BRPI0620888A2

BRPI0620888A2 - terapia de combinação usando anticorpos anti-egfr e anti-her2

Info

Publication number: BRPI0620888A2
Application number: BRPI0620888-6A
Authority: BR
Inventors: Stephen D Gillies; David Azria; Christel Larbouret; Andre Pelegrin
Original assignee: Merck Patent Gmbh; Ct Regional De Lutte Contre Le Cancer; Univ Montpellier I; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2011-11-29
Also published as: EP1968633B1; AU2006332212B2; WO2007076923A1; US20150132308A1; AU2006332212A1; EP1968633B2; CA2636074A1; US9522956B2; KR20080110987A; AR059127A1; MX2008008564A; CN101365486A; US20090214541A1; ZA200806723B; EA015173B1; CN101365486B; EA200870141A1; AU2006332212B8; JP2009522316A; EP1968633A1

Abstract

TERAPIA DE COMBINAçãO USANDO ANTICORPOS ANTI-EGFR E ANTI-HER2. A invenção refere-se ao uso combinado de anticorpos anti-EGFR e anticorpos anti-HER2 para o tratamento de câncer, especialmente adequado para câncer que expressa altos níveis do tipo EGFR e baixos níveis de HER2. A invenção refere-se em particular, a anticorpo monoclonal "trastuzumab (HERCEPTIN<32>) direcionado contra os receptores de HER2 cuja eficácia pode ser significativamente aumentada in vivo quando combinada com anticorpo monoclonal "matuzumab" (hmAB 425, EMD 72000) direcionado contra os receptores de EGF. O tratamento de combinação é adequado para pacientes que sofrem de câncer apresentando o perfil de receptor, preferencialmente câncer pancreático.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA DE COMBINAÇÃO USANDO ANTICORPOS ANTI-EGFR E ANTI-HER2".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao uso combinado de um anticor- po anti-EGFR (ErbBI) e um anticorpo anti-Her2 (ErbB2) para o tratamento de câncer. A invenção além disso refere-se ao tratamento de tumor em um indivíduo como os ditos anticorpos, em que as células do tumor expressam altos níveis do tipo EGFR e baixo ou nenhum nível significativo de HER2. Em particular, a presente invenção refere-se ao tratamento de combinação usando anticorpo monoclonal "trastuzumab" (HERCEPTIN®) direcionado contra o receptor HER2 e "matuzumab" (hmAb 425, EMD 72000) direciona- do contra o receptor EGF1 ou um outro anticorpo anti-EGFR. O tratamento de combinação é preferencialmente adequado a pacientes que sofrem de um câncer, cujo tecido não superexpressa HER2 ou expressa HER2 em bai- xas quantidades, mas superexpressa EGFR.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Subclasse I da superfamília do receptor tirosina quinase (RTK) consiste em receptores de ErbB e compreende quatro membros: EG- FR/ErbB1, HER2/ErbB2, ErbB3 e ErbB4. Todos os membros apresentam uma região de ligação de ligando extracelular, uma única região que atra- vessa a membrana e um domínio contendo tirosina-quinase citoplásmica. Tirosina-quinases é uma classe de enzimas que catalisa a transferência do fosfato terminal de trifosfato adenosina para resíduos de tirosina em substra- tos de proteína.

Os receptores de ErbB são expressos em vários tecidos de ori- gem epitelial, mesenquimatosa e neuronal. Sob condições normais, ativação dos receptores de ErbB é controlada pela expressão espacial e temporal de seus ligandos, os quais são membros da família de fatores de crescimento de EGF. Ligação de ligando a receptores ErbB induz a formação de homo e heterodímeros receptores e ativação do domínio quinase intrínseco, resul- tando na fosforilação em resíduos de tirosina quinase específicos na cauda citoplásmica. Esses resíduos fosforilados funcionam como sítios de acopla- mento de várias proteínas, cujo recrutamento leva à ativação de vias de si- nalização intracelular.

Sabe-se que EGFR e HER2 desempenham um papel essencial na regulação de proliferação e diferenciação celular. Eles apresentam uma forte tendência de agrupar-se com outros receptores de HER em homo e/ou heterodímeros sob fator de ligação de crescimento extracelular, os quais resultam em várias formas de ativação de vias de transdução de sinais, le- vando a apoptose, sobrevivência, ou proliferação celular. Evidência de mon- tagem sugere que não apenas expressão de receptores ou superexpressão de receptores, mas também comunicação entre receptores HER desempe- nha um papel crucial no comportamento tumoral (Kumagai e outros, 2001, PNAS 98, 5526). Em particular, ligação de Iigandos específicos a receptores ao ectodomínio de EGFR freqüentemente resulta no recrutamento de HER2, como o parceiro de heterodimerização preferido (por exemplo, Klapper e outros, 1999, PNAS 96, 4995). Como HER2 é o único membro da família HER que não se liga a um ligando específico conhecido, sua principal função biológica, como um transdutor de sinal, parece resultar de sua participação nos complexos de receptores heterodiméricos com EGFR ou outros recepto- res de HER (por exemplo, Konecny e outros, 2006, CancerRes., 96, 1630).

Estudos recentes (J. Schlessinger, 2002, Cell 110, 669) mostram que dimerização de receptores é mediada por interações de receptor- receptor em que um Ioop que se projeta de receptores adjacentes media dimerização e ativação de receptores. Dimerização de receptores é essenci- al para estimulação da atividade catalítica intrínseca e para a autofosforila- ção de receptores de fator de crescimento em resíduos de tirosina.

Deve-se observar que proteínas tirosina quinases de receptores são capazes de sofrer tanto homodimerização quanto heterodimerização, em que combinações de receptores homodiméricas são menos mitogênicas e transformantes (nenhuma ou fraca iniciação de sinalização) do que as combinações heterodiméricas correspondentes. Heterodímeros contendo ErbB2 são os complexos mais potentes (Yarden e Sliwkowski, 2001, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, volume 2, 127 - 137; Tzahar e Yarden, 1998, BBA 1377, Μ25-Μ37).

Dois tipos importantes de inibidor de ErbB estão em uso clínico: anticorpos quiméricos, humanizados ou totalmente humanos direcionados contra o domínio extracelular de EGFR ou ErbB2, e inibidores de tirosina- quinase de molécula pequena (TKIs) que competem com a ATP no domínio tirosina-quinase do receptor.

O uso de ligação de mAbs com alta afinidade a esses dois membros da família ErbB (HER), EGFR e HER2, desse modo parece ser racional para o desenvolvimento de novas estratégias de terapia de câncer que apresentaria o potencial de inibir a dimerização do receptor. Até o mo- mento, contudo, cada um dos dois mAbs têm sido usado na terapia de cân- cer individualmente em conjunto com várias drogas quimioterapêuticas (S- lamon e outros, 2001, New EngL J. Med. 344, 783; Baselga e outros, 2000, J. Clin. Oncol. 18, 904) ou mais recentemente em associação com diferentes fármacos que apresentam propriedades inibidoras de receptores tirosina quinase (por exemplo, Normanno e outros, 2002, Ann. Oncol. 18, 65). A a- ção de pequenas moléculas de inibidor tirosina quinase, contudo, não pode ser comparada com a atividade biológica potencial induzida pela ligação de uma molécula de anticorpo de alto peso molecular.

O mecanismo de atividade antitumoral de mAbs de receptor anti- ErbB/HER de indivíduo não é totalmente entendido. Uma série de resultados experimentais em camundongos KO em relação a receptor Fc fortemente sugeriu que a maioria do efeito antitumoral foi devido ao recrutamento de células NK efetuadoras mediante um mecanismo citotóxico mediado por cé- lulas dependentes de anticorpos (ADCC). Contudo, a evidência de inibição de fosforilação de receptores e internalização de receptores induzida em células tumorais pelo mAbs de receptores ErbB/HER argumenta em favor de um sinal apoptótico ou citostático traduzido por meio do receptor (por exem- plo, Friedman e outros, 2005, PNAS 102,1915).

Há diversos anticorpos anti-HER/ErbB em estudos clínicos e já aprovados e no mercado, por exemplo, matuzumab, cetuximab, panitumu- mab e trastuzumab. Anticorpo monoclonal humanizado 425. também designado co- mo matuzumab (hMAb 425 US 5.558.864; EP 0531 472) e anticorpo mono- clonal quimérico 225 (cMAb 225), ambos direcionados ao receptor EGF1 têm mostrado sua eficácia em ensaios clínicos.

O anticorpo c225 (cetuximab, ERBITUX®) que demonstrou inibir crescimento celular tumoral mediado por EGF in vitro e inibir tumores color- retais humanos in vivo

recebeu aprovação marcada em 2003. O anticorpo, bem como em geral to- dos os anticorpos anti-EGFR, parecem agir, acima de tudo, em sinergia com certos agentes quimioterapêuticos (isto é, doxorrubicina, adriamicina, taxol e cisplatina) para erradicar tumores humanos in vivo em modelos xenoenxerto murino (por exemplo, EP 0667165). Além disso, pode-se mostrar que a combinação do anticorpo anti-EGFR c225 com o segundo anticorpo anti- EGFR matuzumab mostra um efeito sinérgico em modelos in vitro, indicando que esses dois anticorpos direcionados ao mesmo receptor ligam-se a dife- rentes epítopos de EGFR (WO 2004/032960).

Verificou-se adicionalmente que o anticorpo 4D5 de camundon- go direcionado à HER2/ErbB2 sensibiliza linhagens de células de tumor de mama que expressam ErbB2 aos efeitos citotóxicos de TNF-α (US 5.677.171). Uma versão humanizada recombinante, designada como hu- MAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab ou HERCEPTIN® (US 5.821.337) é clinicamente ativa em pacientes com câncer de mama metastático superex- pressando ErbB2 que receberam terapia anticancerígena extensiva anterior (Baselga e outros, J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). HERCEPTIN® rece- 25 beu aprovação no mercado em 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores superexpressam a proteína ErbB2.

Embora, conforme estabelecido acima, a eficácia terapêutica de trastuzumab em carcinoma de mama é bem-demonstrada, é estritamente limitada e apenas aprovada por 30% de pacientes com câncer de mama cujo tumor superexpressa HER2. 70% dos pacientes com câncer de mama não ou insuficientemente respondem a trastuzumab porque seu tumor individual não superexpressa ou não suficientemente expressa HER2. Em outros cân- ceres e ou cânceres individuais, HER2 é superexpresso em uma porcenta- gem significativa de casos que variam de 43 - 69%, visto que EGFR é usu- almente superexpresso em uma faixa de 45 - 95%. Contudo, geralmente, os níveis de expressão de HER2 são em principal baixos na maioria de tumo- res. Além disso, a superexpressão de receptores de EGFR e HER2 é fre- qüentemente causada por amplificação gênica de codificação (Hynes e ou- tros, 2005, Nat. Rev. Câncer 5, 341), Desse modo, o presente consenso diá- rio é que mAb anti-HER2 é ineficiente em tumores com baixa expressão ou superexpressão ausente de HER2, que é o caso, por exemplo, da maioria de carcinoma pancreático na clínica (por exemplo, Saxby e outros, 2005, J. Surg. Pathoi 29, 1125).

Panitumumab (VECTIBIX®) é um anticorpo anti-EGFR totalmen- te humano e, recentemente recebeu aprovação marcada nos Estados Uni- dos (Schwartz e outros, 2002, Proc. Am. Soe. Clin. Oncol. 21, 24).

Adenocarcinomas do pâncreas permanece uma das malignida- des mais difíceis de tratamento. A incidência aumentou constantemente du- rante as quatro décadas passadas, e seu prognóstico é ainda lúgubre, ape- sar de esforços tremendos na diagnose e terapia prematuras. Quando de diagnose, a maioria de pacientes (80 - 90%) apresentam tumores localmen- te ou metastáticos. Mesrrlo com uma ressecção cirúrgica completa, a taxa de sobrevivência de cinco anos é menor que 20% (Wagner e outros, Br. J. Surg. 2004; 91: 586-94). A terapia convencional que se associa tanto cirurgia quanto radioterapia isolada ou em combinação com quimioterapia mostra eficácia moderada no controle e paliação locais, e nenhum progresso real na sobrevivência do paciente (Azria e outros, Buli. Câncer, 2002; 89: 369-79, Azria e outros, Pâncreas 2002; 25: 360-5, Li e outros, Lancet 2004; 363: 1049-57.2-4). Conseqüentemente, novas abordagens para terapia de carci- noma pancreático humano são urgentemente necessárias.

É bem-documentado que adenocarcinomas pancreático e dis- plasias freqüentemente superexpressam receptores tirosina quinase. Super- expressão de EGFR em câncer pancreático associa-se à doença avançada sob apresentação e tempo de sobrevivência médio reduzido. A significância de expressão/superexpressão de HER2 em prognóstico de câncer pancreá- tico não é tão clara. Na verdade, nenhuma correlação entre grau de diferen- ciação de tumor e o nível de expressão de HER2 em espécimes pancreáti- cos humanos é relatada (Dugan e outros, Pâncreas 1997; 14: 229-36). Isso pode ser explicado recordando que o nível de HER2 não media mitogênese por ela própria e que heterodimerização tem de ser ativada.

O conceito de bloquear EGFR e HER2 é, em principal conhecido e é aplicado em outros modelos que não expressam altos níveis de EGFR e/ou HER2. Um aditivo mas não um efeito sinérgico em reduzir proliferação celular in vitro foi mostrado usando tratamento combinado tanto com mAb C225 de anticorpo quimérico anti-EGFR (cetuximab) quanto anticorpo anti- HER2 4D5 humanizado (trastuzumab) sobre a linhagem celular de câncer ovariano humano OVCAR 420 (Ye e outros, 1999, Oncogene 18, 731) ou com trastuzumab e o variante murino de mAb 225 em linhagens celulares de câncer de colo dependente de EGFR (Kuwada e outros, Int. J. Câncer, 2004; 109:291-301).

Além disso, diferentes grupos abordados a ataque simultâneo de HER1 e HER2 associando o inibidor químico quinase EGFR ZD 1839 (Ires- sa) com trastuzumab (Normanno e outros, Ann. OncoL 2002; 13: 65-72) e verificado que nas linhagens celulares SK-BR-3 e BT-474, a combinação desses últimos compostos induz um melhor efeito antiproliferativo do que os dois compostos usados separadamente, particularmente em termos de indu- ção de apoptose.

Contudo, pouca informação é disponível com referência a eficá- cia de anticorpo e a função real de receptores de EGFR e HER2 em tecido de câncer específico que expressa baixos níveis de pelo menos um desses receptores, por exemplo, câncer pancreático, direcionado por anticorpos es- pecíficos anti-ErbB, e até o momento nenhum estudo clínico tem avaliado a eficácia de direcionar concorrentemente esses dois receptores nesses tumo- res com anticorpos monoclonais adequados.

Com base na falta de uma terapia eficaz e implicação de EGFR e HER2 em câncer específico que expressa baixos níveis de pelo menos um desses dois tipos de receptores, há uma motivação de bloquear EGFR e HER2 simultaneamente em um modelo de câncer específico em que prefe- rencialmente uma alta expressão de EGFR e nenhuma expressão de nível significativo ou baixo é apresentada, em que esse padrão de expressão é avaliado por meio de análise imunocitoquímica ou usando técnica de análise de citometria de fluxo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção atual pode-se mostrar que a combi- nação de um anticorpo anti-HER2, tal como trastuzumab, com um anticorpo anti-EGFR, tal como matuzumab, proporciona regressão de tumor in vivo ou pelo menos crescimento de tumor reduzido e/ou retardado in vivo, contudo preferencialmente apenas em cânceres e tecidos tumorais que expressam nenhum nível significativo ou baixo de HER2, e preferencialmente altos ní- veis de EGFR. Tal diferente padrão de expressão entre esses receptores ErbB pode ser encontrado em muitos cânceres, tal como câncer pancreático.

O diferente padrão de expressão de um tecido de tumor específico poderá ser também uma propriedade individual. Em outras palavras, é possível, que um tumor específico desenvolva um diferente padrão de expressão em rela- ção a esses receptores HER/ErbB em diferentes indivíduos/pacientes que sofrem desse tumor.

Surpreendentemente, o tratamento combinado de um anticorpo anti-Her2 tal como trastuzumab, com um anticorpo anti-EGFR adequado, tal como matuzumab, para terapia de câncer é fortemente sinérgico, se o cân- cer tratado superexpressa EGFR mas não HER2, ou, se o câncer tratado não ou não significativamente expressa HER2 (baixo nível de expressão) e expressa EGFR com níveis maiores que em tecido normal correspondente (não-tumor).

A eficácia de tal tratamento de combinação é sinergicamente aumentada se, além disso, o anticorpo anti-HER2 usado apresenta nenhuma capacidade significante ou não de inibir dimerização de HER2, mas o anti- corpo anti-EGFR usado apresenta a capacidade de inibir significativamente dimerização de EGFR.

Esses achados são novos e não previsíveis mesmo em vista do conceito principalmente conhecido de bloqueio de EGFR e HER2, ou EGFR e EGFR por diferentes epítopos conforme descritos acima.

O efeito sinérgico da combinação é muito distinto quando o cân- cer individual não superexpressa HER2 mas superexpressa EGFR.

O efeito sinérgico descrito de acordo com a invenção sobre crescimento de tumor com, por exemplo, trastuzumab (Herceptin) e matu- zumab (EMD72000) poderá ser

explicado, sem estar ligado a qualquer teoria ou hipótese, por diferentes a- ções mecânicas de cada anticorpo em heterodimerização de EGFR/HER2: de acordo com a invenção trastuzumab, e qualquer anticorpo anti-HER2 po- tencial funcionalmente similar, é reconsiderado de acordo com a invenção ligar-se a domínio IV de uma maneira que não iniba dimerização, mas em vez disso mostra-se acentuar a endocitose de receptor HER2 e seu desapa- recimento da membrana celular.

Em contraste com aquele, EMD72000, e qualquer anticorpo anti- EGFR potencial funcionalmente similar, reconsidera-se diretamente inibir dimerização de EGFR. Natha e outros, (Câncer Res. 2004; 64: 2343-6) veri- ficaram que trastuzumab e um outro anticorpo anti-HER2 chamado pertuzu- mab agem sinergicamente. Umà véz que pertuzumab é sabido inibir dimeri- zação de HER2, anticorpo anti-EGFR matuzumab, e qualquer outro anticor- po anti-EGFR funcionalmente similar, pode surpreendentemente desempe- nhar de acordo com esta invenção um papel análogo na dimerização de EGFR.

Os achados desta invenção mostram e confirmam a importância de comunicação entre os diferentes receptores de HER/ErbB. HER2 mostra- se agir como um co-receptor favorito na parceria com os outros membros da família HER, com um aperfeiçoamento da potência de sinalização de seu parceiro de dimerização em níveis múltiplos.

De acordo com os resultados da presente invenção, a estratégia de simultaneamente direcionar EGFR e HER2 por meio de anticorpos mono- clonais adequados poderá levar sob pré-requisitos específicos a um benefí- cio terapêutico que proporciona eficácia sinérgica em sistemas biológicos com baixa expressão de receptor HER2 sob condições patológicas. De a- cordo com esta invenção, o impacto e eficácia de anticorpos monoclonais EGFR/HER2 combinados adequados parece ser dependente não apenas de sua expressão respectiva de receptor, mas também de sua capacidade, de seu potencial de homo e/ou heterodimerização das células. Esses resultados são novos e não previsíveis mesmo se considerados no contexto com o conceito conhecido de bloquear EGFR e HER2 ou EGFR e EGFR por dife- rentes epítopos (vide acima).

Em vista da presente demonstração do efeito sinérgico terapêu- tico de dois mAbs de anti-EGFR e HER2 sobre duas linhagens de carcinoma pancreático com expressão moderada de HER2 e uma linhagem de carci- noma ovariano que superexpressa ambos os receptores de HER, o grau em que esses resultados experimentais poderão apresentar um impacto no con- trole de carcinomas pancreáticos e outros tipos de carcinomas são conside- rados. Em carcinoma pancreático, sabe-se que tanto EGFR quanto HER2 são

expressos em uma porcentagem significativa dos casos (por exemplo, Tobita e outros, 2003, Int. J. Mol. Med. 11, 305) e expressão desses receptores mostra-se ser envolvida na iniciação e progressão desse tumor.

Desse modo, em vista da toxicidade e resultados muito modes- tos dos regimes de quimioterapia e radioterapia mais avançados e intensivos nesse tipo de câncer (por exemplo, Czito e outros, 2006, J. Clin. Oncoí. 24, 656) seria desejável considerar um tratamento combinado com os dois mAbs anti-EGFR e anti-HER2 em pacientes com carcinomas que expressam mesmo baixos níveis de pelo menos um dos receptores de HER. Em relação a mAb de anti-HER2, é bem-estabelecido que os benefícios clínicos são limi- tados a tumores com superexpressão marcada do receptor (Slamon e ou- tros, 2001, Semin. OncoL 28, 13), visto que pelos presentes experimentos, o sinergismo de anticorpo anti-HER2 específico com anticorpo anti-EGFR es- pecífico foi demonstrado em dois carcinomas pancreáticos com expressão de HER2 baixa a moderada.

Tem sido mostrado em várias linhagens celulares de carcinoma que tratamento com moléculas pequenas que inibem receptores tirosina qui- nase, tal como Iressa de EGFR (Normanno e outros, 2002, Ann. Oncoi 13, 65) ou o inibidor duplo quinase Iapatinib tanto de EGFR quanto de HER2 (Konecny e outros, 2006, Câncer Res. 66, 1630), pode apresentar um efeito sinérgico com tratamento de mAb anti-HER2. Contudo, o efeito sinérgico foi principalmente demonstrado in vitro e exclusivamente em linhagens de car- cinoma-alvo que superexpressam HER2. Além disso, o efeito de uma molé- cuia pequena com propriedade inibitória tirosina quinase não pode ser con- siderado como idêntico àquele de uma molécula grande de anticorpo que se liga ao domínio externo dos receptores.

Por muitos anos, diversos grupos apresentados em estudos in vitro em suspensões de células de tumor mostrando que incubação simultâ- nea com os dois mAbs anti-EGFR e anti-HER2 induziu inibição mais eficien- te de fosforilação de receptores e/ou internalização específica dos recepto- res, do que incubação com um mAb isolado (21-24). Contudo, apenas um dos grupos (23) testou um estudo limitado in vivo mas falhou a demonstrar qualquer sinergismo entre os dois mAbs.

Desse modo, os resultados apresentados neste relatório repre- sentam o primeiro tempo de demonstração experimental in vivo de um novo aperfeiçoamento de terapia de câncer por muito tempo esperado pela ação sinérgica de dois mAbs anti-EGFR e HER2. Além disso, os resultados apre- sentados aqui sugerem que um paciente apresentando carcinoma de mama com expressão moderada de HER2, que não pode ser tratado com terapia de mAb anti-HER2, pode beneficiar-se do tratamento sinérgico dos dois mAbs anti-HER/ErbB, contanto que o tumor também expresse EGFR.

Três outros tratamentos de câncer baseados no efeito sinérgico de dois mAbs de diferentes especificidades estão presentemente sob inves- tigação. Primeiro, um ensaio clínico de fase 1 está em curso para o trata- mento de Iinfoma não-Hodgkin com uma combinação de mAbs anti-CD20 e CD22 (Leonard e outros, 2005, J. Ciin. Oncoi. 23, 5044). Os antígenos reco- nhecidos por esses dois mAbs são muito diferentes, contudo, e não apresen- tam a propriedade de heterodimerização, que é característica dos dois anti- corpos de receptores HER direcionados em nosso estudo.

Um segundo estudo inteiramente experimental, envolve um mAb receptor de fator de crescimento tal como antiinsulina (IGF-IR), o qual relata- se apresentar um efeito sinérgico antitumoral com um agente quimioterapêu- tico (vinorrelbina) ou com um mAb anti-EGFR, em um modelo xenoenxerto de carcinoma de mama e pulmão (Goetsch e outros, 2005, Int. J, Câncer 113, 316). Entretanto, o IGF-IR não pertence à família de receptor HER e em termos de tratamento potencial, aplicação de IGF-IR é menos restrita a tu- mor do que é o receptor HER2.

Um terceiro estudo experimental envolve um mAb anti-EGFR e anti-VEGFR em um modelo xenoenxerto de carcinoma pancreático (Tonra e outros, 2006, Clin. Câncer Res. 12, 2197)). Os dois mAbs usados nesse es- tudo não são direcionados contra as células de tumor-alvo mesmo tumor de cèlulas-alvo. Na verdade, mAb anti-VEGFR liga-se a um receptor, que é ex- presso em células endoteliais, mas não em células de carcinoma pancreáti- co. Desse modo, o mecanismo de ação dos dois mAbs nesse estudo parece ser relacionado a parâmetros de vascularização de tumor e é distinto da li- gação dos dois mAbs em dois receptores de HER/ErbB localizados nas mesmas células de carcinoma-alvo, as quais parecem ser responsáveis pelo efeito sinérgico antitumoral apresentado neste relatório.

No sumário, a invenção refere-se ao seguinte:

No sumário, a invenção refere-se a:

• uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-EGFR e um anticorpo anti-HER2 (ErbB2) ou um fragmento imunologi- camente eficaz deste, em uma quantidade eficaz opcional e juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente, em que o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 murino, quimérico ou humanizado (matuzumab, EMD72000) e o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 murino, quimérico ou hu- manizado (trastuzumab, HERCEPTIN®), preferencialmente, os variantes humanizados de cada um desses anticorpos; • uma composição farmacêutica correspondente, em que esse anticorpo anti-EGFR liga-se a células do tumor, em que o receptor EGF é moderado ou altamente expresso ou superexpresso;

• uma definição farmacêutica correspondente em que esse anti- corpo anti-HER2 liga-se a células do tumor, em que a expressão de receptor HER2 é baixa, ou menor que expressão de EGFR;

• uma composição farmacêutica correspondente, em que as célu- las de tumor são células tumorais pancreáticas;

• uma composição farmacêutica correspondente que compreende adicionalmente um agente citotóxico;

• uma composição farmacêutica correspondente, em que o agente citotóxico é um agente quimioterapêutico, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em cisplatina, doxorrubicina, gencitabina, docetaxel, pa- clitaxel, bleomicina e irinotecano;

· uma composição farmacêutica correspondente, em que o agente citotóxico é um terceiro inibidor de receptor ErbB, um inibidor de receptor VEGF, um inibidor de tirosina quinase, um inibidor de proteína quinase A, um agente antiangiogênico, ou uma citocina;

• uma composição farmacêutica correspondente, em que um ou cada um desses anticorpos são fundidos em seu término C com um peptí- deo, polipeptídeo ou proteína biologicamente eficaz, opcionalmente via um peptídeo ligante, para formar um imunoconjugado, preferencialmente uma imunocitocina;

• um kit farmacêutico que compreende (i) um primeiro pacote que compreende um anticorpo anti-EGFR ou um anticorpo anti-EGFR imunocon- jugado conforme especificado acima ou uma metade imunologicamente efi- caz deste, e (ii) um segundo pacote que compreende um anticorpo anti- HER2 ou um anticorpo anti-HER2 imunoconjugado conforme especificado acima ou uma metade imunologicamente eficaz deste;

· um kit farmacêutico correspondente que compreende (iii) um terceiro pacote que compreende um agente citotóxico conforme especificado acima; • O uso de uma composição farmacêutica conforme especificada acima para a produção de um medicamento para o tratamento de tumores que expressam receptores ErbB;

• o uso correspondente dessa composição farmacêutica, em que esse tumor não superexpressa HER2 ou expressa HER2 apenas em quanti- dades menores que EGFR;

• o uso correspondente dessa composição farmacêutica, em que essas células tumorais superexpressam EGFR mas não HER2;

• o uso correspondente dessa composição farmacêutica para o tratamento de câncer pancreático;

• uso de todas as composições farmacêuticas conforme descritas para a produção de um medicamento direcionado contra câncer em combi- nação com radioterapia e/ou quimioterapia;

• uma composição farmacêutica que compreende qualquer anti- corpo anti-EGFR e qualquer anticorpo anti-HER2 em um aspecto geral e

princípio da invenção, em que esses anticorpos isolados não inibem hetero- dimerização de EGFR e HER2, mas agem desse modo se dados em combi- nação;

• uma composição farmacêutica correspondente, em que o anti- corpo anti-EGFR liga-se a células de tumor a ser tratado que superexpres- sam EGFR, e o anticorpo anti-HER2 liga-se a células de tumor a ser tratado que não superexpressam HER2, ou expressam HER2 em uma quantidade baixa ou moderada comparada a essa superexpressão de EGFR;

• uma composição farmacêutica correspondente, em que o anti- corpo anti-EGFR é selecionado do grupo de mAb 425 murino, quimérico ou humanizado (matuzumab) e o anticorpo anti-HER2 é selecionado do grupo de mAb 4D5 murino, quimérico ou humanizado (trastuzumab);

• um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio de ligação com antígeno que se liga a EGFR, preferencialmente derivando de mAb 425 murino, quimérico ou humanizado (matuzumab), e um segundo sítio de ligação com antígeno que se liga a HER2, preferencialmente deri- vando de mAb 4D5 murino, quimérico ou humanizado (trastuzumab); • uso de uma composição farmacêutica que compreende um anti- corpo anti-HER2 e um anticorpo anti-EGFR para a produção de um medica- mento para o tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer nesse indivíduo expressa EGFR e HER2, em que HER" é expresso em baixos ní- veis ou níveis que não são suficientes para responder significativamente a tratamento isolado de anticorpo anti-HER2;

• uso correspondente, em que o anticorpo anti-HER2, quando da- do isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou heterodimerização de HER2/EGFR, e o anticorpo anti-EGFR, quando dado isolado, significativamente inibe dimerização EGFR e/ou heterodimerização de EGFR/HER2;

• uso correspondente, em que o câncer não superexpressa HER2 e/ou não superexpressa EGFR.

• uso correspondente, em que o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado;

• uso correspondente, em que o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado;

• uso correspondente, em que o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado e o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

• uso correspondente, em que o câncer é câncer pancreático ou câncer de mama;

• uso correspondente, em que os anticorpos são fragmentos imu- nologicamente eficazes, tal como fragmentos Fab'- (Fab')2;

· uso correspondente, em que adicionalmente um agente citotóxi- co é administrado, por exemplo, um agente quimioterapêutico, preferencial- mente selecionado do grupo que consiste em cisplatina, doxorrubicina, gen- citabina, docetaxel, paclitaxel, bleomicina e irinotecano, ou um inibidor de receptor VEGF, um inibidor tirosina quinase de molécula pequena, um agen- te antiangiogênico, ou uma citocina;

• uso correspondente, em que um ou ambos desses anticorpos são fundidos, preferencialmente em seu término C com um peptídeo, poli- peptídeo ou proteína biologicamente eficaz, opcionalmente via um peptídeo ligando, formando desse modo um imunoconjugado;

• uso correspondente, em que o imunoconjugado é uma imunoci- tocina.

uso correspondente que compreende um anticorpo biespecífico que apresenta as especificidades dos dois anticorpos conforme especifica- dos acima e abaixo;

• uso de uma composição farmacêutica que compreende um anti- corpo anti-HER2 e anti-EGFR para a produção de um medicamento para aperfeiçoar a eficácia do tratamento de câncer em um indivíduo com o anti- corpo anti-HER2, em que o câncer nesse indivíduo expressa HER2 em bai- xos níveis ou níveis que não são suficientes para responder significativa- mente a esse tratamento com anticorpo anti-HER2 isolado, e EGFR em ní- veis que são suficientes para responder significativamente a um anticorpo anti-EGFR;

• uso correspondente, em que o anticorpo anti-HER2, quando da- do isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou heterodimerização de HER2/EGFR, e o anticorpo anti-EGFR, quando dado isolado, significativamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodimeriza- ção de EGFR/HER2.

• uso correspondente, em que o câncer HER2 não é superexpres- so e EGFR é superexpresso;

• uso correspondente, em que o anticorpo anti-HER2, é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado e o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado;

• método para tratamento de câncer que expressa HER2 e EGFR em um indivíduo, em que o câncer nesse indivíduo expressa HER2 em ní- veis que não são suficientes para responder significativamente a um anticor- po anti-HER2, quando dado isolado ao indivíduo, método este que compre- ende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-HER2, o qual, quando dado isolado não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou hete- rodimerização de HER2/EGFR, e um anticorpo anti-EGFR, o qual, quando dado isolado, significativamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodi- merização de HER2/EGFR;

• método correspondente, em que o HER2 não é superexpresso e/ou EGFR é superexpresso;

• método correspondente, em que o anticorpo anti-HER2, é mAb 4D5 (trastuzumab) é murino, quimérico ou humanizado;

• método correspondente, em que o anticorpo anti-HER2, é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

• método correspondente, em que o anticorpo anti-HER2, é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado e o anticorpo anti- EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.;

• método correspondente, em que o câncer é pancreático ou de mama;

• método de aperfeiçoamento da eficácia do tratamento de câncer que expressa HER2 e preferencialmente superexpressa EGFR com um anti- corpo anti-HER2, em que o câncer não superexpress HER2 ou expressa HER2 em baixos níveis ou níveis que não são suficientes para responder significativamente ao tratamento de anticorpo anti-HER2 isolado; método este que compreende administrar a um indivíduo um anticorpo anti-HER2 , o qual, quando dado isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou heterodimerização de HER2/EGFR, e um anticorpo anti- EGFR, o qual, quando dado isolado, significativamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodimerização de EGFR/HER2.

• método correspondente, em que o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado, e/ou o anticorpo anti- EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado;

• método correspondente, em que o câncer é pancreático ou de mama. DESCRIÇÃO DETALHADA

Expressões de Superfície Celular de Receptores EGFR e HER2

Análises imunocitoquímicas em células BxPC-3 de carcinoma pancreático humano mostram um alto nível de EGFR (classificado como +++) mas nenhum nível detectável de expressão de receptor HER2, quando comparadas com células SK-OV-3 de carcinoma ovariano humano e células A-431 de carcinoma epidérmico de referência, classificadas como +++ para HER2 e +++ para EGFR, respectivamente, pela mesma análise (Figura 1).

Uma segunda linhagem celular de câncer pancreático MiaPaCa- 2 é também classificada negativa para HER2 e ++ para EGFR.

Em contraste, usando a técnica de citometria de fluxo mais sen- sível (Mimura e outros, 2005, Clin. Câncer Res. 11, 4898), pode-se verificar uma expressão moderada de HER2 em células BxPC-3 e MiaPaCa-2 quan- do comparada com células SK-OV-3.

A superexpressão de EGFR por células BxPC-3 pode ser con- firmada, mas sob um nível ligeiramente menor do que as células A-431 de referência. Mia-PaCa-2 mostra uma expressão moderada e igual tanto de receptores EGFR quanto de HER2. SK-OV-3 mostra uma expressão mode- rada de EGFR e uma alta expressão de HER2 (Figura 1).

Com base no nível de expressão de HER2 totalmente baixo nas células BxPC-3 do tumor e nos resultados de biodistribuição, pode-se espe- rar a atividade limitada de trastuzumab no tumor obtido in vitro e in vivo. Na verdade, superexpressão de HER2 é uma ferramenta diagnostica estabele- cida para avaliar pacientes com câncer de mama para terapia de trastuzu- mab (Slamon e outros, 2001, Semin. Oncoi 28, 13), e conseqüentemente, apenas pacientes com benefício imunoistoquímico de expressão de tumor 3+ HER2 a partir desta terapia de direcionamento.

Superexpressão infreqüente de HER/neu poderá explicar porque trastuzumab não é correntemente usado na clínica para o tratamento de câncer pancreático. Estudos confirmaram a incapacidade de monoterapia de trastuzumab para diminuir crescimento de tumor que apresenta baixa ex- pressão de HER2. Deve-se notar que as doses de trastuzumab usadas nes- ses estudos são de três a doze vezes maiores que aquelas usadas nos ex- perimentos de acordo com a invenção.

Atividade Antitumoral de Matuzumab e/ou Trastuzumab contra Dois Xenoen- xertos de Carcinoma Pancreático e Ovariano

A eficácia terapêutica dos mAbs anti-EGFR e anti-HER2 isola- dos ou em combinação é primeiro, testada em xenoenxertos de BxPC-3 em camundongos sem pêlos. Para avaliar as diferentes formas de terapia de mAb em xenoenxertos de tumores de vários tamanhos, duas séries de resul- tados experimentais representativos, primeiro em tumores de volume relati- vãmente pequeno (77 ± 49 mm3, experimento S) e segundo com tumores maiores (503 ± 205 mm3, experimento L), são analisadas. Resultados de experimento S (Figura 2), obtidos em grupos de oito camundongos tratados com 50 μg de cada anticorpo duas vezes semanais por quatro semanas, mostram uma inibição de crescimento de tumor significativamente maior no grupo de anticorpos combinado quando comparado com os grupos tratados com cada anticorpo isolado (P = 0,002). Análise adicional dos mesmos resul- tados experimentais mostra que os fatores de incremento de tumores no fim de tratamento são notadamente maiores nos camundongos tratados com mAb anti-EGFR e anti-HER2 isolados, 4,9 ±2,1 e 6,4 ± 4,4, quando compa- rados com o grupo mAb combinado 0,7 ± 0,5 (Tabela 1, parte superior). A- lém disso, apenas o tratamento mAb combinado induz duas remissões com- pletas de tumor. Resultados de um experimento adicional em camundongos com xenoenxertos de BxPC-3 de tamanho similar tratados com doses quatro vezes maiores de cada mAb (200 μg) isolado ou em combinação totalmente confirmam os resultados anteriores, com fatores de incremento de tumores muito maiores para o único tratamento com mAB, quando comparados com a terapia de mAb combinada (Tabela 1, parte inferior). Tabela 1. Fator de incremento de volume de xenoenxerto de BxPC-3 no tér- mino de tratamento

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aC: controle, M: matuzumab, T: trastuzumab, T + M: ambos mAbs.

bFator de incremento: (volume do tumor no término de tratamento)/ (volume do tumor no início de tratamento).

Além disso, remissões completas de tumor em três de cinco ca- mundongos são observadas apenas no grupo de terapia combinada no tér- mino de tratamento. Comparação de terapia com diferentes doses de anti- corpos, registrada na Tabela 1, mostra que 50 μg de cada mAb em combi- nação induziram notadamente incrementos inferiores de tumores (0,7 +/-0,5) do que aqueles obtidos em camundongos tratados com quatro vezes doses maiores do único mAb (4,3 e 5,5). Nenhum efeito de dose detectável pode ser observado entre os tratamentos de 50 e 200 μg sugerindo que o siner- gismo dos dois mAbs que se ligam aos dois receptores HER são mais impor- tantes do que as quantidades absolutas de anticorpo. Essa observação é claramente em favor de um efeito sinérgico diferente de um aditivo. Resulta- dos de xenoenxertos maiores dos tumores de BxPC-3 (experimento L) obti- dos em quatro grupos de seis camundongos injetados com 200 μg de cada anticorpo mostram nas curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier adaptadas (Figura 3A) que o atraso médio para tumores atingir 1.500 mm3 de volume é significativamente mais longo (73 dias) em camundongos tratados com a combinação de mAb do que em camundongos tratados com apenas um mAb (anti-HER2, 30 dias, anti-EGFR, 34 dias) P = 0,001. As curvas de tem- po de progressão do tumor do mesmo experimento (Figura 3B), confirmam que o tempo para atingir um tumor três vezes maior é significativamente mais longo (P < 0,001) para o grupo de tratamento combinado, do que para os dois tratamentos com mAb único, De forma interessante, em um grupo adicional de seis camundongos com tumores grandes tratados com apenas 50 μg de cada mAb em combinação, o tempo (70 dias) para o tumor atingir um volume de 1.500 mm3 é muito mais longo quando comparado com os tumores no grupo tratado com 200 μg de cada mAb isolado (30 e 34 dias) (Figura 3A). Isso confirma que mesmo com os tumores maiores a dupla es- pecificidade dos dois mAb é mais eficaz que as doses absolutas de mAb e que o maior efeito antitumoral é devido a um efeito sinérgico em vez de um efeito aditivo dos dois mAbs. A propriedade de inibição do crescimento de tumor dos mAbs anti-EGFR e anti-HER2 combinados é adicionalmente tes- tada em xenoenxertos de uma segunda linhagem de carcinoma pancreático humano MiaPaCa-2, a qual também expressa baixos níveis de HER2. Inje- ção duas vezes uma semana de 50 μg de cada mAb isolado ou em combi- nação é iniciada em grupos de seis camundongos quando o volume médio de tumor atingiu 64 mm3 ± 5 e continuou por quatro semanas. Animais fo- ram submetidos à eutanásia quando o tumor atingiu um volume de 2.000 mm3. As curvas de sobrevivência de tumores adaptadas para atingir esse volume mostram (Figura 4A) que em 120 dias, nenhum tumor maior que 2.000 mm3 pode ser observado no grupo de anticorpo combinado, visto que quatro de seis camundongos de ambos os grupos tratados com um mAb único apresentavam tumores que atingem esse volume (P = 0,0072). Além disso, uma remissão completa do tumor pode ser observada apenas no gru- po de terapia de mAb combinada. De forma interessante, em um experimen- to separado, tratamento de xenoenxertos de MiaPaCa-2 de tamanho similar (65 ± 6 mm3) com apenas 25 μg de cada anticorpo em combinação apre- senta um efeito antitumoral eficiente, visto que injeções únicas de mAb apre- sentam quase nenhum efeito de inibição de crescimento, confirmando, em relação a esse tumor também, o papel importante do ataque por dois mAbs direcionados contra diferentes receptores HER. Para verificar se a vantagem terapêutica da ação combinada dos dois mAbs de receptores anti-HER ob- servada contra as duas linhagens celulares de carcinoma pancreático pode também funcionar em um outro tipo de carcinoma, a mesma comparação entre injeções de mAb únicas e combinadas é testada na linhagem de carci- noma ovariano SK-OV-3 de referência, sabida superexpressar tanto recepto- res EGF quanto HER-2. A terapia que consiste em 200 μg de mAb de anti- EGFR ou anti-HER-2, ou os dois mAbs em combinação, foi iniciada em qua- tro grupos de seis camundongos (incluindo, um controle não-tratado) quando o xenoenxerto de SK-OV-3 apresentava um volume médio de 42 ± 4 mm3.

Conforme esperado, em vista da superexpressão de ambos os receptores HER nessas células tumorais, uma atividade terapêutica de cada mAbs úni- co pode-se observar com 1 e 2 remissões completas no grupo de camun- dongos injetados com anti-EGFR e anti-HER2, respectivamente. Contudo, a injeção de ambos os mAbs fornece uma inibição de crescimento tumoral cla- ramente superior em todos os camundongos, incluindo três remissões com- pletas. Os resultados da curva de sobrevivência adaptada para o tumor atin- gir um volume de 1.000 mm3 (Figura 4B) mostram que os tumores de todos os seis camundongos tratados com a combinação mAb não atingiram 1.000 mm3 durante o período de observação de 120 dias, enquanto o atraso de 50% dos camundongos atingirem esse volume de tumor foi de 69 dias e 85 dias para o grupo de camundongos tratados com anti-EGFR e HER2, res- pectivamente (P = 0,0001). Esses resultados confirmam o sinergismo tera- pêutico dos dois mAbs de anti-HER de camundongos contra um xenoenxerto de carcinoma ovariano humano e sugerem que a injeção combinada desses dois mAbs pode ser útil no tratamento de muitos tipos de carcinomas que expressam receptores EGF e HER2.

Inibição de Autofosforilacão de Receptores

A capacidade de matuzumab ou trastuzumab usado isolado ou em combinação para inibir a atividade de tirosina quinase de EGFR e HER2 em células BxPC-3 e MiaPaCa-2 in vitro pode ser avaliada por ι/vestem blot com quantificação das proteínas fosforiladas por meio de densitometria e análise usando o NIH imager 6.3 (Figura 5). Análises nas duas linhagens celulares de carcinoma pancreático são comparadas após uma incubação de 48 horas com os dois mAbs, isolados ou em combinação, seguido por uma ativação de 10 minutos com EGFR. Deve-se observar primeiro, que ambas as linhagens celulares mostram uma linhagem-base de fosforilação relativamente alta em relação a receptor de EGFR e a receptor de HER2.

Conforme esperado, tratamento com EGF exógeno induz um alto nível de autofosforilação de tirosina de EGFR e HER2 em ambas as linhagens celula- res. De forma interessante, incubação com os mAbs em combinação resulta em uma inibição muito maior de fosforilação de HER2 em ambas as linha- gens celulares do que aquela obtida com mAb anti-HER2 isolado. Em rela- ção a EGFR, a inibição de fosforilação pelos dois mAbs é menos destacada; ela é quase idêntica e apenas ligeiramente superior àquela obtida com o mAb de anti-EGFR isolado nas células MiaPaCa-2 e BxPC-3, respectiva- mente. Esses resultados, bem como estudos in vitro mais extensivos a partir da literatura (22 -24), poderão explicar o sinergismo terapêutico in vivo sur- preendente dos dois mAbs de receptor anti-HER contra xenoenxertos de carcinoma humano descritos neste relatório.

Apesar de uma alta expressão de EGFR na linhagem celular pancreática BxPC-3, matuzumab (EMD72000) não é, ou apenas pouco efi- caz na inibição de crescimento tumoral usado isolado sob uma dose de 50 ou 200 μg/injeção, confirmando a ausência de correlação entre expressão de EGFR e eficácia curativa de anticorpos anti-EGFR. Isso pode ser ilustra- do com um segundo modelo de câncer pancreático in vivo (MiaPaca) em que camundongos são tratados com 50 μg/injeção de EMD72000 duas ve- zes uma semana por quatro semanas. A atividade antitumoral da combina- ção, contudo, é muito mais forte que a atividade antitumoral insignificante dos anticorpos usados como únicos componentes isolados. Com relação à diminuição do volume de tumor e estudos de viabilidade in vitro, o efeito dos anticorpos combinados é claramente sinérgico no modelo BxPC-3 e não um mero efeito aditivo calculado das eficácias dos únicos componentes. Esse efeito é particularmente notável durante o período de tratamento de quatro semanas, em que nenhuma progressão do tumor pode ser observada tanto em tumores pequenos quanto em grandes pancreáticos. O princípio de tratamento combinado com anticorpos monoclo- nais, com diferentes especificidades a estruturas de antígeno nos mesmos ou diferentes receptores é descrito neste relatório exemplarmente para tra- tamento de tumor pancreático positivo a EGFR e HER2. Contudo, esse prin- cípio não se limita a câncer pancreático e pode ser adaptado para uso com qualquer outro câncer que mostra o mesmo ou um perfil de expressão de receptor similar. Se não de outra maneira mostrados, os termos e expres- sões usadas nesta invenção apresentam os significados e definições con- forme dados abaixo. Além disso, essas definições e significados descrevem a invenção em maiores detalhes, modalidades preferidas incluídas.

Por definição, o termo "superexpresso" significa de acordo com a invenção, que o receptor correspondente é expresso na superfície das cé- lulas tumorais com uma taxa

superior, preferencial e significativamente superior e/ou quantidade que na superfície de células não-tumorais normais, preferencialmente derivando do mesmo tecido.

Usualmente, EGFR e HER2 são expressos em taxas muito bai- xas até baixas em muitas células de tecido normais dependendo do tecido e espécime específicos. Em ou sobre tecido tumoral essas taxas são, como regra, significativamente maiores, especialmente com referência a EGFR. Com relação à câncer de mama, por exemplo, HER2 é significativamente superexpresso em pelo menos 30% dos pacientes e é expresso com um nível maior do que EGFR. Em câncer pancreático a situação é, como regra, vice-versa. Em muitos casos, a situação parece também ser dependente da predisposição genética do indivíduo a ser tratado. Desse modo, os termos "expressão moderada", "expressão significante", etc. são termos relativos e podem ser observados no contexto da situação específica. Entretanto, em geral, de acordo com esta invenção, o termo "baixa expressão" significa, se não de outra maneira especificado, não "superexpresso" no sentido confor- me indicado acima. O termo "expressão moderada" ou "expressão signifi- cante" significa, conforme não de outra maneira indicado, "superexpresso" em uma taxa inferior/moderada ou significante/superior. "Significante" signifi- ca neste contexto que as células tumorais correspondentes expressam o receptor em uma quantidade que é mensuravelmente maior que células não- tumorais normais de um indivíduo específico.

Um "receptoi" ou "molécula receptora" é uma proteína ou glico- proteína solúvel ou ligada à membrana/associada que compreende um ou mais domínios aos quais um ligando se liga para formar um complexo recep- tor-ligando. Por meio de ligação, o ligando, poderá ser um agonista ou um antagonista, o receptor é ativado ou inativado e poderá iniciar ou bloquear vias de sinalização.

Um "receptor ErbB' é uma proteína receptora tirosina quinase que pertence, conforme já especificado acima, à família de receptor ErbB e inclui receptores EGFR/HER1 (ErbB1), HER2 (ErbB2), ErbB3 e ErbB4 e ou- tros membros dessa família a serem identificados no futuro. O receptor ErbB geralmente compreenderá um domínio extracelular, o qual poderá ligar-se a um ligando ErbB; um domínio transmembrana lipofílico; um domínio tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização terminal car- boxila ancorando diversos resíduos tirosina que podem ser fosforilados. O receptor ErbB poderá ser um receptor ErbB de "seqüência nativa" ou um "variante de seqüência aminoácido" deste. Preferencialmente, o receptor ErbB é receptor ErbB humano de seqüência nativa. As expressões "ErbB1" e "HER1" e "EGFR" são usadas intercambiavelmente neste relatório e refè-~ rem-se à proteína HER1 humana. As expressões "ErbB2" e "HER2" são u- sadas intercambiavelmente neste relatório e referem-se à proteína HER2 humana. Receptores ErbBI (EGFR) são preferidos de acordo com esta invenção.

O termo "antagonista/inibidor de receptor ErbBx refere-se à mo- lécula biologicamente eficaz, a qual liga-se e bloqueia ou inibe o receptor ErbB. Desse modo, bloqueando o receptor o antagonista impede ligação do ligando ErbB (agonista) e ativação do complexo receptor agonista/ligando. Antagonistas ErbB poderão ser direcionados a HER1 (ErbB1, EGFR), HER2 (ErbB2) e ErbB3 e ErbB4.

Anticorpos da invenção preferidos são anticorpos anti-HER1 e anti-HER2. Anticorpos anti-HER1 preferidos são MAb 425, preferencialmente MAb 425 humanizado (hMAb 425, matuzumab, EMD 72000, US 5.558.864; EP 0531 472) e MAb 225 quimérico

(cetuximab, ERBITUX®). Anticorpo anti-HER2 mais preferido é HERCEP- TIN® comercializado por Genentech/Roche.

O termo "antagonista/inibidor tirosina quinase" refere-se de a- cordo com esta invenção a agentes naturais ou sintéticos que são habilita- dos a inibir ou bloquear tirosina quinases, tirosina quinases receptoras inclu- ídas. Desse modo, o termo inclui intrinsecamente antagonistas/inibidores de receptor ErbB conforme definidos acima. Com exceção dos anticorpos de receptor anti-ErbB mencionados acima e abaixo, agentes antagonistas tiro- sina quinase mais preferíveis sob essa definição são compostos químicos que têm mostrado eficácia na terapia mono-fármaco de câncer de mama e próstata. Um dos agentes anticancerígenos mais promissores neste contexto é gefitinib (IRESSA®, Astra Zeneca), o qual é relatado possuir eficácia tera- pêutica destacada e excelente tolerabilidade em pacientes com câncer do pulmão de células não-pequenas (NSCLC), bem como câncer da cabeça e pescoço avançado. Preferencialmente, a dosagem dos inibidores químicos tirosina quinase conforme definida acima é de 1 pg/kg a 1 pg/kg de peso cor- poral por dia. Mais preferencialmente, a dosagem de inibidores tirosina qui- nase é de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal por dia.

A invenção refere-se não apenas aos anticorpos anti-HER/ErbB conforme mencionados, mas também a seus fragmentos biologicamente ativos e a imunoconjugados conforme especificados abaixo, especialmente imunocitocinas.

Dependendo da seqüência de aminoácidos de suas regiões constantes, anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes "classes de anticorpos (imunoglobulina)". Há cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas dessas poderão ser adicional- mente divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspon- dem às diferentes classes de anticorpos são chamados α, δ, ε, γ e μ, respec- tivamente. Classe principal de anticorpos preferida de acordo com a inven- ção é IgG, em maiores detalhes IgG1 e lgG2.

O termo "anticorpo monoclonal' conforme usado neste relatório refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substanci- almente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para possíveis mutações que ocorrem natu- ralmente que poderão estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Métodos de produção de anticorpos monoclonais incluem o método de hibridoma descrito por Kohler e Milstein (1975, Nature 256, 495) e in "Monoclonal Antibody Technology, The Produc- tion and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" (1985, Burdon e outros, Eds.

Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bioiogy, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam), ou poderão ser produzidos por métodos de DNA recombinante bem-conhecidos (vide, por exemplo, US 4.816.567). Anticorpos monoclonais poderão ser também isolados a partir de bibliotecas de fago-anticorpos usando as técnicas descritas em Clackson e outros, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks e outros, J. MoL Biol. 222:58, 1- 597 (1991), por exemplo.

O termo "anticorpo quimérico" significa anticorpos em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a seqüências cor- respondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, embora o res- tante da(s) cadeia(s) seja idêntico a, ou homólogo a seqüências correspon- dentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou que pertence a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (por exemplo, US 4.816.567; Morrison e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Métodos para produção de anticorpos quiméricos e hu- manizados são também conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, mé- todos para produção de anticorpos quiméricos incluem aqueles descritos em patentes por Boss (CeIItech) e por Cabilly (Genentech) (US 4.816.397; US 4.816.567).

"Anticorpos humanizados" são formas de anticorpos quiméricos não-humanos (por exemplo, roedores) que contêm seqüência mínima deri- vada de imunoglobulina não-humana. Em geral, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região hipervariável (CDRs) do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tais como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano que apresenta a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região de suporte (FR) da imunoglobulina humana são substitu- idos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados poderão compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para adicionalmente refinar desempenho de anticorpos. Em geral, o anticor- po humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente to- dos dos Ioops hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos das FRs são aqueles de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcio- nalmente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobuli- na humana. Métodos para produção de anticorpos humanizados são descri- tos, por exemplo, por Winter (US 5.225.539) e Boss (Celltech, US 4.816.397).

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de um an- ticorpo intacto, preferencialmente que compreendem a ligação com antígeno ou região variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv e Fc, diacorpos, anticorpos lineares, molé- cuias de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmento(s) de anticorpos. Um anticorpo "intacto" é aquele que compre- ende uma região variável de ligação com antígeno, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Preferencialmente, o anticorpo intacto apresenta uma ou mais funções efetuadoras. Digestão de anticorpos com papaína produzem dois fragmentos idênticos de ligação com antígeno, chamados fragmentos "Fab", cada um compreendendo um sítio único de ligação com antígeno e uma região CL e uma região CH1, e um fragmento residual "Fc", cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar-se prontamente. A região "Fc" dos anti- corpos compreende, como regra, uma região CH2, CH3 e a região de articu- lação de uma classe principal de anticorpo IgGI ou lgG2. A região de articu- lação é um grupo de aproximadamente 15 resíduos aminoácidos que combi- nam com a região CH1 com a região CH2-CH3. Tratamento com pepsina produz um fragmento "F(ab')2' que apresenta dois sítios de ligação com an- tígeno e é ainda capaz de antígeno de reticulação. "Fv" é o fragmento míni- mo de anticorpo que contém um reconhecimento completo de antígeno e sítio de ligação com antígeno. Essa região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e de cadeia leve em associação firme não-covalente. É nessa configuração que as três regiões hipervariáveis (C- DRs) de cada domínio variável interage para definir um sítio de ligação com antígeno na superfície do dímero VH - VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação com antígeno ao anticor- po. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas de um antígeno) apresenta a capacidade de reconhecer e ligar-se a antígeno, embora sob uma afinidade mais baixa que o sítio de ligação total.

O fragmento "Fab" também contém o domínio constante da ca- deia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada e apresen- ta apenas um sítio de ligação com antígeno. Fragmentos "Fab" diferem de fragmentos Fab por meio da adição de alguns resíduos no término carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da regi- ão de articulação de anticorpos. Fragmentos F(ab')2 de anticorpos original- mente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que apresentam cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de frag- mentos de anticorpos são também conhecidos (vide, por exemplo, Herman- son, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; US 4.342.566). Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scF\/' compreendem os domínios de anticorpos V e V, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv adicionalmente compreende um ligando polipeptídico entre os domínios VH e VL que permitem o scFv formar a estrutura desejada de ligação com antí- geno. Anticorpos FV de cadeia única são conhecidos, por exemplo, de Plückthun (The Pharmacoiogy of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosen- burg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994)), W093/16185; US 5.571.894; US 5.587.458; Huston e outros (1988, Proc. Natl. Acad. Sei. 85, 5879) ou Skerra e Plueckthun (1988, Science 240, 1038).

"Anticorpos biespecíficos? (BAbs) são anticorpos simples, diva- Ientes (ou fragmentos imunoterapeuticamente eficazes destes) que apresen- tam dois sítios de ligação com antígeno diferentemente específico. De acor- do com esta invenção BAbs são caracterizados como BAb < MAb 1, MAb 2>, em que <MAb 1 > e <MAb 2> designam os sítios de ligação com~ãhtíge- no que derivam de MAb 1 e MAb 2. Por exemplo, o primeiro sítio de ligação com antígeno é direcionado a um receptor de angiogênese (por exemplo, receptor de integrina ou VEGF), visto que o segundo sítio de ligação com antígeno é direcionado a um receptor ErbB (por exemplo, EGFR ou HER2). Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por meio de técnicas quími- cas (vide, por exemplo, Kranz e outros, (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 5807), por meio de técnicas de "polidoma" (vide US 4.474.893) ou por meio de técnicas de DNA recombinante, as quais todas são conhecidas in- trinsecamente. Métodos adicionais são descritos em WO 91/00360, WO 92/05793 e WO 96/04305. Anticorpos biespecíficos podem também ser pre- parados a partir de anticorpos de cadeia simples (vide, por exemplo, Huston e outros (1988), Proc. Nati. Acad. Sei. 85, 5879; Skerra e Plueckthun (1988) Science 240, 1038). Esses são análogos de regiões de anticorpos variáveis produzidas como uma cadeia única de polipeptídeos. Para formar o agente de ligação biespecífico, os anticorpos de cadeia simples poderão ser aco- piados juntamente e quimicamente ou por métodos de engenharia genética conhecidos no estado da técnica. É também possível produzir anticorpos biespecíficos de acordo com esta invenção usando seqüências de zíper de leucina. As seqüências empregadas são derivadas das regiões de zíper de leucina dos fatores de transcrição Fos e Jun (Landschulz e outros, 1988, Science 240, 1759; para revisão, vide Maniatis e Abel, 1989, Nature 341, 24). Zíper de leucina são seqüências específicas de aminoácidos aproxima- damente de 20-40 resíduos de comprimento com leucina tipicamente ocor- rendo em cada sétimo resíduo. Essas seqüências de zíper formam hélices α antipáticas, com os resíduos de leucina dispostos no lado hidrofóbico de formação de dímero. Peptídeos que correspondem a zíper de leucina das proteínas Fos e Jun formam heterodímeros preferencialmente (0'Shea e outros, 1989, Science, 245, 646). Anticorpos biespecíficos contendo zíper e métodos para produzi-los são também descritos em WO 92/10209 e WO 93/11162.

O termo "imunoconjugado" refere-se a uma proteína de fusão e significa um anticorpo ou imunoglobulina, respectivamente, ou um fragmento imunologicamente eficaz deste, o qual é fundido por meio de ligação cova- lente com uma molécula não-imunologicamente eficaz. Preferencialmente, esse parceiro de fusão é um peptídeo ou uma proteína, o qual poderá ser glicosilado. Essa molécula não-anticorpo pode ser ligada ao término C das cadeias pesadas constantes do anticorpo ou aos términos N das cadeias variáveis leves e/ou pesadas. Os parceiros de fusão podem ser ligados via uma molécula ligando, a qual é, como regra, um peptídeo contendo 3-15 resíduos aminoácidos. Imunoconjugados de acordo com esta invenção são proteínas de fusão que consistem em uma imunoglobulina ou fragmento i- munoterapeuticamente eficaz deste, direcionadas a um receptor ErbB, e pre- ferencialmente uma citocina, tais como TNF-a, IFN-γ ou IL-2 ou um outro agente tóxico. Preferencialmente, essas moléculas baseadas em peptídeos ou proteína são ligadas com seu término N ao término C dessa imunoglobu- lina, que é a metade Fc desta. O termo "citocina" é um termo genérico de proteínas liberadas por uma população celular que age em uma outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos dentre as cito- cinas são hormônios de crescimentos tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionila, e hormônio de cres- cimento bovino; hormônio paratireoidiano; tiroxina; insulina; pró-insulina; re- laxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio foliculo- estimulante (FSH); hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio lutei- nizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso tais como NGΡβ; fator de crescimento plaquetário, fatores de crescimento transformante (TGFs) tais como TGFa e TGFP; eritropoietina (EPO); interfe- rons tais como IFN-a, IFN-β e IFN-γ; fatores estimulantes de colônia tais co- mo M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; e TNF-aou TNF-β. Citoci- nas preferidas de acordo com a invenção são interferons, TNF-α e IL-2.

O termo "imunoterapeuticamente ou imunobiologicamente efi- ca" refere-se a moléculas biológicas que causam uma resposta imune em um mamífero. Mais especificamente, o termo refere-se a moléculas que po- derão reconhecer e ligar-se a um antígeno. Tipicamente, anticorpos, frag- mentos de anticorpos e proteínas de fusão de anticorpos que compreendem seus sítios de ligação com antígeno (regiões determinantes complementa- res, CDRs) são imunoterapeuticamente eficazes.

A abordagem terapêutica desta invenção inclui como uma moda- lidade específica a administração de agentes adicionais terapeuticamente eficazes, que suportam o efeito desejado, por exemplo, toxicidade de tumor ou eficácia citostática, ou diminui ou impede efeitos colaterais indesejados. Desse modo, a invenção inclui a combinação desses agentes com a compo- sição farmacêutica definida e reivindicada acima e abaixo, em que os agen- tes poderão ser outros antagonistas de receptor ErbB, antagonistas de re- ceptor VEGF, citocinas, imunoconjugados de citocinas, agentes antiangio- gênicos, agentes anti-hormonais, ou agentes citotóxicos em geral. É também um objetivo desta invenção combinar as composições conforme definidas neste relatório com radioterapia de acordo com métodos conhecidos.

O termo "agente citotóxico" conforme usado neste contexto é definido muito amplamente e refere-se a uma substância que inibe ou impe- de a função de células e/ou causam destruição de células (morte celular), e/ou exerce efeitos antineoplásicos/antiproliferativos, por exemplo, impede direta ou indiretamente o desenvolvimento, maturação ou espalhamento de células tumorais neoplásicas. O termo inclui expressivamente também tais agentes que causam um efeito citostático apenas, e não um mero efeito cito- tóxico.

O termo "agente quimioterapêutico" é um subconjunto do termo "agente citotóxico" e significa especificamente agentes químicos que exer- cem efeitos antineoplásicos, preferencial e diretamente na célula tumoral, e menos indiretamente por meio de mecanismos tal como modificação de res- posta biológica. Agentes quimioterapêuticos adequados de acordo com a invenção são" preferencialmente compostos químicos naturais ou sintéticos. Há grandes números de agentes químicos antineoplásicos disponíveis no uso comercial, na avaliação clínica e no desenvolvimento pré-clínico, os quais podem ser incluídos na presente invenção para tratamentos de tumo- res/neoplasia por meio de terapia de combinação com os antagonistas de receptores conforme reivindicados e descritos nesta invenção. O termo inclui especialmente agentes conforme especificados abaixo, bem como outros antagonistas ErbB (tais como anticorpos anti-ErbB), agentes antiangiogêni- cos, inibidores de tirosina quinase, inibidores de proteína quinase A, mem- bros da família citocina, isótopos radioativos, e toxinas tais como toxinas en- zimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal. A- gentes quimioterapêuticos preferidos são amifostina (etiol), cisplatina, dacar- bazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostarda nitrogenada), es- treptozocina, ciclofosfamida, carnustina (BCNU), Iomustina (CCNU), doxor- rubicina (adriamicina), Iipo doxorrubicina (doxil), gencitabina (genzar), dau- norrubicina, Iipo daunorrubicina (daunoxoma), procarbazina, mitomicina, cita- rabina, etoposida, metotrexato, 5-fIuoruracila (5-FU), vimblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparagina- se, bussulfano, carboplatina, cladribina, camptotecina, CPT-11, 10-hidróxi-7- etil-camptotecina (SN38), gefitinib (Iressa), dacarbazina, floxuridina, fludara- bina, hidroxiuréia, ifosfamida, idarrubicina, mesna, alfa- interferon, beta- in- terferon, irinotecano, mitoxantrona, topotecano, Ieuprolida1 megestrol, melfa- lano, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargaso, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposida, testolac- tona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vinorelbina, clorambucila e combinações destes.

Agentes quimioterapêuticos mais preferidos de acordo com a invenção são cisplatina, gencitabina, doxorrubicina, paclitaxel (taxol) e bleo- micina.

Os termos "câncer" e "tumoi" referem-se ou descrevem a condi- ção fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizado por cresci- mento celular desregulado. Por meio das composições farmacêuticas de

- acordo com a presente invenção tumores podem ser tratados tais como tumores da mama, coração, pulmão, intestino delgado, colo, baço, rim, bexiga, cabeça e pescoço, ovário, próstata, cérebro, pân- creas, pele, osso, medula óssea, sangue, timo, útero, testículos, cérvix e fígado.

Tumores que podem ser preferencialmente tratados com as mo- léculas de anticorpos de acordo com a invenção são tumores sólidos ou me- tástases de tumor que expressam receptores ErbB, especialmente recepto- res ErbBI, em altas quantidades, tais como câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, SCLC, câncer de pâncreas mas com relação a receptores ErbB2 (HER2) também em quantidades menores.

O termo "biologicamente/funcionalmente eficaz!' ou "(quantidade) terapeuticamente eficaz'' refere-se a um fármaco/molécula que causa uma função biológica ou uma alteração de uma função biológica in vivo ou in vi- tro, e que é eficaz em uma quantidade específica para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero, preferencialmente em um ser humano.

"Radioterapia": De acordo com a invenção, os tumores podem adicionalmente ser tratados com radiação ou radiofarmacêuticos. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao paciente que está sendo tratado. Quando a fonte é externa ao paciente, a terapia é conhecida como terapia de radiação de feixes externos (externai beam radiation therapy (EBRT)). Quando a fonte de radiação é interna ao paciente, o tratamento é chamado braquiterapia (BT). Alguns átomos radioativos típicos que têm sido usados incluem rádio, césio-137 e irídio-192, amerício-241 e ouro-198, cobâlto-57; cobre-67; tecnécio-99, iodeto-123; iodeto-131; e índio-111. É também possí- vel marcar os agentes de acordo com a invenção com isótopos radioativos. Terapia de radiação atualmente é o tratamento padrão para controlar tumo- res irressecáveis ou inoperáveis e/ou metástases de tumores. Resultados aperfeiçoados são observados quando terapia de radiação é combinada com quimioterapia.

"Tratamento farmacêutico":. Os agentes desta invenção podem ser administrados parenteralmente por meio de injeção ou por meio de infu- são gradual ao longo do tempo. Embora o tecido a ser tratádõ pode tipica- mente ser acessado no corpo através de administração sistêmica e, portan- to, mais freqüentemente, tratado por meio de administração intravenosa de composições terapêuticas, outros tecidos e dispositivos de transferência são contemplados em que há uma probabilidade de que o tecido direcionado contém a molécula-alvo. Desse modo, os agentes desta invenção podem ser administrados intra-ocular, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcu- tânea, intracavidade, transdermicamente, por meio de injeção e infusão orto- tópica, e podem ser também transferidos por meios peristálticos.

Composições terapêuticas da presente invenção contêm um ve- ículo fisiologicamente tolerável juntamente com o agente relevante, confor- me descrito neste relatório, dissolvido ou disperso nele como um ingrediente ativo.

Conforme usado neste relatório, o termo "farmaceuticamente aceitável' refere-se a composições, veículos, diluentes e reagentes que re- presentam materiais que são capazes de administração a, ou sob um mamí- fero sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis tais como náuseas, vertigem, indisposição gástrica, e similares. A preparação de uma composi- ção farmacológica que contém ingredientes ativos dissolvidos ou dispersos nela é bem-entendida no estado da técnica e não precisa ser limitada com base na formulação. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis ou como soluções ou suspensões líquidas, contudo, formas sóli- das adequadas para solução, ou suspensões, em líquido antes de uso po- dem ser também preparadas. A preparação pode também ser emulsificada. O ingrediente ativo pode ser misturado com excipientes que são farmaceuti- camente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo e em quantidades adequadas para uso nos métodos terapêuticos descritos neste relatório. Ex- cipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glice- rol, etanol ou similares, e combinações destes. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e similares que acentuam a eficácia do ingrediente ativo. A composição terapêutica da presente invenção pode incluir sais farmaceuticamente acei- táveis dos componentes nesse particular. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácidd (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por e- xemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como acé- tico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por e- xemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e similares. Veículos fisiologicamente toleráveis são bem- conhecidos no estado da técnica. Exemplos de veículos líquidos são solu- ções aquosas estéreis que contêm nenhum material além dos ingredientes ativos e água, ou contêm um tampão tal como fosfato de sódio sob valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, tal como solução salina fosfato tamponada. Ainda adicionalmente, veículos aquosos podem conter mais de um sal de tampão, bem como sais tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose, polietileno glicol e outros solutos. Composições líquidas podem também conter fases líquidas além de, e à exclusão de água. Exem- plos de tais fases líquidas adicionais são glicerina, óleos vegetais tal como óleo de caroço de algodão, e emulsões água-óleo.

Tipicamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente imunoterapêutico, por exemplo, na forma de um anticorpo que blo- queia receptor ErbB (ErbB1, ErbB2) ou um conjugado de anticorpo corres- pondente é uma quantidade tal que, quando administrada na composição fisiologicamente tolerável, é suficiente para obter uma concentração plasmá- tica de aproximadamente 0,01 micrograma ^g) por mililitro (ml) a aproxima- damente 100 μg/ml, preferencialmente de aproximadamente 1 μg/ml a apro- ximadamente 5 μg/ml e usual e aproximadamente 5 μg/ml. Diferentemente estabelecida, a dosagem pode variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a a- proximadamente 300 mg/kg, preferencialmente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, mais preferencialmente de aproxima- damente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, em uma ou mais adminis- trações de dose diária em relação a um ou diversos dias. Em que o agente imunoterapêutico é na forma de um fragmento de um anticorpo monoclonal ou um conjugado, a quantidade pode prontamente ser ajustada com base na massa do fragmento/conjugado em relação à massa do anticorpo total. Uma concentração plasmática preferida em molaridade é de aproximadamente 2 micromolar (μΜ) a aproximadamente 5 milimolar (mM) e preferencialmente, aproximadamente 100 μΜ a 1 mM de antagonista de anticorpos.

A dosagem típica de um agente ativo, que é um agente prefe- rencialmente, um agente citotóxico químico ou quimioterapêutico de acordo com a invenção (nem um agente imunoterapêutico nem um peptí- deo/proteína não-imunoterapêutico) é de 10 mg a 1.000 mg, preferencial e aproximadamente de 20 a 200 mg, e mais preferencialmente de 50 a 100 mg por quilograma de peso corporal por dia.

As composições farmacêuticas da invenção podem compreen- der expressão que abrange tratamento de um indivíduo com agentes que reduzem ou evitam efeitos colaterais associados à terapia de combinação da presente invenção ("terapia adjuvante", incluindo, mas não limitado a, esses agentes, por exemplo, que reduzem o efeito tóxico de fármacos anticancerí- genos, por exemplo, inibidores de reabsorção óssea, agentes cardioproteto- res. Esses agentes adjuntivos impedem ou reduzem a incidência de náusea e vômito associados à quimioterapia, radioterapia ou operação, ou reduzem a incidência de infecção associada à administração de fármacos anticance- rígenos mielossupressores. Agentes adjuntivos são bem-conhecidos no es- tado da técnica. Os agentes imunoterapêuticos de acordo com a invenção podem ser adicionalmente administrados com adjuvantes tais como BCG e estimuladores do sistema imune. Além disso, as composições poderão inclu- ir agentes imunoterapêuticos ou agentes quimioterapêuticos que contêm isótopos radiomarcados citotóxicos eficazes, ou outros agentes citotóxicos, tais como peptídeos citotóxicos (por exemplo, citocinas) ou drogas citotóxi- cas e similares.

FONTE DE LINHAGENS CELULARES

Linhagens Celulares e Condições de Cultura. Linhagens Celula- res humanas de carcinoma pancreático (BxPC-3 e MiaPaCa-2), ovariano (SK-OV-3), e epidermóide vulvar (A-431) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA). A linhagem celular BxPC-3 foi cultivada em meio RPMI-1640 (Gibco, Paisley, RU); as linhagens celula- res MiaPaCa-2, SK-OV-3 e A-431 foram cultivadas em meio DMEM (Gibco). Os meios de cultura foram suplementados conforme recomendados por ATCC.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

Figura 1. Análises imunocitoquímicas e citometria de fluxo de expressão de EGFR e HER2 nas duas linhagens celulares de carcinoma pancreático, BxPC-3 e MiaPaCa-2 e nas duas linhagens celulares de referência, A-431 e SK-OV-3 usadas como controles positivos de EGFR e HER2, respectiva- mente. CN (controles negativos): tecidos incubados apenas com o conjuga- do imunoperoxidase. Em análises de citometria de fluxo, picos pretos e cin- zas representam coloração de superfície celular com os anticorpos anti- EGFR e anti-HER2, respectivamente. Os picos brancos representam contro- les, obtidos com células incubadas apenas com o segundo anticorpo marca- do FITC.

Figura 2. Efeitos de trastuzumab e matuzumab isolados ou em combina- ção no crescimento de xenoenxertos de BxPC-3 de tamanho pequeno em camundongos sem pêlos (experimento S). Volumes de tumores de pretrata- mento médio foram de 77 ± 49 mm3. Camundongos (oito por grupo) recebe- ram injeções i.p. de 50 ng de cada mAb duas vezes par semana por quatro semanas. Resultados são expressos como progressão de tumor: [(volume final)-(volume inicial)]/(volume inicial). C: controle; T: trastuzumab; M: matu- zumab; T + M: trastuzumab + matuzumab. Figura 3. Efeitos de trastuzumab e matuzumab isolados ou em combina- ção no crescimento de xenoenxertos de BxPC-3 de tamanho grande em ca- mundongos sem pêlos (experimento L). Volumes de tumores de pretrata- mento médio foram de 502 ± 205 mm3. Camundongos (cinco por grupo) re- ceberam injeções i.p. de 50 ng ou 200 ng de cada mAb duas vezes uma se- mana por quatro semanas. A, curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier obti- das como uma função de tempo adaptada para tumor primário atingir* urrí volume de 1.500 mm3. C: controle; T: trastuzumab (200 μg por injeção); M: matuzumab (200 μg por injeção); T + M: trastuzumab + matuzumab (50 ou 200 μg de cada mAb por injeção). B, resultados dos mesmos experimentos, expressos como curvas de progressão de tumor. Setas de pontas duplas indicam o período de tratamento.

Fioura 4. A, Efeitos de trastuzumab e matuzumab isolados ou em combina- ção no crescimento de xenoenxertos de MiaPaCa-2 em camundongos sem pêlos. Volumes de tumores de pretratamento médio (seis por grupo) foram de 64 ± 5 mm3. Camundongos receberam injeções i.p. de 50 μg de cada mAb duas vezes uma semana por quatro semanas a partir do 15° a 43e. dia. A, Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier obtidas como uma função de tempo adaptada para tumor primário atingir um volume de 2.000 mm3. C: controle; T: trastuzumab; M: matuzumab; T + M: trastuzumab + matuzumab. B, Efeitos de trastuzumab e matuzumab isolados ou em combinação no crescimento de xenoenxertos de SK-OV-3 em camundongos sem pêlos. Vo- lumes de tumores de pretratamento médio (seis por grupo) foram de 42 ± 4 mm3. Camundongos receberam injeções i.p. de 200 μg de cada mAb duas vezes uma semana por quatro semanas a partir do 11° a 40° dias. A, Cur- vas de sobrevivência de Kaplan-Meier para tumor primário atingir um volume de 1.000 mm3. C: controle; T: trastuzumab; M: matuzumab; T + M: trastuzu- mab+ matuzumab.

Figura 5. Efeito in vitro de trastuzumab e matuzumab isolados ou em combi- nação na fosforilação de EGFR e HER2 em linhagens celulares de BxPC-3 e MiaPaCa-2. As células foram incubadas com 10 ng/ml de cada mAb por 48 horas seguidas por 10 minutos com 100 ng/ml de EGFR ou nenhum EGF. Painel superior: análise de western blot, GAPDH = controle de carga. Painel inferior: quantificação de fosforilação de receptores, expressa em porcenta- gem de controle e plotada como um gráfico de barras, mostra a inibição in- duzida pelas condições de tratamento indicadas. C:

controle; T: trastuzumab; M: matuzumab; T/M: trastuzumab + matuzumab. Figura 6. Localização de tumor e biodistribuição de anticorpos matuzumab e trastuzumab radiomarcados em camundongos atímicõs NMRI transportando xenoenxertos de BxPC-3 (A) ou MiaPaCa-2 (B) de carcinoma pancreático humano. Os camundongos receberam uma co-injeção i.v. de 125I- matuzumab e 131I-trastuzumab. Os camundongos foram sacrificados quaren- ta e oito horas pós-injeção. O tumor, e todos os órgãos normais foram pesa- dos, e a radioatividade diferencial foi medida em um contador de cintilação (cintilógrafo) de duplo canal. Os resultados são expressos como a porcenta- gem da dose injetada de radioatividade presente por grama de tecido (% de Dl/g).

Figura 7. Inibição de crescimento in vitro de células BxPC-3 tratadas com trastuzumab e matuzumab isolados ou em combinação. As células BxPC-3 foram semeadas em 10.000 células/cavidade em uma placa de 96 cavidades e deixadas aderir-se da noite para o dia. No dia seguinte, as células foram tratadas com trastuzumab e matuzumab isolados ou em combinação sob uma razão fixa 1:1. Após cinco dias, o ensaio MTS foi realizado conforme descrito in Materials and Methods (Materiais e Métodos). Cada valor repre- senta a média ± SEM (n = 6).

EXEMPLOS:

Exemplo 1

Estudo de Inibição de Crescimento de Tumor In vivo

Todos os experimentos in vivo foram realizados de acordo com as normas francesas de estudos experimentais animais (Acordo No. B34- 172-27). Camundongos sem pêlos, camundongos fêmeas NMRI atímicas e camundongos atímicos BALB/c de 6-8 semanas de idade foram adquiridos de Janvier, Le Genest (St. Isle, França) e Charles Rivers Laboratories (UArbresle, França), respectivamente. Células BxPC-3 (3,5 X 106), MiaPa- Ca-2 (5 X 106) e SK-OV-3 (5 X 106) foram injetadas subcutaneamente (s.c.) no flanco direito de camundongos sem pêlos NMRI atímico (modelo BxPC-3) e BALB/c (MiaPaCa-2 e SK-OV-3). As células MiaPaCa-2 foram suspensas em 50% de meio de cultura e 50% de Matrigel (BD biosciences, Le Pont De claix, França). Camundongos transportando tumores foram randomizados nos diferentes grupos de tratamento quando os tumores atingiram um volu- me aproximado indicado, em cada experimento. Em relação a modelo BxPC- 3, efeitos de tratamentos com anticorpos foram estudados em tumores pe- quenos (experimento S) e em tumores grandes (experimento L). Os camun- dongos foram tratados por meio de injeções intraperitoneais (i.p.) com NaCI a 0,9%, trastuzumab, matuzumab, ou ambos os mAbs sob uma razão de 1:1. As quantidades de cada mAb injetado foram 50 ng ou 200 ng por inje- ção dependendo do experimento, duas vezes uma semana para quatro se- manas consecutivamente. Dimensões de tumores foram medidas duas ve- zes semanalmente com um calibrador e os volumes calculados pela fórmula: D1 χ D2 χ D3/2. Progressão do tumor foi calculada usando a fórmula: [(vo- lume final)-(volume inicial)]/(volume inicial). Os resultados foram também expressos por uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier adaptada, u- sando o tempo tomado para o tumor atingir um volume determinado de 1.000 mm3 em relação a xenoenxertos de SK-OV-3, 1.500 mm3 em relação a BxPC-3 e 2.000 mm3 em relação a MiaPaCa-2, dependendo da rapidez de crescimento dos tumores. Um atraso mediano foi definido como o tempo em que 50% dos camundongos apresentavam um tumor atingindo o volume de- terminado. Em relação a experimento S no modelo BxPC-3, um fator de in- cremento durante o período de tratamento foi calculado dividindo o volume do tumor no término de tratamento (55° dia) por aquele no início do trata- mento (27Q. dia).

Exemplo 2:

Análises Imunocitoquímicas.

Expressão de receptores foi analisada em células embebidas em parafina fixas em AFA (álcool formol de ácido acético). Análise de expressão de EGFR foi realizada por meio de uso do kit de EGFR pharmDx (DakoCy- tomation, Carpinteria, CA, USA) de acordo com as recomendações do fabri- cante. Diaminobenzidina (Dakocytomatiori) foi usada como o cromogênio, e as seções foram ligeiramente contracoradas com hematoxilina. O anticorpo primário usado para a detecção de HER2 foi um anticorpo policlonal de coe- lho (Dakocytomation).

Exemplo 3:

Análise de Imunobiotting.

Células BxPC-3 e MiaPaCa-2, plaqueadas em 106 células por 24 horas em placas de Petri foram desnutridas (starved) por dois dias em um meio sem fatores de crescimento (meio SM) e tratadas com 10 ng/ml de trastuzumab, matuzumab ou ambos os anticorpos em uma razão fixa 1:1 (ou controles sem anticorpos). Após uma incubação de 48 horas, as células fo- ram incubadas por 10 minutos no meio SM com ou sem 100 ng/ml de EGF, lavadas duas vezes, e Iisadas com tampão (CIiniSciences SA, Montrouge, França) contendo PMSF 100 NM, fluoreto de sódio 100 mM, ortovanato de sódio 1 mM, e um comprimido de mistura de inibidor de protease completo (Sigma, St. Louis, MO). Após eletroforese em 8% de SDS-PAGE sob condi- ções não-redutoras, as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore Co., Bedford, MA) as quais foram satu- radas em PBS contendo 0,1% de Tween 20 e 5% de leite em pó desnatado e em seguida incubadas com os anticorpos contra as formas fos- foriladas de EGFR e HER2, obtidas de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Para assegurar carga igual, imunoblots foram também sondados (pro- bed) com anticorpo anti-GAPDH (gliceraldeídos-3-fosfato desidrogenase) (Chemicon International, Austrália). Exemplo 4:

Ensaio de Viabilidade Celular.

Avaliou-se o efeito de trastuzumab e/ou EMD72000 em viabili- dade celular usando um sal de tetrazólio (MTS) e um ensaio de reagente de acoplamento eletrônico (PMSF). Resumidamente, as células BxPC-3 foram plaqueadas em placas de microtitulação de 96 cavidades em 10.000 célu- las/cavidades em 100 Hl de meio. Após 24 horas, as células foram tratadas com anticorpos sob concentrações que variam de 5 a 100 Hg/ml. Após incu- bação de 96 horas, as células foram expostas a reagente MTS (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) e in- cubadas a 37°C por 2 horas. Mediu-se absorbância sob 490 nm, e a inibição percentual de viabilidade foi calculada como a porcentagem de células proli- ferativas comparadas com culturas não-tratadas. Todos os experimentos iTOram realizados em triplicata.

Claims

1. Uso de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-HER2 e um anticorpo anti-EGFR para a produção de um me- dicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer nesse indivíduo expressa EGFR e HER2, em que HER" é expresso em ní- veis baixos que não são suficientes para responder significativamente a tra- tamento com anticorpo anti-HER2 isolado.

2. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 1, no qual o anticorpo anti-HER2, quando dado isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou heterodimerização de HER2/EGFR, e o anticorpo anti-EGFR, quando dado isolado, significati- vamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodimerização de EG- FR/HER2.

3. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 1 ou 2, no qual o câncer não superexpressa HER2.

4. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 1 ou 2, no qual o câncer superexpressa EGFR.

5. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 1 ou 2, no qual o câncer não superexpressa HER2 mas superex- pressa EGFR.

6. Uso de uma composição farmacêutica, de acordcf com qual- quer uma das reivindicações 1 - 5, no qual o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

7. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 - 5, no qual o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

8. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 - 5, no qual o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado e o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

9. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 - 8, no qual o câncer é pancreático ou câncer de mama.

10.Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 - 9, no qual os anticorpos são fragmentos imunologicamente eficazes.

11. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações T- 10, no qual adicionalmente adiciona-se um agente citotóxico.

12. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 11, no qual o agente citotóxico é um agente quimioterapêutico, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em cisplatina, doxor- rubicina, gencitabina, docetaxel, paclitaxel, bleomicina e irinotecano.

13. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 11, no qual o agente citotóxico é um inibidor de receptor VEGF, um inibidor tirosina quinase de molécula pequena, um agente antiangiogêni- co, ou uma citocina.

14. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 -13, no qual um ou ambos desses anticorpos são fundidos em seu término C com um peptídeo, polipeptídeo ou proteína biologicamente eficaz, opcionalmente via um peptídeo ligando, formando desse modo um imunoconjugado.

15. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 14, no qual o imunoconjugado é uma imunocitocina.

16. Uso de uma composição farmacêutica, o qual compreende um anticorpo biespecífico que apresenta as especificidades dos dois anti- corpos conforme especificados em qualquer uma das reivindicações 1-15.

17. Uso de uma composição farmacêutica, o qual compreende um anticorpo anti-HER2 e um anticorpo anti-EGFR para a produção de um me- dicamento para aperfeiçoar a eficácia do tratamento de câncer em um indi- víduo com o anticorpo anti-HER2, em que o câncer nesse indivíduo expres- sa HER2 em níveis que não são suficientes para responder significativamen- te a esse tratamento com anticorpo anti-HER2 isolado, e EGFR em níveis que são suficientes para responder significativamente a um anticorpo anti- EGFR.

18. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 17, no qual o anticorpo anti-HER2, quando dado isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou heterodimerização de HER2/EGFR, e o anticorpo anti-EGFR, quando dado isolado, significati- vamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodimerização de EG- FR/HER2.

19. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com a rei- vindicação 17 ou 18, em que nesse câncer HER2 não é superexpresso e EGFR é superexpresso.

20. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 - 19, no qual o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado e o anticorpo anti- EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

21. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 - 20, no qual o câncer é pancreático ou cân- cer de mama.

22. Método para tratamento de câncer que expressa HER2 e EG- FR em um indivíduo, no qual o câncer nesse indivíduo expressa HER2 em níveis que não são suficientes para responder significativamente a um anti- corpo anti-HER2, quando dado isolado ao indivíduo, método este que com- preende administrar ao indivíduo um anticorpo anti-HER2, que, quando dado isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou hete- rodimerização de HER2/EGFR, e um anticorpo anti-EGFR, que, quando da- do isolado, significativamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodimeri- zação de EGFR/HER2.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual HER2 não é superexpresso.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual EGFR é superexpresso.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual HER2 não é superexpresso mas EGFR é superexpresso.

26.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 - -25, no qual o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimé- rico ou humanizado.

27.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 - -25, no qual o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quiméri- co ou humanizado.

28.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 - -25, no qual o anticorpo anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimé- rico ou humanizado e o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) muri- no, quimérico ou humanizado.

29.Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual o câncer é pancreático ou câncer de mama.

30.Método para aperfeiçoar a eficácia do tratamento de câncer que expressa HER2 e EGFR com um anticorpo anti-HER2, no qual o câncer expressa HER2 em níveis que não são suficientes para responder significa- tivamente ao tratamento com anticorpo anti-HER2 isolado; método este que compreende administrar a um indivíduo um anticorpo anti-HER2, que, quan- do dado isolado, não ou não significativamente inibe dimerização de HER2 e/ou heterodimerização de HER2/EGFR, e um anticorpo anti-EGFR, que, quando dado isolado, significativamente inibe dimerização de EGFR e/ou heterodimerização de EGFR/HER2.

31 .Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual HER2 não é expresso.

32.Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual EGFR é superexpresso no câncer.

33.Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual HER2 não é expresso mas EGFR é superexpresso.

34.Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual o anticor- po anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

35.Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual o anticor- po anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou humanizado.

36. Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual o anticor- po anti-HER2 é mAb 4D5 (trastuzumab) murino, quimérico ou humanizado e o anticorpo anti-EGFR é mAb 425 (matuzumab) murino, quimérico ou huma- nizado.

37.Método, de acordo com a reivindicação 30, no qual o câncer é pancreático ou câncer de mama.