BRPI0707229A2

BRPI0707229A2 - método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BRPI0707229A2
Application number: BRPI0707229-5A
Authority: BR
Inventors: Akito Chinen; Hisaahi Yasueda; Jun Nakamura
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2011-04-26
Also published as: PE20071235A1; CN101374953A; US20100099152A1; BRPI0707229B8; EP1976995A1; US8012722B2; WO2007086608A1; EP1976995B1; CN101374953B; BRPI0707229B1

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOáCIDO. L-aminoácidos como ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína são produzidos por cultivo em um meio de uma bactéria tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido e em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de fosfotransacetilase é aumentada.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO"Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método para produzireficientemente L-aminoácidos como ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína por fermentação.Fundamentos da Técnica

L-aminoácidos tem sido produzidos principalmente por váriosmétodos de fermentação usando bactérias corineformes produzindo L-aminoácido, incluindo as pertencendo aos gêneros Brevibacterium,Corynebacterium, Microbacterium, ou cepas mutantes das mesmas (AminoAcid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, p. 195 - 215, 1986).Exemplos de métodos conhecidos para produzir um L-aminoácido porfermentação usando outras bactérias incluem um método usando ummicroorganismo pertencendo ao gênero Bacillus, Streptomyces, ouPenicillium (patente US 3.220.929), um método usando uma bactériapertencendo ao gênero Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, ou Candida(patente US 3.563.857), um método usando uma bactéria pertencendo aogênero Bacillus, Pseudomonas, Serratia, ou Aerobacter aerogenes(atualmente, Enterobaeter aerogenes) (JP 32-9393 B), e um método usandouma cepa mutante de Eseheriehia eoli (patente US 5378616). Além disso,métodos para produzir um L-aminoácido usando bactérias pertencendo aogênero Klebsiella, Erwinia, Pantotea, ou Enterobaeter (EP 955368 A, EP952221 B, e EP 999282 A) também foram descritos.

Vários métodos para aumentar a capacidade de produzir L-aminoácido por melhora das atividades de enzimas biossintéticas de L-aminoácido por técnicas de DNA recombinantes também foram descritos. Porexemplo, foi relatado que introduzindo-se um gene codificando citrato sintasederivado de Eseheriehia eoli ou Corynebacterium glutamicum em umabactéria pertencendo ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium é efetivopara aumentar a capacidade de produzir L-aminoácido da bactéria (JP 07-121228 B). Além disso, foi relatado que introduzindo um gene de citratosintase derivado de uma bactéria corineforme em uma enterobactériapertencendo ao gênero Enterobacter, Klebsiella, Serrada, Erwinia, ouEscherichia é efetivo para aumentar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico (EP 999282 A).

Fosfotransacetilase é uma enzima que está envolvida emmetabolismo de ácido acético. Em Eseheriehia eoli, esta enzima desempenhaum papel na reação que produz fosfato de acetila a partir de acetil-CoA efosfato, que faz parte da via primária para produzir ácido acético. Além disso,sabe-se que em Corynebaeterium glutamieum, a atividade defosfotransacetilase aumenta quando da produção de acetil-CoA porassimilação de ácido acético, e a atividade é negativamente regulada pelofator de transcrição RamB (Microbiology 1999 503 - 513, Journal ofBacteriology 2004 vol. 186, No. 9 p2798-2809).

Exemplos de métodos conhecidos de produção fermentativa deum material utilizável usando uma bactéria em que a atividade defosfotransacetilase é melhorada incluem a produção de copolímero poli-β-hidroxialcanoato (patente US 5.891.686 e patente US 5.569.595), e produçãode etanol (WO 2003/078643). Além disso, um método enzimático de produzirum L-aminoácido contendo enxofre usando fosfotransacetilase foi descrito(JP 09-009982 A). No entanto, a melhora da atividade de fosfotransacetilasena criação de bactérias produzindo L-aminoácido não foi relatada, e a relaçãoentre a atividade de fosfotransacetilase e a produtividade de L-aminoácidonão foi elucidada.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objeto da presente invenção consiste em prover ummétodo novo de fermentação para produzir L-aminoácidos, como ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína.Os inventores da presente invenção realizaram estudosextensos para alcançar o objeto descrito acima. Como um resultado, osrequerentes verificaram que L-aminoácidos, como ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína, podem sereficientemente produzidos por cultivo de uma bactéria produzindo L-aminoácido que foi modificada para aumentar a atividade defosfotransacetilase, e assim completaram a presente invenção.

É um objeto da presente invenção prover um método paraproduzir um L-aminoácido compreendendo cultivar uma bactéria produzidoL-aminoácido que foi modificada para ter uma atividade melhorada defosfotransacetilase em um meio, e coletar o L-aminoácido a partir do meio ouda bactéria.

É outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a atividade de fosfotransacetilase é melhorada poraumento do número de cópias do gene codificando fosfotransacetilase ou pormodificação da uma seqüência reguladora de expressão do gene codificandofosfotransacetilase.

E outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que o gene codificando fosfotransacetilase é um DNAselecionado dentre o grupo consistindo de:

(a) um DNA compreendendo nucleotídeos 1214 a 2641 deSEQ ID NO: 34 ou a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 40; e

(b) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeoque é complementar para a seqüência de nucleotídeo de nucleotídeos 1214 a2641 de SEQ ID NO: 34 ou a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 40,em que o referido DNA hibridiza sob condições estringentes e codifica umaproteína que tem atividade de fosfotransacetilase.

E outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a atividade de fosfotransacetilase é melhorada porinterrupção de um gene ramB.

E outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a bactéria é ainda modificada de modo que umaatividade é melhorada de uma proteína selecionada dentre o grupo consistindode D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase, frutose 6-fosfato fosfocetolase, ecombinações das mesmas.

É outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a bactéria é ainda modificada para ter atividademelhorada de piruvato carboxilase.

E outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a bactéria é ainda modificada para ter atividademelhorada de fosfoenolpiruvato carboxilase.

E outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a bactéria é selecionada dentre o grupo consistindo deuma bactéria corineforme, bactéria Pantoea, bactéria Enterobacter, e bactériaEscherichia.

E outro objeto da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que o L-aminoácido é selecionado dentre o grupoconsistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra um sítio inserido-IS no gene yggB de tipomutante.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS<1-1> Bactéria da presente invenção

A bactéria usada no método de produção da presente invenção(também referida como uma bactéria da presente invenção) tem umacapacidade de produzir L-aminoácido e foi modificada para ter atividademelhorada de fosfotransacetilase. A bactéria da presente invenção pode serobtida por modificação de uma bactéria tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido (isto é, cepa parental) de modo que é aumentada a atividade defosfotransacetilase. A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidadede produzir L-aminoácido nativo ou pode ser criada para ter uma capacidadede produzir L-aminoácido.

Aqui, a "capacidade de produzir L-aminoácido" significa umacapacidade para produzir um L-aminoácido em uma quantidade que permite acoleta do L-aminoácido das células bacterianas ou do meio. Preferivelmente,significa uma capacidade para produzir uma quantidade maior do L-aminoácido como comparado a uma cepa de tipo selvagem ou não modificadaque é cultivada sob as mesmas condições.

Exemplos dos L-aminoácidos a serem produzidos incluem L-lisina, ácido L-glutâmico, L-treonina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina, L-serina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-glutamina, L-arginina, L-cisteína(cistina), L-metionina, L-fenilalanina, L-triptofano, L-tirosina, L-glicina, L-alanina, L-prolina, L-ornitina, L-citrulina, e L-homoserina. L-aminoácidosderivados de acetil-CoA são preferíveis, e ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína são preferíveis.

Exemplos da bactéria da presente invenção incluem, mas nãosão limitados a, bactérias pertencendo a família Enterobacteriaceae, incluindoas pertencendo ao gênero Eseheriehia, Pantoea, Enterobaeter, ou outros,bactérias corineformes como Corynebacterium glutamieum e Brevibacteriumlaetofermentum, e bactérias pertencendo ao gênero Baeillus, como Bacillussubtilis.

Na presente invenção, a "bactéria corineforme" incluibactérias previamente classificadas como Brevibaeterium, mas não sãoclassificadas como Corynebaeterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)),assim como bactérias pertencendo ao gênero Brevibaeterium, que estãoaltamente relacionados com o gênero Corynebaeterium. Exemplos de taisbactérias incluem os seguintes:

Corynebacterium acetoacidophilumCorynebacterium aeetoglutamieumCorynebaeterium alkanolytieumCorynebaeterium eallunaeCorynebacterium glutamieumCorynebaeterium liliumCorynebacterium melasseeola

Corynebaeterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)Corynebaeterium hereulisBrevibaeterium divarieatum

Brevibaeterium flavum

Brevibaeterium immariophilum

Brevibaeterium laetofermentum (Corynebaeterium glutamieum)

Brevibaeterium roseum

Brevibaeterium saceharolytieum

Brevibaeterium thiogenitalis

Corynebacterium ammoniagenes

Brevibaeterium álbum

Brevibaeterium selinum

Mierobaeterium ammoniaphilum

Especificamente, as seguintes cepas são exemplificadas:

Corynebaeterium acetoacidophilum ATCC13 870

Corynebacterium aeetoglutamieum ATCC15806

Corynebacterium alkanolytieum ATCC21511

Corynebacterium eallunae ATCC15991

Corynebacterium glutamieum ATCC13020, ATCC13032,ATCC13060

Corynebacterium lilium ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC13 868

Brevibaeterium divarieatum ATCC14020

Brevibaeterium flavum ATCC13826, ATCC14067

Brevibaeterium immariophilum ATCC14068

Brevibaeterium laetofermentum ATCC13 869 (Corynebacteriumglutamieum ATCC13869)

Brevibacterium roseum ATCC13 825

Brevibaeterium saeeharolytieum ATCC14066

Brevibaeterium thiogenitalis ATCC19240

Corynebaeterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872

Brevibaeterium álbum ATCC15111

Brevibaeterium selinum ATCCl5112

Microbaeterium ammoniaphilum ATCC15354

Estas cepas são disponíveis junto ao American Type CultureCollection (ATCC: endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,Estados Unidos da America). Isto é, os números de acesso são dados a cadauma das cepas, e as cepas podem ser encomendadas usando estes números(http://www.atcc.org/). Os números de acesso para as cepas são listados nocatálogo do American Type Culture Collection. A cepa AJ12340 foidepositada junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, InternationalPatent Organism Depositary, National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology) (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305 -5466, Japão) em 27 de outubro de 1987 e recebeu o número de acesso FERMBP-1539 sob as provisões do Tratado de Budapeste.

Bactérias pertencendo à família Enterobaeteriaeeae não sãoparticularmente limitadas desde que elas tenham uma capacidade de produzirL-aminoácido, e incluam as pertencendo ao gêneros Escherichia,Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella,Morganella, ou outros. Bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceaecom base na classificação descrita no banco de dados do NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&1 vl=3 &keep= 1 &srchmode= 1&unlock) podem ser usadas. Dentre estas, as bactérias pertencendo ao gêneroEscherichia, Enterobacter, ou Pantoea são preferíveis.

A cepa parental de bactérias Escherichia que pode ser usadapara obter a bactéria da presente invenção não é particularmente limitada, eespecificamente, as bactérias listadas em Neidhardt et al. {Escherichia coli eSalmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, WashingtonD.C., 1029 tabela 1) pode ser usada. Dentre esta, Escherichia coli é preferível.

Os exemplos específicos de Escherichia coli incluem a cepa de Escherichiacoli W3110 (ATCC 27325) e a cepa de Escherichia coli MGl655 (ATCC47076), que são derivadas da cepa Kl2 protótipo de tipo selvagem.

Exemplos de bactérias Enterobacter incluem Enterobacteragglomerans e Enterobacter aerogenes, e exemplos de bactérias Pantoeaincluem Pantoea ananatis. Recentemente, Enterobacter agglomerans foireclassificado em alguns casos como Pantoea agglomerans, Pantoeaananatis, ou Pantoea stewartii com base na análise da seqüência denucleotídeo de 16S rRNA. Assim, as bactérias da presente invenção podempertencer ao gênero Enterobacter ou Pantoea, desde que elas sejamclassificadas na família Enterobacteriaceae. Quando Pantoea ananatis écriado usando uma técnica de engenharia genética, as cepas de Pantoeaananatis AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615), AJ13601(FERM BP-7207), e derivados das mesmas podem ser usadas. Estas cepasforam identificadas e depositadas como Enterobacter agglomerans nomomento do isolamento, mas então reclassificadas como Pantoea ananatiscom base na análise da seqüência de nucleotídeos de rRNA 16S.

Abaixo, métodos para conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido a esta bactéria como descrito acima serão descritos.

A fim de conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido,métodos podem ser usados os quais são tipicamente usados na criaçãoconvencional de bactérias produzindo aminoácidos, como uma bactériacorineforme ou uma bactéria Escherichia. Tais métodos incluem a aquisiçãode cepas mutantes auxotróficas em nutrientes, cepas resistentes dos análogos,e cepas mutantes de regulação metabólica, e a criação de cepas recombinantestendo expressão melhorada de genes codificando enzimas biossintéticas de L-aminoácido (Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press,primeira edição publicação: 30 de maio de 1986, p.77 a 100). Mutaçõesauxotróficas em nutrientes, mutações resistentes dos análogos, e mutações deregulação metabólica podem ser obtidas sozinhas ou em combinação durantea criação de bactérias produzindo L-aminoácido. Além disso, as atividades deuma ou mais das enzimas biossintéticas de L-aminoácido podem sermelhoradas. Ainda mais, mutações auxotróficas em nutrientes, mutaçõesresistentes dos análogos, e mutações de regulação metabólica podem serconcedidas em combinação com melhora das atividades das enzimasbiossintéticas de L-aminoácido.

Cepas mutantes auxotróficas em nutrientes, cepas resistentesdos análogos, e cepas mutantes de regulação metabólica que tem umacapacidade de produzir L-aminoácido podem ser obtidas como a seguir. Istoé, uma cepa parental ou uma cepa de tipo selvagem é submetida a umtratamento de mutação geral, isto é, irradiação com raios X ou raiosultravioletas, ou submetido a um agente como N-metil-lSr-nitro-N-nitrosoguanidina. A cepa que exibe auxotrofia em nutriente, resistência dosanálogos, ou uma mutação de regulação metabólica e tem uma capacidade deproduzir L-aminoácido é selecionada dentre as cepas mudadas.Além disso, uma bactéria produzindo L-aminoácido pode serobtida por melhora da atividade de uma enzima biossintética de L-aminoácidovia recombinação genética. No entanto, a capacidade de produzir L-aminoácido pode ser uma propriedade nativa para a bactéria de tipo selvagem.Além disso, como descrito abaixo, a capacidade de produzir L-aminoácidopode ser conferida por melhora da expressão do gene fosfotransacetilase.

Abaixo, métodos de conferir uma capacidade de produzirácido L-glutâmico e bactérias conferidas com a capacidade de produzir ácidoL-glutâmico serão descritos como exemplo.

A fim de conferir e/ou melhorar a capacidade de produzirácido L-glutâmico, a expressão de um gene codificando uma enzimaenvolvida em biossíntese de ácido L-glutâmico pode ser melhorada. Asenzimas envolvidas em biossíntese de ácido L-glutâmico incluem glutamatodesidrogenase, glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitratodesidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, fosfoenolpiruvatocarboxilase, piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato quinase,fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase,gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triosefosfato isomerase,frutosebisfosfato aldolase, fosfofructoquinase, e glucosefosfato isomerase.

A expressão de gene pode ser melhorada por transformação deuma bactéria com um plasmídeo contendo o gene desejado e seqüênciasrequeridas para replicação do plasmídeo, integrando o gene por recombinaçãohomóloga, conjugação, transferência de gene, ou outros no cromossomo dabactéria, ou introdução de uma mutação na região do promotor do gene (WO95/34672).

Quando se transforma o gene desejado em uma bactériausando um plasmídeo ou se integra o gene no cromossomo, um promotor paraexpressar o gene pode ser qualquer promotor desde que ele funcione nabactéria hospedeira escolhida, e possa ser o promotor nativo do gene oupromotor heterólogo.

O nível de expressão de um gene pode ser aumentado porseleção de um promotor que é conhecido como sendo forte na bactériahospedeira escolhida, ou por modificação da região -35 ou da região -10 dopromotor para ser próxima a uma seqüência de consenso.

As bactérias modificadas para ter expressão melhorada de umgene citrato sintase, uma isocitrato desidrogenase, um gene da piruvatodesidrogenase e/ou um gene da glutamato desidrogenase incluem as descritasem WO 00/18935 e EP 1010755 A.

Conferir uma capacidade de produzir ácido L-glutâmico podeser realizada por diminuição ou eliminação de uma atividade de uma enzimaque catalisa uma reação que se ramifica de uma via biossintética de ácido L-glutâmico e leva a um composto diferente de um ácido L-glutâmico. Taisenzimas incluem isocitrato liase, α-cetoglutarato desidrogenase, acetohidróxiácido sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactatodesidrogenase, glutamato decarboxilase, e 1-pirrolina desidrogenase.

Por exemplo, a atividade da α-cetoglutarato desidrogenasepode ser diminuída por uso do gene sucA (odhA) que codifica a subunidadeElo de α-cetoglutarato desidrogenase. Cepas tendo atividade diminuída da a-cetoglutarato desidrogenase são mostradas abaixo.

Cepa Brevibacterium lactofermentum AS (WO 95/34672)Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172; FR9401748 A)

Brevibaeterium jlavum AJ12822 (FERM BP-4173; FR 9401748 A)Corynebaeterium glutamicum AJl2823 (FERM BP-4174; FR9401748 A)

Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207)Cepa Klebsiella plantieola AJ13410 (FERM BP-6617)Pantoea ananatis AJl3355 (FERM BP-6614)Para diminuir ou eliminar a atividade de tal enzima, umamutação pode ser introduzida no gene codificando a enzima no cromossomousando um tratamento de mutação geral. Por exemplo, o gene pode serinterrompido por recombinação de gene, ou por modificação de umaseqüência reguladora de expressão como um promotor e uma seqüênciaShine-Dalgarno (SD) de modo que a expressão de gene ou tradução tinhadiminuído. Além disso, a substituição de aminoácido (mutação sentidoerrado), um códon parado (mutação não sentido), uma mutação de mudançade fase que adiciona/deleta um ou dois nucleotídeos em uma regiãocodificando as enzimas no cromossomo podem ser introduzidas, ou o gene ouuma parte do mesmo pode ser deletada (Journal of Biological Chemistry 272:8611 - 8617 (1997). Também, a atividade da enzima também pode serdiminuída ou eliminada por substituição do gene de tipo selvagem nocromossomo por um gene mutante em que a região codificada é deletada porrecombinação homóloga, ou por introdução de um transposon ou um fator ISno gene.

Por exemplo, o seguinte método pode ser usado para introduziruma mutação que diminui ou elimina a atividade da enzima descrita acimapor recombinação homóloga. Um gene mutante é preparado por modificaçãode uma seqüência parcial de um gene de marcação de modo que a enzimacodificada não é produzida, e uma bactéria hospedeira é transformada com oDNA contendo o gene mutante. Isto causa recombinação entre o gene mutantee o gene no cromossomo, assim substituindo o gene no cromossomo com ogene mutante. Esta mutagenese sítio-específica por substituição de geneusando recombinação homóloga é conhecida, e pode ser alcançada por uso deum DNA linear ou um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensívela temperatura (patente US 6303383 ou JP 05-007491 A). Também, amutagenese sítio-específica por substituição de gene usando recombinaçãohomóloga também pode ser obtida por uso de plasmídeo que é incapaz dereplicar na bactéria hospedeira escolhida.

Exemplos de plasmídeos sensíveis à temperatura em bactériascorineformes incluem p48K, pSFKT2 (patente US 6303383), e pHSC4 (FR1992-2667875 A e JP 05-7491 A). Estes plasmídeos podem replicarautonomamente a 25 0C mas não podem replicar autonomamente a 37 °C.Escherichia coli AJ12571 transformado com pHSC4 foi depositado junto aoNational Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency ofIndustrial Science and Technology (atualmente, International PatentOrganism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology, Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305 - 5466, Japão)em 11 de outubro de 1990 e recebeu o número de acesso FERM P-11763, eentão convertido em um depósito internacional sob as provisões de Tratado deBudapeste em 26 de agosto de 1991 e recebeu um número de acesso deFERM BP-3524.

Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico podeser conferida a uma bactéria hospedeira por amplificação do gene yggB(NCgl 1221;NP_600492. [gi: 19552490]; SEQ ID NO: 32) ou por introduçãode um gene yggB mutante contendo uma mutação em sua região decodificação (W02006/070944). O seguinte gene pode ser usado como o geneyggB mutante.

(1) Mutação na região C-terminal

Esta mutação é introduzida na região codificando a seqüênciade aminoácido de aminoácidos 419-533 de SEQ ID NO: 33. Esta mutaçãopode ser qualquer mutação desde que seja introduzida na seqüência denucleotídeo codificando a região descrita acima, e uma mutação de inserçãoincluindo a inserção de uma seqüência de inserção (abaixo, referida como IS),ou um transposon, é preferível. A mutação de inserção pode resultar em umasubstituição de aminoácido (mutação sentido errado), uma mudança de fase,ou um códon de parada (mutação não sentido). SEQ ID NOS: 7 e 8 mostram aseqüência de nucleotídeo do gene yggB mutante contendo um elementotransposável (IS) na região C-terminal e a seqüência de aminoácidocodificada pelo gene mutante, respectivamente.

Entrementes, exemplos da mutação na região C-terminalincluem a substituição de uma prolina na seqüência de aminoácidos 419-533de SEQ ED NO: 33 com outro aminoácido.

(2) Mutação em uma região de transmembrana

A proteína Ygg codificada pelo gene yggB gene é previstacomo tendo cinco regiões de transmembrana, e estas regiões detransmembrana correspondem aos aminoácidos 1-23 (primeira região detransmembrana), 25-47 (segunda região de transmembrana), 62-84 (terceiraregião de transmembrana), 86-108 (quarta região de transmembrana), e 1 ΙΟ-Ι 32 (quinta região de transmembrana) na proteína YggB de tipo selvagem(SEQ ID NO: 33). Uma mutação nas regiões de transmembranapreferivelmente causa substituição, deleção, adição, inserção, ou inversão deum ou vários aminoácidos sem causar uma mudança de fase ou umaterminação de tradução.

Exemplos de uma mutação na região de transmembranaincluem inserir um ou vários aminoácidos entre a leucina na posição 14 e otriptofano na posição 15 na seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 33,substituindo a alanina na posição 100 com outro aminoácido, e substituindo aalanina na posição 111 com outro aminoácido.

Como outro método para conferir e/ou melhorar umacapacidade de produzir ácido L-glutâmico, conferir resistência a um análogode ácido orgânico, um inibidor de cadeia respiratória, etc. e conferirsensibilidade a um inibidor de síntese de parede celular pode ser usado.Exemplos de tais métodos incluem conferir resistência a ácidomonofluoroacético (JP 50-113209 A), conferir resistência a adenina ou timina(JP 57-065198 A), atenuar urease (JP 52-038088 A), conferir resistência aácido malônico (JP 52-038088 A), conferir resistência a benzopironas ounaftoquinonas (JP 56-1889 A), conferir resistência a HOQNO (JP 56-140895A), conferir resistência a ácido α-cetomalônico (JP 57-2689 A), conferirresistência a guanidina (JP 56-35981 A), e conferir sensibilidade a penicilina(JP 4-88994 A).

Exemplos específicos de tais bactérias resistentes incluem:

Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632; JP 50-113209 A)

Corynebacterium glutamicum AJl 1628 (FERM P-5736; JP 57-065198 A)

Brevibacterium flavum AJl 1355 (FERM P-5007; JP 56-1889 A)

Corynebaeterium glutamicum AJl 1368 (FERM P-5020; JP 56-1889 A)

Brevibaeterium flavum AJl 1217 (FERM P-4318; JP 57-2689 A)

Corynebacterium glutamicum AJl 1218 (FERM P-4319; JP 57-2689 A)

Brevibaeterium flavum AJl 1564 (FERM P-5472; JP 56-140895 A)

Brevibacterium flavum AJl 1439 (FERM P-5136; JP 56-35981 A)

Corynebaeterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; JP 04-88994 A)

Brevibacterium lactofermentum AJl 1426 (FERM P-5123; JP 56-048890 A)

Corynebacterium glutamicum AJl 1440 (FERM P-5137; JP 56-048890 A)

Brevibacterium lactofermentum AJl 1796 (FERM P-6402; JP 58-158192 A)

Bactérias conferidas com uma capacidade de produzir L-glutamina incluem uma bactéria tendo atividade melhorada de glutamatodesidrogenase, uma bactéria tendo atividade melhorada de glutamina sintase(glnA), e uma bactéria pertencendo a família Enterobacteriaceae tendo umgene glutaminase interrompida (EP 1229121 A e EP 1424398 A). A atividadeglutamina sintase pode ser melhorada por interrupção do gene glutaminaadenililtransferase (glnE) ou por interrupção do gene codificando a proteínareguladora prPII (glnB). Além disso, uma bactéria produzindo L-glutaminapreferível inclui uma bactéria Escherichia tendo um mutante da glutaminasintase em que a tirosina na posição 397 foi substituída com outro aminoácido(publicação de patente US 2003-0148474).

Outro método de conferir e/ou melhorar uma capacidade deproduzir L-glutamina inclui conferir resistência a 6-diazo-5-oxo-norleucina(JP 03-232497 A), conferir resistência a análogo de purina e sulfóxido demetionina (JP 61-202694 A), e conferir resistência a ácido α-cetomaleico (JP56-151495 A). Exemplos específicos de uma bactéria corineforme tendo umacapacidade de produzir L-glutamina incluem:

Brevibacterium flavum AJl 1573 (FERM P-5492; JP 56-161495 A)

Brevibaeterium flavum AJl 1576 (FERM BP-10381; JP 56-161495 A)

Brevibaeterium flavum AJ12212 (FERM P-8123; JP 61-202694 A)

Bactérias tendo uma capacidade de produzir L-prolina incluemuma bactéria abrigando γ-glutamil quinase que não é submetida a umainibição por retro-alimentação por L-prolina e uma bactéria em que o sistemade degradação de L-prolina é atenuado. Um método de modificar umabactéria usando um DNA codificando γ-glutamil quinase não submetida àinibição por retro-alimentação por L-prolina é descrito em Dandekar, A. M.,Uratsu, S. L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988). Também, uma bactériacom um sistema de degradação de L-prolina atenuado é obtida por introduçãode uma mutação no gene da prolina desidrogenase que resulta em atividadeenzimática diminuída. Exemplos específicos de uma bactéria tendo umacapacidade de produzir L-prolina incluem Escherichia coli NRRL B-12403,NRRL B-12404 (GB 2075056), e VKPM B-8012 (patente US 2002-0058315). Exemplos de um plasmídeo mutante para introduzir esta mutaçãoincluem o plasmídeo mutante descrito em DE 3127361 B, e o plasmídeomutante descrito por Bloom et al. (The 15th Miami Winter Symposium, 1983,P- 34).

Bactérias produzindo L-prolina preferíveis incluemEseheriehia coli 702 (VKPM B-8011), que é resistente para 3,4-dehidroxiprolina e azatidina-2-carboxilato, 702ilvA (VKPM B-8012), que éum derivado de ilvA deficiente da cepa 702, e uma cepa E. coli tendo umaatividade melhorada de uma proteína codificada pelo gene b2682, geneb2683, gene bl242, ou gene b3434 (JP 2002-300874 A).

Exemplos de bactérias produzindo L-Ieucina incluemEseheriehia coli H-9068 (ATCC 21530), H-9070 (FERM BP-4704), e H-9072 (FERM BP-4706) que exibem resistência para 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina (patente US 5.744.331), Escherichia coli contendoisopropilmalato sintase não submetida à inibição por retro-alimentação por L-leucina (EP 1067191 B), Escherichia coli AJl 1478 que é resistente para β-2-tienilalanina e β-hidroxileucina (patente US 5.763.231), e Escherichia coli 57(VKPM B-7386, RU 2140450).

Exemplos de bactérias produzindo L-cisteína incluemEscherichia coli JM15 transformadas com um alelo do gene cysE codificandoserina acetiltransferase não submetida à inibição por retro-alimentação(patente US 6.218.168), Escherichia coli W3110 em que o gene codificando aproteína responsável para excreção de substâncias citotóxicas ésuperexpressado (patente US 5.972.663), Escherichia coli tendo diminuídaatividade cisteína desulfhidrase (JP 11-155571 A), e Escherichia coli W3110tendo um ativador transcripcional amplificado do regulon de cisteínacodificado pelo gene cysB (WO 01/27307).Exemplos de bactérias produzindo L-isoleucina incluem umacepa mutante de Escherichia que é resistente a 6-dimetilaminopurina (JP 05-304969 A), uma cepa mutante que é resistente a hidroxamato de L-isoleucina,tiaisoleucina, DL-etionina, ou hidroxamato de arginina (JP 05-130882 A), ecepas recombinantes tendo gene da treonina deaminase amplificado e gene daacetohidroxilato sintase (JP 02-458 A, JP 02-42988 A, e JP 08-47397 A).

Uma capacidade de produzir L-valina pode ser conferida poraumento das atividades de enzimas sintéticas da L-valina codificadas pelooperon ilvGMEDA, em particular, acetohidroxilato sintase codificada pelogene ilvG (JP 02-748418 B). Como uma enzima sintética, L-valina não podeser submetida à inibição por retro-alimentação por L-valina. Uma capacidadede produzir L-valina pode ser conferida por diminuição de uma expressão dogene acetolactato sintase III (gene ilvIH).

Além disso, capacidade de produzir L-valina pode ser obtidaao conferir resistência ao análogo de aminoácido a uma bactéria. Exemplosdestas bactérias incluem cepas mutantes que são auxotróficas para L-isoleucina ou L-metionina e resistentes para D-ribose, nucleosídeo purina, ouribonucleosídeo pirimidina (FERM P-1841 e P-5556; JP 53-025034 A), e umacepa mutante que é resistente a policetídeo (FERM P-9325; JP 1934507 B).

Exemplos de bactérias produzindo L-alanina incluem umabactéria corineforme em que a atividade H+-ATPase é deficiente (ApplMicrobiol Biotechnol. 2001 Nov; 57(4): 534-40) e uma bactéria corineformeem que o gene da aspartato decarboxilase é amplificado (JP 07-163383 A).

Exemplos de bactérias produzindo L-arginina incluem cepasmutantes de Eseheriehia eoli que são resistentes para α-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, S-(2-aminoetil)-cisteína, a-metilserina, β-2-tienilalanina, ou sulfaguanidina (JP 56-106598 A).Uma bactéria produzindo L-arginina preferível é Eseheriehia eoli 237, que éuma cepa mutante que é resistente à inibição por retro-alimentação por L-arginina e tem atividade melhorada da N-acetilglutamato sintase (RU2000117677). A cepa foi depositada junto ao Russian National Collection ofIndustrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika em 10 de abril de 2000 erecebeu o número de acesso de VKPM B-7925, e o depósito foi entãoconvertido para um depósito internacional sob as provisões do Tratado deBudapeste em 18 de maio de 2001. Escherichia coli 382, que é um derivadoda cepa 237 e tem capacidade melhorada para assimilar ácido acético (JP2002-017342 A), pode ser usada como uma bactéria produzindo L-arginina. Acepa de Escherichia coli 382 foi depositada junto ao Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 10 de abril de 2000 erecebeu o número de acesso de VKPM B-7926.

Exemplos de bactérias produzindo L-arginina incluembactérias modificadas para terem melhorada expressão de um genecodificando uma enzima envolvida em biossíntese de L-arginina. As enzimasbiossintéticas de L-arginina incluem N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil-fosfato reductase (argC), ornitina acetiltransferase (argj), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD),acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoil transferase (argF),argininosucinato sintase (argG), argininosucinato liase (argH), ecarbamoilfosfato sintase (carAB). Os termos em parênteses seguindo osnomes da enzima referem-se aos nomes dos genes codificando estas enzimas.Para N-acetilglutamato sintase (argA), é mais preferível usar uma enzimamutante em que a seqüência de aminoácido de tipo selvagem nas posições 15a 19 é substituída e, como um resultado, a inibição por retro-alimentação porL-arginina foi aliviada (EP 1170361 A).

As vias biossintéticas de L-citrulina e L-ornitina são iguais quea de L-arginina, e a capacidade para produzir L-citrulina e L-ornitina pode serconferida por aumento das atividades enzimáticas de N-acetilglutamatosintase (argA), N-acetilglutamilfosfato reductase (argC), ornitinaacetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitinatransaminase (argD), e acetilornitina desacetilase (argE).

Exemplos de bactérias produzindo L-Iisina incluem uma ceparesistente ao análogo de L-Iisina e cepa mutante de regulação metabólica.

Exemplos específicos das mesmas incluem Escherichia coli AJl 1442 (FERMBP-1543, NRRL B-12185; JP 56-18596 A e patente US 4.346.170) eEseheriehia coli VL611 (JP 2000-189180 A). Além disso, WC196 (WO96/17930) pode ser usada como uma cepa produzindo L-Iisina de Eseheriehiacoli. A cepa WC196 é obtida conferindo resistência a AEC (S-(2-aminoetil)-cisteína) para a cepa W3110, que é derivada de cepa de Eseheriehia coli Κ-Ι2. A cepa WC196 foi chamada de cepa de Escherichia coli AJ13 069 edepositada junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, InternationalPatent Organism Depositary, National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology, Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e recebeu o número de acesso deFERM P-14690, e o depósito foi então convertido para um depósitointernacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de1995 e recebeu o número de acesso de FERM BP-5252.

Uma bactéria tendo uma capacidade de produzir L-Iisinatambém pode ser obtida por aumento da atividade de uma enzima envolvidano sistema biossintético de L-lisina. A atividade enzimática pode seraumentada por aumento do número de cópias do gene codificando a enzimanas células, ou por modificação de uma seqüência reguladora de expressão dogene.

Genes codificando uma enzima biossintética da L-lisinaincluem um gene codificando uma enzima envolvida na via de ácidodiaminopimélico como gene da dihidrodipicolinato sintase (dapA), gene daaspartoquinase (IysC)5 gene da dihidrodipicolinato reductase (dapB), gene dadiaminopimelato decarboxilase (IysA), gene da diaminopimelatodesidrogenase (ddh) (WO 96/40934), gene a fosfoenolpiruvato carboxilase(ppc) (JP 60-87788 A), gene da aspartato aminotransferase (aspC) (JP 6-102028 B), gene da diaminopimelato epimerase (dapF) (JP 2003-135066 A),e gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd) (WO 00/61723), e umgene codificando uma enzima envolvida em uma via de ácido aminoadípicocomo o gene homoaconitato hidratase (JP 2000-157276 A).

Entrementes, o gene da aspartoquinase III (IysC) épreferivelmente modificado de modo que a inibição por retro-alimentação daL-Iisina é aliviada. Este gene IysC pode ser obtido pelo método descrito napatente US 5.932.453.

Além disso, uma bactéria tendo uma capacidade de produzirL-Iisina pode ser obtida por diminuição ou eliminação de uma atividade deuma enzima que catalisa uma reação que resulta na geração de um compostodiferente L-Iisina ou uma atividade de uma enzima que funcionanegativamente na produção de L-lisina. Exemplos de tais enzimas incluemhomoserina desidrogenase, lisina decarboxilase (cadA, IdcC), e enzimamálica, e cepas em que as atividades de tais enzimas são diminuídas oudeficientes são descritas em WO 95/23864, WO 96/17930, WO 2005/010175.

Bactérias produzindo L-triptofano são preferivelmente astendo atividades melhoradas de uma ou mais dentre antranilato sintase,fosfoglicerato desidrogenase, e triptofano sintase. Antranilato sintase efosfoglicerato desidrogenase são reguladas por inibição por retro-alimentaçãopor L-triptofano e L-serina, respectivamente. Assim, estas enzimas podem sermodificadas de modo que a inibição por retro-alimentação é aliviada.Especificamente, gene da antranilato sintase (trpE) e/ou gene dafosfoglicerato desidrogenase (serA) é mudado de modo que a inibição porretro-alimentação é aliviada, e os genes mutantes são introduzidos em umabactéria, por exemplo, uma bactéria pertencendo à famíliaEnterobacteriaceae. Exemplos específicos incluem uma cepa recombinanteobtida por transformação de Eseherichia eoli SVl64 que abriga umaantranilato sintase resistente à retro-alimentação com pGH5 (WO 94/08031),que contém um gene mutante serÀ codificando uma fosfogliceratodesidrogenase resistente à retro-alimentação.

A capacidade de produzir L-triptofano pode ser conferida porintrodução de um DNA recombinante contendo o operon triptofano.Exemplos específicos dos mesmos incluem Eseheriehia eoli transformadocom um operon triptofano compreendendo o gene codificando umaantranilato sintase resistente à retro-alimentação (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, e patente US 4.371.614). A capacidade de produzir L-triptofanotambém pode ser conferida e/ou melhorada por melhora da expressão do genecodificando o operon triptofano, em particular, triptofano sintase (trpBA).Triptofano sintase tem subunidades α e β, que são codificadas por trpA etrpB, respectivamente.

A capacidade de produzir L-triptofano também pode serconferida por interrupção do gene trpR, que reprime o operon triptofano, oupor introdução de uma mutação no gene trpR (patente US 4.371.614 e WO2005/056776).

Exemplos preferíveis de bactérias produzindo L-triptofanoincluem uma bactéria em que os operons de malato sintase, isocitrato liase,isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase (operon ace) são constitutivamenteexpressados ou em que a expressão do operon é melhorada. É preferívelmodificar o promotor do operon ace para evitar a supressão pelo repressoriclR, ou o gene iclR pode ser interrompido.

A bactéria em que a expressão do operon ace foi melhoradapode ser obtida por ligação de um DNA contendo o operon ace a umpromotor forte e introdução da construção obtida em uma bactéria usando umplasmídeo, recombinação homóloga ou transposon para aumentar um númerode cópias do DNA.

Além disso, exemplos de uma bactéria tendo capacidade deproduzir L-triptofano incluem Escherichia coli AGX17 (pGX44) [NRRL B-122363] que exibe L-fenilalanina- e L-tirosina-auxotrofia eAGX6(pGX50)aroP [NRRL B-12264] que contém pGX50, que contém umoperon triptofano (patente US 4.371.614).

L-triptofano, L-fenilalanina, e L-tirosina são aminoácidosaromáticos e são produzidos por uma via de biossíntese comum. Exemplos degenes codificando enzimas biossintéticas de aminoácido aromático incluemdeoxiarabino-heptulosonato fosfato sintase (aroG), 3-dehidroxinato sintase(aroB), shikimato desidratase, shikimato quinase (aroL), 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase (aroA), e corismato sintase (aroC) (EP763127 A). Assim, uma capacidade de produzir aminoácido aromático podeser melhorada por aumento do número de cópias destes genes em umplasmídeo ou em um cromossomo. Além disso, sabe-se que estes genes sãoregulados por um repressor de tirosina (tyrR), e a atividade das enzimasbiossintéticas de aminoácido aromático pode ser aumentada por interrupçãodo gene tyrR (EP 763127 B).

Exemplos de uma bactéria tendo uma capacidade de produzirL-fenilalanina incluem AJ12739 em que o gene tyrA e o gene tyrR sãointerrompidos (tyrA:TnlO, tyrR) (VKPM B-8197), e uma cepa em que isgenes de exportação de fenilalanina, como yddG e yedA, são amplificados(WO 03/044192).

Exemplos de uma bactéria tendo uma capacidade de produzirL-treonina incluem Enterobaeteriaeeae tendo atividade melhorada de umaenzima biossintética L-treonina. Exemplos de um gene codificando a enzimabiossintética L-treonina incluem o gene da aspartoquinase III (IysC), gene daaspartato semialdeído desidrogenase (asd), gene da aspartoquinase I (thrA),gene da homoserina quinase (thrB), e o gene da treonina sintase (thrC). Ostermos em parêntese após os nomes de enzimas referem-se aos nomes dosgenes codificando estas enzimas. Dois ou mais destes genes podem serintroduzidos na bactéria hospedeira. Este gene biossintético de L-treoninapode ser introduzido em uma bactéria Escherichia em que a degradação de L-treonina foi suprimida. Exemplos de uma bactéria Eseheriehia em quedegradação de L-treonina foi suprimida incluem a cepa TDH6 em que umaatividade de treonina desidrogenase é deficiente (JP 2001-346578 A).

A atividade da enzima biossintética de L-treonina é suprimidapor L-treonina. Assim, para construir uma bactéria produzindo L-treonina, umgene biossintético de L-treonina é preferivelmente modificado de modo que aenzima não é regulada por inibição por retro-alimentação por L-treonina.Entrementes, os genes thrA, thrB, e thrC descritos acima constituem umoperon de treonina que forma uma estrutura de atenuador, e a expressão dooperon de treonina é reprimida por isoleucina ou treonina no meio de cultura,isto é, reprimida por atenuação. A modificação pode ser obtida por remoçãoda seqüência líder e/ou do atenuador na região de atenuação (Lynn, S. P.,Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., e Gardner, J. F.J. Mol. Biol. 194: 59 - 69 (1987); WO 02/26993; e WO 2005/049808).

Um promotor específico está localizado a montante do operonde treonina e o promotor pode ser substituído por um promotor heterológo(WO 98/04715), ou o operon de treonina pode ser regulado por um repressorou promotor de fago lambda (EP 0593792 B). Para modificar uma bactériaEseheriehia de modo que o operon de treonina não seja regulado por inibiçãopor retro-alimentação com L-treonina, uma cepa bacteriana que é resistentepara ácido a-amino-P-hidroxivalérico (AHV) pode ser selecionada.

Preferivelmente, o operon de treonina modificado, que não éregulado por inibição por retro-alimentação com L-treonina, é ligado em umpromotor forte, e introduzido em uma bactéria hospedeira. O aumento donúmero de cópias pode ser obtido por amplificação do operon de treoninausando um plasmídeo ou por transferência do operon de treonina para umcromossomo usando um transposon, Mu-fago, ou outros.

E preferível para melhorar a expressão de genes envolvidos navia glicolítica, ciclo TCA, e cadeia respiratória, genes que regulam aexpressão destes genes, e genes de absorção de açúcar, além dos genescodificando as enzimas biossintéticas de L-treonina. Exemplos de tais genesefetivos para a produção de L-treonina incluem o gene da transhidronase(pntAB) (EP 733712 B), gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC) (WO95/06114), gene da fosfoenolpiruvato sintase (pps) (EP 877090), e gene dapiruvato carboxilase derivados de uma bactéria corineforme ou uma bactériaBacillus (WO 99/18228 e EP 1092776).

Isto é preferível para melhorar a expressão de genes queconferem resistência a L-treonina e L-homoserina, ou conferem resistência aL-treonina e/ou L-homoserina a um hospedeiro. Exemplos de tais genesincluem o gene rhtA (Res. Microbiol. 154: 123 - 135 (2003)), gene rhtB (EP0994190 A), gene rhtC (EP 1013765 A), gene yfiK, e gene yeaS (EP 1016710A). A resistência a L-treonina também pode ser conferida para um hospedeirocom referência aos métodos descritos em EP 0994190 A e WO 90/04636.

Exemplos de uma bactéria tendo uma capacidade de produzirL-treonina incluem a cepa Escherichia eoli VKPM B-3996 (patente US5.175.107). A cepa VKPM B-3996 foi depositada junto ao Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika em 7 deabril de 1987 e recebeu o número de acesso de VKPM B-3996. A cepaVKPM B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 (WO 90/04636) que é obtido porinserção de um gene biossintético de treonina (operon de treonina: thrABC)em pAYC32, que é um vetor de plasmídeo com a uma faixa ampla dehospedeiro e compreende um marcador resistente a estreptomicina(Chistorerdov, A.Y., e Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161 - 167 (1986)).pVIC40 compreende um gene thrA mutante que codifica aspartoquinase L-homoserina desidrogenase I que não é submetida à inibição por retro-alimentação por L-treonina.

Outro exemplo de uma bactéria tendo uma capacidade deproduzir L-treonina é a cepa Escherichia coli B-5318 (EP 0593792 Β). Acepa B-5318 foi depositada junto ao Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM), GNII Genetika em 3 de maio de 1990 e recebeu onúmero de acesso de VKPM B-5318. A cepa B-5318 é prototrófica comrelação a isoleucina, e abriga um plasmídeo tendo um operon de treonina comuma região de atenuador localizada a jusante do repressor de Cl sensível atemperatura, promotor PR e sítio N-terminal de proteína Cro de fago lambda,de modo que a expressão dos genes biossintéticos de treonina é regulada pelorepressor e promotor de fago lambda.

<l-2> Melhora de atividade de fosfotransacetilase

A bactéria da presente invenção pode ser obtida pormodificação da bactéria descrita acima tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido de modo que a atividade de fosfotransacetilase é melhorada. Noentanto, a capacidade de produzir L-aminoácido pode ser conferida após abactéria ser modificada de modo que a atividade de fosfotransacetilase émelhorada.

A frase "modificado de modo que a atividade defosfotransacetilase é melhorada" inclui quando o número de moléculas defosfotransacetilase por célula aumenta e quando a atividade defosfotransacetilase por molécula aumenta como comparado a uma cepa detipo selvagem ou cepa não modificada. No caso de uma bactéria corineforme,exemplos da cepa de tipo selvagem a serem usadas como controle incluemCorynebaeterium glutamieum (Brevibaeterium laetofermentum) ATCC13 869e ATCC13032. Exemplos de um Eseheriehia coli de tipo selvagem incluemEseheriehia coli W3110 (ATCC 27325) e Escherichia coli MG1655 (ATCC47076), que são derivados da cepa K-12 de tipo selvagem protótipo.Exemplos de um Pantoea ananatis de tipo selvagem incluem Pantoeaananatis AJ13355 (FERM BP-6614) e AJ13356 (FERM BP-6615).

Na presente invenção, fosfotransacetilase(fosfoacetiltransferase) catalisa a reação para gerar acetil-CoA e fosfato defosfato de acetila e CoA ou a reação reversa do mesmo, e também é referidacomo fosfato acetiltransferase ou fosfoacetilase (EC 2.3.1.8).

Na presente invenção, a atividade de fosfotransacetilasemelhorada pode ser determinada pelo método descrito em Reinscheid D. J. etal. (Microbiology. 145: 503 - 513 (1999)).

Atividade melhorada de fosfotransacetilase também pode serconfirmada por comparação do nível de mRNA do gene codificandofosfotransacetilase ao de uma cepa de um tipo selvagem ou não modificada.Métodos de detectar o nível de expressão de um gene incluem Northernhybridization e RT-PCR (Molecular cloning (Cold spring Harbor LaboratoryPress, Cold spring Harbor (USA), 2001). A atividade de fosfotransacetilaseou nível de expressão de gene na bactéria da presente invenção pode ocorrerem qualquer nível desde que seja aumentada como comparado a uma cepa detipo selvagem ou não modificada, e, por exemplo, a atividade ou expressão degene preferivelmente aumenta em não menos que 1,5-vezes, maispreferivelmente não menos que 2-vezes, além disso, preferivelmente nãomenos que 3-vezes como comparado a uma cepa de tipo selvagem ou nãomodificada.

O gene codificando fosfotransacetilase (gene pta) de umabactéria corineforme inclui a seqüência de nucleotídeo de NCg 12657(ATCC13032) registrado em Genbank (um filamento complementar de2936506..2937891 de acesso NC_003450.3). SEQ ID NOS: 40 e 41 mostrama seqüência de nucleotídeo do gene e a seqüência de aminoácido codificadapelo gene, respectivamente. Além disso, números de nucleotídeos 1214-2641de SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35 mostram a seqüência de nucleotídeo dogene pta de C. glutamicum ATCC13 869 e a seqüência de aminoácidocodificada pelo gene, respectivamente.

Além disso, o gene da presente invenção pode ser umhomólogo do gene pta que é derivado de outra bactéria desde que elecodifique uma proteína tendo a atividade de fosfotransacetilase. Um talhomólogo pode ser pesquisado em BLAST (http://blast.genome.jp/) ou outroscom referência para a seqüência de nucleotídeo de nucleotídeos 1214 a 2641de SEQ ID NO: 34 ou a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 40.

A seqüência de nucleotídeo do gene pta da presente invençãofoi identificada. Assim, a região contendo o gene pta, ou o gene pta e suasseqüências reguladoras de expressão podem ser obtidas por PCR (PCR:polymerase chain reaction; White, T.J. et ai., Trends Genet. 5, 185 (1989))usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeoconhecida, por exemplo, usando os iniciadores de SEQ ED NOS: 9 e 10, eusando o DNA cromossômico de uma bactéria corineforme como umgabarito. Um homólogo do gene pta derivado de outra bactéria pode serobtido no mesmo modo.

Podem ocorrer diferenças entre as seqüências de nucleotídeosde genes pta dependendo da espécie ou cepas das bactérias usadas para isolaro gene pta. Assim, o gene pta a ser usado na presente invenção não é limitadoaos nucleotídeos 1214 a 2641 de SEQ ID NO: 34 ou a seqüência denucleotídeo de SEQ ID NO: 40, mas pode ser um gene mutante ou um geneartificialmente modificado que codifica uma proteína tendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 35 ou 41 e que pode incluir substituições,deleções, inserções, ou adições de um ou vários aminoácidos em uma ouvárias posições desde que codifiquem uma proteína tendo a atividade defosfotransacetilase. Apesar de depender de posições na estrutura ternária daproteína ou tipos de aminoácidos, o termo "um ou vários" usado aquiespecificamente significa de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10, maispreferivelmente de 1 a 5. Entrementes, estas substituições, deleções,inserções, adições, ou inversões incluem mutações naturalmente ocorrendo(mutantes ou variantes) devido às diferenças em indivíduos ou espécies dasbactérias abrigando o gene pta.

A substituição mencionada acima é preferivelmente umasubstituição conservadora que não provoca uma mudança funcional. Assubstituições conservadoras incluem uma substituição entre aminoácidosaromáticos como substituição dentre Phe, Trp e Tyr; uma substituição entreaminoácidos hidrofóbicos como substituição dentre Leu, Ile e Vai; umasubstituição entre aminoácidos polares como substituição entre Gln e Asn;uma substituição entre aminoácidos básicos como substituição dentre Lys,Arg e His; uma substituição entre aminoácidos acídicos como substituiçãoentre asp e Glu; uma substituição entre aminoácidos tendo um grupo hidroxilacomo substituição entre Ser e Thr. Exemplos específicos da substituiçãoconservadora incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição deGln, His, ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn;substituição de Asn, Glu, ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys;substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg por Gln; substituição de Gly,Asn, Gln, Lys, ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição deAsn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Vai, ou Phe porlie; substituição de lie, Met, Vai, ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu,Gln, His, ou Arg por Lys; substituição de lie, Leu, Vai, ou Phe por Met;substituição de Trp, Tyr, Met, lie, ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Alapor Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr porTrp; substituição de His, Phe, ou Trp por Tyr; e substituição de Met, lie, ouLeu por Vai.

Além disso, o gene pta pode ser um gene que tem umaseqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos90%, mais preferivelmente 95%, particularmente preferivelmente pelo menos97% homologia para a seqüência completa de aminoácidos de SEQ ID NO:35 ou 41, e codifica uma proteína tendo a atividade de fosfotransacetilase.Também, o gene pta pode ser modificado para ter um códon que é facilmenteusado pela bactéria hospedeira escolhida porque os níveis de degeneração degenes são diferentes dependendo da bactéria hospedeira.

O gene pta pode ter uma seqüência alongada ou encurtada nolado N-terminal e/ou lado C-terminal desde que codifique uma proteína tendoatividade de fosfotransacetilase. O comprimento da seqüência de aminoácidoque é alongada ou encurtada é de 50 ou menos, preferivelmente 20 ou menos,mais preferivelmente 10 ou menos, particularmente preferivelmente 5 oumenos. Mais especificamente, o gene pta pode ter uma seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 35 ou 41 em que um adicional de 50 a 5aminoácidos estão presentes no lado N-terminal e/ou no lado C-terminal.

Um homólogo do gene pta pode ser obtido por modificação daseqüência de nucleotídeo de nucleotídeos 1214 a 2641 de SEQ ID NO: 34 oua seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 40 de modo que os resíduos deaminoácido específico na proteína codificada pelo gene são substituídos,deletados, inseridos, ou adicionados, por exemplo, por mutagenese sítio-específica. Além disso, um gene homólogo também pode ser obtido por umtratamento de mutação conhecido como descrito abaixo. Um gene homólogopode ser obtido por tratamento de uma seqüência descrita acima denucleotídeo in vitro com hidroxilamina ou outros, tratamento de uma bactériaabrigando o gene, por exemplo, uma bactéria corineforme com raiosultravioletas ou com um mutagene como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina(NTG) ou etilmetanossulfonato (EMS), ou por introdução artificial de umamutação no gene pta por recombinação de genes, como PCR propenso a erros,embaralhamento de DNA, e StEP-PCR (Firth AE, Patrick WM;Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction). Adeterminação da atividade enzimática pelo método descrito acima podeconfirmar se este homólogo do gene pta codifica uma proteína tendo aatividade de fosfotransacetilase.

Exemplos do gene pta incluem um DNA que hibridiza comuma seqüência complementar para nucleotídeos 1214a 2641 de SEQ ID NO:34 ou uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 40, ou com uma sondaque pode ser preparada a partir das seqüências sob condições estringentes ecodifica uma proteína tendo a atividade de fosfotransacetilase. O termo"condições estringentes" usado aqui inclui condições sob as quais o assimchamado híbrido específico é formado e híbrido não específico não éformado. Exemplos dos mesmos incluem condições sob as quais DNAs tendohomologia elevada de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%,mais preferivelmente pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente pelomenos 97% hibridizam com cada outro e DNAs tendo homologia menos que80% não hibridizam com cada outro; e especificamente incluem condições delavagem em hibridização Southern geral, isto é, condições incluindo lavagemem uma concentração de sal de 1 χ SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 χSSC, 0,1% SDS a 60 0C, preferivelmente 68 °C, uma vez, preferivelmenteduas vezes ou três vezes.

Como uma sonda, uma seqüência parcial de nucleotídeos 1214a 2641 de SEQ ID NO: 34 ou uma seqüência parcial da seqüência denucleotídeo de SEQ ID NO: 40 pode ser usada. Esta sonda pode ser preparadapor PCR usando oligonucleotídeos preparados com base na seqüência denucleotídeos como iniciadores e um fragmento de DNA tendo a seqüência denucleotídeo de nucleotídeos 1214 a 2641 de SEQ ID NO: 34 ou a seqüênciade nucleotídeo de SEQ ID NO: 40 como um gabarito. Por exemplo, quandousando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp,condições de lavagem exemplares incluem a hibridização em 2 χ SSC, 0,1%SDS a 50 °C.

A expressão do gene pta pode ser melhorada por aumento donúmero de cópia do gene pta. Por exemplo, a expressão pode ser melhoradapor preparação de um DNA recombinante por ligação de um fragmentocontendo o gene pta em um vetor que funciona na bactéria hospedeira,preferivelmente um vetor de múltiplas cópias; e então transformação dabactéria descrita acima tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido como DNA recombinante. Alternativamente, a expressão pode ser melhorada porintrodução do DNA recombinante descrito acima em uma bactéria de tiposelvagem para preparar um transformante, e então conferir uma capacidade deproduzir L-aminoácido para o transformante. Entrementes, o número decópias pode ser aumentado por transferência de uma ou mais cópias do genepta no cromossomo. A integração do gene pta no cromossomo pode serconfirmada por hibridização Southern usando uma parte do gene pta comouma sonda.

Expressão do gene pta também pode ser melhorada pormodificação de uma região reguladora de expressão do gene pta. Porexemplo, isto pode ser obtido por substituição de uma seqüência promotorado gene pta com um promotor mais potente, ou modificação de umaseqüência promotora para ficar próxima de uma seqüência de consenso (WO00/18935).

Abaixo, métodos de construir uma bactéria corineformemodificada de modo que a atividade de fosfotransacetilase é aumentada serãomostrados. Estes métodos podem ser realizados de acordo com os manuais deMolecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA), 2001) e outros. Bactérias diferentes da bactéria corineforme tambémpodem ser modificadas de modo que a atividade de fosfotransacetilase éaumentada pelo mesmo método.

O nível de expressão do gene pta pode ser melhorado poraumento do número de cópias do gene pta, e o número de cópias pode seraumentado por amplificação do gene pta usando um plasmídeo como descritoabaixo. Primeiro, o gene pta é clonado a partir do cromossomo de umabactéria corineforme. O DNA cromossômico pode ser preparado a partir deuma bactéria que serve como um doador de DNA por, por exemplo, o métodode Saito e Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), ExperimentManual for Biotechnology, editado pela The Society for Biotechnology,Japão, ρ 97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992). Oligonucleotideos para PCR sãosintetizados com base na informação de seqüência conhecida descrita acima, eo gene pta pode ser amplificado por uso dos oligonucleotídeos sintéticos deSEQ ID NOS: 9 e 10, por exemplo.

Um fragmento de gene contendo o gene pta amplificado éligado a um vetor que é autonomamente replicável em Escherichia coli e/oubactéria corineforme, e o DNA recombinante é introduzido em Escherichiacoli. Exemplos de um vetor que é autonomamente replicável em Eseheriehiacoli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010,pBR322, pACYC184, e pMW219.

O DNA mencionado acima é introduzido em um vetor capazde funcionar em bactéria corineforme. Um exemplo deste vetor inclui umplasmídeo capaz de replicar autonomamente em bactéria corineforme.

Exemplos específicos dos mesmos incluem pCRY30 descrito em JP 3-210184A; pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KXdescrito em JP 2-72876 A e patente US 5.185.262; pCRY2 e pCRY3 descritoem JP 1-191686 A; pAM330 descrito em JP 58-67679 A; pHM1519 descritoem JP 58-77895 A; pAJ655, pAJ611, e pAJ1844 descrito em JP 58-192900A; pCGl descrito em JP 57-134500 A; pCG2 descrito em JP 58-35197 A;pCG4 e pCGll descrito em JP 57-183799 A; e pVK7 descrito em JP 10-215883 A.

Além disso, se um fragmento de DNA capaz de replicarautonomamente em uma bactéria corineforme for excisado a partir de umdentre estes plasmídeos e inserido no vetor descrito acima para Escheriehiacoli, este vetor pode ser usado como um assim chamado vetor bidirecional, eele será replicável autonomamente em tanto Escherichia coli como embactéria corineforme.

Estes vetores podem ser obtidos a partir das bactériasdepositadas mostradas nos documentos de patente descritos acima como aseguir. As células coletadas na fase de crescimento logarítmico são lisadascom lisozima e SDS, e centrifugadas a 30,000 χ g, e então polietileno glicol éadicionado ao sobrenadante, seguido por separação e purificação porcentrifugação de gradiente de equilíbrio brometo de etídio - cloreto de césio.

Para preparar um DNA recombinante por ligação do gene ptacom um vetor que funciona em bactérias corineformes, o vetor é digerido comuma enzima de restrição apropriada por excisão de um fragmento contendo ogene pta. O sítio de restrição pode ser introduzido antes em umoligonucleotídeo sintético para amplificar o gene pta. A ligação é geralmenterealizada usando uma ligase como T4DNA ligase.

O plasmídeo recombinante preparado como descrito acimapode ser introduzido em uma bactéria corineforme por qualquer método detransformação registrado até agora. Exemplos dos mesmos incluem aumentara permeabilidade de um DNA por tratamento das células recipientes comcloreto de cálcio, o que foi relatado para Eseheriehia coli K-12 (Mandei, M. eHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970), e introdução de um DNA em célulascompetentes preparadas a partir das células no estágio de proliferação, que foirelatado para Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G.A e Young, F. E,Gene, 1, 153 (1977)). Alternativamente, a preparação de células de tipoprotoplasto ou células de tipo esferoplasto a partir de uma bactéria recipientede DNA, que pode facilmente incorporar um DNA recombinante, e introduzirum DNA recombinante nestas células, também pode ser usada (Chang, S. eChoen, S. N., Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. eHopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75 1929 (1978)). Uma bactéria corineformetambém pode ser transformada pelo método de pulso elétrico (JP 02-207791A) ou o método de transferência por conjugação (Biotechnology (NY). 1991Jan; 9(1): 84-7).

O número de cópias do gene pta pode ser aumentado porintrodução de cópias múltiplas do gene pta no DNA cromossômico de umabactéria corineforme. A fim de introduzir cópias múltiplas do gene pta noDNA cromossômico de uma bactéria corineforme, a recombinação homólogaé realizada usando uma seqüência que está presente em um DNAcromossômico em cópias múltiplas. DNA repetitivo ou uma repetiçãoinvertida existente na extremidade de um elemento transposável pode serusado como uma seqüência que está presente em um DNA cromossômico emcópias múltiplas. Alternativamente, como descrito em JP 02-109985 A, ascópias múltiplas do gene pta podem ser introduzidas por inserção do gene emum transposon, para assim transferir as cópias múltiplas do gene em um DNAcromossômico (JP 02-109985 A, JP 07-107976 A, and Mol. Gen. Genet., 245,397 - 405 (1994), Plasmid. 2000 Nov; 44(3): 285 - 91).

Além disso, o gene pta pode ser amplificado no cromossomopor inserção do gene pta em um plasmídeo tendo uma origem de replicaçãoque não pode replicar no hospedeiro ou um plasmídeo tendo uma origem dereplicação que não pode replicar no hospedeiro e é capaz de transferir aconjugação. Exemplos de tais plasmídeos incluem pSUP301 (Simo et al.,Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob, ou pK19mob (Schaefer et al.,Gene 145, 69 - 73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI,USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; patente US 5487993), pCR(R)Blunt (Invitrogen, Groningen,Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534 - 541(1993)), pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510 -4516), e pBGS8 (spratt et al., 1986, Gene, 41: 337 - 342). Um vetor deplasmídeo contendo o gene pta é transferido para uma bactéria corineformepor conjugação ou transformação. Um método de conjugação é descrito, porexemplo, por Schaefer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,756 - 759 (1994)). Os métodos da transformação são descritos, por exemplo,por Theirbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356 - 362(1988)), Dunican e Shivinan (Bio/Technology 7, 1067 - 1070 (1989)), eTauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343 - 347 (1994)).

Expressão do gene pta também pode ser aumentada porsubstituição de uma seqüência reguladora de expressão como o promotor dogene pta no DNA cromossômico ou em um plasmídeo com um promotor maispotente, modificação de um fator envolvido na regulação de expressão dogene pta, por exemplo, um operador ou um repressor, ou ligação de umterminador mais potente (Hamilton et al.; Journal of Bacterology 171: 4617 -4622). Exemplos de promotores potentes conhecidos incluem o promotor lac,promotor trp, promotor trc, e promotor PS2. Os métodos de avaliação dapotência do promotor e exemplos de promotores potentes são descritos porGoldstein et al. (Prokaryotic promotors in biotechnology. Biotechnol. Annu.Rev., 1995, 1. 105 - 128). Como descrito em WO 00/18935, um promotorpode ser tornado mais forte por introdução de uma substituição de váriosnucleotídeos na região do promotor do gene de marcação de modo que opromotor se torna próximo a uma seqüência de consenso. Por exemplo, aregião -35 pode ser mudada em TTGACA ou TTGCCA, enquanto a região -pode ser mudada em TATAAT ou TATAAC. Além disso, sabe-se que aeficiência de tradução de mRNA é significantemente afetada por substituiçãode vários nucleotídeos em uma seqüência de espaçador entre o sítio de ligaçãodo ribossomo (RBS) e o códon de iniciação de tradução, em particular, aseqüência imediatamente a montante do códon de iniciação de tradução e,deste modo, a seqüência do espaçador pode ser modificada.

Um exemplo de uma região a montante do gene pta incluinucleotídeos 1 a 1213 de SEQ ID NO: 34. Uma seqüência reguladora deexpressão como um promotor do gene pta pode ser determinada usando umpromotor de busca de vetor ou software para encontrar genes, comoGENETYX. A substituição do promotor descrito acima ou modificaçãomelhora a expressão do gene pta. A seqüência reguladora de expressãotambém pode ser substituída usando um plasmídeo sensível a temperatura. Amodificação de uma seqüência reguladora de expressão pode ser combinadacom aumento do número de cópias do gene pta.

Além disso, a expressão também pode ser aumentadaprolongando o tempo de retenção do mRNA ou evitando a degradação daproteína PTA na célula.

Também, se tem um sítio de ligação para a proteína RamB queregula negativamente a expressão do gene pta. Este sítio de ligação estálocalizado a montante do gene pta em bactéria corineforme e, assim, o sítio deligação de proteína RamB pode ser modificado para aumentar a atividade depta. Os sítios de ligação de proteína RamB a montante de um gene pta foramregistrados em J Bacteriol. 2004 May; 186 (9): 2798 - 2809, e são previstoscomo incluindo AAAACTTTGCAAA partindo na posição -87 eAAAACTTTGCAAA partindo na posição -203, como contado a partir docódon de iniciação de tradução do gene pta (as seqüências destes sítios deligação de proteína RamB correspondem aos nucleotídeos 1000 a 1012e 1115a 1127 de SEQ ID NO: 34, respectivamente). Uma seqüência de ligação deproteína A RamB é registrada como tendo uma seqüência de consenso deA(A/G)AACTTTGCAAA e está localizada a montante do gene aceA quecodifica isocitrato liase, o gene aceB que codifica malato sintase, e o operonpta-ack, e a expressão destes genes é induzida na presença de umaconcentração elevada de ácido acético. Assim, a modificação da seqüênciaconservada pode evitar a diminuição em expressão do gene pta devido àligação de RamB, e exemplos de uma modificação da seqüência incluem asubstituição de um par de bases AT com um par de bases GC e a substituiçãode um par de bases GC com um par de bases AT, especificamente incluisubstituir AAAACTTTGCAAA com aaaacGAGgcGaG ou aaaacGAGgcaaa.

Se o gene pta for modificado de modo a ser negativamenteregulado por RamB pode ser confirmado por exame de se o gene pta éconstitutivamente expressado na ausência de ácido acético (por exemplo,somente glicose está presente como uma fonte de carbono) (J Bacteriol. 2004May; 186 (9): 2798 - 809).

A atividade de fosfotransacetilase também pode ser aumentadapor modificação de uma proteína reguladora que regula a expressão do genepta. Um exemplo de um regulador para o gene pta inclui a proteína RamBdescrita acima porque ela negativamente controla a expressão do gene pta. Ogene ramB de bactéria corineforme foi registrado em Genbank. Por exemplo,o gene ramB de cepa glutamicum ATCC13032 é registrado sob um No. deacesso NC_006958.1:390784..392208. SEQ ID NOS: 42 e 43 mostram aseqüência do gene ramB e a seqüência de aminoácido codificada pelo generamB, respectivamente. Entrementes, SEQ ID NO: 36 e 37 mostram o generamB de cepa C. glutamicum ATCC13 869 e a seqüência de aminoácidocodificada pelo gene ramB, respectivamente. O gene RamB pode ser umDNA que hibridiza com um filamento complementar da seqüência denucleotídeos de SEQ ID NO: 36 ou 42 ou com uma sonda preparada a partirdai sob condições estringentes, e codifica uma proteína que liga para os sítiosde ligação RamB de modo a reprimir a expressão do gene pta. Aqui, ascondições estringentes são como mencionadas acima.

Expressão do gene ramB pode ser diminuída para melhorar aexpressão do gene pta. Por exemplo, uma mutação que diminui ou elimina aexpressão do gene ramB pode ser introduzida por uma técnica derecombinação de genes, como a seguir. Uma seqüência parcial do gene ramBé mudada de modo que a proteína RamB não é produzida, e uma bactéria étransformada com um DNA compreendendo o gene ramB mutante de modo acausar a recombinação entre o gene ramB mutante e um gene ramB de tiposelvagem no cromossomo, resultando em substituição do gene ramB de tiposelvagem no cromossomo com o gene ramB mutante.

O gene ramB de tipo selvagem no cromossomo de umabactéria hospedeira pode ser substituído pelo gene ramB mutante pelosseguintes procedimentos, por exemplo. Primeiro, um plasmídeo pararecombinação é preparado por inserção, em um vetor de plasmídeo, de umaorigem de replicação sensível a temperatura, o gene ramB mutante, um genesacB codificando uma levansucrase, e um gene marcador que exiberesistência a um antibiótico, como cloranfenicol.

Aqui, o gene sac B codifica uma levansucrase, e é usado paraselecionar efetivamente uma cepa em que uma porção de vetor foi curada apartir do cromossomo (Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69 - 73). Quandouma levansucrase é expressada em uma bactéria, a bactéria não pode crescerporque o levano gerado por assimilação de sacarose afeta letalmente abactéria. Se uma cepa em que o vetor transportando o gene sacB permaneceno cromossomo for cultivada em uma placa contendo sacarose, ela não podecrescer. Assim, somente uma cepa em que o vetor foi curado do cromossomopode ser selecionada em uma placa contendo sacarose.

Exemplos de um gene sacB e homólogos dos mesmos incluem

os seguintes:

Bacillus subtilis: sacB número de acesso no Genbank X02730 (WO2005/113745)

Bacillus amyloliquefaciens: sacB número de acesso no GenbankX52988

Zymomonas mobilis: sacB número de acesso no Genbank L33402

Bacillus stearothermophilus: surB número de acesso no GenbankU34874Lactobacillus sanfranciscensis: fi*fA número de acesso no GenbankAJ508391

Acetobacter xylinus: IsxA número de acesso no GenbankAB034152

Glueonaeetobaeter diazotrophieus: IsdA número de acesso noGenbank L41732

O transformante obtido por introdução de um plasmídeocontendo o gene sacB e o gene ramB mutante é cultivado em umatemperatura apropriada para o funcionamento da origem de replicaçãosensível a temperatura (25 °C). Esta cepa é cultivada em uma temperaturaelevada (por exemplo, 34 °C) de modo que a origem de replicação sensível atemperatura não pode funcionar, resultando na cura do plasmídeo sensível atemperatura, e então esta cepa é cultivada em uma placa contendo umantibiótico. Porque o plasmídeo sensível a temperatura não pode replicar emtemperatura elevada, uma cepa que foi curada do plasmídeo não pode crescerem uma placa contendo um antibiótico, mas uma cepa em que arecombinação ocorre entre o gene ramB mutante no plasmídeo e o gene ramBde tipo selvagem no cromossomo pode crescer, e as colônias aparecem.

Em uma cepa contendo o gene ramB mutante integrado noDNA cromossômico, a recombinação é causada entre o gene ramB mutante eo gene ramB de tipo selvagem nativo para o cromossomo, e os genes de fusãodo gene ramB de tipo selvagem e o gene ramB mutante são inseridos nocromossomo de modo que as outras porções do DNA recombinante(segmento de vetor, origem de replicação sensível a temperatura e marcadorde resistência a antibiótico) estão presentes entre os genes de fusão.

Então, a fim de deixar somente o gene ramB mutante nocromossomo, uma cópia do gene ramB é eliminada junto com o segmento devetor (incluindo a origem de replicação sensível a temperatura e o marcadorde resistência a antibiótico) do DNA cromossômico. Neste caso, o gene ramBde tipo selvagem é deixado no DNA cromossômico e o gene ramB mutante éexcisado a partir do DNA cromossômico, ou ao contrário, o gene ramBmutante é deixado no DNA cromossômico e o gene ramB de tipo selvagem éexcisado a partir do DNA cromossomo. Em ambos os casos, o DNA excisadoé mantido na bactéria hospedeira quando a bactéria hospedeira é cultivada emuma temperatura que permite o funcionamento da origem de replicaçãosensível a temperatura. Então, o gene no plasmídeo é curado a partir dascélulas junto com o plasmídeo por cultivo da bactéria em uma temperaturaque não permite o funcionamento da origem de replicação sensível atemperatura. No caso do gene sacB, as cepas a partir das quais o plasmídeo écurado podem ser eficientemente obtidas por cultivo da bactéria em um meiocontendo sacarose. As cepas em que o gene ramB de tipo selvagem ésubstituído com o gene ramB mutante podem ser obtidas por seleção dascepas que abrigam o gene ramB mutante das cepas curadas por plasmídeo.

A bactéria da presente invenção pode ser modificada de modoque a atividade/atividades de D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase e/ou frutose 6-fosfato fosfocetolase é/são aumentada(s), além de melhorar a atividade defosfotransacetilase.

Pelo menos uma dentre a atividade de D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase e a atividade de frutose 6-fosfato fosfocetolase pode seraumentada. Na presente descrição, D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase e frutose6-fosfato fosfocetolase são algumas vezes coletivamente referidas comofosfocetolase.

A atividade de D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase significa umaatividade que resulta em conversão de xilose-5-fosfato em gliceraldeído-3-fosfato e fosfato de acetila por consumo de ácido fosfórico, com liberaçãoconcomitante de uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser determinadapelo método descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515 - 520(1996) ou pelo método descrito por L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183; 2929 -2936).

Entrementes, a atividade de frutose 6-fosfato fosfocetolasesignifica uma atividade que resulta em conversão de frutose 6-fosfato emeritrose-4-fosfato e fosfato de acetila por consumo de ácido fosfórico, comliberação concomitante de uma molécula de H2O. Esta atividade pode serdeterminada pelo método descrito por Racker, E (Methods Enzymol., 5, 276 -280 (1962)) ou pelo método descrito por L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183;2929 - 2936).

A atividade de fosfocetolase é melhorada preferivelmente emnão menos que 1,5-vezes, mais preferivelmente não menos que 2-vezes,particularmente preferivelmente não menos que 3-vezes como comparadopara uma cepa não modificada ou uma cepa de tipo selvagem.

Como é o caso quando melhorando a atividade defosfotransacetilase como descrito acima, a atividade de fosfocetolase pode sermelhorada por aumento do número de cópia do gene codificandofosfocetolase ou modificação de um promotor do gene codificandofosfocetolase.

O gene fosfocetolase da bactéria hospedeira pode seramplificado, e a atividade de fosfocetolase pode ser conferida por introduçãode um gene heterólogo se a bactéria hospedeira não apresentar atividade defosfocetolase.

Um gene codificando D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase podeser obtido por PCR usando, como um gabarito, o DNA cromossômico de umabactéria tendo uma atividade de enzima de D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase.Exemplos desta bactéria incluem bactérias como bactérias lácticas, bactériasassimilando metanol, bactérias assimilando metano, bactérias pertencendo aogênero Streptococcus, Acetobacter, Bifidobaeterium, Lactobacillus,Thiobaeillus, Methylococcus, Butyrivibrio, ou Fibrobaetor; e leveduraspertencem ao gênero Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Piehia,Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Saecharomyces, Triehosporon,Wingea, ou outros.

O gene codificando frutose 6-fosfato fosfocetolase pode serobtido por PCR usando, como um gabarito, o DNA cromossômico de umabactéria tendo uma atividade enzimática de frutose 6-fosfato fosfocetolase.Exemplos desta bactéria incluem bactérias pertencendo ao gêneroAeetobaeter, Bifidobaeterium, Chlorobium, Brueella, Methyloeoeeus, ouGardnerella·, e leveduras pertencem ao gênero Candida, Rhodotorula,Saccharomyees, ou outros.

Um exemplo específico do gene codificando D-xilose 5-fosfato fosfocetolase é o gene xpkA derivado de Lactobacillus pentosusMD363. A seqüência de nucleotídeo do mesmo é registrada com um númerode acesso de AJ309011 (Posthuma, C. C. et al, Appl. Environ. Microbiol.,68(2), 831-7(2002)) (SEQ ID NO: 52) nos bancos de dados EMBL/GenBank.O gene xpkA pode hibridizar com um filamento complementar da seqüênciade nucleotídeo de SEQ ID NO: 52 ou com uma sonda preparada a partir daisob condições estringentes, e que codifica uma proteína que tem atividade deD-xilose 5-fosfato fosfocetolase.

O gene xpkl derivado de Lactobacillus plantarum tambémpode ser usado. A seqüência de nucleotídeo do mesmo é registrada com umnúmero de acesso de Região NC_004567 (complemento de2362936..2365302) (Kleerebezem, M., et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.100 (4), 1990 - 1995 (2003)) (SEQ ID NO: 54) nos bancos de dadosEMBL/GenBank. O gene xpkl pode hibridizar com um filamentocomplementar da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 54 ou com umasonda preparada a partir dai, sob condições estringentes e codifica umaproteína que tem atividade D-xilose 5-fosfato fosfocetolase.

Além disso, exemplos de homólogos destes genes incluem umgene de Lactobacillus plantarum que é registrado como número de acesso noGenbank NC_004567 (complemento de 3169067-3171478), um gene deStreptococcus agalactiae codificando a seqüência de aminoácido de númerode acesso no Genbank NP_736274, um gene de Lactococcus laetis subsp.Laetis codificando a seqüência de aminoácido de número de acesso noGenbank NP_267658, um gene de Lactobacillus johnsonii que é registradocomo número de acesso no Genbank NC 005362 (696462..698867), e umgene de Lactobacillus aeidophilus codificando a seqüência de aminoácido denúmero de acesso no Genbank YP_193510.

Outros exemplos de gene frutose 6-fosfato fosfocetolase e/ou ogene D-xilose 5-fosfato fosfocetolase são descritos em W02006/016705.

Um gene codificando uma proteína tendo as atividades deambos D-xilose 5-fosfato fosfocetolase e frutose 6-fosfato fosfocetolasetambém pode ser usado. Exemplos deste gene incluem o gene xfp deBifidobaeterium animalis. A seqüência de nucleotídeo do mesmo é registradacomo número de acesso de AJ293946 (Meile, L. et al, J. Bacteriol., 183(9),2929 - 36 (2001)) (SEQ ID NO: 56) nos bancos de dados EMBL/GenBank. Ogene xfp pode hibridizar com um filamento complementar da seqüência denucleotídeo de SEQ ED NO: 56 ou com uma sonda preparada a partir damesma sob condições estringentes, e que codifica uma proteína que tematividade de D-xilose 5-fosfato fosfocetolase e atividade de frutose 6-fosfatofosfocetolase.

Além disso, exemplos de um homólogo do gene xfp incluemum gene isolado de Bifidobaeterium longum que codifica a seqüência deaminoácido de número de acesso no Genbank NP_696135, um gene isoladode Chlorobium tepidum que codifica a seqüência de aminoácido de número deacesso no Genbank NP_662409, um gene isolado de Brueella suis quecodifica a seqüência de aminoácido de número de acesso no GenbankNP 699578, e um gene isolado de Brueella abortus que codifica a seqüênciade aminoácido de número de acesso no Genbank YP 223570.A bactéria da presente invenção pode ser modificada de modoque a atividade da piruvato carboxilase é aumentada, além de melhorar aatividade de fosfotransacetilase, ou também para melhorar as atividades defosfotransacetilase e D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase e/ou frutose 6-fosfatofosfocetolase.

Exemplos do gene da piruvato carboxilase incluem o gene pycderivado de bactéria corineforme e o gene pyc derivado de bactéria Bacillus eexemplos específicos dos mesmos incluem o gene pyc derivado de cepa C.glutamicum ATCC13032 (número de acesso no Genbank NCgl0659: SEQ IDNO: 64) e o gene pyc derivado de B. subtilis (EP 1092776). O gene dapiruvato carboxilase pode hibridizar com um filamento complementar daseqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 64 ou com uma sonda preparada apartir do mesmo sob condições estringentes, e que codifica uma proteína quetem atividade de piruvato carboxilase.

A bactéria da presente invenção também pode ser modificadade modo que a atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase é aumentada, alémde melhorar a atividade de fosfotransacetilase ou além de melhorar asatividades de fosfotransacetilase, D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase e/ou frutose6-fosfato fosfocetolase. Exemplos de um gene da fosfoenolpiruvatocarboxilase incluem o gene ppc derivado de bactéria corineforme e o gene ppcderivado de bactéria Escherichia e exemplos específicos dos mesmos incluemo gene ppc de cepa C. glutamicum ATCC13032 (número de acesso noGenbank NCgl 1523: SEQ ID NO: 62) e o gene ppc derivado de cepa E. coliMGl655 (número de acesso no Genbank NP_418391). O gene dafosfoenolpiruvato carboxilase pode hibridizar com um filamentocomplementar da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 62 ou com umasonda preparada a partir da mesma, sob condições estringentes, e que codificauma proteína que tem atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase. Além disso,porque algum tipo de fosfoenolpiruvato carboxilase é sensível à inibição porretro-alimentação por ácido aspártico, ela é preferivelmente modificada demodo a se tornar resistente à inibição por retro-alimentação por ácidoaspártico (EP0723011).

<2> Método de produzir L-aminoácido

Um L-aminoácido pode ser produzido por cultivo de umabactéria obtida como descrito acima em um meio para produzir e acumularum L-aminoácido no meio ou nas células bacterianas e coletar o L-aminoácido a partir do meio ou a partir das células bacterianas.

O meio pode ser um meio geral contendo uma fonte decarbono, fonte de nitrogênio, sais inorgânicos, e se necessário, nutrientesorgânicos de traço, como um aminoácido ou uma vitamina. Ambos um meiosintético ou um meio natural pode ser usado. A fonte de carbono e a fonte denitrogênio pode ser qualquer substância desde que possa ser utilizada pelacepa escolhida.

Açúcares como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose,manose, galactose, hidrolisado de amido, e melaços podem ser usados como afonte de carbono, e um ácido orgânico como ácido acético ácido cítrico e umálcool como etanol também pode ser usado sozinho ou em combinação comoutra fonte de carbono. Como uma fonte de nitrogênio, um sal de amôniocomo amônia, sulfato de amônia, carbonato de amônio, cloreto de amônio,fosfato de amônio, ou acetato de amônio, ou um sal nitrato pode ser usado.Como nutrientes orgânicos de traço, um aminoácido, uma vitamina, um ácidograxo, e um ácido nucleico, assim como peptona, ácido casamino, extratos delevedura, hidrolisado de soja contendo estes nutrientes podem ser usados e, nocaso de usar uma cepa mutante auxotrófica nutriente, que requer umaminoácido ou outros para crescimento, os nutrientes requeridos sãosuplementados. Um sal de fosfato, um sal de magnésio, um sal de cálcio, umsal de ferro, um sal de manganês, ou outros podem ser usados como o salinorgânico.A cultura é preferivelmente realizada com aeração enquantoajustando a temperatura de fermentação a 20 a 45 0C e o pH a 3-9. Se o pHfor abaixado durante a cultura, o meio é neutralizado por adição de carbonatode cálcio ou um alcalino como gás de amônia ou outros. A cultura é realizadasob tais condições preferivelmente durante cerca de 10 a 120 horas, assim,uma quantidade grande de L-aminoácido é capaz de se acumular no meio decultura.

Quando produzir ácido L-glutâmico, a cultura pode serrealizada usando um meio líquido que é ajustado para as condiçõesapropriadas para produzir ácido L-glutâmico, enquanto ao mesmo tempoprecipitando o ácido L-glutâmico no meio. Exemplos de tais condiçõesincluem uma faixa de pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente de pH 4,5 a 4,0, maispreferivelmente de pH 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente de pH 4,0(EP 1078989 A).

O L-aminoácido pode ser coletado do meio de cultura pormétodos de coleção conhecidos. Por exemplo, o L-aminoácido pode sercoletado por remoção das células bacterianas do meio de cultura, seguido porconcentração e cristalização, cromatografia de troca iônica, ou outros. Quandocultivando sob condições para precipitar o ácido L-glutâmico, o ácido L-glutâmico pode ser coletado por centrifugação, filtração, ou outros. Nestecaso, o ácido L-glutâmico que é dissolvido no meio pode ser tambémcristalizado e então coletado.

EXEMPLOS

Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita porreferência aos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1: Construção da cepa amplificada por gene pta de ATCC13 869

Uma cepa em que o gene sucA é interrompido, e um mutanteyggB é introduzido, foi usada como uma cepa parental para amplificar umgene pta. Esta cepa pode ser construída pelos seguintes métodos.(1-1) Construção de uma cepa em que o gene sucA foi interrompido

Uma cepa em que o gene sucA foi interrompido(ATCC13 869Asuc A) foi construída como a seguir.

A interrupção do gene sucA codificando a subunidade Elo deα-cetoglutarato desidrogenase foi realizada usando pBS3, que transporta ogene sacB que codifica levansucrase, de acordo com o método descrito emWO 2005/113745 e 2005/113744.

Um fragmento de gene que é derivado da cepa C. glutamicumATCC13 869 e em que o ORF do gene sucA foi deletado, foi obtido pelométodo PCR de sobreposição, usando DNAs sintético projetados com base naseqüência de nucleotídeos conhecida do gene sucA (SEQ ID NO: 30) de C.glutamicum ATCC13032 (banco de dados Genbank, número de acessoNC 003450) como iniciadores. Especificamente, PCR foi realizado por ummétodo convencional usando um DNA cromossômico de cepa C. glutamicumATCC13869 como um gabarito e usando DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 1e 2 como iniciadores, para assim obter um produto amplificadocorrespondente para a região N-terminal do gene sucA. Para obter um produtoamplificado correspondente para a região C-terminal do gene sucA, PCR foirealizado usando o DNA cromossômico da cepa C. glutamicum ATCC13 869como um gabarito, e usando DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 3 e 4 comoiniciadores. SEQ ID NOS: 2 e 3 são complementares um para o outro, e sãoprojetados para amplificar o gene sucA que tem ORF completo deletado.

Subseqüentemente, para obter um fragmento de gene sucA emque a seqüência interna é deletada, os produtos amplificados descritos acima,cada correspondendo para a região N-terminal e a região C-terminal do genesucA, foram misturados em quantidades molares aproximadamente iguais, ePCR foi realizado usando a mistura como gabaritos e usando DNAs sintéticosde SEQ ID NOS: 5 e 6 como iniciadores, para assim obter um produtoamplificado em gene sucA em que uma deleção de mutação foi introduzida. Oproduto PCR foi purificado por um método convencional, e então digeridocom BamHI5 seguido por inserção no sítio BamHI do pBS3 descrito acima. ODNA foi usado para transformar as células competentes de Escherichia coliJM109 (Takara Bio Inc.), e as células transformadas foram cultivadas durantea noite em uma placa LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal, e 25μg/ml de canamicina (Km). Colônias únicas de transformantes foram isoladaspor seleção das colônias brancas que apareceram. Os plasmídeos foramextraídos destes transformantes, e os contendo o produto PCR desejado foramchamados de pBS3AsucA.

O pBS3AsucA obtido em (A) acima não contém uma regiãoque permite a replicação autônoma em bactérias corineformes. Assim, quandouma bactéria corineforme é transformada com o plasmídeo, somentetransformantes contendo o plasmídeo integrado no cromossomo porrecombinação homóloga irão aparecer em uma freqüência baixa. A cepa C.glutamicum ATCC13 869 foi transformada com uma concentração elevada doplasmídeo pBS3AsucA pelo método de pulso elétrico, e as células foramaplicadas em uma placa CM-Dex (5 g/L de glicose, 10 g/L de polipeptona, 10g/L de extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,4 g/L de MgS04-7H20, 0,01g/L de FeSO4 TH2O, 0,01 g/L de MnS04-7H20, 3 g/L de uréia, 1,2 g/L dehidrolisado de soja, 10 μg/L de biotina, 15 g/L de ágar, o pH foi ajustado a 7,5com NaOH) contendo 25 μg/ml de canamicina, e cultivado a 31,5 0C durantecerca de 30 horas. Nas células que cresceram neste meio, o gene resistente acanamicina e o gene sacB do plasmídeo foram integrados no cromossomo porrecombinação homóloga entre o gene sucA do plasmídeo e o gene sucA nocromossomo da cepa ATCC13 869.

Subseqüentemente, os recombinantes de cruzamento único,que foram obtidos, foram cultivados a 31,5 0C durante a noite em meiolíquido CM-Dex não contendo canamicina e, após a diluição apropriada, ascélulas foram aplicadas a uma placa Dex-SlO contendo sacarose a 10% (100g/L de sacarose, 10 g/L de polipeptona, 10 g/L de extrato de levedura, 1 g/Lde KH2PO4, 0,4 de g/L MgS04-7H20, 0,01 g/L de FeS04-7H20, 0,01 g/L deMnS04-4H20, 3 g/L de uréia, 1,2 g/L de hidrolisado de soja, 10 μg/L debiotina, 15 g/L de ágar, o pH foi ajustado para 7,5 com KOH) não contendocanamicina, e cultivado a 31,5 0C durante cerca de 30 horas. Como umresultado, as cepas que foram insensíveis a sacarose devido à cura do genesacB pela segunda recombinação homóloga foram obtidas.

As cepas assim obtidas incluem uma em que o gene sucA foisubstituído pelo gene mutante derivado de pBS3AsucA, e uma em que o genesucA reverteu para o gene de tipo selvagem. Se o gene sucA é o gene mutanteou o gene de tipo selvagem pode ser facilmente confirmado ao se submeterdiretamente as células bacterianas obtidas por cultura a uma placa Dex-SlOpara PCR, e detectar o gene sucA. A análise foi realizada usando osiniciadores para amplificar o gene sucA por PCR (SEQ ID NOS: 5 e 6), e ascepas que foram determinadas para conter um produto PCR menor do que oproduto PCR usando DNA cromossômico da cepa ATCC13 869, como umgabarito. Neste modo, as cepas em que sucA é interrompido, foramselecionadas e usadas no seguinte experimento.

A capacidade de produzir ácido L-glutâmico das cepas em quesucA é interrompido foi avaliada pelo seguinte método. As cepas foramcultivadas em meio de placa CM-Dex, e cada uma das cepas em que o genesucA é interrompido, foi semeada em um frasco Sakaguchi contendo 20 ml deum meio contendo 30 g de glicose, 1 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSO4, 15 g de(NH4)2SO4, 0,01 g de FeS04-7H20, 0,01 g de MnS04-7H20, 13,7 ml dehidrolisado de soja, 200 μg de cloreto de tiamina, 300 μg de biotina, e 50 g deCaCOs em 1 L de água pura (o pH foi ajustado a 8,0 com KOH), seguido poragitação da cultura a 31,5 °C. Após a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha se acumulado no meio foi determinada, e a cepa queexibiu a produção de ácido L-glutâmico de maior rendimento foi selecionadae chamada de ATCC13 869AsucA.

(1-2) Introdução de um gene yggB mutante

Um gene yggB mutante preparado por inserção de IS(seqüência de inserção) no C-término do gene yggB foi introduzido na cepaATCC13 869Asuc A (Fig. 1). A seqüência de nucleotídeo do gene yggBmutante e a seqüência de aminoácido codificada assim são mostrados na SEQID NOS: 7 e 8, respectivamente. A cepa mutante introduzida no gene yggBfoi chamada de ATCC13 869AsucAyggB: :IS.

Alternativamente, a cepa em que o IS é inserido na região Ο-terminal do gene yggB também pode ser construída por amplificação de trêsfragmentos com PCR como a seguir.

Primeiro, PCR é realizado usando os oligonucleotídeos deSEQ ID NOS: 44 e 45 como iniciadores e o DNA cromossômico a partir dacepa ATCC13 869 como um gabarito, para assim obter um fragmento amontante do gene yggB. Outro PCR é realizado usando os oligonucleotídeosde SEQ ID NOS: 46 e 47 como iniciadores e o DNA cromossômico a partirda cepa ATCC13 869 como um gabarito, para assim obter o fragmento IS. Osoligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 45 e 46 são parcialmente complementaresum cada outro. A seguir, PCR é realizado usando quantidades molaresaproximadamente iguais destes produtos PCR como gabaritos e osoligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 44 e 47 como iniciadores, para assimpreparar um fragmento onde o fragmento yggB é inserido a montante do IS.

PCR é realizado usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS:48 e 49 como iniciadores e o DNA cromossômico a partir da cepaATCC13869 como um gabarito, para assim obter um fragmento a jusante dogene yggB. Os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 47 e 48 sãocomplementares um para cada outro. O fragmento yggB a jusante e ofragmento descrito acima compreendendo o fragmento yggB inserido amontante do IS são misturados em quantidades molares aproximadamenteiguais, e PCR é realizado usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 50 e51 como iniciadores, para assim obter um fragmento yggB em que o IS éinserido (yggB::IS). O fragmento é tratado com SacI e inserido no sítio SacIde pBS4S (WO 2005/113745 e 2005/113744), para assim construir umplasmídeo que pode ser usado para substituir o gene yggB em umcromossomo com o yggB::IS. A cepa ATCC13869 tem uma pluralidade deseqüências IS similares. Assim, para obter um gene yggB inserido com IScompletamente correspondendo à SEQ ID NO: 7, é necessário confirmar aseqüência de nucleotídeo do plasmídeo para determinar se o plasmídeo tem amesma seqüência. No entanto, diferenças em alguns nucleotídeos em umaregião derivada de IS não tem uma grande influência na função do gene yggBinserido com IS. O plasmídeo resultante é usado para substituir o gene yggBno cromossomo por um método convencional, resultando em uma cepa emque o IS é inserido no gene yggB cromossômico.(1-3) Construção de uma cepa amplificada em pta

Para construir uma cepa em que a expressão de um genefosfotransacetilase (pta) é melhorada, um gene da fosfotransacetilase (pta)derivado de cepa C. glutamicum ATCC13 869 foi amplificado por PCR eclonado no vetor bidirecional pVC7. pVC7 (US 20030134397) é construídopor inserção de um fragmento obtido por digestão de pAM330 (um plasmídeocríptico da cepa ATCC13 869 (No. de acesso no banco de dados do GenBankD00038)) com HindIII e terminação cega no sítio BsaAI de pHSG399(Takara Bio). PCR foi realizado usando DNAs sintéticos (SEQ ID NOS: 9 e10) projetados com base na seqüência de nucleotídeos conhecida do gene dafosfotransacetilase de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (No. deacesso no banco de dados do GenBank NC 003450, SEQ ID NO: 40), paraassim obter um fragmento de gene contendo o ORF completo do gene dafosfotransacetilase e sua região de promotor. Este produto PCR foi purificadopor um método convencional e digerido com BamH I e Kpn I, e inserido entreo sítio BamH Ieo sítio Kpn I em pVC7. Este plasmídeo foi usado paratransformar as células competentes de Escherichia coli DH5a (Takara BioInc.), e as células transformadas foram cultivadas durante a noite em umaplaca LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μ^πύ de X-Gal5 e 25 μ^πύ decloranfenicol (Cm). A seguir, colônias únicas de transformantes foramisoladas por seleção das colônias brancas que apareceram. Os plasmídeosforam extraídos a partir destes transformantes, e o plasmídeo contendo oproduto PCR objetivo foi selecionado e chamado de pVC7-pta.

(1-4) Confirmação de atividade melhorada de PTA na cepaATCC13 869AsucAyggB: :IS

A cepa ATCCl 3 869Asuc AyggB ::IS foi transformada compVK9. A transformação foi realizada pelo método de pulso elétrico, e ascélulas foram cultivadas a 31,5 0C durante cerca de 30 horas em uma placaCM-Dex contendo 25 μg/ml de canamicina. Esta cepa contendo o pVK9 foichamada de ATCC13869AsucAyggB::IS(pVK9).

pVK9 (patente US 20050196846) é um vetor bidirecional. Eleé construído por inserção de um fragmento obtido por digestão de pHK4 (JP-A-05-007491) com BamHI e KpnI e terminação cega (um fragmento capaz dereplicar automaticamente em bactérias corineformes), no sítio AvaIIterminado cego de pHSG299 (TAKARA BIO INC.).

Subseqüentemente, a cepa ATCC13869AsucAyggB::IS(pVK9) foi transformada separadamente com pVC7 (um plasmídeo decontrole) e pVC7-pta (um plasmídeo para amplificar PTA). A transformaçãofoi realizada pelo método de pulso elétrico, e as células foram cultivadas a31,5 0C durante cerca de 30 horas em uma placa CM-Dex contendo 25 μg/mlde canamicina e 5 μg/ml de cloranfenicol. As cepas em que os plasmídeosdescritos acima foram introduzidos foram chamadas deATCC13869AsucAyggB: :IS (pVK9, pVC7) e ATCC13869AsucAyggB::IS(pVK9, pVC7-pta), respectivamente.Para determinar a atividade de PTA destas cepas, uma soluçãode enzima bruta foi preparada pelo seguinte método. Primeiro, cada cepa foicultivada em um meio líquido CM-Dex a 31,5 °C. O OD 660 foi determinadousando um colorímetro digital Mini photo 518R Taitec, e a cultura foicontinuada até o OD alcançar 0,6 a 0,9, seguido por coleta das células. Asseguintes operações foram realizadas a 4 °C. As células foram lavadas comsolução Tris/HCl 50 mM (pH 7,0) duas vezes e então colocadas emsuspensão em um tampão (50 mM Tris/HCl (pH 7,0), 10 mM MgCl2, 1 mMEDTA, 1 mM DTT, e 30% (p/v) glicerol) a 4 g (peso úmido)/ml. As célulasforam homogeneizadas com um homogeneizador ultrassônico (Bioruptor) ecentrifugadas (15.000 g, 60 min). O sobrenadante foi usado como a soluçãode enzima bruta. Os procedimentos para quantificar o nível de proteína nasolução de enzima bruta são como a seguir. Cada solução de enzima bruta eBSA (albumina de soro bovino) com uma concentração conhecida (para criaruma curva de calibre) foi deixada reagir com uma solução de CBB (soluçãoCBB de teste de proteína Nacalai tesque) para revelar uma cor, e então aconcentração de proteína foi quantificada por determinar o OD 595 nmusando um aparelho para determinar as atividades enzimáticas (MolecularDevices, max de espectros 190).

Subseqüentemente, a atividade PTA foi determinada comreferência para o método conhecido (D. J. Reinscheid, S. Schnicke, D.Rittmann, U. Zahnow, H. Sahm e B. J. Eikmanns (1999) Micobiology. 145:503 - 513). Os procedimentos específicos são mostrados abaixo. A reaçãoenzimática foi iniciada por adição de uma solução de enzima bruta para asolução de reação de 100 mM de Tris/HCl (pH 7,6), 5 mM de MgCl2, 0,5 mMde cloridrato de L-cisteína, 20 mM de NH4Cl2, 1 mM de CoA, e 20 mM defosfato de acetila. A geração de acetil-CoA foi detectada por determinação doOD 232 nm usando um aparelho para determinar as atividades enzimáticas(Molecular Devices, spectra max 190), para assim determinar a atividade dePTA. Tabela 1 mostra que ATCC13869AsucAyggB::IS(pVK9, pVC7-pta)tem uma atividade de PTA maior como comparado à da cepa de controle.

[Tabela 1]

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Exemplo 2: Produção de ácido L-glutâmico pela cepaATCCl 3869AsucAyggB::IS melhorada em PTA

O efeito de melhorar a atividade de PTA sobre o rendimentode ácido L-glutâmico durante a fermentação foi avaliado por cultura da cepaATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9, pVC7) e cepaATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9, pVC7-pta) de C. glutamicum pelomesmo método como mostrado acima (1-1). Os resultados são mostrados natabela 2. O rendimento de ácido L-glutâmico pela cepa melhorada em PTAfoi verificado como sendo maior do que o da cepa de controle.

[Tabela 2]

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Exemplo 3: Produção de ácido L-glutâmico pela cepa em que as atividades dePTA e fosfocetolase são melhoradas

A seguir, o efeito combinado da atividade defosfotransacetilase melhorada e a atividade fosfocetolase melhorada emprodução de ácido L-glutâmico foi examinado.

Um plasmídeo de expressão de fosfocetolase foi construídocomo a seguir.

(A) Construção de pVK9-xfp

Para amplificar o gene da fosfocetolase (a informação deseqüência foi descrita: AY518213:gi:41056820) por PCR e inserir o gene novetor bidirecional pVK9 usado no exemplo 1, o DNA cromossômico foiextraído de Bifidobacterium animalis usando o kit de purificação WizardGenomic (Promega Corporation). PCR foi realizado usando um DNAcromossômico de B. animalis como um gabarito de DNAs sintéticos de SEQID NOS: 11 e 12 como iniciadores, para assim obter um fragmento de genecontendo o ORF completo do gene da fosfocetolase e sua região de promotor.Este produto PCR foi purificado por um método convencional e entãodigerido com Xba I, seguido por inserção no sítio Xba I de pVK9. As célulascompetentes de Escherichia coli DH5a (Takara Bio Inc.) foramtransformadas com este DNA, e as células transformas foram cultivadasdurante a noite em uma placa LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal, e 25 μg/ml de Km. A seguir, as colônias únicas de transformantes foramisoladas por seleção das colônias brancas que apareceram. Os plasmídeosforam extraídos dos transformantes, e os contendo o produto PCR desejadoforam selecionados e chamados de pVK9-xfp.(B) Construção de pVK9-PS2_xfp

O método PCR de sobreposição (R. M. Horton, H. D. Hunt, S.N. Ho, J. K. Pullen, e L. R. Pease (1989) Gene 77: 61 - 68) foi realizado paraobter um fragmento de DNA em que uma região do promotor do gene dafosfocetolase de B. animalis foi substituída com o promotor PS2.Especificamente, PCR foi realizado usando pPSTGl (Y. Kikuchi, M. Date, K.Yokoyama, Y. Umezawa, e H. Matsui (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:358 - 366) como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 13 e 14como iniciadores, para assim obter um produto amplificado do promotor PS2.Outro PCR foi realizado usando pVK9-xfp como um gabarito e DNAssintéticos de SEQ ID NOS: 15 e 16 como iniciadores, para assim obter umproduto amplificado do gene da fosfocetolase de B. animalis. Os iniciadoresde SEQ ID NOS: 14 e 16 são complementares um a cada outro. A seguir, paraobter um fragmento onde o promotor PS2 é inserido a montante do gene dafosfocetolase de B. animalis, o promotor PS2 e o produto de gene dafosfocetolase de Β. animalis foram misturados em quantidadesaproximadamente iguais, e o PCR foi realizado usando a mistura comogabaritos e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 12 e 17 como iniciadores. Esteproduto PCR foi purificado por um método convencional e então digeridocom Xba I, seguido por inserção no sítio Xba I de pVK9. O DNA foi usadopara transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (Takara BioInc.), e as células transformadas foram cultivadas durante a noite em umaplaca LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal, e 25 μg/ml de Km.A seguir, as colônias únicas de transformantes foram isoladas por selecionaras colônias brancas que apareceram. Os plasmídeos foram extraídos destestransformantes, e os contendo o plasmídeo tendo o produto PCR desejadoforam selecionados e chamados de pVK9-PS2_xfp.

(C) Produção de ácido L-glutâmico usando uma cepa com atividadesmelhoradas de PTA e de fosfocetolase

Cepa de C. glutamicum ATCC13 869AsucAyggB: :IS foitransformada com pVK9_PS2_xfp de acordo com o método descrito acima,para assim obter uma cepa transformante, que foi chamada deATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9_PS2_xfp). A seguir, a cepaATCC13869AsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp) foi transformadaseparadamente com pVC7 (um plasmídeo para controle) e pVC7-pta (umplasmídeo para amplificar PTA) e as cepas transformadas foram chamadas deATCC13 869AsucAyggB: :IS(p VK9_PS2_xfp, pVC7) eATCC13869AsucAyggB: :IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7-pta), respectivamente.

As cepas de C. glutamicum ATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9, pVC7), ATCC13 869Asuc AyggB:: IS(p VK9, pVC7-pta),ATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7), e deATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9_PS2_xfp, pVC7-pta) foram cultivadas deacordo com o método de (1-1) de exemplo 1. Os resultados são mostrados natabela 3. O rendimento de ácido L-glutâmico da cepa tendo tanto umaatividade melhorada de PTA como de fosfocetolase foi verificado como sendomaior como comparado para as cepas em que uma dentre PTA oufosfocetolase foi melhorada.

[Tabela 3]

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Exemplo 4: Construção de uma cepa em que a atividade de PTA é melhoradapor interrupção de um gene ramB que codifica um fator de transcrição, eavaliação de seu efeito

Sabe-se que a expressão do gene PTA é negativamenteregulada pelo fator de transcrição RamB, e a atividade PTA é aumentada emuma cepa deficiente em gene ramB (Journal of Bacteriology May 2004 2798 -2809). Assim, uma cepa deficiente em ramB é construída, e seus efeitos sobreo rendimento de ácido L-glutâmico durante fermentação são examinados.(4-1) Clonagem de um fragmento para interrupção do gene ramB

Um gene ramB é interrompido usando pBS5T, que é umplasmídeo sensível a temperatura transportando o gene sacB (WO2005/113745 e WO 2005/113744). Um fragmento de gene que é derivado dogene ramB da cepa ATCC13869 e tem uma deleção no ORF do gene ramB éobtido pelo método PCR de sobreposição usando DNAs sintéticos projetadoscom base na seqüência de nucleotídeos conhecida do gene deCorynebacterium glutamicum ATCC13032 (número de acesso no Genbank debanco de dados NC 003450, a seqüência de nucleotídeo de gene ramB e aseqüência de aminoácido codificada assim são mostradas em SEQ ID NOS:36 e 37, respectivamente) como iniciadores. Especificamente, o PCR érealizado por uso do DNA cromossômico de cepa C. glutamicumATCC13869 como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 19 e 20como iniciadores, para assim obter um produto amplificado correspondentepara a região N-terminal do ramB. Outro PCR é realizado para amplificar umfragmento correspondente para a região C-terminal do gene ramB, usando oDNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito e DNAssintéticos de SEQ ID NOS: 18 e 21 como iniciadores. Os DNAs de SEQ IDNOS: 18 e 19 são complementares a cada outro, e eles são projetados demodo que um gene ramB mutante que está faltando no ORF completo éamplificado. Subseqüentemente, para obter o fragmento de gene ramBmutante faltando uma seqüência interna, os produtos amplificados descritosacima correspondendo à região N-terminal e à região C-terminal do generamB são misturados em quantidades molares aproximadamente iguais, e oPCR é realizado usando a mistura como gabaritos e usando DNAs sintéticosde SEQ ID NOS: 22 e 23 como iniciadores. Este produto PCR é purificadopor um método convencional, e então digerido com Xba I, seguido porinserção no sítio Xba I do pBS5T descrito acima. As células competentes deEscherichia coli DH5a (Takara Bio Inc.) são transformadas com este DNA, eas células são cultivadas durante a noite em meio LB contendo 100 μΜ deIPTG, 40 μg/ml de X-Gal, e 25 μg/ml de Km. A seguir, as colônias únicas detransformantes são isoladas por seleção das colônias brancas que aparecem.Os plasmídeos são extraídos destes transformantes, e os contendo o PCRdesejado são selecionados e chamados de pBS5T-ramB.

(4-2) Construção de uma cepa em que o gene ramB é interrompido

Primeiro, cepa ATCC13 869AsucAyggB: :IS é transformadapelo método de pulso elétrico com uma concentração elevada de pBS5T-ramB, e as células transformadas são cultivadas a 25 0C durante cerca de 60horas em uma placa CM-Dex contendo 25 μg/ml de canamicina. Estetransformante é cultivado com agitação a 34 0C durante a noite em um meiolíquido CM-Dex e após diluição apropriada, as células são cultivadas a 34 0Cdurante cerca de 30 horas em meio CM-Dex contendo 25 μg/ml decanamicina.

Na cepa que cresceu neste meio, o gene resistente acanamicina e o gene sacB derivado do plasmídeo são integrados nocromossomo por recombinação homóloga entre o gene ramB mutante doplasmídeo e o gene ramB no cromossomo da cepaATCC13 869AsucAyggB: :IS.

A seguir, estes recombinantes de cruzamento único sãocultivados a 31,5°C durante a noite em meio líquido CM-Dex não contendocanamicina e, após diluição apropriada, as células são cultivadas a 34°Cdurante cerca de 30 horas em 10% de meio Dex-SlO contendo sacarose (100g/L de sacarose, 10 g/L de polipeptona, 10 g/L de extrato de levedura, 1 g/Lde KH2PO4, 0,4 g/L de MgS04-7H20, 0,01 g/L de FeS04-7H20, 0,01 g/L deMnS04*4H20, 3 g/L de uréia, 1,2 g/L de hidrolisado de soja, 10 μg/L debiotina, 2 g/l de acetato de sódio, pH 7,5 (KOH)) sem canamicina. Como umresultado, são obtidas as cepas que são insensíveis a sacarose devido à cura dogene sacB pela segunda recombinação homóloga.

As cepas assim obtidas incluem uma em que o gene ramB ésubstituído pelo gene mutante derivado de pBS5T-ramB, e uma em que ogene ramB reverte para o gene de tipo selvagem. Se o gene ramB for o genemutante ou o gene de tipo selvagem pode ser confirmado submetendo-sediretamente as células bacterianas obtidas por cultura em um meio ágar Dex-SlOa PCR. Uma cepa tendo somente o gene ramB mutante é selecionada echamada de ATCC13869AsucAyggB::ISAramB.

(4-3) A produção de ácido L-glutâmico usando a cepa em que o gene ramB éinterrompido

ATCC13869AsucAyggB: :ISAramB é transformado com pVK9(um plasmídeo para controle) e pVK9_PS2_xfp (um plasmídeo paraamplificar o gene da fosfocetolase (PKT) separadamente. A transformação érealizada pelo método de pulso elétrico, e as células são cultivadas a 31,5 0Cdurante cerca de 30 horas em uma placa CM-Dex contendo 25 μ§/ηι1 decanamicina. As cepas introduzidas no plasmídeo são chamadas deATCC13 869AsucAyggB: :ISAramB(pVK9) e

ATCC13 869Asuc AyggB: :ISAramB(pVK9_PS2_xfp),respectivamente. Estas cepas são avaliadas por cultura de acordo com ométodo de (1-1) de exemplo 1 junto com a cepa ATCC13 869AsucAyggB::IS(pVK9) e a cepa ATCC13869AsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp) construídasno exemplo 1. Este procedimento confirma a melhora do rendimento do ácidoL-glutâmico por interrupção do gene ramB e por uma combinação deinterrupção do gene ramB e melhora do PKT.

Exemplo 5: Construção de uma cepa melhorada em atividade de PTA pormodificação de um promotor do gene pta e avaliação do efeito

A atividade PTA pode ser melhorada por modificação de umpromotor do gene pta. Sabe-se que um promotor de gene pta tem duas regiõesque estão envolvidas, como se pensa, na regulação negativa mediada porRamB que afeta a atividade de PTA (J Bacteriol. 2004 May; 186(9): 2798 -2809.). Assim, as cepas que são modificadas em somente um dos sítios deligação de RamB no promotor pta ou ambos dentre os sítios de ligação RamBno promotor pta, são construídas para examinar o efeito no rendimento defermentação de ácido L-glutâmico.

(5-1) Construção de plasmídeos para mutação do promotor pta, pBS5T-mlPTA, pBS5T-m2PTA, PBS5T-mlm2PTA

Um fragmento de gene contendo a região de ORF e a regiãodo promotor do gene pta derivado de ATCC13 869 é obtido por PCR usandoDNAs sintético projetado com base na seqüência de nucleotídeos conhecidado gene de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (número de acesso noGenbank de banco de dados NC_003450). Especificamente, para amplificar aregião do promotor do gene de pta, PCR é realizado usando o DNAcromossômico de cepa de C. glutamicum ATCC13 869 como um gabarito eDNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 24 e 25 como iniciadores. Este produto dePCR é purificado por um método convencional e digerido com Xba I, seguidopor inserção na região Xba I de pUC19 (Takara Bio Inc.). As célulascompetentes de Escherichia coli DH5a (Takara Bio Inc.) são transformadascom o DNA, e cultivadas durante a noite em meio LB contendo 100 μΜ deIPTG, 40 μg/ml de X-Gal5 e 50 μg/ml de Amp. A seguir, as colônias únicas detransformantes são isoladas por seleção das colônias brancas que aparecem.Os plasmídeos são extraídos destes transformantes, e os contendo o produtoPCR desejado são selecionados e chamados de pUC19-PTA.

A seguir, uma mutação é introduzida na região do promotorpta usando kits de mutagenese sítio-dirigida (STARATAGENE). O PCR érealizado usando pUC19-PTA como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQID NOS: 26 e 27 como iniciadores de acordo com o manual fornecido com oskits, que resulta em um plasmídeo tendo uma mutação em um dos primeirossítios de ligação RamB. Este plasmídeo é chamado de pUC19-mlPTA.

A seguir, PCR é realizado usando pUC19-mlPTA como umgabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 24 e 25 como iniciadores, paraassim obter um produto amplificado contendo a região de promotor do genepta tendo a mutação. Este produto PCR é purificado por um métodoconvencional e inserido na região de SmaI descrita acima de pBS5T. Ascélulas competentes de Eseheriehia coli DH5a (Takara Bio Inc.) sãotransformadas com este DNA, e as células são cultivadas durante a noite emmeio LB contendo 100 μΜ de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal, e 25 μg/ml de Km.A seguir, as colônias únicas de transformantes são isoladas por seleção dascolônias brancas que aparecem. Os plasmídeos são extraídos destestransformantes, e a análise de seqüência confirma que o plasmídeo tem amutação desejada sem erros de seqüência em outros nucleotídeos. Assim, oplasmídeo é chamado de pBS5T-mlPTA.

No mesmo modo, um plasmídeo tendo uma mutação nosegundo sítio de ligação RamB é construído realizando-se PCR usando DNAssintéticos de SEQ ID NOS: 28 e 29, e então inserindo a seqüência desejadaem pBS5T. Este plasmídeo é chamado de pBS5T-m2PTA. Além disso, umplasmídeo tendo mutações em ambos os sítios de ligação de RamB éconstruído pelos mesmos procedimentos como descritos acima e chamado depBS5T-mlm2PTA.

(5-2) Construção de cepas abrigando o gene pta modificado no promotor

Cepas tendo promotores de PTA modificados são obtidas decepa ATCC13 869AsucAyggB: :IS de acordo com o método de exemplo 4. Amutação é confirmada por análise da seqüência da região dopromotor. As cepas com sítios de ligação de RamB modificados nopromotor pta são chamadas de ATCC13 869AsucAyggB: :ISm 1,ATCC13869AsucAyggB: :ISm2, e ATCC13 869AsucAyggB: :ISm 1 m2.(5-3) Produção de ácido L-glutâmico por uso das cepas abrigando o gene ptamodificado no promotor

A cepa ATCC13869AsucAyggB::ISml, a cepaATCC13869AsucAyggB: :ISm2, e a cepa ATCC13 869AsucAyggB: :ISm 1 m2são cada transformadas com pVK9 (um plasmídeo de controle) epVK9_PS2_xfp (um plasmídeo para amplificar PKT). A transformação érealizada pelo método de pulso elétrico, e as células transformadas sãocultivadas a 31,5 0C durante cerca de 30 horas em uma placa CM-Dexcontendo 25 μg/ml de canamicina. Estes cepas são chamadas deATCC13 869Asuc Ay ggB: :ISm 1 (pVK9),ATCC13 869AsucAyggB: :ISm 1 (pVK9_PS2_xfp),ATCC13 869AsucAyggB: :ISm2(pVK9),ATCC13 869AsucAyggB: :ISm2(pVK9_PS2_xfp),ATCC13 869Asuc AyggB: :ISm 1 m2(pVK9), e

ATCC13869AsucAm 1 m2(pVK9_PS2_xfp), e são avaliadas por cultura deacordo com o método de exemplo 1 junto comATCC13869Asuc AyggB: :IS(pVK9) e ATCC13869AsucA(pVK9_PS2_xfp),construídos no exemplo 1. A melhora do rendimento de ácido L-glutâmicopela modificação do promotor pta e a combinação da modificação dopromotor de PTA e a melhora de PKT são confirmadas.

Exemplo 6

Construção de uma cepa em que a melhora de PTA é combinada com amelhora de enzimas de via anaplerótica

A fim de avaliar o efeito de da melhora combinado de PTA efosfoenolpiruvato carboxilase (PPC) ou piruvato carboxilase (PC), as cepascom atividades melhoradas de PTA e PPC ou atividades melhoradas de PTA ePC são construídas.

(6-1) Construção do plasmídeo expressando ppc pVC-PPC

O plasmídeo expressando ppc é construído como a seguir. Ogene ppc é amplificado realizando o PCR usando oligonucleotídeos sintéticosde SEQ ID NOS: 58 e 59 como iniciadores e o DNA cromossômico de cepade C. glutamicum ATCC 14067 como um gabarito. O DNA amplificado éterminado cego e inserido no sítio SmaI de pHSG399 (TAKARA BIO INC.),para assim obter um plasmídeo pPCF. Então, a fim de remover a região amontante da região de codificação do gene ppc, pPCF é digerido com DraI eSalI, e o fragmento obtido é inserido no sítio SmaI de pHSG398 (TAKARABIO INC.) para obter um plasmídeo tendo o gene ppc inserido na direçãoreversa com relação ao gene IacZ, e é chamado de pPCFds. Então, umfragmento de DNA contendo um promotor de aspartoquinase e uma regiãocapaz de replicar autonomamente em bactéria corineforme é preparada pordigestão de p399AKYB (JP6-62866) com PstI e ApaI e então terminado cego,e o fragmento obtido é inserido no pPCFds que foi digerido com SalI eterminado cego, para ligar o promotor aspartoquinase a montante do geneppc. Um plasmídeo em que o promotor de aspartoquinase e o gene ppc sãoligados na mesma direção foi selecionado e chamado de ρAKPFds. A regiãoem pAKPFds envolvida em replicação autônoma em bactéria corineforme éderivada de pHM1519, porque a região de replicação autônoma depVK9JPS2_xfp, e assim, pAKPFds não podem co-existir compVK9_PS2_xfp em bactéria corineforme. Assim, PCR é realizado por usooligonucleotídeos sintéticos de SEQ ID NOS: 60 e 61 como iniciadores epAKPFds como um gabarito, e o fragmento amplificado é digerido com KpnIe inserido no sítio KpnI de pVC7 (JP2000-201692), que contém uma regiãode replicação autônoma de pAM330. O plasmídeo obtido foi chamado depVC-PPC.

(6-2) Construção de uma cepa em que o gene pta e o gene ppc sãoamplificados, e uma cepa em que o gene pta e o gene pc são amplificadospVC7 (controle), pVC-PPC, ou pBPYC6 (plasmídeoexpressando o gene pc: JP2000-201692) é usado para transformarATCC13 869AsucAyggB: :IS(pVK9) (ver exemplo 2),ATCC13 869AsucA(pVK9_PS2_xfp) (ver exemplo 3), eATCC13869Asuc AyggB:: IS ml(pVK9), ATCC13869AsucAyggB::ISm 1 (pVK9_PS2_xfp), ATCCl 3 869Asuc AyggB ::IS m2(pVK9),ATCC13 869AsucAyggB: :IS m2(pVK9_PS2_xfp),ATCC13869AsucAyggB::IS mlm2(pVK9), e ATCC13869AsucAyggB::ISmlm2(pVK9_PS2_xfp) (ver exemplo 5). Estes transformantes são cultivadose a produção de ácido L-glutâmico é avaliada de acordo com o método de (1-1) de exemplo 1. Assim, a melhora da produção de ácido L-glutâmico éconfirmada por combinação da modificação do promotor pta com a melhorade PC ou PPC, ou por combinação da modificação do promotor pta com amelhora de PKT e PC ou PPC.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

O método de produção da presente invenção permite aprodução eficiente de L-aminoácidos como ácido L-glutâmico, L-glutamina,L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelofato de compreender cultivar uma bactéria produzindo L-aminoácido que foimodificada para ter uma a atividade melhorada de fosfotransacetilase em ummeio, e coletar o L-aminoácido a partir do meio ou da bactéria.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a atividade de fosfotransacetilase é melhorada por aumento donúmero de cópias do gene codificando fosfotransacetilase, ou por modificaçãode uma seqüência reguladora de expressão do gene codificandofosfotransacetilase.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o gene codificando fosfotransacetilase é um DNA selecionadodentre o grupo consistindo de:(a) um DNA compreendendo nucleotídeos 1214 a 2641 deSEQ ID NO: 34 ou a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 40; e(b) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeoque é complementar para a seqüência de nucleotídeo de nucleotídeos 1214 a- 2641 de SEQ ID NO: 34, ou a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40,em que referido DNA hibridiza sob condições estringentes e codifica umaproteína que tem atividade de fosfotransacetilase.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a atividade de fosfotransacetilase émelhorada por interrupção de gene ramB.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria é ainda modificada de modo queuma atividade é melhorada de uma proteína selecionada dentre o grupoconsistindo de D-xilose 5-fosfato-fosfocetolase, frutose 6-fosfatofosfocetolase, e combinações das mesmas.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a- 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria é ainda modificada para melhorara atividade de piruvato carboxilase.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria é ainda modificada para ter umaatividade melhorada de fosfoenolpiruvato carboxilase.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada dentre o grupoconsistindo de uma bactéria corineforme, bactéria Pantoea, bactériaEnterobacter, e bactéria Escherichia.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é selecionado dentre o grupoconsistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, e L-cisteína.