BRPI0613039A2 - vacina contra lawsonia e mÉtodos de uso desta - Google Patents
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Abstract
VACINA CONTRA LAWSONIA E MÉTODOS DE USO DESTA. A presente invenção refere-se a métodos de vacinação melhorados para a proteção aumentada contra ileíte. Os métodos levam em consideração a vacinação de animais jovens, preferivelmente leitões, entre 10 e 26 dias de idade, vacinação de porcas prenhes durante o segundo ou terceiro estágios de gestação, e uma combinação destes métodos. A vacinação das porcas prenhes pode ocorrer usando doses repetidas e/ou altas de antígeno de Lawsonia antes de parir.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA CONTRA LAWSONIA E MÉTODOS DE USO DESTA".
PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisó-rio dos Estados Unidos Serial N- 60/699.946, depositado em 15 de julho de2005, os ensinamentos e conteúdos do qual são incorporados por referênciaaqui.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
A presente invenção está amplamente envolvida em métodos devacinação melhorados para a imunização contra enterite proliferativa porci-na, conhecida como ileíte, que é causada por uma bactéria intracelular obri-gatória Lawsonia intracellularis (Lawsonia ou L. intracellularis). Especifica-mente, a invenção fornece métodos para fornecer proteção aumentada con-tra L. intracellularis vacinando-se porcas prenhes; vacinando-se porcas pre-nhes e depois subseqüentemente vacinando seus leitões jovens dentro decerca de três semanas depois do nascimento; e vacinando-se leitões jovensdentro de 25 ou 26 dias de nascimento, respectivamente.
Descrição da Técnica Anterior
Enterite proliferativa porcina (PPE), é uma doença que ocorrenaturalmente que pode afetar porcos do estágio de desmame a adulto jo-vem. Foi estabelecido que o agente causador é Lawsonia intracellularis, umabactéria obrigatória intracelular, gram-negativa que não pode ser cultivadapor métodos bacteriológicos normais em meios isentos de célula convencio-nais e foi considerada requerer células para o crescimento. S. McOrist et ai,Infection and lmmunity, Vol. 61, N2 19, 4286-4292 (1993) e G. Lawson et ai,J. of Clinicai Microbiology, Vol. 31, N2 5, 1136-1142 (1993) debatem o cultivode L. intracellularis usando monocamadas de célula epitelial intestinal derato IEC-18 em frascos de cultura de tecido convencionais. Nas PatentesU.S. N- 5.714.375 e 5.885.823, ambas destas patentes são aqui incorpora-das por referência em suas totalidades, o cultivo de L intracellularis em célu-las hospedeiras colocadas em suspensão foi descrito.Cepas de bactérias atenuadas patogênicas e não patogênicasde L. intracellularis são bem-conhecidas no estado da técnica. Por exemplo,WO 96/39629 e WO 05/011731 descrevem cepas atenuadas não patogêni-cas de L. intracellularis. Outras cepas de bactérias atenuadas de L. intracel-lularis são conhecidas do WO 02/26250 e WO 03/00665. Os ensinamentos econteúdo de cada uma destas referências são incorporados por referência aqui.
A doença é primeiro caracterizada por sua patologia macroscó-pica e microscópica, e mais tarde pela demonstração das bactérias intracelu-lares dentro de células afetadas. A aspecto patológico característico da do-ença é a proliferação de células epiteliais imaturas nas criptas do íleo (parteterminal do intestino delgado), no intestino grosso ou ambos. Seções de te-cido infectado são caracterizadas por uma mucosa com espessamento a-vermelhada assemelhando-se a uma "mangueira de jardim," e lesões entéri-cas. O espessamento do intestino basicamente impede a função intestinalnormal, capacidades de absorção, e transferência de nutriente. Efeitos clíni-cos da doença são perda de peso crônica, prodigalidade, diarréia, e morte. Adoença é de importância econômica devido à perda de morte, custos de me-dicação aumentados, ganho de peso insatisfatório e conversão de alimentosdiminuída em animais afetados. Casos clínicos de ileíte são observados, omais notavelmente em porcos de 6 a 20 semanas de idade. Entretanto, apresença de L. intracellularis foi confirmada (por PCR) em porcos recente-mente desmamados (3 a 4 semanas de idade), sugerindo que a exposição aL. intracellularis ocorre no viveiro e talvez, origina-se de fêmeas Lawsonia-positivas (Mauch e Bilkei (2004) Vet Rec 155: 532; Marsteller et ai (2003).Swine Health Prod 11:127-130; Stege et al. (2004). Vet Micro 104: 197-206).Estas observações enfatizam a importância para incorporar estratégias deprevenção tais como vacinação mais no início no sistema de produção.
Estratégias de vacinação correntes para a imunização contraileíte envolve administração oral da vacina para porcos "naive" de Lawsoniade apenas três semanas de idade e mais velhos, porque leitões abaixo destegrupo de idade podem ter anticorpos maternais positivos para L intracellula-ris devido à exposição ou vacinação prévias da porca. Antes do método dapresente invenção acredita-se que a presença de anticorpos maternais ououtros fatores lactogênicos possa interferir potencialmente com a eficácia devacinações em tais leitões, porque os anticorpos maternais têm a capacida-de para neutralizar a vacina antes que o sistema imune do leitão possa re-conhecê-la e comecem a secretar seus próprios anticorpos. Portanto, a va-cinação de leitões jovens foi evitada em virtude de imunidade maternal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção supera deficiências da técnica anterior efornece novos métodos para fornecer proteção de suínos aumentada contraileíte. Em particular, a presente invenção fornece um método de administraruma quantidade imunologicamente eficaz de vacina a porcas, e/ou leitõesjovens dentro de semanas depois do nascimento, de modo a imunizá-loscontra ileíte. Foi descoberto que a transferência de imunidade maternal deuma porca vacinada contra Lawsonia ou exposta para o leitão fornece algu-ma proteção contra ileíte em leitões durante pelo menos 6 semanas depoisdo nascimento. A menos que vacinadas entretanto, elas rapidamente tor-nam-se suscetíveis à doença. Os métodos da presente invenção demonstra-ram que o uso da vacina em animais prenhes em doses altas, depois de do-ses repetidas, e mesmo quando administrado durante o segundo ou terceiroestágios de gestação foi surpreendentemente seguro e eficaz para fornecerimunidade maternal.
Assim a presente invenção geralmente refere-se a um métodopara a vacinação de animais prenhes (preferivelmente porcos) contra infec-ções por L. intracellularis, em que os ditos animais prenhes são vacinadoscom antígeno de L. intracellularis. De acordo com um outro aspecto, a vaci-nação é com doses altas e/ou doses repetidas de antígeno de L intracellula-ris. De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo para a vacinação de animais prenhes (preferivelmente porcos) con-tra infecções por L. intracellularis, em que os ditos animais prenhes são va-cinados durante o segundo ou terceiro estágios de gestação, preferivelmenteestes animais prenhes são vacinados com doses altas e/ou doses repetidasde antígeno de L. intracellularis.Em uma modalidade preferida, é fornecido um método de vaci-nar porcos contra ileíte administrando-se uma vacina contra Lawsonia a umaporca prenhe pelo menos uma vez antes do parto, preferivelmente duas ve-zes antes do parto e o mais preferivelmente três vezes antes do parto ("do-ses repetidas"). Em algumas formas, as porcas prenhes são vacinadas comdoses altas do antígeno de L. intracellularis. Quando a vacina é administradaà porca três vezes, a primeira administração deve ocorrer entre 50 e 60 diasantes do parto, preferivelmente entre 52 e 58 dias antes do parto, e o maispreferivelmente entre 54 e 56 dias antes do parto. A segunda administraçãodeve ocorrer entre 30 e 40 dias antes do parto, preferivelmente entre 32 e 38dias antes do parto, e o mais preferivelmente entre 34 e 36 dias antes doparto. A administração final deve ocorrer entre 10 e 20 dias antes do parto,preferivelmente entre 12 e 18 dias antes do parto, e o mais preferivelmenteentre 14 e 16 dias antes do parto. Depois de a porca pari, a vacina é admi-nistrada a cada um dos leitões, depois eles são desmamados até o abati-mento, mas preferivelmente antes que eles atinjam três semanas de idade,em qualquer caso, pelo menos dentro de 10 a 25 e 26 dias de idade, respec-tivamente (preferivelmente entre 16 a 26 dias de idade), mais preferivelmen-te entre 10 a 21 dias de idade, ainda mais preferivelmente entre 15 a 21 diasde idade, e o mais preferivelmente entre 19 e 21 dias de idade. Em uma ou-tra modalidade deste método, a vacina é administrada a cada um dos leitõesantes de 26 dias de idade, preferivelmente entre 16 a 26 dias de idade, maispreferivelmente entre 18 a 24 dias de idade, ainda mais preferivelmente en-tre 19 a 22 dias de idade, e o mais preferivelmente em 21 dias de idade.
Assim, ainda em uma outra modalidade, a presente invençãofornece um método para vacinar porcas prenhes assim como os leitões pari-dos. Preferivelmente, as porcas prenhes e leitões paridos são vacinadoscomo descrito acima.
Foi descoberto ainda que a imunidade maternal, inesperada-mente, não interfere com a vacinação bem sucedida dos leitões imediata-mente depois do nascimento, e de fato, leitões vacinados dentro de cerca detrês semanas depois do nascimento, como descrito aqui, têm patologia ma-croscópica reduzida associada com a doença comparados aos leitões nãovacinados.
Assim a presente invenção refere-se a um método para a vaci-nação de animais jovens (preferivelmente leitões jovens) dentro de cerca detrês semanas depois do nascimento contra infecções por L. intracellularis.
Preferivelmente, estes animais jovens (preferivelmente leitões jovens) sãovacinados dentro dos dias 21 ± 5 de idade. Ainda mais preferivelmente, es-tes animais jovens (preferivelmente leitões jovens) são vacinados dentro dosdias 10 a 25 e 26, respectivamente de idade. Ainda mais preferivelmente,estes animais jovens (preferivelmente leitões jovens) são vacinados dentrodos dias 10 a 21 de idade. Ainda mais preferivelmente, estes animais jovens(preferivelmente leitões jovens) são vacinados dentro dos dias 12 a 21, res-pectivamente de idade. Ainda mais preferivelmente, estes animais jovens(preferivelmente leitões jovens) são vacinados dentro dos dias 15 a 21 deidade, o mais preferivelmente dentro dos dias 19 a 21 de idade. Em umaoutra modalidade deste método, a vacina é administrada a cada um dos lei-tões antes de 26 dias de idade, preferivelmente entre 16 a 26 dias de idade,mais preferivelmente entre 18 a 24 dias de idade, ainda mais preferivelmenteentre 19 a 22 dias de idade, e o mais preferivelmente em 21 dias de idade. Avacina para o uso de acordo com a presente invenção pode ser qualquervacina que fornece proteção contra L. intracellularis. Preferivelmente, a vaci-na é uma vacina contra L. intracellularis de vírus vivo. Mais preferivelmente,a vacina é Enterisol® Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).
A vacina é administrada a animais, preferivelmente mamíferos, eainda mais preferivelmente porcos, em qualquer maneira convencional, omais preferivelmente através de dose oral.
A dosagem a ser administrada dependerá do caso particular,mas em qualquer evento, ela é a quantidade suficiente para induzir um anti-corpo protetivo e/ou resposta imune mediada por célula contra ileíte. A do-sagem apropriada é determinável por meios conhecidos na técnica sem ex-perimentação indevida, e o mais freqüentemente será dependente da vacinaparticular utilizada. Em muitos casos, uma faixa de dosagem adequada de0,1 ml a 10 ml, e preferivelmente de cerca de 1 ml a 5 ml. No caso de Enteri-sol® lleitis, a dosagem é preferivelmente pelo menos de 2 ml por porco. Do-sagens também podem ser calculadas em uma base de peso seco por pesodo porco para vacinações não aquosas.
Os estudos apresentados nos exemplos abaixo foram conduzi-dos para avaliar a eficácia da vacina em porcos derivados de porcas expos-tas a Lawsonia intracellularis e negativas de Lawsonia. Além disso, os estu-dos avaliaram se houve alguma interferência materna! que resulta da vaci-nação de leitões em três semanas de idade.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O termo "vacinação" ou "vacinando" como usado aqui significa,mas não é limitado a, um processo que inclui a administração de um antíge-no de L. intracellularis a um animal, em que o dita antígeno de L. intracellula-ris, quando administrado ao dito animal evoca ou é capaz de evocar umaresposta imune no dito animal contra L intracellularis.
O termo "animal" como usado aqui, significa mas não é limitadoa, aves, peixes, e mamíferos tais como gado, porcos, cavalos, e primatas.
Entretanto, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção,o animal é um porco, preferivelmente um leitão entre 10 a 25 e 26 dias deidade, respectivamente, preferivelmente entre 10 a 21 dias de idade, aindamais preferivelmente entre 15 a 21 dias de idade, e o mais preferivelmenteentre 19 e 21 dias de idade. Em uma outra modalidade preferida, o leitão émenos do que 26 dias de idade, preferivelmente entre 16 a 26 dias de idade,mais preferivelmente entre 18 a 24 dias de idade, ainda mais preferivelmenteentre 19 a 22 dias de idade, e o mais preferivelmente 21 dias de idade.
O termo "uma dose eficaz" ou "dose eficaz" como usado aquisignifica, mas não é limitado a, uma quantidade de antígeno que evoca ou écapaz de evocar uma resposta imune em um animal, ao qual a dita doseeficaz de antígeno de L. intracellularis é administrada.
Uma "resposta imunológica ou imune" a uma composição ouvacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celulare/ou mediada por anticorpo à composição ou vacina de interesse. Assim, otermo "evoca ou é capaz de evocar uma resposta imune" significa, mas nãoé limitado a um processo imunológico em um hospedeiro caracterizado emque o dito hospedeiro desenvolve uma resposta imune celular e/ou mediadapor anticorpo à composição ou vacina de interesse. Usualmente, uma "res-posta imune" inclui mas não é limitada a um ou mais dos efeitos seguintes: aprodução ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células Tsupressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células T yd, dirigida especifi-camente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina deinteresse. Preferivelmente, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológicaterapêutica ou protetiva tal que a resistência à nova infecção será realçadae/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstra-da por uma redução, incluindo uma redução na severidade, ou carência dossintomas associados com infecções de hospedeiro como descrito acima.
A quantidade de antígeno que é eficaz para evocar uma respos-ta imune ou é capaz de evocar uma resposta imune em um animal dependedos ingredientes da vacina e do programa de administração. Tipicamente,quando o antígeno bacteriano morto é usado na vacina, a vacina contémuma quantidade de cerca de 103 a cerca de 109 da bactéria por dose, prefe-rivelmente, cerca de 104 a cerca de 108 da bactéria por dose, e ainda maispreferivelmente cerca de 105 a cerca de 106 da bactéria por dose.
Em particular, quando bactérias L. intracellularis modificadasvivas são usadas nas vacinas, por exemplo os isolados de bactérias desig-nados isolado B3903, Acesso ATCC N2 PTA-4926 e isolado designadoN34NP40wk, Acesso ATCC N- 55783 (ambos descritos no WO 96/39629 eWO 05/011731), a dose recomendada a ser administrada ao animal suscetí-vel é preferivelmente de cerca de 3,0 TCID50 (ponto final de 50% de doseinfecciosa de cultura de tecido)/dose a cerca de 6,0 TCID5o/dose e mais pre-ferivelmente cerca de 4,0 TCID50/dose a cerca de 5,0 TCID50/dose. Em umamodalidade preferida, o título da vacina é cerca de 4,9 TCID50/dose comodeterminado por ensaio de diluição de ponto final de 50% de Dose Infeccio-sa de Cultura de Tecido (TCID5o)·
Vacinas subunitárias são normalmente administradas com umnível de inclusão de antígeno de pelo menos 0,2 pg de antígeno por dose,preferivelmente com cerca de 0,2 a cerca de 400 pg/dose, ainda mais prefe-rivelmente com cerca de 0,3 a cerca de 200 Mg/dose, ainda mais preferivelmen-te com cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/dose, ainda mais preferivelmente comcerca de 0,4 a cerca de 50 pg/dose, ainda mais preferivelmente com cerca de0,45 a cerca de 30 pg/dose, ainda mais preferivelmente com cerca de 0,6 acerca de 15 pg/dose, ainda mais preferivelmente com cerca de 0,75 a cerca de8 pg/dose, ainda mais preferivelmente com cerca de 1,0 a cerca de 6 pg/dose,e ainda mais preferivelmente com cerca de 1,3 a cerca de 3,0 pg/dose.
Em geral, a quantidade de antígeno será entre 5 e 5000 micro-gramas, e entre 1020 e 109'0 TCID50, preferivelmente entre 103'0 e 106'0TCID50, e mais preferivelmente entre 1040 e 1050 TCID50, quando bactériaspurificadas são usadas.
Como usado aqui, o termo "doses altas" significa em geral pelomenos a quantidade de três vezes de antígeno de uma única dose normal-mente usada para a vacinação de animais adultos. Em particular, o termo"doses altas" significa a respeito de L intracellularis modificada viva umaquantidade de pelo menos 3 χ 103,0 a 3 χ 109,0 TCID50, preferivelmente cercade 3 χ 104,5 a 3 χ 106,0 TCID50. Em particular, o termo "doses altas" significa arespeito de antígeno de L. intracellularis morto uma quantidade de pelo me-nos 3 χ 104,0 a 3 χ 109 0 organismos ou bactérias, preferivelmente cerca de 3χ 106'0 a 3 χ 108'° organismos ou bactérias. Em particular, o termo "dosesaltas" significa a respeito de qualquer antígeno de L. intracellularis subunitá-rio uma quantidade de pelo menos 3 χ 0,2 a cerca de 3 χ 400 (0,6 a cerca de1200) pg/dose. Neste pedido, doses altas de antígeno de L. intracellularisforam administradas a porcas prenhes de modo a induzir uma resposta imu-nológica elevada na porca prenhe que seria transmitida à prole e fornecemalgum nível de imunidade aos leitões paridos.
Como usado aqui, o termo "doses repetidas" significa a adminis-tração do antígeno de L. intracellularis de pelo menos duas vezes, preferi-velmente de três vezes. Exemplos para um regime de vacinação de "dosesrepetidas" para porcas prenhes são dados acima.Como usado aqui o termo "proteção aumentada" significa, masnão é limitado a, uma redução estatisticamente significante em severidadeou freqüência de um ou mais sintomas clínicos e/ou desenvolvimento de le-são que são associados com infecções por L intracellularis (por exemplofreqüência de lesões cruzadas determinadas pelo método e de acordo comos critérios definidos no Exemplo 1, etc.) em um grupo vacinado de animaisvs. um grupo de controle não vacinado de animais. O termo "redução estatis-ticamente significante de sintomas clínicos" significa mas não é limitado a,que a freqüência na incidência de pelo menos um sintoma clínico e/ou de-senvolvimento de lesão no grupo vacinado de animais é pelo menos 20%,preferivelmente 30%, ainda mais preferivelmente 40%, ainda mais preferi-velmente 50%, ainda mais preferivelmente 60%, ainda mais preferivelmente70%, ainda mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 90%, e omais preferivelmente 95% mais baixa do que no grupo de controle não vaci-nado depois da inoculação com uma bactéria L. intracellularis infecciosa.
Como usado aqui, o termo "L intracellularis ou "Lawsonia" signi-fica as bactérias gram-negativas intracelulares, curvadas descritas em deta-lhe por C. Gebhart et ai, Intl. J. ou Systemic Bacteriology, Vol. 43, N2 3, 533-538 (1993) e S. McOrist et ai, Intl. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, N2 4,820-825 (1995), cada um dos quais é incorporado aqui por referência emsuas totalidades, e inclui mas não é limitado aos isolados descritos no WO96/39629 e WO 05/011731. Em particular, o termo "L. intracellularis tambémsignifica, mas não é limitado aos isolados depositados em the Budapest Tre-aty with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard,Manassas, Virgínia 20110-2209 e Acesso ATCC designado número PTA4926 ou Acesso ATCC número 55783. Ambos os isolados são descritos noWO 96/39629 e WO 05/011731, respectivamente. O termo "L intracellularis?também significa, mas não é limitado a qualquer outra cepa de bactérias L.intracellularis, ou isolado, preferivelmente tendo as propriedades imunogêni-cas de pelo menos uma das cepas L. intracellularis descritas nos WO96/39629 e WO 05/011731, em particular tendo as propriedades imunogêni-cas de pelo menos um dos isolados depositados em the Budapest Treatycom the American Type Culture Collection1 10801 University Boulevard, Ma-nassas, Virgínia 20110-2209 e Acesso ATCC designado número PTA 4926ou Acesso ATCC número 55783.
Uma cepa ou isolado tem as "propriedades imunogênicas" depelo menos uma das cepas de L. intracellularis descritas no WO 96/39629 eWO 05/011731 , em particular, dos isolados depositados como Acesso ATCCnúmero PTA 4926 ou Acesso ATCC número 55783, quando ela é detectávelpelo menos com um dos anticorpos específicos anti-L. intracellularis, descri-tos no W006/01294, em um ensaio de detecção que também é descrito noW006/01294 Preferivelmente estes anticorpos são selecionados dos anti-corpos tendo os números de referência 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2e 268:18. Preferivelmente, o ensaio de detecção é um ELISA sanduíche co-mo descrito nos Exemplos 2 e 3 do WO 06/12949, ao passo que o anticorpo110:9 é usado como um anticorpo de captura e anticorpo 268:29 é usadocomo anticorpo conjugado. Todos os anticorpos descritos no W006/12949são produzidos por células de hibridoma, que são depositadas em the Cen-tre for Applied Microbiology and Research (CAMR) e European Collection ofCell Cultures (ECACC)", Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK, como um depósi-to de patente de acordo com the Budapest Treaty. A data de depósito foi 11de maio de 2004. HYBRIDOMA CELL LINE 110:9 é depositada com êxitoem Ac. ECACC N2 04092204. HYBRIDOMA CELL LINE 113:2 é depositadacom êxito em Ac. ECACC N2. 04092201. HYBRIDOMA CELL LINE 268:18 édepositada com êxito em Ac. ECACC N2 04092202. HYBRIDOMA CELL Ll-NE 268:29 é depositada com êxito em Ac. ECACC N2 04092206. HYBRI-DOMA CELL LINE 287:6 é depositada com êxito em Ac. ECACC N204092203. HYBRIDOMA CELL LINE 301:39 é depositada com êxito em Ac.ECACC N2 04092205.
O termo "antígeno de L. intracellularis como usado aqui signifi-ca, mas não é limitado a, qualquer composição de matéria que compreendepelo menos um antígeno que pode induzir, estimular ou realçar a respostaimune contra uma infecção causada por L. intracellularis, quando adminis-trada a um animal. Preferivelmente, o dito antígeno de L intracellularis éuma bactéria L. intracellularis completa, em particular em uma forma inativa-da (uma, assim chamada bactéria morta), uma bactéria L. intracellularis mo-dificada viva ou atenuada (uma assim chamada MLB), qualquer subunidade,polipeptídeo ou componente de L. intracellularis, ou qualquer vetor quiméri-co, quando cada um compreende pelo menos uma seqüência de aminoácidoimunogênica de L. intracellularis. Os termos "proteína imunogênica", "poli-peptídeo imunogênico" ou "seqüência de aminoácido imunogênica" comousado aqui referem-se a qualquer seqüência de aminoácido que evoca umaresposta imune em um hospedeiro contra um patógeno compreendendo adita proteína imunogênica, polipeptídeo imunogênico ou seqüência de ami-noácido imunogênica. Em particular, uma "proteína imunogênica", "polipeptí-deo imunogênico" ou "seqüência de aminoácido imunogênica" de L intracel-lularis significa qualquer seqüência de aminoácido que codifica um antígenoque evoca uma resposta imunológica contra L. intracellularis em um hospe-deiro ao qual a dita "proteína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico" ou"seqüência de aminoácido imunogênica" são administrados.
Uma "proteína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico" ou "se-qüência de aminoácido imunogênica" como usado aqui, inclui mas não élimitado, à seqüência de tamanho natural de quaisquer proteínas, análogosdestes, ou fragmentos imunogênicos destes. O termo "fragmento imunogêni-co" significa um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos eassim evoca a resposta imunológica contra o patógeno relevante. Tais frag-mentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas demapeamento de epítopo que são bem-conhecidas no ramo. Vide, por exem-pio, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. (Os ensi-namentos e conteúdo dos quais são incorporados por referência aqui.) Porexemplo, epítopos lineares podem ser determinados por exemplo, sinteti-zando-se concorrentemente grandes números de peptídeos em suportessólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína, ereagindo-se os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estãoligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas no ramo e descritas, porexemplo, na Patente U.S. N2 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 81:3998-4002; e Geysen et ai (1986) Molec. Immunol.23:709-715. (Os ensinamentos e conteúdo dos quais são incorporados porreferência aqui.) Similarmente, epítopos conformacionais são facilmente i-dentificados determinando-se a conformação espacial de aminoácidos taiscomo, por exemplo, por cristalografia de raio X e ressonância magnética nu-clear bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.Synthetic antigens também são incluídos dentro da definição, por exemplo,poliepítopos, epítopos de flanqueamento, e outros antígenos recombinantesou sinteticamente derivados. Vide, por exemplo, Bergmann et ai (1993) Eur.J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et ai (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. e Cell Biol. 75:402-408; e Gardner et ai,(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 de Junho a 3de Julho de 1998. (Os ensinamentos e conteúdo dos quais são incorporadospor referência aqui.)
Antígenos de L. intracellularis adequados incluem, mas não sãolimitados àqueles descritos em EP 1219711; US 6.605.696; WO 96/39629;W097/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906;WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO05/026200; e WO 05/011731.
Assim a vacina para o uso de acordo com a presente invençãoinclui qualquer antígeno de L. intracellularis como descrito acima que evocaou é capaz de evocar uma resposta imune contra L. intracellularis. Preferi-velmente, a dita vacina fornece pelo menos proteção aumentada contra Lintracellularis.
Assim de acordo com um outro aspecto, a presente invençãorefere-se a um método de vacinar um animal jovem contra infecções por L.intracellularis compreendendo a etapa de administrar ao dito animal jovemdentro de cerca de 3 semanas de idade uma dose eficaz de antígeno de Lintracellularis, em que o antígeno de L intracellularis é selecionado do grupoconsistindo em bactérias L. intracellularis modificadas vivas, bactérias L. in-tracellularis mortas ou uma ou mais subunidades de bactérias L. intracellula-ris. Como mencionado acima para uma modalidade, preferivelmente a vaci-nação ocorre entre o dia 10 e dia 26 de idade, mais preferivelmente entre odia 12 e dia 21 de idade, ainda mais preferivelmente entre o dia 15 ao dia 21de idade, e o mais preferivelmente entre o dia 19 ao dia 21 de idade. Parauma outra modalidade, a vacinação preferivelmente ocorre antes de 26 diasde idade, preferivelmente entre 16 a 26 dias de idade, mais preferivelmenteentre 18 a 24 dias de idade, ainda mais preferivelmente entre 19 a 22 diasde idade, e o mais preferivelmente em 21 dias de idade.
Preferivelmente, a vacina compreende bactérias L. intracellularismodificadas vivas. Mais preferivelmente, a vacina é Enterisol® Ileitis B3903(Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-sea um método de vacinar um animal jovem preferivelmente um leitão jovem,contra infecções por L. intracellularis compreendendo a etapa de administrarao dito animal jovem começando entre o dia 10 e dia 26 de idade, mais pre-ferivelmente entre o dia 12 e dia 21 de idade, ainda mais preferivelmenteentre o dia 15 ao dia 21 de idade, e o mais preferivelmente entre o dia 19 aodia 21 de idade, ou o animal jovem antes de 26 dias de idade, preferivelmen-te entre 16 a 26 dias de idade, mais preferivelmente entre 18 a 24 dias deidade, ainda mais preferivelmente entre 19 a 22 dias de idade, e o mais pre-ferivelmente em 21 dias de idade, uma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cercade 6,0 TCID50 das bactérias L. intracellularis modificadas vivas. Preferivel-mente, as ditas bactérias são aquelas incluídas na vacina Enterisol® Ileitis133903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-sea um método de vacinar um animal jovem, preferivelmente um leitão jovem,contra infecções por L. intracellularis compreendendo a etapa de administrarao dito animal jovem começando entre o dia 10 e dia 26 de idade, mais pre-ferivelmente entre o dia 12 e dia 21 de idade, ainda mais preferivelmenteentre o dia 15 ao dia 21 de idade, e o mais preferivelmente, entre o dia 19 aodia 21 de idade, ou antes de 26 dias de idade, preferivelmente entre 16 a 26dias de idade, mais preferivelmente entre 18 a 24 dias de idade, ainda maispreferivelmente entre 19 a 22 dias de idade, e o mais preferivelmente em 21dias de idade, uma dose eficaz de antígeno de L. intracellularis, em que oanimal jovem é negativo para L. intracellularis e anticorpo maternal anti-Lintracellularis.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção tambémrefere-se ao novo uso medicinal de uma quantidade eficaz de antígeno de Lintracellularis para a preparação de medicamento, preferivelmente umacomposição de vacina, para a vacinação de um animal jovem, preferivelmen-te um leitão jovem, entre o dia 10 e dia 26 de idade, mais preferivelmenteentre o dia 12 e dia 21 de idade, ainda mais preferivelmente entre o dia 15ao dia 21 de idade, e o mais preferivelmente entre o dia 19 ao dia 21 de ida-de, ou antes de 26 dias de idade, preferivelmente entre 16 a 26 dias de idade,mais preferivelmente entre 18 a 24 dias de idade, ainda mais preferivelmenteentre 19 a 22 dias de idade, e o mais preferivelmente em 21 dias de idade.
De acordo com um outro aspecto do dito uso medicinal descritoacima, o antígeno de L. intracellularis é selecionado do grupo consistindo embactérias L. /nfrace//u/ar/s modificadas vivas, bactérias L. intracellularis mor-tas ou uma ou mais subunidades de bactérias L intracellularis. Preferivel-mente, o antígeno de L. intracellularis é bactérias L. intracellularis modifica-das vivas. Mais preferivelmente, o dito animal jovem é administrado comuma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cerca de 6,0 TCID50 das bactérias L in-tracellularis modificadas vivas. A fabricação de composições de vacina com-preendendo um antígeno de L. intracellularis é convencional no estado datécnica e conhecida a um técnico versado. Por exemplo a pessoa versadana técnica é capaz de conhecer componentes adicionais que podem sercompreendidos na dita composição (vide também Remington's Pharmaceu-tical Sciences. (1990). 18â ed. Mack Publ., Easton). O especialista pode usarsoluções estéreis injetáveis, fisiologicamente aceitáveis conhecidas. Parapreparar uma solução pronta para o uso para injeção parenteral ou infusão,soluções isotônicas aquosas, tais como por exemplo soluções salinas ou deproteína plasmática correspondente, são prontamente disponíveis. As com-posições de vacina podem estar presentes como Iiofilisados ou preparaçõessecas, que podem ser reconstituídos com uma solução injetável conhecidadiretamente antes do uso sob condições estéreis, por exemplo como um kitde partes.
Além disso, as composições imunogênicas e de vacina da pre-sente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis.
Como usado aqui, "um veículo veterinário aceitável" inclui qualquer um etodos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentesestabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngi-cos, agentes isotônicos, agentes retardadores de adsorsão, e similars.
"Diluentes" podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol,glicerol, e similars. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dex-trose, manitol, sorbitol, e lactose, dentre outros. Estabilizadores incluem al-bumina e sais alcalinos de ácido etilendiamintetracético, dentre outros.
"Adjuvantes" como usado aqui, podem incluir hidróxido de alu-mínio e fosfato de alumínio, saponinas por exemplo, Quil A, QS-21 (Carn-bridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals,Inc., Birmingham, AL), emulsão água-em-óleo, emulsão óleo-èm-água, ouemulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser fundamentada emparticular em óleo de parafina líquida leve (European Pharmacopea type);óleo isoprenóide tal como esqualano ou esqualeno; óleo que resulta da oli-gomerização de alcenos, em particular de isobuteno ou deceno; ésteres deácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmenteóleos vegetais, oleato de etila, di-(caprilato/caprato) de propileno glicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de áci-dos graxos ou álcoois ramificados, em particular ésteres do ácido isoesteári-co. O óleo é usado em combinação com emulsificadores para formar a e-mulsão. Os emulsificadores são preferivelmente tensoativos não iônicos, emparticular ésteres de sorbitano, de manida (por exemplo oleato de anidroma-nitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácido oléico, isoesteá-rico, ricinoléico ou ácido hidroxiesteárico, que são opcionalmente etoxilados,e blocos de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, em particular osprodutos da Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter et ai, The Theoryand Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.)· John Wileyand Sons, NY1 páginas 51-94 (1995) e Todd et ai, Vaeeine 15:564-570(1997). (Os ensinamentos e conteúdo do qual são por meio desta incorpora-dos por referência.) Por exemplo, é possível usar a emulsão de SPT descritana página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"editado por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsãoMF59 descrita na página 183 deste mesmo livro. (Os ensinamentos e conte-údo do qual são por meio desta incorporados por referência.)
Um outro exemplo de um adjuvante é um composto escolhidodos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros de anidridomaléico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são ospolímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmen-te com éteres polialquenílicos de açúcares ou poliálcoois. Estes compostossão conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, N- 2, Junho de1996). Pessoas habilitadas na técnica também podem referir-se à PatenteU.S. N2 2.909.462 que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com umcomposto poliidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, preferivelmen-te não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilassendo substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4átomos de carbono, por exemplo vinilas, alilas e outros grupos etilenicamen-te insaturados. Os radicais insaturados podem por si só conter outros substi-tuintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol; (BFGoodrich, Ohio, USA) são particularmente apropriados. Eles são reticuladoscom uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre eles, podem ser men-cionados Carbopol 974P, 934P e 971P. Mais preferido é o uso de Carbopol971P. Entre os copolímeros de anidrido maléico e derivado de alquenila, sãoos copolímeros EMA (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maléico eetileno. A dissolução destes polímeros em água leva a uma solução de ácidoque será neutralizada, preferivelmente ao pH fisiológico, de modo a fornecera solução adjuvante em que a composição imunogênica, imunológica ou devacina por si só será incorporada. Outros adjuvantes adequados incluem,mas não são limitados, ao sistema de adjuvante RIBI (Ribi Inc.), Copolímerode bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforillipídeo A, adjuvante de avridina lipídeo-amina, enterotoxina instável ao calorde E. coli (recombinante ou de outro modo), toxina da cólera, IMS 1314 oumuramil dipeptídeo, entre muitos outros.
Preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidadede cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferivelmente,o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de10 mg por dose. Ainda mais preferivelmente, o adjuvante é adicionado emuma quantidade de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose. Ainda maispreferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de750 pg a cerca de 2,5 mg por dose. O mais preferivelmente, o adjuvante éadicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.
A composição de vacina pode incluir ainda um ou mais outrosagentes imunomoduladores tais como, por exemplo, interleucinas, interfe-rons, ou outras citocinas.
As composições de vacina também podem incluir Gentamicina eMertiolate. Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivosúteis no contexto da presente invenção possam ser facilmente determinadaspelo técnico versado, a presente invenção considera composições compre-endendo de cerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante e preferivel-mente cerca de dose de 250 pg/ml da composição de vacina. Em uma outramodalidade preferida, a presente invenção considera composições de vacinacompreendendo de cerca de 1 pg/ml a cerca de 60 pg/ml de antibióticos, emais preferivelmente menos do que cerca de 30 pg/ml de antibióticos.
A vacina é administrada a animais, preferivelmente mamíferos, eainda mais preferivelmente porcos, em qualquer maneira convencional, omais preferivelmente através de dose oral. A dosagem a ser administradadependerá do caso particular, mas em qualquer evento, ela é a quantidadesuficiente para induzir um anticorpo protetivo ou resposta imune mediada porcélula contra ileíte.
De acordo com um outro aspecto da invenção, a vacina contra Lintracellulariss usada para a vacinação dos animais jovens (preferivelmenteos leitões jovens) é administrada em uma dose ou doses repetidas. Vacinaviva ou morta pode ser administrada 1 ou 2 vezes em intervalos de 2 a 4semanas depois da vacinação inicial. Para as vacinas atenuadas, vivas, umadose é preferida. Preferivelmente, a primeira ou única administração é reali-zada no dia 16 ao dia 26 de idade, mais preferivelmente no dia 18 ao dia 24de idade, ainda mais preferivelmente no dia 19 ao dia 22 de idade, e o maispreferivelmente no dia 21 de idade, como descrito acima, ou começandoentre o dia 10 e dia 26 de idade, mais preferivelmente entre o dia 12 e dia 21de idade, ainda mais preferivelmente entre o dia 15 ao dia 21 de idade, e omais preferivelmente entre o dia 19 ao dia 21 de idade.
Se uma segunda administração for desejável ou necessária, asegunda administração é realizada cerca de 1 a cerca de 4 semanas depoisda primeira administração da vacina. De acordo com um outro aspecto, arevacinação é realizada em um intervalo de 3 a 12 meses depois da admi-nistração de qualquer vacinação prévia. A administração de doses de vacinasubseqüentes é preferivelmente feita em 6 meses para uma base anual.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são representativos de formas de reali-zação preferidas da presente invenção. É entendido que nada aqui deve sertomado como uma limitação rio escopo global da invenção.
EXEMPLO 1
Este exemplo avaliou a eficácia de uma vacina contra Lawsortiaem leitões de três semanas de idade nascidos de porcas vacinadas contraLawsonia e não vacinadas e determinou se a vacinação da porca causou ounão interferência imune maternal que impediu uma resposta à vacinação doleitão, como medido por uma redução na indução na doença a seguir da ino-culação de cultura pura virulenta tanto leitões vacinados quanto não vacina-dos. Os parâmetros de estudo primários usados para medir a eficácia foramlesões macroscópicas e microscópicas do íleo e cólon. Adicionalmente, esteexemplo avaliou a vacina contra Lawsonia quanto a problemas de segurançaquando administrada a porcas prenhes durante os segundo e terceiro está-gios de gestação a seguir de administração de dose única e repetida.
Materiais e Métodos
Em um estudo cego, dezesseis porcas saudáveis, prenhes, esoronegativas para Lawsonia foram obtidas e aleatoriamente divididas em 2grupos, AeB, cada tendo 8 porcas. O grupo A recebeu 3 doses de EnterisolIleitis B3903 por dose oral nos dias -55, -35, e -14, em uma tentativa parainduzir um nível alto de imunidade maternal antes da cria. As porcas do gru-po B receberam um placebo antes do parto e serviram como controles nega-tivos. Porcas foram primeiro alimentadas com uma ração comercial paragestação, não medicada antes de serem trocadas para uma dieta para Iac-tação não medicada. Esforços foram feitos para ter concepção e parto uni-formes por todas as porcas, entretanto, houve alguma variação (10 dias) nomomento do parto. De modo a impedir problemas de variabilidade associa-dos com tendo dias de vacinação múltipla e inoculação, a metade das datasdo parto foi estabelecida como o dia 0 da experiência. Todos os leitões usa-dos na porção da vacina e inoculação do estudo foram de 21 ±5 dias deidade no momento da vacinação (Dia 21). Os leitões foram primeiro alimen-tados com uma ração iniciadora não medicada, seguido por uma ração paraviveiro não medicada, seguido por uma ração para término do crescimentonão medicada. As amostras de sorologia que foram coletadas de porcos fo-ram coletadas no dia real do nascimento, 7 dias de idade, e 14 dias de ida-de, para garantir a medição exata do anticorpo maternal, se presente. A so-rologia foi tomada de porcas antes da cria. Adicionalmente, porcas foramsubmetidas à necropsia no dia 22, seus tecidos do íleo e cólon foram avaliadosquanto à patologia macroscópica, seu íleo, cólon, Iinfonodos mesentéricos, eamígdalas foram avaliados por PCR, porcos natimortos foram testados porPCR, e desempenho reprodutivo da ninhada das porcas foi avaliado registran-do-se porcos como nascidos vivo, natimortos, ou múmias no dia do parto.
Depois do parto (no dia 21 do estudo), 100 leitões saudáveisforam bloqueados por ninhada e depois aleatoriamente designados para umde seis grupos de tratamento, cada um dos quais foi alojado separadamentepor todo o estudo. Leitões derivados de porcas vacinadas (Grupo A) foramaleatoriamente designados para grupos de tratamento 1 a 3. Leitões de por-cas não vacinadas (Grupo B) foram aleatoriamente designados para gruposde tratamento 4 a 6. No dia 21, grupos de tratamento 1 e 4, cada um tendo20 leitões por grupo, receberam uma dose de 2 ml (1 X 105'0 Iogi0TCID50/dose) de vacina Enterisol Ileitis B3903 por dose oral direta. Gruposde tratamento 2 e 5, cada um tendo 20 leitões por grupo, receberam umadose de 2 ml de placebo por dose oral direta. Grupos de tratamento 3 e 6,cada um tendo 10 leitões por grupo, não receberam nenhum tratamento eserviram como controles estritos para validar a suscetibilidade da fonte deporco para infecção por Lawsonia.
Três semanas depois da vacinação (dia 42 do estudo), leitões deteste em grupos de tratamento 1, 2, 4 e 5 foram inoculados recebendo-seuma dose de 10 ml (1 X 107·3 Iogi0 TCID50/dose) de isolado heterólogo deLawsonia em cultura pura de baixa passagem virulenta N101494 por gava-gem gástrica. Entretanto, qualquer outro isolado de L. intracellularis do tiposelvagem ou baixa passagem infeccioso pode ser usado como bactérias deinoculação. No dia 63 do estudo (três semanas pós inoculação), todos osgrupos de tratamento (1 a 6) foram submetidos à eutanásia e submetidos ànecropsia para análise de lesão macroscópica e microscópica para PPE.
O critério primário usado para determinar a eficácia da vacinaEnterisol Ileitis B3903 em leitões contra uma inoculação de cultura pura viru-lenta heteróloga foi a observação do desenvolvimento de lesão usando tantotécnicas macroscópicas quanto microscópicas para avaliar lesões no Neo ecólon. Lesões macroscópicas foram avaliadas em seções do íleo, na junçãoileal/cecal, e no cólon no momento do término do estudo. Lesões intestinaisforam classificadas em seu nível de severidade e amostras adicionais foramtomadas de qualquer sítio infectado do tecido para análise de PCR, IHC, eH&E. A severidade da lesão foi determinada pelo grau de espessamentomucoso encontrado dentro do revestimento interno mucoso do íleo. Umaclassificação de lesão de 0 não indicou nenhuma evidência de espessamen-to mucoso, edema, sulcos/dobras mucosos, ou proeminência de reticulaçãoserosa. Uma classificação de lesão de 1 indicou espessamento suave inclu-indo a presença de sulcos/dobras pequenos na mucosa, edema suave ou naparede mucosa, e em alguns casos hiperemia. Uma classificação de lesãode 2 foi equacionada com espessamento e/ou inflamação moderados. Ela foievidenciada por sulcos/dobras de profundidade proeminente na mucosa,edema moderado da parede mucosa, reticulação de superfícies serosas, eem alguns casos, hiperemia. Uma classificação de lesão de 3 indicou espes-samento e/ou inflamação severos, evidenciados por sulcos/dobras severos eprofundos na mucosa, edema moderado da parede mucosa, reticulação desuperfícies serosas, e novamente em alguns casos, hiperemia. Uma classifi-cação de lesão de 4 indicou espessamento e/ou inflamação severos e/ou apresença de sangue. Esta classificação de lesão foi evidenciada por sul-cos/dobras severos e profundos na mucosa, edema moderado da paredemucosa, reticulação de superfícies serosas, novamente em alguns casos,hiperemia, e a presença de conteúdos de sangramento e/ou coágulos san-güíneos. Finalmente, uma classificação de lesão de 5 indicou necrose evi-denciada por lesões severas da superfície mucosa tal que a presença denecrose está presente ou em alguns casos a superfície mucosa inteira é es-talada ou destacada devido à severidade da lesão.
Lesões microscópicas causadas por Lawsonia são patognomô-nico para PPE. Lesões histopatológicas da doença incluem hiperplasia epite-IiaJl especialmente nas criptas mucosas com uma ausência distinta de célu-las caliciformes. Lawsonia é usualmente encontrada dentro das células epi-teliais proliferantes da cripta mucosa. Seções do íleo de aproximadamente 2a 4 cm de comprimento foram colocadas em formalina tamponada para aexaminação histológica usando métodos de coloração por Hematoxilina eEosina (H&E) e IHC. Manchas de H&E detectam a presença de hiperplasiada cripta causada por infecção por Lawsonia enquanto manchas IHC explo-ram a especificidade de um anticorpo monoclonal anti-Lawsonia em confir-mar a presença do organismo e desenvolvimento de lesão microscópica emtecidos afetados. O anticorpo monoclonal anti-Lawsonia especificamentedetecta Lawsonia de célula total direcionando-se uma proteína de membranaexterna presente em todos os isolados de Lawsonia. Este monoclonal foiderivado da linhagem de célula de hibridoma VPM53, desenvolvida por pes-quisadores na University of Edinburg1 Scotland. A presença de organismosde Lawsonia e severidade da lesão microscópica como determinado por co-loração IHC de seções ileais foram registradas com uma classificação de 0não indicando nenhum enterócito proliferativo (lesões), uma classificação de1 indicando lesões suaves, focais, uma classificação de 2 indicando lesõesmoderadas, difusas, e uma classificação de 3 indicando lesões severas, di-fusas. Com respeito à presença de organismos, o sistema de classificaçãoIHC não registrou a presença de nenhum organismo como um 0, a presençade poucos organismos focais como um 1, a presença de organismos mode-rados, difusos como um 2, e a presença de organismos severos, difusoscomo um 3.
Os critérios secundários de medições foram a observação de sin-tomas clínicos, detecção de Lawsonia em esfregaços fecais e tecidos por PCR1o ADWG e soroconversão (IFAT) devido à exposição do leitão à Lawsonia.
Observações de saúde diárias foram feitas a partir da data doinício do estudo ao dia da inoculação para cada animal de teste. Parâmetrosde saúde clínicos, incluindo diarréia, comportamento e condição corporal,foram registradas diariamente a partir do dia de inoculação (dia 42) ao diaantes do término (dia 62). A classificação refletiu a severidade da doença.
Para diarréia, uma classificação de 1 indicado fezes normais, uma classifica-ção de 2 indicado fezes semi-sólidas sem nenhum sangue, uma classifica-ção de 3 indicado fezes aquosas mas sem nenhum sangue ou fezes escu-ras, e uma classificação de 4 indicado fezes tingidas de sangue, se elas fo-ram livres ou formadas. Uma classificação de comportamento de 1 indicadocomportamento normal, uma classificação de 2 indicado comportamento su-ave a moderadamente deprimido (estará sem auxílio), e uma classificaçãode 3 indicado comportamento severamente deprimido ou ocioso. Uma classi-ficação de condição corporal de 1 indicado uma condição corporal normal,uma classificação de 2 indicado uma condição corporal suave to moderada-mente frágil, e uma classificação de 3 indicado uma condição corporal seve-ramente frágil.O derramamento fecal de Lawsonia foi avaliado por Ileitis PCRtestando-se esfregaços fecais (f-PCR) nos dias -55, -35, -14, 21, 28, 35, 42,49, 56 e 63 do estudo. Esfregaços fecais foram testados quanto à presençade DNA de Lawsonia em fezes usando PCR. Seções de tecido fresco foramrecuperadas de cada animal de teste no término do estudo no dia 63. Análi-se qualitativa de conteúdo bacteriano em tecidos foi avaliado por Ileitis PCR(t-PCR) junto com avaliação histoíógica para Lawsonia no íleo, cólon, amíg-dalas e Iinfonodo mesentérico no dia 63 do estudo. O ensaio de PCR foi de-senvolvido por Jones, et ai., e ele explora a especificidade de dois iniciado-res de oligonucleotídeo (20 pares de base cada) para produzir um fragmentode 319 bp de DNA genômico de Lawsonia. Estes iniciadores direcionam umaseqüência previamente determinada de DNA genômico específico para Law-sonia. Fragmentos de DNA produzido durante PCR são comparados a con-troles de reação de PCR e extração de DNA lleíte-positivos e -negativos pa-ra a confirmação de um resultado "positivo" ou "não positivo". O controle deextração de DNA positivo é Lawsonia de célula total com células McCoy in-fectadas em 1X Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) (200μ l/tubo). O controle de extração de DNA negativo são células McCoy nãoinfectadas em 1X PBS (200 μΙ/tubo). Controles de reação de Ileitis PCR con-sistem em DNA genômico de Lawsonia purificado de material de colheita decultura celular (células McCoy Lawsonia +) enquanto o controle negativo éágua isenta de RNAse (Amresco, Solon, Ohio). Uma amostra de teste positi-va para DNA de Lawsonia produzirá o fragmento de DNA de tamanho idênti-co (319 bp) como ambos controles Ileitis PCR-positivos (extração e reação)enquanto amostras negativas não produzirão um fragmento deste tamanho.
Preparações de DNA extraído de cada amostra de teste foram obtidas usan-do kits de extração de DNA ISO-QUICK (ORCA Research, Inc., Bothell, Wa-shington). Resultados de PCR foram usados para determinar o derramamen-to de Lawsonia em leitões vacinados com Enterisol Ileitis B3903 e/ou inocu-lados com o isolado heterólogo de Lawsonia N101494.
Pesos foram medidos no dia da vacinação (dia 21), no dia dainoculação (dia 42), e no dia do término do estudo (dia 63) de modo a calcu-lar os ganhos de peso diários médios (ADWG) de cada grupo de tratamento.Os ADWG para cada grupo foram comparados entre si para ADWG pós va-cinação e pós inoculação. Pesos corporais foram determinados usando umsistema em escala de barra de peso eletrônico (Weigh-Tronix, Weigh-Tronix,Inc., Fairmont, Minnesota) calibrado usando pesos de teste certificados an-tes e depois de cada uso.
O soro foi testado usando Teste de Anticorpo Fluorescente Indi-reto (IFAT) para detectar anticorpos an\\-Lawsonia em animais de teste.
Sangue total venoso em tubos vacutainer de porcas nos dias -55, -35, e -14e em todos animais de teste em O, 7, e 14 dias de idade, e em dias da expe-riência 21, 28, 35, 42, 49, 56, e 63 do estudo. O sangue foi deixado coagularantes de ser centrifugado, e o soro coletado e congelado. O IFAT depoistriou o soro do porco quanto a moléculas de IgG anti-Lawsonia. Anticorposanti-Lawsonia ligam-se aos antígenos de membrana externa de Lawsonia decélula total, cobrindo completamente o organismo que é fixado ao fundo decada cavidade em uma placa de micro-título de 96 cavidades. E conjugadode anticorpo secundário rotulado com FITC anti-lgG foi introduzido para li-gar-se a quaisquer complexos de IgG-antígeno dentro de cada cavidade.
Estes complexos ligados a FITC iluminam verde fluorescente sob luz ultravi-oleta. Uma amostra de teste positiva revela muitos bastões verdes brilhan-tes, pequenos, de forma curvada assemelhando-se a Lawsonia, ou célulasMcCoy infectadas contendo Lawsonia abundante. Uma amostra de testeIFAT negativo mostra um fundo verde opaco (fraco) de células McCoy. Osresultados verificados pelo IFAT foram usados para observar um padrão desoroconversão em grupos que recebem uma vacinação e/ou inoculação viru-Ienta indicativo de exposição à Lawsonia no animal de teste.
Um ensaio de ponto final TCID50 foi conduzido em amostras re-presentativas de cada dose de vacina administrada a leitões de teste no dia21 deste estudo. Cinco cópias de amostras de teste representativas foramdiluídas dez vezes (10"1 a 10"6) pré- e pós- vacinação e administração deinoculação em Meio Essencial Modificado por Dulbecco fortificado comHam's F12 (DMEM F12) e 5% de Soro Bovino de Recém-Nascido inativadopor calor (NBS) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). Amostras diluídas fo-ram testadas para determinar a quantidade de Lawsonia viva em cada a-mostra de teste. Títulos médios foram calculados de 5 replicações pré- epós-vacina e pré e pós-administração de inoculação e multiplicados pelo vo-lume de material de teste dado a cada leitão para determinar o Iogi0 total deLawsonia por dose. Os títulos médios totais (logioTCID5ü/dose) para vacina-ção ou inoculação foram determinados dos resultados pré- e pós-titulação (2títulos) médios.
Comparações do grupo de tratamento foram feitas analisando-seos dados de ADWG, tanto pós vacinação quanto pós-inoculação, classifica-ções clínicas, taxas de soroconversão (IFAT)1 colonização (t-PCR), derra-mamento fecal (f-PCR), lesão macroscópica, e desenvolvimento de lesãomicroscópica por Imunoistoquímica (IHC).
Três leitões (um do Grupo 1 e dois do Grupo 5) morreram depoisda vacinação, mas antes do término do estudo. O leitão do Grupo 1 foi anali-sado quanto à infecção por Lawsonia, mas a causa da morte foi determinadaser choque/septicemia devido a níveis elevados de E. coli. Osi dois leitões doGrupo 5 que morreram tiveram lesões macroscópicas e microscópicas seve-ras típicas de infecção por Lawsonia e a causa presumida da morte foi devi-do à Lawsonia.
Resultados
Avaliação das amostras fecais e de soro coletadas neste estudoindicou que nenhuma porca no Grupo A ou Grupo B teve Lawsonia detectá-vel em suas fezes ou no íleo ou cólon. As porcas do Grupo A tiveram 5 de 8animais com títulos IFAT detectáveis em pelo menos um ponto no tempodurante o estudo. Nenhuma porca do Grupo B teve um título IFAT detectáveldurante o mesmo período de tempo. Estes dados são resumidos abaixo naTabela 1.Tabela 1: Dados da porca
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Todas as porcas foram submetidas à necropsia e avaliadasquanto a lesões macroscópicas típicas de infecção por Lawsonia. Entretanto,nenhuma porca foi positiva para lesões macroscópicas ou detecção de t-PCR.
Apesar do fato de que a vacina foi administrada tanto durante o2° e 3- trimestres de gravidez, nenhuma observação da saúde geral anormalfoi registrada para qualquer porca durante a experiência clínica. Resultadosdo parto entre porcas do Grupo A e Grupo B também foram muito similarescom uma média de 9,4 e 7,6 leitões nascidos vivos em cada grupo, respecti-vamente. As porcas do Grupo A tiveram uma média de 1,8 porcos natimor-tos por ninhada e nenhuma múmia ou mortalidade no parto. As porcas doGrupo B tiveram uma média de 0,9 natimorto, 0,1 múmia, e 0,1 porcos mor-tos no parto, por ninhada. Avaliação de diagnóstico destes porcos natimortosindicou que eles foram Lawsonia-negativos e dentro de perdas normais as-sociadas com reprodução. Os resultados da sorologia foram como esperadoem que porcas não vacinadas permaneceram animais soronegativos e al-gumas soropositivos foram observados no Grupo A. As porcas do Grupo Ativeram valores de porcos/ninhada mais altos em comparação aos controlesnão vacinados. Este resultado indica que não houve nenhum efeito negativodevido a métodos de vacinação ou conteúdos. Estes dados são resumidosacima na Tabela 1.
Desenvolvimento de lesão de leitão macroscópica foi determina-do avaliando-se e classificando-se o íleo e cólon de cada animal de testequanto a lesões macroscópicas associadas com PPE no tempo do términodo estudo. Leitões dos Grupos 1 e 4 tiveram as classificações de íleo maisbaixas em 0,16 e 0,15, respectivamente. Estes foram não significantementediferentes e demonstram eficácia da vacina em porcos a partir de porcastanto vacinada quanto não vacinadas. Grupos 2 e 5 tiveram classificaçõesde lesão do íleo de 0,85 e 2,35, respectivamente. Estes foram significante-mente diferentes (P < 0,05) e indicam que a vacinação da porca forneceualgum nível de proteção maternal (Grupo 2) e que os animais ingênuos fo-ram sensíveis à inoculação virulenta (Grupo 5). Grupos 4 e 5 também tive-ram classificações de íleo significantemente diferentes (P < 0,05) e confir-mam a eficácia da vacina em leitões vacinados ingênuos. As classificaçõesde íleo dos Grupos 1 e 2 também foram significantemente diferentes (P <0,05) e confirmam que a vacinação de porcos em porcas Lawsonia-positivasfornece um benefício significante (P < 0,05) além de imunidade maternal. Asmesmas tendências e significados também foram observados para as amos-tras de ílios em termos da porcentagem de animais positivos (total de positi-vo/grupo). Lesões de íleo foram encontradas em 80% dos porcos do Grupo5. Ao contrário, menos do que 16% dos animais tanto dos Grupos 1 quanto 4tiveram lesões de íleo.
Com respeito ás classificações da lesão macroscópica do cólone a porcentagem de animais positivos, houve uma diferença significante (P <0,05) entre o Grupo 4 e Grupo 5. Não houve nenhuma outra diferença signi-ficante entre grupos de tratamento. Os controles estritos (Grupos 3 e 6) fo-ram negativos para lesões macroscópicas no íleo e cólon e confirmam destemodo a validade do estudo. Resultados destes testes são fornecidos abaixona Tabela 2.
Tabela 2: Sumário das classificações da lesão macroscópica entre gruposde tratamento em porcos
Comparação dos b Grupos 1 e 2 é significantemente (P < 0,05) diferente.
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Métodos IHC e H&E foram usados para avaliar desenvolvimentode lesão de leitão microscópica. Seções de 2 a 4 cm em comprimento daamígdala, Iinfonodo mesentérico, íleo terminal, e cólon foram coletados notérmino do estudo (dia 63) e colocados em 10% de formalina tamponadapara a análise de IHC. Lawsonia não foi detectada por coloração em IHCdas seções da amígdala em quaisquer grupos de tratamento no término doestudo. Lawsonia foi detectada em 2/20 das amostras de Iinfonodo mesenté-rico do grupo 5. Todas as outras amostras de Iinfonodo mesentérico em to-dos os outros grupos foram negativas e não houve nenhuma diferença signi-ficante entre os grupos de tratamento em relação ao teste de Iinfonodo me-sentérico.
Grupos 1 e 4 tiveram classificações microscópicas de íleo de0,35 e 0,15, respectivamente, e não foram significantemente diferentes.Grupo 5 teve a classificação microscópica de íleo mais alta em 2,42 e foisignificantemente (P < 0,05) diferente do que ambos os grupos de tratamen-to Grupo 2 e 4. Isto demonstra que existe algum nível de imunidade maternalno Grupo 2 e que a vacina fornece eficácia em porcos vacinados ingênuos.
Avaliação da porcentagem de amostras de ílios com lesões microscópicasindicou que 95% dos porcos no Grupo 5 tiveram lesões e este grupo é no-vamente significantemente (P < 0,05) diferente dos Grupos 2 e 4.
Grupo 5 teve uma classificação microscópica do cólon média de1,35 e 60% dos animais neste grupo de tratamento foram positivas para de-tecção da lesão por Lawsonia. Este foi significantemente (P < 0,05) mais doque ambos os grupos de tratamento Grupo 2 e 4. Os dados macroscópicossão resumidos na Tabela 3.
Tabela 3: Sumário das lesões microscópicas em tecidos de porco no términodo estudo
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d Comparação dos Grupos 2 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente.e Comparação dos Grupos 4 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente.f Grupo não incluído na análise estatística como indicado no protocolo.'Amostra 1 teve necrose e esfolamento severos e não pode ser lida por IHC.
De modo a avaliar o derramamento fecal do leitão de Lawsoniapor f-PCR, esfregaços fecais foram coletados semanalmente de todos osanimais de teste em cada grupo de tratamento e testados quanto à presençade L intracellularis por Ileitis PCR nos dias 21, 28, 35, 42, 49, 56, e 63 doestudo. Nos dias 21, 28, e 35, leitões em todos os grupos de tratamento fo-ram f-PCR negativos para L. intracellularis. Leitões do Grupo 1 foram detec-tados como f-PCR positivos no dia 42 e permaneceram positivos até o dia 63com 11a 16% dos leitões verificando-se positivos durante este período detempo. Leitões do Grupo 2 foram detectados como f-PCR positivos no dia 49e permaneceram positivos até o dia 63 com 5 a 25% dos leitões verificando-se positivos durante este período de tempo. Leitões do Grupo 4 foram detec-tados como f-PCR positivos no dia 42 e permaneceram positivos até o dia 63com 5 a 25% dos leitões verificando-se positivos durante este período detempo, respectivamente. Leitões do Grupo 5 foram detectados como f-PCRpositivos no dia 49 e permaneceram positivos até o dia 63 com 15 a 72%dos leitões verificando-se positivos durante este período de tempo. Leitõesdos Grupos 3 e 6 permaneceram f-PCR negativos para a duração da experi-ência. A análise qui-quadrado dos dados indica uma diferença significante (P< 0,05) entre os grupos 4 e 5 no dia 42, grupos 2 e 5 no dia 63, e grupos 4 e5 no dia 63. Os dados de derramamento fecal são resumidos na Tabela 4.
Tabela 4: Sumário de derramamento fecal de L intracellularis entre gruposde tratamento de porco
<table>table see original document page 31</column></row><table>
a Comparação global não é significantemente diferente por teste qui-quadrado.
d Comparação dos Grupos 2 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
e Comparação dos Grupos 4 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
f Grupo não incluído na análise estatística como indicado no protocolo.
A colonização do tecido de Lawsonia (t-PCR) em porcos foi ava-liada no término do estudo (dia 63) por teste de PCR das seções de tecidodo íleo terminal, cólon, amígdala, e Iinfonodo mesentérico. O controle estrito(Grupos 3 e 6) foi t-PCR negativo para a detecção de Lawsonia e confirmadeste modo a validade da fonte de porco e estudo. Todas as amostras deamígdala foram t-PCR negativas. Apenas as amostras de cólon e Iinfonodomesentérico do Grupo 5 foram positivas, com 5 a 10% dos leitões verifican-do-se positivos. As amostras de ílios dos leitões dos Grupos 1 e 2 tiveramresultados do teste em 20% e 25% t-PCR positivos, respectivamente. Emcomparação, leitões dos Grupos 4 e 5 tiveram dos resultados do teste em5% e 45% t-PCR positivos, respectivamente. Todas as amostras de ílios dosGrupos 3 e 6 foram t-PCR negativas. A análise qui-quadrado não indicounenhuma diferença significante entre grupos de tratamento nas amostras deamígdala, Iinfonodo mesentérico, ou cólon. Houve uma diferença significante(P < 0,05) entre os Grupos 4 e 5 nos resultados de t-PCR do íleo, com oGrupo 5 tendo a porcentagem positiva mais alta na experiência. Os dadosdeste teste são resumidos na Tabela 5.
Tabela 5: Resumo da colonização de tecido de L. intracellularis entre gruposde tratamento de porco (positivo/grupo total)
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a Comparação global não é significantemente diferente por teste qui-quadrado.
e Comparação dos Grupos 4 e 5 é significantemente ( < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
f Grupo não incluído na análise estatística como indicado no protocolo.
ADWG foi calculado a partir do tempo de vacinação (dia 21), pa-ra a administração da inoculação (dia 42), ao término do estudo (dia 63), eentre inoculação (dia 42) e término do estudo (dia 63). No dia da vacinação(dia 21), não houve nenhuma diferença significante entre grupos de trata-mento. Similarmente, não houve nenhuma diferença significante a seguir davacinação do dia 21 ao dia 42. Um tal resultado confirma que a vacina é se-gura e não afeta o desenvolvimento como medido pelo ganho de peso. Aseguir da inoculação virulenta, houve diferenças significantes (P < 0,05) emADWG entre os Grupos 1 e 4, Grupos 2 e 5, e Grupos 4 e 5. O Grupo 5 teveo ADWG mais baixo no estudo em 0,88 Ib/dia. A avaliação qui-quadrado doperíodo de tempo a partir da vacinação através de inoculação e até o tempode término do estudo também indicou uma diferença significante (P < 0,05)entre os Grupos 1 e 4 e Grupos 4 e 5. Estes dados são resumidos abaixo na
Tabela 6.
Tabela 6: Ganhos de peso diários médios (ADWG) de porcos
<table>table see original document page 33</column></row><table>
a Comparação global não é significantemente diferente por teste qui-quadrado.
c Comparação dos Grupos 1 e 4 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
d Comparação dos Grupos 2 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
e Comparação dos Grupos 4 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
f Grupo não incluído na análise estatística como indicado no protocolo.
Observações clínicas dos leitões foram registradas em uma ba-se diária para cada animal do dia de inoculação (dia 42) ao término do estu-do (dia 63). Classificações clínicas foram calculadas para obter uma classifi-cação clínica diária média que reflete a severidade e duração da doença en-tre grupos de tratamento devido à inoculação por um isolado de Lawsoniavirulenta. Uma classificação de 3 foi indicativo de um animal normal, saudá-vel. Houve poucas classificações clínicas outras que não "3" em qualquer umdos Grupos a seguir da inoculação virulenta, e não houve uma diferença signifi-cante entre qualquer um dos grupos de tratamento. Classificações clínicas mé-dias para cada grupo de tratamento são resumidas abaixo na Tabela 7.
Tabela 7: Classificações clínicas médias de porcos
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a Comparação global não é significantemente diferente.
f Grupo não incluído na análise estatística como indicado no protocolo.
Avaliação sorológica do leitão por intermédio de teste de IFATquanto à presença de anticorpos IgG anti-Lawsonia foi realizada nas amos-tras de soro que foram coletadas semanalmente de todos os animais de tes-te. As amostras de soro foram coletadas nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49,56, e 63. Antes da inoculação, alguns leitões nos Grupos 1 a 3 foram soro-positivos para Lawsonia, confirmando deste modo que alguma imunidadematernal foi induzida durante a vacinação da porca. Ao contrário, todos osleitões nos Grupos 4 a 6 foram soronegativos para Lawsonia. Leitões noGrupo 1 tiveram números significantemente mais altos (P < 0,05) de animaissoropositivos, quando comparado ao Grupo 4, no dia do parto e nos dias 7 e14. Leitões no Grupo 1 também foram significantemente diferentes (P <0,05) do Grupo 2 no dia 63 da experiência. O Grupo 2 teve números signifi-cantemente mais altos (P < 0,05) de animais soropositivos, quando compa-rado ao Grupo 5, nos dias 7, 14, e 28. A detecção do anticorpo maternalcontinuou até o dia 28 nos Grupos 1 a 3. Todos os animais nos Grupos 1 a 3foram soronegativos no dia 35. A seguir da inoculação virulenta, houve al-guma soroconversão detectada nos Grupos 1, 2, 4, e 5. Houve uma diferen-ça significante (P < 0,05) observada entre os Grupos 1 e 4 no dia 56 da ex-periência. Taxas de soroconversão para cada grupo são resumidas abaixona Tabela 8.
Tabela 8: Resumo de taxas de soroconversão entre grupos de tratamento deporco
<table>table see original document page 35</column></row><table>
a Comparação global não é significantemente diferente por teste qui-quadrado.
b Comparação dos Grupos 1 e 2 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
c Comparação dos Grupos 1 e 4 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
d Comparação dos Grupos 2 e 5 é significantemente (P < 0,05) diferente porteste qui-quadrado.
f Grupo não incluído na análise estatística como indicado no protocolo.
* Morte de animal ocorreu neste grupo de tratamento.Debate
Este estudo avaliou asegurança de uma vacina contra Lawsoniaem porcas a seguir de doses repetidas, de título alto da vacina durante osegundo e terceiro estágios de gestação, que foram intencionados a induzirum nível alto de resposta do anticorpo maternal. Não houve nenhuma Law-sonia detectada nos tecidos por IHC1 t-PCR, ou indicações de infecção porLawsonia como medido por patologia macroscópica em qualquer uma dasporcas vacinadas. Além disso, não houve nenhum derramamento fecal deLawsonia detectado em qualquer uma das porcas vacinadas. Finalmente,porcas vacinadas tiveram números numericamente mais altos de leitões vi-vos saudáveis. Conseqüentemente, todas as indicações são que a vacina ésegura em animais prenhes.
Este estudo complexo envolveu tanto porcas Lawsonia-positivas(Grupo A) quanto Lawsonia-negativas (Grupo B), das quais os leitões pari-dos foram subseqüentemente vacinados (Grupos 1 e 4) ou não vacinados(Grupos 2 e 5). Leitões nos Grupos 3 e 6 serviram como controles estritos enão receberam nenhuma exposição ao tratamento ou inoculação. Análisedos dados e conclusões subseqüentes foram feitas comparando-se os gru-pos de tratamento que variaram em apenas uma única variável (vacinaçãodo leitão ou vacinação da porca).
A eficácia da vacina em leitões ingênuos confirma que a fonte deporco foi suscetível, e que a vacinação destes leitões forneceu eficácia con-tra inoculação heteróloga virulenta. Isto requer uma comparação do Grupo 4(vacinado) e Grupo 5 (não vacinado), ambos dos quais foram derivados deporcas Lawsonia-negaWvas. Os dados indicaram que o Grupo 4 foi signifi-cantemente diferente (P < 0,05) do Grupo 5 em classificações macroscópi-cas de íleo médias, classificações macroscópicas de cólon médias, derra-mamento fecal (f-PCR), colonização do tecido do íleo (t-PCR) e ADWG. Co-mo uma observação marginal, este estudo também confirma que EnterisolIleitis B3903 fornece proteção eficaz depois de uma única administração. Eleainda confirma e valida que a fonte de porcos usada na experiência foi sus-cetível à exposição à inoculação virulenta heteróloga.
A comparação do Grupo 2 (leitões da porca do Grupo A) e Gru-po 5 (leitões da porca do Grupo B) permitiu a avaliação de proteção maternalpotencial derivada da vacinação da porca. Os dados indicaram que houvediferenças significantes (Ρ < 0,05) entre Grupos 2 e 5 em classificações ma-croscópicas do íleo médias, classificações microscópicas de íleo e cólonmédias, derramamento fecal (f-PCR), ADWG, e sorologia. Estes dados tam-bém indicaram que houve alguma forma de imunidade maternal que forneceproteção contra exposição à inoculação virulenta durante pelo menos seissemanas depois do nascimento. O estudo mediu ainda a sorologia (IFA) edescobriu que leitões soropositivos podem ser detectado nos Grupos 1 a 3do dia do parto até o dia 28. Em uma observação interessante, no dia deinoculação, todos os porcos em todos os grupos foram soronegativos usan-do o ensaio IFA, possivelmente significando que o ensaio usado nesta expe-riência não fornece nenhum um indicador exato de imunidade contra exposi-ção à Lawsonia virulenta. Dada a natureza do agente etiológico como umpatógeno mucoso e o uso de uma vacina viva avirulenta, é possível que al-guma forma de imunidade celular pode ser um fator.
Um outro objetivo deste estudo foi determinar se a vacinaçãoeficaz em virtude de imunidade maternal pode ser realizada ou não por vaci-nação de leitões mais no início do que é convencionalmente recomendadoou feito. Para este teste, a vacinação eficaz de leitões de 16 a 26 dias deidade foi confirmada. Esta determinação foi feita comparando-se o Grupo 1(leitões vacinados da porca do Grupo A) e Grupo 2 (leitões não vacinados daporca do Grupo A). Os parâmetros primários usados para a comparação fo-ram macroscópicas e microscópicas associadas com o íleo e cólon. As clas-sificações macroscópicas do íleo médias foram 0,16 e 0,85 para Grupos 1 e2, respectivamente, que foi significantemente diferente (P < 0,05). A porcen-tagem de amostras de íleos com lesões macroscópicas foi de 16% e 45%para Grupos 1 e 2, respectivamente, e esta também foi significantementediferente (P < 0,05). Leitões do Grupo 1 também tiveram numericamente,embora não estatisticamente diferente, classificações macroscópicas do có-lon mais baixas, lesões microscópicas mais baixas do íleo e cólon, e menoscolonização de tecido (t-PCR). No total, estes dados confirmam que a vaci-nação fornece proteção eficaz acima e além de imunidade maternal sozinha.
Todas mas uma das comparações de grupo diferente debatidasacima foram fundamentadas em uma única variável de estudo, vacinação daporca ou vacinação do leitão, mas não ambos. A comparação entre os Gru-pos 1 e 5 requereu a avaliação dos dados em virtude de duas variáveis deestudo (vacinação da porca e vacinação do leitão). É observado que Grupos2 e 5 foram estatisticamente diferentes (P < 0,05) em alguns parâmetros enumericamente mais baixos em vários outros. Pode ser razoavelmente con-siderado que Grupos 1 e 5 seriam estatisticamente diferentes na maioria dosparâmetros de estudo como Grupos 2 e 5. Em resumo, Grupos 1 e 5 foramdeterminados serem significantemente diferentes (P < 0,05) em numerososparâmetros incluindo os parâmetros de estudo primários de classificaçõesmacroscópicas do íleo, classificações microscópicas do íleo, e classificaçõesmicroscópicas do cólon.
Finalmente, Grupos 3 e 6 (os grupos de controle estritos) confir-maram o estado do porco em relação a Lawsonia e validaram as fontes doporco. Estes grupos não foram incluídos na análise estatística. Todos os pa-râmetros medidos e avaliados confirmam que estes animais foram Lawso-nia-negativos, exceto para as classificações de lesão microscópica de umúnico porco do Grupo 6, que foi classificado como sendo Lawsonia-positivo.Com base nos dados cumulativos de todos os outros parâmetros, acredita-se que isto foi um erro.
Claims (48)
1. Método de fornecer proteção aumentada contra infecção porLawsonia intracellularis em um animal compreendendo as etapas de:administrar um dose eficaz de uma vacina contra Lawsonia in-tracellularis ao dito animal dentro de 26 dias depois do nascimento.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, a dita vacina contraLawsonia intracellularis compreendendo antígeno de Lawsonia intracellularis.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 2, a dita dose eficaz compreendendo entre cerca de 103 a cerca de 109 debactéria Lawsonia intracellularis por dose.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 3, a dita dose eficaz compreendendo entre 3,0 TCID50 a cerca de 6,0TCID50 de bactéria Lawsonia intracellularis por dose.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, o dito animal sendo um porco.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 5, a dita vacina sendo administrada ao dito animal entre 16 e 26 dias de-pois do nascimento.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 6, a dita vacina sendo administrada ao dito animal entre 19 e 22 dias de-pois do nascimento.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 7, a dita administração compreendendo uma única dose da dita vacina.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 8, a dita administração sendo por dose oral.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, compreendendo ainda a etapa de vacinar a mãe do dito animal com adita vacina enquanto a dita mãe estiver prenhe do dito animal.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, a dita vacinaçãoocorrendo durante o segundo ou terceiro estágios de gestação do dito animal.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 e 11, a dita mãe sendo vacinada com doses repetidas de vacina antes deparir o dito animal.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, a dita mãe rece-bendo três vacinações com a dita primeira vacinação ocorrendo entre 50 e60 dias antes de parir o dito animal.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, a dita segundavacinação ocorrendo entre 30 e 40 dias antes de parir o dito animal.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-13 e 14, a dita terceira vacinação ocorrendo entre 10 e 20 dias antes de pariro dito animal.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-10 a 15, a dita vacinação sendo com uma dose alta de antígeno de Lawso-nia intracellularis.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, a dita dose altacompreendendo uma quantidade de antígeno de Lawsonia intracellularis queé pelo menos três vezes mais alta do que quantidades convencionais de an-tígeno de Lawsonia usado em vacinas.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-10 a 17, o dito antígeno sendo selecionado do grupo consistindo em bacté-rias Lawsonia intracellularis modificadas vivas, bactérias Lawsonia intracellu-Iaris mortas, uma ou mais subunidades de bactérias Lawsonia intracellularis,e combinações destes.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, as ditas bactériasLawsonia intracellularis modificadas vivas sendo selecionadas do grupo con-sistindo em Acesso ATCC N2 PTA-4926, Acesso ATCC N2 55783, e combi-nações destes.
20. Método de fornecer proteção aumentada contra ileíte em umleitão compreendendo a etapa de vacinar uma porca prenhe do dito leitãocom uma dose eficaz de uma vacina contra infecção por Lawsonia intracellu-laris, a dita vacinação da dita porca ocorrendo no segundo ou terceiro está-gio de gestação.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, a dita vacinaçãoocorrendo até 60 dias antes de parir o dito leitão.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 e 21, a dita porca sendo vacinada com doses repetidas de vacina antesde parir o dito leitão.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 22, a dita porca recebendo três vacinações com a dita primeira vacina-ção ocorrendo entre 50 e 60 dias antes de parir o dito leitão.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, a dita segundavacinação ocorrendo entre 30 e 40 dias antes de parir o dito leitão.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 e 24, a dita terceira vacinação ocorrendo entre 10 e 20 dias antes de pariro dito leitão.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 25, a dita vacinação sendo com uma dose alta de antígeno de Lawso-nia intracellularis.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, a dita dose altacompreendendo uma quantidade de antígeno de Lawsonia intracellularis queé pelo menos três vezes mais alta do que quantidades convencionais de an-tígeno de Lawsonia usado em vacinas.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, o dito antígeno sendo selecionado do grupo consistindo em bacté-rias Lawsonia intracellularis modificadas vivas, bactérias Lawsonia intracellu-laris mortas, uma ou mais subunidades de bactérias Lawsonia intracellularis,e combinações destes.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, as ditas bactériasLawsonia intracellularis modificadas vivas sendo selecionadas do grupo con-sistindo em Acesso ATCC N2 PTA-4926, Acesso ATCC Ns 55783, e combi-nações destes.
30. Uso medicinal de uma quantidade eficaz de antígeno deLawsonia intracellularis para a preparação de um medicamento para vacinaranimais jovens com uma dose eficaz de uma vacina eficaz para fornecerproteção aumentada contra infecção por Lawsonia intracellularis, os ditosanimais jovens estando entre 10 e 26 dias de idade.
31. Uso medicinal de acordo com a reivindicação 30, os ditosanimais jovens compreendendo leitões.
32. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 e 31, a dita dose eficaz compreendendo entre cerca de 103 acerca de 109 da bactéria por dose.
33. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 a 32, a dita dose eficaz compreendendo entre 3,0 TCID50 a cercade 6,0 TCID50 por dose.
34. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 a 33, o dito animal jovem sendo um leitão.
35. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 a 34, a dita vacina sendo administrada ao dito animal jovem en-tre 16 e 26 dias depois do nascimento.
36. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 a 35, a dita vacina sendo administrada ao dito animal jovem en-tre 19 e 22 dias depois do nascimento.
37. Uso medicinal de acordo com qualquer uma dás reivindica-ções de 30 a 36, a dita etapa de vacinação compreendendo a administraçãode uma única dose da dita vacina.
38. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 a 37, a dita etapa de vacinação incluindo a etapa de administrara dita vacina por dose oral.
39. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 30 a 38, compreendendo ainda a etapa de vacinar a mãe do ditoanimal jovem com o dito medicamento enquanto a dita mãe estiver prenhedo dito animal jovem.
40. Uso medicinal de acordo com a reivindicação 39, a dita vaci-nação ocorrendo durante o segundo ou terceiro estágios de gestação do ditoanimal jovem.
41. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 39 a 40, a dita mãe sendo vacinada com doses repetidas de vacinaantes de parir o dito animal jovem.
42. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 39 a 41, a dita mãe recebendo três vacinações com a dita primeiravacinação ocorrendo entre 50 e 60 dias antes de parir o dito animal jovem.
43. Uso medicinal de acordo com a reivindicação 42, a dita se-gunda vacinação ocorrendo entre 30 e 40 dias antes de parir o dito animaljovem.
44. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 42 e 43, a dita terceira vacinação ocorrendo entre 10 e 20 dias an-tes de parir o dito animal jovem.
45. Uso medicinal de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 39 a 44, a dita vacinação sendo com uma dose alta de antígeno deLawsonia intracellularis.
46. Uso medicinal de acordo com a reivindicação 45, a dita dosealta compreendendo uma quantidade de antígeno de Lawsonia intracellularisque é pelo menos três vezes mais alta do que quantidades convencionais deantígeno de Lawsonia usado em vacinas.
47. Uso medicinal de acordo com a reivindicação 46, o dito antí-geno sendo selecionado do grupo consistindo em bactérias Lawsonia intra-cellularis modificadas vivas, bactérias Lawsonia intracellularis mortas, umaou mais subunidades de bactérias Lawsonia intracellularis, e combinaçõesdestes.
48. Uso medicinal de acordo com a reivindicação 47, as ditasbactérias Lawsonia intracellularis modificadas vivas sendo selecionadas dogrupo consistindo em Acesso ATCC N2 PTA-4926, Acesso ATCC N2 55783,e combinações destes.
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