BRPI0719816B1 - Uso do fator de crescimento epidérmico (egf) humano para preparar uma composição farmacêutica injetável para a restauração morfofuncional de nervos periféricos em neuropatia diabética e a referida composição - Google Patents
Uso do fator de crescimento epidérmico (egf) humano para preparar uma composição farmacêutica injetável para a restauração morfofuncional de nervos periféricos em neuropatia diabética e a referida composição Download PDFInfo
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Description
(54) Título: USO DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO (EGF) HUMANO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA INJETÁVEL PARA A RESTAURAÇÃO MORFOFUNCIONAL DE NERVOS PERIFÉRICOS EM NEUROPATIA DIABÉTICA Ε A REFERIDA COMPOSIÇÃO (51) Int.CI.: A61K 38/00; A61P 25/00 (30) Prioridade Unionista: 03/10/2006 CU 2006-0192 (73) Titular(es): CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGIA (72) Inventor(es): JOSÉ IGNACIO FERNANDEZ MONTEQUÍN; LUIS SATURNINO HERRERA MARTINEZ; JORGE AMADOR BERLANGA ACOSTA; DIANA GARCIA DEL BARCO HERRERA; DANAY CIBRIAN VERA; GERARDO ENRIQUE GUILLEN NIETO; RAIMUNDO UBIETA GÓMEZ; SONIA GONZALEZ BLANCO; VIVIAN MARÍA SÁEZ MARTÍNEZ
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO (EGF) HUMANO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA INJETÁVEL PARA A RESTAURAÇÃO MORFOFUNCIONAL DE NERVOS PERIFÉRICOS EM NEU5 ROPATIA DIABÉTICA E A REFERIDA COMPOSIÇÃO.
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a aplicações médicas ou experimentais de uma composição farmacêutica que compreende o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF), de preferência administrada por infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos, para prevenir ou corrigir quaisquer manifestações clínicas de neuropatia diabética, e as manifestações de neurite isquêmica. A dita formulação pode ser administrada também localmente, em regiões distais das extremidades ou na base de membros amputados que experimentam dor neuropática.
Técnica Anterior
Níveis insuficientes de glicose no sangue e outros fatores relacionados ao diabetes podem alterar as fibras nervosas em qualquer parte do corpo, gerando um grupo de distúrbios com características específicas, dependendo dos nervos afetados. Estes distúrbios em conjunto são denomina20 dos neuropatia diabética, e pelo menos três tipos principais foram descritos: (1) neuropatia sensorial e motora (forma mais típica e frequente), (2) neuropatia autônoma, e (3) mononeuropatia (Sadikot, S.M., Nigam, A., Das, S. et al. (2004), The burden of diabetes and impaired glucose tolerance in India using the WHO 1999 criteria: prevalence of diabetes in India study (PODIS),
Diabetes Res. Clin. Pract., 66:301-7).
Embora os mecanismos precisos subjacentes a estes distúrbios não estejam completamente entendidos, sabe-se que a fibra nervosa é modificada estruturalmente pelo acúmulo de substâncias derivadas do metabolismo exacerbado da glicose, o que leva à perda da bainha de mielina nas fibras nervosas. A perda desta bainha protetória infere um retardamento na capacidade de transmitir o impulso nervoso, seja na recepção ou transmissão de ordens motoras ou qualquer outro tipo de sinais. Além deste mecaSegue-se folha 1a
Petição 870170097252, de 13/12/2017, pág. 8/15
1a nismo direto, os vasos sanguíneos que irrigam os nervos podem sofrer obs-
Petição 870170097252, de 13/12/2017, pág. 9/15 diabetes (Ashok, S., Ramu, M., Deepa, R. et a/., Prevalence of neuropathy in type 2 diabetes patients attending diabetes center in South India, J. Assoc. Physiclans India, 50, 546-50 (2002)).
Como é comum em diabetes, as fases iniciais de neuropatia dia5 bética são geralmente assintomáticas, mesmo durante anos, e até agora não há maneira para prever seu curso clínico insidioso. Quando o médico suspeitar de uma neuropatia sensorial e motora, ele pode confirmar o diagnóstico conduzindo um teste para avaliar a velocidade da condução nervosa. Este teste consiste em determinar a velocidade de transmissão de pequenas cor10 rentes elétricas através dos nervos selecionados.
Na forma mais frequente de neuropatia diabética, a neuropatia sensorial e motora, os sintomas iniciais incluem perda de sensibilidade, percepção incorreta de sensações tácteis e, em certos casos, dor intensa depois esfoladuras mínimas da pele. Normalmente, isto ocorre primeiramente nos pés e mãos e primordialmente durante a noite. Quando os nervos afetados são encarregados da motilidade digestiva, pode ocorrer um processo digestivo longo ou alterações do ritmo intestinal (diarréia e/ou constipação). Algumas vezes, a neuropatia diabética afeta o controle do sistema cardiovascular, produzindo síncope ou hipotensão caso os pacientes levantem re20 pentinamente (Levitt, N.S., Stansberry, K.B., Wychanck, S. et al., Natural progression of autonomic neuropathy and autonomic function tests in a cohort of IDDM, Diabetes Care, 19, 751-54 (1996)).
A mononeuropatia diabética pode afetar virtualmente qualquer nervo isolado, originando paralisia em um lado da face, alteração dos movi25 mentos oculares, paralisia é/ou dor em um local autônomo concreto.
A neuropatia periférica pode afetar os nervos cranianos ou aqueles do cordão espinhal e suas ramificações e é um tipo de neuropatia (lesão nervosa) que tende a se desenvolver em estágios. No início há dor e emaranhamento intermitente nas extremidades, particularmente nos pós; embora em estágios mais avançados a dor seja mais intensa e constante. Finalmente, uma neuropatia indolor é desenvolvida quando a deterioração nervosa é maciça (Oh, S.J.) Clinicai electromyography: nerve conduction studies. In:
. . . . · , ..3 ., ν /
Nerve conduction in polynéuropathies, Baltimore: Williams e Wilkins, p:579-91).
Uma das consequências mais graves da neuropatia diabética é a dor associada, que algumas vezes é de alta intensidade e não responde a procedimentos terapêuticos usuais. Os tratamentos farmacológicos e clínicos foram usados sem muito sucesso. Os primeiros foram indicados mormente em combinação com analgésicos, anti-inflamatórios esteróides, anticonvulsivantes, tais como carbamazepina e fentolamina, antidepressivos tricíclicos, e anestésicos locais, que conseguem penetrar mesmo para atingir as fibras bloqueadas. Os anticonvulsivantes foram usados recentemente para tratar a dor associa10 da à neuropatia diabética. Dentre eles, o mais recentemente introduzido para tratar dor é a gabapentina. Em termos neuroquímicos, a gabapentina aumenta a biodisponibilidade do ácido gama-amino-butírico (GABA), inibe o veículo de GAT-1, o que, por sua vez, reduz a recaptura de GABA; diminui a síntese e liberação de aminas biogênicas tais como noradrenalina, dopamina e 5-OH-triptamina; e induz a liberação de peptídeos opiáceos do tipo encefalina envolvidos na modulação da dor. (Didangelos, T.P., KaramitsoS, D.T., Athyros, V.G. et al. (1998) Effect of Aldose reductase inhibition on cardiovascular reflex tests in patients with definite diabetic autonomic neuropathy, J Diabetes Complications, 12,201-7 (1998)).
Em pacientes com neuropatia dolorosa e falta de resposta ao tratamento, a estimulação eletrônica transcutânea foi usada de uma maneira tal que, aplicando voltagens de baixa intensidade programadas, a transmissão da dor através dos nervos afetados foi impedida.
A neuropatia diabética dolorosa foi dividida nas formas crônica e aguda. A forma aguda é observada tipicamente durante os três primeiros anos depois do diagnóstico; ela começa e termina espontaneamente. A forma crônica está presente em pessoas que sofrem da doença há 8 ou 9 anos em média. Ela começa lentamente e persiste por anos com múltiplas recidivas. As neuropatias cranianas podem afetar a visão e causam dor no olho.
Os sintomas da doença são, em geral, hipnestesia, formigamento, perda de sensibilidade em algumas partes do corpo, diarréia ou constipação, perda do controle da bexiga, impotência, ptose da face, pálpebras e/ou
boca. Ela pode causar também mudanças da visão, vertigem, dificuldades de deglutição, alterações da linguagem e contrações musculares. Estes sintomas variam dependendo do nervo ou nervos afetados e, em geral, se desenvolvem gradualmente.
A perda de sensibilidade associada à neuropatia diabética aumenta o risco de lesões. Pequenas infecções podem progredir até se tornarem úlceras e requerem amputação. Além disso, o sano em nervos motores pode levar à decomposição e desequilíbrio muscular. Em outras palavras, a neuropatia é talvez a causa principal de amputação de pernas e pés nesta doença. :
Os objetivos do tratamento de neuropatia diabética são a prevenção da progressão e redução de sintomas da doença. O controle rigoroso da glicose é importante para evitar essa progressão. Nenhum tratamento específico capaz de prevenir, retardar ou reverter a alteração em fibras ner15 vosas em neuropatia diabética está disponível atualmente. Nenhum fármaco capaz de reparara a lesão nervosa foi aprovado, mas vários deles estão presentemente em estudo. As vitaminas com complexo são possivelmente os fármacos mais usados para todas formas de neuropatia. Embora estes fármacos aliviem alguns sintomas, eles não são mais do que um paliativo. Ou20 tra alternativa terapêutica usada recentemente é a aplicação de ácido lipóico por via intravenosa, baseado nas suas propriedades antioxidantes (Ziegler, D., Hanefeld, M., Ruhnau, K.J. et al. (1999), Treatment of symptomatic diabetic polyneuropathy with the antioxidant alpha-Iipoic acid: a 7 month multicenter randomized controlled trial (estudo ALADIN III), grupo de estudo
ALADIN III, Alpha-Iipoic acid in diabetic neuropathy, Diabetes Care, 22:1296-301 (1999)). Outros ensaios foram conduzidos para introduzir tratamento oral com Acetil-L-carnitina, um composto que apresenta influência distinta sobre fibras sensíveis pequenas.
O único procedimento terapêutico com uma base patogênica para neuropatia diabética periférica envolve o uso de inibidores de aldose reductase. Sua atividade baseia-se no papel da aldose reductase nos distúrbios metabólicos estruturais e funcionais, induzidos por hiperglicemia nos nervos do organismo diabético. Até agora, Sorbinil, que é eficaz para melhorar a velocidade da condução motora em pessoas diabéticas com neuropatia, foi avaliado em ensaios clínicos, mas ele foi retirado do mercado devido a efeitos tóxicos. Statil apresentou resultados encorajadores em animais, mas estes resultados não puderam ser corroborados em seres humanos. Em geral, os inibidores de aldose reductase são muito tóxicos.
Um otimismo considerável provocou a introdução do Fator do Crescimento Nervoso (NGF) e outros fatores de crescimento em clínica. Em um ensaio com 250 pacientes com neuropatia de fibras pequenas (fibras C), a eliminação de dor e aumento da capacidade de detectar estímulos quentes foram documentados. Entretanto, em dois ensaios subsequentes com um número mais alto de pacientes, o tratamento com NGF não apresentou qualquer benefício (Vinik, A.l. (1999), Treatmènt of diabetic polyneuropathy (DPN) with recombinant human nerve growth factor (rh NGF), Diabetes, 48,
A54-5). ,
A terapia gênica com o Fator do Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) foi avaliada extensivamente em animais, apresentando melhora na condução de impulsos nervosos ê na densidade de vasos sanguíneos que drenam o nervo. Entretanto, esta e outras abordagens com agentes neurotróficos adicionais foram incapazes de deter a progressão para neuropatia diabética em ensaios clínicos, apesar dos resultados positivos anteriores em animais (Schratzberger, P., Walter, D.H., Rittig, K. etal. (2001), Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer, J Clin. Invest., 107:1083-92). Para reduzir ós sintomas, o tratamento tópico com capsaicina ou fármacos orais tais como amitriptilina, gabapentina e carbamazepina são recomendados. ,
Os mecanismos patogênicos da neuropatia diabética não estão bem-entendidos. Os tratamentos atuais eliminam a dor e podem controlar parte dos sintomas associados, mas o processo é geralmente progressivo. A pior parte é que um fármaco específico para esta doença não parece vir a estar disponível no futuro próximo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção contribui para solucionar o problema supramencionado usando EGF em uma composição farmacêutica que è administrada através de infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos, para a restauração morfofuncional dè nervos periféricos em neuropatia sensorial e motora dolorosa, bem como em neurite isquêmica.
As alterações de nervos periféricos associadas ao diabetes são complexas e provavelmente envolvem uma série de causas. Os dois principais mecanismos patogênicos são 1) a teoria da acumulação de sorbitol que leva a uma série de anomalias bioquímicas, as quais, a longo prazo, causam alterações estruturais nos nervos periféricos; 2) Dano estrutural e funcional de microvasos endoneurais, originando mudanças em fibras nervosas, disparadas por hipóxia ou isquemia. Outros mecanismos de geração de neuropatia diabética são a modulação da produção de enzimas, a ativação do sis15 tema do complemento, a acumulação de proteínas com alta afinidade por metais pesados tais como ferro e cobre, e a diminuição de fatores neurotróficos. Outro elemento que tem sido enfaticamente alegado é a acumulação de produtos de peroxidação e nitrosilação. Uma redução na tensão de oxigênio endoneural foi observada nos nervos de pacientes diabéticos que sofrem de neuropatia. Todos estes episódios levam a um alto nível de apoptose e morte celular em estruturas neurais. Esta é a razão pela qual a neuropatia diabética é distinguida pela perda de unidades funcionais no nível de fibras nervosas mielinizadas e uma redução sigriificativa na velocidade da condução nervosa (NCV). A polineuropatia periférica de distingue pela presença de dor, que está relacionada a uma disfunção de fibras alfa e C.
Em geral, a composição da presente invenção é aplicada por infiltração local, colocando-a perto de troncos e/ou gânglios nervosos, zonas distais de dor das pernas antes ou depois da amputação, e em casos nos quais os especialistas avaliem, perto da lesão nas fibras C. O tratamento com a presente composição por várias semanas demonstrou ser capaz de eliminar a dor neuropática; moderar distúrbios não-autônomos; e restaurar a sensibilidade periférica à pressão e temperatura.
' . .'Ί ' ' ; : Λ7 ? .
Depois de três injeções sistêmicas, ou infiltrações locais na periferia dos troncos nervosos, da composição farmacêutica em animais diabéticos, detectou-se:
1. Melhora na integridade da bainha de mielina do nervo ciático.
2. Reduções em edema dos axônios.
3. Preservação de neurofilamentos axônicos
4. Integridade dos vasa nervorum.
5. Diminuição dé colagenização endoneural.
6. Normalização da velocidade de condução de fibras motoras.
A composição é liberada lentamente perto da estrutura de interesse em um volume de 1 a 5 mililitros. A frequência de infiltração em troncos e gânglios nervosos pode oscilar entre uma e três vezes por semana. O tratamento com a composição descrita nesta invenção pode ou não ser associado com inibidores de aldose reductase, aminoguanidina, hipoglicêmicos orais ou parenterais, insulina, estimulantes de sensibilidade periférica à insulina, peptídeos semelhantes a glucagon, terapia com vitaminas, agonistas ou amplificadores do sistema GABA, precursores de endorfina, antioxidantes, ácidos graxos ou seus precursores, terapias individuais ou combinadas com analgésicos, antidepressivos tricíclicos e fármacos anti-inflamatórios. O nú20 mero de aplicações administradas a um paciente varia de acordo com a gravidade dos sintomas clínicos do paciente. Vários ciclos de tratamento são necessários, caso os sintomas reapareçam.
Uma modalidade específica da presente invenção é o uso de EGF para preparar formulações administradas por infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos para a restauração morfofuncional de nervos periféricos em neuropatia sensorial e motora, quando as manifestações mais importantes desta neuropatia afetam as pernas. Em uma modalidade preferida, o EGF usado para preparar a composição farmacêutica administrada por infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos para a restau30 ração morfofuncional de nervos periféricos é o EGF humano recombinante.
Em outra modalidade específica da invenção, a infiltração da composição farmacêutica que contém EGF é feita no nervo ciático.
Um objeto da presente invenção é uma composição farmacêutica injetável que contém uma combinação de EGF e pelo menos um anestésico ou analgésico local, administrada por infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos, para a restauração morfofuncional de nervos perifé5 ricos em neuropatia diabética. Em uma modalidade específica, o dito anèstésico é lidocaína, que contribui para aliviar a dor causada pela infiltração de EGF. Além disso, o anestésico acompanhante presente na composição pode ser bupivacaína ou novocaína, entre outros.
Faz também parte da presente invenção uma composição na 10 qual EGF é administrado por infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos, com o auxílio de sistemas de liberação controlada. Em uma modalidade preferida, o dito sistema de liberação controlada são microsferas feitas de ácido lático e ácido glicólico, ou copolímeros do poli(ácido lático), que portam o EGF. '
As microsferas podem oferecer várias vantagens, a mais comum sendo uma redução na frequência de administração. A presente invenção fornece uma solução técnica para a falta de um fármaco disponível específico para o tratamento de neuropatia diabética. Entretanto, o tratamento com composições que contêm EGF, onde esta molécula não está ligada á mi20 crosferas, requer a aplicação das doses correspondentes do fármaco pelo menos duas vezes por semana. Levando em consideração este inconveniente, o uso de uma formulação para a liberação lenta e prolongada de EGF reduz a frequência de administração do produto, o que é benéfico para o paciente. A formulação baseada em microsferas tem as seguintes vanta25 gens:
❖ Diminuição na frequência de administração, o que leva a uma melhor adesão ao tratamento pelo paciente.
❖ Aumento no benefício terapêutico devido à eliminação de oscilações nos níveis séricos de proteína, ❖ Diminuição potencial dá dose total requerida para o tratamento devido a um melhor desempenho da dose administrada.
❖ Diminuição potencial de efeitos adversos devido a uma redu.. ' - ·? . . ' ; . ' .9 . . . . , / ção na quantidade de proteína liberada no corpo no momento da aplicação. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Microfotografia de uma microsfera carregada com EGF. A barra embaixo da microfotografia representa um comprimento de 10 pm.
Figura 2. Perfil da liberação de EGF encapsulado em microsferas de PAL. O eixo X apresenta o tempo em dias e o eixo Y, a quantidade de EGF liberada, expressa em porcentagem da quantidade total de EGF dentro das microsferas usadas no ensaio.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO / Exemplos 10 Exemplo 1. Efeito Preventivo da Composição Farmacêutica na
Instalação de Neuropatia Diabética
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito neuroprotetor da composição farmacêutica que contém EGF em um modelo animal de diabetes melito. Primeiramente, foi necessário estabelecer a metodologia da indu15 ção de diabetes melito em ratos Wistar administrando estreptozotocina.
Ratos Wistar machos, com 200-250 gramas de peso corporal, receberam uma injeção subcutânea de estreptozotocina, a 75 mg/kg em tampão de citrato de sódio. Depois, a água foi substituída por uma solução de sacarose a 10% durante as próximas 24 h, para prevenir mortes causa20 das por hipoglicemia. Os níveis sanguíneos de glicose foram monitorados a cada manhã durante as próximas 72 horas depois da injeção. Apenas os animais com valores sustentados de glicose acima de 15 mmol/L foram usados. Os ratos foram alojados a 4 por gaiola e alimentados de maneira convencional. Um grupo concomitante de outros 80 ratos recebeu tampão de citrato sem estreptozotocina e foi manuseado de uma maneira similar ao grupo diabético. O valor médio de glicemia durante as 72 horas beste grupo foi de 5,87 mmols/L.
Para estudar o efeito da composição farmacêutica que contém EGF sobre a prevenção de neuropatia diabética, o seguinte desenho expe30 rimental foi usado com 10 ratos em cada um dos grupos:
· Grupo de Controle - umgrupo de ratos diabéticos que receberam solução salina três vezes por semana em 1 mL por via intraperitoneal.
· Grupo de Tratamento 1 - um grupo de ratos diabéticos que receberam a composição farmacêutica que contém EGF uma vez por semana em 1 mL por via intraperitoneal.
· Grupo de Tratamento 4 - um grupo de ratos diabéticos que 5 receberam a composição farmacêutica que contém EGF três vezes por semana em 1 mL por via intraperitoneal.
Todos tratamentos foram conduzidos durante 8 semanas, começando uma semana depois da injeção de estreptozotooina. A composição usada continha 75 pg de EGF humano recombinante/mL. Vários tipos de observações foram conduzidos nos animais em estudo:
d) Determinação do Limite Nociceptivo (NCT), Teste de dor.
O teste de dor, pela aplicação de uma pressão crescente na cauda, foi conduzido 28 e 56 dias depois do início do tratamento, usando 10 animais de cada um dos grupos experimentais. NCT, expresso em gramas, foi determinado usando um analgesímetro do tipo Ugo Basile para aplicar uma pressão gradualmente crescente à cauda dos animais até que eles desenvolvessem um reflexo de retraimento. Na neuropatia diabética humana o limite nociceptivo é reduzido. A tabela i indica os resultados de NCT medido no 28a dia. .
Tabela 1. Resultados do Teste de NCT (28 dias).
| Grupo Experimental | NCT* (gramas) |
| Controle com solução salina | , 120 ±11 |
| Grupo de Tratamento 1 | 125 ± 18 |
| Grupo de Tratamento 3 | Ί 123±16 |
| Ratos Não-diabéticos | 128±9 |
*Dados expressos como média e desvío-padrão.
Nenhuma mudança no padrão nociceptivo dos animais foi detectada depois de 28 dias da evolução da doença. Isto sugere que a forma clínica de hiperestesia ainda não se instalou. Por esta razão, um efeito do tra25 tamento não pode ser ainda avaliado neste ponto do tempo. Os resultados do exame no 56a dia estão indicados na tabela 2.
Como os resultados demonstraram, dois meses depois da indu/ . . . . ; Ίι ' ' ção de diabetes é possível avaliar o efeito de neuropatia diabética periférica nos animais. Uma redução no limite de sensibilidade à dor foi detectada neste ponto experimental. Há também uma diferença notável entre o grupo de ratos diabéticos que receberam solução salina durante dois meses e o grupo que recebeu tratamento com a composição que contém EGF três vezes por semana.
Tabela 2. Resultados do Teste de NCT (56 dias).
| Grupo Experimental | NCT (gramas) |
| Controle com solução salinà | 80 ±19** |
| Grupo de Tratamento 1 | 91 ± 14* |
| Grupo de Tratamento 3 | 121 ±22 |
| Ratos Não-diabéticos | 123 ±6 25 |
Diferenças significativas entre o grupo diabético tratado com solução salina e o grupo que recebeu o tratamento 3, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram observadas (**p<0,01 ANOVA com correção de Bonferroni). Houve também diferenças significativas entre o grupo de tratamento 1 e os grupos de tratamento 3 e animais sadios. A descoberta que os animais tratados em geral apresentaram mais tolerância à dor sugere que o tratamento a composição que contém EGF realmente impediu a deteriora15 ção de fibras sensíveis.
(2) Determinação da Velocidade de Condução do Impulso por Fibras Sensíveis
Para avaliar o efeito protètor da composição farmacêutica que contém EGF sobre fibras sensíveis e motoras, a velocidade de condução de um impulso elétrico foi medida 60 dias depois do início do tratamento. Quin20 ze animais form usados em cada grupo experimental. A velocidade de condução em neuropatia diabética está geralmente diminuída.
O estímulo supramáximo distai na rota ciático-tibial, usando eletrodos bipolares, foi usado para estudar a condução motora. A determinação da velocidade de condução nas rotas sensíveis foi conduzida aplicando um estímulo em um ponto proximal na cauda e medindo-a 3 cm distantes. Os resultados deste estudo no 60s dia estão indicados na tabela 3.
- ' . < /
Tablela 3. Velocidade de Condução Motora (MCV) no Dia 60.
| Grupo Experimental | MCV (m/s) |
| Controle com solução salina | 34 ±18** |
| Grupo de Tratamento 1 ' | 45 ±13* |
| Grupo de Tratamento 3 | 56 ±11 |
| Ratos Não-diabéticos | 60 ±8 |
Diferenças significativas entre o grupo diabético tratado com solução salina e o grupo que recebeu o tratamento 3, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram observadas (**p<0,01 ANOVA com correção de Bonferroni). Houve também diferenças significativas entre o grupo de tratamento 1 e os grupos de tratamento 3 e animais sadios (*p<0,05); e entre o grupo de tratamento 1 e os animais diabéticos do controle que receberam solução salina.
Nota-se o efeito positivo da composição, particularmente no gru10 po que recebeu três aplicações por semana. Os valores da condução em fibras motoras são muito similares àqueles em animais sadios. Embora ainda com diferença estatística com o grupo de animais não-diabéticos, os ratos no grupo que recebeu o tratamento 1 também melhoraram a velocidade de condução. Os resultados do estudo da velocidade de condução sensível (SCV) no Dia 60 estão indicados na tabela 4.
Tabela 4. Velocidade de Condução Sensível (SCV) no Dia 60
| Grupo Experimental | SCV m/s |
| Controle com solução salina | ‘ 31 ± 7 ** |
| Grupo de Tratamento 1 | , 38 ±6* |
| Grupo de Tratamento 3 | 44 ± 9 |
| Ratos Não-diabéticos | f 56 ±3 |
Diferenças significativas entre o grupo diabético tratado com solução salina e o grupo que recebeu o tratamento 3, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram observadas (**p<0,01 ANOVA com correção de Bonferroni). Houve também diferenças significativas entre o grupo do tratamento 1 e os grupos de tratamento 3 e animais sadios (*p<0,05). Nenhu13 ma diferença significativa foi detectada entre o grupo de tratamento 1 e os animais diabéticos do controle que receberam solução salina. Este estudo demonstra o efeito da composição farmacêutica que contém EGF para preservar a integridade funcional de animais quando receberam administração três vezes por semana.
(3) Influência da Composição sobre a Integridade da Perfusão Sanguínea de
Um Nervo Periférico
O nervo ciático direito de ratos foi usado como modelo. Dez animais foram incluídos em cada um dos grupos experimentais. Um número similar de ratos não-diabéticos foi usado para calcular os valores referenciais. Um sistema de Reprodução de Imagens de Perfusão Doppler a Laser (LDPI) foi usado. Os dados da perfusão em tecidos periféricos ao nervo foram programados como valores zero. Os animais de controle receberam solução salina durante dois meses antes da medição. Todas determinações foram feitas sob as mesmas condições de anestesia e ambientais. Elas estão refletidas na tabela 5.
Tabela 5. Resultados do Estudo Conduzido com o Sistema de Reprodução de Imagens de Perfusão Doppler a Laser
| Grupo Experimental | Unidades de LDPI |
| Controle com solução salina | 525,5± 88,8** |
| Grupo de Tratamento 1 | 653,4 ±41,9** |
| Grupo de Tratamento 3 | 988,7 ± 80,3 |
| Ratos Não-diabéticos | 1.301,7 ± 112,2 |
Diferenças significativas entre o grupo diabético tratado com so20 lução salina e o grupo que recebeu a composição terapêutica uma vez por semana, ambos tratamentos durante dois meses; e também com aqueles que receberam a composição terapêutica três vezes por semana (**p<0,01 ANOVA com correção de Bonferroni), foram observadas. Nenhuma diferença estatística foi foi detectada entre este último grupo e os valores de ratos não-diabéticos sadios.
♦ . ' . ' . *' (4) Determinações e Caracterização Post-mortem
Estudo Histomorfométrico :
Depois que o tratamento foi concluído, os animais foram sacrificados no 70° dia depois da indução de diabetes, 10 dias depois que a última dose foi dada, e a análise descrita acima foi completada. Os animais foram sacrificados com uma overdose de anestesia e perfundidos com tampão de solução salina, pH 7,4. Um total de dez animais por grupo experimental foi incluído para estudos histomorfométricos, e um número equivalente de ratos foi usado para determinações bioquímicas. Em ambos sistemas os nervos ciáticos de ambos membros foram dissecados; os fragmentos foram mantidos a -70°C até serem processados. As amostras retiradas para estudos histológicos e/ou histomorfométricos foram coradas com hematoxilina/eosina e azul de toluidina. Pelo menos cinco fragmentos do mesmo nervo foram estudados quantitativamente usando o programa MADIP. Os fragmentos foram incluídos em blocos de celoidina e gelatina, e estes blocos foram fatiados horizontal e transversalmente, ps seguintes indicadores histológicos foram avaliados:
> Número total de vasos sanguíneos (em epineural/perineural) em 10 campos microscópicos usando 10X com ampliação constante em cor20 tes longitudinais do nervo.
> Porcentagem de fibras desmielinizadas. Avaliado tirando a média dos valores por campo microscópico (x20, pelo menos cinco campos).
> Porcentagem de fibras mielínicas e náo-mielínicas com lesões (dilatadas ou distorcidas) por campo microscópico (x20, peio menos cinco campos).
> Porcentagem de colagenização endoneural (moderada: 25 a 50%; grave: mais do que 50% da área endoneural em fatias transversais, e pelo menos três seções diferentes.
Os resultados deste estudo estão indicados na tabela 6.
Tabela 6. Estudo Morfométrico Conduzido em Fragmentos do Nervo Ciático
| Grupo Experi- | Número de va- | % de fibras | % de fibras | % de área |
| mental | sos sanguíneos | desmielinizadas | com lesões | colagenizada |
| Controle com solução salina | 87,65 ±17,8 | 64,77 ±19,72 | 81,5 ±9,73 | 58,93 ± 28 |
| Grupo de Tratamento 1 | 111,33±14,5 | - ' i. 51,2 ± 17,94 | 60,12 ± 11 | 42,69 ±14,71 |
| Grupo de Tratamento 3 | 158,6 ±26,12 | 35,56 ±12,18 | 41,38 ± 10,26 | 13,45 ±11,82 |
| Ratos Não- diabéticos | 194,42 ±43,81 | 0 I . | 0 | 0 |
Diferenças estatisticamente signifícantes no número de vasos sanguíneos entre o grupo de animais diabéticos tratados com solução salina e os ratos de controle sadios foram documentadas (p=0,0023). Além disso, diferenças estatísticas foram encontradas também quando o grupo de solução salina è o grupo que recebeu o tratamento 1 foram comparadas (p=0,031). Houve também diferenças estatísticas (p=0,014) quando o grupo de solução salina foi comparado com o grupo que recebeu o tratamento 3. Os resultados foram analisados por ANOVA com correção de Bonferroni. As porcentagens foram comparadas com o Teste Exato de Fisher.
Diferenças estatisticamente signifícantes entre os grupos de tratamento para os três parâmetros foram encontradas: porcentagem de fibras desmielinizadas, Porcentagem de fibras com lesões, e porcentagem de áreas colagenizadas. A diferença estatística entre o grupo de camundongos diabéticos tratados com insulina e os animais que receberam o tratamento 3 foram detectadas (p<0,05).
Conclusões Parciais —O tratamento com a composição que contém EGF, três vezes por semana, durante dois meses, foi capaz de inibir o processo de desmielinização, para reduzir significativamente a deterioração morfológica de fibras do nervo ciático e, consequentemente, impedir a colagenização endoneural. De uma maneira similar, o tratamento prolongado com esta composição evita significativamente a atrofia e degeneração de vasos sanguíneos que nutrem o nervo. Todas estas descobertas estão em conformidade com os testes funcionais conduzidos quanto à condução de estímulos sensoriais e motores, e o estudo de perfusão com o sistema Laser Doppler. ...
(5) Caracterização Bioquímica de Fragmentos de Nervos
Dez animais por grupo experimental foram usados para conduzir deterinações bioquímicas nos fragmentos do nervo ciático coletado. Os parâmetros bioquímicos estudados foram os seguintes:
Perfil de Oxirredução:
> Atividade da enzima Superóxido Dismutase total (tSOD).
> Atividade da enzima catalase.
> Acumulação intra-axônica de hidroperóxidos totais (HPT).
> Acumulação intra-axônica de malonildialdeído (MDA).
Os resultados deste estudo estão indicados na tabela 7.
Tabela 7. Caracterização do Estado de Oxirredução em Fragmentos do Nervo Ciático L
| Grupos Experimentais | tSODab | Catalase | HPTC | MDA |
| Ratos Não-diabéticos | 2.267,05 | 26,40 | 18,66 | 0,06 |
| ±202,9 | ±5,95 | ±1,43 | ±0,01 | |
| Grupo de solução salina | . i 433,55 | 440,26 | 208,62 | 0,32 |
| ±95,21** | ±52,19** | ±11,3** | ±0,02** | |
| Grupo de Tratamento 1 | 958,17 ±244,61* | 274,60 ±52,3* | 143,05 ±1,98* | 0,24 ±0,04* |
| Grupo de Tretamento 3 | 2.102,83 ±112,67 | 37,62 ±8,13 | 25,15 ±1,81 | 0,08 ±0,02 |
aValores expressos como média e desvio-padrão. bEnzimas expressas como unidades por miligrama, de proteína por minuto. CHPT e MDA em nmol/mg de proteína.
Difernças significativas entre os animais diabéticos tratados com placebo e aqueles tratados três vezes por semana com a composição que contém EGF foram observadas (** p-0,0001). Houve também diferenças entre os grupos tratados com a formulação que contém EGF uma vez por semana e três vezes por semana, eítambém quando comparados com animais não-diabéticos (*p=0,003). Nenhuma diferença entre os animais sadios e aqueles tratados três vezes por. semana foi encontrada de acordo como teste T de Student com duas caudas. .
, Devido ao fato de que a àcumulação de glicose contribui através de vários mecanismos bioquímicos para aumentar o nível de peroxidação de lipídeos, e por sua vez, para a acumulação dentro de tecidos de produtos finais da glicosilação avançada (AGE), é indispensável avaliar marcadores relacionados com este processo. Como demonstrado pelos resultados indi10 cados na tabela 7, o tratamento com a composição farmacêutica testada reduz significativamente a acumulação de metabólitos indicativos de processos de peroxidação, e depende da frequência de aplicação. Paralelamente, o tratamento é capaz de impedir a diminuição de Superoxido Dismutase.
(6) Atividade Enzimática da Lipoproteína Lipase (LPL) em Fragmentos do
Nervo Ciático < <
. ··,., Fragmentos do nervo de cada animal foram incubados junto com pg/mL de heparina em tampão Krebs-Ringer a 37°C por 50 minutos. Alíquotas destas amostras foram então incubadas na presença de [14C] trioleína-fosfatidilcolina. Ácidos graxos marcados com 14C foram quantificados pe20 los métodos clássicos. A atividade de LPL foi expressa em nanomoles de ácidos graxos liberados (RFA) por minuto e grama de tecido. Os resultados estão indicados na tabela 8.
Tabela 8. Atividade de LPL no Nervo Ôiático
| Grupos Experimentais | LPL (nmoles de RFA/min/g) |
| Ratos Não-diabéticos | 6,18 ±1,05 |
| Controle com solução salina ‘ | 2,24 ±0,97** |
| Grupo de Tratamento 1 | 3,75 ±2,2* * |
| Grupo de Tratamento 3 | 5,41 ±1,83 |
Diferenças significativas entre os ratos diabéticos tratados com 25 solução salina e o gupo que recebeu o tratamento 3, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram encontradas (**p<0,01, ANOVA e teste de Tukey). Houve diferenças também (*p<0,05) entre o grupo do tratamento 1 e os animais do controle. Nenhuma diferença estatisticamente significante foi encontrada entre os animais do tratamento 3 e não-diabéticos.
A presente análise demonstra que o tratamento com a composição que contém EGF garante a preservação da atividade enzimática de LPL, o que, por sua vez, melhora a capacidade de o nervo sintetizar mielina, devido à contribuição relevante de fosfolipídeos para esta função.
Exemplo 2. Efeito da Composição Farmacêutica sobre a Reversão de Neuropatia Diabética Estabelecida
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito neurorrestaurador da composição farmacêutica. Ratos Wistar machos com entre 200-250 gramas de peso corporal receberam uma injeção subcutânea de estreptozotocina a 75 mg/kg em tampão de citrato de sódio, e foram deixados evoluir até 120 dias depois da indução da doença. Todos os ratos usados neste experimento tinham demonstrado níveis de glicose sustentados acima de 15 mmols/L. Os animais foram manuseados e alimentados como descrito anteriormente. Um grupo de controle concomitante foi estabelecido, onde os animais receberam solução salina em vez de estreptozotocina. Os animais foram observados por três meses depois do desafio de estreptozotocina. Depois deste período uma caracterização eletrofisiológica de todos os ratos foi feita e os animais foram divididos em dois grupos de tratamento aleatórios:
grupo I. Animais receberam solução salina (1 mL), 3 dias por semana, pela via intraperitoneal.
grupo II, Animais receberam a composição farmacêutica com 100 pg de EGF em 1 ml, 3 dias por semana, pela via intraperitoneal.
Um grupo de pelo menos 10 ratos não-diabéticos sadios da mesma ninhada foi incluído como referência para valores fisiológicos em animais não-diabéticos. Os resultados da caracterização neurofisiológica dos animais antes do início de tratamento estão indicados na tabela 9. A metodologia empregada nestas explorações foi descrita anteriormente.
Tabela 9. Caracterização Neurofisiológica de Animais antes do Inicio do Tratamento
| Parâmetro Estudado | Diabéticos | Não-diabéticos |
| Limite Nociceptivo | 55+ 5 gramas | 115 ± 15 gramas |
| Velocidade de Condução Motora | 20J53 ± 8,44 m/s | 66,18 ±4,32 m/s |
| Velocidade de Condução Sensorial | 26,88 ±13,27 m/s | 69,94 ±11,8 m/s |
| Irrigação Sanguínea para o Nervo | 480,61 ± 65,92 LDPI | 1.413,8 ±73,41 LDPI |
(1) Determinação do Limite Nociceptivo (NCT). Teste de Dor
O teste de dor, que consiste na aplicação de uma pressão gra5 dualmente crescente na cauda, e o resto das explorações descritas a seguir, foram conduzidas 120 dias depois da indução de diabetes e depois de um mês de tratamento. Pelo menos 10 animais de cada um dos grupos experimentais foram usados. A determinação do NCT foi conduzida como descrito anteriormente e os resultados estão representados na tabela 10.
Tabela 10. Resultados do teste de NCT
| Grupo Experimental | UNC (gramas) |
| Diabéticos + Solução Salina | 55 ±10** |
| Diabéticos + Tratamento | i 80 ±5* |
| Ratos Não-diabéticos | 115±10 |
Diferenças significativas entre o grupo de ratos diabéticos tratados com solução salina e o grupo de ratos que receberam o tratamento, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram observadas (**p<0,01 ANOVA e correção de Bonferroni). Houve também diferenças entre o grupo de tratamento e animais intactos (* p<0,05).
Os resultados demonstram que três meses depois da indução de diabetes há um incremento na progressão de neuropatia periférica, uma redução no limite de sensibilidade à dor èm mais do que 50% em comparação com animais sadios. É digno de nota também a diferença observada entre o grupo de ratos diabéticos e o grupo tratado três vezes por semana, durante um mês, com a composição farmacêutica.
Os animais tratados, em geral, apresentaram tolerância mais alta à dor, uma descoberta que sugere que o tratamento com a composição farmacêutica corrigiu ou restaurou de alguma maneira as fibras sensíveis.
(2) Determinação da Velocidade de Condução de um Impuíso através de .· Fibras Motoras - : ·
Para verificar o efeito da composição farmacêutica sobre a restauração de fibras sensíveis e motoras, a velocidade dé condução de um impulso elétrico foi medida 120 dias depois da indução de diabetes, depois de tratar os animais com a composição farmacêutica ou solução salina. Quinze animais por grupo experimental foram usados. O procedimento se10 guido já foi descrito para os estudos anteriores e os resultados estão indicados na Tabela 11.
Tabela 11. Exploração de Velocidade çle Condução de Fibras Motoras
| Grupo Experimèntal | Velocidade m/s |
| Diabéticos + Solução Salina | 23^62 ±18,7** |
| Diabéticos + T ratamento | 54,8 ±1,66* |
| Ratos Não-diabéticos | 64,72 ±10,55 |
Diferenças significativas entre o grupo de ratos diabéticos tratados com solução salina e o grupo que recebeu a composição da invenção, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram encontradas (**p<0,01 ANOVA e correção de Bonfèrroni). Houve diferenças ambém entre o grupo tratado com a composição que contém EGF e animais nãodiabéticos intactos (* p<0,05).
Os resultados demonstram que três meses depois da indução de diabetes há um incremento na progressão de neuropatia periférica, e uma redução da velocidade de condução de estímulos ao longo de fibras motorãs, particülarmente quando comparado com animais sadios. É importante avaliar, entretanto, que o tratamento com a composição farmacêutica estabeleceu uma grande diferença em comparação com o grupo de ratos diabé25 ticos que receberam solução salina três vezes por semana durante um mês. Em geral, o tratamento com a composição farmacêutica restaura fibras nervosas motoras, melhorando sua capacidade de condução.
Outro aspecto estudado é a velocidade de condução sensorial
1' (SCV), como refletido na tabela 12. i
Tabela 12. Estudo da Velocidade de Condução Sensorial (SCV)
| Grupo Experimental | f . . . Velocidade m/s |
| Diabéticos + Solução Salina | 31,27 ±10,6** |
| Diabéticos + Tratamento | 59,42 ±3,35* |
| Ratos Não-diabéticos | 68,9 + 11,27 |
Diferenças significativas entre o grupo de ratos diabéticos tratados com solução salina e o grupo de ratos que receberam a composição que contém EGF, bem como com o grupo de ratos não-diabéticos, foram encontradas (**p<0,01 ANOVA e correção de Bonferroni). Houve diferenças também entre o grupo tratado com a composição da invenção e os animais nãodiabéticos intactos (* p<0,05). i
Os resultados demonstram que três meses depois da indução de 10 diabetes houve um incremento na progressão de neuropatia periférica, e uma redução na velocidade de condução de estímulos ao longo de fibras sensíveis, particularmente em comparãção com animais sadios. A deterioração dos parâmetros é acima de 50%. È importante avaliar, entretanto, que o tratamento com a composição farmacêutica estabeleceu uma grande dife15 rença em comparação com o grupo de ratos diabéticos que receberam solução salina três vezes por semana durànte um mês. Em geral, o tratamento com a composição farmacêutica restaura fibras nervosas sensoriais, o que está em conformidade com o teste de limite nociceptivo.
(3) Influência da Composição Farmacêutica sobre a Integridade da Perfusão de um Nervo Periférico :
O nervo ciático direito de ratos foi usado novamente como um . Ί ' ' ' modelo. Dez animais de cada um dos grupos experimentais foram usados. Os valores de ratos não-diabéticos estão incluídos como referência. O experimento foi conduzido como descrito anteriormente, embora neste contexto os animais já estivessem diabéticos por três meses e tivessem recebido tratamento prolongado por um mês com a composição que contém EGF ou solução salina, de acordo com o grupo experimental. Os resultados estão representados na tabela 13.
Tabela 13. Resultados do Estudo Conduzido com o Sistema de Reprodução de Imagens de Perfusão Laser Doppler
| Grupo Experimental | Unidades LDPI |
| Controle com Solução Salina | ' 418,5±66,9** |
| Grupo de Tratamento | 934 ±60,18* |
| Ratos Não-diabéticos | ; 1.397,3 ±101,55 |
Diferenças significativas entre o grupo diabético tratado com solução salina e o grupo que recebeu a composição que contém EGF, bem como com o grupo de controle de ratos sadios, foram encontradas (**p<0,01 ANOVA com correção de Bonferroni); Diferenças significativas (*p<0,05) foram entradas também entre o grupo tratado com a composição da invenção e animais não-diabéticos intactos.
O tratamento com a composição da invenção melhorou clara10 mente o nível da perfusão sanguínea para o nervo. Embora os valores não sejam ainda comparáveis com aqueles de animais sadios, eles são muito mais altos em comparação com ratos diabéticos que receberam solução salina. O mecanismo molecular por trás deste efeito não foi ainda esclarecido.
(4) Determinaçlões e Caracterizações Post-mortem
Estudo Histomorfométríco
Um mês depois da conclusão do tratamento com a composição que contém EGF ou solução salina, e 120 dias depois da indução da doen' · - . ' ' - t ' ' ' . · .
ça, os animais foram sacrificados por uma overdose de anestesia e perfundidos com tampão de solução salina pH 7,4. Um total de dez animais por grupo experimental foi incluído para estudos histomorfométricos, e um número equivalente de ratos foi usado para determinações bioquímicas. Em ambos sistemas os nervos ciáticos de ambos membros foram dissecados. Os procedimentos foram similares àqueles descritos para o ensaio de prevenção de dano neuropático. As amostras para estudos histológicos e his25 tomorfométricos foram coradas com hematoxilina/eosina e azul de toluidina. Pelo menos cinço fragmentos do mesmo nervo foram estudados quantitativamente usando o programa MADIP. Os fragmentos foram incluídos em blocos de OCT, pós-fixados com glutaraldeído, e fatiados horizontal e transver23 salmente. Os indicadores histológicos avaliados foram descritos acima, bem como os procedimentos usados para o processamento e avaliação:
> número total de vasos sanguíneos (em epineural/perineural) em 10 campos microscópicos usando 10X como ampliação constante em cortes longitudinais do nervo.
> porcentagem de fibras desmielinizadas. Avaliado tirando a média dos valores por campo microscópico (x20, pelo menos cinco campos).
> porcentagem de fibras mielínicas e não-mielínicas com lesões (dilatadas ou distorcidas) por campo microscópico (x20, pelo menos cinco campos).
. > porcentagem de colagenização endoneural (moderada: 25 a
50%; grave: mais do que 50% da área endoneural em fatias transversais, e pelo menos três seções diferentes.
Os resultados estão indicados na tabela 14. Difereças estatisti15 camente significantes no número de vasos sanguíneos entre os grupos de ratos diabéticos e ratos intactos foram documentadas (p<0,001). Diferenças estatísticas entre ratos tratados coma composição que contém EGF e os animais que receberam solução salina também foram encontradas (p<0,05,
ANOVA com correção de Bonferroni).
Tabela 14. Estudo Morfométrico Conduzido em Fragmentos do Nervo Ciáticos. Avaliação depois de 30 dias. .
| Grupo Experi- | N2 de vasos | % de fibras | % de fibras | % de área co- |
| mental | sanguíneos | desmielinizadas | com lesões | lagenizada |
| Controle com solução salina | 43,2 ±9,8 | 71,5 ± 22,7 | 83 ± 7,5 | 64,1 ±16,4 |
| Grupo de Tratamento | 86,5 ±14,6 | 50,6 ±12,3 | 52,6 ± 8,3 | 46,3 ±9,5 |
| Ratos Não- diabéticos | 178,1 ±44,2 | 0 ; I . | o | 0 |
As porcentagens de fibras desmielinizadas, fibras com lesões e área endoneural colagenizada em animais diabéticos foram significativamente diferentes (p<0,001) dos valores observados em animais diabéticos. Muito embora diferenças significativas (p<0,05) sejam detectadas entre animais sadios e aqueles tratados com a composição que contém EGF, o efeito atenuador do dano é óbvio. As porcentagens foram comparadas usando o teste exato de Fisher. ..·····(10
Conclusões Parciais - O tratamento com a composição da invenção, três vezes por semana, durante um mês, e depois do estabelecimento da neuropatia diabética, reduziu significativamente a deterioração morfológica das fibras do nervo ciático. O tratamento com a composição foi capaz também de reduzir a atrofia e degeneração de vasos sanguíneos. Novamente, todas estas descobertas estão em conformidade com os testes funcionais conduzidos.
(5) Caracterização Bioquímica de Fragmentos de Nervos
Dez animais de cada grupo foram usados para as determinações bioquímicas nos fragmentos dò nervo ciático coletado. Os seguintes parâmetros bioquímicos foram estudados:
Perfil de Oxirredução: ι > Atividade enzimática total de Superóxido Dismutase total (tSOD). . -i > Atividade enzimática de catalase.
> Acumulação intra-axônica de hidroperóxidos totais (THP).
> Acumulação intra-axônica de maloníldialdeído (MDA).
Os resultados deste estudo estão indicados na tabela 15.
Tabela 15. Caracterização do Estado de Oxirredução em Fragmentos do Nervo Ciático 7
| Grupo Experimental | tSOD a,b | Catalase | THPC | MDA |
| Ratos Não-diabéticos | 2.108,3 | 31,8 | 21,1 | 0,08 |
| ±109,7 | ±3,22 | ±1,11 | ±0,005 | |
| Diabéticos + solução salina | 375,8 | 603,6 | 317,5 | 0,87 |
| ±88,2 | ±99,4 | ±12,2 | ±0,1 | |
| Diabéticos + tratamento | 1.988,4 | 86,1 | 55,8 | 0,1 |
| ±101,6 | ±6,5 | ±12,7 | ±0,03 |
Valores expressos como média3 e desvio-padrãob. Enzimas ex25 pressas como unidades por miligrama de proteína por minuto. 'THP e MDA em nmol/mg de proteína. L
Diferenças estatisticamente significantes entre placebo e animais diabéticos tratados e o grupo de ratos tratados com a composição que contém EGF foram encontradas (p<0,01, Teste t de Student com duas caudas). Como indicado na tabela 15, o tratamento com a composição farmacêutica reduz significativamente a presença de metabólitos indicativos de processos de peroxidaçãoho tecido de nervo estudado. Paralelamente, demonstra-se que o tratamento atenua a disfunção da enzima Superóxido
Dismutase.
(6) Atividade Enzimática de Lipoproteína Lipase (LPL) em Fragmentos do
Nervo Ciático
O objetivo deste estudo foi comparar a atividade enzimática de LPL depois de um mês de tratamento com a composição que contém EGF, em comparação com animais diabéticos tratados com solução salina. Os resultados estão indicados na tabela 16. Diferenças significativas entre o grupo tratado com solução salina e aquele tratado com a composição da invenção foram observadas (**p<0,01, AN OVA e testes de Tukey).
Tabela 16. Atividade de LPL no Nervo Ciático.
| Grupo Experimental | LPL (nmoles AGL/min/g) |
| Ratos Não-diabéticos | 7,02 ±1,24 |
| Diabéticos + solução salina | 2,18 ±0,73** |
| Diabéticos + tratamento | 6,29 ±1,67 |
Esta análise demonstra que o tratamento com a composição farmacêutica que contém EGF restaurá a atividade enzimática de LPL, o que consequentemente melhora a capacidade de o nervo sintetizar mielina. Exemplo 3. Demonstração do Efeito Terapêutico da Composição que Contém EGF no Tratamento de Pacientes com Neuropatia Diabética
Um total de cinco pacientes foi tratado com a composição que contém EGF. Os pacientes tiveram manifestações de neuropatia sensorial e motora, e dolorosa, sem resposta a tratamentos anteriores. A dose de EGF administrada ficou na faixa entre 20 e 25 pg. A aplicação da composição que . ··:·.,··; ' ·. . 26 ' ' · ' ' ' , . , contém este ingrediente farmacêutico ativo foi feita por infiltração. Os casos tratados foram os seguintes: Paciente PCM. Paciente feminina com cinquenta anos de idade, com mais de 20 anos de diagnóstico com diabetes tipo 1, manifestações de cardiopatia isquêmica, hipertensão e nefropatia. Uma história de neuropatia sensorial e motora e manifestações de neuropatia dolorosa, com mais de 10 anos de evolução e nenhuma resposta clínica a tratamentos anteriores. Uma composição que contém 25pg de EGF e 100 mg de lidocaína por dose foi infiltrada no nervo ciático maior. Este procedimento foi repetido mais 5 vezes para um total de seis aplicações, sempre no nervo ciático, duas vezes por semana. Depois da terceira infiltração a dor desapareceu. Oito semanas depois do início do tratamento as manifestações sensoriais e motoras cessaram, e permaneceram assim durante um período de acompanhamento de três meses.
Paciente OZD. Paciente feminina com setenta e dois anos de idade que sofre de diabetes, com oclusões arteriais graves e dor em descanso. Ela não consegue caminhar e tem entorpecimento total das pernas. Três aplicações da mesma composição foram feitas, no mesmo local anatômico (nervo ciático maior). A paciente relatou que o entorpecimento das per20 nas não cessou depois da administração da composição que contém EGF; entretanto, a dor em descanso desapareceu depois de três aplicações desta composição, e a paciente conseguiu caminhar mais rapidamente.
Paciente BCB. Paciente feminina com sessenta anos de idade, com mais de 10 anos com um diagnóstico de diabetes tipo 1, dor em des25 canso e entorpecimento dos membros. Ela recebeu seis aplicações da mesma composição por infiltração no nervo ciático maior. Depois da terceira aplicação a dor desapareceu e as parestesias foram reduzidas. Três semanas depois da aplicação da última dose a dor reapareceu; portanto, um novo ciclo de tratamento foi conduzido.
Paciente GTC. Paciente masculino com setenta e cinco anos de idade que sofre de diabetes, com entorpecimento dos membros. Seis aplicações da mesma composição foram fèitas no mesmo local anatômico, em intervalos de 4 dias. Depois de concluído o tratamento mencionado os sintomas de entorpecimento das pernas desapareceu permanecendo assim durante o período de acompanhamento de três meses.
Paciente STL. Paciente masculino com sessenta e oito anos de 5 idade que sofre de diabetes tipo I por mais de 10 anos. Ele apresenta manifestações de entorpecimento nos membros inferiores. Seis aplicações da mesma composição foram feitas, no mesmo local anatômico, em uma taxa de 2 aplicações por semana. Depois da primeira rodada de tratamento (6 doses), o entorpecimento dos membros inferiores desapareceu para voltar depois de 6 meses. Um novo ciclo dé tratamento foi, portanto, aplicado, seguindo os mesmos procedimentos, e as manifestações de entorpecimento declinaram depois da terceira infiltração.
Uma melhora substancial nas funções neurológicas dos pacientes é, em geral, observada, com eliminação de dor espontânea em descanso e sensações parestésicas. ‘
Exemplo 4. Preparação da Composição Farmacêutica que Contém Microsferas de PLGA com EGF.
Preparação de Caracterização de Microsferas Carregadas com EGF
Uma solução de poli(ácido lático) a 5% (em peso) (Sigma, St.
Louis, Missouri, EUA) foi preparada dissolvendo 1 g do polímero em diclorometano (DCM).
Três mililitros da solução de PLGA foram depositados em um recipiente de vidro, e 100 pl de uma solução aquosa de EGF a 30 mg/mL foram adicionados.
Esta mistura foi agitada durante 2 minutos a 14.000 rpm por meio de um homogeneizador Ultraturrax T8 (IKA Labortechnik, Alemanha). A emulsão resultante foi vertida sobre 30 mL de poli(álcool vinílico) a 1% e uma segunda emulsão (peso sobre peso) foi obtida sob agitação intensa das duas fases a 14.000 rpm usando um homogeneizador Ultraturrax T8 (IKA
Labortechnik, Alemanha). A emulsão dupla foi vertida sobre 270 mL de poli(álcool vinílico) a 1% 30.000-70.000 (Sigma, St. Louis, Missouri, EUA) e agitada em um homogeneizador (IKA Labortechnik, Alemanha) a 300 rpm durante 1 h para evaporar o dicloro-metano. Finalmente, as microsferas foram coletadas por filtração, lavadas 5 vezes com 50 mL de água destilada e secadas por congelamento em um liofilizador (Edwards, Reino Unido). As microsferas secas foram estocadas a 4°C até serem usadas.
As micropartículas carregadas eom EGF resultantes eram esféricas e apresentavam uma superfície porosa regular (figura 1). O rendimento do processo foí de 85%, com uma eficiência de encapsuiação na faixa entre 68 e 71%. A carga das microsferas ficou na faixa entre 0,82 e 0,85%. As partículas eram menores do que 30 pm. :
Liberação In vitro de EGF encapsulado
Cinquenta miligramas de microsferas carregadas com'EGF foram colocados em suspensão em 1 mL de fluido receptor (Tween 80 a 0,001% e azida de sódio a 0,1% em PBS pH 7,2). A suspensão foi incubada a 37°C sob agitação suave. As amostras foram centrifugadas por 5 min a
5.000 rpm em uma microcentrífuga Hettich (Tuttlingen, Alemanha), nos dias
1, 3, 7, e 14. O sobrenadante foi coletado e o mesmo volume de fluido receptor foi adicionado. A contração de EGF em cada amostra foi avaliada peIo método de ácido bicinconínico em formato de microensaio (ensaio microBCA).
O perfil da liberação de EGF das microsferas apresentou um estágio de liberação explosiva durante o primeiro dia e um segundo estágio de liberação contínua e gradual de EGF até o Dia 14. Aproximadamente, os 30% de proteína total foram liberados durante o primeiro estágio, enquanto que os 50% do EGF contidos dentro das partículas foram liberados durante o resto do período de valiação, em uma taxa aproximada de 7pg por dia (figura 2). i
Exemplo 5. Demonstração do Efeito Terapêutico de uma Composição que Contém EGF Encapsulada em Microsferas, em Pacientes com Neuropatia Diabética
A seguir, estão resumidas algumas das características dos três pacientes tratados com a composição que contém EGF encapsulada em microsferas, è as informações sobre o tratamento aplicado a eles:
Paciente LNP. Paciente femino com 47 anos de idade, eom mais de10 anos com um diagnóstico de diabetes tipo 1 com manifestações de neuropatia sensorial e motora e dolorosa I. O nervo ciático maior foi infiltrado com uma composição que contém 20pg de EGF por dose. Este procedimen5 to foi repetido três vezes para um total de quarto aplicações em uma freqúência de duas doses por semana. A dor foi reduzida depois da terceira infiltração, e desapareceu depois da quarta aplicação. As manifestações sensoriais e motoras desapareceram duas semanas depois e permaneceram assim durante um período de acompanhamento de três meses.
Paciente JVR. Paciente feminina com 63 anos de idade com diabetes tipo I. Apresenta dor em descanso e entorpecimento dos membros. Ela recebeu seis aplicações de uma composição que contém 25 pg de EGF por dose, a cada 12 dias. A aplicação da composição foi feita por infiltração do nervo ciático maior. A dor desapareceu e as parestesias foram reduzidas depois da terceira aplicação. Seis semanas depois da última aplicação da composição a dor reapareceu, e portanto, uma nova rodada de tratamento foi iniciada.
Paciente DGR. Paciente masculino com 52 danos de idade que sofre de diabetes, sofrendo de entorpecimento dos membros. Ele recebeu cinco doses da composição descrita acima que contém EGF encapsulado em microsferas para a liberação lenta) no mesmo local anatômico, e em intervalos de 14 dias. Depois de concluído o tratamento com EGF o entorpecimento das pernas já tinha desaparecido, permanecendo assim durante o período de acompanhamento de quatro meses.
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Uso do Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) humano, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição farmacêutica injetável administrada por infiltração na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos, para a restauração morfofuncional de nervos periféricos afetados por neuropatia diabética.
- 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neuropatia diabética refere-se à neuropatia sensorial e motora dolorosa, e neurite isquêmica
- 3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a neuropatia sensorial e motora dolorosa, ou neurite isquêmica afetam os membros inferiores.
- 4. Uso de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito EGF é encapsulado em microsferas.6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica que contém EGF é líquida ou liofilizada para ser reconstituída antes do seu uso.
- 5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica que contém EGF é uma composição aquosa, opcionalmente tamponada, ou uma composição liofilizada para ser reconstituída com água ou com uma solução aquosa de tampão.
- 6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica contém entre 10 e 1.000 microgramas de EGF/mililitro.
- 7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica que contém EGF contém adicionalmente lidocaína a 2%.
- 8. Composição farmacêutica injetável para o tratamento de neuropatia diabética sensorial e motora dolorosa; neurite isquêmica na periferia de troncos e/ou gânglios nervosos, para a restauração morfofuncional dos nervos periféricos, caracterizada pelo fato de que contém EGF humano em combinação com um anestésico ou analgésico local.13/12/2017, pág. 10/15
- 9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o EGF é encapsulado em microsferas.
- 10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda lidocaína a 2%.5 11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação10, caracterizada pelo fato de que a concentração de EGF fica na faixa entre 10 e 1.000 microgramas/mililitro.Petição 870170097252, de 13/12/2017, pág. 11/151/1 <1Α.»Fig .1Fig .2 £ο σφ ηφ *·C φΕ οΟLULUTempo (dias)
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