostas celulares na interação entre ferrugem da soja e linhagens transgênicas de cevada com a construção de superexpressão de GFP-BI-I #6(1)E4L3P5(T2), 1 #6(2)E 15L7P1 (T2), #6(2)E15L7P2(T2) e #6(1)E8L I(Tl) CV. 'Golden

Promise'. O WT atuou como o controle. Folhas de plantas de 7 dias de idade foram inoculadas com ferrugem da soja, fixadas depois 24 horas e coradas com anilina azul para contagem.

12. Fig. 12: Fração relativa de formação de papilas e HR seguindo inoculação com P. pachyrhizi em folhas de cevada das linhagens transgênicas (CV. 'Golden Promise') #6(1)E4L3P5 (T2), 1#6(2)E15L7P1 (T2), #6(2)E15L7P2 (T2) e #6(1)E8L I(Tl) em comparação com o WT. As folhas primárias foram removidas sete dias depois de semear os grãos de cevada inoculados com P. pachyrhizi e avaliadas 24 horas depois da inoculação. Os dados mostrados são os valores médios do WT e das linhagens individuais. As barras de erro representam o desvio padrão. Um teste t de Student revela que a formação relativa de papilas e HR nas linhagens transgênicas são significativamente diferentes do WT5 P < 0,001. Exemplos Métodos Rerais:

A síntese química de oligonucleotídeos pode ser efetuada, por exemplo, da maneira conhecida usando o método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2nd Edition, Wiley Press New York, pages 896-897). As etapas de clonagem realizadas para os propósitos da presente invenção tal como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas de nitrocelulose e náilon, ligação de fragmentos de DNA, transformação de células E. coli, culturas bacterianas, multiplicação de fagos e análise de seqüência de DNA recombinante, são realizadas como descrito por Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. O seqüenciamento de moléculas recombinantes de DNA é realizado com um seqüenciador de DNA de fluorescência a laser MWG-Licor seguindo o método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)).

Exemplo 1 : Inoculação com P. pachyrhizi

Material adequado de esporos (Uredósporos) do patógeno Phakopsora pachyrhizi foi obtido a partir de BASF Aktiengesellschaft. Para esta finalidade, esporos de plantas de soja que haviam sido inoculadas 2-3 semanas antes foram usados diretamente ou agitados em papel alumínio e armazenados no escuro em temperatura ambiente em um dessecador (TROPAGel, Tropack, Lahnau).

Para preparar uma suspensão de esporos, os esporos foram lavados das folhas com Tween/H20 (0,1%). Os esporos foram contados usando um hematocitômetro Thoma sob o microscópio luminoso. Para realizar a inoculação, as folhas foram fixadas em 1% de H2O ágar usando um anel metálico. Vários métodos foram finalmente usados para a inoculação. Para a inoculação de líquido pulverizável, a suspensão de esporos foi colocada em um frasco de líquido pulverizável operado com ar pressurizado e foram distribuídos uniformemente nas plantas até que a superfície superior da folha tivesse sido cuidadosamente umedecida. Para obter uma maior densidade de esporos, folhas que haviam sido previamente pulverizadas com Tween/H20 foram adicionalmente inoculadas a seco em uma 'coluna de precipitação'. Para esta finalidade, a coluna é colocada sobre as placas com as folhas umedecidas. Os esporos jovens de plantas de soja infectadas são enchidos na coluna através de uma aba de entrada. Como o resultado da corrente de ar, os esporos são fluidizados, primorosamente distribuídos, e caem nas folhas.

Para obter maiores densidades de inoculação sem agregação de esporos, as folhas foram, como uma alternativa, cobertas com uma camada de uma suspensão de esporos e, depois de 15 minutos, removidas da suspensão (método da alporquia). Depois deste período, adesão suficiente dos esporos precipitados já foi assegurada. As folhas inoculadas foram incubadas em uma câmara com em média 25°C e uma umidade atmosférica de 71,2%.

Para verificar o curso da infecção sob o microscópio, amostras foliares foram tomadas 0 horas após inoculação (hpi), 6 hpi, 24 hpi e 48 hpi, e coradas por diferentes métodos. a) Coloração por Coomassie

Para realizar a coloração por Coomassie, o material foliar infectado foi coletado e descolorido durante a noite em temperatura ambiente. Para o microscópio, o material foliar foi convertido em solução de Coomassie, e a solução foi enxaguada depois de 5 minutos usando um pouco de água. A amostra foi vista sob o microscópio imediatamente posteriormente.

b) Coloração por Calcofluor

Para preparar a solução corante de Calcofluor, 0,03% de Calcofluor White (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em 50 mM de Tris/HCl pH 8,0 nd 0,01% de Tween 20. Para corar as estruturas fungicas extracelulares, a folha infectada foi imersa na solução corante por 30 segundos e então lavada com água por 10 segundos. As estruturas fungicas coradas fluorescem azul pálido sob excitação por UV.

c) Coloração por anilina azul

O material foliar foi transferido para tubos Falcon ou placas com solução descolorante e incubado durante a noite em RT. Posteriormente, a solução descolorante foi removida e as folhas foram lavadas 2x com água. Para a coloração, as folhas foram cobertas por 1,5-2 h em solução corante de anilina azul e subseqüentemente observadas diretamente sob o microscópio.

d) Coloração por aglutinina de germe de trigo Alexa Fluor 488 (coloração de WGA)

Para a coloração por WGA de P. pachyrhizi, folhas de cevada inoculadas foram colocadas em 10% (w/v) KOH por 30-45 minutos em RT. Folhas de soja inoculadas foram dissecadas em secções de 1 cm e fervidas por 5 minutos em 10% (w/v) de KOH. Posteriormente, as folhas de cevada e as de soja foram lavadas 5 vezes por 3-5 minutos com 1 χ de tampão PBS. Para a coloração, o material foliar foi colocado em solução corante de WGA e deixado infiltrar por 10 minutos sob uma pressão residual de IOOmbar. Posteriormente, o material foi observado diretamente sob o microscópio ou armazenado na solução corante a 4°C no escuro. Exemplo 2 : Transformação biolística transiente de células vegetais

Para a superexpressão transiente do inibidor de Bax (para construções e outros métodos, veja patente WO 2004/081217) por transformação biolística, 30-100 mg de partículas de ouro foram pesados, ressuspensos em 1 ml de EtOH com 70% de força e agitados por 3-5 minutos. Depois de incubação por 1 hora em temperatura ambiente, peletização foi efetuada por centriíugação (1 min, 10 000 rpm, microcentrífuga Eppendorf). Posteriormente, as partículas foram lavadas 3χ com água estéril e subseqüentemente absorvidas em glicerol estéril a 50% (v/v) e armazenadas a 4°C. Quando 30 mg de partículas de ouro foram pesados, na solução continha aproximadamente 25 mg/ml de ouro. Antes de uso, as partículas foram agitadas de novo a fim de distribuí-las cuidadosamente e sonicadas por 15 segundos em um sonicador.

Em geral, partículas de ouro suficientes para pelo menos três bombardeamentos foram preparadas. Até a etapa de precipitação, a mistura foi agitada vigorosamente por alguns segundos em um agitador de tubos depois de cada etapa. Para a precipitação de DNA em partículas de ouro para 3 bombardeamentos, um 12,5 μΐ da solução de particular de ouro e glicerol agitada cuidadosamente foram removidos e tratados com o DNA desejado (pGYl-BI-1, pGYl-GFP, pGYl, veja Patente Internacional 2004/081217). 1,6 μg/μl de DNA foram empregados por bombardeamento no plasmídeo. Posteriormente, 12,5 μΐ de 2,5 M de solução de CaCl2 e 5 μΐ de 0,1 M de solução de espermidina foram adicionados. A mistura foi agitada por 3 minutos, tratada com 70 μΐ de etanol a 70% (v/v) e cuidadosamente invertida. Depois de adição de 70 μΐ de etanol a 100%, a mistura foi misturada de novo invertendo cuidadosamente e incubada a -20°C por até 1 hora. As partículas foram peletizadas por centrifugação (1 min, 11000 rpm, microcentrífuga Eppendorf, Wesseling-Berzdorf), ressuspensas em 18 μΐ de etanol a 100% e distribuídas tão uniformemente quanto possível nos macrocarreadores (Bio- Rad, Munich), que haviam sido previamente lavados com etanol a 100% e secos, dentro de um raio de aprox. 1 cm. Os macrocarreadores foram então incubados em temperatura ambiente até que todo o etanol tivesse evaporado.

A transformação biolística transiente de folhas de cevada e soja foi realizada usando o sistema Biolistic Particle Delivery System PDS- 1000/He (Bio-Rad, Munich). O material usado para a transformação foi preferivelmente folhas de cevada de plantas de cevada de 7 dias de idade (cv. 'Hanna') ou as primeiras duas folhas (estágio de duas folhas) de plantas de soja (cv. 'Oxford'). As folhas a serem transformadas foram colocadas em 1% (w/v) água-ágar e fixadas usando um anel metálico.

A fim de determinar a proporção ótima entre pressão aplicada e pressão residual na câmara de vácuo para a transformação, várias combinações de pressão/pressão residual foram testadas. Pressões residuais de 15-27 polegadas de Hg (50,8 KPa - 91,4 KPa) e discos de ruptura classificados em 650-1800 psi (4,5- 12,4 MPa) foram usados. Depois do bombardeamento, a câmara foi ventilada, o carreador junto com as folhas foi removido, e as folhas foram incubadas por pelo menos 24 horas em temperatura ambiente antes de serem observadas sob o microscópio ou coradas.

Partículas de ouro foram usadas para a transformação balísitca das folhas. Emergiu que bombardeamento com partículas de 0,6 μιτι de diâmetro foi melhor adequado a cevada uma vez que ele causou menos lesão de tecido. No caso da transformação transiente de soja, a maior taxa de transformação foi obtida com as partículas de 1 μηι.

Para que a transformação transiente seja bem sucedida, as proporções entre a pressão para acelerar as partículas, a pressão residual na câmara de vácuo e a distância entre amostra e partículas devem ser adaptadas uma a outra. Para atingir isto, várias condições foram testas para folhas de cevada e folhas de soja. No caso de soja, uma pressão de 900 psi (6,2 MPa) com uma pressão residual na câmara de vácuo de 25 polegadas de Hg (0,08 MPa) e uma distância de amostra de 9 cm se mostrou bem sucedida (FIG. 7A). No caso de folhas de cevada, os maiores números de células foram obtidos com uma pressão de IlOOpsi (7,58 MPa), uma pressão residual na câmara de vácuo de 25 polegadas de Hg (0,08 MPa) e uma distância entre folhas e partículas de 9 cm (FIG. 7B).

Para estudar os efeitos de BI-I na interação entre P. pachyrhizi e cevada, foi feito uso da transformação biolística transiente. As folhas primárias de plantas de cevada (cv. 'Hanna') de sete dias de idade foram bombardeadas com construções de superexpressão de BI-I (pGYl-BI-1, Hückelhoven R. et al., 2001). Estes plasmídeos contêm um promotor Camv 35S, que assegura expressão constitutiva dos genes. Uma construção de CaMV 35S/GFP como gene repórter foi bombardeada nas células junto com os plasmídeos de expressão (Schweizer P. et al., MPMI 12, 647 (1999)). O vetor branco pGY-1 junto com a construção GFP/gene repórter foi usado como o controle. A inoculação com P. pachyrhizi foi efetuada 24 horas depois da transformação por precipitação de uma suspensão de esporos (método da alporquia, 2-3 χ IO4 esporos/ml). Depois de incubação por 18 horas, as interações foram avaliadas sob o microscópio seguindo coloração pelo Calcofluor das estruturas füngicas extracelulares. As estruturas contadas foram células que formam GFP que haviam sido penetradas pelo fungo e células que formam GFP que haviam sido atacadas pelo fiingo, mas puderam se defender com sucesso contra ele (ou onde o fungo morreu antes de penetração). Em adição, o número total de células que formam GFP foi contado. Para realizar a avaliação, as taxas relativas de penetração foram calculadas com base no número total de células transformadas que interagiram com ferrugem da soja.

No controle, 53% das células transformadas que interagiram com P. pachyrhizi foram penentradas (média dos experimentos), enquanto que apenas 37% das células transformadas com BI-I foram penentradas (veja Tabela FIG. 10 e FIG. 8). De acordo com a avaliação, a resistência a penetração das células que haviam sido transformadas transientemente com BI-I é significativamente aumentada sobre P. pachyrhizi. Observação sob o microscópio revelou que as células que formam BI-I tiveram uma aparência marcadamente mais vital do que células que apenas expressaram GFP. Exemplo 3 : Transformação estável de cevada, e detecção do transgene GFP:BI-1

Para estudar o efeito de BI-I em interação de cevada com Phakopsora pachyrhizi em maior detalhe, plantas de cevada estavelmente transformadas que superexpressaram uma proteína de fusão GFP:BI-1 foram geradas. A transformação estável mediada por agrobactéria usada para este propósito é uma técnica que foi estabelecida por anos e cujos métodos já foram publicados em diversos artigos de revisão (Cheng Z. et aL, Plant Mol. Biol. 60, 583 (2004); Taylor et aL, DNA & Cell Biology. 21(12), 963 (2002); Rakoczy-Trojanowska, Cellular & Molecular Biology Letters. 7(3), 849 (2002); Grabowska A., Acta Physiologiae Plantarum. 26(4), 451 (2004); Chesnokov V., Sel'skokhozyaistvennaya Biologiya. 1, 26 (2004). Mesmo a transformação de espécies monocotiledôneas tal como, por exemplo, cevada, que ainda era difícil nos anos 90, agora é uma técnica padrão (Travella S. et aL, Plant Cell Reports 23(12), 780 (2005); Murray F. et aL, Plant Cell Reports 22(6), 397 (2004)).

Uma vez que não era sabido das plantas transgênicas resultantes se elas eram linhagens homozigotas, a presença da construção de superexpressão teve que ser detectada primeiro. Para esta finalidade, o DNA genômico foi isolado de uma folha de todas as plantas. Isto foi feito usando o Kit DNeasy 96 Plant (Quiagen, Hilden; seguindo as instruções do fabricante).

A construção de superexpressão GFP-BI-I foi detectada com iniciadores específicos para GFP por meio de PCR para a presença da 10

15

20

25

construção. A Phusion Hot Start (Finnzymes, Espoo) foi usada para a

amplificação in-vitro de DNA por PCR (Mullis & Faloona, 1987).

Iniciador 1: 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 47)

Iniciador 2: 5'TTGAACAACGATGTGCAAGACTCCTTGTACAGC

TCGTCCATGC-3') (SEQ ID NO: 48)

Abordagem de PCR para detectar o transgene GFP:BI-1:

DMSO 0,6 μΐ

Tampão (5x) (F-519 GC) 4 μΐ

DNA 3 μΐ

Mistura de dNTP (10 mM cada) 0,4 μΐ

Iniciador 1 (20 pmol) 1 μΐ

Iniciador 2 (20 pmol) 1 μΐ

Hot Start Phusion F 540L 0,2 μΐ

Água 9,8 μΐ

O PCR foi realizado em um termociclador com tampa térmica auto-ajustável (Tgradient; Biometra, Gõttingen). Programa de PCR:

1. Desnaturação inicial 98°C

2. Desnaturação 98°C

3. Anelamento 58°C

4. Alongamento 12°C

5. Alongamento 12°C

6. Armazenamento 4°C

3 Oseg

IOseg 35 ciclos de etapas 2-4 3 Oseg 3 Oseg min

Usando métodos padrão, o DNA foi separado e analisado por eletroforese em gel em um gel de agarose 1% ([w/v], INYITROGEN, Karlsruhe; em 1 χ tampão TAE) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) 1989).

Em um total de seis plantas das linhagens transgênicas #6(2)E15L7P2 (T2) e #6(1)E8L I(Tl), não foi possível detectar o fragmento de GFP de 740 bp, e assim a construção. Os dados destas plantas [plantas 5, e 19 de linhagem #6(1)E8L I(Tl) e planta 3, 11 e 12 de linhagem #6(2)E15L7P2 (T2)] portanto não foram levados em consideração nos cálculos que seguem (veja FIG. 9).

Exemplo 4: Interação de P. pachyrhizi com cevada transgênica superexpressando inibidor de Bax-1

Para verificar o efeito que aumenta resistência como o resultado de superexpressão transiente de BI-1, a interação entre P. pachyrhizi e plantas transgênicas de cevada cv. 'Golden Promise' (GP), que contêm uma construção de superexpressão de GFP-BI-I foi estudada sob o microscópio em comparação com tipo selvagem (WT) desta variedade. Para gerar as plantas transgênicas, uma fusão GFP-BI-I sob o controle do promotor constitutivo CaMV 35S foi usada, assim assegurando uma expressão suficiente da proteína.

Em cada caso 20 plantas de tipo selvagem e de quatro linhagens transgênicas #6(1)E4L3P5 (T2), 1#6(2)E15L7P1 (T2), #6(2)E15L7P2 (T2) e #6(1)E8LI(Tl) foram cultivadas. Apenas 14 plantas germinaram a partir dos grãos de linhagem #6(2)E15L7P2 (T2). Uma vez que houve apenas uma quantidade limitada de grão disponível, os experimentos foram realizados com um número menor de plantas desta linhagem. Sete dias depois de semeadura, a folha primária foi removida, inoculada com o P. pachyrhizi com o auxílio da coluna de precipitação e fixada em solução descolorante 24 horas depois da inoculação. Depois de descoloração das folhas ter sido completa, elas foram coradas com anilina azul. Anilina azul se intercala na estrutura de calose e assim cora preferencialmente papilas onde calose se acumula e reticula com outras substâncias poliméricas. Células que, como o resultado de uma resposta de hipersensibilidade (HR), passaram por um processo que parece apoptose em células de mamíferos, também mostram uma fluorescência de luz depois de marcação com anilina azul. O número de esporos, os esporos germinados com tubo germinativo que já haviam formado um apressório e, como resposta celular, os apressórios com as papilas que se situam abaixo, e a HR, foram contados nas folhas de cevada inoculadas. Acumulações maiores de esporos onde uma alocação dos apressórios para os esporos não foi mais possível, não foram incluídas na conta. Tanto quanto possível, pelo menos 100 esporos com apressórios foram contados por folha (veja Tabela em FIG. 11).

A análise das folhas sob o microscópio revelou a formação de papilas, que foi freqüentemente marcadamente aumentada nas linhagens transgênicas. Em contraste, um aparecimento de HR nas células infectadas foi observado menos freqüentemente nas plantas transgênicas. Em tipo selvagem, uma média de 36% das células infectadas desenvolveu papilas como resposta de defesa, 45% das células responderam com uma HR. Em contraste, a formação de papilas nas linhagens transgênicas equivaleu a entre 50 e 60%. A HR, que equivaleu a 16-26%, também foi marcadamente menos pronunciada em comparação com tipo selvagem (FIG. 12). De acordo com análise com o assim chamado "teste de Student" (Teste t), a formação relativa de papilas nas linhagens transgênicas é significativamente aumentada sobre o WT e a HR é significativamente reduzida (P < 0,001). De acordo com as observações nestes experimentos, BI-1 previne a morte celular programada e promove formação de papilas, pelas células, como defesa alternativa. Exemplo 5: Interação de P. pachyrhizi com soja transgênica superexpressando inibidor de Bax -1

Plantas de soja que superexpressam NtBI-I foram geradas por métodos conhecidos propriamente ditos e foram inoculadas com P. pachyrhizi como descrito acima. As plantas de soja transformadas com NtBI-I mostraram uma infecção por ferrugem da soja marcadamente reduzida em comparação com as plantas de soja tipo selvagem - a redução equivaleu em média à região em torno de 30%.

Da mesma maneira, plantas de soja transformadas com NTBI- 1 e com SELDA foram geradas e inoculadas com P. pachyrhizi como descrito acima. As plantas de soja transformadas com NtBI-I + SELDA da mesma maneira mostraram uma infecção por ferrugem da soja marcadamente reduzida em comparação com as plantas de soja tipo selvagem - a redução aqui equivaleu em média à região em torno de 15%. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> Métodos para aumentar a resistência de plantas a fungos

<130> PF 58494

<150> EP 06122870.6 <141> 2006-10-24

<160> 48

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 <211> 744 <212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<22 0>

<221> CDS

<222> (1)..(741)

<223> codifica a proteína BIl

<4 00> 1

atg gac gcc ttc tac tcg acc tcg tcg gcg gcg gcg age ggc tgg ggc 48

Met Asp Ala Phe Tyr Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Gly Trp Gly 10 15

cac gac tcc ctc aag aac ttc cgc cag ate tcc ccc gcc gtg cag tcc 96 His Asp Ser Leu Lys Asn Phe Arg Gln Ile Ser Pro Ala Val Gln Ser 25 30

cac ctc aag ctc gtt tac ctg act cta tgc ttt gea ctg gcc tca tet 144 His Leu Lys Leu Val Tyr Leu Thr Leu Cys Phe Ala Leu Ala Ser Ser 40 45

gcc gtg ggt gct tac cta cac att gcc ctg aac ate ggc ggg atg ctg 192 Ala Val Gly Ala Tyr Leu His Ile Ala Leu Asn Ile Gly Gly Met Leu 50 55 60

aca atg ctc gct tgt gtc gga act ate gcc tgg atg ttc tcg gtg cca 240 Thr Met Leu Ala Cys Val Gly Thr Ile Ala Trp Met Phe Ser Val Pro 65 70 75 80

gtc tat gag gag agg aag agg ttt ggg ctg ctg atg ggt gea gcc ctc 288 Val Tyr Glu Glu Arg Lys Arg Phe Gly Leu Leu Met Gly Ala Ala Leu 85 90 95

ctg gaa ggg gct tcg gtt gga cct ctg att gag ctt gcc ata gac ttt 336 Leu Glu Gly Ala Ser Val Gly Pro Leu Ile Glu Leu Ala Ile Asp Phe 100 105 110

gac cca age ate ctc gtg aca ggg ttt gtc gga acc gcc ate gcc ttt 384 Asp Pro Ser Ile Leu Val Thr Gly Phe Val Gly Thr Ala Ile Ala Phe 115 120 125

ggg tgc ttc tet ggc gcc gcc ate ate gcc aag cgc agg gag tac ctg 432 Gly Cys Phe Ser Gly Ala Ala Ile Ile Ala Lys Arg Arg Glu Tyr Leu 130 135 140 tac ctc ggt ggc ctg ctc tcg tct ggc ctg tcg ate ctg ctc tgg ctg 480 Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu 145 150 155 160

cag ttt gtc acg tcc ate ttt ggc cac tcc tct ggc age ttc atg ttt 528 Gln Phe Val Thr Ser Ile Phe Gly His Ser Ser Gly Ser Phe Met Phe 165 170 175

gag gtt tac ttt ggc ctg ttg ate ttc ctg ggg tac atg gtg tac gac 576 Glu Val Tyr Phe Gly Leu Leu Ile Phe Leu Gly Tyr Met Val Tyr Asp 180 185 190

acg cag gag ate ate gag agg gcg cac cat ggc gac atg gac tac ate 624 Thr Gln Glu Ile Ile Glu Arg Ala His His Gly Asp Met Asp Tyr Ile 195 200 205

aag cac gcc ctc acc ctc ttc acc gac ttt gtt gcc gtc ctc gtc cga 672 Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala Val Leu Val Arg 210 215 220

gtc ctc ate ate atg ctc aag aac gea ggc gac aag tcg gag gac aag 720 Val Leu Ile Ile Met Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Ser Glu Asp Lys 225 230 235 240

aag aag agg aag agg ggg tcc tga 744

Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser 245

<210> 2 <211> 247 <212> PRT

<213> Hordeum vulgare <4 00> 2

Met Asp Ala Phe Tyr Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Gly Trp Gly 10 15

His Asp Ser Leu Lys Asn Phe Arg Gln Ile Ser Pro Ala Val Gln Ser 25 30

His Leu Lys Leu Val Tyr Leu Thr Leu Cys Phe Ala Leu Ala Ser Ser 40 45

Ala Val Gly Ala Tyr Leu His Ile Ala Leu Asn Ile Gly Gly Met Leu 50 55 60

Thr Met Leu Ala Cys Val Gly Thr Ile Ala Trp Met Phe Ser Val Pro 65 70 75 80

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Leu Glu Gly Ala Ser Val Gly Pro Leu Ile Glu Leu Ala Ile Asp Phe 100 105 110

Asp Pro Ser Ile Leu Val Thr Gly Phe Val Gly Thr Ala Ile Ala Phe 115 120 125

Gly Cys Phe Ser Gly Ala Ala Ile Ile Ala Lys Arg Arg Glu Tyr Leu 130 135 140

Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu 145 150 155 160

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Glu Val Tyr Phe Gly Leu Leu Ile Phe Leu Gly Tyr Met Val Tyr Asp 180 185 190

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Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala Val Leu Val Arg 210 215 220

Val Leu Ile Ile Met Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Ser Glu Asp Lys 225 230 235 240

Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser 245

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<220>

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<213> Arabidopsis thaliana <400> 4

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Ala Phe Val Cys Phe Ser Ala Ala 130 135

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210 215 220

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225 230 235 240

Lys Lys Lys Lys Arg Arg Asn 245

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<213> Nicotiana tabacum

<220>

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<4 00> 5

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Leu Asp Tyr Val Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala 210 215 220

Val Phe Val Arg Ile Leu Ile Ile Met Leu Lys Asn Ala Ser Asp Lys 225 230 235 240

Glu Glu Lys Lys Lys Lys Arg Arg Asn 245

<210> 7 <211> 1056 <212> DNA

<213> Oryza sativa <220>

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ctg aag Leu Lys

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192

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288

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gtttgccttt tggtgattga tgatgatcct ttccccaaaa aaaaaaaaa 1056

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Gly Met Leu Thr Met Leu Gly Cys Val Gly Ser Ile Ala Trp Leu Phe 65 70 75 80

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Ala Ala Leu Leu Glu Gly Ala Ser Val Gly Pro Leu Ile Lys Leu Ala 100 105 110

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Leu Trp Leu Gln Phe Ala Ala Ser Ile Phe Gly His Ser Thr Gly Ser 165 170 175

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<213> Brassica napus

<22 0>

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<223> codifica a proteina BIl

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<213> Brassica napus <4 00> 10

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Lys Lys Lys Arg Arg Arg Asn 245

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<210> 12

<211> 248

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 12

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384

432

480

528

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624

672

720

747

Ala Ser Leu Phe Gln Gly Ser Ser Ile Gly Pro Leu Ile Asp Leu Ala 100 105 110

Ile His Ile Asp Pro Ser Leu Ile Phe Ser Ala Phe Val Gly Thr Ala 115 120 125

Leu Ala Phe Ala Cys Phe Ser Gly Ala Ala Leu Val Ala Arg Arg Arg 130 135 140

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Leu Trp Leu His Phe Ala Ser Ser Ile Phe Gly Gly Ser Thr Ala Leu 165 170 175

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<210> 13

<211> 1510

<212> DNA

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<220>

<221> CDS

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<4 00> 13

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192

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1177

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1297

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<210> 14 <211> 259 <212> PRT <213> Glycine max

<4 00> 14

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Gly Ala Ser Ile Gly Pro Leu Ile Asp Leu Ala Phe Ala Ile Asp Pro 115 120 125

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<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS <222> (1)..(651)

<223> codifica a proteína BI-I

<4 00> 15

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528

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<213> Triticum aestivum <4 00> 16

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195 200

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<210> 17 <211> 412 <212> DNA <213> Zea mays

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651

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25

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105

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185

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<223> codifica a proteína BIl

<4 00> 17

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<211> 136

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<4 00> 18

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143

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239

287

335

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<210> 19 aestivum <211> 345 <212> DNA <213> Triticum <220> (342 ) <221> CDS <222> (1) . . <4 00> 19 atc gcc aag cgc agg gag tac ctg tac ctc ggt ggc ctg gcc gcc atc Ile Ala Lys Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ile 5 10 15 I ctc tcc tcc ggc ctg tcg atc ctg ctc tgg ctg cag ttt gcc acg tcc Leu Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu Gln Phe Ala Thr Ser 20 25 30 atc ttt ggc cac tcc tet ggc age ttc atg ttt gag gtt tac ttt ggc Ile Phe Gly His Ser Ser Gly Ser Phe Met Phe Glu Val Tyr Phe Gly 35 40 45 ctg ttg atc ttt ctg gga tac atg gtg tac gac acg cag gag atc atc Leu Leu Ile Phe Leu Gly Tyr Met Val Tyr Asp Thr Gln Glu Ile Ile 50 55 60 gag agg gcg cac cac ggc gac atg gac tac atc aag cac gcg ctc acc Glu Arg Ala His His Gly Asp Met Asp Tyr Ile Lys His Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctc ttc acc gac ttt gtc gcc gtc ctc gtc cgg atc ctc atc atc atg Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala Val Leu Val Arg Ile Leu Ile Ile Met 85 90 95 ctc aag aac gca ggc gac aag tcg gag gac aag aag aag agg aag agg Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Ser Glu Asp Lys Lys Lys Arg Lys Arg 100 105 110 agg tcc tga Arg Ser <210> 20 <211> 114 <212> PRT

<213> Triticum aestivum

96

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192

240

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336

345 <4 00> 20

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Leu Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu Gln Phe Ala Thr Ser 20 25 30

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<210> 21 <211> 403 <212> DNA <213> Zea mays

<220>

<221> CDS <222> (1)..(402)

<223> codifica a proteína BIl

<400> 21

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<210> 22

<211> 134

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<400> 22

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<210> 23 <211> 410 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> CDS <222> (3) . . (410) <223> codifica a <4 00> 23 proteina BIl

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384

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<210> 24

<211> 136

<212> PRT

<213> Zea mays

<4 00> 24 Trp Asn Ile Gly 1

Asp Trp Leu Phe 20

Leu Leu Met Ala 35

Val Lys Leu Ala 50

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Leu Ser Ile Leu 100

Ser Ala Thr Ser 115

Leu Gly Tyr Val

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Ala Ala Leu Leu 40

Val Glu Phe Asp 55

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Leu Trp Leu Gln

Phe Met Phe Glu 120

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Met Leu Gly Cys 10

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Glu Gly Ala Ser

Pro Ser Ile Leu 60

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Leu Gly Gly Leu 90

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Val Tyr Phe Gly

Ile Gly Ser Ile 15

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Val Gly Pro Leu 45

Val Thr Ala Phe

Ala Ala Met Val 80

Leu Ser Ser Gly 95

Ile Phe Gly His 110

Leu Leu Ile Phe 125

191

239

287

335

383

410 130 135

<210> 25 <211> 463 <212> DNA

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS <222> (1) . . (462)

<223> codifica a proteína BIl

<400> 25

ttc tca ggt acg ttc cgc aat tcc cgg age gac gat ttc gtg ctc tgc

Phe Ser Gly Thr Phe Arg Asn Ser Arg Ser Asp Asp Phe Val Leu Cys 15 10 15

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gta tac gtg atc cca ata gtg ggc cga ata aaa tet gcc gcg ggt gct Val Tyr Val Ile Pro Ile Val Gly Arg Ile Lys Ser Ala Ala Gly Ala 40 45

tac ctg cac att gcc ctg aac atc ggt ggg atg ctg aca atg ctt gcg Tyr Leu His Ile Ala Leu Asn Ile Gly Gly Met Leu Thr Met Leu Ala 50 55 60

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tcg gtt gga cct ctg att gag ctt gcc ata gac ttt gac cca age atc Ser Val Gly Pro Leu Ile Glu Leu Ala Ile Asp Phe Asp Pro Ser Ile 100 105 110

ctc gtg aca ggg ttt gtt gga acc gcc atc gcc ttt ggg tgc ttc tet Leu Val Thr Gly Phe Val Gly Thr Ala Ile Ala Phe Gly Cys Phe Ser 115 120 125

ggc gcc gcc atc atc gcc aag cgc agg gag tac ctg tac ctc gga ggc Gly Ala Ala Ile Ile Ala Lys Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly 130 135 140

ctg ctc tcc tcc ggc ctg acg atc ctg ctc t Leu Leu Ser Ser Gly Leu Thr Ile Leu Leu 145 150

<210> 26 <211> 154 <212> PRT

<213> Triticum aestivum

9 6

144

192

240

288

336

384

432

463

<400> 26

Phe Ser Gly Thr Phe Arg Asn Ser Arg Ser Asp Asp Phe Val Leu Cys I 5

Glu Leu Gln Arg Glu Leu 20

Val Tyr Val Ile Pro Ile 35

Tyr Leu His Ile Ala Leu 50

Cys Ile Gly Thr Ile Ala 65 7 0

Arg Lys Arg Phe Gly Leu 85

Ser Val Gly Pro Leu Ile 100

Leu Val Thr Gly Phe Val 115

Gly Ala Ala Ile Ile Ala 130

Leu Leu Ser Ser Gly Leu 145 150

10

Pro Arg Cys Arg Asp 25

Val Gly Arg Ile Lys 40

Asn Ile Gly Gly Met 55

Trp Met Phe Ser Val 75

Leu Met Gly Ala Ala 90

Glu Leu Ala Ile Asp 105

Gly Thr Ala Ile Ala 120

Lys Arg Arg Glu Tyr 135

Thr Ile Leu Leu

15

Ala Thr Leu Thr Val 30

Ser Ala Ala Gly Ala 45

Leu Thr Met Leu Ala 60

Pro Val Tyr Glu Glu 80

Leu Leu Glu Gly Ala 95

Phe Asp Pro Ser Ile 110

Phe Gly Cys Phe Ser 125

Leu Tyr Leu Gly Gly 140

<210> 27 <211> 388 <212> DNA <213> Zea mays

<220>

<221> CDS <222> (3)..(386)

<223> codifica a proteina BIl

<400> 27

tc tgg aac atc ggc ggg acg ctg aca atg ctc ggt tgc gtc ggc age

Trp Asn Ile Gly Gly Thr Leu Thr Met Leu Gly Cys Val Gly Ser 15 10 15

atc gcc tgg ctc ttc tcg gtg ccc gtc tac gag gag agg aag agg tat Ile Ala Trp Leu Phe Ser Val Pro Val Tyr Glu Glu Arg Lys Arg Tyr 25 30

ggg ctg ctg atg gcg gct gcc ctc ctg gaa ggc gct tcg gtc gga ccc

Gly Leu Leu Met Ala Ala Ala Leu Leu Glu Gly Ala Ser Val Gly Pro

35 40 45

ctc gtc aag ctc gcc gtg gaa ttt gac cca age atc ctg gtg acg gcg

Leu Val Lys Leu Ala Val Glu Phe Asp Pro Ser Ile Leu Val Thr Ala

50 55 60

ttc gtg ggg act gcc atc gcg ttc gcg tgc ttc tcc ggc gcg cca tgg

Phe Val Gly Thr Ala Ile Ala Phe Ala Cys Phe Ser Gly Ala Pro Trp

65 70 75

95

143

191

239

tgg cag gcc agg gag tac ctc tac ctg ggc ggc tgc tet cgt cga ggc 287 Trp Gln Ala Arg Glu Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Cys Ser Arg Arg Gly 80 85 90 95

tet cca tcc tgc tet ggc tgc age tcg ccg cct cca tet tcg gca ctc Ser Pro Ser Cys Ser Gly Cys Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Ala Leu 100 105 110

cgc aac age ttc atg ttc gag gtc tac ttc ggg ctg ctc att ctt ctg Arg Asn Ser Phe Met Phe Glu Val Tyr Phe Gly Leu Leu Ile Leu Leu 115 120 125

ggc ta Gly

<210> 28 <211> 128 <212> PRT <213> Zea mays

<400> 28

Trp Asn Ile Gly Gly Thr Leu Thr Met Leu Gly Cys Val Gly Ser Ile 15 10 15

Ala Trp Leu Phe Ser Val Pro Val Tyr Glu Glu Arg Lys Arg Tyr Gly 20 25 30

Leu Leu Met Ala Ala Ala Leu Leu Glu Gly Ala Ser Val Gly Pro Leu 35 40 45

Val Lys Leu Ala Val Glu Phe Asp Pro Ser Ile Leu Val Thr Ala Phe 50 55 60

Val Gly Thr Ala Ile Ala Phe Ala Cys Phe Ser Gly Ala Pro Trp Trp 65 70 75 80

Gln Ala Arg Glu Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Cys Ser Arg Arg Gly Ser 85 90 95

Pro Ser Cys Ser Gly Cys Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Ala Leu Arg 100 105 110

Asn Ser Phe Met Phe Glu Val Tyr Phe Gly Leu Leu Ile Leu Leu Gly 115 120 125

<210> 29 <211> 1737 <212> DNA

<213> Solanum tuberosum <220>

<221> promotor <222> (1)..(1737)

<223> promotor patatina

<400> 29

aagcttatgt

ttaaatttgt

tataacatat

tcaatttaaa

aagcaagatt

tgccatatag

aatgataaaa

gaaagacaaa

tcattgtttt

gattgcaagc

agtagtttgt

tttttattgt

ttgtgttaca

attttctctt

tatgtgtcac

gatggtatac

aaattaaaaa

tattttactt

tctttttaca

cacgttattg

ttcataaact

ttacttataa

ttgactttaa

ggtataaaag

atactttgga

ttaacttatg

aattgggcat

tatgaatatt

gtgaaaattg

agaaattttt

335

383

388

60

120

180

240

300 acttatatgt

ttatgcttta

aatatttttg

atgtattgtc

ttgtaattgt

cactttcagt

aaatttatcc

tctttagtga

catgcagtgt

accccaacct

ttcaagtctc

gtaaacatca

tcgtcacaca

tcataatcta

tccattaaaa

ataatactaa

taatatcaga

aaccaattcc

gtggggtaaa

cctcagcaaa

ctcatcacac

acatcactaa

ttggttatgt

gcttgttata

ctttgtttag

gtataatttt

tcattaaata

gtagtaccct

cactacttat

gacaaaataa

ctaatttata

cgatcgtagt

aaaataaacc

cagcaaaaga

atcacacata

ttaaatcgtc

aaatttttag

atttgttgta

aaaaatatct

taaagaatag

gtcgatcatg

gataaggcga

cctcagcaag

agaaaacctc

atatatatat

cgacagttgc

caaactcaaa

tgctcaaagc

gagtaatatt

agttattttt

aattaattta

tttttgttga

gataatattt

tagatttaat

catttaagga

gttgagtcta

tcaaaaagga

aaacctccct

tatttattat

tttgtatatt

tgacgaaaca

gtgatcatta

ctcttcttat

aaaaaggaaa

tgtcaatttt

gaaatatcat

gacgttgagt

ccctcaagaa

attatataat

ggtgcaaact

gtaaaatttc

accaacaaaa

tgatatgttt

attatatgat

tcacaacttg

atatgaataa

agtgacatat

cacaaaatta

caaagtattt

gaaatcataa

cgttcagtcc

tcaacaagga

ataatactaa

tttagtgaca

tgatttatag

ctcctttgtt

gtacgtgaat

gtgagtgagg

atcgatatga

agtattgagt

ccatagaggg

ggacatttgc

actaataaat

gagtgaggta

tcaacttgtt

tttaaaaaca

tagttagatt

catgggtgaa

attactttca

ttttttttat

atgtcgtcgg

ttaacctttt

tttttatata

tgttgaatct

atagaggggg

catttgcggt

taaagaatag

actgattgac

atgatgaaat

tgttttattt

ggttggaacg

ttcgagggag

ccctaacttc

ctagaaaaat

gggtgtatgt

ggtgctaaac

aatagaaaaa

ataaacatca

tacgtgccta

ctttgaacat

ttcttgtcat

ttttgataca

gtgacaaaaa

tttgtgacaa

taaaagcaaa

ttataataat

taaaaaatag

agaaaaatct

tgtatgtgac

gctaaacaat

aaaaggaaag

gaaatctttt

tatttgtccc

gtcatgttag

gatctattat

agaatctgtt

aactgagttt

ctcatgtagt

gacaccccaa

aatttcaagt

ggaaaggtaa

ctaactttta

tatataccat

ttgcaaa

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1737

<210> 30 <211> 1317 <212> DNA

<213> Triticum aestivum <220>

<221> promotor <222> (1) . . (1317)

<223> promotor de gene germina 9f—3.!

<400> 30

gaattcaagc

tgtcgtgagt

tatgatgacc

ggcggtgccc

ttctgaggag

acccattagg

tttaccctcc

agaagaagag

agggagctcc

cggttccacc

tgtgttcatc

gaatttgttg

ggtttttccc

ttggtgttgt

attctcccag

acaattccta

attctgggag

taggctgagg

tatgtttcct

tactttgttt

caatatgcca

ctctcggtaa

tatcactctc

tccaagttgc

aagatattgc

ccatcatgag

atgaccattt

gttatgacct

atccagcagc

agaaaaccaa

tccccaaggt

atctttggta

caagattcag

tatcccacat

ctcaagttga

ccagaaactt

aattgaccct

gctagttaag

aagctgggga

agtgtcttgc

tccgtgctaa

tcgctgcagt

cccgcaactc

acaacctgta

gaaccaagca

tgaaacttga

gaaataagaa

tcggaggggg

gaggcctttt

agggtcattt

caccaccaag

gagagcaagg

tgtgatggtc

agattgttct

aaatcttgat

ttgataatag

ggggttttcc

actcctacca

ctccccagct

gtctaattag

gggggtcaat

ctgctgctta

gcaacgatcc

tatcagttaa

atccaccata

gcttatcagt

cattgatgta

gaagatccat

gctacaagca

agatttgttg

agccagccca

tggactttgc

ggtgacgaaa

gaagaagagg

catatccact

aatccctagt

gtatgagatc

tggaagagga

acgtaaaatc

caagacacta

tctcccagaa

ttaggaattg

tctggaagaa

acattttctg

ttgagttagt

ccacaagtgc

gctcagcagc

ctagctaagc

aggtatcatt

accgacgaca

tgttgcaagg

ggatatcctc

aagaggtgca

acatgagtgg

atcagttcat

aagattgaag

atcttgtctc

tcttgagccc

ctctagtgct

tttgggtggc

tggtgtctct

ggggccagtt

ttgtcactcc

taaaaaaata

ttgcccaaaa

cctccatata

acatgatgtg

atttgcgtgc

aaccaccaat

gtgctgcata

ggattccaga

atggttcaga

tagcgggcat

ctcatgtggg

gaagcccact

atggggatgc

cctccaagag

gaagaagaaa

cttcaaactt

caaatcttgt

gtctagagaa

ttcggcccat

ttgttgatgc

cttttgggaa

atttttcttt

tcaagtggca

gaactggccc

tgttgttgca

gtgctgagat

taattcccaa

gccatagaca

gcaagca

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1317

<210> 31 <211> 959 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> promotor <222> (1)..(959)

<223> CAB-2 promotor

<4 00> 31

gaattcatgt

tttactgtcg

agagtttcta

ttttctgttg

gaatgagtta

atgattaaaa

atagtttttc

aataatcagt

aggttaaatt

aatcaatgtt

ttcggtcatc

ttatctctat

tgctttggct

gaatagtaaa

ttcatagata

ttcaatcact

gtgagggcaa

aaattattta

tcaaagtgat

tggtttttca

ctttagattt

atttacaagc

agtgtttgaa

gtttttgagt

aattacatta

attgtaaatt

ggtatcacac

tcagaactat

gcaatgaaaa

cgttaaaacc

acaaacgtta

ctcactcaca

ttagtgattg

gggtgatgaa

tgaggaatag

tctctacaaa

taaaaggttg

tacatattgt

caatcaattg

ctttgcattt

ttcatgagat

ggtagtgatg

tatctttact

taagctgctt

aatcatagca

aaaatctcaa

ctcgcaattt

agttagtcac

taaaaataaa

aaaatcagta

tttgttgcaa

ttttgaattt

ttcaagttta

ctaaaccaat

gatagttttt

tgatttaaaa

ttatcaggtt

ttggacttct

tttatttaaa

ccaaaagact

aaagctagtg

aaatccaatg

tcctatataa

caaaaaaaaa

attgtgtttt

aactacgaat

attaaacctc

tatgatgaat

caaaacagat

gatgttgaac

atgtttctgc

gcaaaaacaa

agtggataaa

aatgttactc

ggaaagatca

tgcaacatgt

gactagagac

agtaaagaga

tccaacccta

aaaaacacaa

gtaaaaaact

gatagcttaa

taacaaaatg

tagaaagata

tactagaatc

ataccagatg

aaaatatgca

ctgagtttca

ctgacaatgg

tctatgatgt

cacaaataag

ggtctcgaaa

tgccacataa

tatagattac

cctaaccatt

aaagtttca

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

959

<210> 32 <211> 445 <212> DNA <213> Zea mays

<22 0>

<221> promotor <222> (1)..(445)

<223> PPCZml promotor

<400> 32

gaattccaaa

tccccaagtc

acttggcatg

tctccaaacg

aatagacacg

caatctcctc

cacgcccgct

attcggtcgg

aatagacacg

cacagggatt

agtcatgtga

ggccccgcca

cacactccca

ctcctcctcc

gcgggctcgc

attccgtgcg

gcaattttct

agggatcaat

ccatgagaga

cacacgatca

actccccacc

gctctcagac

aggcggcaga

ccgcg

tattcacaga

ctgcaaaact

ggcgcacggt

ccatcacccc

catctccgcc

gagcagcggt

gaattgtctg

aaaaatataa

aaaagtactt

tcagcaaagc

cgggctcccg

gcgcacaccg

tgccatcact

tgccgccggg

ctacaactaa

ttacagttgt

aacataaaat

acccagtaca

cccaatcagc

ctccacttcc

tgggaatttg

60

120

180

240

300

360

420

445

<210> 33 <211> 5455 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Descrição da seqüência artificial: vetor de expressão recombinante pUbiBI-1

<400> 33

ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcgg ccgcactagt gattaggatt ccaacgcgag 60

ccaggacaag cgaggaacct tgcgtgcgag gcgaggccgc cccgctccga ttcgattcga 120

cgcgcaggcg caggcgcagg gatggacgcc ttctactcga cctcgtcggc ggcggcgagc 180

ggctggggcc acgactccct caagaacttc cgccagatct cccccgccgt gcagtcccac 240

ctcaagctcg tttacctgac tctatgcttt gcactggcct catctgccgt gggtgcttac 300 ctacacattg ccctgaacat cggcgggatg ctgacaatgc tcgcttgtgt cggaactatc 360 gcctggatgt tctcggtgcc agtctatgag gagaggaaga ggtttgggct gctgatgggt 420 gcagccctcc tggaaggggc ttcggttgga cctctgattg agcttgccat agactttgac 480 ccaagcatcc tcgtgacagg gtttgtcgga accgccatcg cctttgggtg cttctctggc 540 gccgccatca tcgccaagcg cagggagtac ctgtacctcg gtggcctgct ctcgtctggc 600 ctgtcgatcc tgctctggct gcagtttgtc acgtccatct ttggccactc ctctggcagc 660 ttcatgtttg aggtttactt tggcctgttg atcttcctgg ggtacatggt gtacgacacg 720 caggagatca tcgagagggc gcaccatggc gacatggact acatcaagca cgccctcacc 780 ctcttcaccg actttgttgc cgtcctcgtc cgagtcctca tcatcatgct caagaacgca 840 ggcgacaagt cggaggacaa gaagaagagg aagagggggt cctgaacgtw tctcccgcac 900 atgtagatac cgtcaccgcg tcgacctgca ggcatgcccg ctgaaatcac cagtctctct 960 ctacaaatct atctctctca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt 1020 tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt 1080 tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtgggtaccg 1140 agctcgaatt caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 1200 ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 1260 gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 1320 ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 1380 ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 1440 gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 1500 gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 1560 aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 1620 acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 1680 atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 1740 tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 1800 gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 1860 gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 1920 gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 1980 ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 2040 tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 2100 acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 2160 cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 2220 catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 2280 cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 2340 ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 2400 ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 2460 ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 2520 atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 2580 gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 2640 atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 2700 tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 2760 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 2820 ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 2880 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 2940 gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3000 ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3060 gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3120 acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagctt 3180 tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3240 gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3300 cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3360 cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3420 ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 3480 gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 3540 agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 3600 cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 3660 attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 3720 cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 3780 gattacgaat tcccatgcct cgaggatcta acatgcttag atacatgaag taacatgctg 3840 ctacggttta ataattcttg agttgatttt tactggtact tagatagatg tatatacatg 3900 cttagataca tgaagtaaca tgctcctaca gttcctttaa tcattattga gtacctatat 3960 attctaataa atcagtatgt tttaaattat tttgatttta ctggtactta gatagatgta 4020 tatatacatg ctcaaacatg cttagataca tgaagtaaca tgctgctacg gtttagtcat 4080 tattgagtgc ctataatttc taataaatca gtatgtttta tacttagata gatgtatata tacatgctca aacatgctta actacggttt aattgttctt gagtacctat atattctaat atttcgattt tactggtact tagatagatg tatatataca catgctacta cggtttaatt gttcttgaat acctatatat taaattattt cgattttact ggtacttaga tagatgtata tagatacatg aagtaacatg ctacatatat attataataa tttgatttta ctggtactta gatagatgta tatacatgct aagtaacatg ctactacggt ttaatcatta ttgagtacct atgttttcaa ttgttttgat tttactggta cttagatata catgcttaga tacgtgaagt aacatgctac tatggttaat ttctaataaa tcagtatgtt ttaaattatt tcgattttac atatacatgc tcgaacatgc ttagatacat gaagtaacat cttgagtacc tatatattct aataaatcag tatgtcttaa acttagatag atgtatatac atgcttagat acatgaagta cgttcttgag tacctatata ttctaataaa tcagtatgtt tggtacttag atagatgtat atatacatgc tcgaacatgc gctactacgg tttaatcatt cttgagtacc tatatattct attattttga tattactggt acttaacatg tttagataca gctactgttt aatcattcgt gaatacctat atattctaat tattatgatt ttgatgtact tgtatggtgg catatgctgc tacccagtgt gatgagcatg catggcgcct tcatagttca agactgttct tttttgttga tagtcaccct gttgtttggt

<210> 34 <211> 12633 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: vetor de expressão recombinante pLol14UbiBI-I

<4 00> 34

aattcactgg ccgtcgtttt acaacgactc agagcttgac aggaggcccg atctagtaac 60

atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc 120

gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc 180

atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc 240

atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga 300

tcggggatca tccgggtctg tggcgggaac tccacgaaaa tatccgaacg cagcaagatc 360

tagagcttgg gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 420

gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 480

tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 540

cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 600

gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 660

aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 720

ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 780

caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 840

tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 900

cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 960

gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 1020

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atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc gaggggaatt tatggaacgt 1260

cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata gtgaccttag gcgacttttg 1320

aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat taaactccag aaacccgcgg 1380

ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa acgtaaaacg gcttgtcccg 1440

cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc cgctcatgat cagattgtcg 1500

tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat cctgcttggt aataattgtc 1560

attagattgt ttttatgcat agatgcactc gaaatcagcc aattttagac aagtatcaaa 1620

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<210> 35 <211> 5598 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: vetor de expressão recombinante pOXoBI-1

<4 00> 35

ggqgatcctc tagagtcgac ctgcaggcgg ccgcactagt gattaggatt ccaacgcgag 60 ccaggacaag cgaggaacct tgcgtgcgag gcgaggccgc cccgctccga ttcgattcga 120 cgcgcaggcg caggcgcagg gatggacgcc ttctactcga cctcgtcggc ggcggcgagc 180 ggctggggcc acgactccct caagaacttc cgccagatct cccccgccgt gcagtcccac 240 ctcaagctcg tttacctgac tctatgcttt gcactggcct catctgccgt gggtgcttac 300 ctacacattg ccctgaacat cggcgggatg ctgacaatgc tcgcttgtgt cggaactatc 360 gcctggatgt tctcggtgcc agtctatgag gagaggaaga ggtttgggct gctgatgggt 420 gcagccctcc tggaaggggc ttcggttgga cctctgattg agcttgccat agactttgac 480 ccaagcatcc tcgtgacagg gtttgtcgga accgccatcg cctttgggtg cttctctggc 540 gccgccatca tcgccaagcg cagggagtac ctgtacctcg gtggcctgct ctcgtctggc 600 ctgtcgatcc tgctctggct gcagtttgtc acgtccatct ttggccactc ctctggcagc 660 ttcatgtttg aggtttactt tggcctgttg atcttcctgg ggtacatggt gtacgacacg 720 caggagatca tcgagagggc gcaccatggc gacatggact acatcaagca cgccctcacc 780 ctcttcaccg actttgttgc cgtcctcgtc cgagtcctca tcatcatgct caagaacgca 84 0 ggcgacaagt cggaggacaa gaagaagagg aagagggggt cctgaacgtw tctcccgcac 900 atgtagatac cgtcaccgcg tcgacctgca ggcatgcccg ctgaaatcac cagtctctct 960 ctacaaatct atctctctca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt 1020 tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt 1080 tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtgggtaccg 1140 agctcgaatt caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 1200 ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 1260 gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 1320 ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 1380 ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 144 0 gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 1500 gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 1560 aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 1620 acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 1680 atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 1740 tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 1800 gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 1860 gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 1920 gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 1980 ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 2040 tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 2100 acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 2160 cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 2220 catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 2280 cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 2340 ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 2400 ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 2460 ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 2520 atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 2580 gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 2640 atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 2700 tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 2760 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 2820 ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 2880 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 2940 gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3000 ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3060 gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3120 acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagctt 3180 tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3240 gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3300 cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3360 cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3420 ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 3480 gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 3540 agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 3600 cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 3660 attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 3720 cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 3780 gattacgaat tcccatgcct cgagcagaaa gatataatat gtaaaaaaat gggtctatat 3840 atatggaagg tttcaggaag acaaaggttc tagaaacttc caaaaaaaat ccagaatata 3900 ttttggaaga aataccctct tgggttggcc ccggcgcagc ccctagtggg ccaaaaagcc 3960 acgatctaat cccggtctaa ttggtctaat agtttagact tctaattaga cgggctctta 4020 tgccggtcta attggtctaa ttagattaaa atcctaatta aatatgaacg caactaggct 4080 tcccctctct ctagttttct cggagctctt tttcatggac cttgaagtat tgccggatca 4140 ctacttcgga actcgtggat acttcagagt gcacatctac tttgaatctt gattggtaga 4200 tcatctcgga gaaattctca cagttgggag gtataaccag ttgccgaaat tgccatgctt 4260 cactcacagc caggatcagc ccatgtccca aggcaaccct tgtagctaca tgccgaggcc 4320 tgactacttg gggcctcgcg ccctgcattt ttgcatgttc atgtgacacg ttaaatgttg 4380 agagaaatag attactaaat atcacccatt tcgttattct agatgagtat cctacaatat 4440 gtataccgaa aaatgtattt taaactgtgg taggtgagaa agatctatta aaaagaactc 4500 tacgtatact cccccctccc aatccccatc caggtttgta agacactttc gtcttttttt 4560 gccgaatttt aaccgtaaat ttgactagta aaaataagtt atactgaatg taataaatat 4620 cgtacattcg gatgttggag acagggagag gctggctggt gcgctggatg gatcacggtc 4680 agaaagtctg acttgcaacg ccacaggccc gttgattgcc actgacaacc aagttttcgt 4740 tgtttcgctg gtgccatatt ttccgcgatc gaatatttaa actgcgagga gaaaggcaag 4800 cagggcgcca tatcagcact tgatcactca ctgatcgatc agtagtagcc accttctctg 4860 cgccgacgtg ttatatatta ttggcaacaa gtcatcgatt gagaacagaa acaaaacaag 4920 aagagaacta tttgagagag agtagttacg ccgcagcgag tagcctccca tttctgacga 4980 tcatgccata cgataaaccg gccggcggcg agaccagtta gcaaggttga aatgccaaca 5040 catgtcgcgc tcatttctcg gctttttcat tttgcatgtc gtcatgcagg ccctggacac 5100 tgacatttct ctcttttgct gttgaatgaa gaccctaacc tttcaccatc agcacgcccc 5160 tcaacttgat aagcctagac gaaacccata tgcatgattg atgagtaatg gtgtgcacga 5220 atattatgaa cccgtttcca agagcaatac tccattgaga tacacctcct ccttgtatct 5280 gttcgttggt cccatttcca tagcagccgg cagtggcctt gactctgact gccacgcaag 5340 taatatatct ttaataaact cgctgccttg cttcgtgtgt ccatttgcaa atgcatgcag 5400 tgacgacatg cacatgcata gcttaattag ctccatgcat ccactgcttc cattaatccc 5460 ctatataaag gactccatat gcctcaccat tcactcatcc accacagctt agcagcagca 5520 acaaccagtg ccatagacac tctccatcaa caaactctag ctgatcaatc ctagctaagc 5580 ttattacata gcaagccc 5598

<210> 36 <211> 12776 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: vetor de expressão recombinante pLol14OXoBI-I

<400> 36

aattcactgg

atagatgaca

gcgtattaaa

atgcattaca

atcgcaagac

tcggggatca

tagagcttgg

gaatcgggag

tcttcagcaa

cggccacagt

gcatcgccat

aacagttcgg

ccggcttcca

caggtagccg

ccgtcgtttt

ccgcgcgcga

tgtataattg

tgttaattat

cggcaacagg

tccgggtctg

gtcccgctca

cggcgatacc

tatcacgggt

cgatgaatcc

gggtcacgac

ctggcgcgag

tccgagtacg

gatcaagcgt

acaacgactc

taatttatcc

cgggactcta

tacatgctta

attcaatctt

tggcgggaac

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gtaaagcacg

agccaacgct

agaaaagcgg

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cccctgatgc

tgctcgctcg

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tcaagaaggc

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gctatatttt

cccatctcat

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gatagaaggc

cagcccattc

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tgcgcgcctt

gatcatcctg

tcgcttggtg

cagccatgat

atctagtaac 60 gttttctatc 120 aaataacgtc 180 tatgataatc 240 gtttgaacga 300 cagcaagatc 360 gatgcgctgc 420 gccgccaagc 480 cacacccagc 540 cggcaagcag 600 gagcctggcg 660 atcgacaaga 720 gtcgaatggg 780 ggatactttc 840 tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 900 cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 960 gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 1020 gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 1080 cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 1140 gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atccagatcc ggtgcagatt 1200 atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc gaggggaatt tatggaacgt 1260 cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata gtgaccttag gcgacttttg 1320 aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat taaactccag aaacccgcgg 1380 ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa acgtaaaacg gcttgtcccg 1440 cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc cgctcatgat cagattgtcg 1500 tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat cctgcttggt aataattgtc 1560 attagattgt ttttatgcat agatgcactc gaaatcagcc aattttagac aagtatcaaa 1620 cggatgttaa ttcagtacat taaagacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc 1680 aatttgttta caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag 1740 ctcggcacaa aatcaccacg cgttaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg 1800 ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc 1860 gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag 1920 atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca 1980 ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg 2040 cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc 2100 ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc 2160 aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg 2220 tgttcgagcc gcccgcgcac gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt 2280 ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc 234 0 gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata 2400 tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact 24 60 taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca 2520 actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg 2580 ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga 2640 ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc 2700 ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc 2760 aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga 2820 ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg 2880 catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg 2940 tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc 3000 agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa 3060 actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc 3120 ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca 3180 gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac 3240 gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca 3300 gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat 3360 ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg 3420 cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc 3480 caagcccgag gaatcggcgt gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg 3540 gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc 3600 atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa 3660 gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac 3720 gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc 3780 atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc 3840 cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt 3900 gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga 3960 taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta 4020 ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc 4080 attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc 4140 ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa 4200 accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca 4260 gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc 4320 atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg 4380 ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc 4440 accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg 4500 gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc 4560 gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt 4620 cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg 4680 aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa 4740 gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt 4800 aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag 4860 ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg 4 920 cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg 4 980 cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct 5040 cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 5100 agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 5160 tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 5220 cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 5280 ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 5340 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 5400 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 5460 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 5520 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 5580 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 5640 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 5700 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 57 60 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 5820 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 5880 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 5940 aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 6000 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 6060 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 6120 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcatga tatatctccc 6180 aatttgtgta gggcttatta tgcacgctta aaaataataa aagcagactt gacctgatag 6240 tttggctgtg agcaattatg tgcttagtgc atctaacgct tgagttaagc cgcgccgcga 6300 agcggcgtcg gcttgaacga atttctagct agacattatt tgccgactac cttggtgatc 6360 tcgcctttca cgtagtggac aaattcttcc aactgatctg cgcgcgaggc caagcgatct 6420 tcttcttgtc caagataagc ctgtctagct tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc 6480 aggcgctcca ttgcccagtc ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg 6540 ctgtaccaaa tgcgggacaa cgtaagcact acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc 6600 ggcgagttcc atagcgttaa ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc 6660 ggatcaaaga gttcctccgc cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt 6720 gtcagcaaga tagccagatc aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg 6780 tcattgcgct gccattctcc aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg 6840 atgtcgtcgt gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg 6900 gaagccgaag tttccaaaag gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt 6960 acggtcaccg taaccagcaa atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg 7020 gagccgtaca aatgtacggc cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact 7080 acctctgata gttgagtcga tacttcggcg atcaccgctt cccccatgat gtttaacttt 7140 gttttagggc gactgccctg ctgcgtaaca tcgttgctgc tccataacat caaacatcga 7200 cccacggcgt aacgcgcttg ctgcttggat gcccgaggca tagactgtac cccaaaaaaa 7260 cagtcataac aagccatgaa aaccgccact gcgggggttc catggacata caaatggacg 7320 aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa cgctcttttc 7380 tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga 7440 aacgacaatc agatctagta ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc 7500 tgcaggtcga ctctagagga tcgatccccg ggtaggtcag tcccttatgt tacgtcctgt 7560 agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg 7620 cgaaaactgt ggaattggtc agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat 7 680 tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg 7740 caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt 7800 gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat 7860 ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg 7920 gaaaagtgta cgtaagtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat tatcattaat 7980 tagtagtaat ataatatttc aaatattttt ttcaaaataa aagaatgtag tatatagcaa 8040 ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct aatatatgac 8100 caaaatttgt tgatgtgcag gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac 8160 tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca 8220 tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac 8280 ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt 8340 tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca 8400 ggtggttgca

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cgagaccagt

attttgcatg

aagaccctaa

tatgcatgat

actccattga

ggcagtggcc

tgcttcgtgt

agctccatgc

attcactcat

aacaaactct

tagagtcgac

cgaggaacct

caggcgcagg

acgactccct

tttacctgac

ccctgaacat

tctcggtgcc

tggaaggggc

tcgtgacagg

actggacaag

gaaggttatc

ccgcttcgcg

aaaccgttct

ttcgataacg

taccgtacct

atcgtggtga

gaagcgggca

caagcgcact

gtgatgtgga

gcgccactgg

gtaatgttct

aaccgttatt

gaaaaagaac

ggcgtggata

cagtgtgcat

gaacaggtat

aacaagaaag

aaacgctgga

ctcgaatttc

tgccggtctt

taacatgtaa

atacatttaa

cgcggtgtca

atgtaaaaaa

tccaaaaaaa

gcccctagtg

cttctaatta

taaatatgaa

accttgaagt

actttgaatc

agttgccgaa

cttgtagcta

tcatgtgaca

ctagatgagt

aaagatctat

taagacactt

ttatactgaa

gtgcgctgga

ccactgacaa

aaactgcgag

tcagtagtag

ttgagaacag

agtagcctcc

tagcaaggtt

tcgtcatgca

cctttcacca

tgatgagtaa

gatacacctc

ttgactctga

gtccatttgc

atccactgct

ccaccacagc

agctgatcaa

ctgcaggcgg

tgcgtgcgag

gatggacgcc

caagaacttc

tctatgcttt

cggcgggatg

agtctatgag

ttcggttgga

gtttgtcgga

gcactagcgg

tctatgaact

tcggcatccg

actttactgg

tgctgatggt

cgcattaccc

ttgatgaaac

acaagccgaa

tacaggcgat

gtattgccaa

cggaagcaac

gcgacgctca

acggatggta

ttctggcctg

cgttagccgg

ggctggatat

ggaatttcgc

ggatcttcac

ctggcatgaa

cccgatcggt

gcgatgatta

tgcatgacgt

tacgcgatag

tctatgttac

atgggtctat

atccagaata

ggccaaaaag

gacgggctct

cgcaactagg

attgccggat

ttgattggta

attgccatgc

catgccgagg

cgttaaatgt

atcctacaat

taaaaagaac

tcgtcttttt

tgtaataaat

tggatcacgg

ccaagttttc

gagaaaggca

ccaccttctc

aaacaaaaca

catttctgac

gaaatgccaa

ggccctggac

tcagcacgcc

tggtgtgcac

ctccttgtat

ctgccacgca

aaatgcatgc

tccattaatc

ttagcagcag

tcctagctaa

ccgcactagt

gcgaggccgc

ttctactcga

cgccagatct

gcactggcct

ctgacaatgc

gagaggaaga

cctctgattg

accgccatcg

gactttgcaa

gtgcgtcaca

gtcagtggca

ctttggtcgt

gcacgaccac

ttacgctgaa

tgctgctgtc

agaactgtac

taaagagctg

cgaaccggat

gcgtaaactc

caccgatacc

tgtccaaagc

gcaggagaaa

gctgcactca

gtatcaccgc

cgattttgcg

tcgcgaccgc

cttcggtgaa

caaacatttg

tcatataatt

tatttatgag

aaaacaaaat

tagatcggga

atatatggaa

tattttggaa

ccacgatcta

tatgccggtc

cttcccctct

cactacttcg

gatcatctcg

ttcactcaca

cctgactact

tgagagaaat

atgtataccg

tctacgtata

ttgccgaatt

atcgtacatt

tcagaaagtc

gttgtttcgc

agcagggcgc

tgcgccgacg

agaagagaac

gatcatgcca

cacatgtcgc

actgacattt

cctcaacttg

gaatattatg

ctgttcgttg

agtaatatat

agtgacgaca

ccctatataa

caacaaccag

gcttattaca

gattaggatt

cccgctccga

cctcgtcggc

cccccgccgt

catctgccgt

tcgcttgtgt

ggtttgggct

agcttgccat

cctttgggtg

gtggtgaatc

gccaaaagcc

gtgaagggcg

catgaagatg

gcattaatgg

gagatgctcg

ggctttaacc

agcgaagagg

atagcgcgtg

acccgtccgc

gacccgacgc

atcagcgatc

ggcgatttgg

ctgcatcagc

atgtacaccg

gtctttgatc

acctcgcaag

aaaccgaagt

aaaccgcagc

gcaataaagn

tctgttgaat

atgggttttt

atancgcgca

attcccatgc

ggtttcagga

gaaataccct

atcccggtct

taattggtct

ctctagtttt

gaactcgtgg

gagaaattct

gccaggatca

tggggcctcg

agattactaa

aaaaatgtat

ctcccccctc

ttaaccgtaa

cggatgttgg

tgacttgcaa

tggtgccata

catatcagca

tgttatatat

tatttgagag

tacgataaac

gctcatttct

ctctcttttg

ataagcctag

aacccgtttc

gtcccatttc

ctttaataaa

tgcacatgca

aggactccat

tgccatagac

•tagcaagccc

ccaacgcgag

ttcgattcga

ggcggcgagc

gcagtcccac

gggtgcttac

cggaactatc

gctgatgggt

agactttgac

cttctctggc

cgcacctctg

agacagagtg

aacagttcct

cggacttgcg

actggattgg

actgggcaga

tctctttagg

cagtcaacgg

acaaaaacca

aaggtgcacg

gtccgatcac

tctttgatgt

aaacggcaga

cgattatcat

acatgtggag

gcgtcagcgc

gcatattgcg

cggcggcttt

agggaggcaa

ttcttaagat

tacgttaagc

atgattagag

aactaggata

ctcgagcaga

agacaaaggt

cttgggttgg

aattggtcta

aattagatta

ctcggagctc

atacttcaga

cacagttggg

gcccatgtcc

cgccctgcat

atatcaccca

tttaaactgt

ccaatcccca

atttgactag

agacagggag

cgccacaggc

ttttccgcga

cttgatcact

tattggcaac

agagtagtta

cggccggcgg

cggctttttc

ctgttgaatg

acgaaaccca

caagagcaat

catagcagcc

ctcgctgcct

tagcttaatt

atgcctcacc

actctccatc

ggggatcctc

ccaggacaag

cgcgcaggcg

ggctggggcc

ctcaagctcg

ctacacattg

gcctggatgt

gcagccctcc

ccaagcatcc

gccgccatca

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

9600

9660

9720

9780

9840

9900

9960

10020

10080

10140

10200

10260

10320

10380

10440

10500

10560

10620

10680

10740

10800

10860

10920

10980

11040

11100

11160

11220

11280

11340

11400

11460

11520

11580

11640

11700

11760

11820

11880

11940

12000

12060

12120

12180 tcgccaagcg

tgctctggct

aggtttactt

tcgagagggc

actttgttgc

cggaggacaa

cgtcaccgcg

atctctctca

tttcgctcat

ttctatcaat

cagggagtac

gcagtttgtc

tggcctgttg

gcaccatggc

cgtcctcgtc

gaagaagagg

tcgacctgca

taataatgtg

gtgttgagca

aaaatttcta

ctgtacctcg

acgtccatct

atcttcctgg

gacatggact

cgagtcctca

aagagggggt

ggcatgcccg

tgagtagttc

tataagaaac

attcctaaaa

gtggcctgct

ttggccactc

ggtacatggt

acatcaagca

tcatcatgct

cctgaacgtw

ctgaaatcac

ccagataagg

ccttagtatg

ccaaaatcca

ctcgtctggc

ctctggcagc

gtacgacacg

cgccctcacc

caagaacgca

tctcccgcac

cagtctctct

gaattagggt

tatttgtatt

gtgggtaccg

ctgtcgatcc

ttcatgtttg

caggagatca

ctcttcaccg

ggcgacaagt

atgtagatac

ctacaaatct

tcttataggg

tgtaaaatac

agctcg

<210> 37 aestivum <211> 744 <212> DNA <213> Triticum <220> ) 1 <221> CDS a TaBI- <222> (1)..(741 <223> codificar <400> 37 ttc tac tcg acc tcg tcg gcg gcg gcg age ggc tgg ggc atg gac gcc Phe Tyr Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Gly Trp Gly Met Asp Ala 5 10 15 1 tac gac tcc ctc aag aac ttc cgc gag atc tcc ccc gcc gtg cag tcc Tyr Asp Ser Leu Lys Asn Phe Arg Glu Ile Ser Pro Ala Val Gln Ser 20 25 30 cac ctc aag ctc gtt tac ctg acc cta tgc ttt gcc ctg gcc tca tet His Leu Lys Leu Val Tyr Leu Thr Leu Cys Phe Ala Leu Ala Ser Ser 35 40 4 5 gcc gtg ggt gct tac ctg cac att gcc ctg aac atc ggt ggg atg ctg Ala Val Gly Ala Tyr Leu His Ile Ala Leu Asn Ile Gly Gly Met Leu 50 55 60 aca atg ctc gcg tgt gtt gga acc atc gcc tgg atg ttc tet gtg cca Thr Met Leu Ala Cys Val Gly Thr Ile Ala Trp Met Phe Ser Val Pro 65 70 75 80 gtc tat gag gag agg aag agg ttt ggg ctg ctg atg ggt gca gcc ctc Val Tyr Glu Glu Arg Lys Arg Phe Gly Leu Leu Met Gly Ala Ala Leu 85 90 95 ctg gaa ggg gct tcg gtt gga cct ctg att gag ctt gcc ata gac ttt Leu Glu Gly Ala Ser Val Gly Pro Leu Ile Glu Leu Ala Ile Asp Phe 100 105 110 gac cca agt atc ctc gtg aca ggg ttt gtc gga acc gcc atc gcc ttc Asp Pro Ser Ile Leu Val Thr Gly Phe Val Gly Thr Ala Ile Ala Phe 115 120 125 ggg tgc ttc tet ggc gcc gcc atc atc gcc aag cgc agg gag tac ctg Gly Cys Phe Ser Gly Ala Ala Ile Ile Ala Lys Arg Arg Glu Tyr Leu 130 135 140 12240

12300

12360

12420

12480

12540

12600

12660

12720

12776

48

96

144

192

240

288

336

384

432

tac ctc ggt ggt ctg ctc tcc tcc ggc ctg tcg atc ctg ctc tgg ctg 480 Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu 145 150 155 160 cag ttt gcc acg tcc atc ttt ggc cac tcc tet ggc age ttc atg ttt Gln Phe Ala Thr Ser Ile Phe Gly His Ser Ser Gly Ser Phe Met Phe 165 170 175

gag gtt tac ttt ggc ctg ttg atc ttc ctg gga tac atg gtg tac gac Glu Val Tyr Phe Gly Leu Leu Ile Phe Leu Gly Tyr Met Val Tyr Asp 180 185 190

acg cag gag atc atc gag agg gcg cac cac ggc gac atg gat tac atc Thr Gln Glu Ile Ile Glu Arg Ala His His Gly Asp Met Asp Tyr Ile 195 200 205

aag cac gcg ctc acc ctc ttc acc gac ttc gtc gcc gtt ctc gtc cgc Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala Val Leu Val Arg 210 215 220

gtc ctc atc atc atg ctc aag aac gca ggc gac aag tcg gag gac aag Val Leu Ile Ile Met Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Ser Glu Asp Lys 225 230 235 240

aag aag agg aag agg ggg tcc tga Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser 245

<210> 38 <211> 247 <212> PRT

<213> Triticum aestivum <400> 38

Met Asp Ala Phe Tyr Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Gly Trp Gly 15 10 15

Tyr Asp Ser Leu Lys Asn Phe Arg Glu Ile Ser Pro Ala Val Gln Ser 20 25 30

His Leu Lys Leu Val Tyr Leu Thr Leu Cys Phe Ala Leu Ala Ser Ser 35 40 45

Ala Val Gly Ala Tyr Leu His Ile Ala Leu Asn Ile Gly Gly Met Leu 50 55 60

Thr Met Leu Ala Cys Val Gly Thr Ile Ala Trp Met Phe Ser Val Pro 65 70 75 80

Val Tyr Glu Glu

Leu Glu Gly Ala 100

Asp Pro Ser Ile 115

Gly Cys Phe Ser 130

Tyr Leu Gly Gly 145

Gln Phe Ala Thr

Arg Lys Arg Phe 85

Ser Val Gly Pro

Leu Val Thr Gly 120

Gly Ala Ala Ile 135

Leu Leu Ser Ser 150

Ser Ile Phe Gly 165

Gly Leu Leu Met 90

Leu Ile Glu Leu 105

Phe Val Gly Thr

Ile Ala Lys Arg 140

Gly Leu Ser Ile 155

His Ser Ser Gly 170

Gly Ala Ala Leu 95

Ala Ile Asp Phe 110

Ala Ile Ala Phe 125

Arg Glu Tyr Leu

Leu Leu Trp Leu 160

Ser Phe Met Phe 175

528

576

624

672

720

744 Glu Val Tyr Phe Gly Leu Leu Ile Phe Leu Gly Tyr Met Val Tyr Asp

180

185

190

Thr Gln Glu Ile Ile Glu Arg Ala His His Gly Asp Met Asp Tyr Ile

195

200

205

Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Phe Val Ala Val Leu Val Arg 210 215 220

Val Leu Ile Ile Met Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Ser Glu Asp Lys

225

230

235

240

Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser 245

<210> 39 <211> 1293 <212> DNA

<213> Hordéum vulgare

<220>

<221> CDS

<222> (173) . . (1126)

<223> codificar a Hordeum vulgare subsp. vulgare syntaxin (Ror2)

<4 00> 39

gtaactaacc ccttcttcct cccttgtcca ctccgcttct ccccatccaa gaaacagcgc

caacagctcc acccatcgag gagaatcaag aaaccgcgcc ggcgtggtga tcaaggacat

ccatcgatcg atcgaccgac cctgccttgc ctgagtcaac ccggcggcag cc atg aac

Met Asn 1

aac ctc ttc tcg age tcg tgg aag cgg gcg ggc gcg ggg ggc gac ggg Asn Leu Phe Ser Ser Ser Trp Lys Arg Ala Gly Ala Gly Gly Asp Gly 10 15

gac ctg gag tcg ggc ggc ggc ggc gtg gag atg acg gcg ccg ccg ggc Asp Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Glu Met Thr Ala Pro Pro Gly 25 30

gcc gcg gcg ggg gcg age ctg gac cgc ttc ttc gag gac gtg gag tcg Ala Ala Ala Gly Ala Ser Leu Asp Arg Phe Phe Glu Asp Val Glu Ser 40 45 50

atc aag gac gac ctg cgg gag ctg gag cgg atc cag cgc tcc ctc cac Ile Lys Asp Asp Leu Arg Glu Leu Glu Arg Ile Gln Arg Ser Leu His 55 60 65

gac ggc aac gag tcg ggc aag tcg ctc cac gac gcg tcg gcg gtg cgc Asp Gly Asn Glu Ser Gly Lys Ser Leu His Asp Ala Ser Ala Val Arg 70 75 80

gcg ctc cgc tcc cgc atg gac gcc gac gtg gcc gcc gcc atc aag aag Ala Leu Arg Ser Arg Met Asp Ala Asp Val Ala Ala Ala Ile Lys Lys 85 90 95

gcc aag gtg gtg aag ttg cgg ctc gag tcg ctc gac cgc gcc aac gcc

60

120

178

226

274

322

370

418

466

514 Ala Lys Val Val Lys Leu Arg Leu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Asn Ala 100 105 110

gcc aac cgg tcc gtg gcc ggg tgc ggg ccg ggg tcg tcc acg gac cgc Ala Asn Arg Ser Val Ala Gly Cys Gly Pro Gly Ser Ser Thr Asp Arg 115 120 125 130

acc cgc acc tcc gtc gtg gcc ggg ctg cgc aag aag ctg cgg gat gcc Thr Arg Thr Ser Val Val Ala Gly Leu Arg Lys Lys Leu Arg Asp Ala 135 140 145

atg gag tcc ttc tcc tcc ctc cgc tcc cgc atc acc tcc gag tac cgg Met Glu Ser Phe Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ile Thr Ser Glu Tyr Arg 150 155 160

gaa acc gtg gcc cgc cgc tac ttc acg gtg acg ggg tcc cag ccc gac Glu Thr Val Ala Arg Arg Tyr Phe Thr Val Thr Gly Ser Gln Pro Asp 165 170 175

gag gcc acg ctg gac acg ctg gcg gag acg ggg gag ggg gag cgg ctc Glu Ala Thr Leu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Gly Glu Gly Glu Arg Leu 180 185 190

ctg cag cgc gcc atc gcg gag cag cag ggg aga ggg gag gtg ctg ggc Leu Gln Arg Ala Ile Ala Glu Gln Gln Gly Arg Gly Glu Val Leu Gly 195 200 205 210

gtg gtg gcg gag atc cag gag cgg cac ggc gcc gtg gcg gac ctg gag Val Val Ala Glu Ile Gln Glu Arg His Gly Ala Val Ala Asp Leu Glu 215 220 225

cgg tcc ctg ctg gag ctg cag cag gtg ttc aac gac atg gcc gtg ctg Arg Ser Leu Leu Glu Leu Gln Gln Val Phe Asn Asp Met Ala Val Leu 230 235 240

gtg gcg gcg cag ggg gag cag ctg gac gac atc gag ggc cac gtc ggg Val Ala Ala Gln Gly Glu Gln Leu Asp Asp Ile Glu Gly His Val Gly 245 250 255

cgg gcg agg tcg ttc gtc gac cgc ggg cgc gag cag ctg cag gtg gca Arg Ala Arg Ser Phe Val Asp Arg Gly Arg Glu Gln Leu Gln Val Ala 260 265 270

cgc aag cac cag aag age tcc cgc aag tgg acc ttc atc ggc atc ggc Arg Lys His Gln Lys Ser Ser Arg Lys Trp Thr Phe Ile Gly Ile Gly 275 280 285 290

atc ctg ctc gtc gtc atc ctc atc atc gtc atc ccc atc gtg ctc aag Ile Leu Leu Val Val Ile Leu Ile Ile Val Ile Pro Ile Val Leu Lys 295 300 305

aac acc aac aag age aac aac aac aac age cag cag tagtggtagg Asn Thr Asn Lys Ser Asn Asn Asn Asn Ser Gln Gln 310 315

aacagcctgt ggatctgttg tctgtctctg atgatcctgg tcctggattg cttcctggtt

gttgttgttg attgtctttt gtggaatttt ttgcgattgt aattactcca tccatgtggt

tcgttgagcc actcgattat tatttcatga ctatata

<210> 40

562

610

658

706

754

802

850

898

946

994

1042

1090

1136

1196

1256

1293 <211> 318 <212> PRT

<213> Hordeum vulgare <400> 40

Met Asn Asn Leu Phe Ser Ser Ser Trp Lys Arg Ala Gly Ala Gly Gly 15 10 15

Asp Gly Asp Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Glu Met Thr Ala Pro 20 25 30

Pro Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ser Leu Asp Arg Phe Phe Glu Asp Val 35 40 45

Glu Ser Ile Lys Asp Asp Leu Arg Glu Leu Glu Arg Ile Gln Arg Ser 50 55 60

Leu His Asp Gly Asn Glu Ser Gly Lys Ser Leu His Asp Ala Ser Ala 65 70 75 80

Val Arg Ala Leu Arg Ser Arg Met Asp Ala Asp Val Ala Ala Ala Ile 85 90 95

Lys Lys Ala Lys Val Val Lys Leu Arg Leu Glu Ser Leu Asp Arg Ala 100 105 110

Asn Ala Ala Asn Arg Ser Val Ala Gly Cys Gly Pro Gly Ser Ser Thr 115 120 125

Asp Arg Thr Arg Thr Ser Val Val Ala Gly Leu Arg Lys Lys Leu Arg 130 135 140

Asp Ala Met Glu 145

Tyr Arg Glu Thr

Pro Asp Glu Ala 180

Arg Leu Leu Gln 195

Ser Phe Ser Ser 150

Val Ala Arg Arg 165

Thr Leu Asp Thr

Arg Ala Ile Ala 200

Leu Arg Ser Arg 155

Tyr Phe Thr Val 170

Leu Ala Glu Thr 185

Glu Gln Gln Gly

Ile Thr Ser Glu 160

Thr Gly Ser Gln 175

Gly Glu Gly Glu 190

Arg Gly Glu Val 205

Leu Gly Val Val Ala 210

Leu Glu Arg Ser Leu 225

Val Leu Val Ala Ala 245

Val Gly Arg Ala Arg 260

Val Ala Arg Lys His 275

Ile Gly Ile Leu Leu 290

Glu Ile Gln Glu Arg His 215

Leu Glu Leu Gln Gln Val 230 235

Gln Gly Glu Gln Leu Asp 250

Ser Phe Val Asp Arg Gly 265

Gln Lys Ser Ser Arg Lys 280

Val Val Ile Leu Ile Ile 295

Gly Ala Val Ala Asp 220

Phe Asn Asp Met Ala 240

Asp Ile Glu Gly His 255

Arg Glu Gln Leu Gln 270

Trp Thr Phe Ile Gly 285

Val Ile Pro Ile Val 300

Leu Lys Asn Thr Asn Lys Ser Asn Asn Asn Asn Ser Gln Gln 305

310

315

<210> 41 <211> 948 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS <222> (1)..(945)

<223> codificar a Arabidopsis thaliana syntaxin 121

(SYP121) / proteína relacioanda a sintaxina (SYRl) (At3gll820)

<4 00> 4 atg gcg Met Ala 1

ttc gaa Phe Glu

ctc aac Leu Asn

aat gct Asn Ala 50

gga gtc Gly Val 65

cta gat Leu Asp

ggt tet Gly Ser

aag aaa Lys Lys

atc tcg Ile Ser 130

acc ggc Thr Gly 145

gga gag Gly Glu

aat ccc Asn Pro

gat gtt Asp Val 20

gaa aca Glu Thr 35

aaa gcc Lys Ala

gcg ttg Ala Leu

cgt gcc Arg Ala

tcc tcc Ser Ser 100

ttg atg Leu Met 115

tcc gag Ser Glu

gag aat Glu Asn

agt gag Ser Glu

gcg gga Ala Gly 5

gaa tet Glu Ser

ctc tet Leu Ser

gtt aaa Val Lys

aag aag Lys Lys 70

aat gct Asn Ala 85

gat cga Asp Arg

gac tet Asp Ser

tat aga Tyr Arg

ccg gat Pro Asp 150

aga ttc Arg Phe 165

tca acc Ser Thr

gtg aaa Val Lys

tca tgt Ser Cys 40

gat ctc Asp Leu 55

gcg aag Ala Lys

gct aat Ala Asn

acc agg Thr Arg

atg gat Met Asp 120

gaa act Glu Thr 135

gaa cga Glu Arg

ttg cag Leu Gln

ggt ggt Gly Gly 10

gaa gag Glu Glu 25

cac gag His Glu

cgg tet Arg Ser

atg att Met Ile

cgg agt Arg Ser 90

acc tet Thr Ser 105

agt ttc Ser Phe

gta cag Val Gln

acc cta Thr Leu

aaa gca Lys Ala 170

gtg aac Val Asn

cta aag Leu Lys

cag age Gln Ser

aaa atg Lys Met 60

aaa gtt Lys Val 75

ctc cct Leu Pro

gtc ctc Val Leu

aac cga Asn Arg

agg agg Arg Arg 140

gat cga Asp Arg 155

ata caa Ile Gln

ctc gac Leu Asp

gag cta Glu Leu 30

aag acg Lys Thr 45

gac ggt Asp Gly

aaa ctc Lys Leu

ggc tgt Gly Cys

aat ggt Asn Gly 110

ttg agg Leu Arg 125

tac ttc Tyr Phe

ctg att Leu Ile

gaa caa Glu Gln

aag ttc Lys Phe 15

gat cgg Asp Arg

ctt cac Leu His

gac gtt Asp Val

gag gcg Glu Ala 80

gga cct Gly Pro 95

ctc agg Leu Arg

gag ctt Glu Leu

acc gtc Thr Val

tcc act Ser Thr 160

gga aga Gly Arg 175

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

gga agg gtg tta gac acc att aac gag att caa gaa agg cat gat gcg Gly Arg Val Leu Asp Thr Ile Asn Glu Ile Gln Glu Arg His Asp Ala

576 180

gtt aaa gac att Val Lys Asp Ile 195

gac atg gcc gtg Asp Met Ala Val 210

gag agt cat gtg Glu Ser His Val 225

cag cta caa acc Gln Leu Gln Thr

tgt att gcc att Cys Ile Ala Ile 260

gct gtt tta aaa Ala Val Leu Lys 275

ggt ggt ggg ggt Gly Gly Gly Gly 290

cca aat cct cct Pro Asn Pro Pro 305

<210> 42 <211> 315 <212> PRT <213> Arabidops

<400> 42 Met Ala Asn Pro 1

Phe Glu Asp Val 20

Leu Asn Glu Thr 35

Asn Ala Lys Ala 50

Gly Val Ala Leu 65

Leu Asp Arg Ala

Gly Ser Ser Ser 100

Lys Lys Leu Met

gag aag aat ctc Glu Lys Asn Leu 200

ctg gta gag cac Leu Val Glu His 215

ggt cga gct age Gly Arg Ala Ser 230

gct cgg gtt tac Ala Arg Val Tyr 245

att att ctc atc Ile Ile Leu Ile

ccg tgg aac aac Pro Trp Asn Asn 280

acc act gga gga Thr Thr Gly Gly 295

cag gca agg cgt Gln Ala Arg Arg 310

Ls thaliana

Ala Gly Ser Thr 5

Glu Ser Val Lys

Leu Ser Ser Cys 40

Val Lys Asp Leu 55

Lys Lys Ala Lys 70

Asn Ala Ala Asn 85

Asp Arg Thr Arg

Asp Ser Met Asp

185

agg gag ctt cac Arg Glu Leu His

cag gga gct cag Gln Gly Ala Gln 220

tcc ttt atc aga Ser Phe Ile Arg 235

cag aag aac acg Gln Lys Asn Thr 250

atc atc ata act Ile Ile Ile Thr 265

age agt ggc ggc Ser Ser Gly Gly

agt caa cca aat Ser Gln Pro Asn 300

cta ttg cgt tga Leu Leu Arg 315

Gly Gly Val Asn 10

Glu Glu Leu Lys 25

His Glu Gln Ser

Arg Ser Lys Met 60

Met Ile Lys Val 75

Arg Ser Leu Pro 90

Thr Ser Val Leu 105

Ser Phe Asn Arg

190

cag gtg ttt cta Gln Val Phe Leu 205

ctt gat gac atc Leu Asp Asp Ile

ggc gga act gac Gly Gly Thr Asp 240

cga aaa tgg aca Arg Lys Trp Thr 255

gtt gtg gtt ctt Val Val Val Leu 270

ggc ggc ggt ggt Gly Gly Gly Gly 285

tca ggg aca cca Ser Gly Thr Pro

Leu Asp Lys Phe 15

Glu Leu Asp Arg 30

Lys Thr Leu His 45

Asp Gly Asp Val

Lys Leu Glu Ala 80

Gly Cys Gly Pro 95

Asn Gly Leu Arg 110

Leu Arg Glu Leu

624

672

720

768

816

864

912

948 115

120

125

Ile Ser Ser Glu Tyr Arg Glu Thr Val Gln Arg Arg Tyr 130 135 140

Phe Thr Val

Thr Gly Glu Asn Pro Asp Glu Arg Thr Leu Asp Arg Leu Ile Ser Thr 145 150 155 160

Gly Glu Ser Glu Arg Phe Leu Gln Lys Ala Ile Gln Glu 165 170

Gln Gly Arg 175

Gly Arg Val Leu Asp Thr Ile Asn Glu Ile Gln Glu Arg His Asp Ala 180 185 190

Val Lys Asp Ile Glu Lys Asn Leu Arg Glu Leu His Gln Val Phe Leu 195 200 205

Asp Met Ala Val Leu Val Glu His Gln Gly Ala Gln Leu Asp Asp Ile 210 215 220

Glu Ser His Val Gly Arg Ala Ser Ser Phe Ile Arg Gly Gly Thr Asp 225 230 235 240

Gln Leu Gln Thr Ala Arg Val Tyr Gln Lys Asn Thr Arg 245 250

Lys Trp Thr 255

Cys Ile Ala Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Thr Val 260 265

Val Val Leu 270

Ala Val Leu Lys Pro Trp Asn Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 275 280 285

Gly Gly Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ser Gln Pro Asn Ser Gly Thr Pro 290 295 300

Pro Asn Pro Pro Gln Ala Arg Arg Leu Leu Arg

305

310

315

<210> 43

<211> 1275

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<220>

<221> CDS

<222> (80) . . (1006)

<223> codificar a Hordeum vulgare subsp. vulgare SNAP-34 <4 00> 43

ggcccctcca ccccacccca cccagtcgct gcggatactt gattctgcta ctcggccagc 60

gatcgatctc gcctccgcc atg age gcc acc agg ccc tcc ttc ttc ccc tcc 112

Met Ser Ala Thr Arg Pro Ser Phe Phe Pro Ser 15 10

aac aac aac agg aac aag ccc gcc acc cgg aac ccc ttc gac tcc gac 160 Asn Asn Asn Arg Asn Lys Pro Ala Thr Arg Asn Pro Phe Asp Ser Asp 20 25

tcg gac gac gac ggc ggc atg gcc cgg cgc ggc ccg gcg cgg gcc tcg 208 Ser Asp Asp Asp Gly Gly Met Ala Arg Arg Gly Pro Ala Arg Ala Ser 35 40

tcc gtc ccg acc ccc gcc gcg ggg ccg gcc agg gcc tcc tcg gcc ccg Ser Val Pro Thr Pro Ala Ala Gly Pro Ala Arg Ala Ser Ser Ala Pro 45 50 55

atc ccc gcc gac gag gcg gac cag cgg ggc gcc ctg ttc ggc gcg ggc Ile Pro Ala Asp Glu Ala Asp Gln Arg Gly Ala Leu Phe Gly Ala Gly 60 65 70 75

ccc gcg ccg tcc ggc ttc gcg tcc tcc tcc tcc gcg gcc gcc agg ggc Pro Ala Pro Ser Gly Phe Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Arg Gly 80 85 90

cgg tac agg aac gac ttc cgc gac tcg ggc ggc gtg gag gcg cag tcc Arg Tyr Arg Asn Asp Phe Arg Asp Ser Gly Gly Val Glu Ala Gln Ser 95 100 105

gtg cag gag ctc gag ggc tac gcg gcc tac aag gcc gag gag acc acg Val Gln Glu Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Glu Thr Thr 110 115 120

cgc cgg gtc gac ggc tgc ctc cgg gtc gcc gag gag atg cgg gac acc Arg Arg Val Asp Gly Cys Leu Arg Val Ala Glu Glu Met Arg Asp Thr 125 130 135

gcg tca aag acc ctg ctc cag gtg cac cag cag ggc cag cag atc agg Ala Ser Lys Thr Leu Leu Gln Val His Gln Gln Gly Gln Gln Ile Arg 140 145 150 155

cgc acc cac gcc atg gcc gtc gac atc gac cag gat ctc tcc agg ggg Arg Thr His Ala Met Ala Val Asp Ile Asp Gln Asp Leu Ser Arg Gly 160 165 170

gaa aag cta cta ggt gat ctt ggt ggt ttg ttt tcc aag aag tgg aag Glu Lys Leu Leu Gly Asp Leu Gly Gly Leu Phe Ser Lys Lys Trp Lys 175 180 185

cca aag aag aac ggc gca atc agg ggc cct atg ctg acc aga gac gat Pro Lys Lys Asn Gly Ala Ile Arg Gly Pro Met Leu Thr Arg Asp Asp 190 195 200

tcc ttc ata cgc aag ggc age cat atg gag cag agg cat aaa ctg ggg Ser Phe Ile Arg Lys Gly Ser His Met Glu Gln Arg His Lys Leu Gly 205 210 215

ctg tca gat cgt ccg cat cga tcc aat gca cgc cag ttc cta tet gaa Leu Ser Asp Arg Pro His Arg Ser Asn Ala Arg Gln Phe Leu Ser Glu 220 225 230 235

ccc aca tca ggc ctt gag aaa gtc gag gtg gag aag gca aag cag gat Pro Thr Ser Gly Leu Glu Lys Val Glu Val Glu Lys Ala Lys Gln Asp 240 245 250

gat ggc ctg tet gac ctt age gac ata ctg aca gag ttg aaa gga atg Asp Gly Leu Ser Asp Leu Ser Asp Ile Leu Thr Glu Leu Lys Gly Met 255 260 265

gcc att gac atg gga act gag att gag ggg caa aca aag gat ctt ggt Ala Ile Asp Met Gly Thr Glu Ile Glu Gly Gln Thr Lys Asp Leu Gly 270 275 280

304

352

400

448

496

544

592

640

688

736

784

832

880

928

cat gcg gag aag gac ttt gac gaa ctt aac tac agg gtc aag ggg gca

976 His Ala Glu Lys Asp Phe Asp Glu Leu Asn Tyr Arg Val Lys Gly Ala 285 290 295

aac gct cga aca cgt cgc ctg ctt ggc aga taggcaagaa gcatatgttg 1026 Asn Ala Arg Thr Arg Arg Leu Leu Gly Arg 300 305

ttcaccagag gattctgtga cactccttat cttctgcatt tgctttcgtg ggctgttaat 1086

tcagatcatt ttgtgcataa aactctggtt aggaaggtct gttggggagt tgtatcaggg 1146

tttattgtgt atatacgcta gacgggcggt tcgttttcta tgttgcagtt gtactacatt 1206

tgctatggac agtagatacg tttgtattcg gttttcttgt tttgcaatcg, ctatgctgca 1266

ggaaagcac 1275

<210> 44 <211> 309 <212> PRT

<213> Hordeum vulgare <4 00> 44

Met Ser Ala Thr Arg Pro Ser Phe Phe Pro Ser Asn Asn Asn Arg Asn 15 10 15

Lys Pro Ala Thr Arg Asn Pro Phe Asp Ser Asp Ser Asp Asp Asp Gly 20 25 30

Gly Met Ala Arg Arg Gly Pro Ala Arg Ala Ser Ser Val Pro Thr Pro 35 40 45

Ala Ala Gly Pro Ala Arg Ala Ser Ser Ala Pro Ile Pro Ala Asp Glu 50 55 60

Ala Asp Gln Arg Gly Ala Leu Phe Gly Ala Gly Pro Ala Pro Ser Gly 65 70 75 80

Phe Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Arg Gly Arg Tyr Arg Asn Asp 85 90 95

Phe Arg Asp Ser Gly Gly Val Glu Ala Gln Ser Val Gln Glu Leu Glu 100 105 110

Gly Tyr Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Glu Thr Thr Arg Arg Val Asp Gly 115 120 125

Cys Leu Arg Val Ala Glu Glu Met Arg Asp Thr Ala Ser Lys Thr Leu 130 135 140

Leu Gln Val His Gln Gln Gly Gln Gln Ile Arg Arg Thr His Ala Met 145 150 155 160

Ala Val Asp Ile Asp Gln Asp Leu Ser Arg Gly Glu Lys Leu Leu Gly 165 170 175

Asp Leu Gly Gly Leu Phe Ser Lys Lys Trp Lys Pro Lys Lys Asn Gly 180 185 190

Ala Ile Arg Gly Pro Met Leu Thr Arg Asp Asp Ser Phe Ile Arg Lys 195 200 205 Gly Ser His Met Glu Gln Arg His Lys Leu Gly Leu Ser Asp Arg Pro 210 215 220

His Arg Ser Asn Ala Arg Gln Phe Leu Ser Glu Pro Thr Ser Gly Leu 225 230 235 240

Glu Lys Val Glu Val Glu Lys Ala Lys Gln Asp Asp Gly Leu Ser Asp 245 250 255

Leu Ser Asp Ile Leu Thr Glu Leu Lys Gly Met Ala Ile Asp Met Gly 260 265 270

Thr Glu Ile Glu Gly Gln Thr Lys Asp Leu Gly His Ala Glu Lys Asp 275 280 285

Phe Asp Glu Leu Asn Tyr Arg Val Lys Gly Ala Asn Ala Arg Thr Arg 290 295 300

Arg Leu Leu Gly Arg 305

<210> 45

<211> 1398

<212> DNA

<213> Glicina max

<220>

<221> CDS

<222> (212)..(946)

<220>

<221> misc_feature

<222> <1367>..<1367>

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1368>..<1368>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1369>..<1369>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc^feature

<222> <137 0>..<137 0>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc__f eature

<222> <1371>..<1371>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1372>..<1372>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc feature <222> <1373>. . <1373>

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1374>..<1374>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1375>..<1375>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <137 6>..<137 6>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1377>..<1377>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1378>..<1378>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <137 9>. .<137 9>

<223> n is a, c, g, or t

<22 0>

<221> misc_feature

<222> <1380>..<1380>

<223> n is a, c, g, or t

<22 0>

<221> misc_feature

<222> <1381>..<1381>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1382>..<1382>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1383>..<1383>

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> <1384>..<1384>

<223> n is a, c, g, or t

<400> 45

ggaatttccg tggcgaccca tcggacgctc gtccgacgca tcaacactac ggccgactgg 60

aggcgacttg aatgaaaggg aggtaatctt aagtggaacc gtttgcaaaa ttacccgttc

120 ctcgtacctc gaatgcagtc taaacttggg gtcgctgaag tcacagccat atacgacact

agacatattt gtgtgtctcc gattgcaagc a atg gac tcc ttc aat tcc ttc

Met Asp Ser Phe Asn Ser Phe

ttc gat tca aca aac cga tgg aat tac 1 act ctc aaa 5 ttc cgt gat aac Phe Asp Ser Thr Asn Arg Trp Asn Tyr Asp Thr Leu Lys Asn Phe Arg 10 15 20 caa att tet ccg gtc gtt cag aat cac ctc aag cag gtt tat ttt act Gln Ile Ser Pro Val Val Gln Asn His Leu Lys Gln Val Tyr Phe Thr 25 30 35 ctg tgt ttc gcc gtg gtt gct gcg gct gtt ggg gct tac ctt cat gtc Leu Cys Phe Ala Val Val Ala Ala Ala Val Gly Ala Tyr Leu His Val 40 45 50 55 ctc ttg aac att ggg ggt ttt ctt act aca gtg gca tgc gtg gga age Leu Leu Asn Ile Gly Gly Phe Leu Thr Thr Val Ala Cys Val Gly Ser 60 65 70 agt gtt tgg tta ctc tcg aca cct cct ttt gaa gag agg aaa aga gtg Ser Val Trp Leu Leu Ser Thr Pro Pro Phe Glu Glu Arg Lys Arg Val 75 80 85 act ttg ttg atg gcc gca tca ctg ttt cag ggt gcc tet att gga ccc Thr Leu Leu Met Ala Ala Ser Leu Phe Gln Gly Ala Ser Ile Gly Pro 90 95 100 ttg ata gat ttg gct att caa atc gat cca age ctt atc ttt agt gca Leu Ile Asp Leu Ala Ile Gln Ile Asp Pro Ser Leu Ile Phe Ser Ala 105 110 115 ttt gtg gga aca tcc ttg gcc ttt gca tgc ttc tca gga gca gct ttg Phe Val Gly Thr Ser Leu Ala Phe Ala Cys Phe Ser Gly Ala Ala Leu 120 125 130 135 gtt gct agg cgt agg gag tac ctg tac ctt ggt ggc ttg gtt tet tet Val Ala Arg Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Val Ser Ser 140 145 150 gga ttg tcc atc ctt ctc tgg ttg cac ttt gct tet tcc atc ttt gga Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu His Phe Ala Ser Ser Ile Phe Gly 155 160 165 ggc tca aca gct ctc ttt aag ttt gag ttg tac ttt ggg cta ttg gtg Gly Ser Thr Ala Leu Phe Lys Phe Glu Leu Tyr Phe Gly Leu Leu Val 170 175 180 ttt gta ggt tac att gta gta gac acc caa gaa ata gtt gag agg gca Phe Val Gly Tyr Ile Val Val Asp Thr Gln Glu Ile Val Glu Arg Ala 185 190 195 cac ttg ggc gat ctg gac tat gta aag cat gcc ttg acc ttg ttt acc His Leu Gly Asp Leu Asp Tyr Val Lys His Ala Leu Thr Leu Phe Thr 200 205 210 215 gat ttg gtc gca gtt ttt gtc cgg att ctt gtt att atg ttg aag aat Asp Leu Val Ala Val Phe Val Arg Ile Leu Val Ile Met Leu Lys Asn 220 225 230 tcg act gag agg aat gag aag aaa aag aag aga aga gat tga ttttcttacc Ser Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Lys Lys Arg Arg Asp 235 240

aatctgctcg attaacactt cacctcgctt ggtctgtaat acataaaaac agccgtctat 1016

acagtgtttt ccacttttta agcttgctcc tcctactgtg cagttaagtc gtttgtttac 1076

caatagtaca tgttgacatg ttttgagctc tctaataaga gaaatgttta cattacattt 1136

180

232

280

328

376

424

472

520

568

616

664

712

760

808

856

904

956 gttttaaaga tgaaaagggg agtggggaag aagtcgatgg tgaaggtccc taataaattc 1196

ttactcccaa gactcagaat ttttcttggg gaggaagtgg aattcaggga aacacttttt 1256

tttcacacat tattgagtat attttatact agactcgcca aatcacgaat ttcattatct 1316

atttagcttc ttttttttcc ccctgtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa nnnnnnnnnn 1376

nnnnnnnnaa aaaaaaaaaa aa 1398

<210> 46 <211> 244 <212> PRT <213> Glicina max

<4 00> 46

Met Asp Ser Phe Asn Ser Phe Phe Asp Ser Thr Asn Arg Trp Asn Tyr 1 5 10 15 Asp Thr Leu Lys Asn Phe Arg Gln Ile Ser Pro Val Val Gln Asn His 20 25 30 Leu Lys Gln Val Tyr Phe Thr Leu Cys Phe Ala Val Val Ala Ala Ala 35 40 45 Val Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Leu Asn Ile Gly Gly Phe Leu Thr 50 55 60 Thr Val Ala Cys Val Gly Ser Ser Val Trp Leu Leu Ser Thr Pro Pro 65 70 75 80 Phe Glu Glu Arg Lys Arg Val Thr Leu Leu Met Ala Ala Ser Leu Phe 85 90 95 Gln Gly Ala Ser Ile Gly Pro Leu Ile Asp Leu Ala Ile Gln Ile Asp 100 105 110 Pro Ser Leu Ile Phe Ser Ala Phe Val Gly Thr Ser Leu Ala Phe Ala 115 120 125 Cys Phe Ser Gly Ala Ala Leu Val Ala Arg Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr 130 135 140 Leu Gly Gly Leu Val Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu Leu Trp Leu His 145 150 155 160 Phe Ala Ser Ser Ile Phe Gly Gly Ser Thr Ala Leu Phe Lys Phe Glu 165 170 175 Leu Tyr Phe Gly Leu Leu Val Phe Val Gly Tyr Ile Val Val Asp Thr 180 185 190 Gln Glu Ile Val Glu Arg Ala His Leu Gly Asp Leu Asp Tyr Val Lys 195 200 205 His Ala Leu Thr Leu Phe Thr Asp Leu Val Ala Val Phe Val Arg Ile 210 215 220 Leu Val Ile Met Leu Lys Asn Ser Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Lys 225 Arg Arg Asp 230 235 240 Lys <210> 47 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador GFP 1 <4 00> 47

atggtgagca agggcgagga 20

<210> 48 <211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador GFP 2 <4 00> 48

ttgaacaacg atgtgcaaga ctccttgtac agctcgtcca tgc 43

PF 58494 92

Claims

1. Método para gerar ou aumentar uma resistência a pelo menos um fungo biotrófico em uma planta ou uma parte de uma planta, onde a parte de uma planta compreende um tecido ou uma célula, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) aumentar a quantidade de proteína ou função de pelo menos uma proteína inibidora I Bax (BI1), na planta ou pelo menos uma parte de uma planta acima da quantidade de proteína ou função na planta inicial ou parte desta, e, se apropriado b) selecionar a planta ou uma parte de uma planta onde uma resistência a pelo menos um fungo biotrófico foi gerada ou aumentada em comparação com a planta inicial ou parte desta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um fungo biotrófico é selecionado a partir do grupo dos fungos heminecrotróficos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um fungo biotrófico é selecionado a partir do grupo consistindo do grupo dos Basidiomycota, preferivelmente os Uredinales (ferrugens), especialmente preferivelmente os Melompsoraceae, e em particular do gênero Phakopsora.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um fungo biotrófico é selecionado a partir do grupo consistindo de Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um fungo biotrófico não é um oídio ou míldio.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína BIl compreende pelo menos uma seqüência que tem pelo menos 50% de homologia com pelo menos um motivo consenso de BIl selecionado a partir do grupo consistindo de a) H(L/I)KXVY, b) AXGA(Y/F)XH, c) NIGG, d) P(V/P)(Y/F)E(E/Q)(R/Q)KR, e) (E/Q)G(A/S)S(V/I)GPL, f) DP(S/G)(L/I)(I/L), g) V(G/A)T(A/S)(L/I)AF(A/G)CF(S/T), h) YL(Y/F)LGG, i) L(L/V)SS(G/W)L(S/T)(I/M)L(L/M)W, e j) DTGX(W)(W)E.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína BIl é codificada por um polipeptídeo que compreende pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo de: a) as seqüências como mostrado em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46; b) seqüências com pelo menos 50% de identidade com uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46; e c) seqüências que compreendem pelo menos uma seqüência parcial de pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos de uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46, e/ou que compreendem pelo menos uma seqüência parcial de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, onde a seqüência parcial tem pelo menos 80% de identidade com a seqüência parcial correspondente de uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de aumentar a quantidade de proteína ou função de pelo menos uma proteína BIl é atingida por um método biotecnológico.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de aumentar a quantidade de proteína ou função de pelo menos uma proteína BIl é atingida por expressão recombinante da proteína BIl.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de aumentar a quantidade de proteína ou função de pelo menos uma proteína BIl é atingida aumentando, por meio de biotecnologia, a proteína BIl endógena.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de compreender i. transformação estável de uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos, que codifica para uma proteína BIl, em ligação operável com um promotor específico de tecido, o promotor sendo heterólogo em relação à seqüência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína BIl; ii. regeneração da planta a partir da célula vegetal; e iii. expressão da seqüência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína BIl em uma quantidade, em pelo menos um tecido e por um período suficiente para gerar ou aumentar uma resistência fungica na planta.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada entre plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada entre o grupo das plantas monocotiledôneas, em particular compreendendo trigo, aveia, milheto, cevada, centeio, milho, arroz, sorgo, triticale, espelta ou cana- de-açúcar.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada entre o grupo das plantas dicotiledôneas, em particular compreendendo Arabidopsis, algodão, trigo sarraceno, batata, repolho, agrião, linhaça, colza, tomate, berinjela, pimentão, girassol, tabaco, Tagetes, alface, Calendula, melão, abóbora/moranga, abobrinha, beterraba açucareira, ornamentais, árvores e legumes.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada entre o gênero Phaseolus (compreendendo feijão francês, feijão anão, feijão trepador (Phaseolus vulgaris), feijão de lima (Phaseolus lunatus L.), feijão tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray), feijão da Espanha (Phaseolus coccineus)); o gênero Glycine (compreendendo Glicina soja, soja (Glycine max (L.) Merill)); ervilha (Pisum) (compreendendo ervilhas-forrageiras (Pisum sativum L. convar. sativum), também chamadas ervilhas lisas ou tortas; ervilha medulosa (Pisum sativum L. convar. medullare Alef. emend. C.O. Lehm), ervilha doce (Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C.O. Lehm), também chamada ervilha de cheiro, ervilha de vagem ou ervilha de quebrar, (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium)); amendoim (Arachis hypogaea), trevo (Trifolium spec.), Iuzema (Medicago), videira Kudzu (Pueraria lobata), luzema comum, alfafa (M. sativa L.), grão-de-bico (Cicer), lentilhas (Lens) (Lens culinaris Medik.), tremoços (Lupinus); ervilhacas (Vicia), favarola, fava (Vicia faba), ervilha-do-campo (Lathyrus) (compreendendo chícharo (Lathyrus sativus), chícharo selvagem (Lathyrus tuberosus)); gênero Vigna (compreendendo vigna (Vigna aconitifolia (Jacq.) Maréchal), feijão azuki (Vigna angularis (Willd.) Ohwi & H. Ohashi), feijão rajado (Vigna mungo (L.) Hepper), feijão mungo (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), amendoim bambarra (Vigna subterrane (L.) Verdc.), feijão arroz (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp., nas três subespécies de feijão-aspargo, caupi, feijão de corda)); feijão guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.), o gênero Macrotyloma (compreendendo amendoim de geocarpa (Macrotyloma geocarpum (Harms) Marechal & Baudet), faveira (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc.)); feijão alado (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.), feijão inhame Africano (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), feijão preto egípcio, dólico, labe labe (Lablab purpureus (L.) Sweet), feijão jacatupé (Pachyrhizus), feijão-guar (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.); e o gênero Canavalia (compreendendo feijão de porco (Canavalia ensiformis (L.) DC.), feijão espada (Canavalia gladiata (Jacq.) DC.)).

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada entre os legumes, preferivelmente a tribo Phaseolae, especialmente preferivelmente o gênero Glycine, e em particular soja (Glycine max).

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína BIl em uma planta é aumentada pelo menos na epiderme, preferivelmente essencialmente tecido-especificamente na epiderme, e/ou essencialmente não aumentada no mesófilo.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a planta adicionalmente tem um fenótipo mlo-resistente, ou a expressão ou função de MLO, RacB e/ou NaOx é inibida ou reduzida, em comparação com uma planta de controle, pelo menos na epiderme e/ou a expressão ou função de PEN2, SNAP34 e/ou PENl é aumentada pelo menos na epiderme em comparação com uma planta de controle.

19. Seqüência de polipeptídeo artificial que codifica a proteína BIl caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo de a) as seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 12, 14, 16,18,20, 22, 24, 28, 30, 32, 38 ou 46; b) seqüências com pelo menos 50% de identidade com uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28,30, 32, 38 ou 46; e c) seqüências que compreendem pelo menos uma seqüência parcial de pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos de uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46, e/ou que compreendem pelo menos uma seqüência parcial de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, onde a seqüência parcial tem pelo menos 80% de identidade com a seqüência parcial correspondente de uma das seqüências como mostrado em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38 ou 46.

20. Seqüência de ácido nucléico artificial, caracterizada pelo fato de codificar uma seqüência de polipeptídeos como definida na reivindicação 19.

21. Cassete de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de ácidos nucleicos, que codifica para uma proteína BIl, em ligação operável com um promotor, o promotor sendo heterólogo em relação à dita seqüência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína BIl.

22. Cassete de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a. a proteína BIl é distinguida por uma seqüência de polipeptídeos como definido na reivindicação 19, e/ou b. o promotor é um promotor específico de tecido selecionado a partir do grupo dos promotores específicos de epiderme.

23. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender um cassete de expressão como definido em uma das reivindicações 21 ou 22.

24. Microorganismo recombinante, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um cassete de expressão como definido em uma das reivindicações 19 ou 20 e/ou pelo menos um vetor como definido na reivindicação 23.

25. Microorganismo recombinante de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo consistindo de bactérias, fungos, em particular leveduras.