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BRPI0613164A2 - anticorpos anti mcp-1, composições, métodos e usos - Google Patents

anticorpos anti mcp-1, composições, métodos e usos Download PDF

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BRPI0613164A2
BRPI0613164A2 BRPI0613164-6A BRPI0613164A BRPI0613164A2 BR PI0613164 A2 BRPI0613164 A2 BR PI0613164A2 BR PI0613164 A BRPI0613164 A BR PI0613164A BR PI0613164 A2 BRPI0613164 A2 BR PI0613164A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
mcp
antibody
human
drug
cells
Prior art date
Application number
BRPI0613164-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Anuk Das
Raymond Sweet
Ping Tsui
Michael Baedroff
Original Assignee
Centocor Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centocor Inc filed Critical Centocor Inc
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
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Abstract

ANTICORPOS ANTI MCP-1, COMPOSIçõES, MéTODOS E USOS. A presente invenção se refere à pelo menos um novo anticorpo anti-MCP-1, incluindo ácidos nuclélcos isolados que codificam pelo menos um anticorpo anti MCP-1, MCP-1, vetores, células hospedeiras, animais ou plantas transgênicas, e métodos para a fabricação e utilização do mesmo, incluindo composições terapêuticas, métodos e dispositivos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS ANTI MCP-1, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS".
Antecedentes da Invenção
Referência cruzada à Pedidos de Patente Relacionados.
A presente invenção reivindica prioridade com relação aos pedi-dos de patente provisórios U.S. Série de Ne 60/682654 e 60/682620, o teordos quais fica incorporado em sua totalidade por referência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a anticorpos, incluindo partes ouvariantes, específicos para pelo menos uma proteína quimioatrativa de mo-nócitos-1 (MCP-1) ou a um fragmento da mesma, bem como a anticorposantiidiotipo, e a ácidos nucléicos que codificam tais anticorpos anti-MCP-1,ácidos nucléicos complementares, vetores, células hospedeiras, e a méto-dos para a fabricação e o uso dos mesmos, incluindo formulações terapêuti-cas, administração e dispositivos.
Técnica Relacionada
A Proteína Quimioatrativa de Monócitos-1 (MCP-1) humana(também denominada de CCL-2) uma proteína de 8,6 kDa contendo 76 resí-duos de aminoácidos, é um membro da família da quimiocina-beta (ou C-C)das citocinas. As quimiocinas são proteínas quimotáticas, de baixo peso mo-lecular (8 a 10 kDa), inctazíveis, pró-inflamatórias que tem mostrado atuarem um papel central na transmigração perivascular e na acumulação desubconjuntos específicos de leucócitos em locais de lesões de tecido. Foramdefinidas duas famílias principais que dependem do posicionamento de qua-tro cisteínas conservadas. As CXC ou α-quimiocinas atraem predominante-mente os neutrófilos, enquanto que as CC ou β-quimiocinas atraem predo-minantemente os monócitos e outros leucócitos, porém não os neutrófilos(Leonard e Yoshimura et al., 1990). Membros da família da Proteína Quimio-atrativa de Monócito"s-1 (MCP-1) formam um componente principal da famíliaC-C de quimiocinas e são consideradas as quimiocinas principais envolvidasno recrutamento de monócitos, macrófagos, e linfócitos ativados. Observan-do a homologia das MCP-1 a partir de espécies diferentes, a MCP-1 humanae do macaco são diferentes somente em 2 aminoácidos revelando uma se-qüência de identidade de 97%, enquanto que a MCP-1 murina, uma proteínade 13,8 kDa, contendo 125 resíduos de aminoácidos, é diferente da MCP-1humana em tamanho molecular e no grau de glicosilação.
Os receptores da quimiocina pertencem a grande família dosreceptores do domínio de sete transmembranas (7 TM) acoplados a proteínaG (os GPCR também denominados como receptores serpentinos). Com ba-se na nomenclatura dos receptores estabelecida na Gordon Research Con-ference de 1996 com relação às citocinas quimotáticas, os receptores dequimiocina que se ligam as quimiocinas CXC são designados como os CX-CR e os receptores que se ligam as quimiocinas CC são designados comoos CCR.
A MCP-1 é conhecida como se ligando e sinalizando através doreceptor de quimiocina CCR2. O CCR2 é um receptor acoplado a proteína Gatravessando sete transmembranas expresso em muitas células incluindomonócitos, células T, células B, e basófilos. Dois receptores específicos paraa MCP-1, CCR2A e CCR2B, foram clonados e que sinalizam em resposta aconcentração nano molares (nM) de MCP-1. Os CCR2A (CC-CKR2A) eCCR2B, (CC-CKR2A) representam dois cDNA que codificam dois receptoresespecíficos de MCP-1, com caudas de carboxila divididas de forma alternati-va. A MCP-1 se liga a ambas as isoformas com alta afinidade, a MCP-1 in-duz o fluxo de cálcio nas células expressando o CCR2B, porém, não nascélulas que expressam CCR2A. % vezes menos do MCP-1 induz a quimio-taxia em células que expressam o CCRB2 quando comparadas com as célu-las que expressam o CCR2A.
São conhecidas outras proteínas com determinadas homologiafuncionais e de seqüência a MCP-1 humana. Especialmente similares aMCP-1 (GenBank NP_002973) são a MCP-2 (GenBank NP_005614) e aeotaxina (GenBank P_51671); a MCP-2 que tem 61,8 por cento e a eotaxi-na-1 que tem 63,2 por cento de identidade de seqüência com a MCP-1. Afaixa de atividades e o espectro do envolvimento dessas proteínas no meca-nismo homeostático e a patologia humanas não é tão bem compreendidocom relação aos homólogos da MCP-1. Por exemplo, a MCP-2 (renomeadacomo CCL8) é relacionada intimamente a MCP-1 e a MCP-3 (renomeadacomo CCL7, Genbank NP_006264) e usa ambos os CCR1 e o CCR2B comoos seus receptores funcionais. A MCP-3 se liga a um receptor denominadoD6. A MCP-3 também se liga aos CCR10 e CCR1. A seqüência da proteínaMCP-3 (97 aminoácidos) exibe 74 por cento de identidade com a MCP-1 e58 por cento de homologia com a MCP-2. A MCP-3 secretada é diferente daMCP-1 em sendo N-glicosilada. A MCP-4 (renomeada como CCL13, Gen-bank NP_005399) compartilha em 56 a 61 por cento de identidade de se-qüência com as três proteínas quimotáticas de monócitos e é 60 por centoidêntica com a Eotaxina-1. As funções da MCP-4 parecem ser altamentesimilares com aquelas da MCP-3 e a Eotaxina. Tal como a MCP-3, a MCP-4é um potente atrativo químico para monócitos e linfócitos T. Ela é inativa so-bre os neutrófilos. Nos monócitos o MCP-4 se liga aos receptores que reco-nhecem os receptores de MCP-1, MCP-3, RANTES (CCL5), e eotaxina (osreceptores CCR1 e CCR3) e exibem uma desensibilização cruzada total coma eotaxina-1. A MCP-5 é quimiocina CC murina e é relacionada mais proxi-mamente a MCP-1 humana (66% de identidade de aminoácidos), O símbolodo gene para a MCP-5 é SCYA12 (renomeada CCL12). As células transfec-tadas com o receptor da quimiocina CCR2 foram mostradas como respon-dendo a MCP-5. Para informação geral sobre as citocinas e as quimiocinasvide http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, e para o sistema de classifi-cação atual,Zlotnik A., Yoshie O. 2000 Chemokines: a new classification sys-tem and their role in immunity. Immunity 12:121 -127.
A 125I-MCP-1 se liga a monócitos e análise de gráfico de Scat-chard indicou que os monócitos têm um mínimo de ~ 1700 sítios de ligaçãopor célula com um Kd de ~ 2 nM (Yoshimura e Leonard, 1990). Experimen-tos posteriores de equilíbrio de ligação com monócitos humanos revelaram apresença de aproximadamente 3000 sítios de ligação por célula com um Kdde 0,77 nM (Ernst et al., 1994). A 125I-MCP-1 também demonstrou uma li-gação de alta afinidade a células dEoL-3 expressando o receptor CCR2 umvalor de Kd de 0,4 nM (Sarau et al., 1997) confirmando a afinidade sub na-nomolar da MCP-1 ao seu receptor. Para a identificação das regiões daMCP-1 que entram em contato som o seu receptor CCR2, todos os resíduoscom superfícies expostas foram substituídos com alanina. Alguns resíduostambém sofreram mutação para outros aminoácidos para a identificação daimportância da carga, capacidade hidrófoba, ou aromática em posições es-pecíficas. Dois aglomerados de resíduos básicos primários (R24, K35, K38,K49, e Y13), separados por um sulco hidrófobo 35 A1 reduziram o nível deligação por de 15 a 100 vezes. Os dados sugerem um modelo no qual umagrande área de superfície da MCP-1 entra em contato com o receptor, e ocúmulo de uma quantidade de interações fracas resulta na afinidade 35 pMobservada com relação à proteína do tipo natural (WT) (Hemmerich et al.,1999). A faixa de afinidades a partir de 2 nM para baixo até 35 mM na litera-tura pode ser devido às análises usadas e as respectivas limitações dasanálises.
São conhecidas outras proteínas com determinada homologiafuncional e de seqüência com relação à MCP-1 humana. Especialmente si-milares a MCP-1 (GenBank NP_002973) são a MCP-2 (GenBankNP_005614) e a eotaxina (GenBank P_51671); a MCP-2 que tem 61,8 porcento e a eotaxina-1 que tem 63,2 por cento de identidade de seqüênciacom a MCP-1. A faixa de atividades e o espectro do envolvimento dessasproteínas no mecanismo homeostático e a patologia humanas não é tão bemcompreendido com relação aos homólogos da MCP-1. Por exemplo, a MCP-2 é relacionada intimamente a MCP-1 e a MCP-3 (Genbank NP_006264) eusa ambos os CCR1 e o CCR2B como os seus receptores funcionais. AMCP-3 se liga a um receptor denominado D6. A MCP-3 também se liga aoCCR10. A proteína MCP-3 (97 aminoácidos) exibe 74 por cento de identida-de com a MCP-1 e 58 por cento de homologia com a MCP-2. A MCP-3 se-cretada é diferente da MCP-1 em sendo N-glicosilada. A MCP-4 (GenbankNP_005399) compartilha em 56 a 61 por cento de identidade de seqüênciacom as três proteínas quimotáticas de monócitos e é 60 por cento idênticacom a Eotaxina-1. As funções da MCP-4 parecem ser altamente similarescom aquelas da MCP-3 e a Eotaxina. Tal como a MCP-3, a MCP-4 é um po-tente atrativo químico para monócitos e linfócitos T. Ela é inativa sobre osneutrófilos. Nos monócitos o MCP-4 se liga aos receptores que reconhecemMCP-1, MCP-3, RANTES (CCR2). Nos esinófilos o MCP-4 tem uma eficáciae potência similar como o MCP-3, RANTES e Eotaxina. O MCP-4 comparti-lha receptores com a eotaxina (CCR1 e CCR3) uma desensibilização cruza-da total com a eotaxina-1.
Outros anticorpos capazes de se ligar a MCP-1 tem sido infor-mados: a JP JP9067399 descreve um anticorpo obtido a partir de células desangue isoladas e a JP05276986 descreve um hibridoma que secreta umMCP-1 IgG anti-humano. Mais recentemente, anticorpos capazes de se ligara uma pluralidade de beta-quimiocinas incluindo a MCP-1 foram descritos(WO 03048083) e um anticorpo se ligando a MCP-1 que também se liga aeotaxina (US 20040047860).
Por conseqüência, existe uma necessidade de prover anticor-pos específicos para a MCP-1 humana para uso em terapia para a diminui-ção ou a eliminação dos sintomas de doenças dependentes da MCP-1, bemcomo aperfeiçoamento com relação a anticorpos conhecidos ou fragmentosdos mesmos.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona anticorpos isolados anti MCP-1humanos, de primatas, roedores, mamíferos, quiméricos humanizados e/ouenxertados CDR, e outras proteínas derivadas da imunoglobulina, fragmen-tos, produtos de clivagem e outras partes específicas de variantes das mes-mas, bem como composições de anticorpos anti MCP-1, ácidos nucléicoscodificando ou complementares, vetores, células hospedeiras, composições,formulações, dispositivos, animais transgênicos, plantas transgênicas e mé-todos para a fabricação e utilização dos mesmos, como descritos e possibili-tados aqui, neste pedido de patente, em combinação com o que é conhecidona técnica. Além das composições de anticorpos da invenção como descri-tas aqui, neste pedido de patente, o anticorpo da presente invenção é defini-do através da sua afinidade com relação à MCP-1 humana, especificidadecom a MCP-1 humana, e a capacidade de bloquear a bioatividade da àMCP-1.
A presente invenção também proporciona pelo menos um anti-corpo anti MCP-1, tal como, porém não limitados a pelo menos um anticor-po, proteína de fusão ou fragmentos de anticorpo, como descritos aqui, nes-te pedido de patente. Um anticorpo de acordo com a presente invenção in-clui qualquer proteína ou peptídio que contenha uma molécula que compre-enda pelo menos uma parte de uma molécula de imunoglobulina, tal como,porém não limitadas a, pelo menos um domínio de ligação com ligante, talcomo, porém não limitado a, uma região variável de cadeia leve ou de ca-deia pesada, uma região determinante complementar (CDR) de uma cadeialeve ou pesada ou uma parte de um ligante da mesma como provida na Ta-bela 4A, B1 D e E (SEQ ID NO: 6 a 26); e opcionalmente associada funcio-nalmente com uma região de estrutura (como por exemplo, FR1, FR2, FR3,FR4 ou um fragmento da mesma como descrito na Tabela 4C (SEQ ID NO:2 a 5), também compreendendo opcionalmente pelo menos uma CH1, do-bradiça, CH2 ou CH3 de uma imunoglobulina humana. A pelo menos umaseqüência de aminoácido de um anticorpo podem também compreender op-cionalmente pelo menos uma substituição, inserção ou anulação especifica-da como descrito aqui, neste pedido de patente ou como conhecido na téc-nica.
Em uma modalidade, as partes de ligação ao ligante do anticor-po compreendem as SEQ ID NO: 27 ou 28. Em um aspecto, a presenteinvenção proporciona pelo menos um anticorpo anti MCP-1 isolado de ma-mífero, que compreende pelo menos uma região variável compreendendo asSEQ ID NO: 27 ou 28.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona pelo menosum anticorpo anti MCP-1 isolado de mamífero, compreendendo tanto (i) to-das as regiões determinantes complementares da cadeia pesada (CDR) dasseqüências de aminoácido das ID NOS: 6, 7 e 9; ou (ii) todas as seqüênciasCDR de aminoácido da cadeia leve das SEQ ID NOS: 13, 14 e 16.
A presente invenção proporciona, em um aspecto, moléculasisoladas de ácido nucléico compreendendo, complementares ou se hibridi-zando a, um polinucleotídio que codifica anticorpos específicos anti MCP-1,que compreendem pelo menos uma seqüência especificada, parte de domí-nio ou variante da mesma. A presente invenção também proporciona vetoresrecombinantes que compreendes as referidas moléculas do ácido nucléicodo anticorpo anti MCP-1, bem como os métodos para a fabricação e/ou autilização de tais ácidos nucléicos, vetores e/ou células hospedeiras do anti-corpo.
Pelo menos um anticorpo da invenção se liga a pelo menos umepítopo especificado, específico para pelo menos uma proteína MCP-1 ouvariante ou derivado, tais como aqueles providos na SEQ ID NO: 1. Pelomenos um epítopo pode compreender pelo menos uma região de ligaçãocom o anticorpo que compreende pelo menos uma parte da referida proteí-na, cujo epítopo é composto de preferência de pelo menos de 1 a 5 aminoá-cidos de pelo menos uma parte da mesma, tal como, porém não limitado aum domínio citoplasmático ou externo funcional, extracelular, solúvel, hidrófi-Io da referida proteína, ou de qualquer parte da mesma.
Pelo menos um anticorpo pode compreender, opcionalmentepelo menos uma parte especificada de pelo menos uma região determinantecomplementar (CDR),(como por exemplo, CDR1, CDR2 ou CDR3 da regiãovariável da cadeia pesada ou leve providas como as SEQ ID NOS: 27 e 28,respectivamente) provida como as SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14 e 16; e op-cionalmente ainda compreendendo pelo menos uma região de estruturaconstante ou variável ou qualquer parte da mesma, em que o anticorpo blo-queia, inibe ou impede pelo menos uma atividade, tal como, porém não Iimi-tada a ligação da MCP-1 ao receptor sobre as superfícies das células, inter-nalização do receptor CCR2, mobilização de Ca2+ estimulada pela MCP-1,ou qualquer outro ensaio conhecido adequado da MCP-1. Um anticorpo antiMCP-1 pode dessa forma ser varrido com relação a uma atividade corres-pondente de acordo com métodos conhecidos, tais como, porém não Iimita-dos a, pelo menos uma atividade biológica direcionada a uma proteína MCP-1.
A presente invenção também proporciona pelo menos um anti-corpo antiidiotipo de MCP-1 com relação à pelo menos um anticorpo MCP-1da presente invenção. O anticorpo antiidiotipo inclui qualquer proteína oupeptídio que contenha uma molécula que compreenda pelo menos uma par-te de uma molécula de imunoglobulina, tal como, porém não limitada a pelomenos uma parte de um Iigante (LBP), tal como, porém não limitada a umaregião determinante complementar (CFR) de uma cadeia pesada ou leve, ouum Iigante de ligando a uma parte da mesma, uma região variável de umacadeia pesada ou leve, uma região constante de uma cadeia pesada ou le-ve, uma região de estrutura, ou qualquer parte das mesmas que possa serincorporada dentro o anticorpo antiidiotipo da presente invenção. Um anti-corpo antiidiotipo da invenção pode incluir ou ser derivado a partir de qual-quer mamífero, tal como, porém não limitado a um ser humano, um camun-dongo, um coelho, um rato, um roedor, um primata e os similares.
A presente invenção proporciona, em um aspecto, moléculas deácido nucléico isoladas compreendendo complementares, ou se hibridizandoa um polinucleotídio codificando pelo menos um anticorpo MCP-1 antiidioti-po, compreendendo pelo menos uma seqüência, domínio, parte ou varianteespecificada do mesmo. A presente invenção ainda proporciona vetores re-combinantes compreendendo os referidos anticorpos MCP-1 antiidiotipo,codificando moléculas de ácido nucléico, células hospedeiras que conte-nham esses ácidos nucléicos e/ou vetores recombinantes, bem como méto-dos para a fabricação e/ou utilização de tais ácidos nucléicos, vetores e/oucélulas hospedeiras de anticorpos antiidiotipo.
A presente invenção também provê pelo menos um método paraexpressar pelo menos um anticorpo anti MCP-1 ou um anticorpo MCP-1 anti-idiotipo, em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar uma célula hos-pedeira como descrito aqui, neste pedido de patente sob condições nasquais pelo menos um anticorpo anti MCP-1 seja expresso em quantidadesdetectáveis e/ou recuperáveis.
A presente invenção também provê pelo menos uma composi-ção compreendendo (a) um anticorpo anti MCP-1 isolado codificando ácidonucléico e/ou um anticorpo como descrito aqui, neste pedido de patente; e(b) um veículo ou diluente adequado. O veículo ou diluente pode ser opcio-nalmente farmaceuticamente aceitável, de acordo com veículos ou diluentesconhecidos. A composição pode opcionalmente compreender também pelomenos um outro composto, proteína ou composição.
A presente invenção também proporciona pelo menos um méto-do ou composição de anticorpo anti MCP-1, para administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz para a modulação ou o tratamento depelo menos uma condição relacionada com a MCP-1 em uma célula, tecido,órgão, animal ou paciente e/ou, antes de, em seguida a, ou durante umacondição relacionada, como conhecido na técnica, e/ou como descrito aqui,neste pedido de patente.
A presente invenção também proporciona pelo menos umacomposição, dispositivo e/ou método para o suprimento de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de pelo menos um anticorpo antiMCP-T1 de acordo dom a presente invenção.
A presente invenção também proporciona pelo menos um méto-do ou composição de anticorpo anti MCP-1, para diagnosticar pelo menosuma condição relacionada com a MCP-1 em uma célula, tecido, órgão, ani-mal ou paciente e/ou, antes de, em seguida a, ou durante uma condição re-lacionada, como conhecida na técnica e/ou como descrita aqui, neste pedidode patente.
A presente invenção também proporciona pelo menos umacomposição, dispositivo e/ou método de suprimento para o diagnóstico depelo menos um anticorpo anti MCP-1, de acordo com a presente invenção.
Em um aspecto a presente invenção proporciona pelo menos umanticorpo anti MCP-1 isolado de mamífero, compreendendo pelo menos umaregião variável compreendendo as SEQ ID NOS: 27 ou 28.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona pelo menosum anticorpo anti MCP-1 isolado de mamífero, compreendendo tanto(i)todas as seqüências de aminoácido das regiões determinantes comple-mentares da cadeia pesada (CDR) das SEQ ID NOS: 6, 7 e 8 ou 9; com o (ii)todas as seqüências de aminoácido CDR da cadeia leve das SEQ ID NOS:13, 14 e 15 ou 16.
Em outro, aspecto a presente invenção proporciona pelo menosum anticorpo anti MCP-1 isolado de mamífero, compreendendo pelo menosuma dê (i) todas as seqüências de aminoácido das regiões determinantescomplementares da cadeia pesada (CDR) das SEQ ID NOS: 6, 7 e 8 ou 9;como (ii) todas as seqüências de aminoácido CDR da cadeia leve das SEQID NOS: 13, 14 e 15 ou 16.
Pelo menos um anticorpo pode opcionalmente adicionar pelomenos um de: ligar a MCP-1 com uma afinidade de pelo menos uma sele-cionada a partir de pelo menos 10~10 M, pelo menos 10"11 M, ou pelo menos10"12 M; neutralizar substancialmente pelo menos uma atividade de pelo me-nos uma proteína MCP-1. Também é provido um ácido nucléico isolado quecodifica pelo menos um anticorpo isolado MCP-1 de mamífero; um vetor iso-lado de ácido nucléico compreendendo o ácido nucléico isolado, e/ou umacélula hospedeira procariótica ou eucariótica que compreenda o ácido nu-cléico isolado. A célula hospedeira pode opcionalmente ser pelo menos umaselecionada a partir de NSO, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, YB2/0, SP2/0, HeLa, células de mieloma ou de linfoma, ou qual-quer célula derivada, imortalizada das mesmas. Também é provido um mé-todo para a produção de pelo menos um anticorpo anti MCP-1 compreen-dendo a translação do ácido nucléico codificando o anticorpo sob condiçõesin vitro, in vivo ou in situ, de tal forma que o anticorpo MCP-1 seja expressoem quantidades detectáveis e recuperáveis.
Também é provida uma composição compreendendo pelo me-nos um anticorpo anti MCP-1 isolado de mamífero e pelo menos um veículoou diluente farmaceuticamente aceitável.
Também é provido um método para o diagnóstico ou o tratamen-to de uma condição relacionada com a MCP-1 em uma célula, tecido, órgãoou animal, compreendendo (a) por em contato ou administrar uma composi-ção compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos anticorpo antiMCP-1 isolado de mamífero da invenção, com ou para a célula, tecido, ór-gão ou animal.Também é provido um dispositivo médico, compreendendo pelomenos um anticorpo anti MCP-1 isolado de mamífero da invenção, em que odispositivo é adequado para por em contato ou administrar pelo menos umanticorpo MCP-1 através de pelo menos um modo selecionado a partir deparenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intrabrôn-quica, intra-abdominal, intracapsular, intracartilagenosa, intracavitária, intra-célica, intra-cerebelar, intracérebro-ventricular, intracólica, intracervical, in-tragástrica, intra-hepática, intra miocárdica, intra-óssea, intrapélvica, intrape-ricárdica, intraperitônial, intrapleuial, intraprostática, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retina, intra-espinhal, intra-sinovial, intratorácica, intra-uterina, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, in-tranasal ou transdérmica.
Também é provido um artigo de fabricação para uso farmacêuti-co ou diagnóstico humano, compreendendo material de embalagem e umrecipiente compreendendo uma solução, particulada ou uma forma Iiofilizadade pelo menos um anticorpo anti MCP isolado de mamífero da presente in-venção.
Também é provido um método para a produção de pelo menosum anticorpo anti MCP isolado de mamífero da presente invenção, compre-endendo prover uma célula hospedeira ou um animal transgênico ou plantaou célula de planta transgênica capaz de expressar o anticorpo em quanti-dades recuperáveis. Também é provido na presente invenção pelo menosum anticorpo anti MCP-1 produzido através do método acima.
A presente invenção provê ainda qualquer invenção descrita a-qui, neste pedido de patente.
Breve Descrição da Relação de Seqüências
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Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção proporciona pelo menos um anticorpo puri-ficado, isolado, recombinante e/ou sintético anti MCP-1 humana, primata,roedor, mamífero, quimérica, humanizada, manipulada ou enxertada CDR,anticorpos e anticorpos MCP-1 antiidiotipo dos mesmos, bem como compo-sições e codificando moléculas de ácido nucléico, compreendendo pelo me-nos um polinucleotídio codificando pelo menos um anticorpo anti MCP-1 ouum anticorpo antiidiotipo. A presente invenção também inclui, porém nãoestá limitada a, métodos para a fabricação e a utilização de tais ácidos nu-cléicos e anticorpos e anticorpos antiidiotipos, incluindo composições, méto-dos e dispositivos diagnósticos e terapêuticos.
Citações: Todas as publicações ou patentes citadas aqui, nestepedido de patente estão inteiramente incorporadas por referência aqui, nestepedido de patente na medida em que elas mostrem o estado da técnica notempo da presente invenção e/ou para prover descrições e modalidades dapresente invenção. As publicações referentes a quaisquer publicações cienti-ficas ou de patentes, ou qualquer outra informação disponível em qualquerformato de mídia, incluindo todos os formatos gravados, eletrônicos ou im-pressos. As referência que se seguem ficam inteiramente incorporadas aqui,neste pedido de patente por referência: Ausubel, et al., ed., Current Proto-cols in Molecular Biology1 John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2004);Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, ColdSpring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manu-al, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols inImmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2004); Colligan et al., Cur-rent Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2004).
Abreviaturas:
aa: aminoácido; BSA: albumina de soro bovino; CDR: regiões complementa-res-determinantes; ECL: luminescência química-elétrica; HuCAL®: HumanCombinatorial Antibody Library; HSA: albumina do soro humano; MCP-1:proteína quimioatrativa de monócitos-1; Ig: Imunoglobulina; IPTG: isopropilβ-D-tiogalactosídio; mAb: anticorpo monoclônico; PBS: solução salina tam-ponada com fosfato, pH 7,4: SET: titulação de equilíbrio de solução;VH:região variável de cadeia pesada da imunoglobulina; VL: região variávelde cadeia leve da imunoglobulina.
Definições
Na forma usada aqui, neste pedido de patente, um "anticorpoanti MCP-1", "parte de um anticorpo anti MCP-1", ou "fragmento de um anti-corpo anti MCP-1", e/ou "variante de um anticorpo anti MCP-1", e os simila-res incluem qualquer proteína ou peptídio contendo uma molécula que com-preenda pelo menos uma parte de uma molécula de imunoglobulina, tal co-mo, porém não limitadas a uma região determinante complementar (CDR)de uma cadeia pesada ou leve ou um Iigante ligando partes das mesmas,uma região variável de uma cadeia pesada ou leve, uma região constante deuma cadeia pesada ou leve/uma região de estrutura, ou qualquer parte dasmesmas, ou pelo menos uma parte de um receptor ou proteína de ligação deMCP-1, que possa ser incorporada dentro de um anticorpo da presente in-venção. Esse anticorpo opcionalmente também efetua um Iigante específico,tal como, porém não limitado a quando esse anticorpo modula, diminui, au-menta, antagoniza, migra, alivia, bloqueia, inibe, anula e/ou interfere compelo menos uma atividade ou ligação de MCP-1, ou com a atividade ou liga-ção do receptor MCP-1, in vitro, in situ e/ou in vivo. Como um exemplo nãolimitativo, um anticorpo anti MCP-1 adequado, parte especificada ou varianteda presente invenção pode se ligar a pelo menos uma MCP-1 ou partes es-pecificadas, variantes ou domínios da mesma.
Na forma usada aqui, neste pedido de patente "epítopo" significaum segmento ou uma característica de uma proteína capaz de ligação espe-cífica a um anticorpo. Os epítopos consistem usualmente em agrupamentosde moléculas de superfície quimicamente ativa tais como aminoácidos oucadeias laterais de açúcar e usualmente tem características estruturais detrês dimensões, bem como características específicas de carga. Os epítoposde conformação e de não conformação são distinguidos em que a ligação aoanterior porém não o anterior, é perdida na presença de solventes de desna-turação. Os epítopos de proteínas que resultam a partir da dobragem deconformação da molécula do MCP-1 que aparecem quando aminoácidos apartir de partes que diferem da seqüência linear da molécula de MCP-1 fi-cam juntas em proximidade íntima em espaço tridimensional são incluídas.
Por "MCP-1" é significada uma seqüência de 76 aminoácidos,referênciada no número de acesso NP_002973 registrado no NCBI e de mo-do variado conhecida como MCP (proteína quimiotática de monócito), SMC-CF (fator quimiotático de células da musculatura lisa), LDCF (fator quimiotá-tico derivado de linfócito), GDCF (fator quimiotático de monócito derivado deglioma), TDCF (fatores quimiotáticos derivados de tumor), HC11 (citocina 11humana), MCAF ( monócito quimiotático e fator de ativação). O símbolo dogene é SCYA2, O gene JE no cromossomo humano 17, e a nova designa-ção é CCL2 (Zlotnik1 Yoshie 2000, Immunity 12: 121 a 127). O JE é o homó-logo de camundongo de MCP-1/CCL2 humano.
Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão "an-ticorpo humano" se refere a um anticorpo no qual substancialmente cadaparte da proteína (como por exemplo, CDR1 estrutura, domínios CL, Ch (co-mo por exemplo, Ch 1, CH2, CH3,), dobradiça (VL, VH)0, é derivado a partir deeventos de recombinação de seqüências de gene da linha de germe da imu-noglobulina humana ou a partir de seqüências maduras de anticorpo huma-no. Além dos anticorpos humanos isolados, esses anticorpos podem ser ob-tidos através da imunização de camundongos transgênicos capazes de mon-tar uma resposta de imunização com os genes da linha de germe da imuno-globulina humana (Lonberg et ai, Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) e Fi-shwald et ai, Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)) ou podem ser seleciona-dos a partir de uma coleção de repertório de anticorpos humanos tais comodescritas aqui, neste pedido de patente. Uma fonte dessas seqüências degene humano pode ser encontrada em qualquer coleção adequada tal comoa VBASE. uma base de dados de genes de anticorpos humanos (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc) ou produtos traduzidos da mesma ou emhttp://people.crvst.bbk.ac.uk/~ubcq07s/ que dá anticorpos humanos classifi-cados em bases de agrupamento em suas similaridades de seqüência deaminoácido. Com o âmbito desta definição também são os anticorpos com-pósitos ou fragmentos funcionais de um anticorpo compósito humano queinclua regiões de estrutura a partir de uma ou mais seqüências de anticorposhumanos e regiões CDR a partir de duas fontes humanas ou não humanas.Dentro da definição de "anticorpo humano" está um anticorpo compósito oufragmento funcional de um anticorpo compósito humano que contenha regi-ões de estrutura a partir da linha de germes e das seqüências de anticorpohumano rearranjadas e regiões CDR de duas fontes diferentes de anticor-pos. Um anticorpo humano compósito ou um fragmento funcional de um an-ticorpo humano compósito de acordo com esta descrição inclui regiões deestrutura a partir de um ou mais seqüências de anticorpos humanos, e regi-ões CDR derivadas a partir de seqüências de anticorpos humanos ou nãohumanos ou pode ser totalmente sintética. Desse modo, um anticorpo hu-mano é diferente de um anticorpo quimérico ou humanizado. É mostradoque um anticorpo humano pode ser produzido a partir de um animal nãohumano ou de célula procariótica ou eucariótica que seja capaz de expres-sar genes de imunoglobulina humana funcionalmente rearranjada (como porexemplo, de cadeia pesada e/ou cadeia leve). Além disso, quando um anti-corpo humano é um anticorpo de cadeia única, ele pode compreender umpeptídio de ligação que não seja encontrado em anticorpos humanos natu-rais. Por exemplo, um Fv pode compreender um peptídio de ligação, tal co-mo de dois até cerca de oito resíduos de glicina ou de outro aminoácido, quese conecta a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeialeve. Esses peptídios de ligação são considerados como sendo de origemhumana.
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (como porexemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que tiveram partes da seqüên-cia, que foram derivadas a partir de imunoglobulina não humana substanci-almente substituídas. Em sua maior parte, os anticorpos humanizados sãoimunoglobulina humana (anticorpo recebedor) na qual os resíduos da CDR(regiões determinantes complementares que também são conhecidas comoas regiões hipervariáveis) do recebedor são substituídos por resíduos CDRde uma espécie não humana (anticorpo doador), tais como camundongo,rato, coelho ou primata não humano que tenham a especificidade, afinidadee capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutu-ra (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não hu-manos correspondentes. Além desses, os anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recebedor ouno anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais odesempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreen-der substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois,domíniosvariáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariá-veis correspondem aquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas das FR são aquelas de uma seqüência de imuno-globulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também irá com-preender pelo menos uma parte de uma região constante da imunoglobulina(Fe), tipicamente aquela de uma imunoglobulina IgG humana. Para maioresdetalhes, vide Jones et ai-, Nature 321: 522 a 525 (1986); ReiReichmann etal., Nature 332: 323 a 329 (1988); e Presta, Curr. Op. StrStruct. Biol. 2: 593 a596(1992).
Na forma usada aqui, neste pedido de patente, o Kd de um anti-corpo se refere a constante de dissociação, Kd do anticorpo com relação aum antígeno predeterminado e é uma medida da afinidade do anticorpo comrelação a um alvo específico. Os anticorpos de alta afinidade tem um K0 de10"8 M ou menos, de mais preferência de 10"9 M ou mesmo e ainda de maispreferência de 10"10 M ou menos, com relação a um antígeno predetermina-do. O termo "IW ou "KD" ou "Kd" na forma usada aqui, neste pedido de pa-tente é destinado a se referir a taxa de dissociação específica de um anti-corpo-antígeno. O "Kp", é a proporção de dissociação (k2), também chama-da de "(Koff) fora de taxa, com relação à taxa de associação K1). Desse mo-do a K0 se iguala e k2/ki ou Wkon e é expressa como uma concentraçãomolar (M). Se segue que quanto menor a K0 mais forte a ligação. Dessemodo uma K0 de 10"6 M (ou 1 micro M) indica uma ligação fraca quandocomparada a 10"9 M (ou 1 nM).
Na forma usada aqui, neste pedido de patente, as expressões"especificidade para" e "ligação específica" e "se liga especificamente" serefere a um anticorpo se ligando a um antígeno predeterminado com umaafinidade maior do que a outros antígenos ou proteínas. Tipicamente, o anti-corpo se liga a uma constante de dissociação (K0) de 10"7 M ou menos, e seliga ao antígeno predeterminado com uma K0 que é de pelo menos duasvezes menos do que o seu Kd para a ligação a um antígeno não específico(como por exemplo, BSA, caseína, ou qualquer outro polipeptídio especifi-cado) que não o antígeno predeterminado. As frases "um anticorpo reconhe-cendo um antígeno" e "um anticorpo específico com relação a um antígeno"são usadas de forma intercambiável aqui, neste pedido de patente com afrase "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno" ou "um anti-corpo específico para um antígeno", como por exemplo, um anticorpo espe-cífico para MCP-1.
1. Preparação de Anticorpos da Invenção.
A preparação de anticorpos humanos que sejam específicoscom relação à proteína humana MCP-1 ou fragmentos da mesma (incluindomoléculas sintéticas, tais como peptídios sintéticos) pode ser realizada coma utilização de qualquer técnica adequada conhecida na área. Os anticorposhumanos podem ser produzidos com a utilização de diversas técnicas co-nhecidas na área. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado apartir de uma coleção de fagos, em que a coleção de fagos expressa anti-corpos humanos (Vaughan et Io al. Nature Biotechnology 14: 309 a 314(1996): Sheets et al. PITAS (USA) 95: 6157 a 6162 (1998)); Hoogenboomand Winter, J. Mol. Biol., 227 :381 (1991); Marks et al.' J. Mol. Biol., 222: 581(1991)).
Os anticorpos humanos também podem ser feitos através daintrodução de locais da imunoglobulina humana dentro de animais transgê-nicos, como por exemplo, camundongos nos quais os genes endógenos daimunoglobulina tenham sido parcialmente inativados. Por exemplo.um ca-mundongo transgênico, compreendendo um transgene de cadeia pesada deimunoglobulina humana rearranjada de forma funcional e um transgenecompreendendo DNA a partir de um lócus de uma cadeia leve de imunoglo-bulina humana que possa ser submetido a um rearranjo funcional, pode serimunizado com uma MCP-1 humana ou um fragmento da mesma para pro-vocar a produção dos anticorpos. Se desejado, as células produtoras de an-ticorpo podem ser isoladas e hibridomas ou outras células de produção deanticorpo imortalizadas podem ser preparadas como descrito aqui, nestepedido de patente na forma conhecida na técnica. Alternativamente, o anti-corpo, parte especificada ou variante pode ser expresso com a utilização deácido nucléico codificante ou uma parte do mesmo em uma célula hospedei-ra adequada.
Quando confrontada com um antígeno apropriado, a produçãode anticorpo humano é observada, que se parece intimamente com aquelaobservada em seres humanos em todos os sentidos, incluindo o rearranjodos genes, montagem e repertório de anticorpos. Essa abordagem está des-crita, por exemplo, nas Patentes U. S. N9S 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825;5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, e nas seguintes publicações cientificas:Marks et al., Bio/Technology 10: 779 a 783 (1992); Lonberg et al., Nature368: 856 a 859 (1994); Morrison, Nature 368: 812 a 3 (1994); Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14: 845 a 51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology14: 826 (1996); Lonberg and Huezar, lntern. Rev. Immunol. 13: 65 a 93(1995).
Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado atra-vés da imortalização de linfócitos B humanos produzindo um anticorpo dire-cionado contra um antígen-alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados apartir de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro). Vide, por e-xemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R.Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86 a 95 (1991); e aPatente U.S. N2 5.750.373. As células que produzem anticorpo também po-dem ser obtidas a partir do sangue periférico ou, de preferência no baço osnos nodos linfáticos de seres humanos ou de animais adequados que te-nham sido imunizados com o antígeno de interesse. Qualquer outra célulahospedeira adequada também pode ser usada para a expressão de um áci-do nucléico heterólogo ou endógeno que codifica um anticorpo, fragmentoou variante especificado do mesmo, da presente invenção. As células fundi-das (hibridomas) ou células recombinantes podem ser isoladas com a utili-zação de condições de cultura seletiva ou outros métodos adequados co-nhecidos e clonadas diluição Iimitativa ou escolha de células, ou outros mé-todos conhecidos. As células que produzem anticorpos com a especificidadedesejada podem ser selecionadas através de uma análise adequada (porexemplo, ELISA).
Em uma abordagem, é produzido um hibridoma através da fusãode uma linha de células imortais (por exemplo, uma linha de células de mie-loma tal como, porém não limitadas a Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2,AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5,U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI,NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A), ou similares, ou hete-romielomas ou produtos de fusão das mesmas, ou qualquer célula ou célulade fusão derivada das mesmas, ou de qualquer outra linha de células co-nhecidas na técnica. Vide, por exemplo, www.atcc.org;www.lifetech.com; eos similares, com células de produção de anticorpos tais como, põem nãolimitadas a células isoladas ou clonadas do baço, sangue periférico, linfa,amídalas ou outras células inumes ou células B que contenham células ououtras células expressando seqüências de cadeia pesada ou leve, constan-tes ou variáveis ou de estrutura ou de CDR, tanto os ácidos nucléicos endó-genos ou heterólogos como recombinantes ou endógenos, viróticas, bacteri-anas, de algas, procarióticas, de anfíbios, insetos, répteis, peixes, de mamí-feros, roedores, eqüinas, ovinas, de cabras, ovelhas, primatas, eucarióticas,DNA genômico, cDNA, rDNA, DNA ou RNA mitrocondico, DNA ou RNA clo-roplástico, hRNA, mRNA, tRNA, de filamento único, duplo ou triplo, hibridi-zada e os similares ou quaisquer combinações das mesmas. Vide, por e-xemplo, Ausubel, supra e Colligan Immunology, supra, capitulo 2, inteira-mente incorporados aqui, neste pedido de patente por referência.
Os anticorpos humanos que se ligam a COM-1 humana e quecompreendem uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve po-dem ser preparados com a utilização de métodos adequados, tais como exi-bição de fase (Katsube, Y., et ai, Int J Mol. Medl 1 (5): 863 a 868 (1998))..Outros métodos adequados para a produção ou isolamento de anticorpos daespecificidade exigida podem ser usados, incluindo, porém não limitados a,métodos que selecionam um anticorpo recombinante a partir de uma coleçãode peptídio ou de proteínas (como por exemplo, porém não limitados a, umbacteriófago, ribossomo, oligonucleotídio, RNA, cDNA ou similares, coleçãode exibição; por exemplo, como as disponíveis a partir de Cambridge anti-body Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys1 Martinsreid/Planegg,DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Suécia; DyaxCorp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Vide, por exem-pio as EP 368.684. PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755;PCT/GB92/002240; PCT/G B92/00883; PCT/GB93/00605; US08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662;PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430;PCT/US94/1234; WO 92/18619; WO 96/07754; (Scripps); WO 96/13583.WO 97/08320 (MorphoSys); WO 95/16027 (Biolnvent); WO 88/06630; WO90/3809 (Dyax); US 4.704.692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149(Ixsys); ou peptídios ou proteínas gerados "estocasticamente" - U. S.5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803,EP 590 689 (Ixsys, adora Applied Molecular Evolution (AME), cada uma in-corporada em sua totalidade aqui, neste pedido de patente por referência)ou que se apóia sobre a imunização de animais transgênicos (vide, por e-xemplo, SCID mice, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901 a 907 (1997);Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95 a 118 (1996); Eren et al., Immu-nol. 93:154 a 161 (1998), cada uma das quais é incorporada em sua totali-dade aqui, neste pedido de patente por referência.
Modalidade Específica.
As requerentes exemplificaram um método para selecionar efabricar anticorpos humanos com as desejadas afinidade, especificidade ebioatividade direcionadas a MCP-1 humana iniciando a partir de uma cole-ção Fab de fago de exibição humano. Em resumo, a partir de todas as 10seleções ("pannings") iniciais foram examinados 17.856 clones que levarama 1104 achados primários e finalmente a 46 Fabs únicos.
Com a finalidade de prover um Iigante único que exemplificasseuma capacidade de retenção do antígeno de se ligar a receptores MCP-1 deocorrência natural, o MCP-1 humano e seus análogos ou "miteínas" foramquimicamente sintetizados e modificados para usos específicos em ensaiosde seleção, afinidade e biológicos. O MCP-1-IIe41 e o MCP-1'Tyr43 humanoforam usados na seleção de fase sólida inicial bem como em outros aspec-tos das análises de seleção do anticorpo e afinidade de maturação e descri-tos aqui, neste pedido de patente, como foram as versões biotiniladas a mu·teína MCP-1: Ile41, Lys(Biotin-PEG4)69) e (Ile41, Lys(Biotin-PEG4)75 (SEQ IDNO: 1).
Devido a que nenhum dos 26 Fabs únicos tinha uma afinidademedida como Kd < 0,5 nM ou os valores IC5o desejados nas bioanálises es-pecificadas, a maturação foi essencial. Os candidatos com relação a matu-ração da afinidade foram selecionados e as respectivas IgG foram analisa-das em paralelo ao processo de maturação. Os critérios de seleção foram: 1)a atividade na análise de ligação do receptor em célula inteira, 2) a atividadena análise de mobilização do cálcio, 3) a afinidade ao MCP-1 humano, 4) aespecificidade com relação ao MCP-1 humano, e 5) a afinidade com relaçãoao MCP-1 "cyno" e a ligação ao MCP-1 natural.
As medições de afinidade "Biacore" no modo de captura da Fabcom o MCP-1 em solução funcionou bem com relação a classificação doscandidatos a maturação e as afinidades ficaram na faixa de 49 a 406 nM. Omelhor Fab de origem mostrou uma afinidade de 50 nM, indicando que aafinidade tinha de ser otimizada pelo menos 100 vezes para alcançar o crité-rio de sucesso da afinidade. Além disso, a ligação com o MCP-1 de macacoscynomolgus e ao MCP-1 humano natural pode ser detectada no modo decaptura do Fab, que foi um pré-requisito adicional para a maturação. As afi-nidades com o MCP-1 do macaco cynomolgus estiveram na mesma faixacomo para o MCP-1 humano. Devido as modificações potenciais, como porexemplo, a glicosilação, teve que ser mostrado que os anticorpos não so-mente reconhecem o COM-1 recombinante ou sintético porém também oMCP-1 original que foi expresso de forma endógena e purificado a partir dosobrenadante de células PANC-1 humanas.
A especificidade com relação ao MCP-1 humano foi medida nomodo de captura do anticorpo em Biacore com a adição de 100 nM de cadacimocina e detectando o sinal de ligação, A maioria dos candidatos Fab àmaturação foram específicos, enquanto que uma dupla mostrou um poucode reatividade cruzada a quimiocinas homólogas.
Uma característica muito importante do Fab foi a atividade deneutralização e diversos ensaios diferentes foram feitos para a análise destaatividade. O ensaio e análise de células 125I MCP-1 THP-1 foi a análise maissensível, o que foi especialmente importante depois da otimização. Os Fabsde origem mostraram valores de IC50 a partir de 10 a 650 nM. Além da análi-se de ligação através de radioligante, outras análises biológicas secundáriasforam planejadas para provar a atividade de neutralização em níveis diferen-tes do trajeto de sinalização a jusante do MCP-1.
A atração de monócitos é uma das funções principais do MCP-1,porém mais provavelmente devido a falta de atividade, os fatores co-purificados ou endotoxinas, os Fabs de origem não funcionam na análise dequimiotaxia e por esse motivo foi concordado testar somente a respectivaIgGI, no lugar de tentar fazer com que os Fabs funcionassem nessa análise.Outro evento de sinalização á jusante é a liberação do cálcio para dentro docitoplasma. Com certeza todos os Fabs, que exibiram atividade de neutrali-zação na análise de ligação do Iigante radio, inibiram a mobilização do cálcioinduzida pelo MCP-1 nas células THP-1 com uma faixa de IC50 a partir de0,1 até 3 μΜ. Teve que ser mostrado que a atividade biológica das Fabs deorigem fói completamente retida depois da conversão para dentro do formatoIgG. Como esperado toda a respectiva IgG exibiu atividade na análise deligação do radioligante, na análise de mobilização do cálcio e mesmo naanálise de quimiotaxia, provando finalmente que todas as IgG retêm a ativi-dade observada no formato Fab e mesmo inibiram a quimiotaxia induzidapelo MCP-1.
Para maturação por afinidade, sete Fabs diferentes com um K0na faixa de 10 - 400 nM e valores de IC5o na faixa de 10 - 650 nM na análisede ligação por Iigante de radiação, foram selecionados de acordo com assuas características. Em seguida eles foram agrupados em 3 grupos para aclonagem da coleção e a subseqüente seleção. As otimizações das L-CDR3e H-CDR2 foram realizadas em paralelo. Bibliotecas de alta qualidade foramgeradas. A seleção, por solução foi usada para o processo de seleção e origor da seleção foi aumentado através da redução do antígeno, seleção forade qualidade e etapas muito longas de lavagem. Para o processo de triagemque se segue uma triagem BioVeris foi usada permitindo uma classificaçãode alto resultado dos Iigantes otimizados. A triagem funcionou de forma mui-to eficiente para a identificação de Iigantes melhorados. Além disso as Fabsotimizadas em L-CDR3 e H-CDR2 puderam ser identificadas tornando pos-sível a clonagem cruzada com relação aos derivados MOR03471 eMOR03548. Especialmente a clonagem cruzada dos derivados MOR03471foi feita com bastante sucesso levando a uma afinidade adicional melhorada100 vezes quando comparada com os dois Fabs otimizados de partida. Dos17 Fabs otimizados, 16 foram selecionados para caracterização detalhada efinalmente 4 ligantes, que satisfazem todos os critérios de sucesso, deriva-dos a partir do MOR03471 de origem, dois foram otimizados somente em L-CDR3 e dois vieram da clonagem cruzada. A análise de candidatos a matu-ração por afinidade e as seqüências estão detalhados nos Exemplos 3 e 4,Tabelas 4 - 6 e nas SEQ ID NOS: 2-28.
Depois da maturação, a afinidade dos ligantes otimizados nãopode ser analisada e, Biacore principalmente na medida em que os limitesde detecção foram alcançados. Em MorphoSys, foi usado um método dedeterminação de K0 muito sensível, sendo uma titulação de equilíbrio de so-lução *SET combinado com tecnologia BioVeris. As constantes de dissocia-ção monovalentes puderam ser calculadas por meio de modelos ajustadospara Fab e IgG. Além da medição da afinidade, este método foi usado paraos estudos de reatividade cruzada. As afinidades dos candidatos finais esta-vam na faixa de 10 até 320 pM para MCP-1 humanos e cynomolgus, medi-das em BioVeris e confirmadas por KinezA em Centocor. O teste de especi-ficidade com a utilização de BioVeris não mostrou reatividade cruzada para oMCP-1 humano com relação a todos os 16 Fabs e IgG testados. Vários Fabse IgG também não mostraram reatividade cruzada significativa com relaçãoa Eotaxina humana. De acordo com os critérios de sucesso, os critério deespecificidade foi fixado como não ligando à 100 mM aos homólogos huma-nos MCP-2, 3, 4 e 100 nM á Eotaxina humana 2, 2 e 3 no modo de capturade anticorpos Biacore. Na captura de Fab no modo Biacore todos ao Fabsselecionados exibiram graus diferentes de reatividade cruzada com o MCP-2e Eotaxina. A instabilidade putativa ligeiramente aumentada dos Fabs com-parados com os IgG e a capacidade geral não específica de ligação dasquimiocinas podem ter contribuído para a ligação não específica. Várias dasIgG selecionadas não exibiram um sinal de ligação significativo com relaçãoas quimiocinas homólogas e satisfizeram os critérios de sucesso de especifi-cidade no modo de captura de IgG Biacore. Nos experimentos de titulaçãode solução em equilíbrio com a utilização de BioVeris mesmo vários Fabsnão exibiram reatividade cruzada. Pata analisar se a atividade de ligação doFab ao MCP-2 detectado em Biacore se traduz em atividade de neutraliza-ção,foram desenvolvidas análises de ligação de radioligante em célula totalem Centocor. Os Fabs testados nessa análise não mostraram uma inibiçãosignificativa de ligação de MCP-2 mascados com 1251 do receptor CCR2 emcélulas Thp-1 (IC50 > 2 μΜ).
Devido a baixa quantidade de 1 ng/ml de MCP-1 necessária, aanálise de ligação por radioligante foi a análise mais sensível neste projetocom um limite de IC50 de análise de cerca de 100 pM para o Fab e mesmode 10 pM para a IgG. Além da afinidade, a atividade nesta análise foi usadapara a classificação e seleção de Iigantes otimizados com relação a caracte-rização detalhada. O melhoramento total na atividade durante a otimizaçãofoi até um fator de 1000 χ e finalmente um derivado de Fab MOR03471,MOR03878 exibiu a afinidade mais alta a 110 pM. Todas as IgG testadasconservaram a atividade na análise de ligação por radioligante. Ao valoresde IC50 dos 4 candidatos finais de IgG, MOR03781, MOR03790, MOR03750e MOR033878, estavam na faixa de 20 a 50 pM, sendo mesmo ligeiramentemelhores, quando comparados com a respectiva atividade dos Faz. Umarazão para a atividade melhorada é que a IgG bivalente neutraliza dois MCP-1 por molécula (fator 2 x). As iGg vem de uma produção pura de alta escalae por esse motivo uma outra razão pode ser a pureza, estabilidade ou a ati-vidade dos anticorpos. Como uma bioanálise secundária uma análise combase em FACS1 medindo a inibição da internalização do receptor CCR2 in-duzida pelo MCP-1, foi desenvolvida com sucesso. Finalmente a análise a-inda permitiu a determinação e a classificação dos IC5o- Os 4 candidatos fi-nais Fabs MOR03790, MOR03850, MOR03781 e MOR03878 exibiram valo-res de IC50 na faixa de 3 até 5 nM.
O MCP-1 natural foi necessário para a confirmação das ativida-des dos anticorpos MCP-1 isolados contra os MCP-1 sintéticos ou recombi-nantes. O MCP-1 natural foi purificado a partir do sobrenadante de PANC1 eusado para a indução da liberação de cálcio. Os Fabs otimizados mostrarama inibição da mobilização de cálcio induzida pelo MCP-1 natural com umaatividade mais elevada se comparados aos anticorpo de referência C775.Todos os Fabs pré-selecionados derivados de MORQ3548 inibiram comple-tamente a ligação do C775 ao MCP-1 em um ELISA de competição. Todosos Fabs pré-selecionados derivados de MOR03471 mostraram uma compe-tição parcial (-60%) em ELISA indicando que os epítopos estão pelo menosse sobrepondo. Finalmente os quatro anticorpos MOR03781, MOR03790,MOR03850 e MOR03878 preencheram todos os critérios de sucesso inclu-indo o critério de especificidade e a neutralização do MCP-1 natural.Outros métodos adequados de produzir anticorpos.
Outros métodos para a produção de anticorpos da invenção quesejam capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como co-nhecidos na técnica e/ou como descritos aqui, neste pedido de patente. Es-sas técnicas incluem, porém não estão limitadas a exibição de ribossomoHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 4937 a 4942 (May 1997); Haneset al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 14130 a 14135 (Nov. 1998)); tecnolo-gias de produção de anticorpos de célula única (por exemplo, método sele-cionado de linfócito de anticorpo ("SLAM") (Patente U.S. N6 5,627,052, Wenet al., J. Immunol. 17: 887 a 892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 93: 7843 a 7848 (1996)); micro gotícula de gel e citometria de fluxo(Powe11 et al., Biotechnol. 8: 333 a 337 (1990); One Cell Systems, Cambrid-ge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182: 155 a 163 (1995); Kenny et al., Bi-o/Technol. 13: 787 a 790 (1995)); seleção de célula B (Steenbakkers et al.,Mlec. Biol. Reports 19: 125 a 134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol.5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., ElsevierScience Publishers B.V., Amsterdam1 Holanda (1988)).
Os métodos para a manipulação ou a humanização de anticor-pos não humanos ou humanos também podem ser usados e são bem-conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado ou manipula-do tem um ou mais resíduos de aminoácido a partir de uma fonte que sejanão humana, como por exemplo, porém não limitadas a, camundongo, rato,coelho, primata não humano ou outro mamífero. Os resíduos de aminoáci-dos humanos são quase sempre referidos como resíduos "importados", quesão tipicamente tomados a partir de um domínio de "importação" variável ououtro domínio de uma seqüência humana conhecida. As seqüências de IgGhumana são bem-conhecidas na técnica e podem ser qualquer uma das se-qüências conhecidas. Diversas estratégias para a otimização da ligação,conformação e capacidade de geração de imunização de anticorpos huma-nos manipulados têm sido descritas em, vide, por exemplo, Presta et al. JImmunol. 151: 2623 a 2632, 1993; WO 2003/02019, e WO 2005/080432.
Essas seqüências importadas podem ser usadas para a reduçãoda capacidade de geração de imunização ou reduzir, aumentar ou modificara ligação, afinidade, fora de qualidade, dentro de qualidade, voracidade, es-pecificidade, meia-vida ou qualquer uma outra característica adequada, co-mo conhecidas na técnica. Geralmente parte ou todas as seqüências nãohumanas ou humanas de CDR são mantidas enquanto que as seqüênciasnão humanas de regiões variáveis e constantes são substituídas com ami-noácidos humanos ou outros aminoácidos. Os anticorpos podem ser opcio-nalmente humanizados com a conservação da alta afinidade com relação aoantígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esseobjetivo, os anticorpos humanizados podem ser opcionalmente preparadosatravés de um processo de análise das seqüências de origem e diversosprodutos conceituais humanizados com a utilização de modelos tridimensio-nais das seqüências de origem e humanizadas. Os modelos tridimensionaisde imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares aquelaspessoas versadas na técnica. Estão disponíveis programas de computadorque ilustram e exibem estruturas de conformação tridimensionais prováveisde seqüências candidatas selecionadas de imunoglobulina. A inspeção des-sas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcio-namento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de re-síduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se li-garão seu antígeno. Desse modo, os resíduos FR podem ser selecionados ecombinados a partir do seqüências de consenso e de importação de tal for-ma que as características desejadas do anticorpo, tais como afinidade au-mentada com relação aos antígenos-alvo, seja conseguida. Em geral, osresíduos CDR estão envolvidos diretamente e mais substancialmente eminfluenciar a ligação do antígeno. A humanização e a manipulação de anti-corpos da presente invenção podem ser realizadas com a utilização de qual-quer método conhecido, tal como, porém não limitados aqueles descritos emWinter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Im-munol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987),Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J.Immunol. 151: 2623 (1993), Patentes U.S. Nos: 5723323, 5976862,5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352,6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234,GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO 90/14443, WO 90/14424, WO90/14430, EP 229246, cada uma inteiramente incorporada aqui, neste pedi-do de patente por referência, incluindo as referências citadas nas mesmas.
Os camundongos transgênicos que podem produzir um repertó-rio de anticorpos humanos que se ligam a antígenos humanos podem serproduzidos através de métodos conhecidos (como por exemplo, porém nãolimitados a Patentes U.S. N9S 5.770.428. 5.569.825. 5.545.806. 5.625.126.5.625.825. 5.633.425. 5.661.016 e 5.789.650 concedidas para Lonberg etal·, Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberget al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO94/25585, Kucheriapate et ai WO 96/34096, Kucherlapate et ai EP 0463151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. Patente U.S. Ng5.545.807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et ai GB 2 272 440 A, Lon-berg et ai Nature 368:.856 a 859 (1994), Taylor et ai, Int. Immunoi 6(4) 579a 591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7: 13 a 21 (1994), Mendez et ai,Nature Genetics 15: 146 a 156 (1997), Taylor et ai, Nucleie Aeids Research20(23): 6287 a 6295 (1992), Tuaillon et ai, Proe Natl Aead Sei USA 90(8)3720 a 3724 (1993), Lonberg et ai, Int Rev Immunol 13(1): 65 a 93 (1995) eFishwald et al., Nat Bioteehnol 14(7): 845 a 851 (1996), as quais são cadauma inteiramente incorporadas aqui, neste pedido de patente, por referên-cia). Em geral, esses camundongos compreendem pelo menos um transge-ne compreendendo DNA a partir de pelo menos um local de imunoglobulinahumana que é rearranjado de forma funcional, ou que possa ser submetido aum rearranjo funcional. Os locais da imunoglobulina endógena nesses ca-mundongos podem ser rompidos ou cancelados para eliminar a capacidadedo animal para a produção de anticorpos codificados pelos genes endógenos.
A triagem de anticorpos para a ligação específica a proteínas oufragmentos similares pode ser conseguida convenientemente com a utiliza-ção de bibliotecas de exibição de peptídios. Este método envolve a triagemde grandes bibliotecas de peptídios com relação a membros individuais quetenham as funções ou a estrutura desejada. A triagem de anticorpos de bi-bliotecas de exibição de peptídios é bastante conhecida na técnica. As se-qüências de peptídios exibidas podem ser a partir de 3 até 5000 ou maisaminoácidos de comprimento, freqüentemente a partir de 5 a 100 aminoáci-dos de comprimento, e quase sempre a partir de cerca de 8 até 25 aminoá-cidos de comprimento. Além dos métodos químicos sintéticos para a gera-ção de bibliotecas de peptídios, vários métodos de DNA recombinante têmsido descritos. Um tipo envolve a exibição de uma seqüência de peptídiossobre a superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célulacontém a seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de peptídioespecífica exibida. Esses métodos estão descritos nas Publicações de Pa-tentes PCT NeS 91/17271, 91/18980, 91/19818, e 93/08278. Outros sistemaspara a geração de bibliotecas de peptídios têm aspectos ambos os métodosde síntese química in vitro e recombinantes. Vide as Publicações de Paten-tes PCT NQs 92/05258, 92/14843, e 96/19256. Vide também, as PatentesU.S. NQs 5.658.754; e 5.643.768. As bibliotecas de exibição de peptídios, eos kits para a triagem estão comercialmente disponíveis a partir de tais for-necedores como a Invitrogen (Carlsbad, CA), e Cambridge antibody Techno-logies (Cambridgeshire, UK). Vide, por exemplo, as Patentes U.S. NsS4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621,5656730, 5763733, 5767260, 5856456, concedidas para Enzon; 5223409,5403484, 5571698, 5837500, concedidas para Dyax, 5427908, 5580717,concedidas para Affymax; 5885793, concedida para Cambridge antibodyTechnologies; 5750373, concedida para, 5618920, 5595898, 5576195,5698435, 5693493, 5698417, concedidas para Xoma, Colligan, supra; Au-subel, supra-, ou Sambrook, supra, cada uma das patentes ou pedidos depatente acima são incorporadas em sua totalidade aqui, neste pedido depatente, por referência.
2. Ácidos Nucléicos da Invenção.
Usando a informação provida aqui, neste pedido de patente,talcomo as seqüências de nucleotídios quer codificam pelo menos de 70 a100% dos aminoácidos contínuos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2 a5 e 27 e 28, fragmentos especificados, variantes ou seqüências de consensodas mesmas, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção codifi-cando pelo menos um anticorpo anti MCP-1 pode ser obtida com a utilizaçãode métodos descritos aqui, neste pedido de patente ou como conhecidos natécnica. As moléculas isoladas de ácido nucléicos da presente invenção po-dem incluir moléculas de ácido nucléico que compreendem uma estrutura deleitura aberta (ORF), opcionalmente dom um ou mais íntrons, como por e-xemplo, porém não limitados a, pelo menos uma parte especificada de pelomenos uma CDR, como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de pelo menos uma cor-rente pesada (por exemplo das SEQ ID NOS: 6-12, 22 e 23) ou corrente Ie-ve(por exemplo, das SEQ ID NOS: 13-21 e 24-26); moléculas de ácido nu-cléico compreendendo a seqüência de codificação para um anticorpo antiMCP-1 ou região variável (por exemplo, das SEQ ID NOS:2-5, 27 e 28); emoléculas de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de nucleotí-dios substancialmente diferente a partir daquelas descritas acima, porémque, devido a degenerescência do código genético ainda codificam, pelomenos um anticorpo anti MCP-1 como descrito aqui, neste pedido de paten-te e/ou como conhecido na técnica. Por certo, o código genético é bastanteconhecido na técnica. Desse modo, seria de rotina para uma pessoa versa-da na técnica a geração dessas variantes de ácido nucléico degeneradasque codificam para os anticorpos específicos anti MCP-1 da presente inven-ção. Vide, por exemplo, Ausubel, et al., supra, e essas variantes de ácidonucléico estão incluídas na presente invenção.
Na forma indicada aqui, neste pedido de patente, as moléculasde ácido nucléico da presente invenção que compreendem um ácido nucléi-co codificando um anticorpo anti MCP-1 podem incluir, porém não estão limi-tadas aquelas que codificam a seqüência de aminoácido de um fragmentode anticorpo, por ela própria; a seqüência que codifica para todo o anticorpoou para uma parte do mesmo; a seqüência que codifica para um anticorpo,fragmento ou parte, bem como seqüências adicionais, tais como as seqüên-cias que codificam pelo menos um peptídio líder de sinal ou de fusão, comou sem as seqüências de codificação adicionais antes mencionadas, tal co-mo pelo menos um intron, junto com seqüências adicionais, não codifican-tes, incluindo, porém não limitadas a seqüências 5' e 3' não codificantes, taiscomo as seqüências transcritas não traduzidas que têm um papel na trans-crição, processamento do mRNA, incluindo os sinais de divisão e de polia-denilação (por exemplo,a ligação de ribossomo e estabilidade do mRNA);uma seqüência adicional de codificação que codifique para aminoácidos adi-cionais, tais como aquelas que proporcionam funcionalidades adicionais.
Desse modo, a seqüência que codifica um anticorpo pode ser fundida a umaseqüência marcadora, tal como uma seqüência que codifica um peptídio quefacilita a purificação do anticorpo fundido que compreenda um fragmento ouparte de um anticorpo.
Polinucleotídios que se Hibridizam Seletivamente a um Polinucleotídio comoDescrito Aqui, neste Pedido de Patente: A presente invenção proporcionaácidos nucléicos isolados que se hibridizam sob condições seletivas de hi-bridização a um polinucleotídio descrito aqui, neste pedido de patente. Des-se modo, o polinucleotídio desta modalidade pode ser usado para isolar, de-tectar e ou quantificar ácidos nucléicos que compreendam esses polinucleo-tídios. Por exemplo, os polinucleotídios da presente invenção podem ser u-sados para a identificação, isolamento ou amplificação de clones parciais oude comprimento total em uma coleção depositada. Em algumas modalida-des, os polinucleotídios são seqüências de cDNA genômico isoladas, ou deoutra forma complementares a, um cDNA de uma coleção de ácidos nucléi-cos humanos ou de mamífero.
De preferência, a coleção de cDNA compreende pelo menos80% de seqüências de comprimento total, de preferência pelo menos 85%ou 90% de seqüências de comprimento total, e de mais preferência pelomenos de 95% de seqüências de comprimento total. As bibliotecas de cDNApodem se normalizadas para o aumento da representação de seqüênciasraras. Condições de hibridização de rigorosidade moderada ou baixa sãotipicamente, porém não exclusivamente, empregadas com seqüências quetenham uma identidade de seqüência reduzida com relação a seqüênciascomplementares. Condições de rigorosidade moderadas e altas podem op-cionalmente ser empregadas com relação a seqüências de maior identidade.Condições de rigorosidade baixas permitem a hibridização seletiva de se-qüências que tenham menos do que cerca de 70% de identidade de se-qüência e podem ser empregadas pata a identificação de seqüências ortólo-gas ou paralogas.
Opcionalmente, os polinucleotídios da invenção irão codificarpelo menos uma parte de um anticorpo codificado pelos polinucleotídiosdescritos aqui, neste pedido de patente.
Construção de Ácidos Nucléicos: Ao ácidos nucléicos isolados da presenteinvenção podem ser preparados com a utilização de (a) métodos recombi-nantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação, ou combinaçõesdas mesmas, como bem-conhecidas na técnica.
Métodos Recombinantes para Construir Ácidos Nucléicos: As composiçõesde ácidos nucléicos isolados desta invenção, tais como RNA, cDNA, DNAgenômico, ou qualquer combinação dos mesmos podem ser obtidas a partirde fontes biológicas com a utilização de qualquer número de metodologiasde clonagem conhecidas daquelas pessoas versadas na técnica. Em algu-mas modalidades, sondas de oligonicleotídio que se hibridizam seletivamen-te sob condições rigorosas, aos polinucleotídios da presente invenção sãousadas para a identificação da seqüência desejada em uma coleção de cD-NA ou de DNA genômico. O isolamento de RNA, e a construção das biblio-tecas de cDNA ou de DNA genômico, é bem-conhecida aquelas pessoas dehabilidade comum na técnica (vide, por exemplo, Ausubel supra; ou Sam-brook, supra).
Métodos de Triagem e de Isolamento de Ácidos Nucléicos: Uma coleção decDNA ou de DNA genômico pode ser submetida a triagem com a utilizaçãode uma sonda baseada na seqüência de um polinucleotidio da presente in-venção, de tais como aquelas descritas aqui, neste pedido de patente. Assondas podem ser usadas para se hibridizarem com as seqüências de DNAgenômico ou de cDNA para o isolamento de genes homólogos nos mesmosorganismos ou em organismos diferentes. Aquelas pessoas versadas natécnica poderão observar que diversos graus de rigorosidade de hibridizaçãopodem ser empregados na análise; e tanto a hibridização como o meio delavagem podem ser rigorosos. Na medida em que as condições de hibridiza-ção se tornam mais rigorosas, deve existir um grau maior de capacidade decomplementação entre a sonda e o alvo para que ocorra a formação de dú-plex. O grau de rigorosidade pode ser controlado através de uma ou mais detemperatura, resistência iônica, pH e a presença de um solvente de desnatu-ração parcial tal como a formamida. Por exemplo, a rigorosidade da hibridi-zação é variada de forma conveniente através da mudança da polaridade dasolução reagente através de, por exemplo, a manipulação da concentraçãode formamida dentro da faixa de 0% até 50%. O grau da capacidade decomplementação (identidade de seqüência) necessário pata a ligação detec-tável irá variar de acordo com a rigorosidade do meio de hibridização e/ou omeio de lavagem. O grau da capacidade de complementação irá ser otima-mente de 100%; ou de 70 a 100%, ou qualquer faixa ou valor dentro dasmesmas. No entanto, deve ser entendido que as variações menores de se-qüência nas sondas e iniciadores podem ser compensadas através da redu-ção da rigorosidade da hibridização e/ou do meio de lavagem.
Os métodos para a amplificação de RNA ou de DNA são bem-conhecidos na técnica e podem ser usados de acordo com a presente in-venção sem experimentação não necessária, com base nas informações e aorientações apresentadas aqui, neste pedido e patente. Os métodos conhe-cidos de amplificação de RNA ou de DNA incluem, porém não estão limita-dos a, reação em cadeia de polimerase (PCR), e processos de amplificaçãorelacionados (Mullis, et al., Patente U.S. Ne 4.683.202 (1987); e Innis, et al.,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic PressInc., San Diego1CA (1990).
Métodos Sintéticos para a Construção de Ácidos Nucléicos: Os ácidos nu-cléicos isolados da presente invenção também podem ser preparados atra-vés da síntese química direta através de métodos conhecidos (vide, por e-xemplo, Ausubel et al., supra). A síntese química produz, em geral um oligo-nucleotídio de um único filamento, que pode ser convertido em DNA de fila-mento duplo através de hibridização com uma seqüência complementar, ouatravés de polimerização com uma DNA polimerase usando o filamento uni-do como um padrão. Uma pessoa de habilidade na técnica irá reconhecerque embora a síntese química do DNA possa ser limitada as seqüências decerca de 100 ou mais bases, seqüências mais longas podem ser obtidasatravés da ligação de seqüências mais curtas. Um método de preferênciaespecífica para codificas seqüências é mostrado nas Patentes U. S. Nes6.521.427 e 6.670.127.
3. Vetores e Sistemas de Expressão
A invenção proporciona vetores, de preferência vetores de ex-pressão contendo um ácido nucléico que codifica um anticorpo anti MCP-1,ou que pode ser usado para obter plasmídios que contenham vários anticor-pos HC ou genes LC ou partes dos mesmos. Na forma usada aqui, nestepedido de patente, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléi-co capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ele tenha sido ligado.
Um tipo de vetor é um "plasmídio", que se refere a uma alça circular de DNAde filamento duplo dentro do qual segmentos adicionais de DNA podem serligados. Outro tipo de vetor é um vetor vira!, no qual segmentos adicionais deDNA podem ser ligados dentro do genoma viral. A presente invenção tam-bém se refere a vetores que incluem as moléculas isoladas de ácido nucléi-co da presente invenção, células hospedeiras que são manipuladas geneti-camente com os vetores recombinantes, e a produção de pelo menos umanticorpo anti MCP-1 através de técnicas recombinantes, como é bem-conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook, et al., supra; Ausubel etal., supra, cada incorporado em sua totalidade aqui, neste pedido de patente.
Para a expressão de anticorpos ou de fragmentos de anticorposdo mesmo, os DNA codificando cadeias parciais ou de comprimento totalleves ou pesadas, podem ser inseridos em cassetes ou vetores de expres-são de tal forma que os genes estejam ligados de forma operacional a se-qüências de controle de transcrição e de translação. Um cassete que codifi-que um anticorpo, pode ser montado como um constructo. Um constructopoder ser preparado com a utilização de métodos conhecidos na técnica.Oconstructo pode ser preparado como parte de um plasmídio maior. Essapreparação permite a clonagem e a seleção das construções corretas deuma maneira eficiente. O constructo pode ficar localizado entre sítios de res-trição convenientes no plasmídio ou em outro vetor de tal forma que elespossam ser isolados com facilidade a partir das seqüências restantes doplasmídio,
Em geral, um vetor de plasmídio é introduzido em um precipita-do, tal como um precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo comum lipídio carregado de DEAE-dextrano. Se o vetor for um vírus, ele podeser embalado in vitro com a utilização de uma linha de células de embala-gem apropriada e em seguida introduzido dentro de células hospedeiras. Aintrodução de um constructo de vetor dentro de uma célula hospedeira tam-bém pode ser efetuada através de eletroporação ou outros métodos conhe-cidos. Esses métodos estão descritos na técnica, tais como em Sambrook,supra, Capítulos de 1 a 4 e de 16 a 18; Ausubel, supra, capítulos 1, 9, 13,15,16.
Neste contexto, a expressão "ligado operacionalmente" é desti-nada a significar que um gene de anticorpo é ligado dentro de um vetor detal forma de as seqüências de controle de transcrição e de translação nointerior do vetor servem em sua função pretendida de regular a transcrição ea translação do geme do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüênciasde controle do vetor de expressão são escolhidas para serem compatíveiscom a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do an-ticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos dentrode vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridosdentro do mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridosdentro do vetor de expressão através de métodos padronizados (como porexemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento dogene do anticorpo e no vetor, ou ligação de final rombudo se não estiverempresentes os sítios de restrição).
As regiões variáveis de cadeia leve ou de cadeia pesada dosanticorpos descritos aqui, neste pedido de patente, podem ser usados para acriação de gene de anticorpo de comprimento total de qualquer isotipo deanticorpo através da inserção dos mesmos dentro de vetores de expressãoque já codifiquem regiões constantes de cadeia pesada e regiões constantesde cadeia leve do isotipo desejado de tal forma que o segmento VH estejaligado de modo operativo ao segmento ou segmentos CH no interior do vetore o segmento Vl esteja ligado de modo operativo ao segmento CL no interiordo vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recom-binante pode codificar um peptídio de sinal que facilite a secreção da cadeiado anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O geme da cadeia do anti-corpo pode ser clonado no interior do vetor de tal forma que o peptídio desinal esteja ligado na estrutura do terminal amino da cadeia do gene do anti-corpo. O peptídio de sinal pode ser um peptídio de sinal de imunoglobulinaou um peptídio de sinal heterólogo (isto é, um peptídio de sinal a partir deuma proteína que não a imunoglobulina).
Embora seja possível teoricamente a expressão dos anticorposda invenção tanto em células hospedeiras procarióticas como eucarióticas, aexpressão de anticorpos em células eucarióticas, e de mais preferência emcélulas hospedeiras de mamífero, é a de maior preferência devido a que es-sa células eucarióticas, e especificamente células de mamíferos, são maisprováveis do que as células procarióticas com relação a montagem e a se-creção de um anticorpo propriamente dobrado e imunologicamente ativo.
Em geral um vetor de expressão de mamífero irá conter (1) ele-mentos reguladores, usualmente na forma de seqüências virais promotorasou aumentadoras e caracterizados por uma ampla faixa de hospedeiro e detecido; (2) uma seqüência de "poliligante", facilitando a inserção de um frag-mento de DNA que compreenda a seqüência codificando o anticorpo dentrodo vetor plasmídio; e (3) a seqüência responsável pela divisão do intron apoliadenilação dos transcritos de mRNA. Essa região contígua do sítio depromotor-poliligante-poliadenilação é comumente referido como a unidadede transcrição. O vetor irá também conter provavelmente (4) um gene ougenes marcador selecionável (como por exemplo,o gene beta-lactamase),quase sempre conferindo resistência a um antibiótico (tal como a ampicilina),permitindo a seleção de transformantes iniciais positivos em E. colr, e (5)seqüências facilitando a replicação do vetor em ambos os hospedeiros bac-terianos e de mamífero. Um plasmídio de origem de replicação é incluso pa-ra a propagação do constructo de expressão em E. coli e para a expressãotransitória em células Cós, a origem SV40 de replicação é inclusa no plas-mídio de expressão.
Um promotor pode ser selecionado a partir de um promotorSV40 (como por exemplo, promotores SV40 finais ou prematuros, o promo-tor CVM (Patentes U.S. 5.168.062; 5.385.839), um promotor HSV, um pro-motor pgk (fosfogIicerase quinase), um promotor EF-1 alfa (Patente U. S.5.266.491), pelo menos um promotor de imunoglobulina humana.
Os vetores de expressão irão incluir de preferência, porém op-cionalmente pelo menos um marcador selecionável. Esses marcadores in-cluem, por exemplo, porém não estão limitados a metotrexato (MTX), diidro-folato redutase (DHFR, Patentes U. S. NQs 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134;4.956.288; 5.149.636; 5.179.017), ampicilina, neomicina (G418), ácido mico-fenólico, ou sintetase glutamina (Patentes U. S. N9S 5.122.464; 5.770.359;5.827.739) resistência para cultura de células eucarióticas, e genes de resis-tência a tetraciclina ou ampicilina para cultivo em E. coli e outras bactériasou procarióticas (as patentes acima firam inteiramente incorporadas aqui,neste pedido de patente, por referência) Os meios de cultura e as condiçõesapropriadas para as células hospedeiras acima escritas são conhecidos natécnica. Os vetores adequados se tornarão aparentes com facilidade ao ar-tesão habilitado.
Quando forem empregadas células hospedeiras eucarióticas,seqüências finalizadoras e de transcrição e de poliadenilação são tipicamen-te incorporadas ao vetor. Um exemplo de uma seqüência de finalização é aseqüência de poliadenilação a partir do gene do hormônio de crescimentobovino. As seqüências para uma divisão acurada do transcrito também po-dem ser inclusas. Um exemplo de uma seqüência de divisão é o intron VPIda SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773- a 781 (1983)). Além disso, se-qüências de gene para o controle da replicação na célula hospedeira podemser incorporadas dentro do vetor, como conhecido na técnica. Também, paraevitar uma alta superfície de expressão de moléculas de cadeia pesada, po-de ser necessário o uso de um vetor de expressão que elimine as variantesde divisões do domínio da transmembrana.
Os elementos adicionais incluem aumentadores, seqüências Ko-zak e seqüências intervenientes flanqueadas por sítios doadores e aceitado-res da divisão do RNA. Uma transcrição de alta eficácia pode ser alcançadacom os promotores precedentes e tardios de SV40, as repetições de termi-nal longas (LTRS) a partir de retrovírus, como por exemplo RSV, HTLVI, Hl-Vl e o promotor precedente de citomegalovírus (CVM). No entanto, elemen-tos celulares também podem ser usados (como por exemplo, o promotor deactina humana). Os vetores de expressão adequados para uso na prática dapresente invenção incluem, por exemplo, vetores tais como pIRESIneo,pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, ou pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA),pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) ou pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PS-VL e PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152),pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109).
Alternativamente, os ácidos nucléicos que codificam uma se-qüência de anticorpo podem ser expressos em linhas de células estáveisque co-obtenham o gene integrado em um cromossomo. A co-transfecçãocom um marcador selecionável ral como dhfr, gtp, neomicina ou hidromicinapermite a identificação e o isolamento das células transfectadas que expres-sem grandes quantidades do anticorpo codificado. O marcador DHFR (dii-drofolato redutase) é útil para desenvolver linhas de células que contenhamnumerosas centenas ou mesmo milhares de cópias do gene de interesse.Um outro marcador de seleção útil é a enzima glutamina sintase (GS) (Mur-phy, et al., Biochem. J. 227: 277- a 279 (1991); Bebbington, et al., Bi-o/Technology 10: 169 a 175 (1992)). Com a utilização desses marcadores,as células de mamíferos são cultivadas em meio seletivo e as células com amaior resistência são selecionadas. Essas linhas de células contém o geneou os genes amplificados integrador dentro de um cromossomo. As célulasdo ovário do hamster chinês (CHO) e as células NOS são freqüentementeusadas para a produção de anticorpos.
Os constructos de DNA usados na produção de anticorpos dainvenção podem opcionalmente incluir pelo menos uma seqüência de isola-mento. O termo "isolamento" ou as expressões "seqüência de isolamento" e"elemento de isolamento" são usados aqui, neste pedido de patente de for-ma intercambiável. Um elemento de isolamento é um elemento de controleque isola a transcrição de genes colocados dentro de seu campo de açãoporém que não perturba a expressão do gene, tanto de forma negativa comode forma positiva. De preferência, uma seqüência de isolamento é inseridaem ambos os lados da seqüência de DNA a ser transcrita. Por exemplo, oisolador pode estar posicionado a partir de 200 pb até cerca de 1 kb, 5' apartir do promotor, e pelo menos a cerca de 1 kb até 5 kb a partir do promo-tor, no final 3' do gene de interesse. A distancia da seqüência de isolamentoa partir do promotor e do final 3' do gene de interesse pode ser determinadapos aquelas pessoas versadas da técnica, dependendo dos tamanhos relati-vos do gene de interesse, do promotor e do aumentador usados no construc-to. Além disso, mais do que uma seqüência de isolamento pode ser posicio-nada a 5' a partir do promotor ou no final 3' do transgene. Por exemplo, duasou mais seqüências de isolamento podem ser posicionadas a 5' a partir dopromotor. O isolante ou isolantes no final 3' do transgene podem ser posi-cionados no final 3' do gene de interesse, ou no final 3" de uma seqüênciareguladora 3', como por exemplo, na região 3' não traduzida (UTR) de umaseqüência flanqueadora 3'.
Os exemplos de vetores de expressão de E. coli adequados quepodem ser induzidos e de não fusão incluem pTrc (Amann et al., (1988) Ge-ne 69: 301 a 315) e pET 11 d (Studier et al., Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). A expressão do gene-alvo a partir do vetor pTrc se apóia na transcriçãoda polimerase do RNA do hospedeiro a partir de um promotor de fusão hibri-do trp-lac. A expressão do gene-alvo a partir do vetor pET 11 de apóia sobrea transcrição a partir de um promotor de fusão 17 gn10-Iac mediada por umapolimerase de RNA viral co-expressa (T7 ga1). Essa polimerase viral é su-prida pelas cepas hospedeiras BL21(DE3) ou HMS174(DE3) a partir de umpró-fago λ residente acolhendo um gene 17 ga1 sob o controle de transcri-ção do promotor IacUV 5.
Em outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor de ex-pressão de levedura. Os exemplos de vetores para expressão em leveduraS.cerevisiae incluem pYepSed (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6: 229 a 234),pMFa (Kurjan e Herskowitz, (1982) Cell 30: 933 a 943), pJRY88 (Schultz etal. (1987) Gene 54: 113 a 123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego,Calif.), e pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).
Alternativamente, o vetor de expressão é um vetor de expressãoe baculovírus. Os vetores de baculovírus disponíveis para a expressão deproteínas em células cultivadas de insetos (por exemplo, as células Sf 9)inclui a serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156 a 2165) e a seriepVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31 a 39).
Em ainda outra modalidade, um ácido nucléico da invenção éexpresso em células de mamífero com a utilização de um vetor de expres-são de mamífero. Os exemplos de vetores de expressão em mamíferos in-cluem o pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman et al.(1987) EMBO J. 6: 187 a 195). Quando usados em células de mamíferos, asfunções de controle do vetor de expressão são quase sempre providas atra-vés de elementos de regulação virais. Por exemplo, os promotores comu-mente usados são derivados a partir de polioma, Adenovirus 2, citomegaloví-rus e Simian VÍRUS 40. Para outros sistemas adequados de expressão paraambas as células procarióticas e eucarióticas, vide os capítulos 16 e 17 deSambrooketal., supra.
Em outra modalidade, o vetor de expressão recombinante demamífero é capaz de direcionar a expressão do ácido nucléico, de preferên-cia em um tipo específico de célula, tal como células de Iinfoma (como porexemplo, células de mieloma de camundongo). Em tipos específicos de célu-las, elementos de regulação específicos para o tecido são usados para aexpressão do ácido nucléico. Os elementos de regulação específicos para otecido são conhecidos na técnica. Os exemplos não Iimitativos de promoto-res específicos para tecido adequados incluem o promotor de albumina (es-pecífico para o fígado: Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268 a 277), pro-motores específicos para linfóides (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol.43: 235 a 275), especificamente, promotores de receptores de células T(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729 a 733) e imunoglobulinas (Ba-nerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741 -748), promotores neuro específicos (por exemplo, o promoter do neuro fila-mento; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 5473 a5477), promotor específico para o pâncreas (Edlund et al. (1985) Science230: 912 a 916), e promotores específicos para as glandulas mamárias (co-mo por exemplo, promotore do soro de leite; Patente U.S. N- 4.873.316 ePublicação de Pedido de Patente Européia Ne 264.166).Os promotores regulados com relação ao desenvolvimento também estãoenglobados, por exemplo, pelos promotores hox murinos (Kessel and Gruss(1990) Science 249: 374 a 379) e o promotor de α-fetoproteina (Campes andTilghman (1989) Genes Dev. 3: 537 a 546).
A invenção também proporciona um vetor de expressão recom-binante que compreende uma molécula de DNA clonada dentro do vetor deexpressão em uma orientação anti-sentido. Isto é, a molécula de DNA estáligada operacionalmente a uma seqüência reguladora de uma maneira depermite a expressão (através de transcrição da molécula do DNA) de umamolécula de RNA que está anti-sentido ao mRNA que codifica um polipeptí-dio. As seqüências reguladoras ligadas de modo operacional a um ácido nu-cléico clonado na orientação anti-sentido podem ser escolhidas de formaque direcionem a expressão continua da molécula de RNA anti-sentido emuma variedade de tipos de células. Por exemplo, os promotores virais e/ouos aumentadores, ou as seqüências reguladoras podem ser escolhidos detal forma que direcionem a expressão anti-sentido do RNA constitutivo, es-pecífico para tecido ou específico para tipo de célula. O vetor de expressãoanti-sentido pode estar na forma de um plasmídio recombinante, "fagemido",ou vírus atenuado nos quais os ácidos nucléicos anti-sentido são produzidossob o controle de uma região reguladora de alta eficácia, a atividade da qualpode ser determinada pelo tipo de célula dentro do qual o vetor é introduzi-do. Para uma discursão da regulação da expressão do gene com a utilizaçãode genes anti-sentido, vide Weintraub et al. (Reviews-Trends in Genetics,Vol. 1(1) 1986).
Clonagem e Expressão em Células de Mieloma.
Um anticorpo monoclônico IgGIK quimérico camundon-go/humano contra o CD4 humano, conhecido como cM-T412 (EP 0511308inteiramente incorporada por referência), foi observado para ser expressoem níveis elevados em células de mieloma de camundongo transfectadas(Looney et al. 1992. Hum Antibodies Hybridomas 3(4):191 a 200). Sem umgrande esforço em otimizar as condições de cultura, níveis de produção de >500 mg/ml (produtividade específica em uma base de pg/célula/dia não co-nhecida), foram facilmente obtidas em Centocor, Inc, Malvem, PA em 1990.Com base nos componentes desses vetores de expressão, vetores de clo-nagem de anticorpos foram desenvolvidos com relação a clonagem úteispara HC e LC que incluem a seqüência de ácido nucléico de iniciação pro-motora e transcrição do gene, as seqüências 5' não transladadas e as se-qüências de ácido nucléico de iniciação da translação, as seqüências de á-cido nucléico codificando a seqüência de sinal, as seqüências doadoras dedivisão intron/exon para o intron de sinal e o intron J-C, e as seqüências deácido nucléico aumentadoras do intron J-C. O plasmídio p139, um plasmídiopUC19, contém um fragmento genômico EcoRI-EcoRI de 5,8 kb clonado decélulas de hibridoma C123 secretando o M-T412 Ab total de camundongo; ofragmento contém o promotor de parte de região V do gene cM-T412 HC. Omaterial de partida para a manipulação da região V do vetor LC foi o plasmí-dio p39, um plasmídio pUC que continha um fragmento genômico Hindlll-Hindlll de 3 kb clonado a partir de células de hibridoma C123; este fragmen-to contém o promotor e parte da região V do gene cM-T412 LC. Os vetoresmanipulados derivados a partir dos p139 e p39 foram projetados para permi-tir a montagem conveniente dos genes HC ou LC adequados para a expres-são em uma célula hospedeira de mamífero em um processo de duas eta-pas que vincula 1) clonagem do DNA que codifica uma seqüência de inte-resse entre sítios de restrição especialmente preparados em um vetor daregião V, por meio do que a seqüência que codifica a região V é posicionadaimediatamente a jusante da seqüência de sinal codificando o vetor, bem co-mo á jusante de parte ou de todo o promotor do gene; e 2) transferindo umfragmento que transpõe a seqüência inserida a partir do vetor da região Vpara o vetor da região C na orientação apropriada por meio do que o plas-mídio resultante constitui o plasmídio de expressão final adequado para aexpressão em células (Scallon et al. 1995 Cytokine 7(8):759-769).Clonagem e expressão em células CHO.
O plasmídio pC4 é um derivado do plasmídio pSV2-dhfr (Núme-ro de acesso ATCC 37146). O plasmídio contém o gene DHFR do camun-dongo sob o controle do promotor antecipado SV40. Células de ovário dehamster chinês ou outras células que não têm a atividade diidrofolato quesão transfectadas com esses plasmídios podem ser selecionadas através docultivo das células em um meio seletivo (como por exemplo, MEM alfa me-nos Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com o agente quí-mico terapêutico metotrexato. A amplificação dos genes DHFR em célulasresistentes ao metotrexato (MTX) tem sido bem documentada (vide, por e-xemplo, F. W. Alt, et al„ J. Biol. Chem. 253: 1357 a 1370 (1978); J. L. Hamline C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107 a a143 (1990); e M. J. Page eM. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64 a 68 (1991)).0 cultivo das células emconcentrações crescentes de MTX desenvolve resistência ao fármaco atra-vés de superprodução da enzima-alvo, DHFR, como resultado da amplifica-ção do gene DHFR. Se um segundo gene for ligado ao gene DHFR, ele éusualmente co-amplificado e expresso em excesso. É conhecido na técnicaque essa abordagem pode ser usada para o desenvolvimento de linhas decélulas contendo mais do que 1.000 cópias do gene ou dos genes amplifica-dos. Em seguida, quando o metotrexato é retirado, são obtidas linhas de cé-lulas que contêm o gene amplificado integrado dentro de um ou mais cro-mossomo ou cromossomos da célula hospedeira.
O plasmídio pC4 contém, para a expressão do gene de interesseum promotor forte de longa repetição de terminal (LTR) do Vírus do sarcomade Rouss (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)) mais um frag-mento isolado a partir do aumentador do gene antecipado do citomegaloví-rus humano (CVM)(Boshart, et al., Cell 41: 521-530 (1985)). A jusante dopromotor os sítios de clivagem das enzimas de restrição BamHl, Xbal, eAsp718 que permitem a integração dos genes. Por trás desses sítios de clo-nagem o plasmídio contém o intron 3' e o sítio de poliadenilação do gene dapré-pro-insulina do rato. Outros promotores de alta eficácia também podemser usados para a expressão, por exemplo o promotor da b-actina humana,os promotores antecipados ou tardios SV40 ou as repetições de terminallongas de outros retrovírus, como por exemplo, HIV and HTLVI. Os sistemasde expressão de gene CIontech1S Tet-Off e Tet-On e sistemas similares po-dem ser usados para a expressão do anticorpo MCP-1 de uma maneira re-gulada em células de mamíferos (M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para a poliadenilação de outros sinaisdo rriRNA, por exemplo, a partir dos genes do hormônio de crescimento hu-mano ou da globina, também podem ser usados.
4. Células Hospedeiras para a Produção de Anticorpos.
Pelo menos um anticorpo anti MCP-1 da presente invenção po-de ser opcionalmente produzido por uma linha de células, uma linha de célu-las mista, ou uma célula imortalizada ou uma população clonada de célulasimortalizadas, como bem-conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Ausubel,et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.,NY, NY (1987-2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodi-es, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al.,eds., Current Protocols in lmmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2004); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley &Sons, NY, NY, (1997-2004), cada um dos quais incorporado em sua totali-dade aqui, neste pedido de patente por referência.
Com a finalidade de produzir produtos bio farmacêuticos, é ne-cessária uma linha de células de produção capaz da expressão eficaz e re-produzível de um polipeptídio ou de polipeptídios recombinantes. A linha decélulas é estável e bancável. Uma variedade de linhas de células pode serempregada para essa finalidade. Na medida em que o entendimento dascomplexidades de como a maquinaria celular produz a quantidade final e acomposição do produto bio terapêutico, a seleção de uma linha de célulashospedeiras que irá conferir os atributos necessários para a produção e acomposição do produto se torna mais evidente.
Ao contrario da maioria dos genes que são transcritos a partir deseqüências contínuas de DNA genômico, os genes de anticorpo são monta-dos a partir de segmentos de gene que podem estar amplamente separadosna linha de germes. Especificamente, os genes da cadeia pesada sãoformados através da recombinação dos segmentos genômicos que codifi-cam as regiões variável (V), de diversidade (D) e de junção (J)/constante (C)do anticorpo. Os genes funcionais da cadeia leve são formados pela junçãode dois segmentos de gene: um codifica a região Veo outro codifica a regi-ão J/C. Ambos os locais de cadeia pesada e kapa da cadeia leve contémmuitos segmentos de gene V (os cálculos variam entre centenas e milhares)calculados para se espalharem bem sobre 1000 kb. O local lambda é, emcontraste, muito menor e tem mostrado se espalhar em aproximadamente300 kp no cromossomo 16 no camundongo. Ele consiste em dois segmentosvariáveis do gene e quatro segmentos de gene da região de jun-ção/constante (J/C). A formação de um gene funcional requer a recombina-ção entre um elemento V e um elemento J/C.
Na célula B, na qual o anticorpo é produzido naturalmente, ocontrole da transcrição de ambos os genes kapa rearranjados da cadeia pe-sada e da cadeia leve dependem ambas da atividade de um promotor espe-cífico para o tecido a montante da região V e um estimulador específico parao tecido localizado no intron J/C. Esses elementos atuam de forma sinérgica.Também, um segundo estimulador específico para a célula B foi identificadono local kapa da cadeia leve. Esse aumentador adicional está localizado a 9kp à jusante do Ckapa-Desse modo, o método de hibridoma para imortalizaros genes de expressão de anticorpos se baseia sobre as seqüências dopromotor endógeno e do aumentados da linhagem de células B de origem.Alternativamente, os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser ex-pressos em uma célula hospedeira por tornar a mesma (através de manipu-lação) em uma célula hospedeira que contenha o DNA endógeno codifican-do um anticorpo da presente invenção. Esses métodos são bem-conhecidosna técnica, como por exemplo, descritos nas Patentes U. S. NQs 5.580.734,5.641.670, 5.733.746, e 5.733.761, inteiramente incorporadas aqui, nestepedido de patente por referência.
A clonagem do DNA genômico do anticorpo dentro de um vetorartificial é um outro método para a criação de células hospedeiras capazesda expressão de anticorpos. No entanto, a expressão de anticorpos mono-clônicos por trás de um promotor forte aumenta as possibilidades de identifi-cação de linhas de células de alta produção e obtendo produções mais ele-vadas de anticorpos monoclônicos. Os anticorpos da invenção também po-dem ser produzidos em um "transfectoma" de uma célula hospedeira, com autilização de, por exemplo, uma combinação de técnicas recombinantes deDNA e métodos de transfecção de genes como é bastante conhecido natécnica (como por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Os sistemas para a clonagem e a expressão de produtos bio-farmacêuticos, incluindo anticorpos, em uma variedade de células hospedei-ras diferentes são bem-conhecidos. As células hospedeiras adequadas in-cluem sistemas de bactérias, células de mamíferos, células de vegetais, le-vedura e baculovírus e plantas e animais transgênicos. As linhas de célulasde mamífero disponíveis na técnica para a expressão de uma proteína glico-silada de polipeptídio intacto heterólogo incluem as de ovário de hamsterchinês (CHO), células HeLa, células do rim de filhotes de hamster (BHK),células de melanoma de camundongo NOS e linhas de células derivadas,como por exemplo, células de mieloma de rato SP2/0, YB2/0 (ATC CRL-1662), células embrionárias do rim, humano (HEK), células embrionáriasda retina humana, células PerC.6, células hep G2, BSC-1 (como por exem-pio, ATCC CRL-26) e muitas outras disponíveis a partir de, por exemplo,American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org).
As células de mamífero tais como as células CHO, células demieloma, células HEK293, células BHK (BHK21, ATCC CRL-10), células Ltkde camundongo, e células NIH3T3 tem sido freqüentemente usadas para aexpressão estável de genes heterólogos. Em contraste, as linhas de célulastais como Cos (COS-1 ATCC CRL 1650; COS-7, ATCC CRL-1651) eHEK293 são usadas de forma rotineira para a expressão transitória de prote-ínas recombinantes.
As células hospedeiras de mamífero de preferência para a ex-pressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem as células demieloma tais como as Sp2/0, YB2/0 (ATC CRL-1662), NSO, eP3X63.Ag8.653 (por exemplo, SP2/0-Ag14) devido à alta taxa de expressãodas mesmas. Especificamente, para uso com as células de mieloma NOS,outro sistema de expressão de preferência é o sistema de expressão de ge-ne GS descrito no WO 87/04462 e na EP 338.841. Quando vetores de ex-pressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidosdentro de células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidosatravés da cultura das células hospedeiras durante um período de temposuficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras,ou, de mais preferência, a secreção do anticorpo dentro do meio de culturano qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser re-cuperados a partir do meio de cultura com a utilização de métodos de purifi-cação de proteínas padronizados.
As células de mamífero são ilustrativas das culturas de célulasúteis para a produção de anticorpos, partes especificadas ou variantes dosmesmos. Os sistemas de células de mamífero quase sempre estarão naforma de monocamadas de células embora as suspensões ou biorreatoresde células de mamíferos ou possam também ser usadas.
Uma quantidade de linhas de células hospedeiras adequadascapazes de expressar proteínas glicosiladas intactas têm sido desenvolvidasna técnica, e incluem as linhas de células COS-1 (por exemplo, ATCC CRL1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exem-plo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (e.g.,ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2,P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa e as similares, queestão disponíveis com facilidade a partir de, por exemplo, a American TypeCulture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). As células hospedeiras depreferência incluem as células de origem linfóide tais como as células demieloma e de linfoma. São de preferência específica as células hospedeirasP3X63Ag8. As células 653 (número de acesso ATCC CRL-1580) e célulasSP2/0-Ag14 (Número de acesso ATCC CRL-1851).
As células CHO-K1 e as células DHFR- CHO DG44 e DUK-B11(G. Urlaub, L.A. Chasin, 1980. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77, 4216-4220)são usadas para a produção de proteínas em nível elevado devido ao fatode a amplificação dos genes de interesse é habilitada pela incorporação deum marcador selecionável que pode ser amplificado, DHFR, usando, porexemplo o fármaco metotrexato (MTX) (R.J. Kaufman, 1990. MethodsEnzymol. 185: 537 a 566). As células CHO DHFR' podem ser usadas comsucesso para a produção de mAbs recombinantes em um nível elevado. AsCHO DHFR" podem produzir anticorpos abri MCP-1 em uma taxa de 80 a110 mg 106 células1" por dia"1 ou mais do que 200 mg de 106 células1" pordia"1. Uma variedade de promotores tem sido usada para obter a expressãode cadeias HeL nessas células CHO1 por exemplo o promotor de b-actina,o promotor CMV NIE humano, o promotor tardio principal do vírus Ad (MLP,o promotor RSV1 e um LTR do vírus da leucemia murina. Uma quantidade devetores para a expressão de mAb estão descritos na literatura, nos quais asduas cadeias de Ig estão contidas em dois plasmídios diferentes com ummarcador independente selecionável e amplificável. Os vetores contendouma cadeia de anticorpo, como por exemplo a cadeia H, ligados a um mar-cador DHFR, e um cassete de expressão de uma cadeia L com o marcadorNeor ou vice-versa, podem ser usados para obter até 180 mg de um mAb "17 dias"1 em frascos giratórios. Os métodos usados para a seleção inicial e asubseqüente amplificação podem ser variados e são bastante conhecidosdas pessoas versadas na técnica. Em geral, a expressão de mAb em nívelelevado pode ser obtida com a utilização das seguintes etapas: seleção ini-cial e amplificação em seguida dos clones candidatos (como por exemplo,em casos nos quais os vetores de expressão de ambas as cadeias HeLcont[em uma unidade de expressão de DHFR) e amplificação, co-amplificação com a utilização de marcadores amplificáveis diferentes, e se-leção inicial e amplificação em cultura de massa, seguida pela clonagem pordiluição para a identificação dos clones individuais de expressão elevada.Devido a que os sítios de integração podem influenciar a eficiência da ex-pressão da cadeia H e da cadeia Lea expressão total dos mAb, foram cria-dos vetores individuais nos quais as unidades de expressão das duas cadei-as de Ig são colocadas em tandem. Esses vetores também contém um mar-cador selecionável dominante tal como Neor e o cassete de expressão deDHFR.Para uma revisão vide Ganguly, S. e A. Shatzman. Expression Sys-tems, mammalian cells IN: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermen-tation, Bioeatalysis, and Bioseparation. 1999 por John Wiley & Sons, Inc.
Cockett et al. (1990. Bio/Technology 8, 662-667) desenvolveramo sistema GS para a expressão em alto nível de genes heterólogos em célu-las CHO. A transfecção de um vetor de expressão contendo um cDNA (sobo controle de transcrição do promotor hCMV) e um mini gene GS (sob o con-trole do promotor tardio SV40) dentro de células CHO-K1 (seguido pela se-leção com 20 mM até 500 mM de MSX), pode ser usada para a produção declones expressando os anticorpos da invenção em rendimentos comparáveisaqueles dos sistemas DHFR-CHO. O sistema GS é discutido em sua totali-dade ou em parte em conexão com as Patentes Européias N-s 0 216 846, 0256 055, e 0 323 997, e o Pedido de Patente Européia Ne 89303964.4.
Como um exemplo não limitativo, folhas de tabaco transgênicasque expressam proteínas recombinantes têm sido usadas com sucesso paraa provisão de grandes quantidades de proteínas recombinantes, como porexemplo, com a utilização de um promotor que pode ser induzido. Vide, porexemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) eas referências citadas no mesmo. Também o milho transgênico tem sido u-sado para a expressão proteínas de mamíferos em níveis de produção co-mercial, com atividades biológicas equivalentes aquelas produzidas em ou-tros sistemas recombinantes ou purificadas a partir de origens naturais. Vide,por exemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) e as refe-rências citadas no mesmo. Também têm sido produzidos anticorpos emgrandes quantidades a partir de sementes de plantas transgênicas incluindofragmentos de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia única (os scFv),incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Vide, por exemplo,Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) e as referências citadas nomesmo. Desse modo, os anticorpos da presente invenção também podemser produzidos com a utilização de plantas transgênicas, de acordo com mé-todos conhecidos. Vide também, por exemplo, Fischer et al., Biotechnol. Ap-pl. Biochem. 30: 99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7(1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem.Soe. Trans. 22: 940-944 (1994); e as referências citadas nos mesmos. Videtambém em geral, com relação a expressão de anticorpos em plantas, po-rém não limitados a Patente U. S. Ne 5.959.177. Cada uma das referênciasacima fica inteiramente incorporada aqui, neste pedido de patente, por refe-rência.
5. Purificação de um Anticorpo.
Um anticorpo anti MCP-1 pode ser recuperado e purificado aprtir de culturas de células recòmbinantes através de métodos bem-conhecidos, incluindo, porém não limitados a, purificação de proteína A pre-cipitação pos sulfato de amônio ou por etanol, extração ácida, cromatografiade troca de ânion ou de cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatogra-fia por interação hidrófoba, cromatografia por afinidade, cromatografia comhidróxi apatita e cromatografia com lecitina. A cromatografia líquida de altodesempenho ("HPCL") também pode ser empregada para a purificação. Vi-de, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Pro-tocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por e-xemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um inteiramente incorporado aqui,neste pedido de patente por referência.
Os anticorpos da presente invenção incluem produtos purifica-dos naturalmente, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produ-tos produzidos através de técnicas recòmbinantes a partir de um hospedeiroeucariótico, incluindo, por exemplo, levedura, vegetais superiores, células deinseto ou de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um pro-cedimento de produção por recombinação, o anticorpo da presente invençãopode ser glicosilado ou pode ser não glicosilado, com os glicosilado sendode preferência. Esses métodos estão descritos em muitos manuais padrãode laboratório, tais como Sambrook, supra, Seções 17,37 a 17.42; Ausubel,supra, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20, Colligan, Protein Science, supra,Capítulos 12 a 14, todos inteiramente incorporado aqui, neste pedido de pa-tente por referência.6. Anticorpos da Invenção.
Os anticorpos anti MCP-1 (também denominados de anticorposantiOCCL2 ou anticorpos MCP-1) úteis para os métodos e as composiçõesda presente invenção podem opcionalmente ser caracterizados através daalta afinidade de ligação com o MCP-1, capacidade para inibir uma ou maisdas atividades biológicas associadas com o MCP-1, e opcionalmente e depreferência tendo baixa toxidez.
Os anticorpos da invenção podem se ligar ao MCP-1 humanocom uma ampla faixa de afinidades (KD). Em uma modalidade de preferên-cia, pelo menos um mAb humano da presente invenção pode opcionalmentese ligar ao MCP-1 humano com uma alta afinidade. Por exemplo, um mAbhumano pode se ligar um MCP-1 humano com um Kd igual ou menor do quecerca de 10"7 M, tal como, porém não limitado a 0,1 - 9,9 (ou qualquer taxaou valor dentro das mesmas) X 10"7, 10'8, ΙΟ^ΙΟ'10, 10"11, 10'12, 10"13ouqualquer taxa ou valor dentro das mesmas.
A afinidade ou a avidez de um anticorpo com relação a um antí-geno podem ser determinadas experimentalmente com a utilização de qual-quer método adequado. (Vide, por exemplo, Berzofsky, et ai, "Antibody-Antigen Interactions," em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., RavenPress: New York, NY (1984); Kuby1 Janis Immunology, W. H. Freeman andCompany: New York, NY (1992); e métodos descritos aqui, neste pedido depatente). A afinidade medida de uma interação de um anticorpo-antígenoespecífico pode variar se medida sob condições diferentes (como por exem-plo, concentrações do sal, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e deoutros parâmetros de ligação com antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) sãofeitas de preferência com soluções padronizadas de anticorpo e de antígeno,e um tampão de padronização, tal como as soluções e tampões padrão des-critas aqui, neste pedido de patente.
Os anticorpos isolados da presente invenção compreende umaseqüência de aminoácidos do anticorpo descrita aqui codificada por qualquerpolinucleotídio adequado, ou qualquer anticorpo isolado, ou preparado. Depreferência, o anticorpo humano ou o fragmento que se liga ao antígeno seliga à MCP-1 humano e, por meio disso neutraliza de forma parcial ou subs-tancialmente pelo menos uma atividade biológica da proteína, um anticorpo,ou uma parte especificada ou variante do mesmo, que neutraliza parcial-mente ou de preferência substancialmente pelo menos uma atividade bioló-gica de pelo menos uma proteína ou fragmento MCP-1 pode se ligar a prote-ína ou ao fragmento e por meio disso inibir atividades mediadas através daligação da MCP-1 a um receptor de MCP-1 ou através de outros mecanis-mos dependentes ou mediados pela MCP-1. Na forma usada aqui, nestepedido de patente, a expressão "anticorpo neutralizante" se refere a um anti-corpo que pode inibir uma atividade dependente da MCP-1 por cerca de 20a 120%, de preferência por pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou mais de-pendendo da análise. A capacidade de um anticorpo anti MCP-1 de inibiruma atividade dependente da MCP-1 é avaliada de preferência através depelo menos uma análise de proteína ou receptor de MCP-1 adequada, comodescrita aqui, neste pedido de patente e/ou como conhecida na técnica. Umanticorpo humano da invenção pode ser de qualquer classe ou isótopo (IgG,IgA, IgM, IgE, IgD, etc.)ou pode compreender uma cadeia leve kapa oulambda. Em uma modalidade, o anticorpo humano compreende uma cadeiapesada de IgG ou um fragmento definido, por exemplo, de pelo menos umdos isótipos l.gG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Os anticorpos desse tipo podem serpreparados através do emprego de um camundongo transgênico ou outromamífero transgênico não humano compreendendo pelo menos um trans-gene de cadeia leve humano (como por exemplo, IgG, IgA, e IgM (por e-xemplo, γ1, γ2, γ3, γ4) como descritos aqui, neste pedido de patente ou comoconhecidos na técnica. Em outra modalidade, o anticorpo humano MCP-1anti-humano compreende uma cadeia pesada de IgG e uma cadeia leve deIgG.
Pelo menos um anticorpo da invenção se liga a pelo menos umanticorpo específico especificado para pelo menos uma proteína MCP-1,fragmento, parte ou qualquer combinação da mesma. Pelo menos um epíto-po pode compreender pelo menos um região de ligação com o anticorpo quecompreenda pelo menos uma parte da proteína, cujo epítopo é de preferên-cia composto por pelo menos de 1 a 3 aminoácidos com relação a parte es-pecífica total dos aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1.
Em geral, o anticorpo humano ou o fragmento que se liga ao an-tígeno da presente invenção irá compreender uma região de ligação com oantígeno que compreende, pelo menos uma região determinante comple-mentar humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de pelo menos uma re-gião variável de cadeia leve. Como um exemplo não limitativo, o anticorpoou a parte que se liga ao antigeno ou a variante pode compreender pelo me-nos uma das CDR3 da cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidosdas SEQ ID NO: 9 ou 12 e/ou uma CDR3 de cadeia leve que tenha a se-qüência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 15 a 17, 20 ou 21. Em uma mo-dalidade específica, o anticorpo ou o fragmento que se liga ao antígeno podeter uma região de ligação ao antígeno que compreenda pelo menos umaparte de pelo menos uma CDR de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e/ouCDR3) que tenha a seqüência de a aminoácidos das CDR 1, 2 e/ou 3 cor-respondentes (como por exemplo as SEQ ID NOS: 6-12 e/ou 22, 23, e 26).Em outra modalidade específica, o anticorpo ou a parte ou variante que seliga ao antígeno pode ter uma região de ligação com o antígeno que com-preenda pelo menos uma parte de pelo menos uma CDR de cadeia leve (is-to é, (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) que tenha a seqüência de a aminoá-cidos das CDR 1, 2 e/ou 3 correspondentes (como por exemplo as SEQ IDNOS: 13-21 e/ou 24 e 25). Em uma modalidade de preferência as três CDRde cadeia pesada e as três DCR de cadeia leve do anticorpo ou do fragmen-to que se liga ao antígeno de uma seqüência de aminoácido derivada a partirda CDR correspondente a pelo menos um dos Fab MOR0336, MOR03464,MOR03468, MOR03470, MOR03471, MOR03473, MOR03548, como descri-tos aqui, neste pedido de patente e as regiões de estrutura de cadeia pesa-da derivadas a partir de um anticorpo VH3 (SEQ ID NO: 2) e as regiões deestrutura de cadeia leve derivadas a partir de um anticorpo do tipo kapa(SEQ ID NO: 4.). Esses anticorpos podem ser preparados através da junçãoem conjunto das diversas partes (os CDR e as estruturas) do anticorpo coma utilização de técnicas convencionais, através de preparando e expressan-do uma molécula de ácido nucléico que codifique o anticorpo com a utiliza-ção de técnicas convencionais de tecnologia de DNA recombinante ou atra-vés da utilização de qualquer outro método adequado.
O anticorpo anti MCP-1 pode compreender pelo menos uma deuma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve que tenha uma se-qüência de aminoácidos definida nas regiões de estrutura. Por exemplo, emuma modalidade de preferência, o anticorpo anti-MCP-1 compreende, pelomenos uma região variável de cadeia pesada, tendo opcionalmente a se-qüência de aminoácidos da SEQ ID NOS: 2 ou 3 e/ou pelo menos uma regi-ão variável de cadeia leve, que tenha opcionalmente a seqüência de amino-ácidos das SEQ ID NOS: 4 ou 5.
A classe do anticorpo ou do isótopo (IgA, IgD, IgE, IgG, ou IgM)é conferida pelas regiões constantes que são codificadas pelos genes daregião constante da cadeia pesada. Entre a classe de IgG humana, existemquatro subclasses ou sub tipos IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4 nomeadas na or-dem a sua abundancia natural no soro, se iniciando a partir da mais alta atéa mais baixa. Os anticorpos IgA são encontrados como duas subclasses,IgAI e lgA2. Na forma usada aqui, neste pedido de patente a "troca de isoti-po" também se refere a uma troca entre as subclasses ou sub tipos de IgG.
A invenção também de refere a..anticorpos, fragmentos que seligam a antígeno, cadeias de imunoglobulina e CER que compreendem ami-noácidos em uma seqüência que seja substancialmente a mesma como a deuma seqüência de aminoácido descrita aqui, neste pedido de patente. Depreferência, esses anticorpos ou fragmentos que se ligam a antígenos e osanticorpos que compreendem essas cadeia ou CDR podem se ligar a MCP-1humana com alta afinidade (como por exemplo, Kd menos do que ou igual acerca de 10'9 M). As seqüências de aminoácido que são substancialmenteas mesmas como as seqüências descritas aqui, neste pedido de patenteincluem seqüências que compreendem substituições conservadoras de ami-noácidos, vem como cancelamentos e/ou inserções de aminoácidos. Umasubstituição conservadora de aminoácido se refere a substituição de umprimeiro aminoácido por um segundo aminoácido que tenha propriedadesquímicas e/ou físicas (por exemplo, carga, estrutura, polaridade, capacidadehidrófoba/capacidade hidrófila) que sejam similares aquelas do primeiro a-minoácido. As substituições conservadoras incluem a substituição de umaminoácido por outro dentro dos grupos que se seguem: Iisina (K), ), argini-na (R) e histidina (H); aspartato (D) e glutamato (E); asparagina (N), glutami-na (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (I), K, R, H, D e E; alanina (A), valina(V), Ieucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofan (W), meti-onina (M), cisteína (C) e glicina (G); F, W e I; C, S e T.
Um anticorpo anti MCP-1 da presente invenção pode incluir umaou mais substituições, cancelamentos ou adições de aminoácidos tanto apartir de mutações naturais como por manipulação humana, como especifi-cadas aqui, neste pedido de patente ou como ilustradas em Knappik et al.,U.S. 6828422 com relação a regiões variáveis derivadas a partir de seqüên-cias de linhas de germe humano e categorizadas através de similaridades deseqüência dentro de famílias designadas como VH1 A, VHIBm VH2m etc., epos cadeias leves tais como os subgrupos kapa ou lambda. Essas seqüên-cias e outras seqüências que podem ser usadas na presente invenção inclu-em, podem não estão limitadas as configurações apresentadas da Tabela 1,como também escritas nas Figuras 1 a 42 da Publicação PCT WO05/005604 e na U.S. 10/872.932, depositada em 21/06/2004, inteiramenteincorporadas aqui, neste pedido de patente, por referência, nas quais as Fi-guras de 1 a 42 mostram exemplos de seqüências, estruturas, subdomínios,regiões, partes de domínios variáveis e constantes de cadeia leve e pesadade as quais podem ser usadas em proteínas derivadas de Ig da presenteinvenção, como mostradas aqui, neste pedido de patente.
Tabela 1. Configurações de Anticorpos Humanos.
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O número de substituições de aminoácidos que uma pessoaversada na técnica poderia fazer depende de muitos fatores, incluindo aque-les descritos acima. Falando de um modo geral, o número de substituições,inserções e cancelamentos de aminoácidos para um determinado anticorpoanti MCP-1, fragmento ou variante do mesmo não serão mais do que 40, 30,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como de1 a 30 ou qualquer faixa ou valor dentro da mesma como especificado aqui,neste pedido de patente.
Os aminoácidos em um anticorpo anti MCP-1 da presente inven-ção que são essenciais para a função podem ser identificados através demétodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada a sítio,ou mutagênese de triagem por alanina (como por exemplo, Ausubel, supra,Capítulos 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244: 1081 a 1085 (1989)).O último processo introduz mutações isoladas de alanina a cada resíduo namolécula. As moléculas mutantes resultantes são em seguida testadas comrelação a atividade biológica, tal como, porém não limitada a pelo menosuma atividade de neutralização de MCP-1. Os sítios que são importantespara a ligação com o anticorpo também podem ser identificados através deanálises estruturais tais como, cristalização ressonância magnética nuclearou marcação por foto afinidade (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899 a 904(1992) e de Vos, et al.f Science 255: 306 a 312 (1992)).
Os anticorpos anti MCP-1 da presente invenção, podem incluir,porém não estão limitados a, pelo menos uma parte, seqüência ou combina-ção selecionada a partir de 5 até todos os aminoácidos contíguos de pelomenos uma das SEC ID NOS: 2 a 5 e 27 e 28.
O anticorpo anti MCP-1 pode opcionalmente também compreen-der um polipeptídio de pelo menos uma das SEC ID NOS:27 e 28. Em umamodalidade, a seqüência de aminoácido de uma cadeia de imunoglobulina,ou uma parte da mesma tem cerca de 100% de identidade à seqüência deaminoácido da cadeia correspondente de pelo menos uma das SEC ID NOS:27 e 28, porém para as substituições conservadoras que não mudem a es-pecificidade de ligação do anticorpo anti MCP-1. Por exemplo, a seqüênciade aminoácidos de uma região variável de uma cadeia leve pode ser compa-rada com a seqüência das SEC ID NOS: 4 ou 5, ou a seqüência de aminoá-cido de uma cadeia pesada pode ser comparada com as SEC ID NOS: 2 ou3. De preferência, a identidade em aminoácido é determinada com a utiliza-ção de um algoritmo de computador adequado como conhecido na técnica.
Como aquelas pessoas versadas irão observar, a presente in-venção inclui pelo menos um anticorpo biologicamente ativo da presenteinvenção. Os anticorpos biologicamente ativos tem uma atividade específicade pelo menos 20%, 30% ou 40%, e de preferência pelo menos de 50%,60%, ou 70%, e de mais preferência de pelo menos 80%, 90%, ou de 95% a100% daquela do anticorpo natural (não sintético) endógeno ou relacionado.Os métodos para a avaliação e quantificação as medições de atividade en-zimática e especificidade de substrato, são bem-conhecidos daquelas pes-soas versadas na técnica e descritos aqui, neste pedido de patente.
Em outro aspecto a invenção se refere a anticorpos humanos ea fragmentos que se ligam a antígenos que são modificados através da fixa-ção covalente de uma parte orgânica. Essa modificação pode produzir umanticorpo ou um fragmento que se liga a antígenos com propriedades fárma-co-cinéticas aperfeiçoadas (por exemplo, a uma meia vida no soro in vivoaumentada). A parte orgânica pode ser um grupo polimérico hidrófilo linearou ramificado, grupo de ácido graxo, ou grupo de éster de ácido graxo. Emmodalidades específicas, o grupo polimérico hidrófilo pode ter um peso mo-lecular de cerca de 800 até cerca de 120,000 Dáltons e pode ser um glicolde polialcano (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol(PPG), polímero de carboidrato ou polivinil pirrolidona, e os grupos de ácidograxo ou de éster de adido graxo podem compreender a partir de cerca deoito até cerca de quarenta átomos de carbono.
Os anticorpos e os fragmentos que se ligam a antígenos modifi-cados da invenção podem compreender uma ou mais partes orgânicas queestejam ligadas de modo covalente, diretamente ou indiretamente ao anti-corpo. Cada parte orgânica que está ligada a um anticorpo ou a um fragmen-to que se liga ao antígeno da invenção pode ser independentemente umgrupo polimérico hidrófilo, um grupo de ácido graxo, ou grupo de éster deácido graxo. Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a expressão"ácido graxo" engloba ácidos monocarboxílicos e ácidos di-carboxilicos. Um"grupo polimérico hidrófilo" na forma em que a expressão é usada aqui, nes-te pedido de patente, se refere a um polímero orgânico que seja mais solúvelem água do que em octano. Por exemplo, a polilisina é mais solúvel em á-gua do que em octano. Desse modo, um anticorpo modificado através daligação covalente de polilisina é englobado pela invenção. Os polímeros hi-drófilos adequados para a modificação de anticorpos da invenção podem serlineares ou ramificados, por exemplo, os glicóis de polialquila (por exemplo,PEG, monometóxi polietileno glicol (mPEG), PPG e os similares), carboidra-tos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídios e ossimilares) polímeros de aminoácidos hidrófilos (por exemplo, polilisina, poli-arginina, poliaspartato e os similares), óxidos de polialcano (por exemplo,óxido de polietileno, óxido de polipropileno e os similares) e polivinil pirroli-dona. De preferência, o polímero hidrófilo que modifica o anticorpo da inven-ção tem um peso molecular de cera d e 800 até 120.000 Dáltons como umaentidade molecular separada. Por exemplo, o PEG5000 e o PEG20.000 nosquais o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Dáltons, podemser usados. O grupo de polímero hidrófilo pode ser substituído com um atécerca de seis grupos de alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Os po-límeros hidrófilos que são substituídos com um grupo de ácido graxo ou deéster de ácido graxo podem ser preparados através do emprego de métodosadequados. Por exemplo, um polímero compreendendo um grupo de aminapode ser acoplado com um carboxilato do ácido graxo ou do éster de ácidograxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com Ν,Ν-carbonil dii-midazola) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado aum grupo hidroxila em um polímero.
Os ácidos graxos e os ésteres de ácido graxo adequados para amodificação de anticorpos da invenção podem ser saturados ou podem con-ter uma ou mais unidades de não saturação. Os ácidos graxos que são ade-quados para a modificação de anticorpos da invenção incluem, por exemploos n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (Ci4, miriestato), n-octadecanoato (Ci8, estearato), n-eicosanoato (C2o, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C3o), n-tetracontanoato (C4o),c/s-A9-octadecanoato (Ci8, oleato), todos os c/s-Δδ,8,11,14-eicosatotraenoatos (C20, araquidonato), ácido octanedióico, ácido tetradeca-nedióico, ácido octadecanedióico, ácido docosanedióico e os similares. Osésteres de ácido graxo incluem mono ésteres de ácidos dicarboxílicos quecompreendem um grupo linear ou ramificado de alquila inferior. O grupo dealquila inferior pode compreender a partir de um até doze, de preferência deum até cerca de seis átomos de carbono.
Ao anticorpos humanos modificados e os fragmentos de ligaçãocom antígeno podem ser preparados com a utilização de métodos adequa-dos, tais como pela reação com um ou mais agentes de modificação. Um"agente modificador" na forma em que a expressão é usada aqui, neste pe-dido de patente, se refere a um grupo orgânico adequado (por exemplo, umpolímero hidrófilo, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreen-de um grupo de ativação. Um "grupo de ativação" é uma parte química ouum grupo funcional que pode, sob condições apropriadas, reagir com umsegundo grupo químico e por meio disso formar uma ligação covalente entreo agente modificador e o segundo grupo químico. Por exemplo, grupos ati-vadores reativos a amina incluem os grupos eletrófilos, tais como tosilato,mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidil eos similares. Os grupos de ativação que podem reagir corn os tióis incluem,por exemplo, meleimida, iodoacetila, acrilolila, dissulfetos de piridila, tiol doácido 5-tioM-nitro benzóico (TNB-tiol) e os similares. Um grupo funcional dealdeído pode ser acoplado a moléculas contendo amina ou hidrazida, e umgrupo de azida pode reagir com um grupo de fósforo trivalente para a forma-ção de fosforamidato ou ligações de fosforimida. Os métodos adequadospara a indução de grupos de ativação dentro de moléculas são conhecidosna técnica (vide por exemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate TechniqueslAcademic Press: San Diego, CA (1996)). Um grupo de ativação pode estarligado diretamente ao grupo orgânico (como por exemplo, um polímero hi-drófilo, um ácido graxo, um éster de ácido graxo), ou através de uma partede ligação, por exemplo um grupo C1-C12 divalente no qual um ou mais áto-mos de carbono podem ser substituídos por um hetero átomo tal como oxi-gênio, nitrogênio ou enxofre. As partes de ligação adequadas incluem, porexemplo, tetraetileno QlicoI-(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- and -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-. Os agentes de modificação que com-preendem uma parte de ligação podem ser produzidos, por exemplo, atravésda reação de uma mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono_-Boc-diaminoexano) com um ácido graxo na presençade 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para a formação deuma ligação de amida entre a amina livre e o carboxilato de ácido graxo. 0grupo de proteção Boc pode ser removido a partir do produto pelo tratamen-to com ácido trifluoracético (TFA) para expôs uma amina primária que podeser acoplada a outro carboxilato e o produto resultante se ciclizado para aprodução de um derivado ativado de maleimida do ácido graxo. (vide, porexemplo, Thompson, et ai., WO 92/16221 as informações totais da qual fi-cam incorporadas aqui, neste pedido de patente por referência).
Os anticorpos modificados da invenção podem ser produzidosatravés da reação de um anticorpo humano ou um fragmento que se liga aoantígeno com um agente de modificação. Por exemplo, as partes orgânicaspodem ser ligadas ao anticorpo de uma maneira não específica através doemprego de um agente de modificação reativo a amina, por exemplo, uméster de NHS de PEG. Os anticorpos humanos modificados ou os fragmen-tos que se ligam ao antígeno também podem ser preparados através da re-dução das ligações de dissulfeto (por exemplo, ligações de dissulfeto entrecadeias) de um anticorpo ou um fragmento que se liga ao antígeno. O anti-corpo ou o fragmento que se liga ao antígeno reduzidos podem em seguidaser reagidos com um agente de modificação reativo a tiol para a produçãodo anticorpo modificado da invenção. Os anticorpos ou os fragmentos quese ligam ao antígeno modificados humanos compreendendo uma parte or-gânica que está ligada a sítios específicos de um anticorpo da presente in-venção podem ser preparados com a utilização de métodos adequados, taiscomo proteólise reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: 147-153(1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran etal., Protein ScL 6(10): 2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1):59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)), emétodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Acade-mic Press: San Diego, CA (1996).
7. Anticorpos Anti-ldiótipo para Anticorpos Anti MCP-1.
Além dos anticorpos monoclônicos ou quiméricos anti MCP-1, apresente invenção também é direcionada a um anticorpo antiidiotípico (anti-Id) específico para tais anticorpos da invenção. Um anticorpo anti-idiótipo éum anticorpo que reconhece determinantes únicas geralmente associadascom a região de ligação do antígeno com outro anticorpo. O anti-ld pode serpreparado através da imunização de um animal da mesma espécie e tipogenético (como por exemplo, uma cepa de camundongo) como a fonte doanticorpo Id com o anticorpo ou uma região CDR que contenha o mesmo. Oanimal imunizado irá reconhecer e responder ao determinante idiotípico doanticorpo imunizante e produzir um anticorpo anti-ld. O anticorpo anti-ldtambém pode ser usado como um "imunogeno" para a indução de uma res-posta de imunização em ainda um outro animal, produzindo um assim cha-mado anticorpo anti-ld..8. Composições de Anticorpo compreendendo outros ingredientes terapêuti-cos ativos.
A composição também pode compreender opcionalmente umaquantidade eficaz de pelo menos um composto ou proteína selecionado apartir de pelo menos um fármaco dermatológico, um fármaco antiinflamató-rio, um analgésico, um fármaco renal (por exemplo, um bloqueador ou anta-gonista do receptor da angiotensina (ARB), um fármaco antiinfeccioso, umfármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistemanervoso central (CSN), um fármaco para o sistema nervoso autônomo(ANS), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastro-intestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio fluido oueletrolítico, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco deimuno modulação, um fármaco oftálmico ou nasal, um fármaco tópico umfármaco nutricional ou similares. Esses fármacos são bem-conhecidos natécnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administração paracada um dos apresentados aqui, neste pedido de patente (vide, por exem-plo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., S-pringhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon,Wilson, Stang, Prentice-Hall, lnc, Upper Saddle River, NJ; PharmcotherapyHandbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, cada um in-corporado em sua totalidade aqui, neste pedido de patente, por referência).
As composições de anticorpo anti MCP-1 da presente invençãopodem ainda compreender pelo menos um de qualquer quantidade eficazadequada de uma composição ou composição farmacêutica compreendendopelo menos um anticorpo anti MCP-1 para uma célula, tecido, órgão, animalou paciente que esteja necessitando dessa modulação, tratamento ou tera-pia, compreendendo opcionalmente também pelo menos um selecionado apartir de um antagonista de TNF (como por exemplo, porém não limitados a,um antagonista químico de TNF ou proteína, anticorpo monoclônico policlô-nico ou fragmento TNF,um receptor solúvel de TNF (como por exemplo, p55,p70 ou p85) ou fragmento, polipeptídios de fusão dos mesmos ou um anta-gonista de TNF de molécula pequena, por exemplo, uma proteína de ligaçãoI ou II (TBP-1 ou ΤΒΡ-ΙΙ) nerelimonmab, infliximab, interasses, CDP-571,CDP-870, afelimomab, lenercept, e os similares), um anti-reumático (comopor exemplo, metotrexato, auranofin, aurotioglucose, azatioprina, etanercept,tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfa-salzina), um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco antiinflamatórionão esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um a-nestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (como porexemplo, aminoglicosídio, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, acarbapenemo, cefalosporina, uma flúorquinolona, um macrolidio, uma penici-lina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outros antimicrobianos), um antipso-riátíco, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionadocom diabetes, a mineral, a nutritivo, um agente de tiróide, uma vitamina, umhormônio relacionado com cálcio, um anti diarréico, um anti tosse, um antiemético, um anti ulcera, um laxativo, um antícoagulante, uma eritropoieitina(como por exemplo epoetina alfa), um filgrastim (como por exemplo G-CSF,Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), um agente contra a do-ença obstrutiva pulmonar crônica (COPD), um agente anti-fibrótico, uma i-munização, uma imunoglobulina, um supressor de imunização (como porexemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimen-to, um fármaco de reposição hormonal, um modulador do receptor de estro-gênio, um midriátíco, um cicloplégico, um agente de alquilação, um antime-tabólito, um inibidor mitótico, um radio farmacêutico, um antidepressivo, umagente antimaníaco, um anti psicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um sim-pático mimético, um estimulante, donapezil, tacrina, uma medicação paraasma, um beta agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno,uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, dornase alfa(Pulmozime), uma citocina ou um antagonista de citocina. Os exemplos nãolimitadores de tais citocinas incluem, porém não estão limitados a, qualqueruma de IL-1 até IL-29. As dosagens adequadas são bem-conhecidas na téc-nica. Vide, por exemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2ndEdition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing,Loma Linda, CA (2000), cada uma das quais dessas referências são inteira-mente incorporadas aqui, neste pedido de patente, por referência.
Esses fármacos anticâncer ou antiinfecções também podem in-cluir moléculas de toxina que estão associadas, ligadas, co-formuladas ouco-administradas com pelo menos um anticorpo da presente invenção. Atoxina pode opcionalmente atuar para matar seletivamente a célula ou o te-cido patológico. A célula patológica pode ser um câncer ou outra célula. Es-sas toxinas podem ser, porém não estão limitadas a, toxinas purificadas ourecombinantes ou fragmentos de toxina compreendendo pelo menos umdomínio citotóxico funcional de toxina, como por exemplo, selecionada a par-tir de pelo menos uma de rícino, toxina da difteria, uma toxina de veneno, ouuma toxina de bactéria. O termo toxina também inclui ambas as endotoxinase as exotoxinas produzidas através de um mutante de ocorrência natural oubactéria recombinante ou vírus que possam ocasionar qualquer condiçãopatológica em seres humanos e em outros mamíferos, incluindo a toxina dochoque, que podem resultar em morte. Essas toxinas podem incluir, porémnão estão limitadas a, enterotoxina enterotoxigenica de E. coli instável aocalor (LT), enterotoxina estável ao calor (ST), citotoxina de Shigella, entero-toxina de Aeromonas, toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1), en-terotoxina Estafilocócica A (SEA), B (SEB), ou C (SEC), Enterotoxina Estrep-tocócica e similares. Essas bactérias incluem, porém não estão limitadas a,cepas de uma espécie de E. coli enterotoxiogênico (ETEC), E. coli enterohemorrágico (e.g., cepas do serotipo 0157:H7), espécies de Staphylococcus(como por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphyloeoeeus pyogenes),espécies de Shigella (como por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flex-neri, Shigella boydii, e Shigella sonnei), espécies de Salmonella (como porexempolo, Salmonella typhi, Salmonella eholera-suis, Salmonella enteritidis),especies de Clostridium (como por exemplo, Clostridium perfringens, Clostri-dium difieile, Clostridium botulinum), espécies de Camphlobaeter (como porexemplo, Camphlobaeter jejuni, Camphlobaeter fetus), espécies de Heliobae-ter, (como por exemplo, Heliobaeter pylorí), espécies de Aeromonas (comopor exemplo, Aeromonas sóbria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas eaviae),Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, espécies de Vibrios (comopor exemplo, Vibrios choierae, Vibrios parahemoiyticus), espécies de Klebsi-ella, Pseudomonas aeruginosa, e Streptococci. Vide, por exemplo, Stein,ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston,(1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology andControl, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medicai Book Co., New York (1991);Mandell et al, Principies and Practice of Infeetious Diseases, 3d. Ed., Chur-chill Livingstone, New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual,16th edition, Merck and Co., Rahway1 N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbi-ology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711(1990), os teores de cujas referências são incorporados em sua totalidadeaqui, neste pedido de patente, por referência.
Os compostos, composições ou combinações do anticorpo antiMCP-1 da presente invenção podem ainda compreender pelo menos um dequalquer agente auxiliar adequado, tais como, porém não limitados a, diluen-te, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipófilos, conservante,adjuvante ou os similares. Os auxiliares farmaceuticamente aceitáveis sãoos de preferência. Os exemplos não Iimitativos dos, e dos métodos para apreparação de tais soluções estéreis são bem-conhecidos na técnica, taiscomo, porém não limitados a Gennaro, Ed., Remington1S PharmaceuticalSciences, 18lh Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Podem serselecionados da forma rotineira os veículos farmaceuticamente aceitáveisque sejam adequados para o modo de administração, solubili-dade e/ou estabilidade do anticorpo anti-MCP-1, fragmento ou composiçãovariante como bem-conhecidos na técnica ou descritos aqui, neste pedido depatente.
Os excipientes farmacêuticos e aditivos úteis na presente com-posição incluem porém não estão limitados a proteínas, peptídios, aminoáci-dos, lipídios, e carboidratos (como por exemplo, açúcares, incluindo monos-sacarídeos, di-, tri- tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivatizados taiscomo alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e os similares, e po-lissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes de formaisolada ou em combinação, compreendendo isoladamente ou em combina-ções de 1 a99,99% em peso ou volume. Os excipiente de proteínas de e-xemplo incluem albumina do soro tal como a albumina do soro humano(HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e os simila-res. Os componentes de aminoácido/anticorpo representativos, que tambémpodem funcionar em uma capacidade de tampão, incluem a alanina, glicina,arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina,leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e os similares.Um aminoácido de preferência é a glicina.
Os excipientes de carboidratos adequados para serem usadosna invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos tais como a frutose,maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e os similares; dissacarí-deos, tais como lactose, sacarose, trehalose, celobiose e os similares; polis-sacarídeos, tais como a rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, a-midos e os similares; e alditóis, tais como o manitol, xilitol, maltitol, lactiol,xilitol sorbitol (glicitol), mioinositol, e os similares. Os excipientes de carboi-dratos de preferência para serem usados na presente invenção são manitol,trehalose e rafinose.
As composições de anticorpo anti MCP-1 também podem incluirum tampão ou um agente de ajuste do pH; tipicamente o tampão é um salpreparado a partir de um ácido ou base orgânica. Os tampões representati-vos incluem sais de ácidos orgânicos tais como os sais de ácido cítrico, áci-do ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succí-nico, ácido acético, ou ácido ftálico; tampões de Tris cloridrato de trometami-na ou fosfato. Otampões de preferência para serem usados nas presentescomposições são os sais de ácido orgânico tais como o citrato.
Além disso, as composições de anticorpo anti MCP-1 da inven-ção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos tais como as polivinil pirro-lidonas, ficóis (um açúcar polimérico), dextratos (como por exemplo, ciclo-dextrinas, tais como 1-hidroxipropil-p-ciclodextrina), polietileno glicóis, agen-tes de aromatização, agentes antimicrobianos, adoçantes, agentes antiestá-tica, surfatantes (como por exemplo, polissorbatos tais como o "TWEEN 20"e TWEEN 80") lipídios (como por exemplo, fosfolipídios, ácidos graxos), es-teróides (como por exemplo, colesterol) e agentes de quelação (por exemploo EDTA).
Esses e outros excipientes farmacêuticos adicionais conhecidose/ou aditivos adequados para serem usados no anticorpo anti-MCP-1, parteou composições variantes de acordo com a invenção são conhecidos natécnica, por exemplo, como relacionados em "Remington: The Science &Practice of Pharmacy", 19th ecl., Williams & Williams, (1995), e no nPhysici-an's Desk Reference", 52nd ed., Medicai Economics, Montvale, NJ (1998), adescrição dos quais fica inteiramente incorporada aqui, neste pedido de pa-tente, por referência. Os materiais de veículo ou de excipientes de preferên-cia são os carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e os tampões(por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos.
9. Formulações.
Como observado acima, a invenção proporciona formulaçõesestáveis adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, compreendendopelo menos um anticorpo anti MCP-1 em uma formulação farmaceuticamen-te aceitável.
Como observado acima, a invenção proporciona um artigo defabricação, compreendendo material de embalagem e pelo menos um frascocompreendendo uma solução de pelo menos um anticorpo .anti-MCP-1, comos tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em um diluenteaquoso, em que o referido material de embalagem compreende uma rótuloque indica que tal solução pode ser mantida durante um período de 1, 2, 3,4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou mais. A in-venção também compreende um artigo de fabricação, compreendendo ma-terial de embalagem, um primeiro frasco compreendendo pelo menos umanticorpo anti-MCP-1 liofilizado, e um segundo frasco compreendendo umdiluente aquoso do tampão ou do conservante prescrito, em que o referidomaterial de embalagem compreende uma rótulo que instrui um paciente parareconstituir pelo menos um anticorpo anti-MCP-1 liofilizado no diluente a-quoso para a formação de uma solução que pode ser mantida durante umperíodo de vinte e quatro horas ou maior.
A faixa de pelo menos um anticorpo anti MCP-1 no produto dapresente invenção inclui quantidades que produzem depois da reconstitui-ção, em um sistema seco/molhado, concentrações a partir de cerca de 1,0μg/l até cerca de 1000 μςΛηΙ, embora concentrações mais baixas ou maisaltas sejam operáveis e são dependentes do veículo de suprimento preten-dido, como por exemplo, formulações de solução serão diferentes de méto-dos de adesivo transdérmico, pulmonares, por transmucosa ou osmótica oude micro bombas.
O diluente aquoso também compreende opcionalmente um con-servante farmaceuticamente aceitável. Os conservantes de preferência in-cluem aqueles selecionados a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresil, clorocresol, álcool de benzila, parabeno de alquila(metila, etila, propila, burila e os similares), cloreto de benzalcônio, deidroa-cetato de sódio e timerosal, ou as misturas dos mesmos. A concentração doconservante usado na formulação é uma concentração suficiente para pro-duzir um efeito anti microbiano. Essas concentrações são dependentes doconservante selecionado e são determinadas com facilidade pelo artesãohabilitado.
Outros excipientes, como por exemplo, os agentes isotônicos,tampões, antioxidantes, aumentadores de preservação, podem ser opcio-nalmente e de preferência adicionados ao diluente. Um agente de capacida-de isotônica, tal como a glicerina, é comumente usado em concentraçõesconhecidas. As formulações podem cobrir uma faixa ampla de pH, tal comoa partir de cerca de pH 4 até cerca de pH 10, e de preferência variam a partirde cerca do pH 5 até cerca de pH 9, e em uma faixa de maior preferência decerca de 6,0 até cerca de 8,0. De preferência as formulações da presenteinvenção têm um pH entre cerca de 6, 8 e cerca de 7.8. Os tampões de pre-ferência incluem os tampões de fosfato, de mais preferência fosfato de só-dio, especificamente solução salina tamponada com fosfato (PBS).
Outros aditivos, tais como solubilizantes farmaceuticamente a-ceitáveis como o Teen 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano (20)),Tween 40 (monopalmitato de polioxietileno sorbitano (20)), Tween 80 (mo-nooleato de polioxietileno sorbitano (20)), Pluronic F68 (copolímeros em blo-co de polioxoetileno e polioxipropileno), e PEG (polietileno glicol) ou surfa-tantes não iônicos tais como o polissorbato 20 ou 80 ou o poloxâmero 184ou 188, polis Pluronic®, outros copolímeros em bloco, e quelantes tais comoEDTA e AGTA podem ser adicionados opcionalmente as formulações oucomposições para a redução da agregação. Esses aditivos são especifica-mente úteis se for usado um recipiente de bomba ou de plástico para a ad-ministração da formulação. A presença de um surfatante farmaceuticamenteaceitável mitiga a propensão da proteína para se agregar.
As formulações da presente invenção podem ser preparadasatravés de um processo que compreende a misturação de pelo menos umanticorpo anti MCP-1 e uma solução tamponada em quantidade suficientepara prover a proteína nas concentrações desejadas. As variações desseprocesso poderão ser reconhecidas por uma pessoa versada na técnica. Porexemplo, a ordem em que os componentes são adicionados, se forem usa-dos aditivos adicionais, a temperatura e o pH nos quais a formulação é pre-parada, são todos os fatores que podem ser otimizados com relação a con-centração e os meios de administração usados.
As formulações reivindicadas podem ser providas a pacientescomo soluções ou como frascos duplos compreendendo um frasco de pelomenos um anticorpo anti MCP-1 Iiofilizado que é reconstituído com um se-gundo frasco contendo água, um conservante e/ou excipientes, de preferên-cia um tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido em um di-luente aquoso. Tanto um frasco de solução única ou uma dupla de frascosnecessitando de reconstituição podem ser reusados múltiplas vezes e po-dem ser suficientes para um ciclo único ou múltiplos ciclos de tratamento dopaciente e desse modo podem prover um regime de tratamento mais conve-niente do que o correntemente disponível.
Os artigos de fabricação presentemente reivindicados são úteispara a administração durante um período a partir de imediatamente até vintee quatro horas ou maior. Por conseqüência, os artigos de fabricação presen-temente reivindicados oferecem vantagens significativas para o paciente. Asformulações da invenção podem opcionalmente ser armazenadas com segu-rança em temperaturas a partir de cerca de 2 até cerca de 40°C e conser-vam a atividade biológica da proteína durante períodos de tempo prolonga-dos, permitindo desse modo um rótulo na embalagem indicando que a solu-ção pode ser mantida e/ou usada durante um período de 6, 12, 18, 24, 36,48, 72, ou 96 horas, ou maior. Se for usado um diluente preservado, essorótulo pode incluir o uso em até de 1 a 12 meses, durante meio ano, um anoe meio e/ou dois anos.
O produto reivindicado pode ser provido indiretamente aos paci-entes através da provisão para farmácias, clinicas e outras de tais institui-ções e facilidades, de soluções transparentes ou de frascos duplos compre-endendo um frasco de pelo menos um anticorpo anti-MCP-1 Iiofilizado que éreconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A soluçãotransparente neste caso pode ser de até um litro ou mesmo maior em tama-nho, provendo um reservatório maior a partir do qual pequenas porções depelo menos uma solução de anticorpo possam ser retiradas uma ou múlti-plas vezes para serem transferidas para frascos menores e providas pelafarmácia ou clínica aos seus consumidores e/ou pacientes.
Dispositivos reconhecidos compreendendo esses sistemas defrascos_úηico ou duplos incluem aqueles dispositivos de injetor tipo canetapara o suprimento de uma solução tal como o BD Pens, BD Autojector®,Humaject®· NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen®,Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®,Iject®, J-tiρ Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por exemplo, taiscomo fabricados ou desenvolvidos por Becton Dickensen (Franklin Lakes1NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suíça,www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); NationalMedicai Products, Weston Medicai (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Osdispositivos reconhecidos compreendendo o sistema de frascos duplos in-cluem aqueles sistema de injetor tipo caneta para a reconstituição de umfármaco Iiofilizado em um cartucho para o suprimento da solução reconstitu-ída tal como o HumatroPen®.
Os produtos presentemente reivindicados incluem o material deembalagem. O material de embalagem provê, além da informação requeridapelas agencias reguladoras, as condições sob as quais o produto pode serusado. O material de embalagem da presente invenção provê instruções aopaciente para a reconstituição do pelo menos um anticorpo anti MCP-2 nodiluente aquoso para formar uma solução e para usar a solução durante umperíodo de 2 a 24 horas ou mais para o produto de dois frascos, molha-do/seco. Para o produto de solução de um frasco único, o rotulo indica quetal solução pode ser usada durante um período de 2 a 24 horas ou maior. Osprodutos presentemente reivindicados são úteis para serem usados em pro-dutos farmacêuticos humanos.
Outras formulações ou métodos para a estabilização de um anti-corpo anti MCP-1 podem resultar outra solução, que não a solução transpa-rente de pó Iiofilizado compreendendo o referido anticorpo. Entre as solu-ções não transparentes estão as formulações que compreendem as suspen-sões particuladas, os referidos particulados sendo uma composição que con-tém o anticorpo anti MCP-1 em uma estrutura de dimensões variáveis e co-nhecidos de forma variada como uma microesfera, micro partícula, nano par-tícula, nano esfera, ou lipossomo. Essas formulações particuladas essenci-almente esféricas relativamente homogêneas que contém um agente ativopodem ser formadas através do contato de uma fase aquosa contendo oingrediente ativo e um polímero e uma fase não aquosa seguida pela evapo-ração da fase não aquosa para ocasionar a coalescência das partículas apartir da fase aquosa como reportada pela U. S. 4.589.330. As micropartícu-Ias porosas podem ser preparadas primeiro pela utilização de uma primeirafase contendo o principio ativo e um polímero disperso em um solvente con-tínuo e removendo o referido solvente a partir da suspensão através de se-cagem por congelamento ou por diluição-extração-precipitação como repor-tado pela U. S. 4.818.542. Os polímeros de preferência para essas prepara-ções são copolímeros naturais ou sintéticos selecionados a partir do grupoque consiste em gelatina, ágar, amido, arabinogalactano, albumina, coláge-no, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicolida-L(-) lactídio poli(epsilon-caprolactona), poli(ácido epsilon-caprolactona-CO-láctico, poli(ácido epsilon-caprolactona-CO-glicólico), poli(ácido β-hidróxi butírico), oxido de polietileno,polietileno, poli(alquil-2-acrilato de ciano), poli(metacrilato de hidroxietil), po-liamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(éster deuréia), poli(L-fenilalanina/etileno glicol/1,6 diidrocianato hexano) e po-li(metacrilato de metil).
Os polímeros de preferência específica são os poliésteres tais como o ácidopoliglicólico, ácido poliacético, glicolida-L(-)lactido poli(epsiíon-caprolactona,poli(ácido epsilon-caprolactona-CO-lactico, e poli(ácido epsilon-caprolactona-CO-glicólico). Os solventes úteis para a dissolução do polímeroe/ou do ingrediente ativo incluem água, haxafluorisopropanol, cloreto de me·tileno, tetraidrofurano, hexano, benzeno ou sesquiidrato de hexafluor aceto-na. O processo para a dispersão da fase que contem o ingrediente ativo coma segunda fase pode incluir forças com pressão a referida primeira fase a-través de um orifício ou bocal para efetuar a formação de gotículas.
As formulações em pó seco Rodem partir de outros processosque não o de liofilização tais como através de secagem por pulverização, ouextração do solvente através de evaporação ou pela precipitação de umacomposição cristalina seguida por uma ou mais etapas para a remoção dosolvente aquoso ou não aquoso. A preparação de uma preparação de anti-corpo por secagem por pulverização é ensinada na U. S. 6.019.968. Ascomposições de pó seco com base no anticorpo podem ser produzidas atra-vés de soluções ou suspensões pastosas de secagem por pulverização doanticorpo e.opcionalmente, excipientes, em um solvente sob condições paraprover um pó seco respirável. Os solventes podem incluir compostos polarestais como a água e etanol, que podem ser secados com facilidade. A estabi-lidade do anticorpo pode ser aumentada através da realização dos procedi-mentos de secagem por pulverização na ausência de oxigênio, tal como sobuma atmosfera de nitrogênio ou através da utilização do nitrogênio como ogás de secagem. Outra formulação relativamente seca é uma dispersão deuma pluralidade de microestruturas perfuradas dispersas em um meio desuspensão que compreenda tipicamente um propelente de hidrofluoralcano,como ensinado na WO 99/16419. As dispersões estabilizadas podem, seradministradas ao pulmão de um paciente com a utilização de um inalador dedose medida. Os equipamentos úteis na fabricação comercial de medica-mentos secados por pulverização são fabricados por Buchi Ltd. ou NiroCorp.
Pelo menos um anticorpo anti MCP-1 tanto em formulações ousoluções estáveis como preservadas descritas aqui, neste pedido de paten-te, podem ser administradas a um paciente de acordo com a presente inven-ção através de uma variedade de métodos de suprimento incluindo injeçãoSC ou IM; transdérmico, pulmonar, transmucosa, implante, bomba osmótica,cartucho, microbomba, ou outros meios apreciados pelo versado, como bas-tante conhecidos na técnica.
10. Aplicações Terapêuticas.
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença relacionada com aMCP-1 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, como conhecidana técnica ou como descrita aqui, neste pedido de patente, com a utilizaçãode pelo menos um anticorpo MCP-1 da presente invenção. A presente in-venção também proporciona um método para a modulação ou o tratamentode pelo menos uma doença relacionada com a MCP-1, em uma célula, teci-do, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitando a, pelo menosuma doença maligna, doença metabólica, uma doença relacionada com i-munização ou inflamatória, uma doença cardiovascular, uma doença infec-ciosa, ou uma doença neurológica.
Essas condições são selecionadas a partir de, porém não estãolimitadas a, doenças ou condições mediadas pela adesão de células e/ouangiogênese. Essas doenças ou condições incluem um distúrbio ou doençade imunização, um distúrbio ou uma doença cardiovascular, um distúrbio ouuma doença infecciosa, maligna e/ou neurológica, ou outras condições co-nhecidas ou especificadas como relacionadas com a MCP-1. Específica-mente, os anticorpos são úteis para o tratamento de doenças que envolvema angiogênese tais como a doença do olho e doença neoplásica, remodela-ção de tecido como a restenose, e proliferação de determinados tipos decélulas especificamente os carcinomas de células epiteliais e escamosas. Asindicações específicas incluem o uso no tratamento de aterosclerose, reste-nose, metástase do câncer, artrite reumatóide, retinopatia diabética e dege-neração macular. Os anticorpos neutralizantes da invenção também são Ci-teis para a prevenção ou o tratamento de reabsorção ou degradação de os-so não desejada, por exemplo, como encontrada na osteoporose ou resul-tante da expressão exagerada de PTHrP por alguns tumores. Os anticorpospodem também ser úteis para o tratamento de diversas doenças fibróticastais como fibrose pulmonar idiopática, nefropatia diabética, hepatite e cirro-se.
Desse modo, a presente invenção prove um método para a mo-dulação ou o tratamento de pelo menos uma doença relacionada com aMCP-1, em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, como conhecidasna técnica ou como descritas aqui, neste pedido de patente.com a utilizaçãode pelo menos um anticorpo MCP-1 da presente invenção. As indicaçõesespecíficas são discutidas abaixo:
Doença Pulmonar
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença maligna em umacélula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitada a,pelo menos uma de: pneumonia, abscesso no pulmão, doença ocupacionalpulmonar causada por agentes na forma de poeiras, gases, ou névoas; as-ma, bronquiolite fibrosa obliterans, insuficiência respiratória, doenças da hi-persensibilidade dos pulmões incluindo pneumonite de hipersensibilidade(alveolite alérgica extrínseca), aspergilose bronco pulmonar e reações a fár-macos; síndrome do desconforto respiratório adulto (ARDS), síndrome deGoodpasture, distúrbios obstrutivos crônicos das vias aéreas, doenças in-tersticiais idiopáticas do pulmão tais como fibrose pulmonar idiopática e sar-coisidose, pneumonia intersticial descamativa, pneumonia intersticial aguda,bronquiolite respiratória associada com doença intersticial do pulmão, bron-quiolite obliterans com o pneumonia e organizando, pneumonite intersticiallinfócitica, granulomatose da célula de Langerhans, hemosiderose idiopáticapulmonar; bronquite aguda, proteinose pulmonar alveolar, bronquiestasia,distúrbios pleurais, atelectasis, fibrose cística, e tumores do pulmão, e embo-lismo pulmonar.
Doença Maligna
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou tratamento de pelo menos uma doença maligna em uma célu-la, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitadas a, pelomenos uma de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda,(ALL)Célula B, célula T ou FAB ALL, leucemia mielíide aguda (AML), leuce-mia mielocitica crônica (CML), leucemia linfócitica crônica (CLL), leucemiade célula do pelo, síndrome mielodiplastica (MDS), um linfoma, doença deHodgkin, um linfoma maligno, linfoma não de hodgkin, linfoma de Burkitt,mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colo retal, carcinoma pan-creático, carcinoma da célula renal, câncer de mama, carcinoma nasofarín-gico, histiocitose maligna, síndrome para neoplásica/hipercalcemia de malig-nidade, tumores sólidos, adenocarcinomas, carcinoma de células escamo-sas, sarcomas, melanoma maligno, melanoma especificamente metatástico,hemangioma, doença metastática, câncer relacionado a reabsorção óssea,câncer relacionado a dor óssea e os similares.
Doença Relacionada com Imunização.
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou tratamento de pelo menos uma doença relacionada com aimunização em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, po-rém não limitadas a, pelo menos uma de artrite reumatóide, artrite reumatói-de juvenil, artrite reumatóide juvenil sistêmica inicial, artrite psoriática, es-pondilite anquilosante, úlcera gástrica, artropatias soro negativas, osteoartri-te, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, lúpus etitematoso sis-têmico,síndrome antifosfolipídios, iridocistite/uveíte neurite ótica,fibrose pul-monar idiopática, granulomatose sistêmica vasculite de Wegeger, sardoisi-dose, orquite/procedimentos de reversão de vasectomia, doenças alérgicasatópicas, asma, rinite alérgica, eczema, dermatite alérgica de contato, con-juntivite alérgica, pneumonite de hipersensibilidade, transplantes, rejeição detransplante de órgãos. Doença de enxerto versus hospedeiro, síndrome deresposta inflamatória sistêmica, síndrome se septicemia, septicemia gram-positiva, septicemia gram-negativa, septicemia de cultura negativa, septice-mia fúngica, febre neuropênica, urosepticemia, meningococemia, trau-ma/hemorragia, queimaduras, exposição a radiação ionizante, pancreatiteaguda, síndrome do desconforto respiratório adulto, artrite reumatóide, hepa-tite induzida pelo álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoidose, pato-logia de Chron, anemia da célula foice, diabetes, nefrose, doenças atópicas,reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre do feno, rinite perene,conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafilaxe sistêmica, dermatite,anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição de enxertode qualquer órgão ou tecido, rejeição ao transplante de rim, rejeição aotransplante de coração, rejeição ao transplante de fígado, rejeição ao trans-plante de medula óssea (BMT), rejeição a enxerto de pele, rejeição ao trans-plante de cartilagem, rejeição ao transplante de osso, rejeição ao transplantede intestino delgado, rejeição ao transplante de timo fetal, rejeição ao trans-plante de paratireóide, rejeição ao enxerto de qualquer órgão ou tecido, re-jeição ao transplante de enxerto, reações de hipersensibilidade anti-receptor,doença de Graves, doença de Raymond, diabetes tipo B resistente a insuli-na, asma, miastenia gravis, citotixodez mediada por anticorpo, reações dehipersensibilidade do tipo III, Iupus eritematoso sistêmico, síndrome de PO-EMS (polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia nonoclôni-ca, e síndromes de mudanças da pele), polineuropatia, organonegalia, en-docrinopatia, gamopatia nonoclônica, e síndromes de mudanças da pele,síndrome antifosfolipídio, pênfigo, escleroderma, doença mista do tecido co-nectivo, doença idiopática de Addison, diabete melito, hepatite ativa crônica,cirrose biliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia por Ml, hi-persensibilidade do tipo IV, dermatite de contato, pneumoinite de hipersensi-bilidade, rejeição de enxerto, granulomas devido a organismos intracelula-res, sensibilidade ao fármaco, metabólico/idiopático, doença de Wilson, he-macromatose, deficiência de alfa-1-antitripsina, retinopatia diabética, tiroiditede hashimoto, osteoporose, avaliação do eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal, cirose biliar primária, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, do-ença de pulmão neonatal, doença obstrutiva pulmonar crônica (COPD), Iin-fohistocitose hematofagocitica familiar, condições dermatológicas, psoriase,alopécia,síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renalaguda, hemodiálise, uremia, toxidez, pré-eclampsia, terapia OKT3, terapiaanti CD3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia de radiação (por exem-pio, incluindo, porém não limitada a astenia, anemia, caquexia e os simila-res) intoxicação crônica por salicilato, e os similares. Vide, por exemplo, oMerck Manual, 12th-17th Editions1 Merck & Company, Rahway, NJ (1972,1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al.,eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000),cada um inteiramente incorporado por referência.
Doença Cardiovascular
Relacionada com Imunização.
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou tratamento de pelo menos uma doença cardiovascular emuma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitadasa, síndrome de "stun" cardíaco, infarto do miocárdio, insuficiência cardíacacongestiva, acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral isquêmi-co, hemorragia, arteriosclerose, aterosclerose, restenose, doença aterioscle-rótica diabética, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular,síncope, choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, corpulmonale, hipertensão pulmonar primária, arritmias cardíacas, batimentosatríacos etópicos, palpitação atrial, fibrilação atrial (contínua ou de paroxis-mo), síndrome pós perfusão, resposta a inflamação de desvio cardiopulmo-nar, taquicardia atrial caótica ou multi-focal, taquicardia QSR regular estreita,arritmias específicas, fibrilação ventricular, arritmias de novelo His, bloqueioatriovantricular, bloqueio do ramo do novelo, distúrbios miocárdicos isquêmi-cos, doença da artéria coronária, angina pectoris, infarto do miocárdio, car-diomiopatia, cardiomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva,doenças das válvulas do coração, endocardite, doença do pericárdio, tumo-res cardíacos, aneurismas da aorta e periféricos, disecação da aorta, infla-mação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, distúrbiosvasculares periféricos, distúrbios de oclusão arterial, doença ateroscleróticaperiférica, thromboangitis obliterans, distúrbios arteriais periféricos funcio-nais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromegalgia, doençasvenosas, trombose venosa, veias varicosas, fistula arterovenosa, linfoderma,lipidemia, angina instável, lesão de reperfusão, síndrome pós bomba, lesãode isquemia de reperfusão, e os similares. Esse método pode opcionalmentecompreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composiçãoou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo antiMCP-1 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente que esteja necessi-tando de tal modulação, tratamento ou terapia.
Doença Neurológica.
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou tratamento de pelo menos uma doença neurológica em umacélula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitadas apelo menos uma de: doenças neuro degenerativas, esclerose múltipla, dorde cabeça enxaqueca, complexo de demência de AIDS, doenças diemilinan-tes, tais como esclerose múltipla e mielite transversa aguda, distúrbios extrapiramidais e do cerebelo tais como lesões do sistema córtico espinhal, dis-túrbios dos gânglios basais ou distúrbios do cerebelo, distúrbios de movi-mento hiper cinético tais como Corea de Huntington e corea senil; distúrbiosdo movimento induzidos por fármacos, tais como aqueles induzidos por fár-macos que bloqueiam os receptores de dopamina do SNC, distúrbios demovimento hiper cinético, tais como a mal-de-Parkinson; Paralisia progressi-va supra núcleo, lesões estruturais do cerebelo, degeneração espinho cere-bélica, tal como ataxia espinhal, ataxia de Friederich, degenerações corticaisdo cerebelo, degenerações múltiplas de sistema (Mencel, Dejerine-Thomas,Shi-Drager, e Machado-Joseph); distúrbios sistêmicos (doença de Refsuns,abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia e distúrbios do multi sistema mito-condrial), distúrbios do núcleo "demylinating", tais como esclerose múltipla,mielite transversa aguda; e distúrbios de unidade motora tais como atrofiasmusculares (degeneração celular anterior ao nascimento, tais como esclero-se lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscularespinhal juvenil); doença de Alzheimer, Dindrome de Down na meia idade;doença difusa do corpo de Lewy; Demência senil do tipo do corpo de Lewy;síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoolismo crônico; doença de Creutzfeldt-Jakob; panencefalite esclerosante Sub aguda; doença de Hallerrorden-Spatz;e Demência pugilística, e os similares. Esse método pode opcionalmentecompreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composiçãoou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo antiMCP-1 ou uma parte específica ou variante a uma célula, tecido, órgão, a-nimal ou paciente que esteja necessitando de tal modulação, tratamento outerapia. Vide, por exemplo, o Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company,Rahway, NJ (1992).
Condições Fibróticas
Além das condições e doenças acima descritas, a presente in-venção também proporciona um método para a modulação ou o tratamentode condições fibróticas de várias etiologias tais como fibrose do fígado (in-cluindo, porém não limitada a cirrose induzida pelo álcool, cirrose de induçãovirótica, he.patite induzida, por auto imunização), fibrose do pulmão (incluindo,porém não limitada a escleroderma, fibrose pulmonar idiopática); fibrose dorim (incluindo, porém não limitada a escleroderma, nefrite diabética, nefriteglomerular, nefrite de lupus); fibrose dérmica (incluindo, porém não limitadaa escleroderma, formação de cicatriz hipertrófica ou quelóide, queimaduras);mielofibrose; Neurofibromatose; fibroma, fibrose intestinal; e adesões fibróti-cas resultantes de procedimentos cirúrgicos.
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma lesão, trauma ou lesão detecido ou condição crônica resultante de ou relacionada aos mesmos, emuma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitandoa, pelo menos um de: lesão corporal ou um trauma associado com cirurgiaincluindo cirurgia torácica, abdominal, do crânio ou oral; ou na qual a lesão éselecionada a partir do grupo que consiste em lesões assépticas, lesões decontusão, lesões de incisão, lesões laceradas, lesões não penetrantes, le-sões abertas, lesões penetrantes, lesões perfuradas, lesões de punção, Ie-sões sépticas, lesões de infarto ou subcutâneas; ou em que a lesão é sele-cionada a partir do grupo que consiste em ulceras isquêmicas, escaras depressão, fistulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e lesões de localdoador; ou nas quais a lesão é uma lesão aftosa, uma lesão traumática ouuma lesão associada ao herpes. As lesões dos locais doadores são lesõesque ocorrem, por exemplo, em conexão com a remoção de tecido duro deuma parte do corpo para outra parte do corpo como por exemplo, em cone-xão com transplantes. As lesões resultantes a partir de tais operações sãomuito dolorosas e uma cicatrização melhorada é por esse motivo muito vali-osa. A fibrose de lesão também é tratável com uma terapia de anticorpo antiMCP-1 na medida em que as primeiras células que invadem a área da lesãosão os neutrófilos seguidos pelos monócitos que são ativados pelos macró-fagos. Os macrófagos são considerados como sendo essenciais para a cica-trização eficaz da lesão em que eles também são responsáveis pela fagoci-tose de organismos patogênicos e uma limpeza dos restos de tecido. Alémdo mais, eles liberam numerosos fatores envolvidos em eventos subseqüen-tes do processo de cicatrização. Os macrófagos atraem os fibroblastos queiniciam a produção de colágeno. Quase todos os processos de reparo detecido incluem a formação inicial de tecido conectivo, um estímulo desseprocesso e dos processos subseqüentes melhora a cicatrização do tecido,no entanto a produção exagerada de tecido conectivo e de colágeno podelevar a um tecido fibrótico caracterizado como não elástico e hipóxico. Osanticorpos anti MCP-1 da invenção podem ser usados em métodos para amodulação, tratamento ou prevenção de tais seqüelas da cicatrização delesões.
Os presentes anticorpos da presente invenção também podemser usados em métodos para a modulação ou o tratamento de pelo menosum sintoma de rejeição crônica de um órgão, tecido ou célula transplanta-dos, tal como um transplante cardíaco.
Outros Usos Terapêuticos de Anticorpos Anti MCP-1.
A presente invenção também proporciona um método para amodulação ou o tratamento de pelo menos uma doença infecciosa em umacélula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo porém não limitando a,pelo menos uma: infecção bacteriana aguda ou crônica, processos infeccio-sos ou parasíticos agudos ou crônicos, incluindo as infecções bacterianas,viróticas ou fúngicas, infecção HlV/neuropatia HIV, meningite, hepatite (A, Bou C ou similares) artrite séptica, peritonite, pneumonia, epiglotite, e. coli0157:h7, síndrome hemolítica urêmica/purpura trombolitica trombocitopeni-ca, malária, febre dengue hemorrágica, leishimaniose, lepra, síndrome dochoque tóxico, miosite estreptocócica, gangrena gasosa, micobacterium tu-berculosis, micobacterium avium intracelulare, pneumonia pneumocistis ca-rinii, doença inflamatória da pélvis, orquite/epididimite, legionela, doença delima, influenza a, vírus de epstein-barr, síndrome hemafagocítica vital-associada, encefalite vital/meningite asséptica, e as similares.
Qualquer método da presente invenção pode compreender aadministração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composiçãofarmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti MCP-1 a umacélula, tecido, órgão, animal ou paciente que esteja necessitando de tal mo-dulação, tratamento ou terapia. Esse método também pode opcionalmenteser, pelo menos um selecionado a partir de pelo menos um antagonista deTNF (como por exemplo, porém não limitado a um anticorpo ou fragmentoTNF, um receptor ou fragmento TNF solúvel, uma proteína de fusão domesmo, ou um antagonista TNF de molécula pequena), um anti-reumático(como por exemplo, metotrexato, auranofin, aurotioglucose, azatioprina, eta-nercept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, Ieflunomi-da, sulfasalzina), um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco antiin-flamatório não esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedati-vo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano(como por exemplo, aminoglicosídio, um antifúngico, um anti parasítíco, umantiviral, a carbapenemo, cefalosporina, uma fluorquinolona, um macrolidio,uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outros antimicrobianos),um antipsoriátíco, um corticosteróide (dexametasona), um esteróide anabóli-co, um agente relacionado com diabetes, a mineral, a nutritivo, um agente detiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado com cálcio, um antidiarréico,um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um antícoagu-lante, uma eritropoieitina (como por exemplo epoetina alfa), um filgrastim(como por exemplo G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leuci-na), uma imunização, uma imunoglobulina (rituximab), um supressor de imu-nização (como por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hor-mônio de crescimento, um antagonista de hormônio, um antagonista dehormônio de reprodução (flutamida, nilutamida, um modulador da liberaçãode hormônio (leuprolida, goserelina), um fármaco de reposição hormonal, ummodulador do receptor de estrogênio (tamoxifeno), um retinóide (tretinoína),um inibidor da topoisomerase (eposido, irinotecano), uma cicocina (doxoru-bicina), um midriátíco, um cicloplégico, um agente de alquilação (carboplati-na), uma mostarda de nitrogênio (melfalen, clorabucil), uma uréia nitrosa(carmustina, estramustina), um antimetabólito (metrotexato, citarabi-na.fluoruracil), um inibidor mitótico (viscristina, taxol), um radio farmacêutico,um antidepressivo, um agente antimaníaco, um anti psicótico, um ansiolítico(lodo 131-tositumomab), um rádio sensibilizados (misonidazola, tirapazami-na), um antidepressivo, um agente anti maníaco, um anti psicótico, um an-siolítico, um hipnótico, um simpático mimético, um estimulante, donapezil,tacrina, uma medicação para asma, um beta agonista, um esteróide inalado,um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrinaou análogo, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina (interferon alfa-2, IL2)ou um antagonista de citocina (inflixamab). As dosagens adequadas sãobem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Wells et al., eds., Pharmaco-therapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000);PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Editi-on, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada uma das quais des-sas referências são inteiramente incorporadas aqui, neste pedido de patente,por referência.As combinações específicas para o tratamento de doença neo-plásica compreendem a co-administração ou uma terapia de combinaçãoatravés da administração antes, concorrentemente, e/ou depois de um agen-te antineoplásico, tal como um agente de alquilação, uma amostra de nitro-gênio, uma uréia nitrosa, um antibiótico, um anti metabólito, um agonista ouantagonista hormonal, um modulador de imunização e os similares, Para usono melanoma metatástico e outras doenças neoplásicas, uma combinaçãode preferência é a de co-administrar o anticorpo com dacarbazina, interferonalfa, interleucina-1, temozolamida, cisplatina, vimblastina, Mesilato de Imati-nib, carnustina, paclitaxel e os similares. Para o melanoma metatástico adacarbazina é a de preferência.
11. Dosaaens e Métodos de Administração.
Um método da presente invenção pode compreender um méto-do para o tratamento de um distúrbio mediado por MCP-1, compreendendo aadministração de uma composição ou composição farmacêutica que com-preenda, pelo menos um anticorpo anti MCP-1 a uma célula, tecido, órgãoanimal ou paciente que esteja necessitando de tal modulação, tratamento outerapia. Esse método pode opcionalmente ainda compreender a co-administração ou uma terapia de combinação para o tratamento dessas do-enças ou distúrbios, em que a administração do referido pelo menos um an-ticorpo anti MCP-1, parte especificada ou variante do mesmo, compreendetambém a administração antes, ao mesmo tempo, e/ou depois de pelo me-nos uma selecionada a partir de um fármaco renal, um fármaco dermatológi-co, um fármaco antiangiogênico, um fármaco antiinfecção, um fármaco parao sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central(CSN), um fármaco para o sistema nervoso autônomo (ANS)1 um fármacopara o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal (Gl), umfármaco hormonal, um fármaco para o equilíbrio fluido ou eletrolítico, umfármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco de imunomodulação,um fármaco oftálmico ou nasal, um fármaco tópico um fármaco nutricional ousimilares, e pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, porém nãolimitado a um anticorpo TNF ou fragmento, um receptor ou fragmento TFNsolúvel, uma proteína de fusão do mesmo, ou um antagonista TFN de molé-cula pequena), um antireumático (como por exemplo, metotrexato, auranofin,aurotioglucose, azatioprina, etanercept, tiomalato de sódio de ouro, sulfatode hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), um relaxante muscular, umnarcótico, um fármaco antiinflamatório não esteróide (NSAID), um analgési-co, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuro-muscular, um antimicrobiano (como por exemplo, aminoglicosídio, um anti-fúngico, um antiparasítico, um antiviral, a carbapenemo, cefalosporina, umaflúorquinolona, um macrolidio, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraci-clina, outros antimicrobianos), um antipsoriático, um corticosteróide, um es-teróide anabólico, um agente relacionado com diabetes, a mineral, a nutriti-vo, um agente de tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado com cál-cio, um antidiarréico, um anti-tussígeno, um antiemético, um antiulcera, umlaxativo, um antícoagulante, uma eritropoieitina (como por exemplo epoetinaalfa), um filgrastim (como por exemplo G-CSF, Neupogen), um sargramostim(GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobulina, um supressor deimunização (como por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), umhormônio de crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modula-dor do receptor de estrogênio, um midriátíco, um cicloplégico, um agente dealquilação, um antimetabólito (metrotexato, citarabina, fluoruracila), um inibi-dor mitótico, um radio farmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaní-aco, um antipsicótico, um ansiolítico (lodo 131-tositumomab), um radio sen-sibilizados (misonidazola, tirapazamina), um anti depressivo, um agente an-timaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpático mi-mético, um estimulante, donapezil, tacrina, uma medicação para asma, umbeta-agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metil-xantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, dornase-alfa (Pulmozy-me), uma citocina ou um antagonista de citocina. Esses fármacos são bem-conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e admi-nistração para cada um dos apresentados aqui, neste pedido de patente (vi-de, por exemplo Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, SpringhouseCorp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed.,Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, lnc, Upper Saddle River1 NJ; Pharm-cotherapy Handbook1 Wells et al., ed., Appleton & Lange1 Stamford, CT1 ca-da um inteiramente incorporado aqui, neste pedido de patente, por referên-cia).
Tipicamente o tratamento de condições patológicas é efetuadoatravés da administração de uma quantidade eficaz ou dosagem de pelomenos uma composição de um anticorpo anti MCP-1 que total ou em media,uma faixa a partir de pelo menos cerca de 0,01 até 500 miligramas de pelomenos um anticorpo anti MCP-1 por quilograma do paciente por dose, e depreferência a partir de pelo menos cerca de 0,1 até ν 100 miligramas de an-ticorpo/quilograma do paciente por administração única ou múltipla, depen-dendo da atividade específica do conteúdo da composição. Alternativamen-te, a concentração eficaz no soro pode compreender de 0,1 até 5000 μg/mlde concentração no soro por administração única ou múltipla. As dosagensadequadas são conhecidas dos médicos e irão por certo depender do estadoespecífico da doença, atividade específica da composição que está sendoadministrada, e do paciente específico que está sendo submetido a trata-mento. Em alguns casos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada,pode ser necessário prover uma administração repetida, isto é, administra-ções individuais repetidas de uma dose específica monitorada ou medida,quando as administrações individuais são repetidas até que a dosagem diá-ria ou o efeito desejado seja alcançado.
As doses de preferência podem incluir opcionalmente, 0.1, 0.2,0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99 e/ou 100 a 500 mg/kg/administração, ou qualquer faixa, valor oufração dos mesmos, ou até alcançar uma concentração no soro de 0.1, 0.5,0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5,5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11,11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5., 5.9, 6.0,6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5,11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9,17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100,200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500,4000, 4500, e/ou 5000 μς/ιηΙ de concentração no soro por administraçãoúnica ou múltipla, ou qualquer faixa, valor ou fração dos mesmos.
Alternativamente, a dosagem administrada pode variar depen-dendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicasdo agente específico, e o seu modo e via de administração; idade, saúde epeso do recebedor; natureza e grau dos sintomas, tipo de tratamento con-corrente, freqüência do tratamento e do efeito desejado. Usualmente umadosagem do ingrediente ativo pode ser de cerca de 0,1 até 100 miligramaspor quilograma de peso corporal. Ordinariamente 0,1 até 50, de preferênciade 0,1 até 10 miligramas por quilograma por administração ou em forma deliberação contínua são eficazes para serem obtidos os resultados desejados.
Como um exemplo não limitativo, o tratamento de seres huma-nos ou de animais pode ser provido como uma dosagem de uma vez ou pe-riódica de pelo menos um anticorpo da presente invenção de 0,1 até 100mg/kg, tal como 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60,70, 80, 90 ou 100 mg/kg por dia, em pelo menos um do dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente ou adi-cionalmente, pelo menos uma da semana de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,ou 52, ou alternativamente ou adicionalmente, pelo menos um de 1, 2, 3, 4,5, 6„ 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 anos, ou qualquercombinação dos mesmos, usando doses únicas, por infusão ou repetidas.
As formas de dosagem (composição) adequadas para a admi-nistração interna contém em geral a partir de cerca de 0,001 miligrama atécerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente.Nessas composições farmacêuticas o ingrediente ativo irá estar presenteordinariamente em uma quantidade de cerca de 0,5 a 99,99% em peso combase no peso total da composição.
Para a administração parenteral, o anticorpo pode ser formuladocomo uma solução, suspensão, emulsão, partícula, pó, ou pó Iiofilizado emassociação, ou provido separadamente com um veículo parenteral farma-ceuticamente aceitável. Os exemplos de tais veículos são a água, soluçãosalina, solução de Ringer, solução de dextrose e de 1 a 10% de albumina desoro humano. Os Iipossomos e veículos não aquosos tais como os óleosfixados também podem ser usados. O veículo ou o pó Iiofilizado pode conteraditivos que mantenham a capacidade isotônica (como por exemplo, cloretode sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conser-vantes). A formulação é esterilizada através de técnicas conhecidas ou ade-quadas. Os veículos farmacêuticos adequados estão descritos na ediçãomais recente do Remington1S Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto dereferência padrão neste campo.
Administração Alternativa. Muitos dos modos conhecidos e de-senvolvidos que podem ser usados de acordo com a presente invenção paraa administração de quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menosum anticorpo anti MCP-1 de acordo com a presente invenção. Embora aadministração pulmonar seja usada na descrição que se segue, outros mo-dos de administração podem ser usados de acordo com a presente invençãocom resultados adequados. Os anticorpos MCP-Vda presente invenção po-dem ser supridos em um veículo, tal como uma solução, emulsão, colóide oususpensão, ou como um pó seco, com a utilização de uma variedade de dis-positivos e métodos adequados para a administração por inalação ou outrosmodos descritos aqui, neste pedido de patente dentro da, ou conhecidos natécnica.
Formulação e Administração Parenteral. As formulações para aadministração parenteral podem conter como excipientes comuns água ousolução salina, polialquileno glicóis tais como polietileno glicol, óleos de ori-gem vegetal, naftalenos hidrogenados e os similares. As suspensões aquo-sas ou oleosas para injeção podem ser preparadas através da utilização deum emulsificante apropriado ou humidificador e um agente de suspensão, deacordo com métodos conhecidos. Os agentes para injeção podem ser umagente de diluição não tóxico, não administrável por via oral, tal como umasolução aquosa ou uma solução ou suspensão injetável estéril em um sol-vente. Como o veículo que pode ser usado ou solvente são permitidos a á-gua, solução de Ringer, solução salina isotônica, etc., como um solventecomum, ou solvente de suspensão, pode ser usado óleo não volátil estéril.Para essas finalidades, qualquer tipo de óleo não volátil e de ácido graxopodem ser usado, incluindo óleos graxos ou ácidos graxos naturais ou sinté-ticos ou semi sintéticos; mono-, di, ou tri-glicerídios naturais ou sintéticos ousemi-sintéticos. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui,porém não está limitada a meios convencionais de injeções, um dispositivode injeção de gás pressurizado sem agulha, ou dispositivo perfurador a la-ser, bem como conhecido na técnica ( como por exemplo, porém não limita-dos a materiais e métodos descritos na Patente U. S. 5.851.198 e Patente U.S., N9 5.839.446 inteiramente incorporadas aqui, neste pedido de patente,por referência.
Suprimento Alternativo. A invenção também se refere à adminis-tração de pelo menos um anticorpo anti MCP-1 através de meios parente-rais, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquio,intra abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intra cavitário, intracelial,intracerebelo, intra cerebroventricular, intracólica, intracervical, intra gástrico,intra-hepático, intramiocárdico, intra-ósseo, intrapélvico, intrapericárdico, in-traperitonial, intrapleural, intraprostata, intrapulmonar, intraretal, intrarenal,intra-retina, intraespinhal, intra sinovial, intratorácico, intra-uterino, intra-vesical, intra lesão, bolus, vaginal, retal, bucal sublingual, intranasal outransdérmico. Pelo menos uma composição de anticorpo anti MCP-1 podeser preparada para uso para administração parenteral (subcutânea, intra-muscular ou intravenosa)ou qualquer outra administração especificamentena forma de soluções ou suspensões líquidas; para uso em administraçõesvaginais ou retais especificamente em forma semi-sólida tal como, porémnão limitadas a, cremes e supositórios; para a administração bucal tal como,porém não limitadas na forma de comprimidos ou cápsulas; ou de modo in-tranasal tal como, porém não limitadas, na forma de pós, gotas nasais ouaerossóis ou determinados agentes; ou de forma transdérmica tal como, po-rém não limitadas a um sistema de suprimento de gel, ungüento, loção sus-pensão ou adesivo com aumentadores químicos tais como o sulfóxido dedimetil para tanto modificar a estrutura da pele como para aumentar a con-centração do fármaco no adesivo transdérmico (Junginger, et al. In "DrugPermeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Mareei Dekker,Inc. New York 1994, inteiramente incorporados aqui, neste pedido de paten-te, por referência), ou com agentes oxidantes que permitam a aplicação deformulações que contenham proteínas e peptídios sobre a pele (WO98/53847, ou aplicações de campos elétricos pata a criação de trajetos detransporte transitórios tais como a iontoforese, ou aplicações de ultra somtais como a sonoforese (Patentes U. S. N9S 4,309.989 e 4.767.402 (as publi-cações e as patentes acima sendo inteiramente incorporadas aqui, nestepedido de patente, por referência).
Administração Pulmonar/Nasal. Para a administração pulmonar,de preferência pelo menos uma composição de anticorpo anti MCP-1 é su- _prida em tamanho de partícula eficaz para alcançar as vias aéreas baixas dopulmão e dos sinus. De acordo com a invenção, pelo menos um anticorpoanti MCP-1 pode ser suprido através de qualquer uma de uma variedade dedispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para administraçãode um agente terapêutico por inalação. Esses dispositivos capazes de depo-sitar formulações em forma de aerossol na cavidade ou alvéolos do sinus deum paciente incluem inaladores de dose medida, nebulizadores, geradoresde pó seco, pulverizadores e os similares. Outros dispositivos adequadospara direcionar a administração pulmonar ou nasal de anticorpos são conhe-cidos na técnica. Todos esses dispositivos podem usar formulações ade-quadas para a administração para dispensar o anticorpo em um aerossol.Esses aerossóis podem ser compostos tanto de soluções (ambas as aquo-sas e não aquosas) ou de partículas sólidas. Os inaladores de dose medidatal como o inalador de dose medida Ventolin®, usam tipicamente um gáspropulsor e requerem a atuação durante a inspiração (vide, por exemplo, aWO 94/16970, WO 98/35888). Os inaladores de pó seco tais como o inala-dor Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros® (Dura),dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spi-nhaler® (Fisons), usam a atuação da respiração de um pó misto(US 4668218Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US5458135 lnhale, WO 94/06498 Fisons, inteiramente incorporadas aqui, nestepedido de patente por referência). Nebulizadores tais como AERx® Aradigm,o nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), e o nebulizador Acorn II® (MarquestMedicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), as referências a-cima inteiramente incorporadas aqui, neste pedido de patente, por referênciaproduzem aerossóis a partir de soluções, enquanto que os inaladores dedose medida, inaladores de pó seco, etc., geram aerossóis de pequenaspartículas. Esses exemplos específicos de dispositivos de inalação comerci-almente disponíveis são destinados a serem representativos de dispositivosespecíficos adequados para a prática desta invenção, e não estão destina-dos a limitar o escopo da invenção. De preferência, uma composição com-preendendo pelo menos um anticorpo anti MCP-1 é suprida através de uminalador de pó seco ou de um pulverizador. Existem várias característicasdesejáveis em um dispositivo de inalação para a administração de pelo me-nos um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, o suprimento atravésdo dispositivo de inalação é vantajosamente confiável, reproduzível e acura-do. O dispositivo de inalação pode opcionalmente suprir pequenas partículassecas, como por exemplo de menos do que 10 μιη, de preferência de cercade 1 a 5 μm para uma boa condição de respiração.
Exemplo 1: Geração de anticorpos MCP-1 específicos para exibição de fa-gos como um exemplo não limitativo.
As requerentes mostraram previamente as características tera-pêuticas desejadas de um anticorpo murino anti-humano MCP-1 designadocomo C775 e descrito nos pedidos de patentes co-pendentes dos requeren-tes U.S. Serial Nq N9 11/170453 (SEQ ID NOS: 7 e 8 daquele pedido de pa-tente com relação a regiões variáveis de cadeia pesada e leve, respectiva-mente) e depósitos relacionados. O objetivo do presente esforço foi o de i-dentificar pelo menos um anticorpo humano a partir de HuCAL GOLD®, queneutralize a atividade biológica do quimiocina humana MCP-1 e que exibaatributos similares. Os atributos do anticorpo C775, o assim desejado anti-corpo anti-MCP-1 humano, foram definidos através de critérios de sucessomostrados abaixo:
Critérios de Sucesso para Pelo Menos um Anticorpo Terapêutico:
Se liga a MCP-1 humana em formato de fase sólida;
Especificidade definida como falta de ligação à 100 nM para asproteínas humanas homólogas MCP-2, 3, 4 e a Eotaxina humana 1, 2 e 3;
Inibe a ligação da MCP-1 humana ao seu receptor humano C-CR2 em células Teo valor de IC50 é de menos do que para a referênciaFab C775;
Inibe a quimiotaxia mediada pela MCP-1 humana das células T eo valor de IC50 é de menos do que para a referência Fab C775;
Inibe a atividade mediada pela MCP-1 humana em uma segundaanálise, biológica (como por exemplo a mQbilização de Ca2+ ou a internali-zação do receptor induzida pela CCL-2 como um critério qualitativo sim/não,ou com potência comparável a referência Fab C775 em uma análise quanti-tativa;
Se liga a MCP-2 humana com Kd < 0,5 nM;
Se liga a MCP-1 do macaco cinomolgo com um Kd < 20 nM, e depreferência < 10 nM;
Inibe a MCP-1 humana natural e sintetiza quimicamente a bioati-vidade da MCP-1 humana com potências comparáveis;
Conserva os critérios de 1 a 8 depois do remanejamento da Fabcomo umas IgG com base na forma de comprimento total da IgG do C775como um comparador.Sumário do processo de seleção.
Foram executadas três escolhas diferentes usando HuCALGOLD®, e 17856 clones foram submetidos a triagem resultando em 1104resultados primários, Finalmente 26 Fabs únicos foram identificados se Ii-gando a MCP-1 humana sintética em ELISA, Entre esses, 7 Fabs diferentesforam selecionados com relação a afinidade por maturação, bioatividade,especificidade e ligação a MCP-1 natural de cinomolgo e humana. As afini-dades dos Fabs de origem estavam na faixa de 10 até 400 nM e os valoresde IC50 na análise de ligação por radioligante foram a partir de 10 até 600nM.
Materiais e Métodos.
As enzimas de restrição e de modificação de DNA bem como aspolimerases foram adquiridas da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), New En-gland Biolabs (Beverly, MA, USA), Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)ed MBI Fermentas (Vilnius, Lithuania). IgG de cabra anti-humano F(ab')2fragmento específico POD conjugado foi fornecido por Jacksons (West Gra-ve, PN, USA), IgG de ovelha anti-human, Fd fragmento específico, anticorpopelo The Binding Site (Birmingham, UK) e estreptavidina conjugada a fosfa-tase alcalina (qualidade ZyMAX®) por Zymed Laboratories (San Francisco,CA, USA). Quimiocinas recombinantes humanas, hMCP-1, 2, 3, 4 e hEotaxin1, 2 e 3 (R&D systems)Rç.agents, Ligands and Antibodies: mAb 279, especí-fico para MCP-1 humana (R&D systems); hMCP-1 sintética (Bachem); mAblde camundongo anti hCCR2 biotina (R&D systems); gama globulina humana(Jackson Immuno Research); gama globulin de camundongo (Jackson Im-muno Research); biotina de controle isotipo mAb mlgG2b (R&D systems);estreptavidina-PE (BD Pharmingen); Versene (Invitrogen; PBS (Invitrogen).FCS (PAN); placas de cavidades com fundo em V (Greiner); e placas de ca-vidades com o fundo em U (Nunc).
Preparação do polipeptídio MCP-1 e análogos.
Síntese de peptídio em fase sólida na forma de etapas e purifi-cação por afinidade para prover MCP-1 humana, isolada de comprimentototal, madura (76 aminoácidos) e corretamente dobrada e opcionalmentemodificada e variantes com atividade biológica como descritas no pedido depatente dos requerentes U. S. Série de Ne 60/682620 e em Kruszynski et al.2006, J Peptide Sei. 12: 25-32 As variantes destinadas a exibir a topologiade superfície original e estrutura de esqueleto de peptídio, incluem A40S,V411, e F43Y. A síntese química também proporcionou um método para abiotinilação específica para sítio da MCP-1 humana usando o grupo epsilon-amino da Iisina não envolvido na ligação ao receptor ou atividade de superfí-cie a K69 e K75 é desordenada na estrutura (U. S. Série de Ne 60/682620 eKruszynski et al. 2006, J Peptide Sei. 12: 334 a 360). Um espaçador hidrófilode quatro unidades de etilenóxi (PEG4) foi inserido entre a biotina e o grupoε-amino do resíduo de lisina. O comprimento da cadeia a partir da amida dabiotina até o terminal carbonila é de 19,2 Á. O espaçador foi escolhido paraaumentar a solubilidade e prover comprimento de espaçados suficiente paraa ligação dos conjugados de estreptavidina. A seqüência do MCP-1 e dasvariantes é dada na SEQ ID NO: 1. As variantes foram determinadas paraconservar a capacidade de induzir a mobilização de Ca2+ em células THP-1.A MCP1 de Biotina-Lys69 e biotina-Lys75 foram comparadas lado a lado natriagem, consolidação e determinação de afinidade e não puderam ser ob-servadas diferenças significativas. Usando Biacore1 35 Fabs otimizados fo-ram analisados em MCP-1 Ile41, Lys(biotin-PEG4)69 e MCP-1 Ile41, Lys(biotin-PEG4)75, imobilizadas em chips de estreptavidina em paralelo. Em geral asafinidades medidas em K69 e K75 de MCP-1 foram comparáveis.
Coleção de Fago Fab. A coleção de fagemídos é baseada sobreo conceito HuCAL® (Knappik et al., 2000) e emprega a tecnologia CysDis-play™ para a exibição do Fab da superfície do fago (Lõhning, 2001). A cole-ção codifica aproximadamente 1010 Fabs únicos mostrados em bacteriófa-gos M13 como fusões a uma proteína de revestimento menos, plll. Para aseleção HuCAL GOLD® os anticorpos-fagos foram divididos em três conjun-tos compreendendo genes VH máster diferentes. Além disso a coleção intei-ra foi usada em um conjunto (VH1 a 6). Ingresso de 2 X 1013 HuCAL GOLD®de fagos foram usados em cada seleção, 4 estratégias de seleção diferentesforam aplicadas, incluindo 3 rodadas de seleção no análogo 1 da MCP-1humana (V41I, Ile41) e análogo-2 (F43Y, Tyr43), respectivamente, e duas se-leções alternadas sobre os análogos na ordem de 1 - 2 -1 e 2 -1 - 2.
Seleções em fase sólida. Uma alíquota de 100 μΙ do análogo-1da MCP-1 humana (V41I) ou análogo 2 (F43Y) a 50 ng/ml em PBS1 pH 7,4,foram diretamente revestidos em cavidades Maxisorp® (Nalgen Nunc, Ro-chester, NY) de um dia para o outro à 4°C. As cavidades revestidas foramlavadas e bloqueadas com MPBS a 5% (PBS, 5% de leite em pó de baixagordura). 100 μΙ de fagos HuCAL GOLD® bloqueados por cavidade foramadicionados durante 2 horas em temperatura ambiente. Depois de váriasetapas de lavagem, os fagos ligados foram eluídos por 100 μΙ 20 mM deDTT em 10 mM de Tris/HCI, pH 8,0 incubados em temperatura ambientedurante 10 minutos. O eluado foi usado para infectar TG1 de E.cõli de fasemédia (Stratagene, Amsterdam, Holanda) e os fagemidos foram amplificadoscomo descrito em (Krebs et al., 2001).
Seleção em Semi-solução contra o Análogo 1 (V411) e Análogo 2(F43Y) da MCP-1 Humana, Resultando na Neutralização das Moléculas Fab.
Uma seleção em semi-solução foi realizada pela incubação de dois deriva-dos de MCP-1 humana biotinilados, V41I, K69-PEG-biotina ou V41I, K75-PEG-biotina (SEQ ID NO: 1) com os fagos HuCAL GOLD® em solução se-guida pela captura dos complexos de antígeno dos fagos em tiras de placasde microtitulação Reacti-Bind Neutravidin Coated Polystyrene (PERBIO).Para a seleção tubos de Eppemdorf de 1,5 ml foram bloqueados com Che-miblocker (Chemicon International) 1:1 diluído com PBS O/N á 4°C. No diaseguinte, tiras de placas de microtitulação Reacti-Bind® NeutrAvidin® (Pier-ce, Rockford, IL, USA) (capacidade de ligação: 25 pmols de biotina por cavi-dade; PERBIO) foram enxaguadas com 2 χ 300 ul de PBS, necessários para2 etapas de pré-adsorção para a redução do número de Iigantes de neutra-vidina. 2 χ 1013 de fagos da coleção HuCAL GOLD® em 100 ul de Chemi-blocker (Chemicon) a 50%, 0,05% de Tween 20 (Sigma) foram adicionadospor cavidade e bloqueados durante uma hora em temperatura ambiente comagitação suave. Para a segunda etapa de pré-adsorção da solução de fagosfoi transferida para novas tiras de placas de microtitulação Reacti-Bind Neu-travidin Coated Polystyrene e incubadas durante uma hora em temperaturaambiente com agitação suave. Em seguida os fagos pré-adsorvidos e osantígenos biotinilados (proporção de 3:1 de biotina para antígeno para a bio-tinilação; 200 mM de concentração final) foram adicionados aos tubos deEppendorf pré bloqueados e incubados durante 1 hora em temperatura am-biente em uma roda de rotação. Em paralelo outras tiras de placas de micro-titulação Reacti-Bind Neutravidin Coated Polystyrene foram enxaguadas com2 χ 300 ul de PBS1 bloqueadas com 300 ul de Chemiblocker diluído a 1:1com PBS durante uma hora e lavadas 1 χ com 300 μΙ de PBS. 100 μ/por ca-vidade do complexo de biotina-antígeno-fago foram pipetados dentro de tirasde placas de microtitulação e incubadas durante uma hora em temperaturaambiente com agitação suave. Depois de várias etapas de lavagem, os fa-gos ligados foram eluídos por 100 ul de 10 MM de DTT em 10 mM deTris/HCI, pH 8,0, incubados em temperatura ambiente durante 10 minutos. Oeluado foi usado para infectar TG1 de E.coli de fase média (Stratagene,Amsterdam, Holanda) e os fagemidos foram amplificados como descrito em(Krebsetal., 2001).
Sub Clonagem e Micro Expressão de Fragmentos Fab Selecio-nados. Para facilitar a expansão rápida do Fab solúvel, os insertos codifi-cando os Fabs dos fagos HuCAL GOLD® selecionados foram sub clonadosatravés de Xbal e EcoRI dentro do vetor de expressão pMORPH®X9_PH. Osfragmentos de Fab contem um terminal C FLAG® (Prickett et al., 1989) e umsegundo terminal C marca o 6x His-tag (Chen et al., 1994). Depois da trans-formação do clone isolado TG1-F a expressão e a preparação dos extratosperiplásmicos contendo fragmentos de HuCaI(B)-Fab foram realizados comodescrito anteriormente (Raucehnberger et al., 2003).
A análise de ligação no formato de fase sólida no análogo 1 daMCP-1 humana (V411) foi executada como descrita acima. Depois do blo-queio, os extratos periplásmicos foram adicionados. A detecção dos frag-mentos Fab foi realizada através da incubação com IgG de cabra anti-humano, do anticorpo de fragmento específico F(ab')2.
A triagem no HMCO-1 Vell imobilizado biotinilado foi executadacom a utilização de pacas de 384 cavidades Reacti-Bind® NeutrAvidin® (Pi-erce, Rockford, IL1 USA) revestidas com 20 μΙ de 0,5 μΙ/ml do análogo 1 dahMCP-1 (V41I) ou do análogo 2 (F34Y) diluídos em PBS, pH 7,4, durante 16horas à 4°C. Depois do bloqueio com 1% de BSA em TBS, 0,05% Tween 20(Sigma, St, Louis, MO, USA) durante 1 hora em temperatura ambiente, osextratos periplásmicos foram adicionados. A detecção dos fragmentos Fabfoi realizada através da incubação com IgG de cabra anti-humano, do anti-corpo de fragmento específico F(ab')2.
A triagem em fase de solução com o análogo 1 da hMCP-1(V41I) biotinilado foi executada através do revestimento de placas de 384cavidades Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, USA) com 20 ul de IgG de ove-lha anti-humano, fragmento específico Fdm anticorpo diluído 1:1000 emPBS.m, pH 7,4 durante 16 horas a 4°C. Depois do bloqueio com BSA a 3%em TBS, 0,05% de Tween 20 Sigma, St, Louis, MO, USA) durante 2 horasem temperatura ambiente, os extratos periplásmicos foram adicionados. Emseguida, os fragmentos HuCAL(E)-Fab capturados foram permitidos que seligassem a 0,2 ug/ml do análogo 1 da hMCP-1 (V411) biotinilado em TBS,que foi detectado por incubação com estreptavidina conjugada com fosfata-se alcalina seguida pela adição do substrato fosforescente AttoPhos (RocheDiagnostics, Mannheim, Alemanha). A emissão de fluorescência a 535 nmfoi registrada com uma excitação a 430 nm.
Análises de Bioatividade.
Cultura de células. Todas as células foram cultivadas sob condi-ções padronizadas a 37°C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. Ascélulas expressando a CCR2 foram cultivadas em meio padronizado. Alémdisso, as células THP-1 (células da leucemia monocítica aguda humana)foram cultivadas em RPMI contendo 2 mM de L-glutamina, 1,5 g/l de bicar-bonato de sódio, 4,5 g/l de glicose, 10 mM HEPES e 2,0 mM de piruvirato desódio a 90%; 10% de soro fetal bovino (FBS; Vitacell RPMI 20-2001, ATCCManassas1 VA) a 37°C e 5% de CO2 em uma densidade de 4 a 8 χ 105 célu-las por ml.
Análise de ligação por Radioligante. Análises de competição fo-ram realizadas em placas de filtro Milipore Millipore, Bedford1 MA). 1 χ 106células THP-1 foram incubadas com 125I-MCP-I (1 ng/ml; Perkin Elmer LifeScience, Boston, MA), em conjunto com concentrações diferentes de (rh)MCP-1 recombinante humana (279-MC, R&D Systems, Minneapolis, MN) ouproteínas sintéticas. Todos os reagentes foram diluídos em tampão de liga-ção consistindo em RPMI Médium 1640 (Invitrogen Corp., Grand lsland, NY)e 0,1% BSA. A competição foi deixada continuar durante uma hora em tem-peratura ambiente e as cavidades foram lavadas três vezes com 150 μΙ/porcavidade com tampão de lavagem (tampão de ligação + 1 M NaCI). A ra-dioatividade nos filtros foi contada com a utilização do Wallac Wizard 1470Automatic Gamma Counter (Perkin Elmer Life Sciences Inc., Boston, MA).Asinibições percentuais de ligação do 125I-MCP-I ao CCR2 através das dosesvariadas tanto do MCP-1 recombinante como do sintético foram calculadas.Os valores percentuais de inibição foram em seguida importados para dentrodo programa Graphpad Prism e plotados com a utilização de uma curvasigmóide de resposta a dose com uma inclinação variável e constantes defundo = 0 e topo = 100.
Análise da Mobilização de Cálcio. A análise de mobilização doCa2+ foi realizada em um formato de 96 cavidades com a utilização doFLEXstation® Ca2+ Plus Assay Kit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) se-guindo o protocolo.do fabricante.com relação as células não aderentes e umFLEXstation® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os valores de pico RFUforam importados para dentro do Graphpad Prism para análise.
Análise FACS da Internalização do Receptor CCR2 Induzida pe-la MCP-1. Depois da otimização da concentração dos Iigantes (EC50 daMCP-1 sintética - 100 mg/ml) e do tempo de incubação (depois de 1 hora amaior parte da internalização tinha ocorrido) O IC50 foi determinado atravésda adição das concentrações diferentes de anticorpos. As células cultivadasexpressando o CCR2 foram lavadas com PBS e deslocadas com Versene(Invitrogen) durante cerca de 10 minutos a 37°C. Todas as etapas da centri-fugação das células foram a cerca de 200 Xg. As células foram lavadas duasvezes com tampão FACS (PBS/3% FACS),contadas e conferidas com rela-ção a viabilidade (trypan blue). Placas de 96 cavidades de fundo em V(Greiner) foram enchidas com ~ 2,5 χ 105 células em 100 ul por cavidade ecolocadas no gelo. Em uma placa de 96 cavidades de fundo em U (Nunc) osanticorpos foram diluídos em meio de cultura de células (MEME) para darcerca de 200 ug/ml para baixo até 0,01 ug/ml em amostras em triplicata. Asconcentrações diferentes dos anticorpos foram pré incubadas com uma con-centração final de 100 ng/ml de MCP-1 sintética (Bachem) durante 10 minu-tos em temperatura ambiente. As células foram ressuspensas com 100 μΙ damistura pré-incubada de MCP-1/anticorpos e incubadas durante uma hora a37°C em um incubador para a internalização do receptor. Depois da interna-lização as células foram lavadas com 180 μΙ de tampão FACS frio e as pla-cas tiveram que ser mantidas sobre gelo durante todas as etapas subse-qüentes para impedir internalização adicional. Anti-hCCR2mAb de camun-dongo biotinilado (R&D Systems) foi diluído em 1:10 em tampão FACS. Co-mo controle lgG2b Isotype Biotin mAb de camundongo (R&D Systems) tam-bém foi diluída em 1:10 com tampão FACS. 10 ug/ml da concentração finalde uma mistura de 1:1 de gama-globulina de humana e de camundongo(Jackson Immuno Research) foram adicionados a ambos o anti-CCR2 emAb de controle para bloquear o receptor Fe. As células foram ressuspen-sas em 50 μΙ de uma mistura de anti-CCR2/gama-globulina (ou n=mistura delgG2b de controle/gama globulina) e incubados durante uma hora sobre ge-lo. As células foram lavadas duas vezes com 180 ul de tampão FACS, re-suspensas em 50 ul de Estreptavidina PE (BD Pharmigen) diluídos em 1:400e incubados durante uma hora à 4°C sobre gelo no escuro. As células foramlavadas duas vezes com 180 ul de tampão FACS, re-suspensas em 100 ulde PFA/PBS e armazenadas de um dia para o outro a 4°C para fixação (al-ternativamente a medição direta sem a fixação PFA é possível). Para a me-dição FACS as células foram re-suspensas com 200 ul de tampão FACS epelo menos 5000 células foram cada uma contadas.
Análises de Afinidade.
Método de titulação de equilíbrio (SET) para a Determinação deKd e Estudos de Reatividade Cruzada Usando BioVeris. A determinação deafinidade em solução foi basicamente executada como descrita na literatura(Friguet et al., 1985). Com a finalidade de melhorar a sensibilidade e a preci-são do método DSET1 ela foi transferida do clássico ELISA para a tecnologia
BioVeris com base em ECL(Haenel et al., 2005, aceito para publicação em Analytical Biochemistry).1 mg/ml de (fab)2 de cabra anti-humano ou IgG de cabra anti camundongo,anticorpos de fragmento específico Fc (Jackson Immuno Research) forammarcados com w BV-tag® NHS-Ester (Bioveris Europe, Witney, Oxfordshire,UK), de acordo com as instruções do fabricante. Os experimentos foram e-xecutados em placas de microtitulação de propileno e PBS, pH 7,4 com0,5% de BSA e 0,02% de Tween 20 como o tampão de análise. O antígenonão marcado foi diluído em 4n séries. Para a MCP-1 humana e cyno, umafaixa de concentração de 10 pM até 40 nM e para os controles de reativida-de cruzada (Eotaxina e MCP-2) foi escolhida uma faixa de concentração de40 mM até 160 pM. As cavidades sem o antígeno foram usadas para a de-terminação dos valores Smax. Depois da adição de -100 pM de Fab oi IgG(concentração final em 75 μΙ de volume final), a mistura foi incubada duranteduas horas em temperatura ambiente. Em seguida uma mistura de 25 μΙ deDynabeads (0,4 mg/ml M-200 Estreptavidina, DYNAL, Hamburgo) revestidacom 0,25 μg/ml de MCP-1 biotininada e anticorpo de detecção marcado commarcadores BV em uma diluição final de 1:4000 para Fab anti-humano ou de1:2000 para a IgG anticamundongo foi adicionadas por cavidade. Depois daincubação durante 30 minutos em um agitador Eppendorf (700 rpm) emtemperatura ambiente, os sinais de luminescência eletroquímica foram de-tectados com a utilização de um M-384 SÉRIES® Workstation (Bioveris Eu-rope). Os dados foram avaliados com o software Origin 5.0 (MicrocaI) apli-cando modelos de ajustamento customizados (para Fab: Haenel et al., acei-to para publicação em Analytical Chemistry, para IgG: de acordo com Piheleret al., 1997).
Determinação de K0 em Biacore sobre Antígeno Revestido Dire-tamente. As constantes cinéticas kon e koff foram determinadas com as dilui-ções em série dos Fabs respectivos se ligando a MCP-1 imobilizada de for-ma covalente com a utilização do instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Upp-sala, Suécia). Para a imobilização covalente do antígeno foi usada a químicade acoplamento de amina padrão EDC-NHS. As medições cinéticas foramfeitas em PBS (135 mM NaCI1 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1,76 mMKH2PO4 pH 7,4) em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/minuto usando uma faixa deconcentração de Fab a partir de 1,5 até 500 nM. O tempo de injeção paracada concentração foi de 1 minuto, seguido por 3 minutos de fase de disso-ciação. Para a regeneração foram usados 5 μΙ de 10 MM HCI. Todos ossensorgramas foram ajustados com a utilização do software de avaliaçãoBIA 3.1 (Biacore). A determinação K0 em Biacore sobre Biotin-K90 MCP-1humano e MCP-2 cyno. A Biotin-K90 MCP-1 humana e MCP-2 cyno biotini-lada foram revestidas na superfície de um chip de estreptavidina e a MCP-2cyno foi revestida diretamente dobre chips CM5. A ligação dos Fabs foi tes-tada com a utilização dos métodos padronizados.
Determinação de K0 em Biacore no Modo de Captura de Anti-corpo. Os Fabs foram capturados à 500 nM com anti-Fab (s.3.15) sobre umchip CM5 (taxa de fluxo 5 μΙ/minuto), uma solução de cada análogo (MCP-1,2, 3, 4 e Eotaxina, Eotaxina-2 e -3) foi injetada. Todas as citocinas estavamisentas de veículo e usadas em uma faixa de concentração a partir de 15 até500 nM (para os Fab de origem antes da otimização) em uma análise para adeterminação de afinidade. Os sensorgramas foram analisados com a utili-zação do software de avaliação ΒΙΑ. A determinação da afinidade em Biaco-re com relação a MCP-1 no modo de captura de anticorpo não foi possívelcom relação aos Iigantes otimizados devido a que os limites de detecção doBiacore foram alcançados.
Para a análise de especificidade dos Fabs foi usada a ressonân-cia de superfície de plasmônio (Biacore 3000, Uppsala, Suécia) usando aanálise de captura. Os Fabs foram capturados e as diversas proteínas(MCP-2, 3, 4, e a Eotaxina 1, 2, e 3) foram usados como os analitos. Oschips CM5 (Biacore, Suécia) foram revestidos com de 6500 a 8000 RU deanti (fab)2 (Dianovam Affipure, fragmento F(ab)2 de IgG cabra anti-humano;fragmento específico F(ab)2; 10 mM de tampão de acetato, pH 4,5) em todasas 4 células de fluxo, com a utilização de química de acoplamento de aminapadrão EDC-NHS. As células de fluxo 2 - 4 foram capturadas com Fabs es-pecíficos anti-MCP-1(20 μΙ de 500 nM Fab em uma taxa de fluxo de10 μΙ/ml,resultou em uma densidade de captura de capture de 300 - 400RU). Depoisda captura dos Fabs as quimiocinas foram injetadas (20 μΙ, taxa de fluxo 20μl/min, PBS pH 7,4) em uma concentração de 100 nM. As quimiocinas foramarmazenadas em pequenas alíquotas e somente o material descongelado defresco com um máximo de um ciclo de congelamento descongelamento foiusado para as medições. Para evitar que uma combinação de fora de quali-dade provocada pela fora de qualidade da MCP-1, a interação específica doFab e a interação anti-Fab/Fab, foi injetado um tampão, para determinar adissociação da interação anti-Fab/Fab. O sensorgrama conseguido pelotampão foi subtraído do específico. As unidades de resposta foram normali-zadas com relação a quantidade de captura de anticorpo sobre a superfície.
Ligação a MCP-1 natural no Modo de Captura de Anticorpo. Ométodo foi usado como descrito acima. A MCP-1 natural foi purificada a par-tir do sobrenadante PANC1 e usada para a análise de ligação. A ligação àMCP-1 natural no modo de captura de Fab foi bem acima do limite de detec-ção, no entanto, uma medição de afinidade verdadeira não foi possível devi-do as impurezas no extrato obscurecendo a concentração correta da MCP-1natural.
Conversão para IgG.
Com a finalidade de expressar a IgG de comprimento total,fragmentos de domínio variável (VH) e de cadeia leve (VL) foram subclona-dos a partir dos vetores de expressão Fab em vetores pMorph_hlg apropria-dos para a IgGI humana, lgG4 humana, IgGI quimérica huma-na/camundongo e lgG2. As enzimas de restrição EcoRI, MfeI, Blp\ foramusadas para a sub clonagem do fragmento do domínio VH em pMor-ph_hlgG1.1, pMorph_hlgG4.1, pMorph_mlgG1.1 ou pMorph_mlgG2a.1, eEcoRV, SsAA/1 para a sub clonagem do fragmento do domínio VL dentro dosvetores pMorph_hlgK_1, pMorph_hlgÂ_1, pMorph_mlgK_1 ou pMor-ph_mlgÂ_1, respectivamente. Os constructos de IgG resultantes foram ex-pressos em CNTO.
Resultados
A seleção em fase sólida foi realizada em hMCP-1 (411) ehMCP-1 (43Y) diretamente revestidas em placas Maxisorp. Quatro estraté-gias diferentes de seleção foram aplicadas, contendo três rodadas de sele-ção em cada uma. Depois da subclonagem dentro do vetor de expressãopMORPHx9_Fab_FH a triagem em fase sólida foi executada sobre a hMCP-1(411) diretamente revestida e sobre a e hMCP-1 biotinilada. No total foramanalisados 8832 clones em uma triagem primária e 983 acertos primáriosforam obtidos. Finalmente 5 Fabs únicos foram identificados, porém todos os5 Fabs não neutralizaram a MCP-1 em análises celulares, indicando que orevestimento direto para Maxisorp pode prejudicar a conformação ou pelomenos a acessibilidade dos epítopos neutralizantes.
Uma seleção em semi-solução foi realizada incubando o análogo1 da MCP-1 humana (V41I) e o análogo 2 (F43Y) com os fagos HuCALGOLD® em solução seguida pela captura dos complexos antígeno fago co-mo descrito. Duas estratégias principais de seleção diferentes foram aplica-das incluindo três rodadas de seleção sobre o análogo 1 e análogo 2 (F34Y)da MCP-1 humana (V41I) biotinilada respectivamente (nenhuma seleçãoalternada). No total 9024 clones foram analisados na triagem primária e 121acertos primários foram obtidos, revelando finalmente 18 Iigantes únicos.Uma re-triagem de 192 clones com base em Luminex para seleção no aná-logo 1 da MCP-1 humana (V411) levou a 9 acertos primários adicionais e 3ligantes únicos adicionais, mostrando que a triagem com Luminex é um mé-todo de triagem alternativa adequada para a triagem de captura. No total 21Iigantes únicos foram identificados a partir as seleção em semi-solução e 14desses Iigantes mostraram atividade de neutralização. Todos os Fabs neu-tralizantes a partir de HuCAL GOLD® foram derivados a partir dessa seleção.
Caracterização dos Fabs HuCAL GOLD® Os Fabs únicos foramexpressos e purificados para caracterização posterior. A afinidade de ligaçãoda hMCP-1 foi determinada por BIAcore e os Fabs foram caracterizados nasanalises que se seguem: 1) inibição de ligação de 125l-CCL-2 para célulasThp-1 e 2) inibição da mobilização de Ca2+ induzida por hMCP-1 emcélulas Thp-1. Os Fabs que demonstraram atividade de neutralização emanálises baseadas em células foram ainda testados com relação a 1) ligaçãoa hMCP-1 de cynomolgus sintética; 2) ligação a família da HMCP-2 relacio-nada com a ligação a quimiocinas humanas com relação a especificidade deligação (isto é, MCP-2, 3, 4 e Eotaxina 1,2, 3); e 3) ligação a hMCP-2 huma-na natural para assegurar que os Fabs selecionados com a utilização dopeptídio sintético hMCP-2, reconhecem a hMCP-2 natural. Sete Fabs com aspropriedades mais ótimas foram escolhidos para a maturação por afinidadeadicional.
As propriedades dos Fabs selecionados com relação a matura-ção por afinidade foram resumidas na Tabela 2. Os sete Fabs que foramselecionados para a maturação por afinidade foram designados para 3 gru-pos para a clonagem da coleção e a seleção. A otimização de L-CDR3 e H-CDR2 foi executada em paralelo. A otimização em paralelo das cadeias levee pesada variáveis criou o potencial para a combinação de cadeia leve epesada através da clonagem cruzada para a geração de outros anticorposainda mais aperfeiçoados.
Tabela 2. Um resumo dos Fab candidatos selecionados para maturação porafinidade. (1ã parte)
<table>table see original document page 105</column></row><table>Tabela 2. (2§ parte)
<table>table see original document page 106</column></row><table>
Exemplo 2: Avaliação de alta afinidade, anticorpos específicos para MCP-1 apartir de FABS.
Como observado, a seleção de candidatos com relação a matu-ração por afinidade foi executada sobre candidatos no formato de Fab livre.Os critérios de seleção foram: atividade em análise de radioligante, atividadeem análise de mobilização de Ca2+, afinidade com relação a MCOpI huma-na medida por Biacore, especificidade com relação a MCP-1 humana, afini-dade a MCP-1 de cyno e ligação a MCP-1 natural detectada em Biacore. Oscritérios adicionais para agrupamento dos Fabs de origem foram a competi-ção C775 em ELISA e foram baseados sobre a família da estrutura da ca-deia pesada e leva variável. A caracterização dos candidatos a maturaçãocomo IgG1 especialmente em análises de quimiotaxia, foi executada em pa-ralelo com os processos de seleção para maturação.
Os sete Fabs selecionados para o processo de maturação caí-ram dentro de 3 classes de seqüências diferentes. Em uma classe (Gripo 1,Tabela 2) Os Fabs 03336, 03464, 03468 e 03470 tinham estrutura de cadeialeve com νλ3 uma das duas cadeias diferentes de estrutura de cadeia pesa-da. Os Fabs 03336 e 03464 tinham estruturas VH3 de cadeia pesada. A se-gunda classe de Fabs (Grupo 2, Tabela 2), 03471 e 03473, tinham estrutu-ras VH1A de cadeia pesada e estruturas Vk3 de cadeia leve. O Fab 03548tinha a mesma estrutura para a cadeia leve e para a cadeia pesada comodois dos Fabs da primeira classe (VH3, νλ3) porém foram mantidos separa-damente. (Grupo 3, Tabela 2) devido a que ele tinha excepcionalmente ativi-dade biológica potente e reatividade de ligação cruzada com a Eotaxina. Pa-ra uma descrição completa da classificação das seqüências da região variá-vel usadas aqui, vide a Patente U.S. Ne6.828.422, inteiramente incorporadaaqui, neste pedido de patente por referência. O objetivo da última mutaçãofoi o de melhorar a afinidade do 03548 com relação a CCL-2 enquanto au-mentando a especificidade.
Antes da maturação, foi somente determinada a ligação porémnão a afinidade com relação a MCP-1 natural de cinomólgo e humana, nomodo de captura de Fab Biacore. Todos os 7 Fabs de origem exibiram liga-ção a ambos, a MCP-1 cino e natural, o que é um pré-requisito para a matu-ração.
Especificidade de Ligação das IgG de origem. Depois da con-versão de todos os 7 Fabs de origem para lgG1, os estudos de reatividadecruzada foram repetidos com relação as formas de IgG. A Eotaxina 3 se liga-ram de forma não específica à superfície de dextrano dos chips sensores eessa ligação não específica pode ser completada através da adição de car-boxil metil dextrano. Como a ligação não específica à superfície do dextranode outras quimiocinas também era possível, o carboxil metil dextrano foi adi-cionado em todas as análises de especificidade por Biacore. Em contrastecom os Fabs, duas das IgG não exibiram nenhuma ligação significativa aMCP-1 humana, de modo interessante todos os 4 Iigantes finais que preen-cheram todos os critérios de sucesso vieram a partir de um Fab de origem.
O sinal de ligação da MCP-1 (unidades de resposta) foram nor-malizados através da quantidade da captura de anticorpo sobre a superfície:a proporção molas de ligação = (RU do antígeno ligado/MW do antígeno) X(MW de mAb/RU de mAb capturado sobre a superfície) e a proporção deligação molar mais baixa do que 0,5, foi prevista como não sendo significati-va. Quatro das IgG exibiram uma proporção de ligação normalizada a MCP-1 > 0,5 e todas as quimiocinas homólogas < 0,5 e foram, por esse motivodenominadas de específicas no nível da IgG. Uma IgG também exibiu algu-ma ligação à MCP-2 e a Eotaxina, o que já tinha sido detectado no nível doFab1 porém essa reatividade cruzada foi reduzida no nível da IgG. Os dadosda IgG MOR03468 não estão mostrados.
Inibição da ligação de I125 MCP-1 à células THP-I (CNTO). Aneutralização da atividade dos Iigantes de origem no formato IgG foi primeirotestada na análise de ligação por radioligante. Depois do bloqueio dos recep-tores Fc nas células THP-1 através da adição de IgGI humana não relacio-nada, a inibição da ligação da MCP-1 foi detectável com relação a todas asIgG de origem. Quatro das IgG mostraram inibição de MCP-1 humana mar-cada com radiação para células THP-1 com valores de IC5o na faixa da refe-rência IgG C775.
Inibição da mobilização de cálcio (CNTO). Todas as IgG de ori-gem inibiram a mobilização de cálcio induzida pela MCP-1 em células THP-1. Quatro das IgG mostraram inibição da mobilização do cálcio induzida pelaMCP-1 em uma concentração mais alta de anticorpos, quando comparadacom a referência IgG C775.
Inibição da quimiotaxia induzida pela MCP-1 (CNTO). Como osFabs de origem não puderam ser testados na análise de quimiotaxia, a qui-miotaxia induzida pela MCP-1 foi testada no formato IgG. Todas as IgG tes-tadas foram ativas na análise de quimiotaxia, e quatro das IgG mostraraminibição da quimiotaxia induzida pela MCP-1 em concentrações de anticor-pos mais altas, quando comparada com a referência IgG C775.
Exemplo 3: Afinidade de maturação de FAB selecionado através de troca decassetes I-CDR3H - H-CDR2
Sumário do Processo de Maturação por Afinidade
Na primeira rodada de maturação a otimização de L-CDR3 e aotimização de H-CDR2 foram executadas em paralelo. O DNA para cadaclasse de Fabs foi juntado para a construção da coleção de maturação. Asseqüências originais de CDR2 de cadeia pesada e CDR3 de cadeia leve fo-ram substituídas por seqüências aleatórias cada um dos DNA juntados resul-tando em 6 novas bibliotecas: 3 bibliotecas de H-CDR2 aleatórias e 3 biblio-tecas de L-CDR3 aleatórias. A diversidade de cada uma das 6 bibliotecas foimaior do que 108 Fabs únicas. O peptídio sintético de CCL-2- 411 biotina-K69 foi usado tanto para a seleção em solução ou a seleção de peptídio debiotina capturado em cavidades plásticas revestidas de neutravidina; Cadauma das 6 bibliotecas foi selecionada sob diversas condições para seremenriquecidas em Fabs fora de qualidade vagarosos (isto é, lavagem prolon-gada, concentração de antígeno reduzida). Foram realizadas 36 seleçõesparalelas, incluído seleção em solução e seleção em semi-solução. A redu-ção da concentração de antígenos, seleção fora de qualidade e a lavagemprolongada resultaram em condições severas de seleção. A triagem de afini-dade foi executada com o auxílio de uma plataforma de luminescência eletroquímica (ECL) Bio Veris (anteriormente IGEN), permitindo uma alta produ-ção de classificação de afinidade e identificação das moléculas de Fab comuma afinidade aumentada.
Maturação de Bibliotecas por Afinidade. Como as bibliotecas decadeia pesada H-CDR2 de H1A e H1B foram cionadas separadamente, 7bibliotecas de regiões variáveis diferentes foram cionadas. As duas bibliote-cas H1A e H1B foram mais parte juntadas antes da seleção dando 6 biblio-tecas de seleção, os tamanhos das bibliotecas variaram a partir de 108 até 8χ 109. Toda a diversidade teórica foi coberta para todas as bibliotecas excetopara coleção MOR03548 λ3 L-CDR3, na qual ainda 0,625x da diversidadeteórica foram cobertas. O controle de qualidade das bibliotecas foi executadoatravés do seqüênciamento de clones escolhidos de forma aleatória. 71 das75 (95%) seqüências estavam corretas e diversificadas, enquanto o deslo-camento da estrutura de 4 das 75 seqüências foi detectado. Os derivados detodos os Fabs de origem foram encontrados em suas respectivas bibliotecas.
Para o aumento da afinidade e da atividade biológica dos frag-mentos dos anticorpos selecionados, as regiões L-CDR3 e H-CDR2 foramotimizadas em paralelo através de mutagênese de cassete usando mutagê-nese direcionada a trinucleotídeo (Virnekàs et al, 1994),enquanto que asregiões de estrutura foram mantidas constantes. Antes da clonagem por ma-turação por afinidade, todos os fragmentos dos Fab de origem foram transfe-ridos a partir do correspondente vetor de expressão (pMORPH®X9_FH) den-tro do vetor CysDisplay™ pMORPH®25_LHC através de Xba\/EcoR\. OpMORPH®25_LHC foi criado a partir do vetor de exibição pMORPH®23_LHCde HuCAL GOLD® através da remoção de um sítio BssHII interferindo com aclonagem da coleção para a otimização de H-CDR2. Para a otimização de L-CDR3 de um conjunto de fragmentos L-CDR3 de Fab de origem, a estrutura4 e a região constante das cadeias leves (405 pb) do conjunto de Iigantesforam removidas por Bpi\/Sph\ e substituída por um repertório de L-CDR3diversificado em conjunto com a estrutura 4 e o domínio constante. O Proje-to, síntese e a clonagem desse cassete L-CDR3 serão descritos em outraocasião (manuscrito em preparação). 5 μg do vetor do conjunto de Iigantesforam ligados com um excesso molar de 3 vezes do fragmento inserto con-tendo o L-CDR3 diversificado. Em um conjunto de uma segunda coleção oH-CRD2 (XhoUBssHW) foi diversificado, enquanto que as regiões de ligaçãocom a estrutura foram mantidas constantes. Com a finalidade de monitorar aeficácia da clonagem o H-CDR2 de origem foi substituído por um simulacro,antes que o cassete H-CRD2 diversificado fosse clonado. As misturas deligação de 7 bibliotecas diferentes foram eletroporadas em 4 ml célulasTOPIOFde E.coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), produzindo a partir de 1 χ108 até 8 X 109 de colônias independentes. O tamanho dessa coleção asse-gura a cobertura da diversidade teórica. A amplificação da coleção foi execu-tada como descrito anteriormente (Rauchenberg et al., 2003). Para o contro-le de qualidade foram apanhados de forma aleatória clones isolados e se-qüenciados (SequiServe, Vaterstetten, Alemanha).
Seleção em Semi-Solução contra Biotin-K69 MCP-1 (V41I) Hu-mana com Relação a Maturação por Afinidade. 1 X 1013 de fagos resgatadosdas bibliotecas otimizadas foram pré adsorvidos duas vezes em tiras de pla-cas de microtitulação Reacti-Bind Neutravidin Coated Polystyrene e em se-guida bloqueados com ChemiBLOCKER (Chemicon, Temecula, CA, USA).Os fagos pré adsorvidos e diferentes concentrações de Bíotin-K69 MCP-1(0,02 - 20 nM) foram incubados durante 1,5 hora a 22°C em solução, segui-da pela captura dos complexos de antígeno-fago em tiras de placas de mi-crotitulação Reacti-Bind Neutravidin Coated Polystyrene (PERBIO). As eta-pas de lavagem a 22°C foram prolongadas em até 12 horas. A eluição por20 mM DRR em 10 mM de Tris/HCI, pH 8,0, e a amplificação dos flagemidosentre cada rodada de seleção foram executadas como descrito acima.
Seleção em Solução contra Biotin-K69 MCP-1 (V41I) Humanacom Relação a Maturação por Afinidade. 1 X 1013 de fagos resgatados dasbibliotecas da maturação por afinidade como descrito acima, foram bloquea-dos com ChemiBLOCKER (Chemicon, Temecula, CA, USA), 0,05% Tween20 (sigma, St. Louis, MO) USA) e pré-adsorvidos duas vezes em Dynabe-ads® M-280 Streptavidin (Dynal Biotech, Oslo, Noruega), bloqueados porChemiBLOCKER sem o Tween 20. A redução de antígeno foi aplicada du-rante as três rodadas de seleção e a concentração de Biotin-K69 MCP-1 va-riou a partir de 0,1 até 5 nM. As Dynabeads® bloqueadas e um separadormagnético de partículas, MPC-E (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) foram usa-dos para a captura de fagos ligados ai antígeno biotinilado. As etapas delavagem (Rauchenberger et al., 2003), e a eluição por 20 mM DRR em 10mM de Tris/HCI, pH 8,0, e a amplificação dos flagemidos entre cada rodadade seleção foram executadas como descrito acima. Além disso, a rigorosi-dade da seleção foi ainda aumentada pela seleção fora de qualidade (Haw-kins et al., 1992) e pelo prolongamento das etapas de lavagem (em até 6horas).
3312 clones foram submetidos a triagem e 85 Fabs otimizadosvindos de 4 dos 7 Fabs de origem foram identificados. Os Fabs otimizadosem L-CDR3 e H-CDR2, foram identificados e a clonagem cruzada das ca-deias leve a pesada melhoradas foi realizada a partir da derivatização de 2clones de origem diferentes que levaram a um aperfeiçoamento adicional emafinidade (K0) de até 100 vezes. Os Iigantes de maior classificação (cerca de100 ) com um K0 calculado a -1- nM foram seqüenciados levando a identifi-cação de 41 Fabs únicos melhorados. A maioria dos Iigantes melhorados foiderivada a partir do Grupo Ill (-3548). Uma triagem adicional foi executadanos Grupos I e Il para a identificação de mais Fabs melhorados nesses gru-pos de maturação. Vinte e nove Iigantes adicionais das classes I e Il foramidentificados. No total, 87 Fabs únicos derivados a partir de cinco dos seteFabs de origem foram identificados no processo de maturação, A Tabela 3resume os resultados da seleção de maturação.
Tabela 3. Resumo da seleção de Fab com ligação melhorada à MCP-1.
<table>table see original document page 112</column></row><table> As trocas de aminoácidos nos Fabs melhorados foram localiza-das tanto na H-CDR2 como na L-CDR3 dos clones de origem 03741 e03548. A clonagem cruzada da CDR2 da cadeia pesada mais melhoradacom a CRD3 da melhor cadeia leve dos Fabs foi executada em seguida paratentar gerar Fabs com uma afinidade ainda mais alta. Aproximadamente 36clones cruzados foram gerados. Todas as seqüências dos Fabs únicos tam-bém foram submetidas a triagem para a previsão de sítios de glicosilaçãoligados a N. Poucos Fabs foram identificados com a seqüência de consensoNIS para a glicosilação em CDR2 de cadeia pesada. Esses Fabs foram ex-cluídos de uma caracterização adicional. Um total de 84 Fabs foram expres-sos e purificados em Morphosys e transferidos para Centocor para a carac-terização biológica.
O limite de sensibilidade para a medição de afinidade com a uti-lização do Biacore foi alcançado com os Fabs otimizados. Por esse motivoos valores de afinidade determinados por ECL com base em titulação deequilíbrio em solução (SET) (Haenel et al., 2004, submetido para publicaçãoem Analytical Chemistry). Depois da maturação por afinidade, um K0 de cer-ca de 10 pM foi alcançado e o valor confirmado com a utilização de Kinex A,A ligação de Fab na análise de ligação por radioligante alcançou um IC 50de 110 pM. Desse modo, ambas, a afinidade de MCP-1 e a cinética da liga-ção aumentaram em até 100 vezes quando comparadas a dos Fab de ori-gem. Quatro Fabs otimizados preencheram todos os 9 critérios de sucesso,Dois foram Fabs otimizados L-CDR3 e dois foram clones cruzados compos-tos por cadeias otimizadas de L-CDR3 e H-CDR2. Todos os quatro foramconvertidos para IgG e retiveram a atividade em todas as análises testadascom o melhor K0 de 10 pM e o melhor IC5o de 20 pM na análise de ligaçãopor radioligante. Um clone cruzado adicional MOR03899 preencheu todos oscritérios de sucesso como uma IgG porém não como um Fab. Todos os Ii-gantes que preencheram os critérios de sucesso foram derivados a partir doFab de origem MOR03471 (SEQ ID N2S 2, 4). O Fab único, MOR03790 foiescolhido para a produção de IgG, em desenvolvimento de escala de fabri-cação, e avaliação in vivo em modelos animais com base no MOR03471 ecompreendendo seqüências de regiões variáveis de cadeia pesada e levedadas nas Tabelas 4D e nas SEQ.ID. NOS: 6, 7, 9, 13, 14 e 16.
Triagem por Bioveris Durante a Maturação por Afinidade. Clonesde Fabs com a afinidade melhorada foram identificados através uma análiseBioVeris de uma triagem de afinidade de alta produção com base em ECL.Depois dessa seleção quatro sub clones foram consolidados pelo mesmométodo.
Estratégias de Seleção Para maturação por afinidade. No totalforam executadas 36 seleções diferentes. 18 seleções em solução contrabiotin-K69 MCP-1 (V411) com a captura de complexos de fago-antígeno emcontas de Estreptavidina. A rigorosidade durante o processo de seleção foiaumentada pela redução da concentração de antígenos, seleção fora daqualidade e lavagem prolongada. Além disso, foram executadas 18 seleçõesem semi-solução contra biotin-K69 MCP-1, capturando complexos de fago-antígeno para placas de Neutravidin. Nessas seleções, a rigorosidade foiaumentada pela redução da concentração de antígenos e lavagem longa.
Triagem por BioVeris para maturação por afinidade. O antígenobiotin-K69 MCP-1 411 foi usado as seleção de maturação e também para atriagem com base no BioVeris. A triagem funcionou de forma muito eficientecom relação a identificação dos Iigantes aperfeiçoados. Para cada uma das36 condições de seleção 92 clones foram submetidos a triagem, resultandoem 3312 clones triados. No total, 85 Iigantes únicos diferentes otimizadosforam identificados. Foram encontrados Fabs otimizados em todos os 3 gru-pos. Além desses, Fabs otimizados em L-CDR3 e H-CDR2 puderam ser i-dentificados, tornando possível a clonagem cruzada com relação aos Fabsdesignados como os derivados de MOR03471 e MOR03548. 46 Fabs otimi-zados derivados a partir do MOR03548 vieram da otimização da H-CDR2exibindo uma afinidade e atividade mais altas comparados com os 11 Fabsotimizados L-CDR3. Porém também a MOR03471 de origem foi otimizadacom muito sucesso nessa maturação com 23 Fabs otimizados em L-CDR3 eum em H-CDR2. Fabs melhorados derivaram a partir de 4 entre os 7 Fabsde origem, indicando que cada Iigante de origem tem um potencial diferentepara serem otimizados. Finalmente 4 Fabs preenchendo todos os critériosde sucesso derivaram de MOR03471, somente dois otimizados em L-CDR3e dois a partir de clonagem cruzada otimizados em L-CDR2 e H-CDR2.
Clonagem Cruzada das Moléculas de Fabs Otimizados. A estru-tura modular da tecnologia HuCAL® permite uma rápida clonagem cruzadade cadeias leves e pesadas otimizadas de Fabs derivados a partir do mesmoclone de origem simplesmente pela combinação das duas cadeia otimizadasem uma etapa de clonagem. A clonagem cruzada é um método rápido com opotencial para conseguir anticorpos melhorados adicionais sem uma rodadaadicional de maturação. Por um lado 2 derivados de L-CDR3 de MOR03548otimizados foram clonados de forma cruzada com 6 H-CDR2 de MOR03548otimizados levando a 12 clones cruzados. Por outro lado, 22 L-CDR3 deMOR03471 otimizados foram clonados de forma cruzada com um clone dis-ponível de H-CDR3 de MOR03471 otimizado. Neste projeto a clonagem cru-zada executada com sucesso levando à dois clones cruzados de diferentesderivados de MOR03471, MOR03850 e MOR03878, que finalmente satisfi-zeram a todos os critérios de sucesso.
Caracterização Detalhada de 16 Anticorpos Pré-selecionados85 Fabs otimizados identificados a partir de triagem por afinida-de e 34 clones cruzados adicionais (vide acima) resultaram em um total de110 Fabs únicos otimizados diferentes, que não foram todos caracterizadosatravés de todas as análises disponíveis. Por esse motivo, 16 Fabs otimiza-dos foram pré-selecionados de acordo como seu IC50 em inibição de ligaçãopor radioligante, a atividade na análise de liberação de cálcio, a falta de sí-tios de N-glicosilação nas CDR (Tabelas 4A e B) e a afinidade. A caracteri-zação mais detalhada inclui o teste de especificidade, a ligação a e a neutra-lização da MCP-1 natural, a afinidade a MCP-1 humana e de cyno, a ativida-de na análise de quimiotaxia e a caracterização de todas as GiG1 converti-das.
Os clones representando os Fabs otimizados estão representa-dos pelas seqüências dadas nas Tabelas de 4A a C, nas quais o Fab de ori-gem do clone MOR03471 tem estruturas VH3 χ 3 kapa e o MOR03548 temas estruturas VH1A χ Iambda 3. Os 17 Fabs selecionados com atributos físi-co-químicos desejáveis (nenhum sito de N-glicosilação nas CDR) e proprie-dades otimizadas de afinidade e de bioatividade, exibem determinadas se-qüências alternadas únicas de CDR e seqüências de consenso representati-vas entre as seqüências HC-CDR2 e LC CDR3 dentro das estruturas usadas(VH3 e VH1A) bem como,mais geralmente, um consenso entre todas as HC-CDR1. Essas seqüências de consenso estão mostradas nas Tabelas de $c a4E e nas SEQ ID NOS: 2 a 26.
Tabela 4A: Seqüências CDR de cadeia Pesada de 17 Iigantes selecionados
<table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>
Tabela 4C: Seqüências de consenso para Regiões V anti MCP-1 (1- parte)
<table>table see original document page 118</column></row><table>Tabela 4C: (2ã parte)
<table>table see original document page 119</column></row><table>
Tabela 4D: CDR únicos anti-MCP-1
<table>table see original document page 119</column></row><table><table>table see original document page 120</column></row><table>
Tabela 4E: Seqüências de Consenso das Regiões CDR Anti-MCP-1.
<table>table see original document page 120</column></row><table>Tabela 5: Sumário da Afinidade dos anticorpos selecionados. (1- parte)
<table>table see original document page 121</column></row><table>
Tabela 5: (2ã parte)
<table>table see original document page 121</column></row><table>Ligação a MCP-1 nativa medida por Biacore. Ligação a MCP-1nativa foi testada no modo de captura Biacore Fab e todos Fabs seleciona-dos mostraram ligação a MCP-1 nativa. Especialmente se os limites dedetcção para determinação de Kd forem alcançados com Fabs otimizados,métodos alternativos para determinação de afinidade e verificação de espe-cificidade tiveram que ser usados.
Conversões de IgG. Todos os Fabs otimizados selecionadospara caracterização detalhada foram convertidos no formato IgGI, além dis-so, 4 Fabs foram sub-clonados no formato lgG4. Os dados de expressão ea atividade em diferentes análises do lgG4 humano testado foram tão bonsquanto os respectivos IgGI.
Titulação de Equilíbrio de Solução usando BioVeris. Como ummétodo alternativo para determinações de Kd sensível, a titulação de equilí-brio de solução (SET) usando tecnologia BioVeris foi realizada. Constantesde dissociação monovalentes foram calculadas através de modelos de ajusteapropriados para Fab e IgG. Este método foi adequado para medida de afini-dade e estudos de reatividade cruzada. Todos os 16 Iigandos selecionadosforam analisados através da titulação de equilíbrio de solução (SET) usandoBioVeris (Tabelas 5 e 6) e estes valores de afinidade foram com relação aosvalores de afinidades finais. Vários Iigandos incluindo MOR03757,MORC13781, MOR03790, MOR03850, MOR03878 como Fab e IgG eMOR03899 como IgG preencheram os critérios de sucesso de afinidade con-tra MCP-1 humano sendo < 0,5 nM e ciano MCP-1 sendo < 20 nM. Melhoresafinidades para MCP-1 humano foram 20 a 40 pM no nível do Fab e 10 a 20pM no nível de IgG (Tabela 5). Melhores afinidades para MCP-1 cinomólogoforam 10 a 40 pM no nível de Fab e 20 pM no nível de IgG (Tabela 6).
Testes de especificidade usando BioVeris. Além da afinidade,também a especificidade, especialmente a reatividade cruzada à Eotaxina eMCP-2 foi analisada na titulação de equilíbrio de solução (SET) usando Bio-Veris. Nenhuma reatividade cruzada à MCP-2 humana foi detectável paraqualquer dos selecionados 16 Fabs e 15 IgG testadas (uma das IgG selecio-nadas não estava disponível). Da mesma forma como a MCP-1 humana, aMCP-2 humana se liga principalmente ao receptor CCr2, enquanto que a Eo-taxina humana se liga predominantemente ao receptor CCR3. Nenhuma reati-vidade cruzada a Eotaxina humana foi detectável com relação aos Fab e IgGMOR03744, MOR03747, MOR03790 e MOR03781 em BioVeris, enquantoque 12 Iigantes selecionados incluindo o MOR03850 exibiram alguma reativi-dade cruzada á Eotaxina no formato Fab ou IgG (dados não mostrados).
Especificidade de Anticorpos Otimizados no Modo de Captura deAnticorpo Biacore (CNTO). A avaliação da especificidade foi executada comIgG selecionadas. Em Biacore 100 nM de MCP-1, MCP-2, 3, 4 humana eEotaxina 1, 2 e 3 humana foram adicionados aos anticorpos otimizados cap-turados. As IgG MOR03790, MOR03791, MOR03747, MOR03850,MOR03744, MOR03849, MOR03878, MOR03885, MOR3899 e MOR03781não mostraram um sinal significativo de ligação as quimiocinas homólogas esatisfizeram os critérios de sucesso de especificidade (Tabela 6).
A ligação de Fabs á MCP-2 não inibe a ligação de 125| MCP-2 acélulas Thp-1 (CNTO). Para analisar a atividade de ligação do Fab à MCP-2e a Eotaxina detectada em Biacore transladada para atividade de neutraliza-ção, foram desenvolvidas análises de ligação de radioligante a célula inteirano Centocor. As I125 MCP-2 mostraram uma bela ligação as células Thp-1 ea ligação foi inibida através da adição de MCP-2 não marcada, porém nãopela adição do anticorpo de referência específico para MCP-1 C775. Os re-sultados proporcionaram uma análise funcional importante para testar a es-pecificidade de ligação/neutralização. 1 ng/ml de MCP-1 foi usado em umaanálise de ligação ao receptor, enquanto que cerca de 100 ng/ml de MCP-2foram necessários nessa análise, na medida em que a marcação de MCP-2pode ter ocasionado uma perda em atividade. O MOR03754 não exibiu umainibição significativa da ligação do MCP-2 marcada com 1251 ao receptorCCR2 nas células Thp-1 (IC50 ^ 2 μΜ).
Os Fabs Amadurecidos Inibem de Forma Potente a ligação deI125 MCP-1 a Células Thp-1. Devido a baixa quantidade necessária de 2ng/ml, esta análise foi a análise mais sensível neste projeto com um limite deIC50 de análise de cerca de 100 pM para o Fab e mesmo de 20 pM para aIgG. (Tabela 5). Depois da otimização dos Fabs tinham que inibir a ligaçãoda MCP-1 humana ao seu receptor CCr2 humano nas células Thp-1 com umIC50 abaixo do Fab C775 de referência. O Fab de origem do MOR03471mostrou um IC50 de 180 nM e os derivados do Fab otimizado MOR03471(MOR03781 com 180 pM, MOR03790 com 260 pM, MOR03850 com 160pM, MOR03878 com 110 pM e MOR03899 com 130 pM) exibiram um melho-ramento total de atividade durante a otimização de até um fator de 1000 x.Embora esta análise foi a bioanálise mais sensível disponível neste projeto,mesmo nesta análise os Iigantes otimizados pareceram ter chegado aos Iimi-tes de análise.
As IgG Amadurecidas Inibem de Forma Potente a ligação de I125MCP-1 a Células Thp-1. O bloqueio dos sítios de ligação do receptor Fx pelaadição de IgG humana não relacionada foi importante para as análises deligação por radioligante e de mobilização de cálcio. Todas as IgG testadasconservaram a atividade na análise de ligação por radioligante. O valor deIC50 do MOR03781 otimizado foi de 20 pM, 30 pM para MOR03790, 50 pMpara MOR03850, 30 pM para MOR03878 e 50 pM para MOR03899. Inibiçãodo Desenvolvimento da Análise FACS da Internalização do Receptor CCR2induzida pela MCP-1. As análises se internalização do receptor foram reali-zadas com a utilização de células expressando CCR-2 que exibiram umaexpressão de CCR-2 mais alta do que as células THP-1, levando a um me-lhor sinal com relação a proporção de ruído. Primeiro a MCP-1 humana sin-tética foi titulada na análise para determinar o valor de EC5O- O valor de EC5Opara a MCP-1 foi encontrado como sendo de 116 ng/ml. Por esse motivo,100 ng/ml (-11 nM) para a MCP-1 foi escolhido para outras análises FACS.
Além disso, o tempo de incubação ótimo para ser obtida a internalizaçãocompleta foi avaliado a 37°C. A maioria da internalização ocorreu dentro dosprimeiros 30 minutos. Por essa razão, um tempo de incubação de 1 hora foiusado em todas as análises que se seguiram. A análise foi desenvolvidacom sucesso para permitir uma determinação de IC50. A atividade e a classi-ficação d entre 0,001 até 200 ug/ml de Fab ou IgG usados para a inibição dainternalização do receptor induzida pela MCP-1 foi medida. Os Iigantes oti-mizados selecionados exibiram uma boa inibição as internalização do recep-tor induzida pela MCP-1 (dados não mostrados). Dois lotes diferentes deFabs foram testados em paralelo com uma capacidade de reprodução de-monstrada.
Para a análise de internalização com a utilização de Fabs, umIC50 de 5 nM para MOR03790, 4 nM para MÜR03850, 7 nM paraMOR03781, 5,3 nM para MOR03878 e 3.3 nM para MOR03899 (Tabela 6).A IgGI de MOR03781 também mostrou 7 nM, indicando que a atividade foiconservada depois da conversão da IgG.
Mobilização da Inibição de Cálcio (CNTO). A MCP-1 induz amobilização de cálcio nas células THP-1 que pode ser detectada com o auxi-lio de um fluorforo. Os anticorpos otimizados exibiram uma inibição potenteda mobilização de cálcio os 4 candidatos finais MOR03781, MOR03790,MOR03850 e MOR03878 Fab exibiram valores de IC5o a partir de 18 até 28nM. As respectivas IgG de nosso conservaram a atividade e exibiram valoresde IC50 ainda ligeiramente melhores a partir de cerca de 6 até 10 nM devidoa capacidade das mesmas de neutralizar 2 moléculas de MCP-1 por IgG. Denovo os limites da análise pareceram ser alcançados à cerca de 10 nM.
A inibição da MCP-1 natural Induziu a Mobilização de Cálcio. AMCP-1 natural foi purificada a partir do sobrenadante PANCRI e usada paraa indução da liberação de cálcio. Os Fabs otimizados exibiram a inibição damobilização de cálcio induzida pela MCP-1 natural com uma atividade maiselevada quando comparada ao anticorpo de referência C775. De novo oslimites da análise pareceram ser alcançados à cerca de 10 até 20 nM daMCP-1 natural.
Inibição da quimiotaxia. Devido aos efeitos potenciais não espe-cífico, os Fabs de origem não puderam ser testados na análise de quimiota-xia., porém depois da maturação, todos os Fabs otimizados testados inibi-ram especificamente a quimiotaxia o que pode ser devido a atividade au-mentada. Todas as IgG otimizadas testadas foram ativas na análise de qui-miotaxia. Como a análise foi semi quantitativa, nenhum dos valores de IC5oapropriados pode ser determinado.Competição de Ligação com Referência ao Anticorpo C775. To-dos os MOR03548 pré-selecionados derivados de Fabs inibiram completa-mente a ligação do C775 à MCP-1 em um formato de competição em fasesólida. Todos os 7 MOR03548 pré-selecionados derivados de Fabs exibiramuma competição parcial ( ~ 60%)nesta análise.
Sumário dos Dados.
Tabela 6: Perfis de Abs Que Satisfazem os Critérios de Sucesso. (1ê parte)
<table>table see original document page 126</column></row><table>Tabela 6: (29 parte)
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Exemplo 4: Seleção de Candidatos Terapêuticos
Seleção e geração do candidato terapêutico final, CNT0888.
Dois dos mAbs, 3781 e 3790, que são diferentes somente emsuas seqüências de cadeia leve CDR3 (Tabelas 4C e D, SEQ ID NOS: 15 e16) demonstraram atividades biológicas quase idênticas nas análises. A aná-lise de capacidade de geração de imunização in silico foi realizada para aidentificação de potenciais peptídios de ligação da classe HLA Il e para de-terminar se os candidatos eram significativamente diferentes em termos deepítopos de ligação HLA. A análise previu que o mAb 3790 apresentar umpotencial mais baixo com relação a capacidade de geração de imunizaçãodo que o mAb 3781. Com base isso e nas outras análises bioquímicas e bio-lógicas mostradas na Tabela 6, o 3790 compreendendo as regiões de estru-tura de cadeia pesada VH1A (SEQ ID NO: 2) e as regiões CDR da cadeiapesada, SEQ ID NOS: 6,7 e 9 e a estrutura kapa 3 da cadeia leve (SEQ IDNO; 4) e as regiões CDR, SEQ ID NOS: 13, 14 e 16, foram selecionadospara os mAb terapêuticos finais.
A seqüência do terminal N do mAb 3709 determinou variações apartir das seqüências da linha de germe humana, devido as mudanças deaminoácido introduzidas durante a clonagem. Além, disso, os códons de a-minoácido (isto é, a seqüência de DNA) tiveram a propensão de expressãomáxima em células procarióticas bacterianas. O DNA Mab foi ressintetizadopara a correção do alinhamento imperfeito do terminal N com relação a se-qüência da linha de germe e para a mudança do viés do códon para aquelesfavorecidos em proteínas humanas altamente expressas. A seqüência modi-ficada do mAb 3790 é designada como CNTO 888 compreendendo as se-qüências das regiões variáveis de seqüência pesada e de seqüência levedas SEQ ID NOS: 27 e 28 respectivamente e abaixo (com as CDR sublinha-das) nas quais os resíduos do terminal N da cadeia pesada são QVQ (Gln-Val-Gln) e ou da cadeia leve são EIV (Glu-lle-Val).
Seqüência variável da cadeia pesada CNT0888 (SEQ ID NO: 27)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDGIYGELDFWGQGTLVTVSS
Seqüência variável da cadeia leve CNT0888 (SEQ ID NO: 28)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSDAYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYIQLHSFTFGQGTKVEIKCaracterização bioquímica e biofísica da CNTQ888. A CNT0888 é um anti-corpo totalmente humano IgG kapa. Não existe na seqüência a previsão pa-ra sítios de glicosilação ligados a N. As propriedades bioquímicas e biofísi-cas da CNT0888 (transitoriamente expressas em células HEK293 e purifi-cadas através de cromatografia de afinidade de proteína A) foram caracteri-zadas em SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), es-pectro de massa (MS) e BIAcore1 com relação a afinidade de ligação (K0) eespecificidade. No SDS-PAGE, a CNT0888 natural migra como uma faixaúnica à aproximadamente 150 kDa. A IgG reduzida/alquilada migra comoduas faixas a aproximadamente 60 kDa e 33 kDa. A cromatografia por ex-clusão de tamanho da CNTO888 demonstrou a eluição da IgG como um úni-co pico no mesmo volume de eluição como aquele medido para a IgG decontrole Remicade (dados não mostrados). Finalmente, a análise MS mos-trou que a CNT0888 tem uma massa de 147.000 Da (dados não mostra-dos). A análise BIAcore demonstrou que a afinidade de ligação da CNT0888(K0) com relação a CCL-2 de cyno e humana foi de 30 e 10 pM, respectiva-mente. A CNT0888 não exibiu a ligação detectável em BIAcore às quimioci-nas relacionadas com a CCL-2, isto é, as MCP-2, 3, 4 a eotaxina 2, 2 e 3.
Caracterização in vitro da CNT0888.
As atividades biológicas da CNT0888 fora, avaliadas em umavariedade de análises com base em células. A CNT0888 expressa transito-riamente avaliada em todos os critérios de sucesso tinha atividades dasquais não foram distinguidas da mAb 3790 de origem (Tabela 5).
Exemplo 5: Clonagem e Expressão de um Anticorpo Anti MCP-1
Alíquotas de E.coli com os plasmídios CNT0888, p2844 ep2882, contêm as cadeias pesada e leve do anticorpo, respectivamente. Oplasmídio p2844 contém a seqüência de codificação da cadeia pesada oti-mizada da CNT0888 codificando as regiões sob o promotor anti-CD4 dacadeia pesada e o plasmídio p2882 contem a cadeia leve otimizada da CN-T0888 codificando regiões sob o promotor anti-CD$ da cadeia leve. Ambosos constructos incluem o gene de seleção gpt para conferir resistência quí-mica com relação a MHX (Ácido Micofenólico, Hipoxantina e Xantina). Cadaplasmídeo foi purificado, caracterizado e seqüenciado.
As células a partir de uma cultura exponencial da linha de célu-las hospedeiras C463A, um derivado Sp2/0 adaptado para crescer no meioquimicamente definido (CD-Hibridoma)1 foram co-eletroporadas com osp2844 e p2882 linearizados. Depois de 48 horas, as células foram expostasa 1 χ MHX (0,5 mg/l de ácido micofenólico, 2,5 mg/l de Hipoxantina e 50 mg/lde Xantina). Três dias depois da seleção, a viabilidade das células tinha de-crescido para menos do que 13%, em cuja ocasião - 90.000 células viáveisforam colocadas em placas de metilcelulose. As células foram incubadassem serem perturbadas durante de oito até treze dias, em seguida triadas ecolocadas em placas de 24 cavidades com a utilização do procedimento Ha-lo. As culturas foram expandidas e foram obtidas as titulações crescidas emexcesso nas 24 cavidades.
A linha mais alta de células de origem (1C4) teve uma titulaçãocrescida em excesso nas 24 cavidades de 70 mg/l e uma titulação de 108,5mg/l em frascos de agitação (em meio de CD-hibridoma). Essa linha de célu-las de origem, C126A, foi escolhida para uma avaliação posterior em frascosde agitação. A Ç126A foi submetida ao Cell Banking Group para a geraçãode um Development Cell Bank (DCB). As células do DCB, designadas comoC1262A:DCB;02SEP04, testaram como negativas com relação a micoplas-ma e esterilidade. A Produção da CNT0888 para sustentar outros estudosde pesquisa a partir das células C126A em frascos de agitação (com a adi-ção de peptona de soja) alcançou uma titulação de 230 mg/l e produziram366 mg de CNT0888 purificada a partir de uma cultura de 2 litros. Em para-lelo, uma cultura de 9 I adicional de células C126A produziu - 2 g de matériade CNT0888 em bruto para purificação antecipada e desenvolvimento deformulação.
A linha de células de origem C126A foi sub clonada com a utili-zação de procedimento Halo e produziu cinco linhas de células de sub clonede alta produção. A melhor linha de sub clones da célula (4D5) teve umatitulação crescida em excesso nas 24 cavidades de 70 mg/l e uma titulaçãode 108,5 mg/l em frascos de agitação (em meio de CD-hibridoma). Essa Ii-nha de células de subclone foi codificada como C1262B.
Exemplo 6: Tratamento de tumores pancreáticos humanos com CNT0888.
Este estudo investiga se o bloqueio de MCP-1 de tumor (produ-zido através de células derivadas de tumor humano) suprime o crescimentodo tumor em um xenotransplante murino. Com a finalidade de aferir o tumor,bem como o papel do homologo hospedeiro COM-1, JE, no crescimento ena progressão de doença maligna, ambos os anticorpos MCP-1 anti-humanoe JE anticamundongo foram testados com relação a capacidade de suprimiro crescimento de tumores pancreáticos humanos in vivo.
Camundongos portadores de tumores pancreáticos BxPC-3 fo-ram tratados com o anticorpo anti-humano MCP-1 humano designado deCNT0888 que compreende as seqüências das regiões variáveis (SEQ IDNOS: 27 e 28, fundidas as regiões constantes da IgG humana. Com a finali-dade de comparar a atividade in vivo do CNT0888 com o anticorpo murinopreviamente testado no qual ele foi considerado mais eficaz na inibição dosefeitos no hospedeiro, ambos o CNT0888 e o MCP-1 (C775) murino anti-humano foram administrados em combinação com o anti-um JE(C1142).Com base na medição do peso final do tumor ambos os Mabs anti-humanos(CNT0888) e murino (V775) inibiram de forma significativa o crescimento dotumor.
Materiais e Métodos
As BxPC-3 são células derivadas do câncer pancreático huma-no. Matrigel® preparadas a partir do rumos de Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) foram obtidas de Becton Dickinson (0.2 EU/mg, Bedford, MA).
C775 é um Mab MCP-1 anti-humano de camundongo e C1142 éum anticorpo JE taro/murino quimérico anti camundongo, com regiões variá-veis de rato e regiões constantes de camundongo ambas descritas no Pedi-do de Patente co-pendente das requerentes U. S. Série de Ng 11/Co-pendente das requerentes e depósitos relacionados. O anticorpo de controlee cVaM é uma IgG rato/murina quimérica que consiste em uma região variá-vel de rato e constante de camundongo que serve como um controle de iso-tipo com relação a C1142 e C775. A IgG humana de qualidade clínica foiobtida da Beckett Apothecary and Home Health Care, lnc, Sharon Hilll PA1 eserve como um controle para o CNT888.
Foram usados no estudo camundongos SCDI fêmeas (6 a 8 semanas deidade) obtidos de Charles River (Raleigh, NC). Os camundongos foram alo-jados em grupo em gaiolas de plástico com cobertura de filtro e supridascom alimento e água passada em autoclave.
As células BxPC-3 foram cultivadas em meio RPMI 1640 quecontinha 10% de FBS (meio completo). As células foram divididas 1:3 qua-renta e oito horas antes do início do estudo. No dia do estudo, as célulasforam tripnizadas para a geração de um a única suspensão de células e asuspensão de células foi lavada com 10 volumes do meio completo para aneutralização da tripsina. As células foram submetidas a rotação e ressus-pensas em soro isento de RPML O Matrigel® foi descongelado a 4°C de umdia para o outro. A suspensão de células de tumor Matrigel® foi preparadapela mistura de volumes iguais da solução de Matrigel® e de células BxPC-3.A concentração final da suspensão de células de câncer foi de 5 c 106 célu-las em 5 mg/ml de Matrigel®.
No Dia 0, 80 camundongos SCID fêmeas foram implantados porvia subcutânea com 0,2 ml da suspensão de células BxPC-3. A suspensãode células de 0,2 ml continha 1 χ 106 de células BxPC-3 e 1,0 mg de Matri-gel®. Foram usadas seringas frias para impedir a polimerização do Matrigel®.
Tabela 7. Projeto do estudo antitumor.
<table>table see original document page 132</column></row><table>Todos os animais foram pesados no início do estudo e uma vezpor semana durante a duração do estudo. Uma vez que foi observado ocrescimento do tumor (3,0 mm3), os tumores foram medidos com compassosde calibre em duas dimensões (comprimento e largura) em milímetros (mm).Os camundongos foram monitorados com relação ao crescimento do tumore o volume do tumor (mm3)foi calculado com base na fórmula (comprimentoχ largura χ largura)/2.
No dia 14 depois da implantação das células de tumor, os ca-mundongos com um volume médio de tumor de cerca de 50 mm foram dis-tribuídos aleatoriamente em cinco grupos (n - 10 por grupo). O tratamento(Tabela 7) se iniciou no dia 14, e os tratamentos foram administrados duasvezes por semana durante o restante do estudo (52 dias depois do início dotratamento no dia 14). Os tumores foram medidos uma vez por semana du-rante o restante do estudo. No final do estudo, os camundongos foram mor-tos por asfixia por CO2. Os tumores foram dissecados, pesados em uma ba-lança digital e fixados. Os tumores foram fotografados com a utilização deuma câmara digital. No dia 50, um camundongo do Grupo 3 tinha um tumorque excedia o limite aceitável sob as normas do estudo. O volume e o pesodeste animal estão incluídos na análise final.
Com relação ao peso dos tumores, os dados foram analisadosatravés de um modelo linear padrão e análise da variação (ANOVA). Os va-lores de P de menos do que 0,5 com relação a todos os testes e compara-ções foram considerados como significativos a não ser que indicado de outraforma. Foi usada a escala logarítmica uma vez que as presunções subjacen-tes de variação igual e distribuição de tamanho normal foram melhor satisfei-tas. Os valores de meia-dúzia zero, para os camundongos que estavam li-vres do tumor, foram substituídos com um pequeno valor interpolado porcurvas (0,007240538) que facilitou a análise estatística na escala logarítmicasem a corrupção doa estrutura dos dados.
Com relação ao volume do tumor, um modelo de medições repe-tidas foi ajustado aos dados, presumindo uma primeira autocorrelação de co-variação da estrutura. As curvas naturais foram usadas para flexibilizar omodelo da curvatura das tendências nos perfis de tempo. As comparaçõesdo tipo de confrontação entre os grupos foram feitas a cada ponto de tempo.Os cálculos foram realizados pelo software de ambiente R.
Resultados
Ambos os grupos de controle negativo de PBS e de cVam/hulgGexibiram crescimento de tumores similares, chegando a ~ 350 mm depoisde 51 dias. Isso indica que o tratamento com anticorpo com anticorpos irre-levantes não inibe o crescimento de tumores. O crescimento dos tumoresnos três grupos (C775/C1142 e CNT0888/C1142) foi mais vagaroso do queo dos grupos de controle negativo,indicando que os tratamentos anti C-CL2/anti-JE teve um impacto sobre o crescimento do tumor. Os grupos(C775/C1142 e CNT0888/C1142) (2 mg/kg) exibiram uma inibição significa-tiva do tumor quando comparados com o grupo de controle de PBS, comomedido pelo volume de tumor no dia 18 até o final do estudo. O grupoCNT0888/C1142 (20 mg/kg) mostrou uma inibição significativa a partir doDia 18 até o Dia 39, quando comparado com o grupo de controle de PBS.
Os pesos dos tumores foram obtidos no final do estudo no dia 51(Tabela 8). Houve camundongos isentos de tumor no Grupo 1 do PBS (1camundongo), no Grupo 3 C775/C142 (3 camundongos), e no Grupo 4 (CN-T0888/C1142) (2 camundongos). Quando os pesos dos tumores foramcomparados, os grupos de CNTO888 em teste mostraram cada um uma re-dução significativa no peso de tumor quando comparada ao grupo de contro-le PBS (Tabela 8). O percentual de inibição do grupo CNT0888/C1142 do-sado a 2 mg/kg foi de 80% (P = 0,006), enquanto que para o grupo de CN-T0888/C1142 dosado com 20 mg/kg a inibição foi de 68% (P = 0,046). Ogrupo C775/C1142 também exibiu uma inibição significativa do crescimentode tumor (P = 0,004). As diferenças observadas na interpretação estatísticados resultados do volume do tumor vs o peso do tumor é mais provável de-vido a imprecisão da medição do volume do tumor com compassos de cali-bre, quando comparados a precisão da pesagem dos tumores retirados doanimal.Tabela 8: Peso Final do Tumor
<table>table see original document page 135</column></row><table>
Coletivamente esses resultados indicam que no modelo estabe-lecido BxPC-3 o bloqueio do MCB-1 e do JE de camundongo inibem de for-ma significativa o crescimento de tumor, e que o CNTO888 tem uma ativida-de antitumor.
Se tornará claro que a invenção pode ser praticada de outraforma do que a especificamente descrita na descrição e nos exemplos pre-cedentes.
Numerosas modificações e variações da presente invenção sãopossíveis na luz das informações acima e, por esse motivo, estão dentro doescopo das reivindicações em anexo.
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<170> Versão PatentIn 3.3<210> 1<211> 76<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> VARIANTE<222> (1)..(1)<223> Xaa pode ser Gln, Glu ou ácido piroglutâmico<220>
<221; VARIANTE
<222> (40)..(40)
<223; Xaa pode ser Ala ou Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (41).. (41)
<223> Xaa pode ser Val ou Ile
<220;·
<221> VARIANTE
<222; (43) . . (43)
<223> Xaa pode ser Phe ou Tyr<220>
<221> SITE<222> (69).. (69)<220>
<221> SITE<222> (75).. (75)
<223> Posição conjugada, como por exemplo, biotina ou PEG-biotina<400> 1
Xaa Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Xaa Ile Xaa Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75
<210> 2<211> 119<212> PRT<213> Humano<220>
<221> FRl<222> (1)..(25)<220>
<221> CDRl<222> (26) . . (35)<223> Degenerate<220>
<221> FR2<222> (36)..(46)<223> Degenerate<220>
<221> CDR2<222> (47).. (66)<223> Degenerate<220>
<221> FR3<222> (67).. (98)<220>
<221> CDR3<222> (99)..(108)<220>
<221> FR4
<222> (109)..(119)
<400> 2
Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 3<211> 109
<212> PRT
<213> Humano<220>
<221> FRl
<222> (1) . . (23)<220>
<221> CDRl
<222> (24)..(35)<220>
<221> FR2
<222> (36).. (46)<220>
<221> CDR2
<222> (47).. (57)<220>
<221> FR3
<222> (58).. (89)<220>
<221> VARIANTE
<222> (90)..(90)
<223> X pode ser H ou 0<220>
<221> CDR3
<222> (90)..(97)<220>
<221> VARIANTE
<222> (94) . . (94)
<223> X pode ser Glu, Gln, Asp, Ser, Thr ou Phe
<220>
<221> VARIANTE
<222> (95)..(95)<223> X pode ser Leu, He, His, Tyr, Phe ou Gln<220>
<221> VARIANTE<222> (96)..(96)
<223> X pode ser Trp, His, Ser, Prolina<220>
<221> VARIANTE<222> (97).. (97)
<223> X pode ser Ala, Vai, Asn, Gln, Ser ou Prolina<220>
<221> VARIANTE<222> (98) . . (98)
<223> X pode estar ausente ou ser Phe ou Met<220>
<221> FR4<222> (98)..(109)<220>
<221> FR4<222> (99)..(109)<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Gln Tyr Ile Xaa Xaa Xaa85 90 95Xaa Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 4<211> 120<212> PRT<213> Humano<220>
<221> FRl<222> (1) . . (25)<220>
<221> CDRl<222> (26).. (35)<220>
<221> FR2
<222> (36).. (46)
<220>
<221> CDR2<222> (47).. (66)<220>
<221> FR3<222> (67).. (98)<220>
<221> CDR3<222> (99)..(110)<220>
<221> FR4<222> (111)..(120)<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asn Ile Arg Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Glu Phe Thr Pro Trp Thr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 5<211> 107<212> PRT<213> Humano<220>
<221> FRl<222> (1) . . (22)<220>
<221> CDRl<222> (23).. (33)<220>
<221> FR2<222> (34) . . (44)<220>
<221> CDR2<222> (45)..(55)<220>
<221> FR3<222> (56)..(87)<220><221> CDR3
<222> (88)..(97)<220>
<221> VARIANTE
<222> (89).. (89)
<223> Xaa pode ser Ser ou Thr<220>
<221> VARIANTE
<222> (91).. (91)
<223> Xaa pode ser Asp ou Thr<220>
<221> VARIANTE
<222> (92).. (92)
<223> Xaa pode ser Arg ou Ala
<220>
<221> VARIANTE
<222> (93).. (93)
<223> Xaa pode ser Gln ou Phe<220>
<221> VARIANTE
<222> (96).. (96)
<223> Xaa pode ser Thr ou Ala<220>
<221> VARIANTE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa pode ser Ala, Gly ou Ser<220>
<221> FR4
<222> (98)..(107)
<400> 5
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa
85 90 95
Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105
<210> 6<211> 10<212> PRT<213> Humano<400> 6
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Ile Ser1 5 10
<210> 7<211> 20<212> PRT<213> Humano<400> 7
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly20
<210> 8<211> 20<212> PRT<213> Humano<400> 8
Trp Met Gly Ala Ile Asn Pro Leu Ala Gly His Thr His Tyr Ala Gln1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly20
<210> 9<211> 10<212> PRT<213> Humano<400> 9
Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe1 5 10
<210> 10<211> 10<212> PRT<213> Humano<4 00> 10
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met Ser1 5 10
<210> 11<211> 20<212> PRT<213> Humano<4 00> 11
Trp Val Ser Asn Ile Arg Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp1 5 10 15
Ser Val Lys Gly20
<210> 12<211> 11<212> PRT<213> Humano<400> 12
Phe Glu Phe Thr Pro Trp Thr Tyr Phe Asp Phe1 5 10
<210> 13<211> 12<212> PRT<213> Humano<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Humano
<400> 14
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Humano
<400> 15
His Gln Tyr Xle Glu Leu Trp Ser Phe1 5
<210> 16<211> 9<212> PRT<213> Hixmano<400> 16
His Gln Tyr Ile Gln Leu His Ser Phe1 5
<210> 17<211> 8<212> PRT<213> Humano<4 00> 17
His Gln Tyr Ile Phe Tyr Pro Asn1 5
<210> 18<211> 11<212> PRT<213> Humano<400> 18
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val Tyr1 5 10
<210> 19<211> 11<212> PRT<213> Humano<400> 19
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser1 5 10
<210> 20<211> 10<212> PRT<213> Humano<400> 20
Gln Thr Tyr Asp Arg Phe Ser Ser Thr Ala1 5 10
<210> 21<211> 10<212> PRT<213> Humano<400> 21Gln Ser Tyr Asp Arg Phe Ser Ser Thr Gly 1 5 10
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> Humano<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa pode ser Gly ou Ala<220>
<221> VARIANTE
<222> (6) .. (6)
<223> Xaa pode ser Ile ou Asn
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa pode ser Ile ou Leu<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa pode ser Phe ou Ala<220>
<221> VARIANTE
<222> (11).. (11)
<223> Xaa pode ser Thr ou His<220>
<221> VARIANTE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa pode ser Ala ou Thr<220>
<221> VARIANTE<222> (13).. (13)
<223> Xaa pode ser Asn ou His
<400> 22
Trp Met Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gln1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly20
<210> 23
<211> 22
<212> PRT
<213> Humano<22 0>
<221> VARIANTE
<222> (10)..(10) . -
<223> Xaa pode ser Ser ou Thr<220>
<221> VARIANTE
<222> (Il)--(Il)
<223> Xaa pode ser Gly ou Asn<220>
<221> VARIANTE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa pode ser Ala ou Thr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (15) ... (15)
<223> Xaa pode ser Gly, Ser, ou Thr<220>
<221> VARIANTE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa pode ser Ser ou Gly
<400> 23Trp Val Ser Ser Ile Glu His Lys Trp Xaa Xaa 1 5 10 Ala Ala Xaa Val Lys Gly 20 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Humano <220> <221> VARIANTE <222> (1) · - (1) <223> Xaa pode ser His ou Gln <220> <221> VARIANTE <222> (5) . . (5) <223> Xaa pode ser Asp, Glu, Gln, Ser, Thr <220> <221> VARIANTE <222> (6) . . (6) <223> Xaa pode ser Gln, Leu, lie, His, Tyr <220> <221> VARIANTE <222> (7)..(7) <223> Xaa pode ser Trp, His, Ser ou Pro <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <22 3> Xaa pode ser Ala, Gln, Vai, Asn, Pro- <400> 24
Xaa Gln Tyr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 25<211> 10
<212> PRT
<213> Humano<220>
<221> VARIANTE
<222> (2).. (2)
<223> Xaa pode ser Ser ou Thr<220>
<221> VARIANTE
<222> (4).. (4)
<223> Xaa pode ser Asp ou Thr<220>
<221> VARIANTE<222> (5).. (5)
<223> Xaa pode ser Ala ou Arg<220>
<221> VARIANTE<222> (6)..(6)
<223> Xaa pode ser Gln ou Phe<22 0>
<221> VARIANTE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa pode ser Ala ou Thr<220>
<221> VARIANTE
<222> (10).,(10)
<223> Xaa pode ser Ala, Gly ou Ser
<400> 25
Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Xaa1 5 10
<210> 26
<211> 10<212> PRT
<213> Humano<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa pode ser Gly ou Phe<220>
<221> VARIANTE
<222> (5).. (5)
<223> Xaa pode ser Ser ou Arg<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa pode ser Ile ou Met
<400> 26
Gly Xaa Thr Phe Xaa Ser Tyr Gly Xaa Ser1 5 10
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> Humano<220>
<221> Estrutura 1
<222> (1) . . (25)
<223> CDR3<220>
<221> CDRl
<222> (26)..(35)
<223> CDRl
<220>
<221> Estrutura 2
<222> (36)..(46)<223> CDR3<220>
<221> CDR2<222> (47)..(66)<223> CDR2<220>
<221> Estrutura 3<222> (67)..(98)<223> CDR3<220>
<221> CDR3<222> (99)..(108)<223> CDR3<220>
<221> Estrutura 4<222> (109)..(119)<223> CDR3<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> Humano<220>
<221> VARIANTE
<222> (1) . . (1)
<223> Xaa pode ser Asp ou Glu<220>
<221> Estrutura 1
<222> (1) . . (23)
<223> VHlA<220>
<221> Característica _ Misc
<222> (24)..(35)
<223> CDRl<220>
<221> Estrutura 2
<222> (36).. (46)
<223> VHlA<220>
<221> Característica _ Misc
<222> (47).. (57)
<223> CDR2<220>
221> Estrutura 3
222> (58) . . (89)
223> VHlA220>
<221> Característica _ Misc<222> (90)..(97)
<223> CDR3
<220>
<221> Estrutura 4<222> (98)..(109)<223> VHlA<400> 28
Xaa Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile Gln Leu His
85 90 95
Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

Claims (26)

1. Pelo menos um anticorpo de mamífero isolado MCP-1, com-preendendo, pelo menos uma região variável composta de pelo menos umaregião variável de cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, o referidoanticorpo MCP-1 compreendendo ambas as regiões variáveis de cadeia pe-sada e cadeia leve compreendendo as SEQID NOS: 27 e 28.
2. Pelo menos um anticorpo de mamífero isolado MCP-1, com-preendendo, pelo menos uma região variável composta de pelo menos umaregião variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de ca-deia leve, o referido anticorpo compreendendo todas as regiões determinan-do de forma complementar de cadeia pesada e de cadeia leve (CDR) dasseqüências de aminoácido das SEQID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16.
3. Um anticorpo que se liga de forma competitiva ao MCP-1 compelo menos um anticorpo de mamífero isolado MCP-1 compreendendo pelomenos uma região variável compreendendo pelo menos uma cadeia pesadae uma cadeia leve, o referido anticorpo MCP-1 compreendendo ambas asregiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve compreendendo asSEQ ID NOS: 27 e 28.
4. Um anticorpo que se liga de forma competitiva ao MCP-1 compelo menos um anticorpo de mamífero isolado MCP-1 compreendendo pelomenos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região vari-ável de cadeia leve, o referido anticorpo compreendendo todas as regiõesdeterminando de forma complementar de cadeia pesada e de cadeia leve(CDR) das seqüências de aminoácido das SEQID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16.
5. Pelo menos um anticorpo de mamífero isolado MCP-1, que seliga especificamente à mesma região do polipeptídio MCP-1 como um anti-corpo compreendendo pelo menos um CDE de cadeia pesada ou cadeialeve tendo a seqüência de aminoácido de pelo menos uma das SEQID NOS:- 6, 7, 9, 13, 14, e 16.
6. Um anticorpo humano isolado anti MCP-1 compreendendouma região variável de uma cadeia pesada ou de uma cadeia leve de pelomenos uma das SEQ ID NOS: 2 a 5 compreendendo ainda uma região de-terminante complementar (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou um Iigan-te ligando uma parte das mesmas, selecionada a partir do grupo que consis-te em SEQID NO; 6 a 20, e, opcionalmente associada de forma funcionalcom uma região de estrutura, também compreendendo opcionalmente pelomenos CH1, dobradiça, CH2 ou CH3 de uma imunoglobulina humana.
7. Um anticorpo MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivin-dicações de 1 a 5, em que o referido anticorpo se liga ao MCP-1 com umaafinidade de pelo menos uma selecionada a partir de pelo menos 10"9 M1pelo menos "IO"10 M1 pelo menos 10"11 M, ou pelo menos 10"12 M.
8. Um anticorpo MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivin-dicações de 1 a 7, em que o referido anticorpo modula substancialmentepelo menos uma atividade de pelo menos um polipeptídio MCP-1.
9. Um ácido nucléico isolado que codifica pelo menos um anti-corpo de mamífero isolado MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivin-dicações de 1 a 7.
10. Um vetor de ácido nucléico isolado compreendendo um áci-do nucléico isolado de acordo com a reivindicação 8.
11. Uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compre-endendo um ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 9.
12. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10,em que a referida célula hospedeira é pelo menos uma célula selecionada apartir de COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO1 BSC-1, Hep G2, 653,SP2/0, 293, HeLa, YB2/0, células de mieloma, ou linfoma, ou qualquer céluladerivada, imortalizada ou transformada das mesmas.
13. Um método para a produção de pelo menos um anticorpoMCP-1, compreendendo transladar um ácido nucléico de acordo com a rei-vindicação 9, sob condições in vitro, in vivo ou in situ, de tal forma que o an-ticorpo MCP-1 seja expresso em quantidades detectáveis ou recuperáveis.
14. Uma composição compreendendo pelo menos um anticorpode mamífero isolado MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 7, que tenha pelo menos um CDR humano, e pelo menos um veículoou diluente farmaceuticamente aceitável.
15. Uma composição de acordo com a reivindicação 13, quecompreende ainda pelo menos um pelo menos um composto ou polipeptídioselecionado a partir de pelo menos um de um marcador ou repórter detectá-vel, um antagonista TFN, um fármaco antiinfecção, um fármaco do sistemacardiovascular (CV)1 um fármaco do sistema nervoso central (CNS), um fár-maco do sistema nervoso autonômico (ANS), um fármaco do trato respira-tório, um fármaco do trato gastrointestinal (GI)1 um fármaco hormonal, umfármaco para o equilíbrio fluido ou eletrolítico, um fármaco hematológico, umantineoplásico, um fármaco de imuno modulação, um fármaco oftálmico, óti-co ou nasal, um fármaco tópico, um produto nutricional, uma citocina, ou umantagonista de citocina.
16. Um anticorpo ou fragmento antiidiotipo que se ligue especifi-camente a pelo menos um anticorpo MCP-1 de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 7.
17. Um método para o diagnóstico ou tratamento de uma condi-ção relacionada com o MCP-1 em ume célula, tecido, órgão ou animal, com-preendendo contatar ou administrar uma composição compreendendo umaquantidade eficaz de pelo menos um anticorpo de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 7, com, ou à referida célula, tecido, órgão ou animal.
18. Um método de acordo coma reivindicação 16, no qual a refe-rida quantidade eficaz é de 0,001 a 50 mg/quilograma das referidas células,tecido, órgão ou animal.
19. Um método de acordo com a reivindicação 16, no qual o re-ferido contato ou administração é através de pelo menos um modo selecio-nado a partir de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabronquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso,intracavitario, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracolico,intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraósteo, intra-pélvico, intrapericardio, intra-peritônial, intrapleural, intraprostático, intrapul-monar, intra-retal, intra-renal, intra-retina, intra-espinhal, intrasinovial, intrato-rácico, intra-uterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal,sublingual, intranasal, ou transdérmico.
20. Um método de acordo com a reivindicação 16, que compre-ende ainda a administração antes, concorrentemente ou depois do referido(a) contato ou administração d pelo menos uma composição compreenden-do uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou polipeptídio sele-cionado a partir de pelo menos um de um marcador ou reportes detectável,um fármaco antiinfecção, um fármaco do sistema cardiovascular (CV), umfármaco do sistema nervoso central (CNS), um fármaco do sistema nervosoautonômico (ANS), um fármaco do trato respiratório, um fármaco do tratogastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para o equilíbriofluido ou eletrolítico, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fár-maco de imuno modulação, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fárma-co tópico, um produto nutricional, uma citocina, ou um antagonista de citocina.
21. Um dispositivo medicinal compreendendo pelo menos umanticorpo MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6,em que o referido dispositivo é adequado para o contato ou a administraçãodo referido pelo menos um anticorpo MCP-1 através de pelo menos um mo-do selecionado a partir de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intraveno-so, intra-articular, intrabronquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartila-ginoso, intracavitario, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intra-cólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraósteo,intrapélvico, intrapericardio, intra-peritônial, intrapleural, intraprostático, intra-pulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retina, intra-espinhal, intrasinovial, in-tratorácico, intra-uterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bu-cal, sublingual, intranasal, ou transdérmico.
22. Um artigo de fabricação para uso farmacêutico ou para diag-nóstico humano compreendendo material de embalagem e um recipientecompreendendo um a solução ou uma forma Iiofilizada de pelo menos umanticorpo MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
23. O artigo de fabricação da reivindicação 21, no qual o referidorecipiente é um componente de dispositivo ou sistema de suprimento paren-teral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabronquico,intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial,intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico,intra-hepático, intramiocárdico, intraósteo, intrapélvico, intrapericardio, intra-peritônial, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal,intra-retina, intra-espinhal, intrasinovial, intratorácico, intra-uterino, intravesi-cal, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou trans-dérmico.
24. Um método para a produção de pelo menos um anticorpo demamífero isolado MCP-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 1 a 7, compreendendo a provisão de uma célula hospedeira ou um animaltransgênico ou uma planta transgênica ou célula de planta capaz de expres-sar em quantidades recuperáveis o referido anticorpo.
25. Pelo menos um anticorpo MCP-1 produzido através de ummétodo de acordo com a reivindicação 23.
26. Qualquer invenção descrita aqui, neste pedido de patente.
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