BRPI0709732A2 - fitase, seqÜÊncia de Ácidos nucleicos isolada, construÇço de Ácido nuclÉico, vetor de expressço recombinante, cÉlula hospedeira recombinante, mÉtodo para produzir a fitase, planta transgÊnica ou parte da planta, animal nço humano transgÊnico ou seus produtos ou elementos, composiÇço, mÉtodo para melhorar o valor nutritivo de uma raÇço para animal, processo para reduzir os nÍveis de fitato no esterco de animal, mÉtodo para o tratamento de proteÍnas de legume, e, uso da fitase ou da composiÇço na raÇço para animal - Google Patents

Abstract

FITASE, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADA, CONSTRUÇçO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSçO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR A FITASE, PLANTA TRANSGÊNICA OU PARTE DA PLANTA, ANIMAL NçO HUMANO TRANSGÊNICO OU SEUS PRODUTOS OU ELEMENTOS, COMPOSIÇçO, MÉTODO PARA MELHORAR O VALOR NUTRITIVO DE UMA RAÇçO PARA ANIMAL, PROCESSO PARA REDUZIR OS NIVEIS DE FITATO NO ESTERCO DE ANIMAL, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE PROTEINAS DE LEGUME, E, USO DA FITASE OU DA COMPOSIÇçO NA RAÇçO PARA ANIMAL A presente invenção diz respeito a uma fitase que tem pelo menos 74% de identidade com um derivado de fitase de Citrobacter braakii e compreende pelo menos uma alteração em comparação com esta fitase. Estas variantes de fitase têm propriedades aperfeiçoadas, preferivelmente melhoradas, tais como a termoestabilidade, o perfil de temperatura, o perfil de pH, a atividade específica, o desempenho na alimentação de animais, sensibilidade reduzida à protease, e/ou um padrão aperfeiçoado de glicosilação. A invenção também diz respeito a DNA codificando estas fitases, a métodos de sua produção, bem como ao seu uso, por exemplo na ração de animal e em aditivos de ração de animal.

Description

"FITASE, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADA,CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃORECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE,MÉTODO PARA PRODUZIR A FITASE, PLANTA TRANSGÊNICA OUPARTE DA PLANTA, ANIMAL NÃO HUMANO TRANSGÊNICO OUSEUS PRODUTOS OU ELEMENTOS, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARAMELHORAR O VALOR NUTRITIVO DE UMA RAÇÃO PARA ANIMAL,PROCESSO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE FITATO NO ESTERCO DEANIMAL, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE PROTEÍNAS DELEGUME, E, USO DA FITASE OU DA COMPOSIÇÃO NA RAÇÃOPARA ANIMAL"Referência à listagem de seqüências

Este pedido contém uma Listagem de Seqüências na formalegível por computador. A forma legível por computador fica aquiincorporada como referência.

Campo da invenção

A presente invenção diz respeito a uma fitase que tem pelomenos 74% de identidade com um derivado de fitase de Citrobacter braakiiATCC 51113, e compreende pelo menos uma alteração em comparação comesta fitase (ou seja, é uma sua variante). A invenção também diz respeito aDNA codificando estas fitases, a métodos de sua produção, bem como ao seuuso, por exemplo na alimentação de animais e aditivos de alimentação deanimais. A parte madura da fitase Citrobacter braaki ATCC 51113 é incluídana listagem de seqüência como SEQ ID NO: 2.

Fundamentos da invenção

Fundamentos da técnica

A seqüência do gene phyA do Citrobacter freundii foisubmetida por Zinin et al. ao banco de dados do EMBL/GenBank/DDBJ como número de acesso AY390262. A seqüência de aminoácidos de fitase éencontrada nos bancos de dados do UniProt/TrEMBL com o número deacesso Q676V7. A parte madura esperada do Q676V7 é incluída na presentelistagem de seqüências como SEQ ID NO: 4.

A WO 2004/085638 apresenta, como a SEQ ID NO: 7, aseqüência de aminoácidos de uma fitase de Citrobacter braakii YH-15,depositada como KCCM 10427. A parte madura desta seqüência deaminoácidos é aqui incluída como SEQ ID NO: 3. Esta seqüência é tambémencontrada no banco de dados Geneseqp, com número de acesso ADU50737.

A WO 2006/037328 apresenta a fitase do tipo selvagem doCitrobacter braakii ATCC 51113 (isto é, neste relatório SEQ ID NO: 2), bemcomo uma sua variante, a qual se acha também incluída na presente listagemde seqüências, a saber, como SEQ ID NO: 6.

As WO 2006/038062 e WO 2006/038128 apresentam, ambas,a seqüência de aminoácidos do gene da fitase Citrobacter freundii P3-42,depositada sob o número de acesso NCIMB 41247. A seqüência deaminoácidos é aqui incluída como SEQ ID NO: 9.

E um objeto da invenção prover fitases de propriedadespreferivelmente melhoradas, reformadas. Exemplos não limitativos de taispropriedades são: Termoestabilidade, perfil da temperatura, perfil do pH,atividade específica, desempenho na alimentação de animais, sensibilidade àprotease, e/ou padrão de glicosilação.

Sumário da invenção

A presente invenção diz respeito a uma fitase que tem pelomenos 74% de identidade com a SEQ ID NO: 2 e que compreende pelomenos uma alteração em comparação com a SEQ ID NO: 2 em pelo menosuma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 41, 46, 52, 53, 55, 57,59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107, 109, 111 , 114, 115, 116, 117,118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 136, 137, 141, 154, 161, 162, 164, 167,171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202,203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276, 281, 282, 283, 284, 285, 286,289, 294, 299, 308, 314, 316, 324, 331, 339, 351, 355, 362, 379, 385, 406,409, 410 e 411; com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nema SEQ ID NO: 4, e nem a SEQ ID NO: 6.

A invenção também diz respeito a uma fitase que tem pelomenos 74% de identidade com a SEQ ID NO: 2 e que compreende pelomenos uma das seguintes alterações: 1H,K,R, 60P, 105E, 106A,G, 155F,157F, 173P, 175L, 188P, 205P, 215M, 231P, 254Y, 280P, 330D e/ou 371P;com a condição de que essa fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nem a SEQ IDNO: 4, nem. a SEQ ID NO: 6, e nem a SEQ ID NO: 9, nem as suas varianteslistadas na Figura 1.

A invenção também diz respeito ao DNA codificando estasfitases, a métodos de sua produção, bem como ao seu uso, por exemplo naalimentação de animais e aditivos de ração para animal.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 corresponde à Tabela 2 da WO 2006/038062 eapresenta várias variantes da fitase de Citrobacter freundii NCIMB 41247 quetem a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 9; e

A Figura 2 é um alinhamento das fitases de SEQ ID NOs: 2 e 9.

Os números de posição na Figura 1 referem-se à numeração daSEQ ID NO: 9. As posições correspondentes da SEQ ID NO: 2 podem serencontradas pela dedução de 22 (por exemplo, a variante P229S da Figura 1significa a variante P207S usando-se a numeração do presente pedido).

Descrição detalhada da invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito auma fitase que tem pelo menos 74% de identidade com a SEQ ID NO: 2 e quecompreende pelo menos uma alteração em comparação com a SEQ ID NO: 2em pelo menos uma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 41,46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107, 109, 111,114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 136, 137, 141, 154,161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186,196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276, 281, 282,283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 316, 324, 331, 339, 351, 355,362, 379, 385, 406, 409, 410 e 411; com a condição de que a fitase não seja a

SEQ ID NO: 3, nem a SEQ ID NO: 4 e nem a SEQ ID NO: 6.

O percentual de identidade é determinado como descrito naseção "Percentual de Identidade dos Polipeptídeos da Fitase".

Os números de posição referem-se à numeração de posição da

SEQ ID NO: 2, como descrito na seção "Numeração das Posições". Asposições correspondentes a estes números de posição da SEQ ID NO: 2 emoutras fitases são determinadas como descrito na seção "Números dasPosições Correspondentes à Identificação".

A Fitase da invenção é uma variante da fitase da SEQ ID NO:2, a saber, ela não é idêntica à SEQ ID NO: 2, já que ela compreende pelomenos uma alteração em comparação com a SEQ ID NO: 2.

Em uma forma de realização particular, a fitase da invençãocompreende pelo menos uma alteração em comparação com a SEQ ID NO: 2em pelo menos uma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 46,52, 53, 55, 57, 59, 76, 82, 99, 100, 107, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118,119, 120, 121, 122, 123, 124, 137, 141, 161, 162, 164, 167, 179, 180, 181,182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 218, 223, 241, 273, 276, 285,286, 299, 314, 331, 339, 362, 379, 385, 406, 410 e 411.

Em outra forma de realização particular, a fitase da invençãonão é a SEQ ID NO: 9.

Em ainda outra forma de realização particular, a fitase dainvenção não constitui as variantes da SEQ ID NO: 9 listadas na Figura 1.

Em uma forma de realização preferida, a fitase da invençãocompreende pelo menos uma das seguintes alterações: 1*, 2*, 3*, 4P, 5P,31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 55D,I, 57Y, 59C, 74A, 76G, 82E, 84Y,91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G, 11 IP, 114H,N,T, 115Q,116A,E5P5T5Q, 117D,E,K, 118I,L,M,T, 119G,K5R5S, 120K,S5T,Q,121A5D5M5P5T5V5 122D, 123P,S, 124L5T5V5 136P, 137P, 141C, 154P, 161P,162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G5I5K5N5Q5 180A5E5G5T518ID5G5I5K5 182H5K5S5Q5 183 A5L5P5S5V5Q5 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C,200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 24IQ5 247C, 273L,Q,276K,R, 28IH5 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, 286K5Q5 289P, 294T, 299L,308A5 314G,N, 316D, 324N, 331K, 339D, 351Y, 355P, 362K.R, 379K,R,385D, 406A, 409D,E, 410D,E e/ou 41IR5K.A nomenclatura usada neste relatório descritivo quanto àsalterações é descrita em detalhes na seção "Alterações, tais comoSubstituições, Deleções, Inserções".Preferivelmente, a fitase da invenção compreende pelo menosuma das seguintes alterações: 1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 3IC5 46E, 52C,E5 53V, 55D,57Y5 59C, 76G, 82E, 99C, 100C, 107D5E5G5 109A, IllP5 114T, 115Q,116AT, 117D, 118T, 119K,R5S5 120S, 121D,P,T, 122D, 123P, 124L, 137P,141C, 161P, 162C, 164E, 167Q, 179K, 180E,T, 181D,K, 182H5K5Q5183L,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C, 200K, 202N, 218Q, 223E, 241Q,273L, 276K,R, 285G,R, 286Q, 299L, 3 HG5N5 33IK5 339D, 362K,R,379K5R5 385D, 406A, 4IOD5E e/ou 41IR5K; e/ou em que os aminoácidos nasposições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenham sido substituídos porKEKHQ5 KEKQQ, KEKKV ou KTDKL.Em outra forma de realização preferida, os aminoácidos nasposições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 foram substituídos porQADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ouKTDKL.A invenção também diz respeito a uma fitase que tem pelomenos 74% de identidade com a SEQ ID NO: 2 e que compreende pelomenos uma das seguintes alterações: IH5K5R, 60P, 105E, 106A,G, 155F,157F, 173P, 175L, 188P, 205P, 215M, 231P, 254Y, 280P, 330D e/ou 371P;com a condição de que a fitase não seja a SEQ LD NO: 3, nem a SEQ ID NO:4, nem a SEQ ID NO: 6, e nem a SEQ ID NO: 9 e nem as suas varianteslistadas na Figura 1. Em uma forma de realização preferida, a fitasecompreende a alteração 1K. Nas formas de realização preferidas adicionais, afitase compreende as seguintes combinações de alterações: 280P/282P/283P,155F/254Y e/ou 155F/157F/254Y.

As fitases preferidas da invenção compreendem uma alteraçãoselecionada das seguintes:

52C, 141C, 162C, 310, 52C, 99Ct 59C, 100C, 141C/199C, AP, 5P, 111P, 137P, 161 Pt 52E,57Y, 760, 107D, 107G, 1€9A, 1*. 1*/2*, 17273*, 121T, 273L, 285G, 286Q, 299L, 362K,331K/55D, 107Éf 46E, S2E, 119R, 119K, 164E, 223E, 276R, 276K, 362R 379R, 37ÔK, 385D,41 ODr 41OH, 411R, 411K, 53V, 121D, 167Q, 196Q, 200K, 202N, 2180, 241 Qt 285N, 314N,314G, 406Â, 179K/180E/181 K/182H/183Q/18471857186*,

179K/180 E/181 K/182Q/183Q/18471857186*, 179K/180E/181 K/182K/183V/18471857185%179k180T/181 D/182K/183U18471857186% 111P/241Q, 1Kt114T/115Q/116A/117D/118T7119S/120S/121P/122D/123P/124L, e114T/115Q/11617117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L

A fitase da invenção pode ser uma variante de qualquer fitasedo tipo selvagem ou variante. Nas formas de realização particulares, ela é umavariante da fitase de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 6, SEQ LD NO: 9, ou uma variante de qualquer uma das variantes defitase relacionadas à SEQID NO: 9 e listadas na Figura 1.

A fitase da invenção pode, além disso, compreender umaalteração (substituição) ou uma combinação de alterações (substituições)selecionadas dentre as alterações (substituições) listadas em cada fileira daFigura 1.

As variantes da fitase particularmente preferidas de SEQ IDNO: 2 são as seguintes: R339D, N4P, G5P, QllIP, El*, El*/E2*,El*/E2*/Q3*, M273L e N286K, assim como qualquer de suas combinações,bem como as variantes correspondentes das SEQ ED NOs: 3, 4 e 6.

Fitases particularmente preferidas da invenção compreendempelo menos uma das seguintes alterações: 339D, 4P, 5P, 11 IP, 1*, l*/2*,1 */2*/3*, 273L, e/ou 286K.

A invenção também diz respeito a uma fitase que tem pelomenos 74% de identidade com a SEQ ID NO: 2 e que compreende pelomenos uma das seguintes alterações:

(i) 141C/199C, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C e/ou162C/247C;

(ii) 41P, 91P, 136P, 137P, 154P, 161P, 355P, 111 Ρ, 240P, 282P, 283P, 284P,289P, 4P e/ou 5P;

(iii) 52E, 551, 57Y, 104A/105F, 107D,G, 109A,G, 76G, 84Y, 121T, 362K,273L,Q, 285G,R, 286K,Q, 294T, 299L, 331K/55D e/ou 351Y;

(iv) 1*, l*/2* ou l*/2*/3*j

(v) em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 foramsubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

(vi) 119R,K, e/ou 411R,K;

vii) 107Ee/ou 164E,D;

(viii) 362R,K, 276R,K, 379R,K, 409D,E, 223E, 385D, 46D,E, 410D,E e/ou82E;

(ix) 218Q, 324N, 200R,K, 121D, 196Q, 202N, 406A, 167Q, 53V,Q, 241Q,314N,G, 239Q, e/ou 285N;

(χ) 114H/115Q/116E/117K/118M/119G/120T/121M/122D/123P/124T,114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121V/122D/123S/124L,114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121M/122D/123P/124V,114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121A/122D/123P/124L,114Τ/115Q/116Τ/117D/118Τ/119S/120S/121P/122D/123P/124L ou114N/115Q/116A/117D/118L/119K/120K/121T/122D/123P/124L;

(xi) 31T, 74A, 171T, 203T, 281H, 316D e/ou 308A; e/ou

(xii) 339D.

Estratégia para preparar as variantes

A estrutura da fitase de C. braakii ATCC 51113 foi construídapor modelagem de homologia, com o uso, como um gabarito, da estrutura dafitase AppA de E. coli [Banco de Dados de Proteínas id.: 1DKO; Lim et al.,Nat. Struct. Biol. (2000), volume 2, pp. 108-113].

A estrutura foi submetida a simulações da dinâmica molecular(MD) e cálculos eletrostáticos. As posições para as pontes dissulfeto supostase as prolinas foram também identificadas, bem como outras posições deimportância potencial a respeito das várias propriedades enzimáticasdesejáveis. Finalmente, sítios de glicosilação supostos (extensões de NXT ouNXS) foram identificados.

Todas estas sugestões foram avaliadas dentro do esqueleto daestrutura modelada e os resultados de simulação, quanto à propriedade determoestabilidade, com ênfase particular na extremidade de alta temperatura.

As variantes correspondentes da fitase foram preparadas pormétodos conhecidos na técnica, e testadas como descrito na parteexperimental.

Percentual de identidade dos polipeptídeos da fitase

No presente contexto, uma fitase é um polipeptídeo tendoatividade de fitase, isto é, uma enzima que catalisa a hidrólise do fitato(hexaquisfosfato de mio-inositol) em (1) mio-inositol e/ou (2) seus mono-, di-tri-, tetra- e/ou pentafosfatos, e (3) fosfato inorgânico.

No presente contexto, a expressão substrato de fitase inclui,inter alia, o ácido fítico e qualquer fitato (sal de ácido fítico), bem como osfosfatos listados sob (2) acima.O site ΕΝΖΥΜΕ na internet (http://www.expasy.ch/enzymeA)é um repositório de informações relativas à nomenclatura de enzimas. Baseia-se principalmente nas recomendações do Nomenclature Committee daInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB) edescreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número da EC(Enzyme Commission) tenha sido fornecido (Bairoch, A. The ΕΝΖΥΜΕdatabase, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305). Ver também o manualEnzyme Nomenclature from NC-IUBMB, 1992).

De acordo com o site ENZYME, três diferentes tipos de fitasessão conhecidos: um assim chamado 3-fitase (nome alternativo 1-fitase; umahexafosfato de mio-inositol 3-fosfoidrolase, EC 3.1.3.8), uma assim chamada4-fitase (nome alternativo 6-fítase, nome com base no sistema de numeraçãoIL e não de numeração 1D, EC 3.1.3.26), e uma assim chamada 5-fitase (EC3.1.3.72). Para os fins da presente invenção, todos os três tipos são incluídosna definição da fitase.

Em uma forma de realização particular, as fitases da invençãopertencem à família da histidina ácida fosfatase, que inclui a fosfatase ácidade pH 2,5 de Escherichia coli (gene appA) bem como as fitases fungicas taiscomo as fitases A e B de Aspergillus awamorii (EC: 3.1.3.8) (genes phyA ephyB). As histidinas fosfatases ácidas compartilham duas regiões dasimilaridade de seqüência, cada uma centralizada ao redor de um resíduo dehistidina conservado. Estas duas histidinas parecem estar envolvidas nomecanismo catalítico das enzimas. A primeira histidina localiza-se na seçãoN-terminal e forma um intermediário da fosfor-histidina, enquanto a segundalocaliza-se na seção C-terminal e, possivelmente, atua como doador de prótons.

Em uma outra forma de realização particular, as fitases dainvenção têm um motivo de sítio ativo conservado, a saber, R-H-G-X-R-X-P,em que X designa qualquer aminoácido (ver aminoácidos 16 a 22 das SEQ IDNOs: 2, 3, 4, 6, e aminoácidos 38 a 44 da SEQ ID NO: 9). Em uma forma derealização preferida, o motivo de sítio ativo conservado é R-H-G-V-R-A-P,isto é, aminoácidos 16 a 22 (por referência à SEQ ID NO: 2) são RHGVRAP.

Para os fins da presente invenção, a atividade da fitase édeterminada na unidade FYT, uma FYT sendo a quantidade de enzima quelibera 1 micromol de orto-fosfato inorgânico por minuto, sob as seguintescondições: pH 5,5; temperatura 37°C; substrato: fitato de sódio(C6H6O24P6Nai2) em uma concentração de 0,0050 mol/litro. Ensaios de fitaseadequados são os ensaios de FYT e FTU descritos no Exemplo 1 da WO00/20569. O FTU é para determinar a atividade da fitase no alimento e na pré-mistura. A atividade da fitase pode também ser determinada com o uso dosensaios do Exemplo 1 ("Determinação da atividade da fosfatase" ou"Determinação da atividade da fitase").

Em uma forma de realização particular, a fitase da invenção éisolada. O termo "isolada", como aqui usado, refere-se a um polipeptídeo queé pelo menos 20% puro, preferivelmente pelo menos 40% puro, maispreferível pelo menos 60% puro, ainda mais preferível pelo menos 80% puro,o mais preferível pelo menos 90% puro, e o mais preferível ainda pelo menos95% puro, determinado por SDS-PAGE. Em particular, é preferível que ospolipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação dos polipeptídeos seja essencialmente livre de outro materialpolipeptídico com o qual ele esteja nativamente associado. Isto pode serrealizado, por exemplo, pelo preparo do polipeptídeo por meio de métodosrecombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássica.

O relacionamento entre duas seqüências de aminoácidos édescrito pelo parâmetro "identidade". Para os fins da presente invenção, oalinhamento de duas seqüências de aminoácidos é determinado pelo uso doprograma Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. Oprograma Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito emNeedleman, S. Β. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matrizde substituição usada é BLOSUM62, a penalidade de abertura de intervalo é10, e a penalidade de extensão de abertura é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácidos da presente invenção (a "seqüência da invenção" e a seqüência de aminoácidosreferida nas reivindicações (SEQ ID NO: 2) são calculadas como o número decombinações exatas em um alinhamento das duas seqüências, dividido pelocomprimento da "seqüência da invenção", ou pelo comprimento da SEQ IDNO: 2, qualquer que seja a mais curta. O resultado é expresso em percentual de identidade.

Uma combinação exata ocorre quando a "seqüência dainvenção" e a SEQ LD NO: 2 têm resíduos idênticos de aminoácidos nasmesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo, isto érepresentado por O comprimento de uma seqüência é o número de resíduos de aminoácidos na seqüência (por exemplo, o comprimento dosaminoácidos 1 a 411 da SEQ ID NO: 2 é 411).

O Exemplo 13 é um exemplo de um alinhamento da fitase daSEQ ID NO: 2 e da fitase da SEQ ID NO: 9, e o exemplo ilustra comocalcular o percentual de identidade entre estas duas estruturas.

Em outro exemplo de alinhamento, puramente hipotético,abaixo, a sobreposição é a seqüência de aminoácidos "HTWGER-NL" daSeqüência 1; ou a seqüência de aminoácidos "HGWGEDANL" da Seqüência2. No exemplo, um intervalo é indicado por um "-".

Exemplo hipotético de alinhamento:

Seqüência 1: AGMSHTW3ER-HL

Seqüência 2: HGWGEDANLAMNPS

Em uma forma de realização particular, o percentual deidentidade de uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo com, oupara, a SEQ LD NO: 2, é determinado por i) alinhar as duas seqüências deaminoácidos com o uso do programa Needle, com a matriz de substituiçãoBLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10, e umapenalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) contar o número decombinações exatas no alinhamento; iii) dividir o número de combinaçõesexatas pelo comprimento das mais curtas das duas seqüências deaminoácidos, e iv) converter o resultado da divisão de iii) em percentual.

No exemplo hipotético acima, o número de combinaçõesexatas é 6, o comprimento daquela mais curta das duas seqüências deaminoácidos é 12; conseqüentemente, o percentual de identidade é de 50%.

Nas formas de realização particulares da fitase da invenção, ograu de identidade para a SEQ ID NO: 2 é de pelo menos 75%, 76%, 77%,78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%. Em aindaoutras formas de realização particulares, o grau de identidade é de pelo menos98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%,99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou pelo menos 99,9%. Nas formas de realizaçãoalternativas, o grau de identidade é de pelo menos 70%, 71%, 72%, ou pelomenos 73%.

Em ainda outras formas de realização particulares, a fitase dainvenção tem não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou não mais do que 10,alterações em comparação com a SEQ ID NO: 2; não mais do que 11,12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, ou não mais do que 20 alterações em comparação coma SEQ ID NO: 2; não mais do que 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou nãomais do que 30, alterações, em comparação com a SEQ ED NO: 2; não maisdo que 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou não mais do que 40, alterações,em comparação com a SEQ ID NO: 2; não mais do que 41, 42, 43, 44, 45, 46,47, 48, 49, ou não mais do que 50 alterações em comparação com a SEQ IDNO: 2; não mais do que 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ou não mais do que60, alterações em comparação com a SEQ ED NO: 2; não mais do que 61 ,62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, ou não mais do que 70 alterações em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2; não mais do que 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ounão mais do que 80 alterações em comparação com a SEQ ID NO: 2; nãomais do que 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ou não mais do que 90alterações em comparação com a SEQ ID NO: 2; não mais do que 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99, ou não mais do que 100 alterações em comparação coma SEQ ID NO: 2; não mais do que 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,109, ou não mais do que 110 alterações em comparação com a SEQ ED NO:2; não mais do que 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, ou não maisdo que 120 alterações em comparação com a SEQ ID NO: 2; ou não mais doque 121, 122, 123 ou 124 alterações, em comparação com a SEQ ID NO: 2.

Numeração de posição

A nomenclatura aqui usada para definir as posições deaminoácidos baseia-se na seqüência de aminoácidos da fitase derivada deCitrobacter braakii ATCC 51113, a seqüência madura sobre a qual émencionado na listagem de seqüência como SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 1 a411 da SEQ ID NO: 2). Conseqüentemente, no presente contexto, a base paranumerar as posições é a SEQ ID NO: 2 iniciando com El e finalizando comE411.

Quando aqui usada, a expressão parte (ou seqüência) "madura"refere-se àquela parte do polipeptídeo que é secretada por uma célula quecontenha, como parte do seu equipamento genético, um polinucleotídeocodificando o polipeptídeo. Em outras palavra, a parte do polipeptídeomaduro refere-se àquela parte do polipeptídeo que permanece após a parte dopeptídeo de sinal, bem como uma parte de pró-peptídeo, se houver, tenha sidoseparada por clivagem. A parte do peptídeo de sinal pode ser prognosticadapor programas conhecidos na técnica (por exemplo, SignalP). A parte dopeptídeo de sinal esperada da SEQ ID NO: 2 é incluída na presente listagemde seqüências como SEQ ID NO: 8, a qual é codificada pela SEQ ID NO: 7.A SEQ ID NO: 2 é a parte madura esperada. Geralmente, o primeiroaminoácido da parte madura de uma enzima pode ser determinado pelaseqüenciação de N-terminal da enzima purificada. Qualquer diferença entre aparte do peptídeo de sinal e a parte madura deve então ser devida à presençade um pró-peptídeo.

Alterações como substituições, deleções, inserções

Uma variante da fitase pode compreender vários tipos dealterações relativas a um gabarito (isto é, uma seqüência de aminoácidos dereferência ou comparativa, tal como a SEQ ID NO: 2): Um aminoácido pode ser substituído por outro aminoácido; um aminoácido pode ser deletado; umaminoácido pode ser introduzido; assim como qualquer combinação dequalquer número de tais alterações. No presente contexto, o termo "inserção"pretende cobrir também as extensões N-terminais e/ou C-terminais.

A nomenclatura geral aqui usada para uma alteração única é aseguinte: XDcY, em que "X" e "Y" independentemente designam um códigode aminoácido de uma letra, ou um "*" (deleção de um aminoácido), "D"designa um número, e "c" designa um contador alfabético (a, b, c, e assim pordiante), o qual se acha apenas presente nas inserções. Referência é feita àTabela 1 abaixo, a qual descreve exemplos puramente hipotéticos de aplicar esta nomenclatura a vários tipos de alterações.TABELA 1

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Como explicado acima, o número de posição "D" é contado apartir do primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

Várias alterações na mesma seqüência são separadas por "/"(barras inclinadas); por exemplo a designação "1*/2*/3*" significa que osaminoácidos nas posições 1, 2 e 3 são todos deletados, e a designação"104A/105F" significa que o aminoácido na posição número 104 é substituídopor A, e o aminoácido na posição número 105 é substituído por F.

As alterações alternativas são separadas por "," (vírgula); porexemplo, a designação "119R,K" significa que o aminoácido na posição 119 ésubstituído por Rou K.

As vírgulas aqui usadas em várias outras enumerações depossibilidades significam o que elas usualmente representamgramaticalmente, a saber, freqüentemente e/ou. Por exemplo, a primeiravírgula na listagem "53V,Q, 12ID e/ou 167Q" denota uma alternativa (V ouQ), enquanto as duas vírgulas seguintes devem ser interpretadas como opõese/ou: 53V ou Q, e/ou 121D, e/ou 167Q.

No presente contexto "pelo menos uma" (por exemplo,alteração) significa uma ou mais, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10alterações; ou 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28 ou 30 alterações; e assimpor diante, até um número máximo de alterações de 125, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190, ou de 200. As variantes da fitase da invenção, entretanto, aindatêm de ser pelo menos 74% idênticas à SEQ ED NO: 2, este percentual sendodeterminado conforme descrito acima.

Uma substituição ou extensão sem qualquer indicação do que com elas substituir ou estender, refere-se à introdução de qualqueraminoácido natural ou não natural, exceto aquele que ocupe esta posição nogabarito.

O Exemplo 13 fornece outra ilustração de como aplicar estanomenclatura.

Identificação dos números das correspondentes posições

Como explanado acima, a fitase madura do Citrobacter braakiiATCC 51113 (SEQ ID NO: 2) é usada como o padrão para a numeração dasposições e, por esse meio, também para a nomenclatura.

Para outra fitase, em particular uma variante da fitase dainvenção, a posição correspondente à posição D na SEQ ID NO: 2 éencontrada pelo alinhamento das duas seqüências conforme especificadoacima na seção intitulada "Percentual de Identidade dos Polipeptídeos daFitase". A partir do alinhamento, a posição na seqüência da invençãocorrespondente à posição D da SEQ ID NO: 2 pode ser clara e nãoambiguamente identificada (as duas posições no topo uma da outra noalinhamento).

O Exemplo 13 é um exemplo de um alinhamento da fitase daSEQ ID NO: 2 com a fitase da SEQ ED NO: 9, e o exemplo ilustra como asposições correspondentes nestas duas estruturas são identificadas.Abaixo, alguns exemplos adicionais puramente hipotéticos sãoincluídos, os quais são derivados da Tabela 1 acima, a qual, na terceiracoluna, inclui vários alinhamentos de duas seqüências:

Considerar a terceira célula na primeira fileira da Tabela 1: A seqüência superior é o gabarito, a inferior é a variante. O número de posição80 refere-se ao resíduo G do aminoácido no gabarito. O aminoácido A ocupaa posição correspondente na variante. Conseqüentemente, esta substituição édesignada G80A.

Considerar agora a terceira célula na segunda fileira da Tabela 1: A seqüência superior é novamente o gabarito e a inferior é a variante. Onúmero de posição 80 refere-se novamente ao resíduo G do aminoácido nogabarito. A variante tem duas inserções, a saber, TY, após G80 e antes de V81no gabarito. Considerando que as T e Y naturalmente devem ter seu próprionúmero de posição "real" na seqüência de aminoácidos variante, para a presente finalidade nós sempre nos referimos aos números de posição dogabarito, e conseqüentemente a T e a Y são referidas como estando nosnúmeros de posição 80a e 80b, respectivamente.

Finalmente, considerar a terceira célula na última fileira daTabela 1: o número de posição 275 refere-se ao último aminoácido do gabarito. Uma extensão C-terminal de ST é referida como estando nosnúmeros de posição 275a e 275b, respectivamente, embora, novamente, elasnaturalmente tenham seu próprio número de posição "real" na seqüência deaminoácidos variante.

Propriedades aperfeiçoadas, fitase de referência Em uma forma de realização particular, a fitase da invençãotem propriedades aperfeiçoadas, preferivelmente melhoradas. Os termos"aperfeiçoadas" e "melhoradas" implicam em uma comparação com outrafitase. Exemplos dessas outras fitases de referência, ou comparativas, são:SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4. Contudo, outros exemplos de fitases dereferência podem ser a SEQ ID NO: 2 e/ou a SEQ ID NO: 6. Um outroexemplo ainda de uma fitase de referência pode ser a SEQ ED NO: 9 e as suasvariantes apresentadas na Figura 1.

Exemplos não limitativos de propriedades que sãoaperfeiçoadas, preferi velmente melhoradas, são os seguintes:Termoestabilidade, perfil de pH, atividade específica, desempenho na raçãopara animal, sensibilidade à protease, e/ou padrão de glicosilação. A fitase dainvenção pode também ter um perfil de temperatura aperfeiçoado,preferivelmente melhorado, e/ou ela pode incorporar uma mudança de umsítio de clivagem da protease potencial.

Termoestabilidade

A termoestabilidade, ou estabilidade da temperatura, pode serdeterminada como descrito no Exemplo 1, sob o título de "Determinação daestabilidade de temperatura". Conseqüentemente, em uma forma de realizaçãopreferida, uma fitase da invenção tem uma atividade residual que é maiselevada do que a atividade residual de uma fitase de referência, em que aatividade residual seja determinada como segue: Um sobrenadante dafermentação é dividido em duas partes, uma parte é incubada por 30 minutosem uma temperatura elevada desejada, e a outra parte por 30 minutos em 5°C,em seguida ao que a atividade de ambas é determinada sobre o fosfato de p-nitrofenila em 37°C e pH 5,5, e a atividade da amostra que foi incubada emuma temperatura elevada é dividida pela atividade da mesma amostra quehavia sido incubada em 5°C. As temperaturas elevadas preferidas são de50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C ou 85°C. Se desejável, asamostras contendo a enzima podem ser diluídas em NaAc 0,1 M em pH 5,5.A atividade residual de uma fitase da invenção é preferivelmente de pelomenos 105%, ou pelo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150% da atividaderesidual da fitase de referência. Em ainda outras formas de realização, aatividade residual de uma fitase da invenção é de pelo menos 200%, ou depelo menos 250%, 300%, 400%, ou de pelo menos 500% da atividaderesidual da fitase de referência. Em ainda outras formas de realização, aatividade residual de uma fitase da invenção é de pelo menos 2x, 3x, 4x, 5x,6x, 7x, IOx, 15x, 20x, ou de pelo menos 25x a atividade residual da fitase dereferência.A termoestabilidade pode também ser determinada comodescrito no Exemplo 5. Conseqüentemente, em uma forma de realizaçãopreferida, uma fitase da invenção tem uma atividade residual que é maiselevada do que a atividade residual de uma fitase de referência, em que aatividade residual é determinada como segue: Um sobrenadante dafermentação é dividido em duas partes, uma parte é incubada por 30 minutosem 50°C, e a outra parte por 30 minutos em 5°C, em seguida ao que aatividade de ambas é determinada sobre o fosfato de p-nitrofenila em 37°C epH 5,5, e a atividade da amostra que foi incubada em uma temperaturaelevada é dividida pela atividade da mesma amostra que tenha sido incubadaem 5°C. Se desejável, as amostras contendo a enzima podem ser diluídas emNaAc 0,1 M, em pH 5,5. A atividade residual de uma fitase da invenção épreferivelmente de pelo menos 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, IOx, 15x, 20x, ou depelo menos 25x a atividade residual da fitase de referência da SEQID NO: 3.A atividade residual de uma fitase da invenção situa-se preferivelmente empelo menos 105%, ou pelo menos 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%,170%, 180%, 190% ou pelo menos 200% da atividade residual da fitase dereferência da SEQ ID NO: 2. As seguintes substituições são particularmentepreferidas, já que elas melhoram a termoestabilidade em comparação com afitase da SEQ ID NO: 3, bem como com a fitase da SEQ ID NO: 2 (ver aTabela 3): 4P, 5P, 111P, 1*, l*/2*, l*/2*/3*, 273L, e/ou 286Q.A termoestabilidade pode também ser determinada comodescrito no Exemplo 8. Conseqüentemente, em uma forma de realizaçãopreferida, uma fitase da invenção tem uma atividade residual que é maior doque a atividade residual de uma fitase de referência, em que a atividaderesidual é determinada como segue: Um sobrenadante de fermentação édividido em duas partes, uma parte é incubada por 30 minutos em 60°C, e aoutra parte, por 30 minutos em 5 °C, em seguida ao que a atividade de ambas édeterminada sobre fosfato de p-nitrofenila em 37°C e pH 5,5, e a atividade daamostra que havia sido incubada em uma temperatura elevada é dividida pelaatividade da mesma amostra que havia sido incubada em 5°C. Se desejável, asamostras contendo a enzima podem ser diluídas em NaAc 0,1 M em pH 5,5,opcionalmente incluindo 0,005% de Tween-20. A fitase da invenção e a fitasede referência podem ser expressas em uma cepa hospedeira de Bacillussubtilis. A cepa hospedeira pode ser cultivada em 100 ml de meio de PSl[100 g/litro de sacarose, 40 g/litro de flocos de soja, 10 g/litro deNa2HPO4.12H20, 0,1 ml/litro de Dowfax 63N10 (Dow)] em frascos deagitação de 500 ml por quatro dias a 3O0C em 300 rpm. A atividade residualde uma fitase da invenção é preferivelmente de pelo menos 32%, ou pelomenos 34%, 36%, 38%, ou pelo menos 40% da atividade residual da fitase dereferência da SEQ ID NO: 2. Mais preferível, a atividade residual de umafitase da invenção é de pelo menos 50%, ou de 60%, 70%, 80%, 90%, ou depelo menos 100% da atividade residual da fitase de referência de SEQID NO:2. Ainda mais preferível é que a atividade residual de uma fitase da invençãoseja de pelo menos 120%, 140%, 160%, 180%, ou pelo menos 200% daatividade residual da fitase de referência de SEQ ID NO: 2. Mais preferível, aatividade residual de uma fitase da invenção é de pelo menos 2x, ou pelomenos 3x, 4x ou pelo menos 5x a atividade residual da fitase de referência deSEQ ID NO: 2. As seguintes substituições são particularmente preferidas (verTabela 5):

(i) 409E, 136P;

(ii) 411K, 331K/55D, 167Q, 179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*,107E;(iii) 196Q, 276R, 285G, 299L, 200Κ;

(iv) 119R, 121D, 107D, 179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*;

(ν) 314N, 161P, 410D, 141C, 179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*,285N;

(vi) 164E, 411R, 52C, 137P, 314G;

(vii) 1K, l*/2*/3*, 121T, 406A, 82E, 109A;

(iix) 5P, 57Y, 379R, l*/2*;

(ix) 41OE5 1*,119K, 52E;

(χ) 4P, 362K, 202N, 276K, 385D;

(xi) 111P/241Q, 162C, 179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*, 241Q;

(xii) 223E, 286Q, 107G, 114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L, 379K, 273L;

(xiii) 31C, 53V, 59C/100C;

(xiv) 46E, 11 IP, 114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L, 76G, 362R;

(xv) 141C/199C, 52C/99C.

A termoestabilidade pode também ser determinada comodescrito no Exemplo 9, isto é, com o uso de medições de DSC paradeterminar a temperatura de desnaturação, Td, da proteína de fitasepurificada. A Td é um indicativo da termoestabilidade da proteína: Quantomais elevada a Td, mais elevada a termoestabilidade. Conseqüentemente, emuma forma de realização preferida, a fitase da invenção tem uma Td que émais alta do que a Td de uma fitase de referência, em que a Td é determinadasobre amostras de fitase purificada (preferivelmente com uma pureza de pelomenos 95%, determinada por SDS-PAGE), após a diálise em acetato de Na 20mM, pH 4,0 (preferivelmente em uma etapa de 2 a 3 horas seguida por umaetapa noturna), seguida por filtração de 0,45 um e diluição com tampão dediálise até uma concentração de proteína correspondente a aproximadamente2 unidades de absorbância (A2go), usando a Calorimetria de VarreduraDiferencial em um índice de varredura de 90°C/hora de 20 a 90°C em tampãode acetato de Na 20 mM, pH 4,0. Em uma forma de realização preferida, a Tdda fitase da invenção é mais elevada do que a Td da fitase de SEQ LD NO: 4,mais preferível de pelo menos 101% desta, ou pelo menos 102%, 103%,104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, ou pelo menos 110% desta. Aindamais preferível, a Td da fitase da invenção é pelo menos 120%, 130%, 140%,150%, 160%, 170%, 180%, ou pelo menos 190% da Td da fitase da SEQ IDNO: 4. As seguintes substituições são particularmente preferidas (ver Tabela6): 362K, 362R, 11 IP, e/ou 273L. Em ainda outras formas de realizaçãoparticulares, a fitase termoestável da invenção tem uma temperatura de fusão,Tm (ou uma temperatura de desnaturação, Td), conforme determinado com ouso da Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) como descrito noExemplo 2 (isto é, em acetato de sódio 20 mM, pH 4,0), de pelo menos 50°C.

Em ainda outras formas de realização particulares, a Tm é de pelo menos 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62,5. 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 100°C. As medições de DSCpodem também ser realizadas como descrito no Exemplo 1 ("medições deDSC"), ou no Exemplo 2 ("Termoestabilidade por DSC").

A termoestabilidade também pode ser determinada comodescrito no Exemplo 12. Conseqüentemente, em uma forma de realizaçãopreferida, a fitase da invenção, após a incubação por 60 minutos em 70°C epH 4,0, tem uma atividade residual melhorada em comparação com aatividade residual de uma fitase de referência tratada da mesma maneira, a atividade residual sendo calculada para cada fitase em relação à atividadeencontrada antes da incubação (em 0 minuto). A atividade residual épreferivelmente medida sobre fitato de sódio em pH 5,5 e 37°C. A incubaçãoé preferivelmente em acetato de sódio 0,1 M, pH 4,0. A fitase é de preferênciapurificada, mais preferível até uma pureza de pelo menos 95%, determinadapor SDS-PAGE. Um tampão de ensaio da atividade da fitase preferido é oacetato de Na 0,25 M, em pH 5,5. Com o uso deste método, a atividaderesidual da fitase da invenção é preferivelmente de pelo menos 105% daatividade residual da fitase de referência, mais preferível de pelo menos110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, ou pelomenos 200%. Na alternativa a atividade residual relativa à atividade em 0minuto, é preferivelmente de pelo menos 31%, ou de pelo menos 32%. Asseguintes substituições proporcionando termoestabilidade melhorada sãopreferidas (ver Tabela 9): 273L, 46E, 362R e/ou 53V.

Em uma forma de realização particular, a variante de fitase dainvenção é mais termoestável do que a fitase de referência, em que atermoestabilidade é determinada com o uso de qualquer dos quatro testesmencionados acima (Com base nos Exemplos 1, 5, 8, 9 ou 12).

Nas formas de realização particulares, uma termoestabilidademelhorada é esperada das seguintes variantes da fitase da SEQ ID NO: 2 (naordem de preferência, dentro de cada agrupamento):

(i) K141C/V199C, Q91C/W46C, G52C/A99C, N31C/E176C, N31C/T177C,G59C/F100C, S162C/S247C;

(ii) D41P, Q91P, N136P, T137P, L154P, S161P, T355P, Qll IP, K240P,G282P, T283P, T284P, G289P, N4P, G5P;

(iii) G52E, V55I, E57Y, L104A/A105F, K107D,G, Q109A,G, T76G, A84Y,N121T, I362K, M273L.Q, E285G,R, N286Q, V294T, I299L, E331K/V55D,F351Y;

(iv) El*, El*/E2*, El*/E2*/Q3*;

(v) substituindo o elo compreendido entre Cl78 e Cl87 com elos mais curtosselecionados, por exemplo, de QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ,KEKQQ, KEKKV, KTDKL;

(vi) El 19R,K, E411R,K;

(vii) K107E, R164E,D;(viii) I362R,K, T276R,K, I379R,K, V409D,E, Q223E, N385D, W46D,E,T4IOD5E, Q82E.

(ix) substituindo o elo entre os resíduos 114 e 124 (YQKDEEKNDPL) quefaceia o sítio ativo com um elo selecionado, por exemplo, de

HQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTS SPDPL,HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL;(x) R339D.

Perfil da temperatura

Quer ou não uma fitase da invenção tenha um perfil detemperatura aperfeiçoado em comparação com uma fitase de referência, podeser determinada como descrito no Exemplo 10. Conseqüentemente, em umaforma de realização particular, a fitase da invenção tem um perfil detemperatura aperfeiçoado em comparação com uma fitase de referência, emque o perfil de temperatura seja determinado como atividade da fitase comouma função da temperatura sobre o filato de sódio em pH 5,5 na faixa detemperatura de 20 a 90°C (em etapas de 10°C). Um tampão preferido é otampão de acetato de Na em 0,25 M, pH 5,5. A atividade de cada temperaturaé preferivelmente indicada como atividade relativa (em%) normalizada até ovalor na temperatura ótima. A temperatura ótima é aquela temperatura dentrodas temperaturas testadas (isto é, aquelas com saltos de 10°C) em que aatividade seja a mais elevada.

Em uma forma de realização preferida, a fitase da invençãotem uma atividade relativa em 70°C de pelo menos 18%, ou de pelo menos19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, ou pelo menos 25%. Como explanadoacima, isto é relativo à atividade na temperatura ótima. Mais preferível, afitase da invenção tem uma atividade relativa em 70°C de pelo menos 26%,27%, 28%, 29%, 30%, 31%, ou pelo menos 32%. Substituições preferidas queproporcionem um perfil de temperatura aperfeiçoado (na forma de umaatividade relativa superior em 70°C) são (ver Tabela 7):57Y, 76G, 107G,273L, 362Κ, 46Ε, 362R, 53V e/ou 241Q. Sua atividade relativa em 70°C émais elevada em comparação com a fitase de referência da SEQ ID NOs: 3 e4, e, em alguns casos (57Y, 76G, 107G, 273L, 362K, 362R e/ou 53V)também em comparação com a fitase de referência da SEQ ID NO: 2.Perfil do pHQuer ou não uma fitase da invenção tenha um perfil de pHaperfeiçoado em comparação com uma fitase de referência, pode serdeterminado como descrito no Exemplo 11. Conseqüentemente, em umaforma de realização particular a fitase da invenção tem um perfil de pHaperfeiçoado em comparação com uma fitase de referência, em que o perfil depH é determinado como atividade da fitase como uma função do pH sobre ofitato de sódio a 37°C na faixa de pH de 2,0 a 7,5 (em etapas unitárias de pH0,5). Um tampão preferido é um coquetel de glicina 50 mM, ácido acético 50mM e Bis-Tris 50 mM. Outro tampão preferido é o acetato de sódio 0,25 M.A atividade de cada pH é preferivelmente indicada como atividade relativa(em%) normalizada ao valor no pH ótimo.Um exemplo de um perfil de pH aperfeiçoado é aquele em quea curva do pH (atividade relativa como uma função do pH) é alterado nadireção de pH mais elevado ou mais baixo. Substituições preferidas queproporcionam uma alteração de 0,5 unidade de pH em direção a um pH maiselevado em comparação com a fitase de referência da SEQ ID NOs: 2, 3 ou 4,são (ver Tabela 8): 46E e/ou 218Q.Outro exemplo de um perfil de pH aperfeiçoado é aquele emque o pH ótimo é alterado, na direção para cima ou para baixo. Substituiçõespreferidas que proporcionam um pH ótimo inferior em comparação com asSEQ ID NOs: 2, 3 e 4, são (ver a Tabela 8): 46E, 12ID e/ou 200K.Substituições preferidas que proporcionam um pH ótimo mais elevado emcomparação com as SEQ ID NOs: 2, 3 e 4 são (ver Tabela 8): 218Q e/ou241Q.Um perfil de pH aperfeiçoado pode também ser determinadocomo descrito no Exemplo 1 ("Perfil de pH aperfeiçoado: Determinação darelação da atividade de pH 3,5/5,5"), a saber, pela comparação da atividade dafosfatase em pH 3,5 e 5,5. Alternativamente, a atividade no pH 3,5 pode sercomparada com a atividade nos pH 4,0, 4,5 ou 5,0. Em ainda uma outra formade realização alternativa, as atividades da fitase são comparadas, ao invés dasatividades da fosfatase.

Em uma forma de realização particular, a fitase da invençãotem um perfil de pH aperfeiçoado em comparação com uma fitase dereferência. Mais em particular, o perfil de pH é aperfeiçoado na faixa de pHde 3,5 a 5,5. Mais em particular ainda, a atividade no pH 4,0, 4,5, 5,0 e/ou 5,5situa-se em um nível de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,85%, 90% ou pelo menos 95% da atividade no pH ótimo (pH 3,5).

O perfil do pH. bem como o pH ótimo, de um polipeptídeopode ser determinado pela sua incubação em vários valores de pH, com o usode um substrato em uma concentração predeterminada e uma temperatura deincubação fixa. O perfil de pH é uma representação gráfica da atividade dafitase em relação ao pH, o pH ótimo sendo determinado do perfil do pH. Emuma forma de realização particular, o ensaio da fosfatase ou da fitase doExemplo 1 é usado, por exemplo o substrato é fitato de sódio 5 mM, atemperatura da reação é de 37°C, e a atividade é determinada em váriosvalores de pH, por exemplo o pH 2 a 12, substituindo-se o tampão de acetatode pH 5,5 por um tampão adequado. Exemplos de tampões adequados são:glicina/HCl 0,1 M (pH 2,0 a 3,5), NaAc/Ac 0,1 M (pH 4,0 a 5,0), Bis-Tris/HCl 0,1 M (pH 5,5 a 6,5), Tris/HCl 0,1 M (pH 7,0). Outros exemplos detampões são: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM,CABS 100 mM, ajustados a valores do pH de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0,7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0 e 12,0 com HCl ou NaOH.

Nas formas de realização particulares, um perfil de pHaperfeiçoado é esperado das seguintes variantes da fitase de SEQ ID NO: 2(na ordem de preferência dentro de cada agrupamento):(i) E218Q, D324N, T200R,K, N121D, E196Q, D202N, E406A, E167Q,E53V,Q, E241Q, D314N,G, E239Q, E285N;

(ii) substituindo-se o elo entre os resíduos 114 e 124 (YQKDEEKNDPL) quefaceiam o sítio ativo com um elo selecionado, por exemplo, deHQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTS SPDPL,HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL.

Atividade específica

Em uma forma de realização particular, a fitase da invençãotem uma atividade específica melhorada em relação a uma fitase dereferência. Mais em particular, a atividade específica de uma fitase dainvenção é de pelo menos 105%, em relação à atividade específica de umafitase de referência determinada pelo mesmo procedimento. Em ainda outrasformas de realização particulares, a atividade específica relativa é de pelomenos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220,240, 260, 280, 300, 350 ou mesmo 400%, ainda em relação à atividadeespecífica da fitase de referência, determinada pelo mesmo procedimento.

Na alternativa, a expressão elevada atividade específica refere-se a uma atividade específica de pelo menos 200 FYT/mg de ProteínaEnzimática (EP). Em formas de realização particulares, a atividade específicaé de pelo menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300,1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500,2600, 2700, 2800, 2900 ou 3000 FYT/mg de EP.

A atividade específica é medida em amostras altamentepurificadas (um gel de amida poliacrílica de SDS deve apresentar a presençade apenas um componente). A concentração de proteína enzimática pode serdeterminada por análise de aminoácido, e a atividade da fitase nas unidadesde FYT, determinadas como descrito no Exemplo 1. A atividade específica éuma característica da variante de fitase específica em questão, e é calculadacomo a atividade da fitase medida em unidades de FYT por miligramaproteína enzimática de variante de fitase. Ver o Exemplo 7 para detalhesadicionais.

Em formas de realização particulares, uma atividade específicaaperfeiçoada é prevista das seguintes variantes da fitase de SEQ ID NO: 2, emque, na ordem de preferência, o elo entre os resíduos 114 e 124(YQKDEEKNDPL) que faceiam o sítio ativo é substituído por um eloselecionado, por exemplo, de HQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL, HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL,NQADLKKTDPL.

Desempenho na ração para animal

Em uma forma de realização particular, a fitase da invençãotem um desempenho aprimorado na ração para animal em comparação com uma fitase de referência. O desempenho na ração para animal pode serdeterminado pelo modelo in vitro do Exemplo 6. Conseqüentemente, em umaforma de realização preferida, a fitase da invenção tem um desempenhoaprimorado na ração para animal, em que o desempenho é determinado emum modelo in vitro, mediante o preparo de amostras de ração compostas de30% de farinha de soja e 70% de farinha de milho, com adição de CaC^ auma concentração de 5 g de cálcio por quilograma de ração; pré-incubar asamostras em 40°C e pH 3,0 por 30 minutos, seguido pela adição de pepsina(3000 U/g de ração) e fitase; incubar as amostras em 40°C e pH 3,0 por 60minutos, seguido por pH 4,0 por 30 minutos; interromper as reações; extrair ácido fítico e fosfatos de inositol pela adição de HCl até uma concentraçãofinal de 0,5 M e incubação a 40°C por 2 horas, seguida por um ciclo decongelamento-descongelamento e 1 hora de incubação em 40°C; separar oácido fítico e os fosfatos de inositol mediante cromatografia de íons de altodesempenho; determinar a quantidade de fósforo de filato residual (IP6-P);calcular a diferença no ΓΡ6-Ρ residual entre a fitase tratada e uma amostrabranca de fitase não tratada (esta diferença é IP6-P degradado); e expressar oIP6-P degradado da fitase da invenção em relação ao ΓΡ6-Ρ degradado dafitase de referência (por exemplo, as fitases tendo as SEQID NO: 3 e 4).

A fitase da invenção e a fitase de referência são, naturalmente,dosadas na mesma quantidade, preferivelmente com base nas unidades deatividade da fitase (FYT). Uma dosagem preferida é de 125 FYT/kg de ração.Outra dosagem preferida é de 250 FYT/kg de ração. As fitases podem serdosadas na forma de fitases purificadas, ou na forma de sobrenadantes defermentação. As fitases purificadas preferivelmente têm uma pureza de pelomenos 95%, determinada por SDS-PAGE.

Em formas de realização preferidas, o valor de IP6-Pdegradado da fitase purificada da invenção, em relação aos valor do IP6-Pdegradado da fitase de referência, é de pelo menos 101%, ou de pelo menos102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115% ou de pelo menos 120%. Em aindaoutras formas de realização preferidas, o valor do IP6-P degradado da fitasepurificada da invenção, em relação ao valor do IP6-P degradado da fitase dereferência, é de pelo menos 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%,190% ou de pelo menos 200%. Preferivelmente, o valor do IP6-P degradadoda fitase da invenção, em relação ao valor de IP6-P degradado da fitase deSEQ ID NO: 2, é de pelo menos 105%, 110%, 113%, 115%, 120%, 125%, oude pelo menos 130%.

As seguintes substituições proporcionam um desempenhomelhorado ou pelo menos tão bom na ração para animal in vitro (ver a Tabela4A) em comparação com a fitase da SEQ ID NO: 3: 4P, 5P, 11 IP, 1*, l*/2*,1*/2*/3*, 273L, 286Q.

As seguintes substituições também proporcionam umdesempenho melhorado, ou pelo menos tão bom, na ração para animal in vitro(ver a Tabela 4B) em comparação com a fitase de SEQ ID NO: 3: 57Y, 76G,107G, 362Κ, 362R, 12 IDj 196Q, 200Κ, 202Ν, 314Ν, 406Α e114Τ/115Q/116Α/117D/118Τ/119S/120S/121P/122D/123P/124L.

Substituições ainda mais preferidas, quando elas implicam nodesempenho da ração para animal, são: 57Y, 76G, 362K, 362R, 121D, 196Q,200K, 202N e 406A.

O desempenho relativo de uma fitase da invenção podetambém ser calculado como o percentual do fósforo liberado pela fitase dereferência.

Em ainda uma outra forma de realização particular, odesempenho relativo da fitase da invenção pode ser calculado como opercentual do fósforo liberado pela fitase da invenção, em relação àquantidade de fósforo liberada pela fitase de referência.

Em ainda outras formas de realização particulares, odesempenho relativo da fitase da invenção é de pelo menos 105%,preferivelmente de pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 oupelo menos 200%.

Sensibilidade reduzida à protease

Em uma forma de realização particular, a fitase da invençãotem uma sensibilidade reduzida à protease. Mais em particular, ela tem umasensibilidade reduzida com respeito à protease Kex2, significando umatendência reduzida de tornar-se clivada por esta protease.

A variante 339D, preferivelmente a R339D, é um exemplo deuma fitase da invenção com uma sensibilidade reduzida à protease.

Padrão de glicosilação

A glicosilação é um fenômeno que é apenas observado quandose expressa proteínas em eucariotas, tais como fungos e plantas transgênicas,mas não em procariotas tais como as bactérias. Existem vários tipos deglicosilação, mas, no presente contexto, a mais relevante é a N-glicosilação,isto é, a glicosilação ligada à asparagina, em que os açúcares são ligados auma proteína, iniciando-se de uma molécula de N-acetilglicosamina ligada àsasparaginas. A N-glicosilação tem sido observada ocorrer apenas àasparaginas que, na seqüência, fazem parte dos seguintes tripeptídeos: N-X-Tou N-X-S, em que X designa qualquer aminoácido.

Surpreendentemente, uma menor termoestabilidade foiobservada quando a fitase da SEQ ID NO: 2 foi expressa no fungo (levedura)Pichia pastoris, em comparação a quando ela foi expressa no Bacillus subtilis.Ver o Exemplo 2.

Esta observação levou à proposição da presente invenção deque a termoestabilidade pode ser melhorada quanto às fitases expressas nosfungos mediante alteração dos sítios potenciais de glicosilação.

A presente invenção, conseqüentemente, também diz respeitoa variantes de fitase tendo um padrão de glicosilação aperfeiçoado,preferivelmente sítios de N-glicosilação aperfeiçoados. Espera-se que aglicosilação aperfeiçoada confira uma termoestabilidade melhorada sobre avariante da fitase, quando expressa em um fungo.

Exemplos de fitases são as fitases bacterianas, por exemplo asfitases Gram-negativas, tais como as fitases de E. coli e de Citrobacter, e suasvariantes, incluindo as fitases da presente invenção, bem como as fitases dasSEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO:9 neste relatório. Exemplos de hospedeiros de expressão fungicos são asespécies Pichia, Saccharomyces e Aspergillus.

Nas formas de realização particulares, um padrão deglicosilação aperfeiçoado é esperado das seguintes fitases da invenção (porexemplo, as variantes da SEQ ID NO: 2), na ordem de preferência: N31T,N74A, N171T, N203T, N281H, N316D, N308A. As seguintes estãosubstituindo um padrão do tipo N-X-T: N31T, N74A, N281H. As seguintesestão substituindo um padrão do tipo N-X-S: N171T, N203T, N308A,N316D.Variantes alergenicamente reduzidas

Em uma forma de realização específica, as fitases da presenteinvenção são (também) variantes alergenicamente reduzidas, projetadas parainvocar uma resposta imunológica reduzida quando expostas a animais,incluindo o ser humano. A expressão resposta imunológica deve ser entendidacomo qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto à variante dafltase. Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica que leve aníveis aumentados de IgE no animal exposto. As variantes alergenicamentereduzidas podem ser preparadas com o uso de técnicas conhecidas na prática.

Por exemplo, a variante de fitase pode ser combinada com componentespoliméricos protegendo porções ou epítopos da variante de fitase envolvidaem uma resposta imunológica. A combinação com polímeros pode envolver oacoplamento químico in vitro do polímero com a variante de fitase, porexemplo, como descrito nas WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026e/ou WO 99/00489. A combinação pode, além disso, ou alternativamenteenvolver o acoplamento in vivo dos polímeros com a variante de fitase. Talcombinação pode ser obtida pela engenharia genética da seqüência denucleotídeos que codifica a variante de fitase, introduzindo seqüências deconsenso codificando sítios de glicosilação adicionais na variante de fitase eexpressando a variante de fitase em um hospedeiro capaz de glicosilar avariante de fitase; ver, por exemplo, a WO 00/26354. Outro meio deproporcionar variantes alergenicamente reduzidas é a engenharia genética daseqüência de nucleotídeos codificando a variante de fitase, de modo a fazercom que as variantes de fitase se auto-oligomerizem, resultando em que osmonômeros das variantes de fitase possam proteger os epítopos de outrosmonômeros de variantes de fitase e, por esse meio, reduzindo a antigenicidadedos oligômeros. Tais produtos e sua preparação acham-se descritos, porexemplo, na WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em uma respostaimunológica podem ser identificados por vários métodos tais como o métodode apresentação de fago descrito nas WO 00/26230 e WO 01/83559, ou aabordagem aleatória descrita na EP 561907. Uma vez um epítopo tenha sidoidentificado, sua seqüência de aminoácidos pode ser alterada para produzirpropriedades imunológicas alteradas da variante de fitase por técnicasconhecidas de manipulação de genes, tais como a mutagênese dirigida ao sítio(ver, por exemplo, as WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103) e/oua combinação de um polímero pode ser feita em suficiente proximidade aoepítopo pelo polímero para proteger o epítopo.Seqüências e construções de ácidos nucleicos

A presente invenção também diz respeito a seqüências deácidos nucleicos compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos quecodifica uma variante de fitase da invenção.

A expressão "seqüência de ácidos nucleicos isoladas" refere-sea uma seqüência de ácidos nucleicos que é essencialmente livre de outrasseqüências de ácidos nucleicos, por exemplo, pelo menos cerca de 20% pura,preferivelmente pelo menos cerca de 40% pura, mais preferível pelo menoscerca de 60% pura, ainda mais preferível pelo menos cerca de 80% pura, e omais preferível pelo menos cerca de 90% pura, como determinado pelaeletroforese de agarose. Por exemplo, uma seqüência de ácidos nucleicosisolada pode ser obtida por procedimentos padrão de clonagem usados naengenharia genética para relocalizar a seqüência de ácidos nucleicos da sualocalização natural para um sítio diferente em que ela seja reproduzida. Osprocedimentos de clonagem podem envolver a excisão e o isolamento de umfragmento de ácido nucleico desejado compreendendo a seqüência de ácidosnucleicos codificando o polipeptídeo, a introdução do fragmento em umamolécula de vetor, e a incorporação do vetor recombinante em uma célulahospedeira, onde cópias ou clones múltiplos da seqüência de ácidos nucleicossejam replicados. A seqüência de ácidos nucleicos pode ser de origemgenômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou de quaisquer dascombinações destas.

As seqüências de ácidos nucleicos da invenção podem serpreparadas pela introdução de pelo menos uma mutação em uma seqüência degabarito codificadora da fitase, ou em uma de suas subseqüências, em que aseqüência mutante de ácidos nucleicos codifique uma fitase variante. Aintrodução de uma mutação na seqüência de ácidos nucleicos para trocar umnucleotídeo por outro nucleotídeo, pode ser realizada por qualquer dosmétodos conhecidos na técnica, por exemplo por mutagênese dirigida ao sítio,por mutagênese aleatória, ou por mutagênese aleatória dopada, reforçada oulocalizada.

A mutagênese aleatória é adequadamente realizada ou comomutagênese aleatória localizada ou específica da região em pelo menos trêspartes do gene transferindo-se para a seqüência de aminoácidos apresentadaem questão, ou dentro do gene completo. Quando a mutagênese é realizadapelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado oureforçado com os três nucleotídeos não precursores durante a síntese dooligonucleotídeo nas posições que devam ser trocadas. A dopagem e o reforçopodem ser realizados de modo que os códons para os aminoácidosindesejados sejam evitados. O oligonucleotídeo dopado ou reforçado pode serincorporado no DNA codificando a enzima da fitase por qualquer técnica,com o uso, por exemplo, de PCR, LCR ou qualquer polimerase e ligase deDNA conforme se julgue apropriado.

Preferivelmente a dopagem é realizada com o uso de"dopagem aleatória constante", em que o percentual do tipo selvagem emutação em cada posição seja pré-definido. Além disso, a dopagem pode serdirecionada a uma preferência pela introdução de certos nucleotídeos e, dessaforma, uma preferência pela introdução de um ou mais resíduos específicos deaminoácidos. A dopagem pode ser feita, por exemplo, de modo a levar emconta a introdução de 90% do tipo selvagem e 10% de mutações em cadaposição. Uma consideração adicional da escolha de um esquema de dopagembaseia-se nas limitações genéticas, bem como estruturais protéicas.

A mutagênese aleatória pode ser vantajosamente localizada emuma parte da fitase precursora em questão. Isto pode, por exemplo, servantajoso quando certas regiões da enzima tenham sido identificadas comosendo de particular importância para uma dada propriedade da enzima.

Métodos alternativos para prover as variantes da invençãoincluem o embaralhamento dos genes, por exemplo como descrito na WO95/22625 ou na WO 96/00343, e o processo de derivação de consenso comodescrito na EP 897985.Construções de ácido nucleico

Uma construção de ácido nucleico compreende uma seqüênciade ácido nucleico da presente invenção operavelmente ligada a uma ou maisseqüências de controle que dirigem a expressão da seqüência codificadora emuma célula hospedeira adequada, sob condições compatíveis com asseqüências de controle. A expressão será entendida como incluindo qualqueretapa envolvida na produção do polipeptídeo, incluindo, porém sem limitar, atranscrição, a modificação pós-transcricional, a translação, a modificação pós-translacional, e a secreção.

A expressão "construção de ácido nucleico", como usada nesterelatório descritivo, refere-se a uma molécula de ácido nucleico, ou defilamento único ou de filamento duplo, a qual seja isolada de um gene deocorrência natural ou que seja modificada para conter segmentos de ácidosnucleicos de uma maneira que não deva de outra forma existir na natureza. Aexpressão construção de ácido nucleico é sinônima da expressão "cassete deexpressão" quando a construção de ácido nucleico contenha as seqüências decontrole requeridas para expressão de uma seqüência codificadora da presenteinvenção.

A expressão "seqüência de controle" é definida aqui comoincluindo todos os componentes que sejam necessários ou vantajosos para aexpressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presenteinvenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha à seqüênciade nucleotídeos que codifica o polipeptídeo. Tais seqüências de controleincluem, porém sem limitar, uma seqüência condutora de poliadenilação,seqüência de pró-peptídeos, seqüência promotora de peptídeo de sinal, eterminador da transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluem umpromotor, e sinais de parada transcricional e translacional. As seqüências decontrole podem ser dotadas de ligadores com a finalidade de introduzir sítiosde restrição específicos que facilitem a ligação das seqüências de controlecom a região codificadora da seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo.

A expressão "operavelmente ligada" denota neste relatóriouma configuração em que uma seqüência de controle seja colocada em umaposição apropriada em relação à seqüência codificadora da seqüência depolinucleotídeos, de tal modo que a seqüência de controle direciona aexpressão da seqüência codificadora de um polipeptídeo.

Quando aqui usada, a expressão "seqüência codificadora"(CDS) significa uma seqüência de nucleotídeos, a qual diretamente especificaa seqüência de aminoácidos de seu produto proteico. Os limites da seqüênciacodificadora são geralmente determinados por uma matriz de leitura aberta,que usualmente começa com o códon de partida ATG ou com códons departida alternativos, tais como GTG e TTG. A seqüência codificadora podeser uma seqüência de DNA, cDNA ou de nucleotídeos recombinantes.Vetor de expressão

O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida naprodução do polipeptídeo, incluindo, porém sem limitar, a transcrição, amodificação pós-transcricional, a translação, a modificação pós-translacional,e a secreção.A expressão "vetor de expressão" é aqui definida como umamolécula de DNA linear ou circular que compreenda um polinucleotídeocodificando um polipeptídeo da invenção, e que seja operavelmente ligado anucleotídeos adicionais que levem em conta sua expressão.Uma seqüência de ácidos nucleicos codificando uma variantede fitase da invenção pode ser expressa com o uso de um vetor de expressãoque tipicamente inclua as seqüências de controle codificando um promotor,operador, sítio de ligação ribossômica, sinal de iniciação da translação, e,opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.O vetor de expressão recombinante carregando a seqüência deDNA codificando uma variante de fitase da invenção pode ser qualquer vetorque possa convenientemente ser submetido a procedimentos de DNArecombinantes, e a escolha do vetor freqüentemente dependerá da célulahospedeira dentro da qual ele deva ser introduzido. O vetor pode ser aqueleque, quando introduzido em uma célula hospedeira, fique integrado nogenoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o(s) cromossoma(s)dentro do(s) qual(is) ele tenha sido integrado.A variante de fitase pode também ser co-expressa junto compelo menos uma outra enzima de interesse da ração para animal, tal comouma fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, protease,fosfolipase, amilase e/ou beta-glucanase. As enzimas podem ser co-expressasde diferentes vetores, de um vetor, ou com o uso de uma mistura de ambas astécnicas. Quando do uso de diferentes vetores, estes podem ter diferentesmarcadores selecionáveis e diferentes origens de replicação. Quando do usode apenas um vetor, os genes podem ser expressos a partir de um ou maispromotores. Se clonados sob a regulação de um promotor (di- ou multi-cistrônico), a ordem em que os genes são clonados podem afetar os níveis deexpressão das proteínas. A variante de fitase pode também ser expressa comouma proteína de fusão, isto é, em que o gene que codifica a variante de fitasetenha sido fundido na matriz ao gene codificando outra proteína. Esta proteínapode ser outra enzima ou um domínio funcional de outra enzima.Células hospedeiras

A expressão "célula hospedeira" como aqui usada inclui qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção,transdução, e outras, com uma construção de ácido nucleico compreendendoum polinucleotídeo da presente invenção.

A presente invenção também diz respeito a células hospedeirasrecombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, quesão vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Umvetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzidoem uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como umintegrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico auto-replicador, como anteriormente descrito. A expressão "célula hospedeira" inclui qualquer progênie de uma célula precursora que não seja idêntica àcélula precursora devida às mutações que ocorrem durante a replicação. Aescolha de uma célula hospedeira dependerá, em grande parte, do gene quecodifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular,por exemplo um procariota, ou um microorganismo não unicelular, porexemplo um eucariota.

Microorganismos unicelulares úteis são as células bacterianastais como as bactérias Gram-positivas, incluindo, porém sem limitar, umacélula de Bacillus, por exemplo Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii,Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillusthuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, por exemplo Streptomyceslividans e Streptomyces murinus, ou bactérias Gram-negativas tais como E.coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillusstearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em outro aspecto preferido, a célulade Bacillus é um Bacillus alcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacterianapode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (ver, porexemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115),com o uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961,Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971,Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo,Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou combinação (ver,por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira pode também ser um eucariota, tal comouma célula de mamífero, inseto, planta ou fungica.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célulafungica. "Fungos", como aqui usado, inclui os filos Ascomycota,Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido porHawksworth et al., em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8~edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido),bem como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, acima,página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, acima).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula de levedura. "Levedura", como usado neste relatório, inclui alevedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e alevedura pertencente ao Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Tendo em vistaque a classificação da levedura pode mudar no futuro, para os fins destainvenção a levedura será definida como descrito em Biology and Activities ofYeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. e Davenport, R. R., editores, Soe.App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Cândida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia,Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de leveduraé uma célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomycescarisbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus,Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensisou Saccharomyces oviformis. Em outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em outroaspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula deYarrowia lipolytica.

Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula fungica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas asformas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota como definido porHawksworth et al., 1995, acima). Os fungos filamentosos são geralmentecaracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose,glicano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. Ocrescimento vegetativo é por alongamento hifal e o catabolismo do carbono éobrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo porleveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talounicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus,Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor,Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium,Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces,Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungicafilamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ouFusarium venenatum. Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula das cepas de Bjerkandera adusta,Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens,Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa ouCeriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicolainsolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila,Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium,Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa,Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii,Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processoenvolvendo a formação de protoplastos, a transformação dos protoplastos, e aregeneração da parede celular de uma maneira por si conhecida.Procedimentos adequados para a transformação das células de Aspergillus ede Trichoderma são descritos na EP 238 023 e em Yelton et al., 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474.Métodos adequados para transformar as espécies Fusarium são descritos porMalardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e na WO 96/00787. A levedurapode ser transformada com o uso dos procedimentos descritos por Becker eGuarente, em Abelson, J. N. e Simon, Μ. I., editores, Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187,Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75: 1920.

Métodos de produção

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir uma fitase da presente invenção, compreendendo (a) cultivar umacélula hospedeira sob condições conducentes à produção da fitase; e (b)recuperar a fitase.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células sãocultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo,com o uso de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula podeser cultivada mediante cultivo em frasco de agitação, e fermentação de pequena escala ou de grande escala (incluindo as fermentações contínuas, emlotes, em lotes alimentados, ou no estado sólido) em fermentadores delaboratório ou industriais, realizada em um meio adequado e sob condiçõesque permitam que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo temlugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e denitrogênio e sais inorgânicos, com o uso de procedimentos conhecidos natécnica. Meios adequados acham-se disponíveis de fornecedores comerciaisou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (porexemplo nos catálogos da American Type Culture Collection). Se opolipeptídeo for secretado no meio nutriente, ele pode ser recuperadodiretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode serrecuperado dos lisados celulares.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado com o uso demétodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode serrecuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais, incluindo,porém sem limitar, a centrifugação, filtração, extração, secagem porpulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadospor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, porémsem limitar, a cromatografia (por exemplo de troca de íons, de afinidade,hidrofóbica, de cromatofocalização e de exclusão de tamanho), osprocedimentos eletroforéticos (por exemplo a focalização isoelétricapreparativa), a solubilidade diferencial (por exemplo a precipitação de sulfatode amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).Plantas transgênicas

A presente invenção também diz respeito a uma plantatransgênica, parte da planta ou célula da planta, que tenham sidotransformadas com uma seqüência de nucleotídeos codificando umpolipeptídeo que tenha atividade de fitase da presente invenção, de modo aexpressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. Opolipeptídeo pode ser recuperado da planta ou de parte da planta.Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeorecombinante podem ser usadas como tais, para melhorar a qualidade de umgênero alimentício ou ração, por exemplo melhorar o valor nutritivo, opaladar e as propriedades reológicas, ou destruir um fator anti-nutritivo.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo édirigido aos vacúolos de armazenagem do endosperma nas sementes. Istopode ser obtido pela sua sintetização como um precursor com um peptídeo de sinal adequado; ver Horvath et al. em PNAS, 15 de fevereiro de 2000, vol. 97,n2 4, pp. 1914-1919.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea oumonocotiledônea ou suas variantes engendradas. Exemplos de plantasmonocotiledôneas são as gramas, tais como a grama do prado (o capim-do-campo, Poa), a grama de forragem, tal como a Festuca, Lolium5 gramatemperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo o trigo, aveias, centeio,cevada, arroz, sorgo, triticale [híbrido estabilizado de trigo (Triticum) e docenteio (Secale) e do milho]. Exemplos de plantas dicotiledôneas são otabaco, legumes tais como o girassol (Helianthus), algodão (Gossypium),tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e feijão soja, e plantas crucíferas(família Brassicaceae), tais como a couve-flor, a colza, e o organismo modelointimamente relacionado Arabidopsis thaliana. As plantas pobres em fitato,como descritas, por exemplo, na patente U.S. n~ 5.689.054 e na patente U.S.n° 6.111.168, são exemplos de plantas engendradas.

Exemplos de partes da planta são o caule, o calo, as folhas, araiz, os frutos, as sementes e os tubérculos, assim como os tecidos individuaisque contêm estas partes, por exemplo epiderme, mesofilo, parênquima, ostecidos vasculares, meristemas. Igualmente os compartimentos específicosdas células das plantas, tais como o cloroplasto, apoplasto, mitocôndrias,vacúolo, peroxissomos e citoplasma, são considerados como sendo uma parteda planta. Da mesma forma, as partes da planta tais como tecidos específicose células isoladas para facilitar a utilização da invenção, são tambémconsiderados partes da planta, por exemplo os embriões, os endospermas, oaleurona e as cascas das sementes.

Acham-se igualmente incluídas dentro do escopo da presenteinvenção a progênie de tais plantas, as partes das plantas e as células dasplantas.

A planta ou a célula da planta transgênicas expressando umpolipeptídeo da presente invenção podem ser construídas de acordo commétodos conhecidos na técnica. Resumidamente, a planta ou célula da plantasão construídas pela incorporação de uma ou mais construções de expressãocodificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro daplanta e transformando a planta ou célula da planta resultantes em uma plantaou célula de planta transgênicas.

Convenientemente, a construção da expressão é umaconstrução de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácidonucleico codificando um polipeptídeo da presente invenção operavelmenteligado com seqüências reguladoras apropriadas necessárias para expressão daseqüência de ácidos nucleicos na planta ou parte da planta de escolha. Alémdisso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionávelútil para identificar células hospedeiras dentro das quais a construção daexpressão tenha sido integrada e as seqüências de DNA necessárias paraintrodução da construção na planta em questão (estas últimas dependem dométodo de introdução do DNA a ser usado).

A escolha das seqüências reguladoras, tais como as seqüênciaspromotoras e terminadoras e, opcionalmente, as seqüências de sinal ou detrânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como opolipeptídeo é desejado que seja expresso. Por exemplo, a expressão do genecodificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ouindutível, ou pode ser desenvolvimental, específica do estágio ou do tecido, eo produto do gene pode ser direcionado a um compartimento celular, tecidoou parte da planta específicos, tal como sementes ou folhas. Seqüênciasreguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, PlantPhysiology 86: 506.

Quanto à expressão constitutiva, os seguintes promotorespodem ser usados: o promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), a ubiquitina 1 do milho (Christensen, A. H., Sharrock, R. A. e Quail1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation ofexpression and transcript splicing, and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation), ou o promotor da actina 1 do arroz (Plant Mo.Biol. 18, 675-689; Zhang, W., McElroy, D. e Wu, R. 1991, Analysis of riceActl 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Ospromotores específicos do órgão podem ser, por exemplo, um promotor dostecidos perecíveis em armazenagem, tais como as sementes, os tubérculos dabatata, e as frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303),ou dos tecidos perecíveis metabólicos tais como os meristemas (Ito et ai.,1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico da semente talcomo o promotor da glutelina, da prolamina, da globulina ou da albumina doarroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotorda Vicia faba da legumina B4 e o gene proteico das sementes desconhecidoda Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711),um promotor de uma proteína do corpo oleoso da semente (Chen et al., 1998,Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor napA da proteína dearmazenagem da Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico dasemente conhecido na técnica, por exemplo como descrito na WO 91/14772.Além disso, o promotor pode ser um promotor específico das folhas, tal comoo promotor rbcs do arroz ou do tomate (Kyozuka et al., 1993, PlantPhysiology 102: 991-1000, o promotor do gene da adenina metiltransferasedo vírus da Chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular andGeneral Genetics 248: 668-674), ou um promotor indutível do ferimento, talcomo o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22:573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser indutível por tratamentosabióticos tais como temperatura, estiagem ou alterações na salinidade, ouindutíveis por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor,por exemplo o etanol, estrogênios, hormônios das plantas como o etileno, oácido abscísico, o ácido giberélico e/ou os metais pesados.

Um elemento intensificador dos promotores pode também serusado para se obter expressão mais elevada do polipeptídeo na planta. Porexemplo, o elemento intensificador do promotor pode ser um íntron que sejacolocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos codificando umpolipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, acima,apresenta o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz paraintensificar a expressão.

Além disso ainda, a utilização do códon pode ser otimizadapara as espécies de plantas em questão para melhorar a expressão (verHorvath et al. referido mais acima).

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes daconstrução da expressão, podem ser escolhidos daqueles disponíveis natécnica.

A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma daplanta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindoa transformação mediada pela Agrobacterium, a transformação mediada pelovírus, a microinjeção, o bombardeamento de partículas, a transformaçãobiolística e a eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244:1293; Potrykus,1990, Bio/Technology 8:535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:274).

Presentemente, a transferência do gene mediada pelaAgrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneastransgênicas (para um exame, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, PlantMolecular Biology 19:15-38), e ele pode também ser usado para transformarmonocotiledôneas, não obstante outros métodos de transformação sejam maisfreqüentemente usados para estas plantas. Presentemente, o método deescolha para gerar monocotiledôneas transgênicas, suplementando aabordagem da Agrobacterium, é o bombardeamento de partículas (partículasmicroscópicas de ouro ou de tungstênio revestidas com o DNAtransformador) dos calos embriônicos ou dos embriões em desenvolvimento(Christou, 1992, Plant Journal 2:275-281; Shimamoto, 1994, Current OpinionBiotechnology 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674).Um método alternativo para a transformação das monocotiledôneas baseia-sena transformação dos protoplastos, como descrito por Omirulleh et al., 1993,Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Em seguida à transformação, os transformantes tendo nelesincorporados a construção da expressão, são selecionados e regenerados nasplantas completas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Freqüentemente o procedimento de transformação é designado para aeliminação seletiva dos genes de seleção ou durante a regeneração ou nasgerações seguintes mediante o uso, por exemplo, da co-transformação comduas construções separadas de T-DNA ou excisão específica do sítio do genede seleção mediante uma recombinase específica.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivaruma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo umaseqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que tenha atividadede fitase da presente invenção sob condições conducentes à produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Animais transgênicos

A presente invenção também diz respeito a um animaltransgênico não humano, e a seus produtos ou elementos, exemplos dos quaissão os fluidos corporais tais como o leite e o sangue, os órgãos, a carne e ascélulas de animais. As técnicas para expressar as proteínas, por exemplo nascélulas de mamíferos, são conhecidas na prática; ver, por exemplo, o manualProtein Expression: A Practical Approach, Higgins e Hames (editores),Oxford University Press (1999), e os três outros manuais desta série referentesa Transcrição de Genes, processamento do RNA e Processamento Pós-translacional. De um modo geral, para preparar um animal transgênico, ascélulas selecionadas de um animal selecionado são transformadas com umaseqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade defitase da presente invenção, de modo a expressar e produzir o polipeptídeo. Opolipeptídeo pode ser recuperado do animal, por exemplo do leite, dosanimais fêmeas, ou o polipeptídeo pode ser expresso para o benefício dopróprio animal, por exemplo para auxiliar na digestão do animal. Exemplosde animais são mencionados abaixo na seção intitulada Ração para animal.

Para produzir um animal transgênico com vistas a recuperar opolipeptídeo do seu leite, um gene codificando o polipeptídeo pode serintroduzido nos ovos fertilizados de um animal em questão, por exemplomediante o uso de um vetor de expressão transgênica que compreenda umpromotor adequado de proteína do leite, e o gene codificando o polipeptídeo.O vetor de expressão do transgene é microinjetado nos ovos fertilizados e, depreferência permanentemente integrado no cromossoma. Uma vez o ovocomece a crescer e dividir-se, o embrião potencial é implantado dentro deuma mãe substituta, e os animais que carregam o transgene são identificados.O animal resultante pode então ser multiplicado por reprodução convencional.O polipeptídeo pode ser purificado do leite dos animais; ver, por exemplo,Meade, Η. M. et al. (1999): Expression of recombinant proteins in the milk oftransgenic animais, Gene expression systems: Using nature for the art ofexpression. J. M. Fernandez e J. P. HoeffIer (editores), Academic Press.

Na alternativa, a fim de produzir um animal transgênico nãohumano que carregue no genoma de suas células somáticas e/ou germinaisuma seqüência de ácidos nucleicos que inclua uma construção de transgeneheteróloga, incluindo um transgene codificando o polipeptídeo, o transgenepode ser operavelmente ligado a uma primeira seqüência reguladora paraexpressão específica do polipeptídeo das glândulas salivares, comoapresentado na WO 00/064247.Composições e usos

Em ainda outros aspectos, a presente invenção diz respeito acomposições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção, bemcomo a métodos de usá-las.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas deacordo com métodos conhecidos na técnica, e podem estar na forma de umlíquido ou de uma composição seca. Por exemplo, a composição depolipeptídeo pode estar na forma de granulados ou de microgranulados. Opolipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado emconformidade com métodos conhecidos na técnica.

A fitase da invenção pode ser usada para degradação, emqualquer contexto industrial, por exemplo do fitato, ácido fítico e/ou mono-,di-, tri-, tetra- e/ou penta-fosfatos de mio-inositol. E bem conhecido o fato deque os componentes de fosfato destes compostos quelam cátions divalentes etrivalentes tais como os íons de metal, inter alia os íons nutritivamenteessenciais de cálcio, ferro, zinco e magnésio, bem como os minerais de traçomanganês, cobre e molibdênio. Além disso, o ácido fítico, até uma certaextensão, também liga as proteínas por interação eletrostática.

Conseqüentemente, os usos preferidos dos polipeptídeos dainvenção são nas preparações alimentares dos animais (incluindo aalimentação humana) ou nos aditivos para tais preparações.

Em uma forma de realização particular o polipeptídeo dainvenção pode ser usado para melhorar o valor nutritivo de uma ração paraanimal. Exemplos não limitativos de melhorar o valor nutritivo da ração dosanimais (incluindo a alimentação humana) citam-se: melhorar adigestibilidade da ração; promover o desenvolvimento do animal; melhorar autilização da ração; melhorar a biodisponibilidade das proteínas; aumentar onível de fosfato digerível; melhorar a liberação e/ou a degradação do fitato;melhorar a biodisponibilidade dos minerais de traço; melhorar abiodisponibilidade dos macrominerais; eliminar a necessidade de adicionarfosfato suplementar, minerais de traço e/ou macrominerais; e/ou melhorar aqualidade da casca dos ovos. O valor nutritivo da ração é, portanto,aumentado, e o índice de crescimento e/ou o ganho de peso e/ou a conversãoda ração (isto é, o peso da ração ingerida em relação ao ganho de peso) doanimal podem ser melhorados.

Além disso, o polipeptídeo da invenção pode ser usado parareduzir o nível de fitato do esterco.

Animais, alimentação de animais, e aditivos da ração dos animais

O termo animal inclui todos os animais, incluindo os sereshumanos. Exemplos de animais são os não ruminantes e os ruminantes. Osanimais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como o carneiro, acabra e o gado vacum, por exemplo a vaca, tal como o gado vacum paraengorda e as vacas leiteiras. Em uma forma de realização particular, o animalé um animal não ruminante. Animais não ruminantes incluem os animaismonogástricos, por exemplo o porco ou suíno (incluindo, porém sem limitar,os leitões, os porcos em desenvolvimento, e as porcas); aves domésticas taiscomo os perus, os patos e as galinhas (incluindo, porém sem limitar, os pintospara grelhar, galinhas poedeiras); peixe (incluindo, mas sem limitar, o salmão,a truta, a tilápia, o peixe-gato e a carpa); e os crustáceos (incluindo, semlimitar, o camarão e o pitu).

Os termos alimentação ou composição alimentícia significamqualquer composto, preparação, mistura ou composição adequada oudestinada à ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção, o polipeptídeo pode serfornecido ao animal antes, após ou simultaneamente com a dieta. Este últimoé o preferido.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo, naforma em que ele é acrescentado à ração, ou quando esteja sendo incluído emum aditivo de ração, é substancialmente puro. Em uma forma de realizaçãoparticular, ele é bem definido. A expressão "bem definido" significa que apreparação de fitase é pelo menos 50% pura, como determinado porcromatografia de exclusão de tamanho (ver o Exemplo 12 da WO 01/58275).

Em outras formas de realização particulares, a preparação de fitase é pelomenos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou, pelo menos, 95% pura, determinadapor este método.Uma preparação polipeptídica substancialmente pura e/ou bemdefinida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente àração um polipeptídeo que seja essencialmente livre de interferir oucontaminar outros polipeptídeos. A expressão dosar corretamente refere-se,em particular, ao objetivo de se obter resultados consistentes e constantes, àcapacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.Para o uso na ração para animal, entretanto, o polipeptídeo defitase da invenção não necessita ser tão puro; ele pode, por exemplo, incluiroutros polipeptídeos, em cujo caso ele pode ser denominado de umapreparação de fitase.A preparação de fitase pode ser (a) adicionada diretamente àração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas), ou(b) ela pode ser usada na produção de uma ou mais composiçõesintermediárias, tais como aditivos ou pré-misturas alimentares que sejamsubseqüentemente adicionadas à ração (ou usadas em um processo detratamento). O grau de pureza descrito acima refere-se à pureza da preparaçãode polipeptídeos original, quer usada de acordo com (a) ou de (b) acima.As preparações de polipeptídeos com purezas desta ordem degrandeza são, em particular, obteníveis com o uso de métodos recombinantesde produção, ao passo que elas não são tão facilmente obtidas e também estãosujeitas a uma variação de batelada-em-batelada muito mais elevada quando opolipeptídeo é produzido por métodos de fermentação tradicionais.Tal preparação polipeptídica pode, naturalmente, ser misturadacom outros polipeptídeos.O polipeptídeo pode ser acrescentado à ração em qualquerforma, esteja ele como um polipeptídeo relativamente puro ou em misturacom outros componentes destinados à adição à ração para animal, isto é, naforma de aditivos de ração para animal, tais como as assim chamadas pré-misturas para ração para animal.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito acomposições para uso na ração para animal, tal como em rações para animal,e aditivos de ração para animal, por exemplo pré-misturas. Independente dopolipeptídeo da invenção, os aditivos de ração da invenção para animalcontêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos umavitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral traço. O aditivo deração pode também conter pelo menos um macro-mineral.

Além disso, ingredientes de aditivos de ração opcionais são osagentes colorantes, por exemplo os carotenóides tais como o beta-caroteno, aastaxantina e a luteína; compostos de aroma; estabilizadores; peptídeosantimicrobianos; ácidos graxos poliinsaturados; espécies geradoras deoxigênio reativo; e/ou pelo menos um outro polipeptídeo selecionado dentre afitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); fosfatase (EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC3.1.3.39); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase(EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipaseA2 (EC 3.1.1.4); Iisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3);fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC3.2.1.1); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

Em uma forma de realização particular, estes outrospolipeptídeos são bem definidos (como definido acima quanto às preparaçõesde fitase).

A fitase da invenção também pode ser combinada com outras fitases, por exemplo as fitases de ascomicetos tais como as fitases deAspergillus, por exemplo derivada de Aspergillus ficuum, Aspergillus nigerou Aspergillus awamori; ou fitases de basidiomicetos, por exemplo derivadasde Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Trametes pubescens ou Paxillusinvolutus; ou derivados, fragmentos ou variantes destes que tenham atividadede fitase.

Assim sendo, nas formas de realização preferidas do uso naração para animal da invenção, e nas formas de realização preferidas doaditivo de ração para animal da invenção, a fitase da invenção é combinadacom tais fitases.

Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP's) são oCAPl 8, Leucocina A, Tritrpticin, Protegrina-1, Tanatina, Defensina,Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina tal como a Novispirina (RobertLehrer, 2000), as Prectasinas e as Estatinas, incluindo os compostos epolipeptídeos apresentados nas WO 03/044049 e WO 03/048148, bem comoas variantes ou fragmentos dos acima que conservem a atividadeantimicrobiana.

Exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFP's) são ospeptídeos de Aspergillus giganteus e de Aspergillus niger, bem como as suasvariantes e seus fragmentos que conservem a atividade antifungica, comoapresentado nas WO 94/ol459 e WO 02/090384.

Exemplos de ácidos graxos poliinsaturados são os ácidosgraxos poliinsaturados Cl 8, C20 e C22, tais como o ácido araquidônico, oácido docosoexaenóico, o ácido eicosapentaenóico e o ácido gama-linoleico.

Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são osprodutos químicos tais como o perborato, o persulfato ou o percarbonato; e ospolipeptídeos tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

Usualmente as vitaminas solúveis em gordura e em água, bemcomo os minerais de traço fazem parte de uma assim chamada pré-misturadestinada à adição à ração, ao passo que os macrominerais usualmente sãoadicionados em separado à ração. Qualquer destes tipos de composição,quando enriquecido com um polipeptídeo da invenção, é um aditivo da raçãopara animal da invenção.

Em uma forma de realização particular, pretende-se que oaditivo de ração para animal da invenção seja incluído (ou recomendadocomo tendo de ser incluído) nas dietas ou nas rações dos animais em níveis de0,01 a 10,0%; mais particularmente 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (%significando g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim, em particular, parapré-misturas.

A seguir são apresentadas listas não exclusivas dos exemplosdestes componentes:

Exemplos de vitaminas solúveis em gorduras citam-se avitamina A, a vitamina D3, a vitamina Eea vitamina K, por exemplo avitamina K3.

Exemplos de vitaminas solúveis em água citam-se a vitaminaB12, a biotina e a colina, a vitamina BI, vitamina B2, vitamina B6, niacina,ácido fólico e o pantotenato, por exemplo o C-pantotenato de Ca.

Exemplos de minerais de traço são o manganês, zinco, ferro,cobre, iodo, selênio e cobalto.

Exemplos de macrominerais são o cálcio, o fósforo e o sódio.

As exigências nutritivas destes componentes (exemplificadoscom aves domésticas e leitões/porcos) acham-se listadas na Tabela A da WO01/58275. Exigência nutritiva significa que estes componentes devem serfornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

Na alternativa, o aditivo de ração para animal da invençãocompreende pelo menos um dos componentes individuais especificados naTabela A da WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dentre eles,um ou mais de um, ou dois, ou três, ou quatro, e assim por diante até todos ostreze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente,este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invençãoem uma quantidade tal de modo a prover uma concentração na ração dentroda faixa indicada na colina quatro, ou na coluna cinco, ou na coluna seis, da Tabela A.A presente invenção também diz respeito a composições deração para animal. As composições ou dietas alimentares para animal têm umteor de proteína relativamente elevado. As dietas para aves domésticas eporcos podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B da WO01/58275, colunas 2 e 3. As dietas para peixes podem ser caracterizadas comoindicado na coluna 4 desta Tabela B. Além disso, tais dietas para peixes têmusualmente um teor de gordura bruto de 200 a 310 g/kg.

A WO 01/58275 corresponde à U.S. 09/779334, que fica aquiincorporada como referência.

Uma composição de ração para animal em conformidade coma invenção tem um teor proteico bruto de 50 a 800 g/kg, e além dissocompreende pelo menos um polipeptídeo como reivindicado no presenterelatório descritivo.

Além disso, ou na alternativa (para o teor proteico brutoindicado acima), a composição de ração para animal da invenção tem um teorde energia metabolizável de 10 a 30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1 a200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 a 200 g/kg, e/ou um teorde metionina de 0,1 a 100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de0,1 a 150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5 a 50 g/kg.

Nas formas de realização particulares, o teor de energiametabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina maiscisteína, e/ou lisina, acha-se dentro de qualquer uma das fileiras 2, 3, 4 ou 5da Tabela B da WO 01/58275 (R. 2 a 5).

A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicadopor um fator de 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) χ 6,25; O teor denitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, OfficialMethods of Analysis 14â edição, Association of Official Analytical Chemists,Washington DC).

A energia metabolizável pode ser calculada com base napublicação da NRC5 Nutrient requirements in swine, nona edição revisada1988, subcomitê sobre a nutrição de suínos, comitê sobre a nutrição deanimais, conselho de agricultura, junta de pesquisa nacional. NationalAcademy Press, Washington, D.C, pp. 2-6, e a Tabela Européia de Valores daEnergia para Ingredientes Alimentares para Aves Domésticas, centroSpelderholt para pesquisa e extensão de aves domésticas, 7361 DABeekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv,Wageningen, ISBN 90-71463-12-5.

O teor dietético de cálcio, do fósforo disponível e dosaminoácidos nas dietas completas para animal, é calculado com base emtabelas alimentares, tais como a Veevoedertabel 1997, gegevens overchemische samenstelling, verteerbaarheid en voedenwaarde vanvoedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad.

ISBN 90-72839-13-7.

Em uma forma de realização particular, a composição de raçãopara animal da invenção contém pelo menos uma proteína. A proteína podeser uma proteína animal, tal como a farinha de carne e de ossos, e/ou farinhade peixe; ou ela pode ser uma proteína de legume. A expressão proteínas delegume, como aqui usada, refere-se a qualquer composto, composição,preparação ou mistura que inclua, pelo menos, uma proteína derivada de, ouoriginada de, um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados deproteínas. Em formas de realização particulares, o teor de proteína dasproteínas de legume é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60% (p/p).

As proteínas de legume podem ser derivadas de fontes deproteínas de legume, tais como legumes e cereais, por exemplo materiais deplantas das famílias das Fabaceae (Leguminosas), Cruciferaceae,Chenopodiaceae e Poaceae, tais como a farinha de feijão soja, a farinha detremoços e farinha de colza.

Em uma forma de realização particular, a fonte de proteínas delegume é o material de uma ou mais plantas da família das Fabaceae, porexemplo, soja, tremoços, ervilha ou feijão.

Em outra forma de realização particular, a fonte de proteínasde legume é material de uma ou mais plantas da família das Chenopodiaceae,por exemplo, a beterraba, o espinafre ou trigo sarraceno.

Outros exemplos de fontes de proteínas de legume são a colza,a semente de girassol, a semente de algodão, e o repolho.

A soja é uma fonte vegetal de proteínas preferida.

Outros exemplos de fontes vegetais de proteínas são os cereaistais como a cevada, o trigo, o centeio, a aveia, o milho, o arroz, o triticale e osorgo.

Em ainda outras formas de realização particulares, acomposição de ração para animal da invenção contém 0 a 80% de milho; e/ou0 a 80% de sorgo; e/ou 0 a 70% de trigo; e/ou 0 a 70% de cevada; e/ou 0 a30% de aveias; e/ou 0 a 40% de farinha de soja; e/ou 0 a 25% de farinha depeixe; e/ou 0 a 25% de farinha de carne e de ossos; e/ou 0 a 20% de soro deleite.

As dietas de animais podem, por exemplo, ser fabricadas comoração em papa (não pelotizado) ou ração pelotizada. Tipicamente, os materiaisalimentares moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas eminerais essenciais são adicionados de acordo com as especificações quantoàs espécies em questão. Os polipeptídeos podem ser adicionados comoformulações polipeptídicas sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulaçãopolipeptídica sólida é tipicamente adicionada antes ou durante a etapa demistura; e uma preparação polipeptídica líquida é tipicamente adicionada apósa etapa de pelotização. O polipeptídeo pode ser também incorporado em umaditivo ou pré-mistura de alimentação.

A concentração final de polipeptídeo na dieta acha-se dentroda faixa de 0,01 a 200 mg de proteína polipeptídica por quilograma de dieta,por exemplo na faixa de 5 a 30 mg de proteína polipeptídica por quilogramade dieta animal.A fitase da invenção devem, naturalmente, ser aplicada emuma quantidade eficaz, isto é, em uma quantidade adequada para melhorar asolubilização e/ou melhorar o valor nutritivo da ração. Considera-sepresentemente que o polipeptídeo é administrado em uma ou mais dasseguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01 a 200, 0,01 a 100, 0,5-100, 1a 50, 5 a 100, 10 a 100, 0,05 a 50 ou 0,10 a 10 - todas estas faixas sendo emmg de proteína polipeptídica de fitase por quilograma de ração (ppm).Para se determinar os miligramas de proteína polipeptídica defitase por quilograma de ração, a fitase é purificada da composição de ração, ea atividade específica da fitase purificada é determinada com o uso de umensaio relevante. A atividade da fitase da composição de ração, como tal, étambém determinada com o uso do mesmo ensaio, e com base nestas duasdeterminações, a dosagem em miligrama de proteína de fitase por quilogramade ração, é calculada.Os mesmos princípios se aplicam para se determinar osmiligramas de proteína polipeptídica de fitase nos aditivos de ração.Naturalmente, se uma amostra estiver disponível na fitase usada para prepararo aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada a partirdesta amostra (sem necessidade de purificar a fitase da composição de raçãoou do aditivo).Formas de realização particularesA invenção também diz respeito às seguintes formas derealização particulares:I. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ED NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ED NO: 2 em pelo uma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3,4, 5, 31, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107,109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 136, 137,141, 154, 161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184,185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276,281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 316, 324, 331, 339, 351, 355, 362, 379, 385, 406, 409, 410 e 411;

preferivelmente em pelo menos uma posição selecionada dasseguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 76, 82, 99, 100, 107, 109,111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 137, 141, 161,162, 164, 167, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 218, 223, 241, 273, 276, 285, 286, 299, 314, 331, 339, 362, 379, 385, 406,410 e 411;

com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nema SEQ ID NO: 4, e nem a SEQ ID NO: 6.

II. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com a SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparação

com SEQ ID NO: 2 em pelo uma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3,4, 5, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107, 109,111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 123, 124, 136, 137, 141, 154,161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276, 281, 282,283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 324, 339, 351, 355, 362, 379,385,406, 409, 410 e 411;

preferivelmente em pelo menos uma posição selecionada dasseguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 76, 82, 99, 100, 107, 109, 111,114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 123, 124, 137, 141, 161, 162, 164,167, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 218, 223,241, 273, 276, 285, 286, 299, 314, 339, 362, 379, 385, 406, 410 e 411.

III. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ED NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2 em pelo uma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3,4, 5, 31, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107,109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 136, 137,141, 154, 161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184,185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276,281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 316, 324, 331, 339,351, 355, 362, 379, 385, 406, 409, 410 e 411;

preferivelmente em pelo menos uma posição selecionada dasseguintes, preferivelmente em pelo menos uma posição selecionada dentre asseguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 76, 82, 99, 100, 107, 109,111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 137, 141, 161,162, 164, 167, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202,218, 223, 241, 273, 276, 285, 286, 299, 314, 331, 339, 362, 379, 385, 406,410 e 411;

com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nema SEQ ID NO: 4, nem a SEQ ID NO: 6 e nem a SEQ ID NO: 9 nem as suasvariantes listadas na Figura 1.

IV. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2 em pelo uma posição selecionada das seguintes: 1 , 2, 3,4, 5, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107, 109,111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 123, 124, 136, 137, 141, 154,161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186,196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276, 281, 282,283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 324, 339, 351, 355, 362, 379,385,406, 409, 410 e 411

preferivelmente em pelo menos uma posição selecionada dasseguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 76, 82, 99, 100, 107, 109, 111,114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 123, 124, 137, 141, 161, 162, 164,167, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 218, 223,241, 273, 276, 285, 286, 299, 314, 339, 362, 379, 385, 406, 410 e 411;

com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 9 nemas suas variantes listadas na Figura 1.

V. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com a

SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2 em pelo uma posição selecionada das seguintes: 4, 5,41, 46, 59, 82, 84, 91, 99, 105, 107, 109, 111, 115, 116, 117, 119, 122, 123,124, 136, 137, 141, 161, 162, 164, 167, 171, 176, 179, 180, 186, 196, 199,200, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276, 281, 282, 283, 284, 289, 294,299, 308, 314, 324, 339, 351, 355, 379, 385, 406, 409, 410 e 411;

preferivelmente, em pelo menos uma posição selecionada dasseguintes: 4, 5, 46, 59, 82, 99, 107, 109, 111, 115, 116, 117, 119, 122, 123,124, 137, 141, 161, 162, 164, 167, 179, 180, 186, 196, 199, 200, 218, 223,241, 273, 276, 299, 314, 339, 379, 385, 406, 410 e 411.

VI. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 55D,I, 57Y, 59C,74A, 76G, 82E, 84Y, 91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G,111P, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,L,M,T, 119G,K,R,S,120K,S,T,Q, 121A,D,M,P,T, V, 122D, 123P,S, 124L,T,V, 136P, 137P, 141C,154P, 161P, 162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G,I,K,N,Q,180A,E,G,T, 181D,G,I,K, 182H,K,S,Q, 183A,L,P,S,V,Q, 184*, 185*, 186*,196Q, 199C, 200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 241Q, 247C,273L,Q, 276K,R, 281H, 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, 286K,Q, 289P, 294T,299L, 308A, 314G,N, 316D, 324N, 331K, 339D, 351Y, 355P, 362K,R,379K,R, 385D, 406A, 409D,E, 410D,E e/ou 411R,K; e/ou em que osaminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenhamsido substituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

preferivelmente pelo menos uma das seguintes alterações: 1*,2*, 3*, 4P, 5P, 31C, 46E, 52C,E, 53V, 55D, 57Y, 59C, 76G, 82E, 99C, 100C,107D,E,G, 109A, 11 IP, 114T, 115Q, 116AT, 117D, 118T, 119K,R,S, 120S,121D,P,T, 122D, 123P, 124L, 137P, 141C, 161P, 162C, 164E, 167Q, 179K,180E,T, 181D,K, 182H,K,Q, 183L,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C,200K, 202N, 218Q, 223E, 241Q, 273L, 276K,R, 285G,R, 286Q, 299L,314G,N, 331K, 339D, 362K,R, 379K.R, 385D, 406A, 410D,E e/ou 411R,K;e/ou em que os aminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e186 tenham sido substituídos por KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ou KTDKL;

com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 3 e nema SEQID NO: 6.

VII. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade coma SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 551,D, 57Y, 59C,74A, 76G, 82E, 84Y, 91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G,11 IP, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,M,L,T, 119G,K,R,S,120K,S,T,Q, 121A,D,M,P,V, 122D, 123P,S, 124L,T,V, 136P, 137P, 141C,154P, 161P, 162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G,I,K,N,Q,180A,E,G,T, 181D,G,I,K, 182H,K,S,Q, 183A,L,P,S,V,Q, 184*, 185*, 186*,196Q, 199C, 200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 241Q, 247C,273L,Q, 276K,R, 281H, 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, 286K,Q, 289P, 294T,299L, 308A, 314G,N, 316D, 324N, 339D, 351Y, 355P, 362K,R, 379K,R,385D, 406A, 409D,E, 41OD,E e/ou 411K,R; e/ou em que os aminoácidos nasposições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenham sido substituídos porQADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ouKTDKL;

preferivelmente pelo menos uma das seguintes alterações: 1*,2*, 3*, 4P, 5P, 31C, 46E, 52C,E, 53V, 55D, 57Y, 59C, 76G, 82E, 99C, 100C,107D,E,G, 109 A, 11 IP, 114T, 115Q, 116AT, 117D, 118T, 119K,R,S, 120S,121D,P, 122D, 123P, 124L, 137P, 141C, 161P, 162C, 164E, 167Q, 179K,180E,T, 181D,K, 182H,K,Q, 183L,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C,200K, 202N, 218Q, 223E, 241Q, 273L, 276K,R, 285G,R, 286Q, 299L,314G,N, 339D, 362K,R, 379K,R, 385D, 406A, 410D,E e/ou 411R,K; e/ou emque os aminoácidos na posição 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186tenham sido substituídos por KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ou KTDKL.

VIII. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade coma SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 55D,I, 57Y, 59C,74A, 76G, 82E, 84Y, 91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G,11 IP, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,L,M,T, 119G,K,R,S,120K,S,T,Q, 121A,D,M,P,T,V, 122D, 123P,S, 124L,T,V, 136P, 137P, 141C,154P, 161P, 162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G,I,K,N,Q,180A,E,G,T, 181D,G,I,K, 182H,K,S,Q, 183A,L,P,S,V,Q, 184*, 185*, 186*,196Q, 199C, 200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 241Q, 247C,273L,Q, 276K,R, 281H, 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, 286K,Q, 289P, 294T,299L, 308A, 314G,N, 316D, 324N, 331K, 339D, 351Y, 355P, 362K,R,379K,R, 385D, 406A, 409D,E, 410D,E e/ou 411R,K; e/ou em que osaminoácidos nas posições 179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185 e 186 tenhamsido substituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

preferivelmente pelo menos uma das seguintes alterações:,1*,2*, 3*, 4P, 5P, 31C, 46E, 52C,E, 53V, 55D, 57Y, 59C, 76G, 82E, 99C, 100C,107D,E,G, 109 A, 11 IP, 114T, 115Q, 116AT, 117D, 118T, 119K,R,S, 120S,121D,P, 122D, 123P, 124L, 137P, 141C, 161P, 162C, 164E, 167Q, 179K,180E,T, 181D,K, 182H,K,Q, 183L,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C,200K, 202N, 218Q, 223E, 241Q, 273L, 276K,R, 285G,R, 286Q, 299L,314G.N, 339D, 362K,R, 379K,R, 385D, 406A, 410D,E e/ou 411R,K; e/ou emque os aminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186tenham sido substituídos por KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ou KTDKL.

com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nema SEQ ID NO: 4, nem a SEQ ID NO: 6 e nem a SEQ ID NO: 9, nem as suasvariantes listadas na Figura 1.

IX. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 551,D, 57Y, 59C,74A, 76G, 82E, 84Y, 91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G,11 IP, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,M,L,T, 119G,K,R,S,120K,S,T,Q, 121A,D,M,P,V, 122D, 123P,S, 124L,T,V, 136P, 137P, 141C,154P, 161P, 162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G,I,K,N,Q,180A,E,G,T, 181D,G,I,K, 182H,K,S,Q, 183A,L,P,S,V,Q, 184*, 185*, 186*,196Q, 199C, 200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 241Q, 247C,273L,Q, 276K,R, 281H, 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, 286K,Q, 289P, 294T,299L, 308A, 314G,N, 316D, 324N, 339D, 351Y, 355P, 362K,R, 379K,R,385D, 406A, 409D,E, 41OD,E e/ou 411K,R; e/ou em que os aminoácidos nasposições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenham sido substituídos porQADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ouKTDKL;

preferivelmente pelo menos uma das seguintes alterações:, 1*,2*, 3*, 4P, 5P, 31C, 46E, 52C,E, 53V, 55D, 57Y, 59C, 76G, 82E, 99C, 100C,107D,E,G, 109 A, 11 IP, 114T, 115Q, 116AT, 117D, 118T, 119K,R,S, 120S,121D,P, 122D, 123P, 124L, 137P, 141C, 161P, 162C, 164E, 167Q, 179K,180E,T, 181D,K, 182H,K,Q, 183L,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C,200K, 202N, 218Q, 223E, 241Q, 273L, 276K,R, 285G,R, 286Q, 299L,314G.N, 339D, 362K,R, 379K,R, 385D, 406A, 410D,E e/ou 41IR5K; e/ou emque os aminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186tenham sido substituídos por KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ou KTDKL.com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 9, nemas suas variantes listadas na Figura 1.

X. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:

1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53Q, 55D, 57Y, 59C, 74A,82E, 84Y, 91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G, 11 IP,114H,T, 115Q, 116A,E5P5T5Q5 117D5E5K5 118I5M5L,T5 119G,K5R5S,120K,S,T,Q5 121A5D5M5 V5 122D, 123P,S, 124L5T5V5 136P, 137P, 141C,154P, 161P, 162C, 164D5E5 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G,I5K5N5Q5180A,E5G5T5 18ID5G5K5 182K5S5Q5 183A5L5S5V5Q5 184*, 185*, 186*, 196Q,199C, 200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 241Q, 247C, 273L,Q,276K,R, 28IH5 282P, 283P, 284P, 285G,N,R, 286K,Q, 289P, 294T, 299L,308A5 314G,N, 316D, 324N, 339D, 351Y, 355P, 362K,R, 379K,R, 385D,406A5 409D,E5 4IOD5E e/ou 41IK5R; e/ou em que os aminoácidos nasposições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenham sido substituídos porQADKP, GEDKP5 NGISA5 IAGKS5 KEKHQ5 KEKQQ5 KEKKV ouKTD KL;

preferivelmente pelo menos uma das seguintes alterações: 1*,2*, 3*, 4P, 5P, 3IC5 46E, 52C,E, 55D, 57Y, 59C, 82E5 99C, 100C, 107D,E,G,109A, 11 IP, 114T, 115Q, 116AT, 117D, 118T, 119K,R,S, 120S, 121D,122D, 123P, 124L, 137P, 141C, 161P, 162C, 164E, 167Q, 179K, 180E,T,18ID5K5 182K,Q, 183L,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C, 200K, 202N,218Q, 223E, 241Q, 273L, 276K,R, 285G,R, 286Q, 299L, 314G.N, 339D,362K,R, 379K,R, 385D, 406A, 410D,E e/ou 411R,K; e/ou em que osaminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenhamsido substituídos por KEKHQ, KEKQQ5 KEKKV ou KTDKL.

XI. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade com aSEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:1HKR, 60P, 105E, 106A,G, 155F, 157F, 173P, 175L, 188P, 205P, 215M,23 IP, 254Y, 280P, 330D e/ou 371P;

preferívelmente 1K;

com a condição de que a fitase não seja a SEQ LD NO: 3, nema SEQ ID NO: 4, nem a SEQ ID NO: 6, e nem a SEQ ID NO: 9, nem as suasvariantes listadas na Figura 1.

XII. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade coma SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:1H,R, 60P, 105E, 106A,G, 157F, 173P, 175L, 188P, 205P, 215M, 23 IP,254Y, 280P.

XIII. Uma fitase que tenha pelo menos 74% de identidade coma SEQ ED NO: 2 e que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:52C, 141C, 162C, 31C, 52C, 99C, 59C, 100C, 141C/199C, 4P, 5P, 11 IP,137P, 161P, 52E, 57Y, 76G, 107D, 107G, 109A, 1*, l*/2*, l*/2*/3*, 121T,273L, 285G, 286Q, 299L, 362K, 331K/55D, 107E, 46E, 82E, 119R, 119K,164E, 223E, 276R, 276K, 362R, 379R, 379K, 385D, 410D, 410E, 41 IR,411K, 53V, 121D, 167Q, 196Q, 200K, 202N, 218Q, 241Q, 285N, 314N,314G, 406A,

179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*,179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*,179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*,179K/180T/181D/182K/183L/184*/l 85 */l 86*,111P/241Q, 1K,

114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/1213, que seja uma variante da fitase da SEQ ED NO: 3.

XVI. A fitase de qualquer uma das formas de realização de 1 a13, que seja uma variante da fitase da SEQID NO: 4.

XVII. A fitase de qualquer uma das formas de realização de 1a 13, que seja uma variante da fitase da SEQID NO: 6.

XVIII. A fitase de qualquer uma das formas de realização de 1a 13, que seja uma variante da fitase da SEQ ID NO: 9.

XIX. A fitase de qualquer uma das formas de realização de 1 a13, que seja uma variante de qualquer uma das variantes de fitase relacionadas à SEQID NO: 9 e listadas na Figura 1.

XX. A fitase de qualquer uma das formas de realização de 1 a19, que além disso compreende uma substituição ou uma combinação desubstituições selecionadas dentre as substituições e combinações desubstituições listadas em cada fileira da Figura 1.

XXI. A fitase de qualquer uma das formas de realização de 1 a20, que tenha uma termoestabilidade melhorada, um perfil de pH melhorado,uma atividade específica melhorada, um padrão de glicosilação aperfeiçoado,um perfil de temperatura melhorado, um desempenho melhorado na raçãopara animal, e/ou que incorpore uma mudança de um sítio potencial declivagem da protease.

XXII. Uma seqüência isolada de ácidos nucleicoscompreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos que codifique a fitase dequalquer das formas de realização I a XXI.

XXIII. Uma construção de ácido nucleico que compreenda a seqüência de ácidos nucleicos da forma de realização XXII operavelmenteligada a uma ou mais seqüências de controle que direciona a produção dafitase em um hospedeiro de expressão adequado.

XXIV. Um vetor de expressão recombinante compreendendo aconstrução de ácido nucleico da forma de realização XXIII.XXV. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo aconstrução de ácido nucleico da forma de realização XXIII e/ou o vetor deexpressão da forma de realização XXIV.XXVI. Um método para produzir a fitase de qualquer uma dasformas de realização I a XXI, compreendendo (a) cultivar a célula hospedeirada forma de realização XXV para produzir um sobrenadante contendo afitase; e (b) recuperar a fitase.XXVII. Uma planta transgênica, ou parte da planta, capaz deexpressar uma fitase de qualquer uma das formas de realização I a XXI.XXVIII. Um animal transgênico não humano, ou produtos, ouseus elementos, sendo capazes de expressar uma fitase de qualquer uma dasformas de realização I a XXI.XXIX. Uma composição compreendendo pelo menos umafitase de qualquer uma das formas de realização I a XXI, e(a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura;(b) pelo menos uma vitamina solúvel em água; e/ou(c) pelo menos um mineral traço.XXX. A composição da forma de realização XIX aindacompreendendo pelo menos uma enzima selecionada do seguinte grupo deenzimas: amilase, fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase,protease, fosfolipase e/ou beta-glucanase.XXXI. A composição de qualquer uma das formas derealização XIX a XXX, que é um aditivo de ração para animal.XXXII. Uma composição de ração para animal tendo um teorde proteína bruta de 50 a 800 g/kg e contendo a fitase de qualquer uma dasformas de realização I a XXI ou a composição de qualquer uma das formas derealização XXIX a XXXI.XXXIII. Um método para melhorar o valor nutritivo de umaração para animal, em que a fitase de qualquer uma das formas de realização Ia XXI ou a composição de qualquer uma das formas de realização XXIX aXXXI é adicionada à ração.

XXXIV. Um processo para reduzir os níveis de fitase noesterco animal, compreendendo alimentar um animal com uma quantidadeeficaz da ração da forma de realização XXXII.

XXXV. Método para o tratamento de proteínas de legume,compreendendo a etapa de adicionar a fitase de qualquer uma das formas derealização I a XXI ou a composição de qualquer uma das formas de realizaçãoXXIX a XXXI, a pelo menos uma proteína de legume ou a uma fonteprotéica.

XXXVI. Uso da fitase de qualquer uma das formas derealização I a XXI ou da composição de qualquer uma das formas derealização XXEX a XXXI na ração para animal; na preparação da ração paraanimal; para melhorar o valor nutritivo da ração para animal; para reduzir osníveis de fitato no esterco animal, para o tratamento das proteínas de legume;ou para liberar fósforo de um substrato de fitase.

a). Uma fitase que tenha pelo menos 70% de identidade com aSEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2 em pelo menos uma posição selecionada das seguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104,105,107, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,136, 137, 141, 154, 161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182,183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247,273, 276, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 316, 324, 331, 339, 351, 355, 362, 379, 385, 406, 409, 410 e 411; com a condição deque a fitase não seja a SEQ ED NO: 3 nem a SEQ ID NO: 4 e nem a SEQ IDNO: 6.

al). Uma fitase que tenha pelo menos 70% de identidade coma SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2 em pelo menos uma posição selecionada das seguintes:1, 2, 3, 4, 5, 31, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104,105,107, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,136, 137, 141, 154, 161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182,183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247,273, 276, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 316, 324,331, 339, 351, 355, 362, 379, 385, 406, 409, 410 e 411; com a condição deque a variante não compreenda (i) 31D/121T/316N/331E, e nem (ii)31D/121N/316K/331E, e nem (iii) 31N/121N/316N/331K.

a2). Uma fitase que tenha pelo menos 70% de identidade coma SEQ ID NO: 2 e que compreenda pelo menos uma alteração em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2 em pelo menos uma posição selecionada das seguintes:1, 2, 3, 4, 5, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76, 82, 84, 91, 99, 100, 104,105,107, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 123, 124, 136,137, 141, 154, 161, 162, 164, 167, 171, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183,184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218, 223, 239, 240, 241, 247, 273,276, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294, 299, 308, 314, 324, 339, 351,355, 362, 379, 385, 406, 409, 410 e 411.

a3). A fitase da forma de realização a2), que compreenda pelomenos uma das seguintes alterações: 1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E,52C.E, 53V,Q, 551,D, 57Y, 59C, 74A, 76G, 82E, 84Y, 91C,P, 99C, 100C,104 A, 105F, 107D,E,G, 109A,G, 11 IP, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q,117D,E,K, 118I,M,L,T, 119G,K,R,S, 120K,S,T,Q, 121A,D,M,P,V, 122D,123P.S, 124L,T,V, 136P, 137P, 141C, 154P, 161P, 162C, 164D.E, 167Q,171T, 176C, 177C, 179G,I,K,N,Q, 180A,E,G,T, 181D,G,I,K, 182H,K,S,Q,183A,L,P,S,V,Q, 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C, 200K,R, 202N, 203T,218Q, 223E, 239Q, 240P, 241Q, 247C, 273L,Q, 276K,R, 281H, 282P, 283P,284P, 285G,N,R, 286K,Q, 289P, 294T, 299L, 308A, 314G,N, 316D, 324N,339D, 351Y, 355P, 362K,R, 379K,R, 385D, 406A, 409D,E, 410D,E e/ou411K,R; e/ou em que os aminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183,184, 185 e 186 tenham sido substituídos por QADKP, GEDKP, NGISA,IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ou KTDKL.

a4). A fitase de qualquer uma das formas de realização a2) a

a3), que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:

(i) 31C, 46C, 52C, 59C, 91C, 99C, 100C, 141C, 162C, 176C, 177C, 199Ce/ou 247C;

(ii) 4P, 5P, 41P, 91P, 11 IP, 136P, 137P, 154P, 161P, 240P, 282P, 283P,284P, 289P e/ou 355P;

(iii) 52E, 55D,I, 57Y, 76G, 84Y, 104A, 105F, 107D,G, 109A.G, 273L,Q,285G,R, 286Q, 294T, 299L, 35IY e/ou 362K;

(iv) 1*, l*/2* ou l*/2*/3*;

(v) em que Kl 79, Tl80, Tl81, E182, Kl83, S184, Tl85 e Kl 86 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV ou KTDKL;

(vi) 119K,R e/ou 411K,R;

(vii) 107E e/ou 164D,E;

(viii) 46D,E, 82E, 223E, 276K.R, 362K,R, 379K,R, 385D, 409D,E e/ou410D,E;

(ix) 53V.Q, 121D, 167Q, 196Q, 200K,R, 202N, 218Q, 239Q, 241Q, 285N,314G,N, 324N e/ou 406A;

(x) 114H,N,T 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,L,M,T, 119G,K,S,120K,S,T,Q, 121A,M,P,V, 122D, 123P,S e/ou 124L,T,V

(xi) 31T, 74A, 171T, 203T, 281H, 308A e/ou 316D; e/ou(xii) 339D.

a5). A fitase de qualquer uma das formas de realização a2) a

a4), que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:

(i) 141C/199C, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C e/ou162C/247C;(ii) 41Ρ, 91Ρ, 136Ρ, 137Ρ, 154Ρ, 161Ρ, 355Ρ, 11 IP, 240P, 282P, 283P, 284P,289P, 4P e/ou 5P;

(iii) 2E, 551, 57Y, 104A/105F, 107D,G, 109A,G, 76G, 84Y, 362K, 273L,Q,285G,R, 286Q, 294T, 299L, 331K/55D e/ou 351Y;

(iv) 1*, l*/2* ou l*/2*/3*;

(v) em que K179, T180, T181, El82, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

(vi) 119R,K e/ou 411R,K;

(vii) 107E e/ou 164E,D;

(viii) 362R,K, 276R,K, 379R,K, 409D,E, 223E, 385D, 46D.E, 410D,E e/ou82E;

(ix) 218Q, 324N, 200R,K, 121D, 196Q, 202N, 406A, 167Q, 53V,Q, 241Q,314N,G, 239Q e/ou 285N;

(x)l 14H/115Q/116E/117K/118M/119G/120T/121M/122D/123P/ 124T,

114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121V/122D/123S/124L,

114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120Q/121M/122D/123P/124V,

114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,

114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121A/122D/123P/124L,

114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L ou

114N/115Q/116A/117D/118L/119K/120K/121T/122D/123P/124L;

(xi) 31T, 74A, 171T, 203T, 281H, 308A e/ou 316D; e/ou

(xii) 339D.

b). A fitase das formas de realização a) ou al), quecompreenda pelo menos uma das seguintes alterações: 1*, 2*, 3*, 4P, 5P,31 C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 55D.I, 57Y, 59C, 74A, 76G, 82E, 84Y,91C,P, 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G, 109A,G, 111P, 114H,N,T, 115Q,116A,E,P,T,Q, 117D,E,K 118I,L,M,T, 119G,K,R,S, 120K,S,T,Q,121 A,D,M,P,T, V, 122D, 123P,S, 124L,T,V, 136P, 137P, 141C, 154P, 161P,162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C, 179G,I5K5N5Q, 180A5E5G,T,181D,G5I5K5 182H5K5S5Q5 183 A5L5P5S5V5Q5 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C,200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q, 240P, 24IQ5 247C, 273L,Q,276K,R, 281H, 282P, 283P, 284P, 285G,N,R5 286K,Q, 289P, 294T, 299L,308A, 314G,N, 316D, 324N, 331K, 339D, 351Y, 355P, 362K,R, 379K,R,385D, 406A5 409D,E, 4IOD5E e/ou 41IR5K; e/ou em que os aminoácidos nasposições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e 186 tenham sido substituídos porQADKP, GEDKP, NGISA5 IAGKS5 KEKHQ5 KEKQQ5 KEKKV ouKTDKL.c). A fitase de qualquer uma das formas de realização acima,que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:(i) 3IC5 46C, 52C, 59C, 91C, 99C, 100C, 141C, 162C, 176C, 177C, 199Ce/ou 247C;(ii) 4P, 5P, 41P, 91P, 11 IP, 136P, 137P, 154P, 161P, 240P, 282P, 283P,284P, 289P e/ou 355P;(iii) 52E, 55D.I, 57Y, 76G, 84Y, 104A, 105F, 107D,G, 109A,G, 121T, 122D,123P,S, 124L5T5V5 136P, 137P, 141C, 154P, 161P, 162C, 164D,E, 273L,Q,285G,R, 286Q, 294T, 299L, 33IK5 35IY e/ou 362K;(iv) 1*, l*/2* ou l*/2*/3*;(v) em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;(vi) 119K.R e/ou 411K,R;(vii) 107E e/ou 164D,E;(viii) 46D.E, 82E, 223E, 276K,R, 362K,R, 379K5R, 385D, 409D.E, e/ou4IOD5E;(ix) 53V.Q, 121D, 167Q, 196Q, 200K,R, 202N, 218Q, 239Q, 241Q, 285N,3,4G,N, 324N e/ou 406A;(x) 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,L,M,T, 119G,K,S,120Κ,S,T,Q, 121A,M,P,T,V, 122D, 123P,S e/ou 124L,T,V;(xi) 31T, 74A, 171T, 203T, 281H, 308A e/ou 316D; e/ou(xii) 339D.

c1). A fitase de qualquer uma das formas de realização acima,que compreenda pelo menos uma das seguintes alterações:(i) 31C, 46C, 52C, 59C, 91C, 99C, 100C, 141C, 162C, 176C, 177C, 199Ce/ou 247C, preferivelmente 52C, 99C, 141C e/ou 199C;(ii) 4P, 5P, 41P, 91P, 111P, 136P, 137P, 154P, 161P, 240P, 282P, 283P,284P, 289P e/ou 355P, preferivelmente 4P, 5P, 111P;(iii) 52E, 55D.I, 57Y, 76G, 84Y, 104A, 105F, 107D,G, 109A,G, 121T,273L,Q, 285G,R, 286Q, 294T, 299L, 331K, 351Y e/ou 362K, preferivelmente57Y, 76G, 107G, 273L, 286Q e/ou 362K;(iv) 1*5 l*/2* ou l*/2*/3*;(v) em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL, preferivelmente KEKKV;(vi) 119K.R e/ou 411K,R, preferivelmente 119K;(vii) 107E e/ou 164D,E;(viii) 46D.E, 82E, 223E, 276K,R, 362K,R, 379K,R, 385D, 409D.E, e/ou410D,E, preferivelmente 46D,E, 223E, 362K,R e/ou 379K,R;(ix) 53V.Q, 121D, 167Q, 196Q, 200K,R, 202N, 218Q, 239Q, 241Q, 285N,314G,N, 324N e/ou 406A, preferivelmente 53V, 121D, 196Q, 200K, 202N,218Q, 241Q, 314N e/ou 406A;x) 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 118I,L,M,T, 119G,K,S,120K,S,T,Q, 121A,M,P,T,V, 122D, 123P,S e/ou 124L,T,V, preferivelmente114T 115Q, 116A,T, 117D, 1I8T, 119K,S, 120S, 121P, 122D, 123P e/ou124L;(xi) 31T, 74A, 171T, 203T, 281H, 308A e/ou 316D; e/ou(xii) 339D.d). A fitase de qualquer uma das formas de realização acima,que tenha propriedades melhoradas.

e). A fitase das formas de realização c) ou cl), quecompreenda pelo menos uma ou mais daquelas alterações dos aspectos (i),

(ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (x), (xi) e/ou (xii) da forma de realização 3e tenha termoestabilidade melhorada.

f). A fitase das formas de realização c) ou cl), que compreendapelo menos uma ou mais daquelas alterações dos aspectos (ix) e ou (x) daforma de realização c) e tenha um perfil de pH melhorado.

g). A fitase das formas de realização c) ou cl), quecompreenda pelo menos uma ou mais daquelas alterações do aspecto (x) daforma de realização c) e tenha uma atividade específica melhorada.

h). A fitase das formas de realização c) ou cl), quecompreenda pelo menos uma ou mais daquelas alterações do aspecto (xi) daforma de realização c) e tenha um padrão de glicosilação aperfeiçoado.

i). A fitase das formas de realização c) ou cl), que compreendaa alteração do aspecto (xii) da forma de realização c) que muda um sítiopotencial de clivagem da protease.

j). Uma fitase de qualquer uma das formas de realização a) a

d), incluindo al)aa5)ecl), a qual compreenda uma das seguintes alterações:

i). 141C/199C, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C e/ou162C/247C;

ii) 41P, 91P, 136P, 137P, 154P, 161P, 355P, 11 IP, 240P, 282P, 283P, 284P,289P, 4P e/ou 5P;

(iii) 52E, 551, 57Y, 104A/105F, 107D,G, 109A,G, 76G, 84Y, 121T, 362K,273L,Q, 285G,R, 286Q, 294T, 299L, 331K/55D e/ou 351Y;

(iv) 1*, l*/2* ou l*/2*/3*;

(v) em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

(vi) 119R,K e/ou 411R,K;

(vii) 107E e/ou 164E,D;

(viii) 362R,K, 276R,K, 379R,K, 409D,E, 223E, 385D, 46D.E, 410D,E e/ou82E;

(ix) 218Q, 324N, 200R,K, 121D, 196Q, 202N, 406A, 167Q, 53V,Q, 241Q,314N,G, 239Q e/ou 285N;

(x) 114H/115Q/116E/117K/118M/119G/120T/121M/122D/123P/ 124T,114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121V/122D/123S/124L,114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121M/122D/123P/124V,114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121A/122D/123P/124L,114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L ou114N/115Q/116A/117D/118L/119K/120K/121T/122D/123P/124L;(xi) 31T, 74A, 171T, 203T, 281H, 316D e/ou 308D; e/ou(xii) 339D.

k). A fitase de qualquer uma das formas de realização a) a d),incluindo a1) a a5) e cl), que compreenda pelo menos uma das seguintesalterações:

(i) K141C/V199C, Q91C/W46C, G52C/A99C, N31C/E176C, D31C/T177C,G59C/F100C e/ou S162C/S247C;

(ii) D41P, Q91P, N136P, T137P, L154P, S161P, T355P, Q111P, K240P,G282P, T283P, T284P, G289P, N4P e/ou G5P;

(iii) G52E, V55I, E57Y, L104A/A105F, K107D,G, Q109A,G, T76G, A84Y,N121T, I362K, M273L,Q, E285G,R, N286Q, V294T, I299L, E331K/V55De/ou F351Y;

(iv) El*, El*/E2* ou El*/E2*/Q3*;

(v) em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

(vi) El 19R,K e/ou E411R,K;

(vii) K107E e/ou R164E,D;

(viii) I362R,K, T276R,K, I379R,K, V409D,E, Q223E, N385D, W46D,E,T4IOD5E e/ou Q82E;

(ix) E218Q, D324N, T200R,K, N121D, E196Q, D202N, E406A, E167Q,E53V,Q, E241Q, D314N,G, E239Q e/ou E285N;

(x) Yl 14H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121M/L124TY114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S,

Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/122D/L124V,

Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P,

Yl14H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A,Yl14T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P ou

Yl14N/K116A/E118L/E119K/N121T;

(xi) N74A, N171T, N203T, N281H e/ou N308A; e/ou

(xii) R339D.

p). A fitase da forma de realização o), que seja uma variante daSEQ ID NO: 3.

q). A fitase de qualquer uma das formas de realização a) a d),incluindo al) a a5) e cl), que compreenda pelo menos uma das seguintesalterações:

(i) K141C/V199C, Q91C/W46C, G52C/A99C, N31C/E176C, N31C/T177C,G59C/F100C e/ou S162C/S247C;

(ii) D41P, Q91P, N136P, T137P, L154P, S161P, T355P, Q111P, K240P,G282P, T283P, T284P, G289P, N4P e/ou G5P;

(iii) G52E, V55I, E57Y, L104A/A105F, K107D,G, Q109A,G, T76G, A84Y,N121T, I362K, M273L,Q, E285G,R, N286Q, V294T, I299L, V55D e/ouF351Y;

(iv) El*, El*/E2* ou El*/E2*/Q3*;(ν) em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP5 NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ,KEKKV ou KTDKL;

(vi) El 19R,K e/ou E41IR5K;

(vii) Kl 07E e/ou Rl 64E,D;

(viii) I362R,K, T276R,K, I379R,K, V409D,E, Q223E, N385D, W46D,E,T4IOD5E e/ou Q82E;

(ix) E218Q, D324N, T200R,K, N121D, E196Q, D202N, E406A, E167Q,E53V,Q, E241Q, D314N,G, E239Q e/ou E285N;

(x) Yl 14H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121M/L124T,

Yl 14H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S,

Yl 14H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V,

Yl 14T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P,

Yl 14H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121 A,

Yl 14T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P ou

Yl 14N/K116A/E118L/E119K/N121T;

(xi) N31T, N74A, N171T, N203T, N281H, N316d e/ou N308A; e/ou

(xii) R339D.

r). A fitase da forma de realização q), que seja uma variante daSEQ ID NO: 6.

s). A fitase de qualquer uma das formas de realização a) a d),incluindo al) a a5) e cl), que compreenda pelo menos uma das seguintesalterações:

(i) K141C/V199C, Q91C/W46C, G52C/A99C, N31C/E176C, D31C/T177C,G59C/F100C e/ou S162C/S247C;

(ii) D41P, Q91P, N136P, T137P, L154P, S161P, T355P, Q111P, K240P,G282P, T283P, T284P, G289P, N4P e/ou G5P;

(iii) G52E, V55I, E57Y, L104A/A105F, K107D,G, Q109A,G, T76G, A84Y,I362K, M273L,Q, E285G,R, N286Q, V294T, I299L, E331K/V55D e/ouF351Y;

(iv)El*,El*/E2* ou El*/E2*/P3*;

(v)em que K179, T180, T181, E182, K183, S184, T185 e K186 tenham sidosubstituídos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ5 KEKQQ,

KEKKV ou KTDKL;

(vi) El 19R,K e/ou E411R,K;

(vii) K107E e/ou R164E,D;

(viii) I362R,K, T276R,K, I379R,K, V409D,E, Q223E, N385D, W46D,E,T4IOD5E e/ou Q82E;

(ix) E218Q, D324N, T200R,K, T121D, E196Q, D202N, E406A, E167Q,E53V,Q, E241Q, D314N,G, E239Q e/ou E285N;

(x) Yl 14H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/T121M/L124T,Yl 14H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121V/P123S,

Yl 14H/K116P/D117E/E118I/E119G/T121M/L124V,

Yl 14T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121P,

Yl 14H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A,

Yl 14T/K116T/E118T/E119S/K120S/T121P ou

Yl 14N/K116A/E118L/E119K;

(xi) D31T, N74A, N171T, N203T, N281H, N316D e/ou N308A; e/ou(xii) R339D.

t). A fitase da forma de realização s), que seja uma variante daSEQ ID NO: 9.

u). Uma seqüência de ácidos nucleicos isolada,compreendendo uma seqüência de ácidos nucleicos que codifique a fitase dequalquer uma das formas de realização a) a t), incluindo al) a a5) e cl).

v). Uma construção de ácido nucleico compreendendo aseqüência da ácidos nucleicos da forma de realização u) operavelmente ligadaa uma ou mais seqüências de controle que direciona a produção da fitase emum hospedeiro de expressão adequado.w). Um vetor de expressão recombinante compreendendo aconstrução de ácido nucleico da forma de realização v).

x). Uma célula hospedeira recombinante compreendendo aconstrução de ácido nucleico da forma de realização v) e/ou o vetor deexpressão da forma de realização w).

y). Um método para produzir a fitase de qualquer uma dasformas de realização a) a t), incluindo al)aa5)ecl), compreendendo

(a), cultivar a célula hospedeira da forma de realização x) paraproduzir um sobrenadante contendo a fitase; e (b) recuperar a fitase.

z). Uma planta transgênica, ou parte da planta, capaz deexpressar a fitase de qualquer uma das formas de realização a) a t), incluindoal) a a5) e cl).

ae). Um animal transgênico não humano, ou seus produtos ouelementos, sendo capazes de expressar uma fitase de qualquer uma das formas de realização a) a t), incluindo al) a a5) e cl).

oe). Uma composição compreendendo pelo menos uma fitasede qualquer uma das formas de realização a) a t), incluindo al) a a5) e cl), e

(a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura;

(b) pelo menos uma vitamina solúvel em água; e/ou

(c) pelo menos um mineral traço.

aa). A composição da forma de realização oe) aindacompreendendo pelo menos uma enzima selecionada do seguinte grupo deenzimas: amilase, fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidade,protease, fosfolipase e/ou beta-glucanase.

bb). A composição de qualquer uma das formas de realização

oe) a aa), que seja um aditivo de alimentação para animal.

cc). Uma composição de alimentação para animal tendo umteor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e compreendendo a fitase de qualqueruma das formas de realização a) a t), incluindo al) a a5) e cl) ou acomposição de qualquer uma das formas de realização oe) a aa).

dd). Um método para melhorar o valor nutritivo de umaalimentação para animal, em que a fitase de qualquer uma das formas derealização a) a t), incluindo al)aa5)ecl)oua composição de qualquer umadas formas de realização oe) a aa), sejam adicionadas à ração.

ee). Um processo para reduzir os níveis de fitato no esterco deanimal, compreendendo alimentar um animal com uma quantidade eficaz daração da forma de realização cc).

ff). Um método para o tratamento das proteínas de legume,compreendendo a etapa de adicionar a fitase de qualquer uma das formas derealização a) a t), incluído as al) a a5) e cl), ou a composição de qualqueruma das formas de realização oe) a aa), a pelo menos uma proteína de legumeou fonte de proteínas.

gg). Uso da fitase de qualquer uma das formas de realização a)a t), incluindo al) a a5) e cl), ou a composição de qualquer uma das formasde realização oe) a aa) em uma alimentação para animal; na preparação daração para animal; para melhorar o valor nutritivo da ração para animal; parareduzir os níveis de fitato no esterco dos animais; para o tratamento dasproteínas de legume; ou para liberar fósforo de um substrato de fitase.

A invenção descrita e reivindicada neste relatório descritivonão fica limitada no escopo pelas formas de realização específicas aquiapresentadas, uma vez que estas formas de realização são fornecidas comoilustrações dos vários aspectos da invenção. Quaisquer formas de realizaçãoequivalentes são entendidas como estando dentro do escopo desta invenção.

De fato, várias modificações da invenção, além daquelas apresentadas edescritas neste relatório, tornar-se-ão evidentes, àqueles habilitados natécnica, da descrição supracitada. Entende-se também que tais modificaçõesse situem dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, opresente relatório descritivo, incluindo as definições, assumirão o controle.Várias referências são aqui citadas, cujos teores sãoincorporados como referência em suas totalidades.

EXEMPLOS

Os produtos químicos usados são produtos comerciais de pelomenos graduação de reagente.

Exemplo 1: preparação de variantes, e teste de termoestabilidade e de perfilde pH.

Preparação das variantes de fitase

O DNA codificando uma variante da fitase tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, é gerado por métodos conhecidos natécnica, e as construções são fundidas por PCR ao DNA codificando para opeptídeo de sinal descrito por Takami et al. em Biosci. Biotechnol. Biochem.56: 1455 (1992) e integrado por recombinação homóloga no genoma de umacélula hospedeira de Bacillus subtilis [ver Diderichsen et al. (1990), J. Bacteriol., 172, 4315-4321] com o uso de técnicas padrão. Os genes sãoexpressos sob o controle de um sistema promotor triplo (como descrito naWO 99/43835), e as proteínas de fitase resultantes são purificadas com o usode métodos convencionais.Determinação da estabilidade de temperatura A estabilidade da temperatura de uma variante de fitase podeser determinada da seguinte maneira: 500 microlitros de solução protéica davariante e da proteína de referência (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 4 e/ou SEQ ID NO: 6) tendo aproximadamente 10 microgramas deproteína por mililitro, e sendo dissolvidos em tampão de acetato de Na 0,1 M, pH 5,5, são repartidos em duas porções, uma porção sendo incubada em umatemperatura elevada desejada (por exemplo 50 °C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C,75°C, 80°C ou 85°C) em recipientes de plástico, a outra é armazenada em5°C. Após 30 minutos de incubação na temperatura elevada, as soluçõesprotéicas são transferidas para um banho gelado e a atividade da amostraesfriada, bem como da amostra aquecida, é medida pelo ensaio de fosfatasedescrito abaixo (tampão cego subtraído). A atividade residual é definida comoa atividade após o tratamento de calor dividida pela atividade da amostraesfriada (em%). Uma variante é considerada como sendo mais estável àtemperatura (termoestável) se a atividade residual no ensaio da fosfatase ouda fitase for mais elevada, em comparação com a referência.Determinação da atividade da fosfatase

75 microlitros de solução enzimática contendo fitase sãodispensados em um reservatório de placa microtituladora, por exemploNUNC 269620, e 75 microlitros de substrato são acrescentados (para prepararo substrato, dois tabletes de 5 mg de fosfato de p-nitrofenila (Sigma, Cat. n°N-9389) são dissolvidos em 10 ml de tampão de acetato de Na 0,1 M, pH5,5). A placa é selada e incubada por 15 minutos, sacudida com 750 rpm em37°C. Após o tempo de incubação, 75 microlitros de reagente de parada sãoadicionados (o reagente de parada é tetraborato dissódico 0,1 M em água) e aabsorbância em 405 nm é medida em um espectrofotômetro de placamicrotituladora. Uma unidade de fosfatase é definida como a atividadeenzimática que libera 1 micromol de fosfato/minuto sob as dadas condiçõesde reação (tampão cego subtraído). A absorbância de 1 micromol de p-nitrofenol é determinada como sendo de 56 AU (AU = unidades deabsorbância) sob as condições do ensaio.

Medições de DSC

A Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) pode serrealizada em vários valores de pH com o uso da VP-DSC da Micro Cal. Asvarreduras são realizadas em um índice constante de varredura del,5°C/minuto, de 20 a 90°C. Antes do desenvolvimento da DSC, as fitasessão dessalinizadas com o uso de colunas NAP-5 (Pharmacia) equilibrada nostampões apropriados (por exemplo, glicina-HCL 0,1 M, pH 2,5 ou 3,0;acetato de sódio 20 mM, pH 4,0; acetato de sódio 0,1 M, pH 5,5; Tris-HCl 0,1Μ, ρΗ 7,0). A manipulação dos dados é realizada com o uso do programaMicroCal Origin (versão 4.10), e a temperatura de desnaturação, Td (tambémchamada de temperatura de fusão), Tm) é definida como a temperatura noápice do pico no termograma.

Perfil de pH aperfeiçoado: determinação da relação da atividade em ph3,5/5,5.

Um aperfeiçoamento do perfil de pH de uma variante de fitasepode ser determinado como segue: A atividade é medida em pH 3,5 (tampãode acetato 0,1 M, pH 3,5) e em pH 5,5 (tampão de acetato 0,1 M, pH 5,5), emambos os o tempão cego sendo subtraído. A atividade determinada em pH 3,5é dividida pela atividade determinada em pH 5,5, isto é, as duas medições daabsorbância são divididas (ver abaixo). Para medir a atividade, ossobrenadantes das variantes e das referências são apropriadamente diluídos(por exemplo, 1:5000) no tampão respectivo. 75 microlitros da soluçãoenzimática respectiva são dispensados em um reservatório de placamicrotituladora, por exemplo NUNC 269620, e 75 microlitros de substratocom o pH correspondente são adicionados [o substrato é preparado peladissolução de dois tabletes de 5 mg de fosfato de p-nitrofenila (Sigma, Cat. n2N-9389) em 10 ml de tampão de acetato de Na 0,1 M, pH 5,5, e 10 ml detampão de acetato 0,1 M, pH 3,5, respectivamente]. A placa é selada eincubada por 15 minutos, sacudida com 850 rpm em 37°C. Após o tempo deincubação, 75 microlitros de reagente de parada (tetraborato dissódico 0,1 Mem água) são adicionados e a absorbância em 405 nm é medida em umespectrofotômetro de placa microtituladora.

Determinação da atividade da fitase

75 microlitros de enzima contendo fitase, apropriadamentediluída (por exemplo em acetato de sódio 0,25 M, 0,005% (p/v) de Tween-20,pH 5,5), são dispensados em um reservatório de placa microtituladora, porexemplo NUNC 269620, e 75 microlitros de substrato são adicionados[preparados pela dissolução de 100 mg de fitato de sódio de arroz (AldrichCat. n° 274321) em 10 ml de tampão de acetato de Na 0,25 M, pH 5,5]. Aplaca é selada e incubada por 15 minutos, sacudida em 750 rpm a 37°C. Apóso tempo de incubação, 75 microlitros de reagente de parada são acrescentados[o reagente de parada sendo preparado pela mistura de 10 ml de solução demolibdato (10% (p/v) de hepta-molibidato de amônio em 0,25% (p/v) desolução de amônia); 10 ml de vanadato de amônio (0,24% do produtocomercial da Bie&Berntsen, Cat. n° LAB17650) e 21,7% (p/v) de ácidonítrico], a absorbância em 405 nm é medida em um espectrofotômetro deplaca microtituladora. A atividade da fitase é expressa na unidade de FYT, umFYT sendo a quantidade de enzima que libera 1 micromol de orto-fosfatoinorgânico por minuto sob as condições acima. Um valor absoluto para aatividade da fitase medida é obtido pela referência a uma curva padrãopreparada de diluições apropriadas do fosfato inorgânico, ou a uma curvapadrão produzida das diluições de uma preparação de enzimas de fitase comatividade conhecida (tal preparação de enzima padrão com uma atividadeconhecida acha-se disponível, sob pedido, da Novozymes A/S, Krogshoejvej36, DK-2880 Bagsvaerd).

Exemplo 2: Influência do hospedeiro de expressão/glicosilação emtermoestabilidade

Expressão em Bacillus

A fitase da SEQ ID NO: 2 foi expressa em Bacillus subtilis,como descrito no Exemplo 1, e purificada com o uso de métodosconvencionais: Centrifugação, filtração em gel, precipitação de sulfato deamônio (80% de saturação de sulfato de amônio), centrifugação, recolocaçãoem suspensão das pelotas no tampão A (acetato de sódio 50 mM, sulfato deamônio 1,5 M, pH 4,5), filtração, cromatografia de interação hidrofóbica[Phenyl Toyopearl, carga com tampão A, eluição com tampão B (acetato desódio 50 mM, pH 4,5)], e cromatografia de troca de cátions (SP-sefarose,carga com citrato de sódio 10 mM, pH 4,0), eluindo com um gradiente linearde sal (citrato de sódio 10 mM, pH 4,0 + NaCl 1M).

Expressão em Pichia

Além disso, a fitase da SEQ ED NO: 2 foi expressa em Pichiapastoris como descrito de uma maneira geral por Rodriguez et al. emArchives of Biochemistry and Biophysics, volume 382, n° 1, 2000, pp. 105-112. A fitase foi purificada do sobrenadante do caldo de fermentação comosegue: Precipitação com sulfato de amônio (80% de saturação), redissoluçãoem 10 ml de tampão de acetato de sódio 25 mM, pH 4,5, diálise em relaçãocom o mesmo tampão, e filtração através de um filtro de 0,45 mm. 150 mldesta solução foram aplicados a uma coluna SP Sepharose FF de 40 ml(Pharmacia) equilibrada com o mesmo tampão, pH 4,5, e a proteína foi eluídacom um gradiente linear de NaCl (0 a 0,5 M). As frações da coluna foramanalisadas quanto à atividade de fitase. As frações com atividade de fitaseforam verificadas por SDS-PAGE e as frações puras foram reunidas. Aconcentração protéica foi medida pelo uso do kit BCA (Pierce).

Termoestabilidade por DSC

A fitase expressa em Pichia e em Bacillus da SEQ ID NO: 2foi submetida a medições de termoestabilidade por Calorimetria de VarreduraDiferencial (DSC).Preparação das amostras

As amostras (menos do que 3 ml em volume) foram dialisadasem um ambiente frio (aproximadamente 5 graus centígrados) por um mínimode 1 hora, em relação a 500 ml de tampão de acetato de sódio 20 mM, pH 4,0.A amostra foi transferida para 500 ml da preparação de tampão recente e friae deixada dialisar-se durante a noite. As amostras foram filtradas com o usode um filtro de seringa micrométrica de 0,45, o volume foi ajustado emaproximadamente 1,5 ml com o uso do tampão de diálise, e a A280(absorbância em 280 nm) foi registrada. O tampão de diálise foi usado comoreferência nas varreduras de DSC. As amostras foram desgaseificadas com ouso de sucção a vácuo e agitação por aproximadamente 10 minutos.

Durante a preparação da amostra da fitase expressa em Pichia[diálise em relação a acetato de sódio 20 mM (NaAc)5 pH 4,0], umprecipitado foi formado. O sobrenadante foi usado para uma primeiraexperiência. Posteriormente, a parte remanescente da solução de estoquepurificada foi dialisada em relação a NaAc 20 mM, pH 4,0, e isto possibilitoua precipitação de algumas impurezas de peso molecular baixo presentes nolote. Este lote foi usado para uma segunda experiência, que revelou uma Tmmuito semelhante à da primeira experiência (54 vs. 55°C).

Experiência da DCS:

Ajustes experimentais com o uso de um instrumentoMicroCal® VP-DSC: índice da varredura: 90 K/h. Intervalo da varredura: 20 a90 graus centígrados. Modo de realimentação: Nenhum. Período de filtragem: 16 s.

As concentrações de enzimas das amostras aproximadamenteforam de 1 a 1,5 mg/ml, estimadas por A2so e um coeficiente de extinçãoteoricamente calculado em 280 nm (Vector NTI versão 9.0.0). A temperaturade desdobramento térmico (Td) foi avaliada com o uso do programa MicroCalOrigin (versão 4.10) e a temperatura de desnaturação foi determinada como atemperatura no ápice no termograma.

Os resultados são resumidos na Tabela 2 abaixo.

TABELA 2

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Da Tabela 2, parece claramente que a fitase expressa emPichia é muito menos termoestável do que a fitase expressa em Bacillus.

A fitase expressa em Pichia foi pesadamente glicosilada, comoobservado por uma ampla faixa de massas moleculares com o uso daespectrometria de massa (Maldi-TOF), ao passo que a fitase expressa emBacillus não foi glicosilada.

Exemplo 3:variante de fitase R339D

Uma variante da fitase, engendrada em proteína, de SEQ IDNO: 2, tendo a substituição R339D, foi preparada e expressa em Arpergillusoryzae com o uso de métodos conhecidos na técnica. Sua temperatura dedesnaturação, Td, foi determinada a 62,5°C (acetato de sódio 20 raM, pH4,0), com o uso da DSC como descrito no Exemplo 2.

A substituição R339D além disso serve para remover um sítiode clivagem da protease Kex2 de relevância potencial para a expressão emAspergillus.

Exemplo 4: ração para animal e aditivos de ração para animais,compreendendo uma variante de fitase.

Aditivo de ração para animais

Uma formulação da variante de fitase R339D da SEQ ID NO:2 contendo 0,15 g de proteína da enzima fitase, é adicionada à seguinte pré-mistura (por quilograma de pré-mistura):

5000000 IE Vitamina A

1000000 IE Vitamina D3

13333 mg Vitamina E

1000 mg Vitamina K3

750 mg Vitamina B1

2500 mg Vitamina B2

1500 mg Vitamina B6

7666 mcg Vitamina B12

12333 mg Niacina

33333 mg Biotina

300 mg r Acido Fólico<table>table see original document page 91</column></row><table>

Ração para animal

Este é um exemplo de uma ração para animal (rações parafrangos para assar) compreendendo 1,5 mg/kg (1,5 ppm) da variante de fitaseR339D da SEQ ID NO: 2 (calculado como proteína da enzima fitase):

62,55% de milho33,8% de farinha de soja (50% de proteína bruta, CP)1,0% de óleo de soja0,2% de DL-Metionina0,22% de DCP (fosfato dicálcico)0,76% de CaCO3 (carbonato de cálcio)0,32% de Areia0,15% de NaCl (cloreto de sódio)1% da Pré-mistura acima

Os ingredientes são misturados, e a ração é pelotizada natemperatura desejada, por exemplo em 60, 65, 75, 80, 85, 90 ou mesmo 95°C.

Exemplo 5: determinação da estabilidade da temperatura

Oito variantes da SEQ ID NO: 2 (as alterações, em comparaçãocom a SEQ ID NO: 2, são apresentadas na Tabela 3, abaixo) foram preparadascomo descrito no Exemplo 1. As duas fitases de referência, tendo as SEQ IDNO: 2 e SEQ ID NO: 3, foram preparadas da mesma maneira.

A estabilidade de temperatura foi determinada como segue:200 microlitros dos sobrenadantes de cada uma das variantes,e as proteínas de referência foram divididas em duas porções, uma porção foiincubada em 50°C em recipientes plásticos, a outra foi armazenada em 5°C.Após a incubação de 30 minutos em 5 0°C, as soluções protéicas foramtransferidas para um banho gelado. Após a diluição a 1:100 em tampão deacetato de Na 0,1 M, pH 5,5, a atividade da amostra esfriada e aquecida foimedida pelo ensaio da fosfatase do Exemplo 1 ("Determinação da Atividadeda Fosfatase"), tampão cego subtraído. Os resultados são apresentados naTabela 3, abaixo, como atividade enzimática [em unidades de absorção (AU)]após a incubação por 30 minutos em 5°C e 50°C, respectivamente, e aatividade residual (RA) é calculada como atividade da amostra tratada pelocalor (incubação a 50°C) dividida pela atividade da amostra esfriada(incubação a 5 °C), em%.

Tabela 3: variantes de fitase com termoestabilidade melhorada

<table>table see original document page 92</column></row><table>

Exemplo 6: desempenho na ração para animal em um modelo in vitro

O desempenho na ração para animal de uma variante defitase é comparado, em um modelo in vitro, ao desempenho de umaproteína de referência, tal como as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 4 e/ou SEQ ID NO: 6. O modelo in vitro simula as condiçõesgastrintestinais em um animal monogástrico e se correlaciona bem com osresultados obtidos em testes com animais in vivo. A comparação érealizada como segue:

A atividade da fitase na amostra da variante é determinadacomo descrito no Exemplo 1 sob "Determinação da atividade da fitase".

As amostras de ração compostos de 30% de farinha de soja e70% de farinha de milho, com CaCl2 adicionado até uma concentração de 5gde cálcio por quilograma de ração, são então preparadas e pré-incubadas em40°C e pH 3,0 por 30 minutos, seguido pela adição de pepsina (3000 U/g deração) e dosagens adequadas das fitases (dosagens idênticas são usadas para todasas fitases a serem testadas, para possibilitar a comparação), por exemplo entre 0,25a 0,75 unidades de fitase FYT/g de ração. Um branco sem nenhuma atividade defitase é também incluído como referência. As amostras são então incubadas em40°C e pH 3,0, por 60 minutos, seguido por pH 4,0 por 30 minutos.

As reações são interrompidas e o ácido fítico e os fosfatos deinositol são extraídos pela adição de HCl até uma concentração final de 0,5 Me incubação a 40°C por 2 horas, seguida por um ciclo de congelamento-descongelamento e 1 hora de incubação a 40°C.

O ácido fítico e os fosfatos de inositol são separados porcromatografia iônica de alto desempenho conforme descrito por Chen et al.em Journal of Chromatography A (2003) volume 1018, pp. 41-52 equantificados como descrito por Skoglund et al. em J. Agric. Food Chem.(1997), volume 45, pp. 431-436.

O fósforo liberado é então calculado como a diferença nofósforo ligado ao fosfato de inositol (IP-P) entre as amostras tratadas comfitase e as não tratadas. O desempenho relativo da variante é calculado comoo percentual do fósforo liberado pela fitase de referência.

O desempenho in vitro de várias variantes da fitase da SEQ IDNO: 2 foi determinado como descrito acima, em uma dosagem de 125FYT/kg de ração.

Os resultados são apresentados nas Tabelas 4A e 4B abaixo,quanto aos sobrenadantes e as fitases purificadas, respectivamente. IP6-Presidual designa a quantidade de IP6-P (fósforo do fitato) deixada após aincubação in vitro e é indicado em mg/g de DM (Matéria Seca). O IP6-Pdegradado é determinado como a diferença entre o IP6-P residual do branco eo IP6-P residual da amostra respectiva. Finalmente, o IP6-P degradado naúltima coluna é indicado em relação à fitase tendo a SEQ ID NO: 2. NaTabela 4A, os valores do branco e da referência (SEQ ID NO: 2) são asmédias de várias determinações independentes, enquanto os outrosvalores baseiam-se em determinações isoladas. Na Tabela 4B, o valor dobranco é a média de várias determinações independentes, enquanto osoutros valores baseiam-se em determinações isoladas.

Tabela 4A: Desempenho in vitro dos sobrenadantes das variantes de fitase

<table>table see original document page 94</column></row><table>Variante rr / (aperfeiçoamento em comparação com a SEQ IDNO: 2) - LP6-P residual - IP6-P degradado - Branco.

As variantes 015, 016, 018, 040, 041, 042, 044 e 050 parecemter um desempenho in vitro que é pelo menos tão bom ou melhor do que asfitases das SEQ ID NOs: 2 e 3.

Tabela 4B: Desempenho in vitro das variantes de fitase purificadas

<table>table see original document page 95</column></row><table>

As variantes 030, 031, 037, 056, 072, 085, 087, 089, 090, 095,098 e 125 parecem desempenhar-se pelo menos tão bem in vitro quanto afitase da SEQ ID NO: 3.

Exemplo 7: atividade especifica

A atividade específica de uma variante de fitase é determinadasobre amostras altamente purificadas dialisadas em relação a acetato de sódio250 mM, pH 5,5. A pureza é verificada de antemão sobre um gel depoliacrilamida de SDS mostrando a presença de apenas um componente.

A concentração protéica é determinada pela análise deaminoácidos, como segue: Uma alíquota da amostra é hidrolisada em HCl 6N,0,1% de fenol, por 16 horas a 110ᵒC em um tubo de vidro evacuado. Osaminoácidos resultantes são quantifidados com o uso de um sistema deanálise de aminoácidos da Applied Biosystems 420A operado de acordo comas instruções do fabricante. Das quantidades dos aminoácidos, a massa total -e assim também a concentração - da proteína na alíquota hidrolisada, pode sercalculada.

A atividade da fitase é determinada nas unidades de FYT,como descrito no Exemplo 1 ("Determinação da atividade da fitase"), e aatividade específica é calculada como a atividade da fitase medida emunidades de FYT por miligrama de proteína enzimática da variante de fitase.

A atividade da fitase quanto à fitase da SEQ ID NO: 2 e avariante 072 (I362R da SEQ ID NO: 2) foi determinada como descrito acima.A atividade específica da variante 072 foi de 86% da atividade específica dafitase da SEQ ID NO: 2. A incerteza (desvio padrão) é estimada emaproximadamente 10%, a qual é principalmente devida ao ensaio da atividadeda fitase com base em um substrato complexo.Exemplo 8: estabilidade da temperatura

Várias variantes da SEQ ID NO: 2 foram preparadas comodescrito no Exemplo 1, e as cepas hospedeiras de Bacillus subtilis cultivadasem 100 ml de meio PSl [100 g/litro de sacarose, 40 g/litro de flocos de soja,10 g/litro de Na2HPO4.12H20, 01, ml/litro de Dowfax 63N10 (Dow)] emfrascos de agitação de 500 ml por quatro dias em 30°C, em 300 rpm.

Duas fitases de referência foram preparadas da mesmamaneira, a saber, a fitase tendo a SEQ ID NO: 3 (correspondente à varianteN31 D/Q 139K/L197F/N316K da SEQ ID NO: 2), e a fitase tendo a SEQ IDNO: 4 (correspondente à variante N31D/N121T/K132T/Q139K da SEQ IDNO: 2).

Igualmente a fitase tendo a SEQ ID NO: 9 foi incluída paracomparação (correspondente à variante Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K daSEQID NO: 2).

A estabilidade da temperatura das variantes e das fitases dereferência foi determinada como segue:

Os sobrenadantes foram diluídos por dez vezes pela adição de20 ul (microlitros) de sobrenadante a 180 ul de tampão de acetato de Na 0,1M, pH 5,5 + 0,005% de Tween-20. As enzimas diluídas foram divididas emduas porções, uma porção foi incubada em 60°C em recipientes plásticos, e aoutra porção foi armazenada em 5°C. Após 30 minutos de incubação a 60°C,as soluções protéicas foram transferidas para um banho gelado. Após adiluição a 1:10 em tampão de acetato de Na 0,1 M, pH 5,5, e 0,005% deTween-20, a atividade da amostra esfriada e aquecida foi medida pelo ensaioda fosfatase do Exemplo 1 ("Determinação da atividade da fosfatase"), otampão cego subtraído.

A Tabela 5 é uma lista de variantes com estabilidade detemperatura melhorada em comparação com as fitases de referência. Paracada variante, a tabela também especifica as alterações em comparação com aSEQ ID NO: 2. A atividade enzimática [em umidades de absorção (AU)] apósa incubação por 30 minutos em 50C e 60°C, respectivamente, foideterminada, e a atividade residual (RA) foi calculada como a atividade daamostra tratada pelo calor (incubação a 60°C), dividida pela atividade daamostra esfriada (incubação a 5°C). Em seguida, os resultados da atividaderesidual foram normalizados à atividade residual da fitase da SEQ ID NO: 2,tendo sido expressa e tratada da mesma maneira. O Fator de Melhoramento(IF) resultante é apresentado na Tabela 5. Para a fitase da SEQ ID NO: 2, o IFé de 1,0, enquanto as duas fitases de referência de SEQ ID NOs: 3 e 4 forammenos termoestáveis do que a fitase da SEQ ID NO: 2, o que é evidente dofato de que o IF para estas duas fitases foi de apenas 0,1 e 0,3,respectivamente.

Tabela 5: variantes da fitase com termoestabilidade melhorada

<table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table>

Exemplo 9: termoestabilidade por DSC

Várias variantes purificadas da SEQ ID NO: 2 forampreparadas como escrito de uma maneira geral no Exemplo 1. Duasfitases de referência foram preparadas da mesma maneira, a saber, a fitasetendo a SEQ ID NO: 3 (correspondente à varianteN31 D/Q 139K/L197F/N316K da SEQ ID NO: 2), e a fitase tendo a SEQ IDNO: 4 (correspondente à variante N31D/N121T/K132T/Q139K da SEQ IDNO: 2). Igualmente a fitase tendo a SEQ ID NO: 9 foi incluída paracomparação (correspondente à variante Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139Kda SEQ ID NO: 2).

As alíquotas das amostras de proteína foram dialisadas emrelação a 2 χ 500 ml de acetato de Na 20 mM, pH 4,0, em 4°C em uma etapade 2 a 3 horas, seguida por uma etapa durante a noite. Cada amostra foifiltrada em 0,45 um e diluída com tampão até aproximadamente 2 unidades deA28o- Os valores exatos da absorbância medidos são dados na tabela deresultados. A DSC foi realizada em um MicroCal VP-DSC em um índice devarredura de 90°C/hora, de 20 a 90°C, em tampão de acetato de Na 20 mM,pH 4,0.

As temperaturas de desnaturação (Td) resultantes sãoapresentadas na Tabela 6 abaixo, a qual resume os resultados de trêsdiferentes experiências.

Tabela 6: medições das td por dsc

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Exemplo 10: purificação e perfil da temperatura

As variantes de fitase e as fitases de referência e comparativasaqui usadas foram purificadas como segue: O sobrenadante da fermentaçãocom a fitase foi primeiro centrifugado em 7200 rpm e a 50C por uma hora, efiltrado através de um sanduíche de quatro filtros de microfibras de vidroWhatman (2,7, 1,6, 1,2 e 0,7 micrômetros). Em seguida a isto, a solução foifiltrada de forma estéril (ou através de um filtro elevado Fast PES Bottle comum corte de 0,22 μηι ou através de um filtro de profundidade Seitz-EKS como uso de pressão). À solução foi adicionado sulfato de amônio sólido, dandouma concentração final de 1,5 M, e o pH foi ajustado em 6,0 com o uso deHCl 6 Μ.

A solução contendo fitase foi aplicada a uma coluna de butil-sefarose, aproximadamente 50 ml em uma coluna XK26, usando comotampão A bis-tris 25 M [Bis-(2-hidroxietil)imino-tris(hidroximetil)metano)] +sulfato de amônio 1,5 M, pH 6,0, e como tampão B bis-tris 25 M, pH 6,0. Asfrações da coluna foram analisadas quanto à atividade com o uso do ensaio defosfatase (ver Exemplo 1, "Determinação da atividade da fosfatase") e asfrações com atividade foram coletadas. As frações coletadas foram dialisadasextensivamente em relação a acetato de sódio 10 mM, pH 4,5. Em seguida aisto, a solução contendo fitase foi purificada por cromatografia sobreSepharose S, aproximadamente 75 ml em uma coluna XK26, com o uso,como tampão A, de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, e como tampão B,acetato de sódio 50 mM + NaCl 1 M, pH 4,5. Novamente as frações da colunaforam analisadas quanto à atividade, e as frações com atividade foramcoletadas. Finalmente, a solução contendo a fitase purificada foi concentradacom o uso de um dispositivo de filtragem Amicon ultra-15 com umamembrana de corte de 10 kDa.

O peso molecular, estimado de SDS-PAGE, foiaproximadamente de 40 kDa para todas as fitases, e a pureza foi, em todos oscasos, > 95%.

O perfil de temperatura (atividade de fitase como uma funçãoda temperatura) das variantes foi determinado na faixa de temperatura de 20 a90°C, essencialmente como descrito no Exemplo 1 ("Determinação daatividade da fitase"), porém as reações enzimáticas (100 microlitros desolução enzimática contendo a fitase + 100 microlitros de substrato)foram realizadas em tubos de PCR, ao invés de placas microtituladoras.Após um período de reação de 15 minutos na temperaturadesejada, os tubos foram esfriados a 20°C por 20 segundos, e 150microlitros da mistura de reação foram transferidos para uma placamicrotituladora. 75 microlitros de reagente de parada foram adicionados ea absorbância em 405 nm foi medida em um espectrofotômetro de placamicrotituladora. Os resultados acham-se resumidos na Tabela 7, abaixo.

Os números dados para cada temperatura (20 a 90°C em etapas de 10°C)são as atividades relativas (em%) normalizadas aos valores maisfavoráveis.

Tabela 7: perfis das temperaturas

<table>table see original document page 102</column></row><table>

As variantes 030, 031, 037, 044, 056, 062, 072, 083 e 093 têmuma atividade relativa mais elevada em 70°C, em comparação com as fitasesde referência 026 e 102.

Exemplo 11: perfil do pH

Os perfis do pH (atividade da fitase como uma função do pH)de várias variantes, e as mesmas fitases de referência e comparativas, comousados nos exemplos anteriores, foram determinados em 37°C nas faixas depH de 2,0 a 7,5 (nas etapas unitárias de pH de 0,5) como descrito no Exemplo1 ("Determinação da atividade da fitase"), exceto que um coquetel de tampão(glicina 50 mM, ácido acético 50 mM e Bis-Tris 50 mM) foi usado no lugardo tampão de acetato de sódio 0,25 M, pH 5,5. Os resultados são resumidosna Tabela 8, abaixo. Os números dados para cada pH (2,0 a 7,5) são aatividade relativa (em%) normalizada aos valores mais favoráveis.

Tabela 8: perfis do pH

<table>table see original document page 103</column></row><table>

Quanto a YC062 e YC091, a curva do pH (atividade relativacomo uma função do pH) parece ter-se deslocado de 0,5 unidade de pH emdireção a pH mais elevado.

Além disso, enquanto para a maioria das fitases da Tabela 8(incluindo as fitases de referência 026 e 102), o mais favorável é nos pH 3,5 apH 4,0, um pH ótimo de 3,5 sendo observado para os n— 062, 085 e 089, umpH ótimo de 4,0 sendo observado para os n~ 091 e 093.

Exemplo 12: Estabilidade Da Temperatura

A estabilidade da temperatura de várias variantes purificadas eda mesma referência e das fitases comparativas conforme os exemplosanteriores, foi determinada pela medição da atividade da fitase residual após aincubação em 70°C e pH 4,0 (acetato de sódio 0,1 M). As fitases foramincubadas e as amostras foram recolhidas após 0, 10, 30 e 60 minutos, eesfriadas sobre gelo. A atividade residual em pH 5,5 foi determinada com ouso do método descrito no Exemplo 1 ("Determinação da atividade dafitase"). Os resultados, normalizados à atividade encontrada em 0 minutos,são apresentados na Tabela 9, abaixo.

Tabela 9: estabilidade da temperatura

Os resultados acima indicam que os n~ 044, 062, 072 e 083

podem ser mais estáveis sob estas condições (70°C e pH 4) do que as fitasesde referência (embora nesta experiência uma grande variação tenha sidoobservada quanto ao ne 000).

Exemplo 13: cálculo do percentual de identidade e identificação das posiçõescorrespondentes

A SEQ ID NO: 9 foi alinhada com a SEQ ID NO: 2 com o usodo programa Needle do pacote EMBOSS, versão 2.8.0. A matriz desubstituição usada foi a BLOSUM62, a penalidade de abertura dadescontinuidade foi de 10,0, e a penalidade de extensão da abertura foi de 0,5.

O alinhamento resultante é apresentado na Figura 2.O grau de identidade entre a SEQ ID NO: 9 e a SEQ ID NO: 2é calculado como segue: O número de combinações exatas é de 406 (todasessas com um curso vertical). O comprimento da seqüência mais curta é 411(SEQ ID NO: 2). O percentual de identidade é 406/4Ilxl 00% = 98,8%.O alinhamento da Figura 2 é também usado para derivarposições correspondentes, como segue: os aminoácidos em cima um do outroneste alinhamento, acham-se nas posições correspondentes. Por exemplo, oaminoácido Q na posição 3 da SEQ ID NO: 2 corresponde ao aminoácido Pna posição número 25 da SEQ ID NO: 9. Para a presente finalidade, referimo-nos ao número de posição da SEQ ED NO: 2. Portanto, a SEQ ID NO: 9 podeser considerada uma variante da SEQ ID NO: 2 que compreende asubstituição Q3P.

Outras diferenças na forma das substituições dentro dasobreposição do alinhamento, são observadas nas posições 31, 121, 132, e139, a saber, N31D, N121T, K132T e Q139K.

Diferenças adicionais são observadas no término N, em que aSEQ ID NO: 9 tem uma extensão de 22 aminoácidos em comparação com aSEQ ID NO: 2.

Especialmente, a SEQ ID NO: 9 pode, portanto, serconsiderada a seguinte variante da SEQ ID NO: 2:

* OaM/* ObS/* OcT/* OdF/* Oel/* Ofl/* OgR/* OhL/* Oil/* OjF/* OkF/*OmS/* OnL/* OOL/* OpC/* OqG/* OrS/* OsF/* OtS/* OuI/* OvH/* 0wA/Q3P/N3 ID/N121T/K132T/Q139K.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes A/S

<120> "VARIANTES DE FITASE"

<130> 10945.204-KQ

<160> 9

<170> PatsntIn versão l. 4

<210> 1<211> 1233<212> DHA<213> Citrobacter braakii ATCC 51113

<220><221> mat_peptídeo<222> (1)..(1233)

<220><221> CDS<222> (1)..(1233)

<400> 1gaa gag cag aat ggt atg asa ctt gag cgg gtt gtg ata gtg agt cgt 48

Glu Glu Gln Asn Gly Mst Lys Lsu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg

15 10 15

cat gga gta aga gca cct acg aag ttc act cca ata atg aaa aat gtc S6

Bis Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val20 25 30

aca ccc gat caa tgg cca caa tgg gat gtg ccg tta gga tgg cta acg 144

Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Lsu Gly Trp Leu Thr35 40 45

cct cgt ggg gga gaa ctt gtt tct gaa tta ggt cag tat caa cgt tta 1S2

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ssr Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu50 55 SO

tgg ttc acg age aaa ggt ctg ttg aat aat caa acg tgc cca tct cca 240

Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro65 70 75 80

ggg cag gtt gct gtt att gca gac acg gat caa cgc acc cgt aaa acg 2SS

Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr.35 90 95

ggt gag gcg ttt ctg gct ggg tta gca cca aaa tgt caa att caa gtg 336

Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val100 105 110

cat tat cag aag gat gaa gaa aaa aat gat cct ctt ttt aat ccg gta 3S4

His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Lsu Phs Asn Pro Val

115 120 125

aaa atg ggg aaa tgt tcg ttt aac aca ttg cag gtt aaa aac gct att 432

Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Als Ile

130 135 140

crtg gaa cgg gcc gga gga aat att gaa ctg tat acc caa cgc tat caa 4ê0

Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln145 150 155 160tct tca ttt cgg acc ctg gaa aat gtt tta aat ttc tca caa tcg gag 528

Ssr Ssr Phs Arg Thr Lsu Glu Asn Val Leu Asn Phs Ssr Gln Ser Glu165 170 175

aoa tgt aag act aca gaa aag tct acg aaa tgc aca tta cca gag gct 576

Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ssr Thr Lys Cys Thr Lsu Pro Glu Ala160 1S5 150

tta Gcg tct gaa ctt. aag gta act cct gac aat gta tca tta cct ggt 624

Lsu Pro Ssr Glu Lsu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ssr Leu Pro Gly1S5 200 205

gcc tgg agt ctt tct tcc acg ctg act gag ata ttt ctg ttg caa gag 6 72

Ala Trp Ser Leu Ssr Ser Thr Leu Thr Glu Ils Phe Lsu Leu Gln Glu210 215 220

gcc cag gga atg cca cag gta gcc tgg ggg cgt att acg gga gaa aaa 720

Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys225 230 235 240

gaa tgg aga gat ttg tta agt ctg cat aac gct cag ttt gat ctt ttg 7S8

Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Piie Asp Leu Leu245 250 255

caa aga act cca gaa gtt gcc cgt agt agg gcc aca cca tta ctc gat S16

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp260 265 270

atg ata gac act gca tta ttg aca aat ggt aca aca gaa aac agg tat BS4

Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tvr275 280 225

ggc ata aaa tta ccc gta tct ctg ttg ttt att gct ggt cat gat acc 912

Gly Ile Lys Leu Pro Val Ssr Leu Lsu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr290 295 300

aat ctt gca aat tta age ggg gct tta gat ctt aac tgg tcg cta ccc 9S0

Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Lsu Pro305 310 315 320

ggt caa ccc gat aat acc cct cct ggt ggg gag ctt gta ttc gaa aag 1.008Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys325 330 335

tgg aaa aga acc agt gat aat acg gat tgg gtt cag gtt tca ttt gtt 1056Trp Lys Arg Thr Ssr Asp Asn Thr Asp Trp Val GId Val Ser Phe Val340 345 350

tat cag acg ctg aga gat atg agg gat ata caa ccg ttg tcg tta gaa 1104Tyr Gln Thr Lsu Arg Asp Met Arg Asp Ils Gln Pro Leu Ser Leu Glu355 360 365

aaa cct gct ggc aaa gtt gat tta aaa tta att gca tgt gaa gag aaa 1152Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Lsu Ile Ala Cys Glu Glu Lys370 375 3S0

aat agt cag gga atg tgt tcg tta aaa agt ttt tcc agg ctc att aag 1200Asn Ssr Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Lsu Ile Lvs3S5 350 395 400

gaa att cgc gtg cca gag tgt gca gtt acg gaa 1233

Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu405 410

<2i0> 2<211> 411<212> PRT

<213·> Citrobactsr fcraakii ATCC 51113<40D> 2

Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ssr Arg15 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Edst Lvs Asn Val20 25 3*0

Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Lsu Gly Trp Leu Tfrr35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Lsu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu50 55 60

Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro65 10 75 90

Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr85 90 95

Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ils Gln Val100 105 110

His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val115 120 125

Lys Mst Gly Lvs Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ils130 * 135 140

Lsu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln145 150 155 160

Ser Ssr Phs Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phs Ser Gln Ser Glu165 170 175

Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ssr Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala160 1S5 190

Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly135 ' 200 205

Ala Trp Ssr Lsu Ssr Ser Thr Lsu Thr Glu Ile Phs Lsu Lsu Gln Glu210 215 220

Ala Gln Gly Itet Pro Gln Val Ala Trp Glv Arg Ils Thr Gly Glu Lys225 230 " 235 240

Glu Trp Arg Asp Leu Lsu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu245 250 255Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp260 265 270

Mst Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr275 280 285

Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr290 295 300

Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro305 310 315 320

Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys325 330 335

Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val340 345 350

Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Mst Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu355 360 365

Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile AIa Cys Glu Glu Lys370 375 3S0

Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys3S5 390 355 400

Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu405 410

<210> 3

<211> 411

« 212> PRT

<213> Citrobacter braakil YH-15

<220>

<221> mat_peptideo<222> (1J..Í411)

<40Q> 3

Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arq Val Val Ile Val Ser Arg1 5 IO" 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asp Val20 25 30

Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu50 55 60

Trp Phe Thr Ssr Lys Gly Lsu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ssr Pro65 70 75 SO

Glv Gln Val Ala Val 11« Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lvs Thr35 SO 95

Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val100 105 110

Hls Tyr Gln Lvs Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val115 * 120 125

Lys Met Gly Lys Cys Ser Phs Asn Thr Leu Lys Val Lys Asn Ala Ile130 135 140

Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln145 150 155 160

Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu165 170 175

Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala180 185 190

Leu Pro Ser Glu Phe Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly195 200 205

Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu210 215 220

Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Glv Arg Ile Thr Gly Glu Lvs225 230 235 240

Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu245 250 255

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp

2S0 265 270

Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tvr275 280 2S5

Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr290 295 500

Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Lys Trp Ser Leu Pro305 310 315 320Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Lsu Val Phe Glu Lys325 33D 335

Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val340 345 350

Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Lsu Ser Lsu Glu355 360 365

Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Lsu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lvs370 375 380

Asn Ser GLn Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ssr Arg Leu Ile Lys3S5 390 * 395 4D0

Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu405 410

<210> 4

<211> 411

<212> PRT

<213> Citrobactsr frsundii

<220>

<221> mat_peptídeo<222> (1) ..(411)

<400> 4

Glu Glu Gln Asn Gly Mst Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg15 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asp Val20 25 30

Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Lsu Gly Trp Lsu Thr35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Lsu50 55 60

Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro65 70 75 30

Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr

95 90 95

Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val100 105 110

His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val115 120 125Lys Met Gly Thr Cys Ssr Phe Asn Thr Leu Lys Val Lys Asn Ala Ile130 135 140

Lsu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ils Glu Leu Tyr TJir Gln Arg Tvr Gln145 150 155 160

Ser Ssr Phs Arg Thr Leu Glu Asn Val Lsu Asn Phe Ssr Gln Ssr Glu165 170 175

Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Lsu Pro Glu Alal80 185 190

Lsu Pro Ser Glu Leu Lvs Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly195 200 205

Ala Trp Ser Leu Ssr Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Lsu Leu Gln Glu210 215 220

Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ils Thr Gly Glu Lys225 230 235 240

Glu Trp Arg Asp. Leu Lsu Ssr Lsu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Lsu245 250 255

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Lsu Asp260 265 270

Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr275 280 285

Gly Ils Lys Lsu Pro Val Ser Lsu Leu Phe lis.Ala Gly His Asp Thr290 295 300

Asn Lsu Ala Asn Lsu Ser Gly Ala Lsu Asp Lsu Asn Trp Ser Lsu Pro305 310 315 320

Glv Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Lsu Val Phe Glu Lys325 330 335

Trp Lys Arg Thr Ssr Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ssr Phe Val340 345 350

Tyr Gln Thr Lsu Arg Asp Ifet Arg Asp Ils Gln Pro Leu Ssr Leu Glu355 360 365

Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ils Ala Cys Glu Glu Lys370 375 3S0

Asn Ser Gln Gly Met Cys Ssr Lsu Lys Ssr Phe Ssr Arg Leu Ile Lys385 390 395 400Glu Ils Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu405 410

<210> 5<211> 1236<212> DNA<213> Variante da SEQ ID NO:2

<220><221> CDS<222> (1)..(1233)

<220><22l> mat_peptídeo<222> (1)..(1233)

<400> 5

gaa gag cag aat ggt atg aaa ctt gag cgg gtt gtg ata gtg agt cgt 48Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Yal Val Ile Val Ser Arg1 5 10 15

cat ggr gta aga gca cct acg aag ttc act cca ata atg aaa aat gtc 96His Xaa Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val20 25 30

aca ccc gat caa tgg cca caa tgg gat gtg ccg tta gga tgg cta acg 144Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr35 40 45

cct cgt ggg gga gaa ctt gtt tct gaa tta ggt cag tat caa cgt tta 132Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu50 55 60

tgg ttc acg age aaa ggt ctg ttg aat aat caa acg tgc cca tct cca 240Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro65 70 75 80

ggg cag gtt gct gtt att gca gac acg gat caa cgc acc cgt aaa acg 2S3Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Ssp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr85 90 95

ggt gag gcg ttt ctg gct ggg tta gca cca aaa tgt caa att caa gtg 336Gly Glu Ala Phs Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val100 105 110

cat tat cag aag gat gaa gaa aaa aat gat cct ctt ttt aat ccg gta 384His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val115 120 125

aaa atg ggg aaa tgt tcg ttt aac aca ttg cag gtt aaa aac gct att 432Lys Met Gly Lys Cvs Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ile130 135 140

ctg gaa cgg gcc gga gga aat att gaa ctg tat acc caa cgc tat caa 480Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tvr Gln145 150 155 * 160

tct tca ttt cgg acc ctg gaa aat gtt tta aat ttc tca caa tcg gag 528Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu165 170 175

aca tgt aag act aca gaa aag tct acg aaa tgc aca tta cca gag gct 5 76Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala180 185 190

tta ccg tct gaa ctt aag gta act cct gac aat gta tca tta cct ggt 624

Leu Pro Ser Glu Lsu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly195 200 205

gcc tgg agt ctt tct tcc acg ctg act gag ata ttt ctg ttg caa gag 672

Ala Xrp Ser Leu Ser Ser Ihr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu210 215 220

gcc cag gga atg cca cag gta gcc tgg ggg cgt att acg gga gaa aaa 720

Ala Gln Gly Itet Prc Glri Val Ala Trp Gly Arg Ils Thr Gly Glu Lyis225 230 235 240

gaa tgg aga gat ttg tta agt ctg cat aac gct cag ttt gat ctt ttg 768

Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Lsu Leu245 250 255

caa aga act cca gaa gtt gcc cgt agt agg gcc aca cca tta ctc gat 816

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Lsu Leu Asp260 265 270

atg ata gac act gca tta ttg aca aat ggt aca aca gaa aac agg tat £64

Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tvr275 280 285

ggc ata aaa tta ccc gta tct ctg ttg ttt att gct ggt cat gat acc 912

Gly Ile Lys Leu Prc Val Ssr Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr290 295 300

aat ctt gca aat tta age ggg gct tta gat ctt aac tgg tcg cta ccc 95 0

Asn Leu Ala Asn Lsu Ser Gly Ala Leu Ãsp Leu Asn Trp Ssr Leu Pro305 310 315 320

ggt caa ccs gat aay acc ccg ccg ggc gac aag ctt gta ttc gaa aag 1008Gly Gln Xaa Asp Asn Thr Pro Pro Gly Asp Lys Leu Val Phe Glu Lys325 330 335

tgg aaa aga acc agt gat aat acg gat tgg gtt cag gtt tca ttt gtt 1056Trp Lys Arg Thr Ssr Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ssr Phe Val340 345 350

tat cag acg ctg aga gat atg agg gat ata caa ccg ttg tcg tta gaa 1104Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Ifet Arg Asp Ile Gln Prc Leu Ser Leu Glu355 360 365

aaa cct gct ggc aaa gtt gat tta aaa tta att gca tgt gaa gag aaa 1152Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Lsu Ile Ala Cys Glu Glu Lys370 375 380

aat agt cag gga atg tgt tcg tta aaa agt ttt tcc agg ctc att aag 1200Asn Ser Gln Gly Mst Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lvs385 390 395 400

gaa att cgc gtg cca gag tgt gca gtt acg gaa taa 1236

Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu405 410

<210> 6

<211> 411

<212> PRT

<213> VariantedaSEQ ID NO: 2<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)<223> ο 'Xaa' na localização 18 permanece para Gly

<22G>

<221> niisc_feature

<222> (323)..(323)

<223> O lXaal na localização 323 permanece para pro.

<400> 6

Glu Glu Gln Asn Gly Mst Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg1 5 10 15

His Xaa Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val20 25 30

Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Ihr35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu50 55 60

Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro65 70 75 30

Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr35 50 95

Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val100 105 110

His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val115 120 125

Lys Met Gly Lvs Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ile130 135 140

Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln145 150 155 160

Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu165 170 175

Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala180 185 ISO

Leu Pro Ser Glu Leu Lvs Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly155 200 205

Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu210 215 220

Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys225 230 235 240Glu Trp Arg Asp Leu Lsu Ser Leu His Asn Ala Gla Phe Asp Lsu Leu245 250 255

Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp260 265 270

Met Ile Asp Thr Ala Lsu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr275 280 2S5

Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly Hls Asp Thr230 295 300

Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu305 310

Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro315 320

Gly Gln Xaa Asp Asn Thr Pro Pro Gly Asp Lys Leu Val Phe Glu Lys325 330 335

Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val340 345 350

Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Het Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Lsu Glu355 360 365

Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lvs Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys370 375 * 3S0

Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys3S5 390 395 400

Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu405 * 410

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> Citrobacter braakii ATCC 51113

<2 20>

<221> sig_peptídeo

<222> (1)..(66)

<220>

<221> CDS

<222> (I)..<66}

<400> 7

stg agt aca ttc ate att cgt tta ttaMst Ser Thr Phe Ile Ile Arg Leu Leu1 5

tet ttc tca ata cat gctSer Phe Ssr Ile His Ala

ttt ttt tet ctc tta tgc ggt 48

Phe Phe Ser Leu Leu Cys Gly10 15

6620

<210> β<211> 22<Ζ12> PRT<213> Citxobacter JbraaJcii ATCC 51113

<400> S

Mst Ser Thr Phe Ile Ile Arg Leu Leu Phe Phe Ser Leu Leu Cys Gly15 10 15

Ser Phe Ser Ile His Ala20

<210> 9<211> 433<212> PRT<213> Citrobacter freundii NCIMB 41247

<220><221> mat_peptídeo<222> (1)..(433)

<400> 9

Met Ser Thr Phe Ile Ile Arg Leu Leu Phe Phe Ser Leu Leu Cys Gly1 5 10 15

Ser Phe Ser Ile His Ala Glu Glu Pro Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg20 25 30

Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr35 40 45

Pro Ile Met Lys Asp Val Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val50 55 60

Pro Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu

65 70 75 80

GIy Gln Tyr Gln Arg Leu Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn

85 50 95

Gln Thr Cys Pro Ser Pro Gly GlE Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Αερ100 105 110

Gln Arg Thr Arg Lys Thx Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro115 120 125

Lys Cys Gln Ile Gln Val His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Thr Asp130 135 140

Pro Leu Phe Asn Pro Val Lys Met Glv Thr Cys Ser Phe Asn Thr Leu145 150 155 160

Lys Val Lys Asn Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu165 170 175

Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln Ser Ssr Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu180 1Ê5 190

Asn Phe Ser Gln Ser Glu Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys195 200 205

Cys Thr Leu Pro Glu Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp210 215 220

Asn Val Ser Leu Pro Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu225 230 235 240

Ile Phe Leu Leu Gln Glu Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly245 250 255

Arg Ile Thr Gly Glu Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu Hls Asn

260 265 270

Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg275 2S0 2S5

Ala Thr Pro Leu Leu Asp líst Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly250 295 300

Thr Thr Glu Asn Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe305 310 315 320

Ile Ala Gly Hls Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp325 330 335

Leu Asn Trp Ser Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly340 345 350

Glu Leu Val Phe Glu Lvs Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp355 ' 360 365

Val Gln Val Ser Phe Val Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile370 375 380

Gln Pro Leu Ser Leu Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu3S5 390 3§5 400

Ile Ala Cys Glu Glu Lys Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser405 410 415Phe Ser Arg Lsu Ile Lys Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr420 425 430

Glu

Claims (29)

1. Fitase, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 74%de identidade com a SEQ ED NO: 2, e que compreende pelo menos umaalteração em comparação com a SEQ ID NO: 2 em pelo menos uma posiçãoselecionada das seguintes: 1, 2, 3, 4, 5, 31, 41, 46, 52, 53, 55, 57, 59, 74, 76,- 82, 84, 91, 99, 100, 104, 105, 107, 109, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119,- 120, 121, 122, 123, 124, 136, 137, 141, 154, 161, 162, 164, 167, 171, 176,- 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 196, 199, 200, 202, 203, 218,- 223, 239, 240, 241, 247, 273, 276, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 289, 294,- 299, 308, 314, 316, 324, 331, 339, 351, 355, 362, 379, 385, 406, 409, 410 e- 411; com a condição de que a fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nem a SEQ IDNO: 4, e nem a SEQ ID NO: 6.

2. Fitase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que não é a SEQ ID NO: 9 nem suas variantes listadas na Figura 1.

3. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma das seguintesalterações: 1*, 2*, 3*, 4P, 5P, 31C,T, 41P, 46C,D,E, 52C,E, 53V,Q, 55D,I,-57Y, 59C, 74A, 76G, 82E, 84Ys 9IC9P9 99C, 100C, 104A, 105F, 107D,E,G,- 109 A,G, 11 IP, 114H,N,T, 115Q, 116A,E,P,T,Q, 117D,E,K, 1181,L9M9T,- 119G,K,R,S, 120K,S9T9Q, 121A9D9M9P9T9V9 122D, 123P9S, 124L,T,V, 136P,- 137P, 141C, 154P, 161P, 162C, 164D,E, 167Q, 171T, 176C, 177C,- 179G,I9K5N,Q9 180A,E,G,T, 18ID5G9I9K9 182H,K,S,Q, 183 A,L9P9S9V9Q9- 184*, 185*, 186*, 196Q, 199C, 200K,R, 202N, 203T, 218Q, 223E, 239Q,- 240P, 24IQ9 247C, 273L,Q, 276K,R, 28IH9 282P, 283P, 284P, 285G9N,R,- 286K,Q, 289P, 294T, 299L, 308A, 314G,N, 316D, 324N, 331K, 339D, 351Y,- 355P, 362K.R, 379K,R, 385D, 406A, 409D,E, 410D,E e/ou 411R,K.

4. Fitase de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelofato de que os aminoácidos nas posições 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 e- 186 foram substituídos por QADKP, GEDKP9 NGISA, IAGKS9 KEKHQ9KEKQQ, KEKKV ou KTDKL.

5. Fitase, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 74%de identidade com a SEQ ID NO: 2, e que compreende pelo menos uma dasseguintes alterações: 1H,K,R, 60P, 105E, 106A,G, 155F, 157F, 173P, 175L,-188P, 205P, 215M, 23 IP, 254Y, 280P, 330D e/ou 371P; com a condição deque a fitase não seja a SEQ ID NO: 3, nem a SEQ ID NO: 4, nem a SEQ IDNO: 6, e nem a SEQ ID NO: 9, nem as suas variantes listadas na Figura 1.

6. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizada pelo fato de que compreende uma alteração selecionada dasseguintes: 52C, 141C, 162C, 31C, 52C, 99C, 59C, 100C, 141C/199C, 4P, 5P,-11IP5 137P, 161P, 52E, 57Y, 76G, 107D, 107G, 109A, 1*, l*/2*, l*/2*/3*,-121T, 273L, 285G, 286Q, 299L, 362K, 331K/55D, 107E, 46E, 82E, 119R,-119K, 164E, 223E, 276R, 276K, 362R, 379R, 379K, 385D, 410D, 410E,-41 IR, 411K, 53V, 121D, 167Q, 196Q, 200K, 202N, 218Q, 241Q, 285N,-314N, 314G, 406A,-179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*,-179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/l 85*/l 86*,-179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*,-179K/180T/181 D/l 82K/183L/184*/185*/186*,-111P/241Q, 1K,-114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L e-114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L.

7. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizada pelo fato de que é uma variante da fitase da SEQ ID NO: 2.

8. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizada pelo fato de que é uma variante da fitase da SEQ ID NO: 3.

9. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizada pelo fato de que é uma variante da fitase da SEQID NO: 4.

10. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizada pelo fato de que é uma variante da fitase da SEQID NO: 6.

11. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizada pelo fato de que é uma variante da fitase da SEQID NO: 9.

12. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizada pelo fato de que é uma variante de qualquer uma dasvariantes da fitase relacionadas com a SEQ ID NO: 9 e listadas na Figura 1.

13. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que, além disso, compreende uma substituiçãoou uma combinação de substituições selecionadas dentre as substituições ecombinações de substituições listadas em cada fileira da Figura 1.

14. Fitase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, caracterizada pelo fato de que tem uma termoestabilidade melhorada, umperfil de pH melhorado, uma atividade específica melhorada, um padrão deglicosilação aperfeiçoado, um perfil de temperatura melhorado, umdesempenho melhorado na ração para animal, e/ou que incorpora umamudança de um sítio potencial de clivagem da protease.

15. Seqüência de ácidos nucleicos isolada, caracterizada pelofato de que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica a fitasecomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende a seqüência de ácidos nucleicos como definida nareivindicação 15 operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controleque direcionam a produção da fitase em um hospedeiro de expressãoadequado.

17. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 16.

18. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 16, e/ou o vetor de expressão como definido na reivindicação 17.

19. Método para produzir a fitase como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende(a) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação-18 para produzir um sobrenadante contendo a fitase, e(b) recuperar a fitase.

20. Planta transgênica ou parte da planta, caracterizada pelofato de que é capaz de expressar uma fitase como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 14.

21. Animal não humano transgênico ou seus produtos ouelementos, caracterizado(os) pelo fato de que é(são) capaz(es) de expressar afitase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendepelo menos uma fitase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a-14, e(a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura;(b) pelo menos uma vitamina solúvel em água; e/ou(c) pelo menos um mineral traço.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos uma enzimaselecionada do seguinte grupo de enzimas: amilase, fitase, fosfatase, xilanase,galactanase, alfa-galactosidase, protease, fosfolipase e/ou beta-glucanase.

24. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 22 e 23, caracterizada pelo fato de que é um aditivo de raçãopara animal.

25. Composição de ração para animal, caracterizada pelo fatode que tem um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg, e que compreende afitase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou acomposição como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 24.

26. Método para melhorar o valor nutritivo de uma ração paraanimal, caracterizado pelo fato de que a fitase como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 14 ou a composição como definida em qualqueruma das reivindicações 22 a 24, são adicionadas à alimentação.

27. Processo para reduzir os níveis de fitato no esterco deanimal, caracterizado pelo fato de que compreende alimentar um animal comuma quantidade eficaz da ração como definida na reivindicação 25.

28. Método para o tratamento de proteínas de legume,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adicionar a fitase comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou a composição comodefinida em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, a pelo menos umaproteína de legume ou fonte de proteínas.

29. Uso da fitase como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 14, ou da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 22 a 24, na ração para animal, caracterizado pelo fato de ser napreparação da ração para animal; para melhorar o valor nutritivo da ração paraanimal; para reduzir os níveis de fitato no esterco de animal; para otratamento das proteínas de legume; ou para liberar fósforo de um substratode fitase.