BRPI0715200A2

BRPI0715200A2 - cultura biologicamente pura de microorganismos clostridium ragsdalei, e, composiÇço, mÉtodo e sistema para produzir etanol

Info

Publication number: BRPI0715200A2
Application number: BRPI0715200-0A
Authority: BR
Inventors: Raymond L Huhnke; Randy S Lewis; Ralph S Tanner
Original assignee: Univ Oklahoma State; Univ Oklahoma
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2013-06-11
Also published as: EP2061872A2; CN101573437A; MX2009002194A; EA200970241A1; WO2008028055A3; JP2010502191A; CA2661974A1; EP2061872A4; US20080057554A1; WO2008028055A2; US7704723B2; US20100203606A1

Abstract

CULTURA BIOLOGICAMENTE PURA DE MICROORGANISMO CLOSTRIDIUM RAGSDALEI, E, COMPOSIÇçO, MÉTODO E SISTEMA PARA PRODUZIR ETANOL. Uma nova espécie bacteriana clostridiana (Clostridium ragsdalei, ATCC BAA-622 e/ou PTA-7826, "P11") é provida. P11 é capaz de sintetizar, a partir de gases de refugo, produtos que utilizáveis como biocombustível. Em particular, P11 pode converter CO em etanol. Assim, esta nova bactéria transforma gases de refugo (por exemplo singás e refugos de refinaria) em produtos úteis. P11 também catalisa a produção de acetato.

Description

"CULTURA BIOLOGICAMENTE PURA DE MICROORGANISMO CLOSTRIDIUM RAGSDALEI, E, COMPOSIÇÃO, MÉTODO E SISTEMA PARA PRODUZIR ETANOL"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se geralmente a bactérias que são capazes

de produzir biocombustível a partir de refiigo de lixo. Em particular, a invenção provê uma nova espécie clostridiana (Clostridium ragsdalei) tendo as características de identificação de Depósito ATCC nos. BAA-622 e/ou PTA-7826) e um método de sintetizar etanol e outros produtos utilizáveis a partir de CO usando a espécie clostridia.

Antecedentes da Invenção

Foi só após as crises do petróleo da década de 70 que o Governo dos Estados Unidos começou a custear mais iniciativas para encontrar um modo de desenvolver recursos renováveis para aliviar a dependência do país das importações de óleo (Klass, 1998). Foi também então quando o governo tinha um interesse renovado em produção de solvente de biobase para misturar na gasolina. Um interesse particular e que ocorre ainda mais recentemente, é bioetanol (etanol a partir de biomassa).

Atualmente, o modo principal de produção de bioetanol é através de fermentação direta, que perfaz 90% da produção de etanol nos Estados Unidos (Licht, 2001). A fermentação é o processo em que o microorganismo sacarolítico, como uma levedura ou bactérias, converte açúcar em etanol. Estes açúcares podem ser simples (isto é, glicose) ou complexos (isto é, amido celulose, hemicelulose). O amido de milho é o substrato primário usado nas plantas de produção de etanol atualmente. Além de amido de milho, biomassa de lignocelulose (isto é gramas, árvores pequenas, refugo de papel, serragem) também está sendo pesquisada como um substrato para este processo. A lignocelulose é composta de celulose, hemicelulose, pectina e lignina. A dificuldade com a fermentação direta de biomassa lignocelulósica é que os processos de pré-tratamento adicionais são necessários para romper a biomassa em seus componentes individuais antes da utilização do microorganismo. Isto aumenta mais o custo nas áreas de materiais, projeto da planta, controle dos refugos do lixo, etc.

Em uma tentativa para ter o melhor rendimento dos recursos

disponíveis para a produção de etanol combustível, métodos alternativos estão sendo examinados. Um destes métodos alternativos é fermentação indireta. A fermentação indireta é o processo em que a biomassa lignocelulósica é pirolisada (queimada para produzir gases) e os gases produzidos são convertidos em etanol por bactérias. Os gases produzidos são geralmente chamados gases de síntese. O gás de síntese (CO-H2-CO2), um produto de biomassa pirolisada ou carvão, tem sido e é atualmente reconhecido por seu papel potencial na fermentação indireta de biomassa em álcool combustível (Zeikus, 1980, Bredwell et. al., 1980). Os microorganismos anaeróbicos como bactérias acetogênicas

oferecem uma via viável para converter singás em produtos úteis, particularmente em biocombustíveis líquidos, como etanol. Estas bactérias catalisam a conversão de singás com especificidade maior, rendimentos maiores e custos de energia menores do que pode ser atingido usando processos químicos (Vega et al, 1990; Phillips et al., 1994). Vários microorganismos capazes de produzir biocombustíveis a partir de gases de refugos e outros substratos foram identificados.

Três cepas de acetogênios (Drake, 1994) foram descritas para uso na produção de combustíveis líquidos a partir de singás: Butyribacterium methylotrophicum (Grethlein et al., 1990; Jain et al., 1994b); Clostridium autoethanogenum (Abrini et al., 1994); Clostridium Ijungdahlii (Arora et al, 1995; Barik et al., 1988; Barik et al. 1990; e Tanner et al., 1993). Dentre estes, Clostridium Ijungdahlii e Clostridium autoethanogenum são conhecidos como convertendo CO em etanol. Patente US 5,173,429 para Gaddy et al. descreve Clostridium Ijungdahlii ATCC No. 49587, um microorganismo anaeróbico que produz etanol e acetato a partir de CO e H2O e/ou CO2 e H2 em gás de síntese.

Patente US 5.192.673 para Jain et al. descreve uma cepa mutante de Clostridium acetobytylicum e um processo para fazer butanol com a cepa.

Patente US 5.593.886 para Gaddy et al. descreve Clostridium Ijungdahlii ATCC No. 55380. Este microorganismo pode produzir anaerobicamente acetato e etanol usando gás de refugo (por exemplo, gás de refugo de negro de fumo) como um substrato.

Patente US 5.807.722 para Gaddy et al. descreve um método e aparelho para converter gases de refugo em produtos utilizáveis como ácidos orgânicos e álcoois usando bactérias anaeróbicas, como Clostridium Ijungdahlii ATCC No. 55380. Patente US 6.136.577 para Gaddy et al. descreve um método e

aparelho para converter gases de refugo em produtos utilizáveis como ácidos orgânicos e álcoois (particularmente etanol) usando bactérias anaeróbicas, como Clostridium Ijungdahlii ATCC Nos. 55988 e 55989.

Patente US 6.136.577 para Gaddy et al. descreve um método e aparelho para converter gases de refugo em produtos úteis com ácidos orgânicos e álcoois (particularmente ácido acético) usando cepas anaeróbicas de Clostridium Ijungdahlii.

Patente US 6.753.170 para Gaddy et al. descreve um processo de fermentação microbiano anaeróbico para a produção de ácido acético. Outras cepas de acetogênios foram também descritas para uso

na produção de combustíveis líquidos a partir de gás de síntese, por exemplo : Butyribacterium methylotrophicum (Grethlein et al., 1990, Appl. Biochem. Biotech. 24/24:875-884); e Clostridium autoethanogenum (Abrini et al., 1994, Arch. Microbiol. 161:345-351). Permanece a necessidade crescente para descobrir e desenvolver microorganismos adicionai que sejam capazes de produzir produtos úteis como biocombustíveis via fermentação. Particularmente, seria vantajoso prover micróbios que sejam robustos, relativamente fáceis de cultivar e manter, e que forneçam bons rendimentos de produtos de interesse, como biocombustíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê uma nova bactéria anaeróbica biologicamente pura (Clostridium ragsdalei, depositada no American Type Culture Collection em Manassas, VA, em outubro de 2002 sob a designação BAA-622 e novamente em 14 de junho de 2006 sob a designação PTA-7826, também referida como "Pll") que é capaz de produzir rendimentos elevados de fluidos orgânicos valiosos a partir de substratos relativamente comuns. Em particular, o microorganismo pode produzir etanol e ácido acético por fermentação de CO. Uma fonte comum de CO é singás, o subproduto gasoso de gaseificação de carvão. Os micróbios podem assim converter substâncias que iriam de outra forma ser produtos de refugo em produtos valiosos, alguns dos quais são biocombustíveis. Singás, e assim CO, também pode ser produzido a partir de matérias primas agrícolas de baixo custo, disponíveis prontamente, por pirólise, provendo um meio para se dirigir tanto às preocupações econômicas como ambientais de produção de energia. As bactérias desta invenção assim participam na conversão indireta de biomassa em biocombustível através de uma via de gaseificação/fermentação.

As culturas de Clostridium ragsdalei são extremamente estáveis e podem ser armazenadas na temperatura ambiente ou em uma incubadora a 38°C, durante mais de um ano, enquanto retendo atividade.

É um objeto desta invenção prover uma cultura biologicamente pura do microorganismo Clostridium ragsdalei. O microorganismo tem todas as características de identificação de ATCC Nos. BAA-622 e/ou ΡΤΑ-7826. Além disso, a invenção provê uma composição pra produzir etanol. A composição compreende 1) uma fonte de CO, e 2) Clostridium ragsdalei. Em uma forma de realização da invenção, a fonte de CO é singás.

Em ainda outra forma de realização, a invenção provê um

método para produzir etanol. O método compreende a etapa de combinar uma fonte de CO e Clostridium ragsdalei sob condições que permite ao referido Clostridium ragsdalei converter CO em etanol.

A invenção ainda provê um sistema para produzir etanol, o sistema compreendendo 1) um vaso em que uma fonte de CO é combinada com Clostridium ragsdalei, e 2) um controlador que controla das condições no referido vaso que permitem a Clostridium ragsdalei converter o CO em etanol. Em uma forma de realização da invenção, o sistema também inclui 1) um segundo vaso para produzir singás, e 2) um transporte para transportar o singás para o vaso, em que o singás serve como a fonte de CO. Este sistema é ilustrado na figura 5, que mostra o vaso 100 e controlador 101, com o segundo vaso opcional 200 e transporte 201.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Micrografia eletrônica de transmissão de célula negativamente colorida de cepa Pl 1, Bar, 1 μηι.

Figura 2. Determinação de pH ótimo para cepa Pll com frutose como o substrato.

Figura 3. Determinação de temperatura ótima para cepa Pl com frutose como o substrato. Figura 4. Árvore filogenética com base em similaridades de

seqüência de genes 16S rDNA e construída usando o método de união de vizinhos, indicando a posição de C. ragsdalei ATCC BAA-622 e/ou PTA- 7826 e espécies representativas do gênero de Clostridium. Números de acesso do GenBank para as seqüências de 16s rRNA são dados após os números da cepa.

Figura 5 - Esquema para um sistema para produzir etanol a partir de singás usando P11.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDASDA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na descoberta de uma nova bactéria acetogênica que é capaz, sob condições anaeróbicas, de produzir rendimentos elevados de produtos valiosos a partir de CO e outros substratos prontamente disponíveis. Em particular, o microorganismo produz produtos líquidos valiosos como etanol, butanol e acetato por fermentação de CO, com etanol sendo um produto predominante. Por " fermentação" os Requerentes significam um processo fisiológico em que o substrato serve tanto como a fonte de elétrons como o escoadouro de elétrons (oxidação de uma porção do substrato e redução de uma porção do substrato) que podem ser usados par a produção de produtos, como álcoois e ácidos. Como resultado, este organismo é capaz de converter o que seriam de outra forma gases de refugo em produtos utilizáveis como biocombustível. O micróbio anaeróbico desta invenção é uma nova espécie clostridia que demonstra as características de culturas purificadas representadas por depósito ATCC BAA-622 e/ou PTA-7826, aqui referidos como "PI 1".

As propriedades morfológicas e bioquímicas de Pll foram analisadas e como descrito aqui na seção de exemplos abaixo. Apesar de algumas das propriedades de Pll serem similares a outras espécies Clostridium, Pll possui características singulares que indicam o mesmo como uma nova espécie deste gênero. Pll foi denominado Clostridium ragsdalei e é considerado como sendo representativo desta espécie.

As bactérias nas culturas biologicamente puras da presente invenção tem a capacidade, sob condições anaeróbicas, de produzir etanol a partir de substratos CO + H2O e/ou H2 + CO2 de acordo com as seguintes reações:

Síntese de etanol

6CO + 3H2O — > C2H5OH + 4C02 (1)

6H2 + 2C02 — > C2H5OH + 3H20 (2)

Com relação à fonte destes substratos, os versados na técnica irão reconhecer que muitas fontes de CO, CO2 e H2 existem. Por exemplo, as fontes preferidas dos substratos são gases de "refugo" como singás, gases de refugo de refinarias de petróleo, gases (contendo algum H2), que são produzidos por fermentação de leveduras e algumas fermentações clostridiais, materiais celulósicos gaseificados, gaseificação de carvão. Etc. alternativamente, estes substratos gasosos não são necessariamente produzidos como subprodutos de outros processos, mas podem ser produzidos especificamente para uso nas reações de fermentação da invenção, que usam P11. Os versados na técnica irão reconhecer que qualquer fonte de gás substrato pode ser usado na prática da presente invenção, desde que seja possível prover a bactéria com quantidades suficientes dos gases substratos sob condições apropriadas para o micróbio realizar as reações de fermentação. A fonte de H2O para a reação representada na equação (1) é tipicamente o meio aquoso em que o organismo é cultivado.

Em uma forma de realização preferida da invenção, a fonte de CO, CO2 e H2 é singás. O singás para uso como um substrato pode ser obtido, por exemplo, como um subproduto gasoso de gaseificação de carvão. As bactérias assim convertem uma substância que seria de outra forma um produto de refugo em um biocombustível valioso. Alternativamente, singás pode ser produzido por gaseificação de matérias primas agrícolas de baixo custo prontamente disponíveis expressamente para o fim de fermentação bacteriana, assim provendo uma fonte para fermentação indireta de biomassa em álcool combustível. Existem exemplos numerosos de matérias primas que podem ser convertidas em singás, como a maior parte dos tipos de vegetação poderia ser usada para este fim. As matérias primas preferidas incluem mas não são limitadas a gramíneas perenes como o Panicum, resíduos de culturas com forragem de milho, refugos de processamento como serragem, etc. Os versados na técnica conhecem a geração de singás a partir de materiais de partida. Em geral, singás é gerado em um gaseificador a partir de biomassa secada primariamente por pirólise, oxidação parcial, e reforma a vapor, os produtos primários sendo CO, H2 e CO2. (Os termos "gaseificação", e "pirólise" referem-se a processos similares. Ambos os processos limitam a quantidade de oxigênio à qual a biomassa é exposta. A gaseificação permite uma quantidade pequena de oxigênio (isto também pode ser referido como "oxidação parcial") e pirólise permite mais oxigênio. O termo "gaseificação" é às vezes usado para incluir tanto gaseificação como pirólise). Tipicamente, uma parte do gás produto é reciclada para otimizar os rendimentos de produto e minimizar a formação de alcatrão residual. O craqueamento de alcatrão e coque não desejados no singás em CO pode ser realizado usando cal e/ou dolomita. Estes processos são descritos em detalhes em, por exemplo, Reed, 1981. (Reed, T.B.,1981, Biomass gasification: principies and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.)

Além disso, combinações de fontes de gases substratos podem ser usadas. Por exemplo, a fone primária de CO, CO2 e H2 pode ser singás, mas esta pode ser suplementada com outras fontes, por exemplo, de várias fontes comerciais. Por exemplo, a reação de acordo com a equação (1) acima gera quatro moléculas de CO2, e reação de acordo com a equação (2) utiliza 6 H2 mas somente duas moléculas de CO2. Salvo se H2 for abundante, o acúmulo de CO2 pode ocorrer. No entanto, a suplementação de meios com H2 adicional deve resultar em um aumento da utilização de CO2, e a produção conseqüente de ainda mais etanol.

O produto primário produzido pela fermentação de CO pela bactéria da presente invenção é etanol. No entanto, acetato também pode ser produzido. A produção de acetato ocorre provavelmente via as seguintes reações:

Síntese de acetato

4CO + 2H20 — > CH3COOH + 2C02 (3) 4H2 + 2C02 — > CH3COOH + 2H20 (4)

Os organismos da presente invenção devem ser cultivados sob condições anaeróbicas. Por 'condições anaeróbicas" os Requerentes significam que oxigênio dissolvido está ausente do meio.

Em geral, os meios para cultivo de acetogênios da invenção é um meio líquido como meio ATCC 1754 (desenvolvido por R. S. Tanner). No entanto, os versados na técnica irão reconhecer que meios alternativos podem ser usados, por exemplo, meio ATCC 1045 sob uma atmosfera de H2:C02 ou COiCO2 em um pH inicial de 6. Além disso, vários suplementos de meios podem ser adicionados para qualquer um de vários fins, por exemplo, agentes de tampão, metais, vitaminas, sais, etc. Em particular, os versados na técnica são familiarizados com tais técnicas, como manipulação de nutrientes e adaptação, que resulta em aumentar ou otimizar os rendimentos de um produto de interesse. Por exemplo, o cultivo de micróbios sob condições de "não crescimento" (isto é, condições que não favorecem o crescimento bacteriano e reprodução) podem resultar em maior produção de produtos de fermentação.

Isto é provavelmente porque sob condições de não crescimento, os recursos das bactérias, não são dedicados à reprodução e estão assim livres para outras atividades sintéticas. Os exemplos de condições de não crescimento incluem, por exemplo, manutenção da cultura em temperatura não ótima ou pH, a limitação de nutrientes e fontes de carbono, etc. Em geral, condições de não crescimento podem ser implementadas após uma densidade desejada de bactérias ser alcançada na cultura. Também, é possível por otimização do meio favorecer a produção de um produto sobre os outros, por exemplo, para favorecer a produção de etanol sobre acetato. Por exemplo, o aumento da concentração de ferro dez vezes comparado com o no meio padrão dobra a concentração de etanol produzido, enquanto diminui a produção de ácido acético. Os versados na técnica conhecem os procedimentos para otimizar a produção de produtos desejados, e todos estes procedimentos otimizados usando a bactéria Pll são destinados a serem englobados pela presente invenção. Referência é feito, por exemplo, ao trabalho realizado com Clostridium acetobutylicum que provê uma diretriz para estas técnicas, (ver, por exemplo, Bahl et al., 1986, Appl Environ. MicrobioL 52:169-172; e parentes US 5.192.673 para Jain et al. e patente US 5.173.429 para Gaddy, cujos conteúdos completos são incorporados aqui por referência).

Em particular, Clostridium ragsdalei pode ser cultivada usando a técnica de Balch (Balch e Wolfe, 1976, Appl. Environ. Microbiol. 32:781-791; Balch et al., 1979, Microbiol. Rev. 43:260-296), como descrito nas revisões por : Tanner, 1997, Manual Environ. Microbiol., p. 52-60, ASM Press; Tanner, 2002, Manual Environ. Microbiol. 2nd ed., p. 62-70; Wiegel et al., 2005, An Introduction to the Family Clostridiaceae, The Prokaryotes, Release 3.20; Tanner, 2006, Manual Environ. Microbiol. 3rd ed., ASM Press. Isto acarreta a ajuda de uma câmara anaeróbica para preparar materiais de cultura e uma tubulação de troca de gás para estabelecer qual fase de gás é desejada para cultura em tubos ou vasos selados. Os detalhes mais específicos na cultura de acetogênios produzindo solvente, como o uso de um pH ácido, aparecem em Tanner et al., 1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43:232-236 e Liou et al., 2005, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:2085-2091. Métodos para melhorar a produção de etanol incluem otimização de cada componente do meio (como amônio, fosfato e metais de traço), controle do pH da cultura, metagênese e triagem clonal, etc.

A fermentação de CO pelos organismos da invenção pode ser realizada em qualquer um de vários tipos de aparelhos que são bem conhecidos do versado na técnica, com ou sem modificações adicionais, ou em outros estilos de equipamento de fermentação que estão atualmente sob desenvolvimento. Os exemplos incluem mas não são limitados a reatores de coluna de borbulhamento, biorreatores de dois estágios, reatores de leitos de gotejamento, reatores de membrana, reatores de leitos recheados, contendo células imobilizadas, etc. As exigências chaves para estes aparelhos incluem que esterilidade, condições anaeróbicas, e condições apropriadas ou temperatura, pressão e pH sejam mantidos, e que quantidades suficientes de substratos sejam fornecidas à cultura; que os produtos sejam prontamente recuperados, etc. O reator pode ser, por exemplo, um reator de tanque agitado tradicional, um fermentador de coluna com células imobilizadas ou em suspensão, um reator de tipo de fluxo contínuo, um reator de pressão elevada, um reator de células em suspensão, com reciclo das células, e outros exemplos como listados acima, etc. Além disso, reatores podem ser dispostos em um sistema de reator em série e/ou paralelo, que contém qualquer um dos reatores acima mencionados. Por exemplo, reatores múltiplos podem ser utilizáveis para o crescimento de células sob um conjunto de condições e gerando etanol (ou outros produtos) com crescimento mínimo sob outro conjunto de condições. Em geral, a fermentação será deixada prosseguir até um nível

desejado de produto ser produzido, por exemplo até uma quantidade desejada de etanol ser produzida no meio de cultura. Tipicamente, este nível de etanol está na faixa de pelo menos cerca de 1 grama/litro de meio de cultura a cerca de 50 g/litro, com um nível de pelo menos cerca de 30 g/litro (ou menor) sendo preferível. No entanto, células ou sistemas de cultivo de células que são otimizadas para produzir de cerca de 1 a 10, ou de cerca de 10 a 20, ou de cerca de 20 a 30, ou de cerca de 30 a 40, ou de cerca de 40 a 50 grama/litro são também contempladas. Pll permanece viável e irá crescer em concentrações de etanol de pelo menos 60 g/L. Alternativamente, a produção pode ser parada quando uma certa taxa de produção é obtida, por exemplo, quando a taxa de produção de um produto desejado declinou devido a, por exemplo, acúmulo de produtos de refugo bacteriano, redução em disponibilidade de substrato, inibidor de realimentação por produtos, redução no número de bactérias viáveis, ou qualquer um dentre várias outras razões bem conhecidas do versado. Além disso, técnicas de cultura contínuas existem que permitem o reabastecimento contínuo de meio de cultura novo com remoção concorrente de meio usado, incluindo quaisquer produtos líquidos ai, (isto é o modo quimiostato). Os produtos que são produzidos pelas bactérias da invenção

podem ser removidos da cultua e purificados por qualquer um de vários métodos que são bem conhecidos do versado. Por exemplo, etanol pode ser removido e ainda processado, por exemplo por extração com solvente, destilação ao azeótropo seguido por destilação azeotrópica, desidratação de peneira molecular, ou por tubos de zeólito de fluxo transpassante. O versado na técnica irá reconhecer que as duas técnicas principais na indústria para desidratação de etanol após a destilação são destilação azeotrópica e desidratação de peneira molecular. (Ver, por exemplo, Kohl, S. "Ethanol 101- 7: Dehydration" in Ethanol Today, Março 2004: 40-41). Além disso, dependendo do número de produtos, várias técnicas de separação podem precisar ser empregadas para obter vários produtos puros. Do mesmo modo, acetato pode ser removido e ainda processado por processos similares.

Em algumas formas de realização da invenção, P11 é cultivado como uma cultura pura a fim de produzir etanol (ou outros produtos de interesse). No entanto, em outras formas de realização, Pl 1 pode ser cultivado junto com outros organismos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Em um esforço para descobrir novos catalisadores microbianos capazes de metabolisar eficientemente singás e produzir etanol, Clostridium ragsdalei, um novo acetogênio mesofílico, utilizando monóxido de carbono, foi isolado e é descrito abaixo. A caracterização do novo organismo foi feita em parte por comparação para conhecida cepa Clostridium Ijundahlii PETC.

MATERIAIS E MÉTODOS

Organismos. Cepa de Clostridium Ijundahlii PETC foi obtida de uma cultura de carga de frutose mantida pelo Dr. Ralph S. Tanner e usada como a cepa de controle de referência. Cepa Pll foi obtida de um enriquecimento anaeróbico inoculado com sedimento de água fresca do Lago Duck na University of Oklahoma por um procedimento previamente descrito. (Bryant, 1972) sob uma atmosfera de COiN2:C02 (75:15: 10) e um pH inicial de 6,0. O Clostrídio oxidando monóxido de carbono descrito interiormente foi nomeado Clostridium ragsdalei. Essa bactéria foi designada cepa Pll e foi originalmente depositada com American Type Culture Collection, como cepa ATCC BAA-622 e, mais tarde, depositada novamente como ATCC PTA- 7826.

Meios de cultura. O meio de cultura usado nesse estudo foi preparado usando técnica anaeróbica precisa descrita por Balch & Wolfe (1976) e continha os sais minerais, metais de traço e solução de vitamina descritos por Tanner (2002), suplementado com extrato de levedura (1 g/L, Difco) (Tabelas 1-4).

TABELA 1. Solução de carga minerala

Componente g/litro NaCl 80 NH4Cl 100 KCl 10 KH2PO4 10 MgSOWH2O 20 CaCl*2H20 4

a. armazenar a temperatura ambiente TABELA 2. Solução de metais de traçoa

Componente g/litro Acido nitroacético Ajustar pH a 6 com KOH 2,0 MnSO4-H2O 1,0 Fe(NH4)2(SO4)2^H2O 0,8 CoC12*6H20 0,2 ZnSOWH2O 0,2 CuCl2 0,02 NiCl2*6H20 0,02 Na2Mo04*2H20 0,02 Na2SeO4 0,02 Na2WO4 0,02 a. armazenar a 4°C. TABELA 3. Solução de vitamina.3 Componente mg/litro Piridoxina*HCl 10 Tiamina*HCl 5 Riboflavina 5 Pantotenato de cálcio 5 Acido tióctico 5 Acido p-aminobenzóico 5 Acido nicotínico 5 Vitamina B12 5 MESAb 5 Biotina 2 Acido Fólico 2 a. Armazenar a 4°C no escuro. b, Ácido Mercaptoetanossulfônico. TABELA 4. Descrição de meio de cultura para cepa Pl l.a Componente Quantidade por IOOOmL de diH20 Solução mineral 25 mL Solução de metais traço IOmL Solução de vitamina IOmL Extrato de levedura 1,0 g MESb IOg Agente de redução 2,0 mL

a, pH 6,1-6,3

b, ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico.

Exceto para remoção de NaHCO3 e um pH inicial de 6,3, cultivo em substratos orgânicos e gasosos foi realizado como previamente descrito (Tanner et. al., 1993). Resazurina (lmg/L) foi usada como indicador redox. Agar purificado foi adicionado ao meio de cultivo em uma concentração de 2% para descrição de morfologia de colônia (Tabela 5). Substratos lábeis em calor foram esterilizados em filtro (não autoclavado) e adicionados de soluções de carga estéreis para uma concentração final de 5 g/L antes de inoculação. A temperatura ótima e pH (pH inicial) foi determinada em meio de cultura contendo frutose como o substrato. Para determinação do pH ótimo, o meio foi tamponado com HOMOPIPES (homopiperazina-N,N'-bis-2-[ácido etanossulfônico] (Research Organics, Cleveland, OH), MES (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico), ou TES (N- tris [hidroximetil] ácido metil-2-aminoetanossulfônico) a (1,0 g/L). Um inóculo de O3Iml (-2%) de células cultivadas em frutose foi utilizado para iniciar o crescimento. Todos componentes de meios de cultura usados nestes experimentos foram obtidos de Sigma salvo indicação em contrário (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

TABELA 5. Agar nutriente usado para descrição de morfologia de colônia.a

Componente Quantidade por IOOOmL de diH20 Solução mineral 2,5 mL Solução de metais de traço 1,0 mL Solução de vitamina 1,0 mL Extrato de levedura 0,1 g MESb l,0g Agente de redução 0,2 mL

a, pH 6.1-6.3

b, Ácido Mercaptoetanossulfônico.

Reações bioquímicas. Análises bioquímicas para hidrólise de esculina e amido, produção de gelatinase, e produção de indol foram realizadas por procedimentos descritos por Smibert & Krieg (1994). Redução de nitrato foi medida usando um kit de teste CHEMetrics e espectronic 20 D ajustado a 520nm. As células cultivadas em para fase exponencial média a tardia em meio de cultura suplementado com frutose foram usadas para as análises.

Equilíbrio de fermentação. Um equilíbrio de fermentação foi determinado para cultivo em frutose. Frutose foi medida usando uma análise de carboidrato fenol- ácido sulfurico (Dubois et. al., 1956). Acetato e etanol foram medidos simultaneamente por um cromatógrafo a gás (GC) equipado com um detector de ionização de chama (FID) em um Varian 3400 equipado com uma coluna de aço de 2m recheada com 80/120 resina Carbopak B- DA/4% carbowax 20M (Supelco, Bellfonte, PA). As temperaturas de coluna, injetor, detector foram 155, 200, e 200°C, respectivamente. Hélio foi o gás de transporte e a taxa de fluxo foi ajustada em 30 ml min-1. CO2 foi medido com um cromatógrafo a gás equipado com um detector de condutividade térmica (TCD) (Varian, Sugar Land, TX) e uma coluna de aço de 2m Porapak Super Q (Alltech, Deerfield, MI). A temperatura de coluna foi ajustada a 60°C com uma taxa de fluxo de 15ml min-1 e hélio foi o gás de transporte. Microscopia de contraste eletrônico e de fase. Células de fase

exponencial cultivadas em 0,5% de extrato de levedura como substrato foram usadas para microscopia eletrônica de transmissão . Células foram espalhadas em grades de Formvar revestidas de carbono, fixadas com 1 % de glutaraldeído, e coloridas com 0,5% de fosfotunsgato (pH 7,0). Células foram examinadas e fotografadas usando um JEOL JEM 2000 FX TEM. Um microscópio de contraste de fase Olympus CH-2 foi usado para observar células.

Métodos analíticos. Crescimento foi medido espectrofotometricamente a 600nm (Spectronic 20D; Milton Roy) em tubos de vedação de alumínio (Balch & Wolfe, 1976). Para demonstrar que cepa Pll foi capaz de utilizar um substrato, crescimento tinha de ocorrer após transferências consecutivas em tubos replicados. Para o substrato malato, utilização foi analisada por HPLC ("cromatografia líquida de alto desempenho") equipada com um detector de UV ajustado em 214nm usando uma coluna de ácido orgânico Prevail da Alltech, (4,6 χ 150 mm, 5 μιη; Alltech, Deerfield, MI) com uma fase móvel de 25mM KH2PO4, pH 2,5 e 10% (em volume) de metanol.

DNA para análise de % molar de G+C (guanina mais citosina) foi isolado de acordo com o método modificado do procedimento de Marmur (Johnson, 1994) e incluía tratamentos com lisozima, proteinase K e RNase. Um tratamento com lisozima de pelo menos 6 horas foi verificado como sendo mais efetivo. O teor de G+C foi medido por HPLC (Mesbah et al., 1989). Uma coluna de fase reversa Prevail Cl8 de Alltech (4,6 χ 250 mm, tamanho de partícula de 5 μηι; Alltech, Deerfield, DL) foi usada com uma fase móvel de 25mM KH2PO4, pH 2,5 e 4% de (em volume) acetonitrila, e um detector de UV ajustado em 254 nm.

Impressão digital genômica de BOX-PCR. Impressão digital de PCR de DNA repetitiva foi realizada usando o iniciador BOXAIR, obtido de Invitrogen (Carlsbad, CA) e o protocolo de Versalovic et al. (1994). Misturas de PCR continham 2,5μ1 IOX tampão B (500mM de KCl e 100 mM de TriseHCl, Fisher Scientific), 2μ1 de MgCl2«6H20 (25mM, Fisher Scientific), 0,25 μΐ de polimerase Taq (Fisher Scientific), 0,5 μΐ de cada trifosfato de desoxinucleosídeo (10 mM, Promega, Madison, WI), Ιμΐ de iniciador, e DNA de amostra em um volume final de 25 μΐ. A reação de PCR foi realizada em um ciclador de Temperatura Robocycler Gradient 40 (Stratagene, Cedar Creek, TX) usando um protocolo de uma etapa de desnaturação inicial (94°C, quatro min, um ciclo), 30 ciclos de reação (94°C por um min, 5O0C por um min, 12°C por oito min), e uma etapa de extensão final (72°C por oito min). Produto de PCR (10 μΐ) foi ciclado em 5% de gel vertical de poliacrilamida com uma escada de par de bases 100 (Fisher Scientific) por 17 h a 26°C e 120 mAmps. A imagem de gel colorida com brometo de etídio foi analisada usando um sistema de documentação de Imagem Digital de NucleoCam. (Núcleo Tech Corp., San Mateo, CA). Análise de seqüência de rDNA 16S. A análise de seqüência foi realizada de acordo com os procedimentos descritos por Chandler et al. (1997).

Hibridização de DNA. As análises de hibridização de DNA foram realizadas a DSMZ usando os métodos previamente descritos de Wayne et al. (1987). Análise de seqüência de nucleotídeo. Os números de acesso GenBank para as seqüências de gene de rDNA 16s de cepa Pll ATCC BAA- 622 são AYl700378 e DQ20022.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Morfologia celular. Células de cepa Pll foram raramente

capazes de mover, de forma de bastonetes, coloridas gram-positivas, e ocorrer isoladamente ou em cadeias. Células tinham 0,7-0,8 μηι por 4-5 μηι e foram flageladas de modo perítrico (ver Figura 1). Esporos ocorreram raramente, mas quando estavam presentes eram de não intumescimento e localizados subterminais a terminais. Colônias pareceram circulares, translúcidas e planas em ágar nutriente.

Fisiologia. Clostridium ragsdalei foi estritamente anaeróbico. Extrato de levedura estimulou crescimento, embora em sua ausência crescimento marginal foi observado após fase atrasada estendida. Crescimento autotrófico ocorreu com H2/C02 ou CO/CO2 e crescimento quimiorganotrófico foi observado com os seguintes substratos: piruvato, D- treose, xilose, manose, frutose, glicose, sacarose, etanol, 1-propanol, ácidos casamino, glutamato, serina, colina, e alanina (Tabela 6). Malato ou formato inicialmente não suportaram crescimento mesmo quando examinados a uma taxa de pH de 5,0-6,5. Entretanto, após um período de incubação de cerca de trinta dias na faixa de pH testado, C Ijungdahlii estava apto a crescer com malato como fonte única de carbono. Isto é indicativo que este organismo pode requerer adaptação a malato sob as condições testadas. Exigências similares foram mostradas com C. Ijungdahlii quando cultivado em glicose. Tabela 6 mostra uma comparação entre cepa Pl 1 e cepa PETC de Clostridium Ijungdahlii e seu crescimento em substratos como fontes únicas de carbono e energia. TABELA 6. Comparação de utilização de substrato por cepa Pll de

Clostridium ragsdalei e cepa PETC de Clostridium Ijungdahlii

Substrato C. ragsdalei C. Ijungdahlii H2/C02 + + CO + + Na-formato - - Na-acetato - - Na-Lactato - - Acido glicólico - - Na-Piruvato + + Na-proprionato - - Na-Sueeinato - - Na-Citrato - +* Aeido málico - - Na-Fumarato - _* Aeido maléico - - Aeido glucônico - _T Laetose - - D(-) Treose + + L(+) Treose - - Entrose - - Arabinose - _* Xilose + + Manose + + Frutose + + Glueose + + Saearose + +* Fueose - - Ramnose - +t Galaetose - - Maltose - - Melibiose - - Melizitose - - Trealose - - Turanose - - Metanol - - Etanol + + Isopropanol - - 1 -Propanol + +T Butanol - +t Glieerol - - Manitol - - Sorbitol - - Inositol - - Celibiose - - Inulina - - Amigdalina - - Salieina - - Celulose - - Amido - - Glicogênio - - Pectina - - Acido trimetoxibenzóico - - alfa-cetoglurarato - + Aminoácidos Casaminoácidos + + Arginina - + Glutamato + +T Histidina - +τ Glutamina - - Serina + +t Colina + Betaína - - Alanina + +*

+, positivo (indica um ODóOO final maior que ou igual a 0,1.)

negativo (indica um ODóOO final menor do que o controle negativo) *, resultado diferente previamente relacionado (Tanner, 1993). f, resultados desse estudo

Cepa Pll cresceu otimamente em uma pH inicial 6,3; crescimento ocorreu em valores de pH inicial entre 4,0 e 8,5 (Figura 2). Quando cultivada em meios de cultura não tamponados com um pH inicial de 6,3, um pH final de 4,1 foi medido. A temperatura ótima para crescimento foi 37°C (Figura 3); a faixa de temperatura em que Pl 1 cresceu foi 18-37°C.

O tempo de duplicação para cepa Pll quando cultivada com frutose e CO sob condições ótimas foi 0,143 h"1 e 0,175 h"1 respectivamente. Entretanto, quando cultivada com xilose o tempo de duplicação decaiu significativamente (0,220 h"1), indicando que xilose pode ser a fonte de carbono e energia preferida de cepa P11.

Cepa Pll produziu 2,35 mmol de ácido acético de 1 mmol de frutose; em adição, 0,63 mmol de CO2 e 0,5 mmol de etanol foram produzidos como produtos finais (Tabela 7). Outros organismos acetogênicos, Acetobacterium woodii, Aeetobaeterium wieringae e Acetobaeterium earbinolieum também foram observados para produzir etanol durante a fermentação de hexoses (Buschhorn et. al., 1989). Acetato foi o único produto formado em quantidades significantes quando cultivado em H2/CO2, indicando que C. ragsdalei mais que provavelmente utiliza a coenzima acetila A (acetil-Co-A) via Wood/Ljungdahl (Drake 1994).

TABELA 7. Equilíbrio de fermentação de cepa Pl 1 com frutose._

Substrato Rendimento Carbono Valor Valor O/R H H disponível e Produtos mo 1/100 mol (mols) O/R (mo 1/100 disponível (mol/100 de substrato mol) mol) Frutose 100 600 0 - 24 2400 Acetato 222 444 0 - 8 1776 CO2 59 59- +2 +118 0 0 Etanol 48 96 -2 -96 12 576 Total 599 0 +118, -96 2400/2352

% de carbono recuperado, 99,8 % de hidrogênio recuperado, 98 % de oxigênio recuperado, 100

Impressão digital genômica de BOX-PCR. O resultado da eletroforese de gel de produtos PCR de C. Ljungdahlii e cepa Pll foram comparados (não mostrado). Ambos tinham uma banda de aproximadamente 1.310 pares de base em tamanho, uma banda de aproximadamente 1.210 pares de base em tamanho, uma banda de aproximadamente 980 pares de base em tamanho, uma banda de aproximadamente 820 pares de base em tamanho, uma banda de aproximadamente 400 pares de base em tamanho em comum. C. Ijungdahlii também tinha bandas de produto PCR de 2.000 pares de base, 1.770 pares de base, 1.410 pares de base, 1.370 pares de base, 1.260 pares de base, 1.040 pares de base, 680 pares de base, e 360 pares de base em tamanho. Cepa Pl 1 tinha uma banda única de 1.500 pares de base. Assim, estas duas clostridias foram prontamente mostradas

como sendo diferentes usando esta técnica. Apesar da impressão digital genômica não são um substituto para hibridização DNA-DNA, o uso desta técnica pode ser uma ferramenta valiosa para muitos laboratório desejando distinguir cepas bacterianas intimamente relacionadas. Análise genética. A análise filogenética das seqüências de

gene 16S rDNA de Pll indicou que o organismo pertencia ao agrupamento I de gênero Clostridium (Collins et. al., 1994) essencialmente grupo I de Johnson & Francis (1975). Neste agrupamento, cepa Pll estava localizada dentre de uma unidade de cinco outras Clostridia; C. Ijungdahlii, C. tyrobutyricum, C. magnum, C. pasteurianum, e C. scatologenes. A seqüência de 16S rDNA de cepa Pll era a mais similar (99,9%) à de Clostridium Ijungdahlii ATCC M59097 (Figura 4), um acetogênio também capaz de crescer em CO (Tanner et. al., 1993).

Devido à elevada similaridade com 16S rDNA entre a cepa Pll e C. Lungdahlii, um estudo de hibridização DNA-DNA foi realizado. O valor determinado foi de 57 por cento, claramente indicando que a cepa Pl 1 era uma nova espécie. % molar G+C do DNA foi 29-30% (n = 5), também similar à espécie de Clostridium intimamente relacionada.

Este exemplo mostra que este exemplo mostra que Clostridium ragsdalei cepa P11 é uma nova espécie distinta, com base tanto nas diferenças fenotípicas para C. Ijungdahlii como espécies relacionadas, e o padrão claro de ter menos do que 70% de parentesco DNA-DNA (Wayne et al., 1987). EXEMPLO 2.

O estudo de melhorar, maximizar ou minimizar os efeitos, e alguns aspectos já encontrados como estando contidos dentro de um organismo sem mudar suas propriedades inerentes para obter o resultado o mais desejável pode ser definido como otimização. Os estudos de otimização são um elemento chave no desempenho de estratégias para melhorar o crescimento assim como a produção de um produto de fermentação desejado. No caso dos Requerentes, etanol é o produto final desejado. MATERIAIS E MÉTODOS

Cepa bacteriana e meios de cultivo. Cepa clostridiana Pll foi usada em todo o estudo. O meio de monóxido de carbono (COM) foi usado para cultivar e manter a cultura. A temperatura de crescimento foi 37°C. COM é um meio tamponado não definido inicialmente pressurizado a 70 kPa com N2/C02 e então autoclavado durante 15 min a 121°C. O meio contida por litro de água destilada: 25 ml solução mineral (tabela 1), 10 ml solução de metais de traço (tabela 2, 10 ml solução vitamina (tabela 3), l,0g de extrato de levedura, 10 g de MES ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico) 0,001 g resazurina, 4,0 g cisteína · HCl, e 4,0 Na2S*9H20, o pH inicial deste meio foi 6,1-6,3. O meio oi preparado usando técnica anaeróbica estrita (Balch & Wolfe, 1976). O monóxido de carbono foi o único substrato provido a 210 kPa. Salvo especificado em contrário, todas as experiências de crescimento foram conduzidas sob uma pressão de 210 kPa com CO como o único ou substrato primário e foram incubados horizontalmente para maximizar a difusão de gás no meio. O tamanho do inoculo padrão foi cerca de 2% (v/v) transferido de uma cultura de carga que estava crescendo em fase exponencial média a tardia, salvo especificado em contrário.

Métodos analíticos. O crescimento foi medido espectrofotometricamente a 600 nm (Spectronic 20D, Milton Roy) em tubos de vedação de alumínio(Balch & Wolfe, 1976. Acetato e etanol foram medidos simultaneamente por um cromatógrafo a gás (GC) equipado com um detector de ionização de chama (FID) em um Varian 3400 equipado com uma coluna de aço de 2m recheada com 80/120 resina Carbopak B-DA/4% carbowax 20M (Supelco, Bellfonte, PA). As temperaturas de coluna, injetor, detector foram 155, 200, e 200°C, respectivamente. Hélio foi o gás de transporte e a taxa de fluxo foi ajustada em 30 ml min-1. A concentração de íon hidrogênio foi medida por eletrodo.

Estudos de inibidor metabólico. Soluções de carga anaeróbica esterilizadas em filtro de fluoroacetato (FA) e trifluoroacetato (TFA) (Sigma Chemical Co.) foram preparadas a concentrações finais de 4.5M. antes da preparação, os pós de FA e TFA foram deixados assentar durante a noite em béqueres pequenos na câmara anaeróbica para deixar qualquer oxigênio aprisionado difundir do pó. As concentrações finais na faixa de 5 mM a 210 mM foram testadas para tentar determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e a concentração a mais efetiva para inibir a acetogenese para produção de etanol máxima com relação ao rendimento de crescimento. Os inibidores foram geralmente adicionados ao meio um dia antes da inoculação com Pll para assegurar que a anaerobicidade estava mantida. Todas as adições foram feitas de modo anaeróbico por seringa. Durante este estudo, o crescimento foi medido periodicamente por espectroscopia. Para o final da fase de células em repouso, amostras líquidas ( 1 mL) foram tomadas e armazenadas congeladas (-20°C) até serem analisadas por GC e HPLC.

Culturas em batelada semi-contínua. As experiências de cultura em batelada a longo prazo e semi-contínua foram realizadas com garrafas de soro de 500 mL contendo entre 100-200 mL de COM não corrigido. COM corrigido a pH de 5,5 foi também adicionado para observação junto com uma cultura cultivada em condições de agitação (50 rpm). As culturas foram mantidas por troca de meio de líquido gasto com novo COM não corrigido e corrigido e a adição/troca de H2/C02 para atmosfera e CO a cada 7-10 dias. CO foi adicionado a pelo menos 210 kPa. Durante a troca do meio, as medidas de pH e crescimento foram tomadas e as amostras de líquido (1,0 mL) foram tomadas dai e armazenadas congeladas (- 20°C) até etanol e acetato serem analisados por GC e HPLC.

Tolerância a etanol. O efeito de etanol em metabolismo de CO e produção de solvente foi investigado com cepa Pl 1. A concentração máxima inicial em que a cepa P11 pode sobreviver foi determinada durante o curso destes estudos. Os tubos de Balch com COM contendo concentrações de etanol na faixa de 15- 35 g por litro foram inoculados com Pll e o crescimento foi medido durante aproximadamente 10 dias. As amostras líquidas (1,0 mL) foram extraídas uma vez que as células permaneceram em fase estacionária e armazenadas congeladas (-20°C) até serem analisadas por GC e HPLC. Após uma concentração de etanol máxima para sobrevivência das células ser determinada, as experiências de cultura em batelada semi- contínua foram conduzidas usando garrafas de soro de 500 mL contendo entre 100-200 mL de COM contendo concentrações diferentes de etanol (20, 30, 40 e 50 g/L) para adaptar a cepa Plla condições de elevado teor de solvente . O COM corrigido com etanol foi preparado por adição de etanol esterilizado em filtro para tubos Balch pré-esterilizados, e então purgando com N/C02 para remover oxigênio. Após o meio ser esterilizado, o etanol foi então adicionado às concentrações apropriadas. Estes frascos foram inoculados com as células Pll das culturas em batelada semi-contínuas e já foram estabelecidos acima. O crescimento e pH foram medidos periodicamente. Uma porção do meio extraído para estas medidas foi tomada para análise de etanol e concentrações de acetato.

Metais de traço. Ferro (Fe), molibdênio (Mo), cobalto (Co), cobre (Cu) e níquel (Ni) foram examinados em várias concentrações para determinar seu efeito em rendimento do crescimento e produção de etanol. Os tubos em triplicata de meio não corrigido (IX) e corrigido (0X e 10X) foram inoculados com cepa Pll onde cada um destes metais de traço individuais foram adicionados ou eliminado com o COM a 10 X e OX da concentração de metal original. As culturas foram alimentadas cada 48 h com CO.

Isto também foi completado em duplicata em frascos de soro de 160 mL para similar condições de batelada em escala pequena. As soluções de carga foram preparadas para cada um dos metais acima e adicionadas durante a preparação do meio antes da ebulição e desgaseificação. Para minimizar o transporte de metal e exaurir as quantidades de metais presentes nas células para as concentrações de teste de metais 0 μΜ, pelo menos 6 transferidos foram feitos antes das experiências de crescimento começarem. A fim de adaptar as células nas maiores concentrações de metais, pelo menos 2 transferências foram feitas para cada configuração. Esta experiência foi realizada em triplicata e o crescimento foi medido durante 7 dias após o que as análise de pH e concentração de etanol foram completadas. Extrato de levedura. Várias concentrações de extrato de levedura na faixa de 0 - 2,0% foram examinadas para determinar seu efeito sobre o crescimento e produção de etanol. O crescimento foi medido durante um período de 7 dias e o pH e concentração de etanol determinados na conclusão da experiência. O extrato de levedura foi examinado nas seguintes concentrações percentuais: 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2. CO foi o substrato primário e a fonte de carbono. Cepa Pll foi adaptada para as menores concentrações como acima por uso de pelo menos seis transferências consecutivas e pelo menos duas transferências consecutivas para as maiores concentrações.

pH. Estudos de pH ótimo foram completados para determinar as melhores condições para a melhora da produção de etanol a partir de metabolismo de CO. Para determinação do pH ótimo, meios foram tamponados com HOMOPIPES (homopiperazina-N,N'-bis-2-[ácido etanossulfônico] (Research Organics, Cleveland, OH), MES (2-[N-morfolino] ácido etanossulfônico, ou TES (N-tris [hidroximetil] metil-2-ácido aminoetanossulfônico) a (1,0 g L-I). Um inóculo de O.lml (-2%) de células cultivadas em CO em fase estacionária foi usado para iniciar o crescimento. Todos os componentes do meio usados nestas experiências foram obtidos de Sigma, salvo especificado em contrário (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Ao completar estas experiências, pH foi determinado e as concentrações de etanol e acetato foram analisadas.

Dois conjuntos de experiências foram realizados com relação ao pH. A primeira experiência de pH foi realizada em tubos Balch e o crescimento foi examinado durante 5 dias sem manter o pH. O segundo foi realizado em frascos de soro pequenos (120 mL) para determinar o pH ótimo para a produção de etanol. No segundo ajuste, o pH foi controlado pela adição de IN HCl ou IN NaOH esterilizado.

RESULTADOS

Inibidores metabólicos - FA/TF A. O MIC estabelecido para fluoroacetato (FA) e trifluoroacetato (TFA) foi 100 mM e 150 mM respectivamente. As tendências definitivas não foram estabelecidas com Pll para produção de etanol e acetato na presença de FA e TFA nas várias concentrações testadas (ver tabela 8). Quando cultivados em COM contendo 20 mM FA, não foram observadas diferenças significantes no rendimento de crescimento (OD) ou produtos finais com relação ao controle de Pl 1. No entanto, na presença de 30 mM FA e acima, a produção de acetato diminuiu quase 90 por cento e a produção de etanol e o rendimento do crescimento diminuíram cinqüenta e quarenta por cento, respectivamente. A relação de etanol para acetato aumentou oitenta por cento.

Quando cultivado em COM contendo 30 mM TFA, se notou um aumento de 126 e 52 por cento no etanol e acetato produzidos respectivamente, apesar da relação de solvente para ácido somente aumentar levemente (50%). O rendimento do crescimento permaneceu inalterado. Isto sugere que o fluxo de carbono foi mudado de produção de ácido para solvente para ambos os inibidores usados, somente afetando o crescimento no caso de FA.

TABELA 8 - OD e ETOH finais e produção de acetato com e sem inibidores metabólicos

Produto final controle Pl 1 Pll com 15 Pll controle Pll com 60 FA mM FA TFA mM TFA OD final 600 0,788 0,741 0,694 0,641 Etanol (mM) 38,91 39,62 39,05 45,60 Acetato (mM) 445, 86 48,72 45,18 34,58

Culturas em batelada semí-contínua

O rendimento do crescimento de Pll permaneceu estável ou aumentado durante a monitoração em todo o período de quatro meses. Após corrigir para diluição, o rendimento do crescimento para uma cultura de P11 alcançou 2,4 OD unidades. O pH para todas as culturas foi consistentemente medido em torno de 4,3. O COM corrigido (pH 5,5) obteve o maior rendimento de etanol a 252 mM (11,6 g/L) e relação de etanol para acetato, enquanto o maior rendimento de etanol não corrigido foi 95 mM (4,4 g/L). Um aumento na concentração de acetato e uma diminuição na produção de etanol foi a tendência geralmente exibida em culturas durante o período de tempo (um indicador possível de degeneração da cepa). A exceção foi a cultura de Pl 1 iniciada a um pH de 5,5 (dados não são mostrados).

Tolerância a etanol

Cepa Pll foi cultivada em COM corrigido com 15, 20, 25, 30 e 35 g/L e verificada como sendo inicialmente tolerante a concentrações de etanol de até 30 g/L com a concentração inibitória mínima sendo 35 g/L. O crescimento foi retardado na presença de todas as concentrações de etanol com relação ao controle não corrigido sem etanol. O crescimento mensurável não foi obtido para as culturas corrigidas até 48 h, exceto para a cultura corrigida de 25 g/L que cresceu em 96 h (dados não mostrados). O melhor crescimento na maior concentração de etanol ocorreu a 20 g/L.

Usando a cultura crescendo na presença de concentração de 20 g/L e a cultura em batelada semi-contínua foi iniciada e mantida. Uma vez que a cultura foi estabelecida a 20 g/L, uma tentativa para adaptar a mesma a g/L foi feita com sucesso. Este processo de adaptação continuou até a concentração de 50 g/L ser alcançada. Após este ponto, a cultura não foi capaz de ser estabelecida em concentrações acima de 50 g/L, apesar de várias tentativas serem feitas. O crescimento na concentração de 50 g/L não foi capaz de ser mantido acima de 0,55 unidades OD, mas permaneceu próximo deste nível em toda a monitoração. A produção de acetato e etanol apresentou resultados mistos em todo a monitoração e, assim, tendências definitivas não foram estabelecidas com estas culturas.

Metais de traço

Os efeitos da eliminação e adição de metal em metabolismo de CO em Pll foram testados. A eliminação de Fe, Co, Cu e Ni limitou o metabolismo de CO. No entanto, na ausência de MO, o metabolismo de CO aumentou levemente. Os níveis aumentados de Mo, Fe, Co, Cu, e Ni (200 μΜ, 80 μΜ, 12 μΜ e 8 μΜ respectivamente) estimularam o metabolismo de CO, e isto foi especialmente notável após uma alimentação de 48 h (dados não mostrados).

A relação de solvente para ácido melhorou com a eliminação

de todos os metais, exceto Mo. No caso de eliminação de Fe e Ni, se tem um aumento próximo de 300 e 400 por cento na relação de solvente para ácido. A eliminação de Co e Cu diminuiu a produção de acetato, aumentando a relação de solvente para ácido, enquanto a eliminação de Mo aumentou a produção de acetato.

Extrato de levedura

Inicialmente, a cepa Pll não cresceu na construção de extrato de levedura de 0% e a experiência de crescimento foi somente conduzida com as outras concentrações mencionadas acima. No entanto, após quase quatro semanas, evidência de crescimento foi observada. A partir deste ponto, transferências foram feitas a cada uma a duas semanas, e os tubos iniciais foram realimentados com CO. Pelo menos 15 transferências foram feitas. Assim, Pll pode ser adaptado para crescer na ausência do componente de meio completo extrato de levedura. Efeitos de pH ótimo sobre a produção de etanol

Crescimento e a relação de álcool: ácido foram medidos. O pH ótimo para metabolismo de CO e produção de etanol em C. ragsdalei foi determinado como estando entre 5,5 e 6,0. A relação de etanol : acetato para as culturas com pH inicial de 5,5 e 6,0 foi de 0,7: 1 e 0,6: 1, respectivamente. DISCUSSÃO

FA/TFA

Previamente, uma concentração 50 mM de fluoroacetato tinha mostrado inibir o crescimento de clostrídio termofílico (Rothstein 1986). A importância dos dados apresentados aqui é que eles mostraram um aumento na produção de etanol por Pl 1 na presença de fluoroacetato e trifluoroacetato quando comparados com as cepas de controle mantidas em condições idênticas.

Cepa Pll foi inibida por etanol a uma concentração de 30 gramas por litro quando de isolamento inicial. As culturas foram adaptadas para tolerar maiores concentrações de etanol por adaptação, similar às técnica anterior de adaptação em Yamano et al, 1998. Até agora, a cultura foi adaptada para funcionar completamente em uma concentração de etanol de 50 gramas por litro de etanol. Este exemplo mostra que procedimentos de adaptação usados na microbiologia industrial podem ser usados para melhorar o desempenho de cepa Pll como um catalisador microbiano para a produção de etanol e/ou ácido acético.

REFERENCIAS, cada uma sendo aqui incorporada por

referência.

Balch, W.E. & R.S. Wolfe. (1976). New approach to the cultivation of methanogenic bactéria: 2-mercaptoethanosulfonic acid (HS- CoM)-dependent growth of Methanobacterium ruminantium in a pressurized atmosphere. Appl Environ Microbiol 32, 781-791.

Bredwell, M.D., Srivastava, P., & Worden, R.M. (1999). Reactor design issues for synthesis-gas fermentations. Biotechnol Prog 15, 834-844.

Bryant, M.P. (1972). Commentary on the Hungate technique for culture of anaerobic bactéria. Am Journ Clin Nutrition 25, 1324-1328.

Buschhorn, H., Durre, P., & Gottschalk. (1989). Production and utilization of ethanol by the homoacetogen Acetobacterium woodii. Appl EnvironMicrobiol 55, 1835-1840.

Collins, M.D., Lawson, P.A., Willems, A., Cordoba, J. J., Fernandez-Garayzabal, J., Garcia, P., Cai, J., Hippe, H. & Farrow, J.A.E. (1994). The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. Int J Syst Bacteriol 44, 812-826.

Drake, H.L. (1994). Acetogenesis, acetogenic bactéria, and the acetyl-CoA "Wood/Ljungdahl" pathway: past and current perspectives. In Acetogenesis, pp. 3-60. Edited by H.L. Drake. New York: Chapman and Hall.

Dubois, M., K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, and F.

Smith. 1956.

Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350-356.

Johnson, J.L., & B. S. Francis. (1975). Taxonomy of the Clostridia: ribosomal ribonucleic acid homologies among the species. J Gen Microbiol 88, 229-244.

Johnson, J.L. (1994). Similarity analysis of DNAs. In Methods for General and Molecular Microbiology, pp. 655-682. Edited by P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W.A. Wood, and N. R. Krieg. Washington, DC: American Society for Microbiology.

Klass, Donald L. (1998). Biomass for renewable energy, fuels, and chemicals. San Diego, CA: Academic Press.

Licht, F.O. (2001). World Ethanol Markets, Analysis and Outlook, p. 17. Kent, United Kingdom: F.O. Licht Mesbah, M., Premachandran, U., & Whitman, W.B. (1989).

Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high- performance liquid chromatography. Int J Syst Bacteriol 39, 159-167.

Rothstein, D. M. 1986. Clostridium thermosaccharolyticum strain defícient in acetate production. J. Bacteriol. 165:319-320. Smibert, R. M., & Krieg, N. R. (1994). Phenotypic

Characterization. In Methods for General and Molecular Microbiology, pp. 611-654. Editado por P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W.A. Wood, e N. R. Krieg. Washington, DC: American Society for Microbiology.

Tanner, R.S., Miller, L.M., & Yang, D. (1993). Clostridium Ijungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. Int J Syst Bacteriol 43, 232-236.

Tanner, R.S. (2002). Cultivation of bactéria and fungi. In Manual of Environmental Microbiology, pp. 62-70. Edited by CJ. Hurst, Crawford, R.L., G.R. Knudson, MJ. Mclnerney, & L.D. Stetzenbach. Washington, DC: American Society for Microbiology.

Versalovic, J., Schneider, M., de Bruihn, FJ. & Lupski, J.R. (1994). Genomic fingerprinting of bactéria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods MoI Cell Biol 5, 25-40.

Wayne, L.G., Brenner, DJ., Colwell, R.R., Grimont, P.A.D., Kandler, O., Krichevsky, M.I., Moore, L.H., Moore, W.E.C., Murray, R.G.E., Stackebrandt, E., Starr, M.P. & Trüper, H. G. (1987). Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int J Syst Bacteriol 37, 463-464.

Yamano, L. P., S. W. York, e L. O. Ingram. 1998. Isolation and characterization of ethanol-tolerant mutants of Eseherichia coli KOl 1 for íuel ethanol production. J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 20:132-138.

Zeikus, J.G. (1980). Chemical and fuel production by anaerobic bactéria. Annu Rev Microbiol 34, 423-464.

Apesar da invenção ter sido descrita em termos de suas formas de realização preferidas, os versados na técnica irão reconhecer que a invenção pode ser praticada com modificação dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas. Assim, a presente invenção não deve ser limitada às formas de realização como descritas acima, mas deve ainda incluir todas as modificações e equivalentes da mesma dentro do espírito e escopo da descrição aqui provida.

Claims

1. Cultura biologicamente pura de microorganismo Clostridium ragsdalei, caracterizada pelo fato de ter todas as características de identificação de ATCC Nos. BAA-622 ou PTA-7826.

2. Composição para produzir etanol, caracterizada pelo fato de compreender: uma fonte de CO, e Clostridium ragsdalei.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que referida fonte de CO é singás.

4. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de: combinar uma fonte de CO e Clostridium ragsdalei sob condições que permite referido

5. Sistema de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ainda compreendClostridium ragsdalei converter CO em etanol.

6. Sistema para produzir etanol, caracterizado pelo fato de compreender: um vaso em que uma fonte de CO é combinada com Clostridium ragsdalei, e um controlador que controla as condições no referido vaso que permitem referido Clostridium ragsdalei converter referido CO em etanol. er: um segundo vaso para produzir singás, e um transporte para transportar referido singás para referido vaso, em que referido singás serve como referida fonte de CO.