DE102009046623A1

DE102009046623A1 - Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologen Proteins zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase

Info

Publication number: DE102009046623A1
Application number: DE102009046623A
Authority: DE
Inventors: Liv Reinecke; Steffen Dr. Schaffer; Tim Dr. Köhler; Anja Thiessenhusen; Achim Dr. Marx; Markus Dr. Buchhaupt
Original assignee: Evonik Roehm GmbH
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2011-05-12
Also published as: WO2011057871A2; US20120264182A1; DE112010004358A5; BR112012011305A2; MX2012005367A; RU2012123725A; WO2011057871A3; US8980594B2; CN102770445A; ZA201203421B; CA2780529A1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologen Proteins zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, ein Fusionsprotein umfassend eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase und eine zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz sowie ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure.

Description

Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologen Proteins zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, ein Fusionsprotein umfassend eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase und eine zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz sowie ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure.
Stand der Technik
2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIB) kann als Ausgangsstoff durch Dehydratisierung in Methacrylsäure, einen kommerziell bedeutenden Rohstoff, umgewandelt werden. Dies begründet eine gewerbliche Anwendbarkeit.
Die WO 2007/110394 beschreibt ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren aus 3-Hydroxycarbonsäuren, wobei eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase-Aktivität aufweisende Einheit, welche sowohl 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester produzierende als auch 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Ester isomerisierende Aktivität besitzt und die die Umwandlung von 3-Hydroxycarbonsäure in die entsprechende 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure bewirkt, eingesetzt wird. Die cobalaminabhängigen Mutasen, welche als geeignete 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase-Aktivität aufweisende Einheiten genannten sind, sind solche aus HCM-10 (DSM 18028), Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8 (Stammsammlung des UFZ Leipzig), Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) oder Nocardioides sp. JS614.
Der rekombinante Einsatz zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure der in der WO 2007/110394 beschriebenen 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen in Zellen, bei denen die 2-Hydroxy-2-Methylcarbonsäuren über Acetoacetyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A als Vorprodukt erfolgt, wird in der DE 10 2008 002 715 beschrieben; hier werden als weitere, geeignete 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen solche genannt, die sich aus Aquincola tertiaricarbonis L108, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen.
Stromaufwärts im A. tertiaricarbonis Genom vor dem die große Untereinheit der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase kodierenden Gen hcmA liegt ein, das im Folgenden auch als MeaB bezeichnetes, putatives Protein mit bisher unbekannter Funktion kodierendes Gen. Sequenzvergleiche zeigen Übereinstimmungen mit Enzymen, die eine ATPase/GTPase-Funktion besitzen.
Den beschriebenen enzymatischen Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure ist gemein, dass die Ausbeuten gering sind, da die enzymatischen Umsatzraten niedrig sind.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure bereitzustellen, welches mit höheren Ausbeuten aufwartet.
Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebene Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenzen sowie das im Folgenden beschriebene Fusionsprotein einen Beitrag zur Lösung der Aufgabe leistet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologen Proteins zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Fusionsprotein umfassend eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase und eine zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe leistet die Verwendung eines Proteins umfassend eine zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu einem MeaB-Protein zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase.
Unter einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, im Folgenden als Hcm abgekürzt, wird ein Enzym verstanden, welches die Umsetzung von 3-Hydroxycarbonyl-CoA-Estern zu den entsprechenden 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäure-CoA-Estern, insbesondere von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert.
Unter dem Begriff „MeaB-Protein” wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Protein verstanden, welches ausgewählt ist aus der Gruppe der als Accession-Nummer angegebenen Proteine bestehend aus:
Sequenz ID Nr. 1 (Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),
YP_001023545 (Methylibium petroleiphilum PM1),
YP_001409454 (Xanthobacter autotrophicus Py2),
YP_001045518 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029),
YP_002520048 (Rhodobacter sphaeroides),
AAL86727 (Methylobacterium extorquens AM1),
CAX21841 (Methylobacterium extorquens DM4),
YP_001637793 (Methylobacterium extorquens PA1),
AAT28130 (Aeromicrobium erythreum),
CAJ91091 (Polyangium cellulosum),
AAM77046 (Saccharopolyspora erythraea) und
NP_417393 (Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655).
Genannte Sequenzidentitäten werden bestimmt nach dem blastp Algorithmus mit einem expect threshold von 10, einer Word size von 3, einer blosum62 Matrix mit gap costs von existence: 11 und extension: 1 und einem conditional compositional score matrix adjustment.
Proteinsequenzen von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100%, zu einem MeaB-Protein werden im Folgenden auch als „zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenzen” bezeichnet.
Unter dem Begriff „2-Hydroxyisobuttersäure” bzw. „3-Hydroxybuttersäure” sind insbesondere deren Salze zu verstehen, als auch protonierte Formen, wie auch Polyhydroxyalkanoate, welche aus Monomeren der jeweiligen Säure aufgebaut sind.
Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent.
Es ist dem Fachmann offenbar, dass durch hier angegebene Nukleotidsequenzen oder Verweise auf konkrete, bereits offenbarte Gene die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind, ermöglicht wird, um etwa weitere MeaB-Proteine bzw. hcm zu identifizieren, die hier nicht explizit erwähnt sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten” Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Nukleinsäuresequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen, z. B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit einer erfindungsgemäßen Mutase oder ATPase/GTPase in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der genannten Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden.
Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart, DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen.
Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50–70°C, vorzugsweise 60–65°C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1 × SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20 × SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z. B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6. beschrieben.
Unter der erfindungsgemäßen Verwendung des Proteins umfassend zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz wird insbesondere die Verwendung in einem Mikroorganismus oder in einem Zellextrakt desselben verstanden.
Hierbei ist es bevorzugt, dass das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz im Vergleich zu dem Wildtyp des Mikroorganismus im Mikroorganismus verstärkt vorliegt.
Unter „verstärkt vorliegen” wird auch verstanden, dass der Wildtyp vor der Modifikation keine das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz aufweist.
Dieses verstärkte Vorliegen wird bevorzugt durch Einbringen einer exogenen Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz erreicht.
Daher wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter dem „Wildtyp” der Ausgangsmikroorganismus verstanden, wie er vor Einbringen der exogenen Nukleinsäure in den Mikroorganismus vorlag.
Grundsätzlich lässt sich das verstärkte Vorliegen dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz kodieren, einen starken Promotor verwendet und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die exogene Nukleinsäure stellt bevorzugt einen Expressionsvektor, insbesondere einen extrachromosomal replizierenden, dar, bei welchem ein Promotor die Expression des Proteins umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz sicherstellt.
Ebenso bevorzugt kann die exogene Nukleinsäure eine Integration der Nukleinsäuresequenz kodierend für das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz in das Genom des Mikroorganismus bewirken. Hierbei ist es denkbar, dass die Expression des Proteins umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz durch dem Organismus eigene Promotoren sicherstellt wird oder aber auch die integrierte Nukleinsäure selber einen auf die Expression des Proteins umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz aktiv wirkenden Promotor mitbringt.
Entsprechende Expressionsvektoren und Integrationskassetten sind dem Fachmann für die jeweiligen Zielorganismen bekannt. Alternativ kann ebenso in der erfindungsgemäßen Verwendung in einem Zellextrakt eines Mikroorganismus das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz verstärkt vorliegen, etwa durch direktes Hinzugeben des Proteins oder durch Hinzugabe eines in-vitro-Translationsansatzes für das Protein zu dem Zellextrakt.
Das verstärkte Vorliegen des Proteins umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz im Vergleich zu dem Wildtyp kann mit herkömmlichen Methoden bestimmt werden. Die Proteinkonzentration kann somit durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647), analysiert werden.
Es ist bevorzugt, dass bei der erfindungsgemäße Verwendung in einem Mikroorganismus oder in einem Zellextrakt desselben der Mikroorganismus ebenso wie oben für das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz beschrieben die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase verstärkt vorliegt. Dasselbe gilt für das verstärkte Vorliegen des Proteins im Zellextrakt.
In diesem Zusammenhang sind bevorzugte Mikroorganismen solche, die unten im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure beschrieben sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen, die sich aus den Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere bestehend aus Aquincola tertiaricarbonis L108, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18028, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638, Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces coelicolor isolieren lassen, besonders bevorzugt werden die in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Coenzym B12-abhängigen Mutasen.
Bevorzugte 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen sind in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information zu finden unter den Accession Nummern
ABM97311 und ABM97308.1 (M. petroleiphilum PM1)
YP_001045519 und YP_001045516 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029)
YP_001409455 und YP_001409452 (Xanthobacter autotrophicus Py2)
YP_923327 und YP_923324 (Nocardioides sp. JS614)
YP_001313797 und YP_001313799 (Sinorhizobium medicae WSM419)
ZP_01035346 und ZP_01035348 (Roseovarius sp. 217)
NP_579206 (Pyrococcus furiosus DSM 3638)
ZP_01892066 und ZP_01892069 (Marinobacter algicola DG893)
AAC08713 und CAB59633 (Streptomyces cinnamonensis),
CAB40912 und NP_628957 (Streptomyces coelicolor A3(2))
sowie insbesondere Sequenz ID Nr. 21 und Sequenz ID Nr. 22, (unvollständig angegeben als ABD93936 und ABD93937, A. tertiaricarbonis DSM 18512).
In diesem Zusammenhang erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen weisen eine Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz der kleinen bzw. großen Untereinheit der in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Mutase (Sequenz ID Nr. 21 und Sequenz ID Nr. 22) von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere 100% auf Aminosäureebene auf.
Erfindungemäß bevorzugt lässt sich die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz ableiten aus der Gruppe bestehend aus:
Sequenz ID Nr. 1 (Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),
YP_001023545 (Methylibium petroleiphilum PM1),
YP_001409454 (Xanthobacter autotrophicus Py2),
YP_001045518 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029),
YP_002520048 (Rhodobacter sphaeroides),
AAL86727 (Methylobacterium extorquens AM1)
Es ist erfindungsgemäße besonders bevorzugt, dass die zu MeaB homologe Proteinsequenz dieselbe Anzahl Aminosäuren umfasst, wie das einschlägige MeaB-Protein selber.
Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden die Proteine umfassend eine zu einem MeaB-Protein homologen Proteinsequenz als im Folgenden beschriebenen erfindungsgemäßen Fusionsproteine, die zu einer Erhöhung der enzymatischen Aktivität der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen führen.
Somit leistet einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe ein Fusionsprotein umfassend eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase und eine Proteinsequenz von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu einem MeaB-Protein.
Unter dem Begriff „Fusionsprotein” wird erfindungsgemäß verstanden, dass in mindestens einem Polypeptidstrang, welcher essentiell für die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase-Aktivität ist, eine zusätzliche Proteinsequenz enthalten ist, welche die notwendigen Sequenzidentitäten zu einem MeaB-Protein aufweist. Da 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen oligomere Proteine darstellen können, ist somit unter dem Begriff „Fusionsprotein” ebenfalls ein Proteinkomplex zu verstehen, der beispielsweise aus mehreren verschiedenen Untereinheiten der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase aufgebaut ist, wobei eine der Untereinheiten die MeaB homologe Aminosäuresequenz zusätzlich aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein um ein isoliertes Fusionsprotein.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Fusionsprotein 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutasen, die im Zusammenhang mit oben genannter erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt sind; dasselbe gilt für bevorzugt in dem erfindungsgemäß enthaltenen zu einem MeaB-Protein homologen Proteinsequenzen.
Die zu MeaB-Proteinen homologe Proteinsequenz kann derart im Fusionsprotein angeordnet sein, dass sie direkt vor der („N-terminal”) 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, bzw. im Falle einer oligomeren 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase direkt vor einer Untereinheit der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, angeordnet ist, oder aber hinter der („C-terminal”) 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase bzw. einer ihrer Untereinheiten.
Bevorzugt ist die zu MeaB-Proteinen homologe Proteinsequenz N-terminal an die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, bevorzugt an die große Untereinheit der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, fusioniert.
Zwischen der zu MeaB-Proteinen homologen Proteinsequenz und der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase können zusätzliche Aminosäuren vorhanden sein. Solche „Linker” können vorteilhaft sein, da Sie die dreidimensionale Anordnung der Proteine beeinflussen können. Zwischen der zu MeaB-Proteinen homologen Proteinsequenz und der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase befindliche Linker weisen 4 bis 20, bevorzugt 6 bis 12, insbesondere 8 Aminosäuren auf. Ein Linker bestehend aus der Aminosäuresequenz Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile, Sequenz ID Nr. 2, hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen.
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Fusionsprotein ist gekennzeichnet durch eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Sequenz ID Nr. 21 und 22 (A. tertiaricarbonis DSM 18512) und
ABM97311 und ABM97308.1 (M. petroleiphilum PM1)
und
an deren große Untereinheit N-terminal eine zu MeaB-Proteinen homologe Proteinsequenz, welche sich ableiten lässt aus der Gruppe bestehend aus
Sequenz ID Nr. 1 (A. tertiaricarbonis DSM 18512),
YP_001023545 (M. petroleiphilum PM1),
fusioniert ist, wobei der Linker aus der Aminosäuresequenz Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile
besteht.
Insbesondere ist ein bevorzugtes Fusionsprotein charakterisiert durch ein heterodimeres Protein umfassend, insbesondere bestehend aus Sequenz ID Nr. 3 und Sequenz ID Nr. 4.
Molekularbiologische Verfahren zur Generierung entsprechender Nukleinsäure-Konstrukte, die für erfindungsgemäße Fusionsproteine kodieren, sind dem Fachmann bekannt und etwa dem Standardwerk „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Third Edition) von Joseph Sambrook et al. zu entnehmen. So lassen sich etwa über PCR-Verfahren die für zu fusionierende Proteinabschnitte kodierenden Nukleinsäuren amplifizieren, mit Endonukleaseschnittstellen versehen und durch Kombination geeigneter Restriktion und Ligation ligieren. Alternativ kann beispielsweise per SOE-PCR (splicing by overlap extension – polymerase chain reaction) Nukleinsäuren generieren, die die beiden kodierenden Gene fusionieren und beispielsweise zusätzlich die Länge des Linkers bestimmen.
Vereinfachend werden heutzutage bereits solche Nukleinsäuren künstlich durch kommerzielle Dienstleister synthetisiert, wobei die Codon-Benutzung bereits in Hinblick auf den zu verwenden Organismus optimiert werden kann.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung eingangs genannter Aufgabe leisten daher isolierte Nukleotidsequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z. B. DNA, cDNA und mRNA) kodierend für erfindungsgemäße Fusionsproteine.
Unter „kodierend für” wird hier der genetische Code mit einer Codon-Verwendung verstanden, wie er beispielsweise in E. coli vorzufinden ist; es sind aber auch Konstellationen denkbar, bei denen eine unkonventionelle Codon-Benutzung wie beispielsweise in Tetrahymena, Plasmodium, Mycobacterium pneumoniae oder Candida tropicalis zu erfindungsgemäßen Fusionsproteinen führen kann. Auch diese Nukleinsäuren gelten als „kodierend für erfindungsgemäßes Fusionsprotein”.
Erfindungsgemäß bevorzugte Nukleinsäuren kodieren für erfindungsgemäß bevorzugte Fusionsproteine.
Insbesondere eine Nukleinsäure mit der Sequenz ID Nr. 5 ist besonders bevorzugt.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der oben gestellten Aufgabe leistet ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure umfassend die Verfahrensschritte:

a) in Kontakt Bringen a1) eines Mikroorganismus oder eines Zellextraktes des Mikroorganismus aufweisend eine enzymatische Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, wobei das Protein umfassend eine zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz im Vergleich zu dem Wildtyp des Mikroorganismus im Mikroorganismus verstärkt oder im Zellextrakt selber verstärkt vorliegt oder a2) einer ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein aufweisenden Einheit mit einem wässrigen Medium beinhaltend 3-Hydroxybuttersäure, sowie gegebenenfalls
b) Aufreinigung der 2-Hydroxyisobuttersäure aus dem wässrigen Medium oder aus der das Fusionsprotein aufweisenden Einheit.

Es ist offenbar, dass auch Mischungen verschiedener Mikroorganismen oder Extrakte derselben gemäß a1), Mischungen verschiedener erfindungsgemäßes Fusionsprotein aufweisenden Einheiten gemäß a2) sowie Kombinationen dieser eingesetzt werden können.
Die ein Fusionsprotein aufweisende Einheit in a2) ist bevorzugt ein Mikroorganismus oder ein Zellextrakt desselben.
Dieser Mikroorganismus wird in der Regel derart gentechnisch verändert worden sein, dass er selber erfindungsgemäßes Fusionsprotein herstellt. Dies erfolgt etwa durch Transformation des Mikroorganismus mit einem Expressionsvektor, welcher erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst.
Als Mikroorganismus in a1) oder a2) geeignet sind Bakterien, Hefen oder Pilze, insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
aufgeführt sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
aufgeführt sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
aufgeführt sind.
Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen in a1) oder a2) sind diejenigen der Gattungen Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium und Cupriavidus sowie acetogene Mikroorganismen,
wobei Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymomonas mobilis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium acetobutylicum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii und Clostridium carboxidivorans,
insbesondere Ralstonia eutropha H16, Ralstonia eutropha H16 PHB-4, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Acinetobacter calcoaceticus und Pichia pastoris besonders bevorzugt sind.
Der Mikroorganismus in a1) oder a2) vermag bevorzugt 3-Hydroxybuttersäure aus Kohlenstoffquellen zu synthetisieren.
Als Mikroorganismen, die 3-Hydroxybuttersäure bereitstellen, sind insbesondere solche geeignet, die in der WO 2007/110394 und der DE 10 2008 002 715 beschrieben sind. Insbesondere in der DE 10 2008 002 715 findet der Fachmann Anleitungen, mit welchen Mitteln er die 3-Hydroxybuttersäure Ausbeute aus Kohlenstoffquellen mit rekombinanten Methoden erhöhen kann.
Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise
Kohlenhydrate [wie z. B. Monosaccharide (z. B. Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose, Xylose), Oligosaccharide (z. B. Maltose, Saccharose, Lactose), und Polysacharide (z. B. Stärke, hydrolytisch behandelte Stärke, Cellulose, hydrolytisch behandelte Cellulose, Hemicellulose, hydrolytisch behandelte Hemicellulose)], sowie deren Reaktionsprodukte, wie z. B. Zuckeralkohole und Polyhydroxysäuren;
Kohlendioxid, Kohlenmonoxid, Abgas oder Synthesegas;
organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1, 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, z. B. Essigsäure, Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Propionsäure, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, Glutarsäure, Lävulinsäure, Gluconsäure, Aconitsäure, Bernsteinsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure;
Lipide;
Öle oder Fette wie z. B. Rapsöl, Sojaöl, Palmöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett;
gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z. B. γ-Linolensäure, Dihomo-γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Linolsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure;
Kohlenwasserstoffe, z. B. mit 1 bis 22 C-Atomen mir einer oder meheren Doppel- oder Dreifachbindungen, wie Methan, Ethan, Ethen, Ethylen, Dodecan, Octadecan;
Alkohole, z. B. mit 1 bis 22 C-Atomen, z. B. Butanol, Methanol, Ethanol;
Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z. B. Propandiol und Butandiol;
mehrwertige (auch bezeichnet als höherwertige) Alkohole mit 3 oder mehr, z. B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z. B. Glycerin, Sorbitol, Mannitol, Xylitol und Arabinitol;
Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z. B. Aceton und Acetoin;
Lactone, z. B. γ-Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z. B. Polyhydroxyacetat, Polyester, z. B. Polylactid, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide;
aromatische Verbindungen, z. B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo;
Proteine, z. B. Enzyme wie Amylasen, Pektinasen, saure, hybride oder neutrale Zellulasen, Esterasen wie Lipasen, Pankreasen, Proteasen, Xylanasen und Oxidoreduktasen wie Laccase, Katalase und Peroxidase, Glucanasen, Phytasen; Carotenoide, z. B. Lycopin, β-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin;
proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren, z. B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan und Threonin;
Purin- und Pyrimidinbasen;
Nukleoside und Nukleotide, z. B. Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP);
sowie Vorstufen und Derivate, z. B. bei den genannten Säuren deren Salze, der vorgenannten Verbindungen
eingesetzt werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlenhydraten, insbesondere Monosacchariden, Oligosacchariden oder Polysacchariden, wie dies beispielsweise in US 6,136,576 beschrieben ist, von C₅-Zuckern oder von Glycerin.
Methanol ist ein bevorzugt einzusetzender Alkohol, da es aus vielen verschiedenen Quellen wie beispielsweise Biogas, Biomasse, Erdgas oder Kohle hergestellt werden kann.
Die Kohlenstoffquellen können in unterschiedlicher Form (rein oder in Lösung/Suspension) und in unterschiedlichen Zusammensetzungen (aufgereinigt oder als Rohprodukt) aus unterschiedlichen Verarbeitungsstufen (z. B. Zuckerrohrsaft, Syrup, Melasse, Rohzucker, Kristallzucker; Maiskorn, Mehl, Stärke, Dextrin, Glucose), vor oder nach Behandlung (Dampfexplosion, Säurevorbehandlung, enzymatische Vorbehandlung) eingesetzt werden.
In einer bevorzugten, alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Kohlenstoffquelle, aus der 3-Hydroxybuttersäure synthetisiert wird CO₂ oder CO, insbesondere Synthesegas oder Abgas. Die in diesem Zusammenhang eingesetzten Mikroorganismen in a1) oder a2) sind acetogene Mikroorganismen, wie beispielsweise Arten der Gattung Acetobacterium wie A. woodii und Clostridium aceticum. Insbesondere sind die acetogenen Zellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere bestehend aus, Acetoanaerobium notera, Acetobacterium woodii, Archaeoglobus fulgidus, Butyribacterium methylotrophicum, Butyribacterium methyltrophicum, Carboxydibrachium pacificus, Carboxydocella sporoproducens, Carboxydocella thermoautotrophica, Carboxydothermus hydrogenoformans, Citrobacter sp. Y19, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium ljungdahlii, Desulfotomaculum carboxydivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum, Eubacterium limosum, Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina barkeri, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Moorella AMP, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Rhodopseudomonas palustris P4, Rhodospirillum rubrum, Rubrivivax gelatinosus, Thermincola carboxydiphila, Thermincola ferriacetica, Thermococcus AM4, Thermolithobacter carboxydivorans und Thermoanaerobacter kivui. Eine besonders geeignete Zelle ist in diesem Zusammenhang Clostridium carboxidivorans, insbesondere solche Stämme wie ”P7” und ”P11”. Solche Zellen sind beispielsweise in US 2007/0275447 und US 2008/0057554 beschrieben. Eine weitere, in diesem Zusammenhang besonders geeignete Zelle ist Clostridium ljungdahlii, insbesondere Stämme ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere bestehend aus, Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii C0l und Clostridium ljungdahlii O-52; diese werden in der WO 98/00558 und WO 00/68407 beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Synthese der 3-Hydroxybuttersäure aus der Kohlenstoffquelle und der 2-Hydroxyisobuttersäure aus 3-Hydroxybuttersäure in einem einzigen Verfahrensschritt erfolgt, ist bevorzugt.
Die in erfindungsgemäßem Verfahren eingesetzte, ein Fusionsprotein aufweisende Einheit kann auch als Extrakt des Mikroorganismus, somit in aus dem Mikroorganismus gereinigter, angereicherter und/oder isolierter Form, in die Reaktion eingebracht werden.
Somit kann die ein Fusionsprotein aufweisende Einheit im erfindungsgemäßen Verfahren im Sinne der Erfindung als Katalysatoren sowohl in Form von intakten Mikroorganismen als auch in Form von permeabilisierten Mikroorganismen eingesetzt werden. Weitere Einsatzmöglichkeiten bestehen in Form von Komponenten (eine oder mehrere) aus mikrobiellen Zellextrakten, aber auch in partiell gereinigter oder gereinigter Form. Gegebenenfalls werden CoA-Ester synthetisierende Enzyme, z. B. CoA-Transferase oder CoA-Synthetasen, erfindungsgemäß eingesetzt. Die enzymatischen Katalysatoren können immobilisiert sein oder an ein gelöstes oder ungelöstes Trägermaterial angeheftet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante werden bestimmte Zellkompartimente oder Teile davon voneinander getrennt oder vereinigt, das heißt, Kohlenhydratstrukturen, Lipide oder Proteine und/oder Peptide sowie Nukleinsäuren, die in der Lage sind, die Aktivität der das Fusionsprotein aufweisenden Einheit positiv oder negativ zu beeinflussen, können kombiniert oder getrennt werden. Um eine solche Beeinflussung bewusst zu nutzen, werden aus den Mikroorganismen z. B. fachgemäß Rohextrakte hergestellt, welche ggf. zentrifugiert werden, um eine erfindungsgemäße Umsetzung mit dem Sediment oder dem Überstand durchführen zu können.
Die durch erfindungsgemäßes Verfahren erhaltene 2-Hydroxyisobuttersäure kann je nach Bedingungen in Form ihrer Salze oder aber in Form eines Polyhydroxyalkanoats, in dem die 2-Hydroxyisobuttersäure als funktionales Monomer gespeichert ist, vorliegen.
Die erfindungsgemäß hergestellte 2-Hydroxyisobuttersäure kann durch Behandlung des wässrigen Mediums, nach Entfernung von ungelösten Bestandteilen wie mikrobiellen Zellen, mit bereits bekannten Methoden isoliert werden. Solche Verfahren sind neben weiteren z. B. Konzentrierung, Ionenaustausch, Destillation, Elektrodialyse, Extraktion und Kristallisation. Das Produkt kann als Salz oder (nach Ansäuerung) als protonierte 2-Hydroxyisobuttersäure isoliert werden.
Verfahren zur Isolierung sind dem Fachmann an sich bekannt, ausführliche und spezielle Anleitungen findet er in der DE 10 2008 002 715 .
Die durch erfindungsgemäßes Verfahren erhaltene 2-Hydroxyisobuttersäure kann vorteilhaft zur Herstellung von Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder Polymeren derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation verwendet werden.
Verfahren zur Dehydratisierung, Veresterung und Polymerisation sind dem Fachmann an sich bekannt, ausführliche und spezielle Anleitungen findet er in der DE 10 2008 002 715 .
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Folgende Figuren sind Bestandteil der Beispiele:
1: Hybridplasmid pBBR1MCS-2::Mutase-Operon
2: Hybridplasmid pBBR1MCS-2::Mut_At_delhcl.
3: Hybridplasmid pBBR1MCS-2::meaBhcmA-hcmB.
4: 2D-Polyacrylamid-Gele (pH 4–pH 7) vom rekombinanten R. eutropha H16 PHB-4 Stamm.
5: 2-HIB-Konzentration absolut im Kulturüberstand bei der Kultivierung verschiedener rekombinanter R. eutropha H16 PHB-4 Stämme. Nach 6 h, 21 h, 24 h, 28 h, 48 h, 52 h und 120 h im Produktionsmedium, wurden Proben entnommen und mittels Ionenaustauschchromatographie (IC) analysiert.
6: 2-HIB-Konzentration pro OD₆₀₀ im Kulturüberstand bei der Kultivierung verschiedener rekombinanter R. eutropha H16 PHB-4 Stämme. Nach 6 h, 21 h, 24 h, 28 h, 48 h, 52 h und 120 h im Produktionsmedium wurden Proben entnommen und mittels IC analysiert.
Beispiele:
1. Isolierung genomischer DNA und Amplifikation des Mutase-Operons beinhaltend die Gene hcmB, hcl, meaB und hcmA
Aus dem Stamm Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512 wurde mit dem Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben genomische DNA isoliert und als Matrize für eine PCR zur Amplifikation des Mutase-Operons eingesetzt. Die Primer wurden aus der Sequenz des Organismus Methylibium petroleiphilum PM1 Plasmid RPME01 (NCBI Accession: CP000556.1) abgeleitet, da die Ähnlichkeit der Nucleotidsequenz der im Operon enthaltenden Gene hcmA (icmA) und hcmB (icmB) zu jenen von Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512 bei > 97% liegt. Dabei wurden die Oligonucleotide UPicmB fw 5'-CAGCGACTTGCAACCTTCTTCACCGG-3' (forward Primer, Sequenz ID Nr. 8) und ICM5,4-PMI_rev 5'-GTATCAGTCGCTCCGACTTGCCGATCC-3' (reverse Primer, Sequenz ID Nr. 9) zur Amplifikation der dazwischen liegenden Gene eingesetzt.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR, nach SAIKI et al., 1985, Enzymatic amplifikation of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350–1354.) wurde mit der Pfu-Polymerase (Promega, Madison, USA) angesetzt. Dabei wurden 35 Zyklen mit jeweils 60 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 65°C und 8 Minuten bei 72°C durchgeführt. Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Thermocycler (Primus 96 advanced; PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen).
Die Fragmente wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben aufgereinigt.
2. Herstellung eines Ralstonia eutropha Expressionsvektors
Das aufgereinigte PCR-Fragment „Mutase-Operon” (ca. 5,4 kbp) wurde nach Angaben des Herstellers in den Vektor pET101/D-TOPO ligiert (Invitrogen GmbH, Karlsruhe). Das erhaltene Hybridplasmid pET101/D-TOPO::Mutase-Operon wurde in kompetente E. coli DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) transferiert und durch Restriktion und Sequenzierung kontrolliert.
Zusätzlich wurde das PCR-Produkt in das Plasmid pCR-BluntIITOPO nach Herstellerangaben (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) kloniert. Das erhaltene Hybridplasmid pCR-BluntIITOPO::Mutase-Operon wurde in kompetente E. coli DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) transferiert und durch Restriktion und Sequenzierung kontrolliert.
Um eine Expression in R. eutropha-Stämmen zu erreichen, musste das Konstrukt in einen geeigneten broad-host-range Vektor kloniert werden. Bei dem benutzten Vektor handelt es sich um pBBR1MCS-2, beschrieben bei KOVACH et al. (1995). Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166: 175-176.
Dazu wurden die Plasmide pCR-BluntIITOPO::Mutase-Operon und pBBR1MCS-2 mit den Enzymen EcoRV und SpeI verdaut und das Fragment Mutase-Operon in den Zielvektor pBBR1MCS-2 ligiert und kompetente E. coli DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) mit dem entstandenen Hybridplasmid pBBR1MCS-2::Mutase-Operon (1, Sequenz ID Nr. 6) transformiert.
Das Plasmid wurde durch Restriktion und Sequenzierung überprüft und mittels Elektroporation (2,43 kV, 25 μF, 200 Ω) in kompetente R. eutropha H16 PHB-4 (reklassifiziert als Cupriavidus necator, DSM 541) gebracht.
Es konnten Transformanten erhalten werden, die das Plasmid pBBR1MCS-2::Mutase-Operon tragen.
Zur Deletion des hcl Genes, das für eine putative 2-HIB-Co A-Ligase codiert, wurde eine Mutations- und nachfolgende Fusions-PCR durchgeführt.
Für die Mutations-PCR wurden die folgenden Primer genutzt:
Fragment A (1228_pCOLAD_fp1 × 1251_hcl_del-) wurde mit den Primern 1228_pCOLAD_fp1: 5'-GGA ATT GTG AGC GGA TAA-3' Sequenz ID Nr. 10 und 1251_hcl_del-: 5'-CAG CGC CCC GGG ATA CTC GAC CGG AAA GTT CC-3' Sequenz ID Nr. 11 amplifiziert,
Fragment B (1251_hcl_del+ × 1251_nach_StuI) mit den Primern 1251_hcl_del+ 5'-GAG TAT CCC GGG GCG CTG AAC CAG CAA CTG-3' Sequenz ID Nr. 12 und 1251_nach_StuI 5'-ATG GCC TGG ATC TCG TCT C-3' Sequenz ID Nr. 13.
Die Fusions-PCR (s. o.: 35 Zyklen mit jeweils 60 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 65°C und 7 Minuten bei 72°C) erfolgte mit den Primern 1228_pCOLAD_fp1 und 1251_nach_StuI und das PCR-Produkt wurde über HindIII/StuI in den Ausgangsvektor pBBR1MCS-2 zurück kloniert. Das entstandene Hybridplasmid pBBR1MCS-2::Mut_At_delhcl (2) wurde durch Restriktion und Sequenzierung überprüft.
3. Amplifikation der Fragmente hcmA, meaB und hcmB; Fusion der codierenden Bereiche von MeaB (N-terminal) und HcmA (C-terminal)
Das im Beispiel 2 beschriebene Plasmid pBBR1MCS-2::Mut_At_delhcl wurde als Matrize für eine PCR zur Amplifikation der Fragmente hcmA (1,7 kbp; DQ436456), hcmB (0,4 kbp; DQ436457) sowie des als meaB bezeichneten Fragmentes (1 kbp) eingesetzt.
Zur Fusion der codierenden Bereiche von MeaB (N-terminal) und HcmA (C-terminal) müssen das Start-Codon von hcmA und das Stopp-Codon von meaB modifiziert werden. Zur Amplifikation von meaB (1 kbp) wurden die Oligonukleotide MeaB_NsiI_fw 5'-ATAGCAATGCATGACCGGAATGACTTACGTTCCC-3' (forward primer; NsiI Schnittstelle ist unterstrichen; Startcodon fettgedruckt, Sequenz. ID Nr. 14) und MeaBFus_HindIII_rev 5'-ACTTTAAGCTTGGCGCAAGCCAGGTCATTCG-3' (reverse primer; HindIII-Schnittstelle unterstrichen; mod. Stoppcodon fett gedruckt, Sequenz ID Nr. 15) verwendet.
Die Amplifizierung von hcmA (1,7 kbp) wurde mit dem Primer hcmAFus_HindIII_fw 5'-AAAAAGCTTACCATAACCTGGCTTGAGCCG-3' (HindIII-Schnittstelle unterstrichen; mod. Startcodon fett gedruckt, Sequenz ID Nr. 16) und dem Primer hcmA_SpeI_rev 5'-ATACCGACTAGTGCTCAGAAGACCGGCGTCTC-3' (SpeI-Schnittstelle unterstrichen; Stoppcodon fett gedruckt, Sequenz ID Nr. 17) durchgeführt.
Das Fragment hcmB (0,5 kbp) wurde mit den Oligonukleotiden hcmB_SpeI_fw 5'-AAATCTACTAGTTGGAGATCCCACCATGGACCAAATCCCG-3' (forward primer; SpeI Schnittstelle ist unterstrichen; Startcodon fettgedruckt, Sequenz ID Nr. 18) und hcmB_SacI_rev 5'-TAGGCTGAGCTCCAAGCTTCGAATTGAGCTCGCCCTTTCAG-3' (reverse primer; SacI-Schnittstelle unterstrichen; Stoppcodon fett gedruckt, Sequenz ID Nr. 19) amplifiziert.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR, nach SAIKI et al., 1985, Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350–1354.) wurde mit dem Phusion^TM High-Fidelity PCR Master Mix (Finnzymes, Espoo, Finnland) angesetzt. Nach der initialen Denaturierung (30 s; 98°C), wurden 35 Zyklen mit jeweils 10 s bei 98°C, 30 s bei 65°C und 1 min bei 72°C durchgeführt. Zur finalen Elongation wurden die Ansätze 10 min bei 72°C inkubiert. Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Thermocycler (Primus 96 advanced; PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen).
Die PCR-Ansätze wurden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, das 1 kbp große meaB-Fragment aus dem Gel isoliert, mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben aufgereinigt und anschließend mit NsiI und HindIII verdaut. Das 1,7 kbp große hcmA-Fragment wurde direkt aus dem PCR-Ansatz mittels QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit HindIII und SpeI verdaut. Beide Ansätze wurden über die HindIII-Schnittstelle ligiert.
Das Ligationsprodukt meaBhcmA (2,7 kbp) wurde als Matrize für eine SOE-PCR mit den Oligonukleotiden MeaB_NsiI_fw 5'-ATAGCAATGCATGACCGGAATGACTTACGTTCCC-3' (NsiI Schnittstelle ist unterstrichen; Startcodon fettgedruckt, Sequenz ID Nr. 14) und hcmA_SpeI_rev 5'-ATACCGACTAGTGCTCAGAAGACCGGCGTCTC-3' (SpeI-Schnittstelle unterstrichen; Stoppcodon fett gedruckt, Sequenz ID Nr. 17) eingesetzt (30 s, 98°C initialen Denaturierung; 35 Zyklen mit jeweils 10 s bei 98°C, 30 s bei 65°C und 1 min bei 72°C; finale Elongation 10 min bei 72°C). Das erhaltene PCR-Produkt der entsprechenden Größe wurde mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, isoliert und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden) aufgereinigt.
Das hcmB-Fragment wurde nach erfolgter PCR mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden) aufgereinigt und mit SpeI und SacI verdaut.
4. Herstellung eines Ralstonia eutropha Expressionsvektors
Das aufgereinigte meaBhcmA-Fusionsfragment (2,7 kbp) wurde in den ebenfalls mit diesen beiden Restriktionsendonukleasen verdauten broad-host-range Vektor pBBR1MCS-2 ligiert. Das erhaltene Hybridplasmid pBBR1MCS-2::meaBhcmA wurde in kompetente E. coli DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) transferiert und durch Restriktion und Sequenzierung kontrolliert. Zusätzlich wurde hcmB in den Vektor einkloniert. Dazu wurde der Vektor pBBR1MCS-2::meaBhcmA mit SpeI und SacI verdaut. Das aufgereinigte hcmB-Fragment wurde in diesen Vektor ligiert und anschließend ein Aliquot des Ligationsansatzes in DH5α-Zellen (New England Biolabs, Frankfurt) transferiert. Das erhaltene Hybridplasmid pBBR1MCS-2::meaBhcmA-hcmB-P wurde durch Restriktion und Sequenzierung kontrolliert.
Als Schnittstelle zur Erzeugung des Hybridplasmides musste, aufgrund der zahlreichen in den Inserts enthaltenen, andererseits der wenigen in der Multiple Cloning Site (MCS) verbleibenden unikalen Schnittstellen von pBBR1MCS-2, NsiI verwendet werden. Diese Schnittstelle liegt stromaufwärts der Promotorregion, so dass bei der Klonierung der Promotor vom Vektor entfernt wurde. Zur Ermöglichung der Transkription wurde das gesamte Konstrukt meaBhcmA-hcmB-P (3,1 kbp) mit den Oligonukleotiden MeaB_RBS_fw 5'-AAATTTAGATCTGGAGACCGGAATGACTTACGTTCCC-3' (Startcodon fettgedruckt, Sequenz ID Nr. 20) und hcmB_SacI_rev 5'-TAGGCTGAGCTCCAAGCTTCGAATTGAGCTCGCCCTTTCAG-3' (SacI-Schnittstelle unterstrichen; Stoppcodon fett gedruckt, Sequenz ID Nr. 19) in einer mittels Phusion^TM High-Fidelity PCR Master Mix (Finnzymes, Espoo, Finnland) vermittelten PCR (30 s, 98°C initiale Denaturierung; 35 Zyklen mit jeweils 10 s bei 98°C, 30 s bei 65°C und 1 min bei 72°C; finale Elongation 10 min bei 72°C) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde aufgereinigt und wie der Leervektor pBBR1MCS-2 mit EcoRV und SacI verdaut. Nach der Ligation des linearisierten Vektors mit meaBhcmA-hcmB, erfolgte die Transformation von E. coli DH5α (New England Biolabs, Frankfurt). Das Plasmid wurde durch Restriktion und Sequenzierung überprüft.
Der Vektor pBBR1MCS-2::meaBhcmA-hcmB (3, Sequenz ID Nr. 7) wurde mittels Elektroporation (2,43 kV, 25 μF, 200 Ω) in R. eutropha H16 PHB-4 (reklassifiziert als Cupriavidus necator, DSM 541) eingebracht. Mittels der Methode konnten plasmidtragende Transformanten erhalten werden.
5. Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure in rekombinanten R. eutropha-Zellen
Die in Beispiel 2 bis 4 beschriebenen plasmidtragenden R. eutropha-Stämme wurden zur Produktion von Biomasse in Erlenmeyerkolben mit 100 ml Biomasseproduktionsmedium (mod. MSM-Schlegel-Medium: 0,36% (w/v) NH₂HPO₄; 0,15% (w/v) KH₂PO₄; 0,1% (w/v) NH₄Cl; 1% (w/v) Hefeextrakt, 0,8 mM MgSO₄ × 7H₂O; 0,1 mM CaCl₂ × 2H₂O; 37 μM FeCl₃; Spurenelement-Lösung (10 ×; Pfennig und Lippert, 1966), 0,1% (v/v)) kultiviert. Dem Medium wurde zusätzlich 1,5% (w/v) Fruktose und 300 μg/ml Kanamycin zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte für ca. 18 h bei 30°c und 180 rpm im temperierbaren Schüttler.
Zur Einstellung einer Stickstofflimitierung wurde die Biomasse abzentrifugiert (20°C; max. 4000 × g, 15 min) und anschließend in Produktionsmedium (mod. MSM-Schlegel-Medium: 0,36% (w/v) NH₂HPO₄; 0,15% (w/v) KH₂PO₄; 0,8 mM MgSO₄ × 7H₂O; 0,1 mM CaCl₂ × 2H₂O; 37 μM FeCl₃; Spurenelement-Lösung (10 ×; Pfennig und Lippert, 1966), 0,1% (v/v)) gewaschen und nach erneuter Pellettierung in 50 ml Produktionsmedium resuspendiert. Dem Medium wurde zur 2-Hydroxyisobuttersäure-Produktion neben 1,5% (w/v) Fruktose und 300 μg/ml Kanamycin auch 76 nM CoB₁₂ zugeführt. Die Kultivierung erfolgte bei 30°C, 180 rpm. Nach sechsstündiger Kultivierung wurden 1,5 (w/v) Fruktose und 76 nM Coenzym B₁₂ (CoB₁₂) nachgefüttert. Die Ernte der Zellen erfolgte nach 120 h durch Zentrifugation bei 5.000 rpm (4°C) und der Kulturüberstand wurde bei –20°C bis zur Analyse gelagert.
Während der Kultivierung im Produktionsmedium (s. o) wurde Kulturbrühe entnommen und abzentrifugiert (13.000 rpm, 4°C). Die Proben wurden dann mittels IC, High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) und quantitativer ¹H-NMR-Spektroskopie (¹H-NMR) untersucht. Zusätzlich wurde nach 24 h im Produktionmedium (s. o.) 2 ml der Kultur geerntet (13.000 rpm, 4°C). Die Zellpellets wurden auf Trockeneis zu Toplab (Martinsried, Deutschland) versandt und mittels 2D Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht. Sowohl das Fusionsprotein MeaBhcmA (98 kDa), als auch HcmB (14,5 kDa) konnte eindeutig mittels MS nachgewiesen werden (3).
Nachweis und Quantifizierung von 2-Hydroxyisobuttersäure erfolgte mittels IC, HPLC und ¹H-NMR. Der Kulturüberstand wurde ggf. zur Analyse mittels IC bzw. HPLC mit _ddH₂O verdünnt. Zur chromatographischen Auftrennung in der ICS-2000 RFIC (Dionex, Corporation, Synnyvale, USA) wurde die RFIC^TM TonPac Säule (2 × 250 mm, Säulentemperatur 30°C, + Vorsäule AG15 4 × 50 mm, Durchflussrate 0,38 ml/min) verwendet. In der HPLC (Agilent Technologies 1200 Series, Ratingen, Deutschland) wurde eine auf 40°C temperierte Aminex Säule (HPX-87H, 300 × 7,8 mm) von Biorad (Hercules, USA; 0,6 ml/min Durchflussrate, max. 400 bar, Injektionsvolumen 20 μl) verwendet. Die Identifizierung des 2-Hydroxyisobuttersäure-Peaks erfolgte durch den Abgleich der Retentionszeit mit der Reinsubstanz. Zur Abschätzung des Gehaltes an 2-Hydroxyisobuttersäure erfolgte eine Dotierung der Proben mit einer definierten Menge der Reinsubstanz 2-Hydroxyisobuttersäure.
In den analysierten Proben wurde eine Konzentration von maximal 1,1 g/l (120 h in Produktionsmedium) 2-Hydroxyisobuttersäure detektiert. Dieses entspricht einer Konzentration von 64 mg/l/OD₆₀₀ (5). In entsprechenden Kontrollansätzen mit Leerplasmid (pBBR1MCS-2) wurde dagegen keine 2-Hydroxyisobuttersäure nachgewiesen. Die IC-Messungen wurden qualitativ und quantitativ durch Aufstockung mit der Reinsubstanz 2-Hydroxyisobuttersäure bestätigt. SEQUENCE LISTING
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verwendung eines Proteins umfassend eine zu einem MeaB-Protein homologen Proteinsequenz von mindestens 100 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von mindestens 60% zu einem MeaB-Protein zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase.
Verwendung gemäß Anspruch 1 in einem Mikroorganismus oder einem Zellextrakt desselben, wobei das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz im Vergleich zu dem Wildtyp des Mikroorganismus im Mikroorganismus verstärkt oder im Zellextrakt selber verstärkt vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Gattungen Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium und Cupriavidus sowie acetogene Mikroorganismen.
Verwendung gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, sich isolieren lässt aus den Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aquincola tertiaricarbonis L108, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18028, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638, Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces coelicolor.
Verwendung gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz ableiten lässt aus der Gruppe der MeaB-Proteine bestehend aus: Sequenz ID Nr. 1 (Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512), YP_001023545 aus Methylibium petroleiphilum PM1, YP_001409454 aus Xanthobacter autotrophicus Py2, YP_001045518 aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, YP_002520048 aus Rhodobacter sphaeroides, AAL86727 aus Methylobacterium extorquens AM1
Fusionsprotein umfassend eine 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase und eine zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz von mindestens 100 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von mindestens 60% zu einem MeaB-Protein.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, sich isolieren lässt aus den Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aquincola tertiaricarbonis L108, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18028, Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638, Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces coelicolor.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz ableiten lässt aus der Gruppe der MeaB-Proteine bestehend aus: Sequenz ID Nr. 1 aus Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512, YP_001023545 aus Methylibium petroleiphilum PM1, YP_001409454 aus Xanthobacter autotrophicus Py2, YP_001045518 aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, YP_002520048 aus Rhodobacter sphaeroides, AAL86727 aus Methylobacterium extorquens AM1.
Fusionsprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz N-terminal an die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase fusioniert ist.
Fusionsprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz N-terminal an eine kleine Untereinheit einer oligomeren 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase fusioniert ist.
Fusionsprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz ID Nr. 21 und 22 (A. tertiaricarbonis DSM 18512) sowie ABM97311 und ABM97308.1 (M. petroleiphilum PM1) an deren große Untereinheit N-terminal eine zu MeaB-Proteinen homologe Proteinsequenz, welche sich ableiten lässt aus der Gruppe der MeaB-Proteine bestehend aus Sequenz ID Nr. 1 (A. tertiaricarbonis DSM 18512) und YP_001023545 (M. petroleiphilum PM1) fusioniert ist, wobei zwischen der zu einem MeaB-Protein homologen Proteinsequenz und der 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase ein Linker bestehend aus der Aminosäuresequenz Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile vorhanden ist.
Heterodimeres Fusionsprotein gemäß Anspruch 11, Protein umfassend Sequenz ID Nr. 3 und Sequenz ID Nr. 4.
Isolierte Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 12.
Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure umfassend die Verfahrensschritte: a) in Kontakt Bringen a1) eines Mikroorganismus oder einem Zellextrakt des Mikroorganismus aufweisend eine enzymatische Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase, wobei das Protein umfassend die zu einem MeaB-Protein homologe Proteinsequenz gemäß Anspruch 1 im Vergleich zu dem Wildtyp des Mikroorganismus im Mikroorganismus verstärkt oder im Zellextrakt selber verstärkt vorliegt oder a2) einer ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 6 bis 12 aufweisenden Einheit mit einem wässrigen Medium beinhaltend 3-Hydroxybuttersäure, sowie gegebenenfalls b) Aufreinigung der 2-Hydroxyisobuttersäure aus dem wässrigen Medium oder aus der das Fusionsprotein aufweisenden Einheit.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die ein Fusionsprotein aufweisende Einheit ein Mikroorganismus oder ein Zellextrakt desselben ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Gattungen Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium und Cupriavidus sowie acetogene Mikroorganismen.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus 3-Hydroxybuttersäure aus einer Kohlenstoffquelle synthetisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der acetogene Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Acetoanaerobium notera, Acetobacterium woodii, Archaeoglobus fulgidus, Butyribacterium methylotrophicum, Butyribacterium methyltrophicum, Carboxydibrachium pacificus, Carboxydocella sporoproducens, Carboxydocella thermoautotrophica, Carboxydothermus hydrogenoformans, Citrobacter sp. Y19, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium ljungdahlii, Desulfotomaculum carboxydivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. Thermosyntrophicum, Eubacterium limosum, Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina barkeri, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Moorella AMP, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Peptostreptococcus productus, Rhodopseudomonas palustris P4, Rhodospirillum rubrum, Rubrivivax gelatinosus, Thermincola carboxydiphila, Thermincola ferriacetica, Thermococcus AM4, Thermolithobacter carboxydivorans und Thermoanaerobacter kivui, und die 3-Hydroxybuttersäure aus Kohlenstoffquellen synthetisiert wird, wobei die Kohlenstoffquelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kohlenmonoxid, Kohlendioxid, Abgas und Synthesegas.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der 3-Hydroxybuttersäure aus der Kohlenstoffquelle und der 2-Hydroxyisobuttersäure aus 3-Hydroxybuttersäure in einem einzigen Verfahrensschritt erfolgt.
Verwendung von 2-Hydroxyisobuttersäure erhalten durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 14 bis 19 zur Herstellung von Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder Polymeren derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation.