VACUNA DE LAWSONIA Y MÉTODOS DE USO DE LA MISMA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención está relacionada de forma general con métodos mejorados de vacunación para la inmunización contra la enteriíis proliferaíiva porcina, conocida como ileílis, que es provocada por una bacteria intracelular obligada, la Lawsonia intracellularis (Lawsonia o L. intracellularis). Específicamente, la invención proporciona métodos para proporcionar una proíección ¡ncremeníada coníra L. intracellularis mediante la vacunación de cerdas preñadas; mediante la vacunación de cerdas preñadas y posterior vacunación de los cochinillos en aproximadamenle las primeras íres semanas de vida, y medianíe la vacunación de cochinillos en los primeros 25 ó 26 días de vida, respeclivamenle. Descripción de la Técnica Aníerior La enteritis proliferativa porcina (PPE) es una enfermedad naíural que puede afeclar a los cerdos desde las elapas de destelado hasla las de adulto joven. Se ha determinado que el agente causante es la Lawsonia intracellularis, una bacteria intracelular obligada, gram-negativa, que no puede ser cullivada empleando métodos bacteriológicos normales o medios convencionales libres de células, y se cree que es necesario que haya células para su crecimienlo. S. McOrisl y col., Infection and Immunity, Vol. 61 , N° 19, 4286-4292 (1993) y G. Lawson y col., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31 , N° 5, 1136-1142 (1993) discuten la cultivación de L. intracellularis usando monocapas de células epiteliales de iniesiino de rata IEC-18 en matraces convencionales de cultivo de tejidos. En las Patentes de EE.UU. N° 5.714.375 y 5.885.823, ambas incorporadas por completo a la preseníe memoria a modo de referencia, se describe el cullivo de L intracellularis en células hospedantes suspendidas. En el estado de la técnica se conocen bien las cepas de bacterias L. intracellularis patogénicas y no patogénicas atenuadas. Por ejemplo, los documentos WO 96/39629 y WO 05/011731 describen cepas no patogénicas atenuadas de L. intracellularis. Otras cepas de bacterias atenuadas de . intracellularis son descritas en los documentos WO 02/26250 y WO 03/00665. Las enseñanzas y contenidos de cada una de eslas referencias se incorporan por referencia en esía memoria. La enfermedad se caracteriza en primer lugar por su patología macroscópica y microscópica, y más farde por la presencia de la bacleria ¡nlracelular deníro de las células afecíadas. La característica patológica caracleríslica de la enfermedad es la proliferación de células epiteliales inmaduras en las criptas del íleon (parte final del iníesíino delgado), del intestino grueso o de ambos. Las secciones de tejido infeclado se caracterizan por una mucosa engrosada enrojecida que se parece a una "manguera de jardín", y lesiones intestinales. El engrosamiento del intestino previene en última inslancia la función normal del iniesiino, las capacidades de absorción, y la transferencia de nutrientes. Los efectos clínicos de la enfermedad son pérdida de peso crónica, incapacidad de que un animal joven crezca o gane peso a la razón promedio acosíumbrada ("uníhriftiness"), diarrea, y muerte. La enfermedad es de importancia económica debido a la perdida por muertes, el aumento de costes de medicación, la escasa ganancia de peso y la disminución de conversión del alimento en los animales afeclados. Los casos clínicos de ileííis se observan especialmente en cerdos de 6-20 semanas de edad. Sin embargo, la presencia de L. intracellularis se ha confirmado (medíanle PCR) en cerdos recientemente destelados (3-4 semanas de edad), lo que sugiere que la exposición a L. intracellularis liene lugar en el criadero y quizás es originada a partir de madres positivas en Lawsonia (Mauch y Bilkei (2004) Vet Rec 155: 532; Marsteller et al. (2003). Swine Health Prod 11 :127-130; Stege y col. (2004). Veí Micro 104: 197-206). Esías observaciones subrayan la importancia de la incorporación de eslraíegias de prevención lales como la vacunación temprana en el sistema de producción. Las actuales estrategias de vacunación para la inmunización contra la ileítis implican la administración oral de la vacuna a cerdos sensibles a Lawsonia desde tan sólo tres semanas de edad en adelante, debido a que los cochinillos por debajo de esíe grupo de edad podrían presenlar anlicuerpos maternos posilivos para la L. intracellularis debido a una exposición o vacunación previa de la cerda. Aníes del méíodo de la presente invención se creía que la presencia de anlicuerpos maternos o de oíros factores laclogénicos podría interferir polencialmeníe con la eficacia de las vacunaciones de los cochinillos, debido a que los anticuerpos maternales lienen la capacidad de neuíralizar la vacuna antes de que el sistema inmune del cochinillo pueda reconocerla y comenzar a segregar sus propios anticuerpos. Por lo tanto, la vacunación de cochinillos jóvenes se ha evitado en favor de la inmunidad materna. INVENCIÓN La presente invención supera las deficiencias de la técnica anterior y proporciona nuevos métodos para proporcionar protección en cerdos contra la ileítis. En particular, la presente invención proporciona un méíodo para adminisírar una canlidad inmunológicamenle eficaz de vacuna a cerdas, y/o a cochinillos jóvenes en las primeras semanas de edad, con el fin de inmunizarlos coníra la ileítis. Se descubrió que la transferencia de inmunidad materna desde una cerda vacunada conlra Lawsonia, o expuesto a ella, a los cochinillos proporciona algo de prolección conlra la ileítis en los cochinillos durante al menos 5 6 semanas después del nacimiento. Sin embargo, a menos que fueran vacunados, rápidamente se volvían suscepíibles a la enfermedad. Los méíodos de la preseníe invención demostraron que el uso de la vacuna en animales preñados en dosis elevadas, después de dosis repetidas, e incluso cuando se adminisíraba duraníe la segunda o la tercera eíapa de geslación, era
sorprendentemente seguro y eficaz para proporcionar inmunidad materna. Por íanlo, la preseníe invención se refiere de forma general a un mélodo para la vacunación de animales preñados (preferiblemente cerdos) contra las infecciones de L. intracellularis, en el que dichos animales preñados son vacunados con antígeno de L. intracellularis. De acuerdo con un aspecto
! 5 adicional, la vacunación se realiza con altas dosis y/o con dosis repetidas de antígeno de L intracellularis. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la vacunación de animales preñados (preferiblemente cerdos) contra infecciones de L. intracellularis, en el que dichos animales preñados son vacunados durante la segunda o la tercera elapa de geslación,
2 o preferiblemente dichos animales preñados son vacunados con altas dosis y/o con repetidas dosis de antígeno de L. intracellularis. En una realización preferida, se proporciona un método para vacunar cerdos conlra la ileííis mediante la adminisíración de una vacuna de Lawsonia a una cerda preñada al menos una vez aníes del parto, preferiblemente 5 dos veces antes del parto y más preferiblemente íres veces antes del parto ("dosis repelidas"). En algunas formas, las cerdas preñadas se vacunan con alias dosis del anlígeno de L. intracellularis. Cuando la vacuna se administra a la cerda tres veces, la primera adminislración debería producirse entre 50 y 60 días antes del parto, preferiblemente entre 52 y 58 días antes del parto, y más preferiblemente entre 54 y 56 días antes del parto. La segunda adminislración debería producirse enlre 30 y 40 días antes del parto, preferiblemeníe enlre 32 y 38 días antes del parto, y más preferiblemente eníre 34 y 36 días antes del parto. La adminisíración final debería producirse enlre 10 y 20 días aníes del parto, preferiblemente eníre 12 y 18 días aníes del parto, y más preferiblemente eníre 14 y 16 días antes del parto. Una vez la cerda ha dado a luz se adminislra la vacuna a cada uno de los cochinillos, después de que son destelados y hasla la matanza, pero preferiblemente antes de que alcancen las tres semanas de edad, en cualquier caso, al menos en los primeros 10 a 25-26 días de edad, respectivamente (preferiblemente enlre 16 y 26 días de edad), más preferiblemente enlre 10 y 21 días de edad, incluso más preferiblemente enlre 15 y 21 días de edad, y aún más preferiblemeníe enlre 19 y 21 días de edad. En oíra realización de este mélodo, la vacuna se adminislra a cada uno de los cochinillos antes de los 26 días de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 18 y los 24 días de edad, aún más preferiblemente entre los 19 y los 22 días de edad, y aún más preferiblemente a los 21 días de edad. Por tanto, en otra realización la presente invención proporciona un mélodo para vacunar cerdas preñadas así como cochinillos recién nacidos. Preferiblemente, las cerdas preñadas y los cochinillos recién nacidos se vacunan como se ha descrito anteriormente.
También se descubrió que la inmunidad materna, inesperadamente, no interfiere con la vacunación exitosa de los cochinillos al poco de nacer, y de hecho los cochinillos vacunados en las primeras íres semanas después del parto, tal como se describe en la presente memoria, presenían menos patología macroscópica asociada a la enfermedad en comparación con los cochinillos no vacunados. Por íanlo, la presente invención se refiere a un méíodo para la vacunación de animales jóvenes (preferiblemeníe de cochinillos jóvenes) en las primeras fres semanas desde el parto coníra infecciones de L. intracellularis. Preferiblemeníe, dichos animales jóvenes (preferiblemente cochinillos jóvenes) se vacunan a la edad de 21 a 5 días. Incluso más preferiblemente, dichos animales jóvenes (preferiblemente cochinillos jóvenes) se vacunan respeclivameníe a la edad de 10 a 25 y 26 días. Incluso más preferiblemente, dichos animales jóvenes (preferiblemente cochinillos jóvenes) se vacunan a la edad de 10 a 21 días. Incluso más preferiblemente, dichos animales jóvenes (preferiblemente cochinillos jóvenes) se vacunan respectivameníe a la edad de 12 a 21 días. Incluso más preferiblemente, dichos animales jóvenes (cochinillos jóvenes preferiblemente) se vacunan respeclivamenle a la edad de 15 a 21 días, más preferiblemente a la edad de 19 a 21 días. En oíra realización de este méíodo, la vacuna se adminisíra a cada uno de los cochinillos antes de los 26 días de edad, preferiblemente enlre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente eníre los 18 y los 24 días de edad, aún más preferiblemente enlre los 19 y los 22 días de edad, y aún más preferiblemeníe a los 21 días de edad. La vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier vacuna que proporcione prolección coníra L. intracellularis. Preferiblemente, la vacuna es una vacuna de virus vivo de L. intracellularis. Más preferiblemente, la vacuna es Eníerisol® lleilis B3903 (Boehringer Ingelheim Velmedica, Inc.). La vacuna se adminislra a animales, preferiblemente a mamíferos, y aún más preferiblemente a cerdos, en cualquier modo convencional, más preferiblemente mediante un empapado oral. La dosificación que se va a adminislrar dependerá del caso particular, pero en cualquier caso, es la canlidad suficiente para inducir una respuesta inmune de anticuerpo protector y/o mediado por células contra la ileítis. La dosificación apropiada puede determinarse empleando medios conocidos en la lécnica sin necesidad de experimenlación indebida, y casi siempre será contingente con la vacuna concreta uíilizada. En muchos casos, una dosificación adecuada oscila eníre 0.1 mL y 10 mL, y preferiblemeníe eníre aproximadameníe 1 mL y 5 mL. En el caso de Enlerisol® lleilis, la dosificación es preferiblemente al menos 2 mL por cerdo. También se pueden calcular las dosis en una base de peso seco por peso del cerdo para preparar vacunaciones no acuosas. Los estudios presentados en los ejemplos moslrados a conlinuación fueron llevados a cabo para evaluar la eficacia de la vacuna en cerdos derivados de cerdas expuestos a Lawsonia intracellularis y de cerdas negalivas en Lawsonia. Además, los esludios evaluaron si exislía alguna interferencia materna procedente de la vacunación de los cochinillos de íres semanas de edad. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "vacunación" o "vacunar" como se uliliza en la presente memoria significa, pero no está limitado a ello, un procedimienlo que incluye la adminisíración de un anlígeno de L. intracellularis a un animal, en el que dicho anlígeno de L. intracellularis, cuando se adminisíra a dicho animal provoca o es capaz de provocar una respuesla inmunilaria en dicho animal coníra la . intracellularis. El término "animal" tal como se usa en la presente memoria, significa aunque sin limitarse a ellos, pájaros, peces y mamíferos tales como ganado, cerdos, caballos y primates. Sin embargo, de acuerdo con una realización preferida de la preseníe invención, el animal es un cerdo, preferiblemeníe un cochinillo de 10 a 25 y 26 días de edad, respeclivamenle, preferiblemente enlre 10 y 21 días de edad, incluso más preferiblemente enlre 15 y 21 días de edad, y aún más preferiblemente enlre 19 y 21 días de edad. En olra realización preferida, el cochinillo íiene menos de 26 días de edad, preferiblemeníe eníre 16 y 26 días de edad, más preferiblemente enlre 18 y 24 días de edad, aún más preferiblemente eníre 19 y 22 días de edad, y aún más preferiblemeníe 21 días de edad. El término "una dosis eficaz" o "dosificación eficaz" lal como se usa en la présenle memoria significa, aunque sin limitarse a ello, una cantidad de antígeno que provoca o que es capaz de provocar una respuesta inmune en un animal, al que se le administra dicha dosis eficaz de antígeno de L. intracellularis. Una "respuesta inmunológica o inmune" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Así, la terminología "provoca o es capaz de provocar una respuesla inmunilaria" significa, pero no está limitada a un proceso inmunológico en un anfitrión caracterizado por que dicho anfitrión desarrolla una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés.
Habitualmente, una "respuesta inmune" incluye, pero no se limita a ello, uno o más de los siguientes efectos: la producción o acíivación de anlicuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T ciíoíóxicas y/o células T yd, dirigidas específicamente a un aníígeno o anlígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemenle, el hospedanle exhibirá una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de modo que la resistencia a la nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Una protección de este lipo quedará demoslrada por una reducción, que incluye una reducción de la gravedad, o por la carencia de los síntomas asociados con infecciones de hospedante según se han descrito anteriormente. La canlidad de anlígeno que es eficaz para provocar una respuesta inmunitaria o es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un animal depende de los ingredientes de la vacuna y el programa de administración. Típicamente, cuando se usa antígeno bacteriano muerto en la vacuna, la vacuna contiene una cantidad de aproximadamenle 103 a aproximadamenle 109 bacterias por dosis, preferiblemente de aproximadamente 104 a aproximadamente 108 bacterias por dosis, y aún más preferiblemente de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 bacterias por dosis. En particular, cuando se usan bacterias L. intracellularis vivas modificadas en las vacunas, por ejemplo los elementos aislados de bacterias B3903, N° de acceso ATCC PTA-4926 y el elemento aislado designado N34NP40wk, N° de acceso ATCC 55783 (ambos descritos en el documenío WO 96/39629 y en el WO 05/011731 ), la dosis recomendada para ser adminisírada al animal susceplible es preferiblemeníe de aproximadamente 3.0 TCID50 (dosis infectiva de cultivo de tejido de punto final 50%)/dosis a aproximadamente 6.0 TCID50/dosis, y más preferiblemente de aproximadamente 4.0 TCID50/dosis a aproximadamente 5.0 TCID50/dosis. En una realización preferida, el título de la vacuna es aproximadamente 4.9 TCID50 /dosis según se determina por el ensayo de dilución de punto final de la Dosis Infecíiva del 50% de los Culíivos Tisulares inoculados (TCID50). Vacunas sub-unidad son adminisíradas normalmente con un nivel de inclusión de anlígenos de al menos 0.2 µg de aníígeno por dosis, preferiblemeníe con aproximadamenle 0.2 hasla aproximadamente 400 µg/dosis, todavía más preferiblemente con aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 200 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadameníe 0.35 hasla aproximadamenle 100 µg/dosis, aún más preferiblemente con aproximadamente 0.4 hasta aproximadamente 50 µg/dosis, aún más preferiblemente con aproximadamente 0.45 hasta aproximadamente 30 µg/dosis, aún más preferiblemente con aproximadamente 0.6 hasta aproximadamente 15 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0.75 hasta aproximadamente 8 µg/dosis, incluso más preferiblemeníe con aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 6 µg/dosis, y aún más preferiblemente con aproximadamenle 1.3 hasla aproximadamente 3.0 µg/dosis. En general, la cantidad de antígeno se encontrará entre 5 y 5000 microgramos, y entre 102 0 y 109 0 TCID50, preferiblemente enlre 1030 y 10 60 TCID50, más preferiblemenle enlre 10 40 y 10 50 TCID50, cuando se emplean bacterias purificadas. Tal como se usa en la presente memoria, el término "alias dosis" significa en general al menos íres veces la canlidad de anlígeno de una dosis sencilla usada normalmente para la vacunación de animales adultos. En particular, el término "alias dosis" significa en relación a L. intracellularis vivas modificadas una canlidad de al menos 3 x 1030 a 3 x 1090 TCID50> preferiblemente de aproximadamente 3 x 1045 a 3 x 1060 TCID50. En particular, el término "altas dosis" significa en relación a antígeno de L. intracellularis muertas una cantidad de al menos 3 x 1040 a 3 x 1090 organismos o bacterias, preferiblemente de aproximadamente 3 x 1060 a 3 x 1080 organismos o bacterias. En particular, el término "alias dosis" significa en relación a cualquier sub-unidad de antígeno de L. intracellularis una cantidad de al menos 3 x 0.2 a aproximadamente 3 x 400 (de 0.6 a aproximadamente 1200) µg/dosis. En esta solicitud, se administraron altas dosis de antígeno de L. intracellularis a cerdas preñadas con el fin de inducir una respuesta inmunológica aumentada en la cerda preñada que se íransmitiera al recién nacido y proporcionara algún grado de inmunidad a los cochinillos recién nacidos. Tal como se usa en la presente memoria, el término "dosis repetidas" significa la administración del antígeno de L. intracellularis en al menos dos veces, preferiblemente en tres veces. Anteriormente se han presentado ejemplos de un régimen de vacunación de "dosis repetidas" para cerdas preñadas. Tal como se usa en la presente memoria, el término "protección aumentada" significa, aunque sin limitarse a ello, una reducción significativa estadísticamente en la gravedad o en la frecuencia de uno o más síntomas clínicos y/o en el desarrollo de lesiones que están asociadas a infecciones de L. intracellularis (por ejemplo, la frecuencia de lesiones cruzadas determinada medianíe el méíodo definido en el Ejemplo 1 y según los criterios definidos en el mismo, ele.) en un grupo de animales vacunados frente a un grupo de animales de control no vacunados. El término "reducción estadísticamente significativa de los síntomas clínicos" significa, aunque no se limita a ello, que la frecuencia de la incidencia de al menos un síntoma clínico y/o desarrollo de lesión en el grupo de animales vacunados es al menos un 20%, preferiblemente un 30%, incluso más preferiblemente un 40%, aún más preferiblemente un 50%, incluso más preferiblemenle un 60%, aún más preferiblemeníe un 70%, incluso más preferiblemente un 80%, aún más preferiblemente un 90%, y todavía más preferiblemenle un 95% menor que en el grupo de conlrol no vacunado tras exposición a bacterias infecciosas de L. intracellularis. Tal como se usa en la presente memoria, el término "L. intracellularis" o "Lawsonia" significa la bacíeria ¡nlracelular curvada gram-negaliva descriía con delalle por C. Gebhart y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, N° 3, 533-538 (1993) y S. McOrisí y col., Iní'l. J. of Systemic Bacíeriology, Vol. 45, N° 4, 820-825 (1995), cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria a modo de referencia en su lolalidad, e incluye, pero no eslá limitada a ellos, los elementos aislados descritos en el documento WO 96/39629 y en el documenío WO 05/011731. En particular, la terminología " . intracellularis" íambién significa, pero no eslá limiíada a ellos, los elementos aislados depositados bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 y con número de regislro de la ATCC asignado PTA 4926 o número de regisíro de la ATCC 55783. Ambos elementos aislados se describen en el documento WO 96/39629 y en el documento WO 05/011731 , respeclivameníe. El término "L intracellularis" lambién significa, aunque no eslá limitado a ello, cualquier otra cepa de bacterias L. intracellularis, o elemento aislado, que tenga preferiblemente las propiedades inmunogénicas de al menos una de las cepas de L intracellularis descritas en el documento WO 96/39629 y en el WO 05/011731 , que tenga en particular las propiedades inmunogénicas de al menos uno de los elementos aislados del Tratado de Budapest con el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 y que tenga asignado el número de acceso ATCC PTA 4926 o el número de acceso ATCC 55783. Una cepa o elemento aislado íiene las "propiedades inmunógenas" de al menos una de las cepas de L. intracellularis descriías en el documenío WO 96/39629 y en el documento WO 05/011731 , en particular, de los elementos aislados deposiíados como número de acceso ATTC PTA 4926 o número de acceso ATCC 55783, cuando es deíecíable al menos con uno de los aníicuerpos específicos aníi- .intracellularis, descritos en el documento WO06/01294, en un ensayo de de ección que lambién se describe en el documento WO06/01294. Preferentemente estos anticuefos se seleccionan de los anticuerpos que tienen los números de referencia 301 :39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 y 268:18. Preferiblemente, el ensayo de detección es un ELISA de tipo sandwich de doble anticuerpo como se describe en los Ejemplos 2 y 3 del documento WO06/12949, en los que se utiliza el anticuerpo 110:9 como un anticuerpo de captura y el aníicuerpo 268:29 se uliliza como anlicuerpo conjugado. Todos los anticuerpos descritos en el documento WO06/12949 están producidos por células de hibridoma, los cuales están depositados en el Centro para Microbiología Aplicada y Desarrollo (Centre for Applied Microbiology and Research) (CAMR) y en la Colección Europea de Cultivos Celulares (European Collection of Cell Cultores) (ECACC), Salisbury, Wilíshire SP4 0JG, R.U., como depósito de paíeníe según el Tralado de Budapesl. La fecha de depósito fue el 11 de mayo de 2004. La LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 110:9 se depositó saíisfacíoriameníe bajo el N° de reg. de la ECACC 04092204. La LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 113:2 se depositó saíisfacíoriamenle bajo el N° de reg. de la ECACC 04092201. La LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 268:18 se depositó saíisfacíoriamenle bajo el N° de reg. de la ECACC 04092202. La LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 268:29 se depositó satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092206. La LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 287:6 se depositó satisfacíoriameníe bajo el N° de reg. de la ECACC 04092203. La LÍNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 301 :39 se depositó salisfacíoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092205. La terminología "aníígeno de L. intracellularis" íal como se uíiliza en la presente memoria significa, pero no eslá limiíada a ello, cualquier composición de materia, que comprende por lo menos un antígeno que puede inducir, estimular o potenciar la respuesta inmunitaria contra una infección causada por L. intracellularis, cuando se administra a un animal. Preferiblemente, dicho antígeno de . intracellularis es una bacteria L. intracellularis completo, en particular en una forma ¡nactivada (una así llamada bacteria muerta), una bacteria L. intracellularis viva modificada o atenuada (una así llamada MLB), cualquier subunidad, polipéptido o componente de L. intracellularis, o cualquier vector quimérico, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos inmunogénica de L. intracellularis. Las expresiones "proleína inmunogénica", "polipéplido inmunogénico" o "secuencia de aminoácidos inmunogénica", tal como se utiliza en la presente memoria, se refieren a cualquier secuencia de aminoácidos que provoca una respuesía inmunilaria en un hospedante contra un agente patógeno que comprende dicha proteína inmunogénica, polipépíido inmunogénico o secuencia de aminoácidos inmunogénica. En particular, una "proleína inmunógena", "polipéptido inmunógeno" o "secuencia de aminoácidos inmunógena" de L. intracellularis significa cualquier secuencia de aminoácidos que codifica un antígeno que provoca una respuesta inmunológica contra L. intracellularis en un anfitrión al que se administra dicha proteína inmunógena", "polipéptido inmunógeno" o "secuencia de aminoácidos inmunógena". Una "proteína inmunogénica", "polipéptido inmunogénico" o "secuencia de aminoácidos inmunogénica", íal como se uliliza en la presente memoria, incluye pero no esfá limiíada a ella, la secuencia de longitud completa de cualesquier proteínas, sus análogos, o sus fragmentos inmunogénicos. La terminología "fragmento ¡nmunógeno" significa un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y así provoca la respuesta inmunológica coníra el ageníe patógeno relevante. Tales fragmentos se pueden ideníificar uíilizando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos que son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Prolocols ¡n Melhods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Toíowa, Nueva Jersey. (Las enseñanzas y contenido de las cuales se incorporan como referencia en la presente memoria.) Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando concurrentemente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de la proteína, y haciendo reaccionar los péplidos con anlicuerpos, mienlras los péplidos siguen eslando fijados a los soportes. Técnicas de este tipo son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n° 4.708.871 ; Geysen y col. (1984) Proc. Nall. Acad. Sci. USA, 81 :3998-4002; y Geysen y col. (1986), Molec. Immunol., 23:709-715. (Las enseñanzas y contenido de las cuales se incorporan como referencia en la presenté memoria.) De manera similar, los epííopos conformacionales se ¡deníifican fácilmeníe deíerminando la conformación espacial de aminoácidos íales como, por ejemplo, crisíalografía de rayos x y resonancia magnélica nuclear bidimensional. Véase, p. ej., Epiíope Mapping Prolocols, supra. También se incluyen deníro de la definición anlígenos sinlélicos, por ejemplo poliepílopos, epítopos flanqueantes y otros aníígenos recombinaníes u obtenidos de forma siníélica. Véase, por ejemplo, Bergmann y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781 ; Bergmann y col. (1996), J. Immunol., 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol., 75: 402-408; y Gardner y col., (1998) 12íh World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, 28 de junio - 3 de julio, 1998. (Las enseñanzas y contenido de las cuales se incorporan como referencia en la presente memoria.) Los aníígenos de L.intracellularis adecuados ¡ncluyen, pero no se limiten a los descritos en los documentos EP 1219711 ; US 6.605.696; WO 96/39629; WO97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631 ; WO 05/026200; y WO 05/011731. Por lanío, la vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención incluye cualquier antígeno de L. intracellularis como los descritos anteriormente que provoque o que sea capaz de provocar una respuesta inmune contra L. intracellularis. Preferiblemenfe, dicha vacuna proporciona al menos protección aumentada conlra L. intracellularis. Por íanlo, de acuerdo con un aspecto adicional, la preseníe invención se refiere a un mélodo de vacunación de un animal joven conlra infecciones de L. intracellularis que comprende la etapa de administrar a dicho animal joven en las tres primeras semanas de edad una dosis eficaz de aníígeno de L. intracellularis, en donde el aníígeno de L. intracellularis se selecciona del grupo que consisíe en bacterias L. intracellularis vivas modificadas, bacterias L. intracellularis muertas o una o más subunidades de bacterias L. intracellularis. Tal como se ha mencionado aníeriormeníe para una realización, preferiblemenle la vacunación se produce enlre el día 10 y el día 26 de edad, más preferiblemente entre el día 12 y el día 21 de edad, incluso más preferiblemenle entre el día 15 y el día 21 de edad, y aún más preferiblemente entre el día 19 y el día 21 de edad. Para otra realización, la vacunación se produce preferíblemente antes de los 26 días de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente enlre los 18 y los 24 días de edad, aún más preferiblemeníe eníre los 19 y los 22 días de edad, y aún más preferiblemenle a los 21 días de edad. Preferiblemenle, la vacuna comprende bacterias L. intracellularis vivas modificadas. Más preferiblemente, la vacuna es Enterisol® lleitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de vacunación de un animal joven, preferiblemente un cochinillo joven, coníra infecciones de L. intracellularis que comprenden la elapa de adminisírar a dicho animal joven comenzando enlre los 10 y los 26 días de edad, más preferiblemente eníre los 12 y los 21 días de edad, incluso más preferiblemeníe eníre los 15 y los 21 días de edad, y aún más preferiblemenle enlre los 19 y los 21 días de edad, o al animal joven antes de los 26 días de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente enlre los 18 y los 24 días de edad, aún más preferiblemente entre los 19 y los 22 días de edad, y más preferiblemente a los 21 días de edad, una dosis de aproximadamente 3.0 TCID50 a aproximadamente 6.0 TCID50 de bacterias L. intracellularis vivas modificadas. Preferiblemenle, dichas bacterias son las incluidas en la vacuna Enterisol® lleitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de vacunación de un animal joven, preferiblemente un cochinillo joven, contra infecciones de L. intracellularis que comprenden la etapa de adminislrar a dicho animal joven comenzando entre los 10 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 12 y los 21 días de edad, incluso más preferiblemente entre los 15 y los 21 días de edad, y aún más preferiblemenle enlre los 19 y los 21 días de edad, o al animal joven antes de los 26 días de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 18 y los 24 días de edad, aún más preferiblemente enlre los 19 y los 22 días de edad, y más preferiblemeníe a los 21 días de edad, una dosis eficaz de anlígeno de L. intracellularis, en donde el animal joven es negaíivo en aníicuerpos maternos L. intracellularis y anfi- . intracellularis. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención lambién se refiere a un nuevo uso medicinal de una canlidad eficaz de antígeno de L. intracellularis para la preparación de un medicamento, preferiblemente una composición de vacuna, para la vacunación de un animal joven, preferiblemente un cochinillo joven, entre los 10 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 12 y los 21 días de edad, incluso más preferiblemente eníre los 15 y los 21 días de edad, y aún más preferiblemenle enlre los 19 y los 21 días de edad, o antes de los 26 días de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 18 y los 24 días de edad, aún más preferiblemente entre los 19 y los 22 días de edad, y más preferiblemente a los 21 días de edad.
Según un aspecto adicional de dicho uso medicinal descrito anteriormente, el antígeno de L. intracellularis se selecciona del grupo que consisíe en una bacteria L. intracellularis viva modificada, una bacteria . intracellularis muerta o una o más sub-unidades de la bacteria L. intracellularis. Preferiblemeníe, el aníígeno de L. intracellularis es bacteria L. intracellularis viva modificada. Más preferiblemente, a dicho animal joven se le administra una dosis de aproximadamente 3.0 TCID50 a aproximadamente 6.0 TCID50 de bacterias L. intracellularis vivas modificadas. La fabricación de las composiciones de vacuna que comprenden un anlígeno de L. intracellularis es convencional en el eslado de la técnica y es conocida por el especialista en el campo. Por ejemplo, el experto en la técnica puede conocer componentes adicionales que pueden estar comprendidos en dicha composición (véase también Remingíon's Pharmaceuíical Sciences, (1990), 18a ed. Mack Publ., Easion). El experto puede utilizar disoluciones estériles inyectables conocidas, fisiológicamente aceptables. Para preparar una disolución lista para el uso como inyección o infusión parenteral, se encuentran disponibles fácilmente disoluciones isotónicas acuosas, tales como, por ejemplo, una disolución salina o las correspondieníes disoluciones de proíeínas en plasma. Las composiciones de vacunas pueden estar presentes en forma de liofilizados o preparaciones secas, las cuales se pueden reconstiíuir con una solución inyeclable conocida, direcíamente antes del uso bajo condiciones estériles, p. ej. en forma de un kil de piezas. Además, las composiciones inmunogénicas y de vacuna de la presente invención pueden incluir uno o más soportes aceptables desde el punto de visla veterinario. Tal como se emplea en esta memoria, "un soporte aceptable desde el punto de vista veterinario" incluye uno y cualesquiera disolventes, medios dispersaníes, recubrimientos, adyuvantes, agentes esíabilizadores, diluyenles, conservantes, agentes anlibacíerianos y aníifúngicos, ageníes isolónicos, ageníes que demoran la adsorción y similares. Los "diluyenles" pueden incluir agua, disolución salina, dexlrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, enlre oíros. Los eslabilizaníes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido eíilendiaminleíracético, entre oíros. "Adyuvantes", íal como se utilizan en la presente memoria, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Bioíech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galénica Pharmaceulicals, Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua o emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión se puede basar, en particular, en aceite de parafina líquido ligero (del lipo de la Farmacopea Europea); aceite ¡soprenoide, tales como escalano o escaleno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; esteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilaío/caprato) de propilenglicol, lri-(caprilalo/caprato) de glicerilo o dioleaío de propilenglicol; ésíeres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésíeres de ácido isosleárico. El aceite se uliliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no ¡ónicos, en particular ésíeres de sorbilán, de manida (por ejemplo, oleaío de anhidromaniíol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isosíeárico, ricinoleico o hidroxiesleárico, que esíán opcionalmenle eloxilados, y copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxieíileno, en particular los productos Pluronic, en especial el L121. Véase Hunter y col., The Theory y Praclical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.).John Wiley and Sons, NY, pág. 51-94 (1995), y Todd y col., Vaccine, 15: 564-570 (1997). (Las enseñanzas y contenido de las cuales son incorporadas por la preseníe memoria como referencia.) Por ejemplo, es posible uíilizar la emulsión SPT descriía en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunil y Adjuvanl Approach" ediíada por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descriía en la página 183 del mismo libro. (Las enseñanzas y contenido de las cuales son incorporadas por la preseníe memoria como referencia.) Un ejemplo adicional de adyuvante es un compuesío elegido enlre los polímeros de ácido acrílico o meíacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros del ácido acrílico o melacrílico que eslán reliculados, especialmente con poli {alquenil éteres) de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, n° 2, junio 1996). Los expertos en la técnica también pueden referirse a la patente de EE.UU. N° 2.909.462 que describe polímeros acrílicos de esíe íipo, reíiculados con un compuesto polihidroxilado que liene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemenle no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos sustituidos por radicales alifáticos insaturados que lienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicameníe insaíurados. Los radicales insafurados pueden coníener por sí mismos oíros susíiluyenles lal como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE.UU) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alil- sacarosa o con alil-penlaerilriíol. Eníre ellos, se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971 P. Lo más preferido es el uso de Cabopol 971 P. Enlre los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, se encueníran los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y eíileno. La disolución de esíos polímeros en agua produce a una disolución acida que será neulralizada, preferiblemenle hasla un pH fisiológico, con el fin de obtener la disolución adyuvante en la que se incorporará la propia composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna. Adyuvantes adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a ellos, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero de bloques (CylRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil- lípido A, adyuvante de lípido-amina Avridina, enterotoxina térmicamente lábil procedente de E. coli (recombinaníe o de oíra forma), íoxina de cólera, IMS 1314, o dipéplido de muramilo, enlre muchos oíros. Preferiblemeníe, el adyuvaníe se añade en una canlidad de aproximadamenle 100 µg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemeníe, el adyuvante se añade en una caníidad de aproximadamenle 500 µg hasla aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso más preferiblemenle, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 750 µg hasta aproximadamente 2.5 mg por dosis. Lo más preferible, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis. Las composiciones de vacuna pueden además incluir uno o más de otros agentes inmunomoduladores tales como por ejemplo, interleucinas, interferones u otras citocinas. Las composiciones de vacuna pueden también incluir Gentamicina y Mertiolato. Si bien las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por el experto en la técnica, la presente invención conlempla composiciones que comprenden eníre aproximadamente 50 µg y aproximadamente 2.000 µg de adyuvante y preferiblemeníe aproximadamenle 250 µg/mL de dosis de la composición de vacuna. En olra realización preferida, la presente invención contempla composiciones de vacuna que comprenden entre aproximadamente 1 µg/mL y aproximadamenle 60 µg/mL de anlibióticos, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 µg/mL de antibióticos. La vacuna se administra a animales, preferiblemente a mamíferos, y aún más preferiblemente a cerdos, en cualquier modo convencional, más preferiblemente mediante un empapado oral. La dosificación que se va a adminislrar dependerá del caso particular, pero en cualquier caso, es la caníidad suficiente para inducir un anlicuerpo protector o respuesía inmuniíaria mediada por la célula conlra la ileííis. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, las vacunas de L. intracellularis usadas para la vacunación de los animales jóvenes (preferiblemeníe los cochinillos jóvenes) se adminislran en una o en repelidas dosis. La vacuna viva o muerta puede administrarse 1 ó 2 veces en intervalos de 2 a 4 semanas después de la vacunación inicial. Para las vacunas vivas atenuadas se prefiere una dosis. Preferiblemente, la primera o única administración se lleva a cabo entre los 16 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 18 y los 24 días de edad, incluso más preferiblemente enlre los 19 y los 22 días de edad, y aún más preferiblemenle a los 21 días de edad, íal como se ha descrito anteriormente, o comenzando entre los 10 y los 26 días de edad, más preferiblemente entre los 12 y los 21 días de edad, incluso más preferiblemeníe eníre los 15 y los 21 días de edad, y aún más preferiblemenle enlre los 19 y los 21 días de edad. Si es deseable o necesaria una segunda administración, la segunda administración se lleva a cabo de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanas después de la primera administración de la vacuna. Según un aspecto adicional, la revacunación se realiza en un intervalo de 3 a 12 meses después de la adminislración de cualquier vacunación previa. La administración de las dosis subsiguientes de la vacuna preferiblemenle se realiza según una base semeslral o anual. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos representativos de realizaciones preferidas de la presente invención. Debe entenderse que nada de lo presentado debería ser considerado como una limitación del alcance global de la invención. EJEMPL0 1 Esíe ejemplo evaluó la eficacia de una vacuna de Lawsonia en cochinillos de íres semanas de edad nacidos de cerdas vacunadas conlra Lawsonia y de cerdas no vacunadas, y determinó si la vacunación de las cerdas indujo interferencias inmunológicas maternas que impidieran una respuesla a la vacunación del cochinillo, medido como una reducción de la inducción de la enfermedad después de una exposición a cullivo virulento puro de los cochinillos vacunados y no vacunados. Los parámetros primarios de estudio usados para medir la eficacia fueron las lesiones macroscópicas y microscópicas del íleo y del colon. Adicionalmente, este ejemplo evaluó la vacuna de Lawsonia en episodios de seguridad cuando se adminislra a cerdas preñadas duraníe la segunda y tercera elapas de la geslación Iras administración de dosis sencilla y repetida. Materiales y Métodos En un esludio a ciegas, se tomaron dieciséis cerdas sero-negalivas de Lawsonia saludables y preñadas, y fueron divididas aleatoriamente en 2 grupos, cada uno de ellos con 8 cerdas. El grupo A recibió 3 dosis de Enlerisol lleilis B3903 por mojado oral en los días -55, -35 y -14, con la intención de inducir un alto nivel de inmunidad materna antes del parto. Las cerdas del grupo B recibieron un placebo antes del parto y sirvieron a modo de control negativo. Al principio a las cerdas se las alimentó con una ración de geslación comercial no medicada, antes de cambiar a una dieta lactante no medicada. Se realizaron esfuerzos para obtener concepciones y partos uniformes para todas las cerdas, pero aún así exislió algo de variación (10 días) en la fecha del parto. Con el fin de evilar los problemas de variabilidad asociados a lener múltiples días de vacunación y de exposición, se estableció la media de las fechas de parto como día 0 del ensayo. Todos los cochinillos usados en la porción de vacuna y de exposición del estudio tenían 21 ± 5 días de edad en el momento de la vacunación (Día 21 ). Al principio los cochinillos fueron alimentados con una ración de inicio no medicada, seguida de una ración de cría no medicada, seguida de una ración finalización del crecimiento no medicada. Las muestras de serología tomadas de los cerdos se recogieron el mismo día del nacimiento, a los 7 días de edad y a los 14 días de edad, para asegurar una medida precisa de los anticuerpos maternos, en caso de que hubiera. Antes del parto se tomó la serología de las cerdas. Adicionalmente, las cerdas fueron sacrificadas en la jornada 22, sus tejidos de colon y de íleo fueron evaluados para determinar patologías graves, su íleo, colon, nodos linfáticos mesentéricos y amígdalas fueron evaluados mediante PCR, los cerdos nacidos muertos fueron evaluados mediante PCR, y se evaluó la capacidad reproductiva de carnada de las cerdas se evaluó registrando los cerdos como recién nacidos, nacidos muertos o momias el día del parto. Después del parto (en el día 21 del estudio), se bloquearon 100 cochinillos sanos por carnada y a continuación fueron asignados a uno de los seis grupos de tratamiento, cada uno de ellos alojado por separado a lo largo de todo el estudio. Los cochinillos procedentes de cerdas vacunadas (Grupo A) fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento 1-3. Los cochinillos procedentes de cerdas no vacunadas (Grupo B) fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento 4-6. En la jornada 21 , los grupos de tratamiento 1 y 4, con 20 cochinillos cada uno, recibieron una dosis de 2 mL (1 X 10 5.0 log Jí10
TCID 0 dosis) de vacuna de Enterisol lleilis B3903 por mojado oral directo. Los grupos de tratamiento 2 y 5, cada uno de ellos con 20 cochinillos, recibieron una dosis de 2 mL de placebo por mojado oral directo. Los grupos de tralamienlo 3 y 6, con 10 cochinillos por grupo, no recibieron írafamienlo alguno y sirvieron como coníroles eslricíos para validar la susceplibilidad del origen del cerdo a la infección de Lawsonia. Tres semanas después de la vacunación (día 42 del esíudio), los cochinillos del ensayo de los grupos de Iralamienlo 1 , 2, 4 y 5 fueron expuestos mediante la adminisíración de una dosis de 10 mL (1 X 107 3 logio TCID50/dosis) de cullivo puro virulento de bajo pasaje del elemento aislado heterólogo N101494 de Lawsonia, mediante saluración gásírica. Sin embargo, se pueden uíilizar oíros elementos aislados de L. intracellularis naturales infecciosos o de bajo pasaje como bacterias de exposición. En la jornada 63 del esludio (Ires semanas después de la exposición), todos los grupos de tralamiento (1-6) fueron somelidos a eutanasia y sacrificados para realizar un análisis de lesiones macro y microscópicas de la PPE. El criterio principal usado para deíerminar la eficacia de la vacuna de Eníerisol lleilis B3903 en cochinillos conlra la exposición a cultivo puro virulento heterólogo fue la observación del desarrollo de lesiones usando lanío técnicas macroscópicas como microscópicas para evaluar las lesiones del íleo y del colon. Las lesiones macroscópicas se evaluaron en secciones del íleo, en la unión ileal-cecal y en el colon en el momento de finalización del estudio. Las lesiones intestinales fueron clasificadas en grados según el nivel de gravedad, y se tomaron muestras adicionales de la zona infectada del tejido para realizar análisis PCR, IHC y H&E. La gravedad de las lesiones se determinó a través del grado de espesamiento mucosal encontrado en el recubrimiento mucosal del íleo. Una puntuación de lesión de 0 indicó que no había evidencia de espesamiento mucosal edema pliegues o fisuras de mucosa, o prominencia de reticulación serosal. Una punluación de lesión de 1 indicó un espesamiento suave que incluye la presencia de pequeños pliegues/grieías en la mucosa, edema suave de la pared mucosal y en algunos casos hiperemia. Una punluación de lesión de 2 se alribuyó a un espesamiento y/o inflamación moderados. Quedó en evidencia a través de pliegues/grietas profundos en la mucosa, edemas moderados de la pared mucosal, reticulación de las superficies serosales y, en algunos casos, hiperemia. Una puntuación de lesión de 3 indicó un espesamiento y/o inflamación grave, evidenciado por pliegues/grietas profundos en la mucosa, edemas moderados de la pared mucosal, reticulación de las superficies serosales y, de nuevo en algunos casos, hiperemia. Una puntuación de lesión de 4 indicó un espesamiento y/o inflamación grave y/o presencia de sangre. Dicha puntuación de lesión quedó evidenciada por pliegues/grielas graves y profundos en la mucosa, por edemas moderados en la pared mucosal, reliculación de las superficies serosales, de nuevo en algunos casos hiperemia, y por la presencia de conlenidos sanguíneos y/o de coágulos de sangre. Finalmente, una puntuación de lesión de 5 indicó necrosis evidenciada por lesiones graves de la superficie mucosal tales como presencia de necrosis, o en algunos casos que toda la superficie mucosal esté mudada o separada debido a la gravedad de la lesión. Lesiones microscópicas causadas por Lawsonia son patognómicas para la PPE. Las lesiones hislopalológicas de la enfermedad incluyen la hiperplasia epitelial, especialmente en las criplas mucosales con una dislinía ausencia de células copa. Normalmente, la Lawsonia se encuenlra en las células epiteliales proliferalivas de la cripla mucosal. Se colocaron secciones de íleo de aproximadamente 2-4 cm de longitud en formalina tamponada para el examen histológico usando los méíodos de íinción de Hemaíoxilina y Eosina (H&E) y de IHC. Las íinciones de H&E detecten la presencia hiperplasia de cripfa provocada por la infección de Lawsonia mienlras que las unciones de IHC exploten la especificidad de un anficuerpo monoclonal anli- awson a al confirmar la presencia del organismo y del desarrollo de lesiones microscópicas en los tejidos afeclados. El anticuerpo monoclonal anti- awsop/a deíecla específicamente la célula completa de Lawsonia apuntando a la proíeína de membrana exíerior de todos los elementos aislados de Lawsonia. Este anlicuerpo monoclonal fue derivado a partir de la línea celular de hibridoma VPM53, desarrollada por invesligadores de la Universidad de Edimburgo, Escocia. La presencia de organismos de Lawsonia y de gravedad de lesión microscópica determinada mediante íinción IHC de secciones ¡leales su punluó con una punluación de 0, que indica que no había enlerocitos proliferativos (lesiones), con una puntuación de 1 , que indica lesiones focales moderadas, con una puntuación de 2, que indica lesiones difusas moderadas, y con una puntuación de 3, que indica lesiones difusas graves. Con respecto a la presencia de organismos, el sistema de puntuación IHC determinó la presencia de ningún organismo como 0, la presencia de pocos organismos focales como 1 , la presencia de organismos difusos moderados como 2, y la presencia de organismos difusos graves como 3. Los criterios secundarios de medidas fueron la observación de síntomas clínicos, la detección de Lawsonia en muestras fecales y tejidos mediante PCR, el ADWG y la seroconversión (IFAT) debido a la exposición de cochinillos a Lawsonia. Se realizó una vigilancia diaria de la salud desde la fecha del inicio del esludio hasla el día de la exposición para animal ensayado. Los parámetros de salud clínica, que incluyen la diarrea, el comportamiento y la condición corporal, fueron evaluados diariamente desde el día de la exposición (día 42) hasta el día anterior a la finalización (día 62). La puntuación reflejó la gravedad de la enfermedad. Para la diarrea, una puntuación de 1 indicó heces normales, una puntuación de 2 indicó heces semisólidas sin sangre, una puntuación de 3 indicó heces acuosas pero sin ninguna sangre o heces oscuras, y una puntuación de 4 indicó heces teñidas con sangre, independientemente de que estuvieran sueltos o formadas. Una punluación de comportamiento de 1 indicó un comportamiento normal, una puntuación de 2 indicó un comportamiento deprimido de ligero a moderado (se mantiene aislado), y una puntuación de 3 indicó un comportamiento yacenle o gravemeníe deprimido. Una punluación corporal de 1 indicó una condición corporal normal, una punluación de 2 indicó una condición corporal de ligera a moderadamente demacrada, y una puntuación de 3 indicó una condición gravemente demacrada. Se evaluó el derrame fecal de Lawsonia mediante PCR de ileítis evaluando muestras fecales (f-PCR) en los días -55, -35, -14, 21 , 28, 35, 42, 49, 56 y 63 del estudio. Las muestras fecales fueron analizadas para determinar la presencia de ADN de Lawsonia en heces usando PCR. Se tomaron secciones de tejido fresco de cada animal evaluado a la finalización del estudio, en la jornada 63. Se evaluó el análisis cualitativo del contenido de bacterias en los tejidos mediante PCR de ileítis (í-PCR) junio con una evaluación histológica para determinar Lawsonia en el íleo, colon, amígdalas y nodos linfáticos mesentéricos en el día 63 del esludio. El ensayo de PCR fue desarrollado por Jones, y col., y explota la especificidad de dos cebadores de oligonucleótidos (de 20 pares base cada uno) para producir un fragmento de 319 pb a partir de ADN genómico de Lawsonia. Esíos cebadores esíán dirigidos a una secuencia previamente determinada de ADN genómico específico de Lawsonia. Los fragmeníos de ADN producidos duraníe la PCR se comparan con controles de reacción de PCR y de extracción de ADN negativos y posilivos en ileítis para confirmar un resultado "posiíivo" o "no posifivo". El conírol de exlracción de ADN posiíivo es célula entera de Lawsonia con células McCoy infecladas en 1X Disolución Salina Tamponada de Fosfato (PBS) (200µL/lubo). El conírol de exíracción de ADN negaíivo es células McCoy no infecladas en 1X PBS (200µL/lubo). Los controles de reacción PCR de ileítis consisten en ADN genómico de Lawsonia purificado a partir de malerial recolecíado de un cultivo celular (células Lawsonia + McCoy), mienlras que el conlrol negalivo es agua libre de ARNasa (Amresco, Solón, Ohio). Una muesíra de ensayo posiliva en ADN de Lawsonia producirá el fragmento de ADN de íamaño ¡dénlico (319 pb) al de ambos coníroles posilivos de PCR de ileííis (exlracción y reacción), mieníras que las mueslras negaíivas no producirán un fragmenío de dicho lamaño. Las preparaciones de ADN extraído de cada mueslra de ensayo fueron obtenidas usando kits de extracción de ADN ISO-QUICK (ORCA Research, Inc., Bothell, Washington). Los resultados de PCR se usaron para determinar las deposiciones de Lawsonia en cochinillos vacunados con Enterisol lleitis B3903 y/o expuestos al elemento aislado heterólogo de Lawsonia N101494. Se midieron los pesos el día de la vacunación (día 21 ), el día de la exposición (día 42) y el día de finalización del estudio (día 63) con el fin de calcular la ganancia media de peso diaria (ADWG, en sus siglas en inglés) de cada grupo de tratamiento. Se compararon las ADWG de todos los grupos para determinar la ADWG post-vacunación y post-exposición. Los pesos corporales se determinaron usando un sistema eleclrónico de escala de barra de peso (Weigh-Tronix, Weigh-Tronix, Inc., Fairmonl, Minnesola) calibrado usando pesos certificados de ensayo aníes y después de cada uso. Se evaluó el suero usando el Ensayo de Aníicuerpo Fluorescente Indirecto (IFAT en sus siglas en inglés) para detector aníicuerpos anti- .awsop/a en animales de ensayo. Se tomó sangre entera venosa en íubos de las cerdas en los días -55, -35 y -14 y de iodos los animales a los 0.7 y 14 días de edad, y en los días de ensayo 21 , 28, 35, 42, 49, 56 y 63 del esludio. Se dejó que la sangre coagulara antes de ser centrifugada, y se recolectó y congeló el suero. A continuación el I FAT escrutó el suero de cerdo para determinar la presencia de moléculas IgG aníi- awson/a. Los anticuerpos anti- awson/a se unen a anlígenos de la membrana exterior de la célula entera de Lawsonia, cubriendo completamente el organismo que está fijado al fondo de cada pocilio de una placa de microíilulación de 96 pocilios. Se inlrodujo conjugado de anlicuerpo secundario aníi-lgG marcado con FITC para unirse a cualesquier complejos IgG-anlígeno de cada pocilio. Estos complejos ligados a FITC se iluminan en verde fluorescente bajo luz ultraviolela. Una mueslra de ensayo positiva revela muchas varas pequeñas de forma curva, de color verde brillante, que se asemejan a Lawsonia, o a células McCoy infectadas que contienen numerosas Lawsonia. Una muestra de ensayo negativa en I FAT mueslra un fondo verde apagado (tenue) de células McCoy. Los resultados obtenidos mediante IFAT fueron usados para observar un modelo de seroconversión en grupos que reciben una vacunación y/o una exposición virulenta indicativa de presencia de Lawsonia en el animal. En ensayo de punto final de TCID50 se llevó a cabo sobre muestras representativas de cada dosis de vacuna administrada a los cochinillos de ensayo el día 21 del estudio. Se diluyeron cinco réplicas de muestras de ensayo represenlalivas en una proporción de 10 a 1 (de 10"1 a 10"6) antes y después de la vacunación y de la adminisfración de exposición en Medio Esencial Modificado de Dulbecco reforzado con Ham's F12 (DMEM F12, de sus siglas en inglés) y con un 5% de Suero Bovino de Neonato (NBS en sus siglas en inglés) aclivado lérmicameníe (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). Se evaluaron muesíras diluidas para determinar la caníidad de Lawsonia vivas en cada muesíra de ensayo. Se calcularon títulos medios a partir de 5 réplicas antes y después de la adminislración de exposición, y se mulliplicaron por el volumen de malerial de ensayo proporcionado a cada cochinillo para determinar el loíal de Iog10 de Lawsonia por dosis. Los títulos medios tolales (log-io TCID5o/dosis) para vacunación o exposición se determinaron a partir de los resullados de valoración de antes y de después (2 títulos). Las comparaciones de grupos de traíamienío se realizaron analizando los datos de ADWG, íanío después de la vacunación como después de la exposición, las punluaciones clínicas, las tosas de seroconversión (IFAT), la colonización (í-PCR), la pérdida fecal (f-PCR), el desarrollo de lesiones macroscópicas, y el de lesiones microscópicas mediante inmunohisloquímica (IHC). Tres cochinillos murieron después de la vacunación (uno del Grupo 1 y dos del Grupo 5), pero antes de la finalización del esíudio. El cochinillo del Grupo 1 fue analizado para deíerminar la presencia de infección de Lawsonia, pero se determinó que la causa de muerte fue choque/sepíicemia debida a altos niveles de E.coli. Los dos cochinillos del Grupo 5 que murieron preseníaron las lesiones macroscópicas y microscópicas lípicas de la infección de Lawsonia y la causa presumible de muerte fue debida a la Lawsonia. Resullados La evaluación de muesíras fecales y de suero recogida en este estudio indicó que ninguna cerda del Grupo A o del Grupo B presentaba Lawsonia detectable en sus heces o en el íleo o el colon. Las cerdas del Grupo A tenían de 5 a 8 animales con títulos IFAT detecíables en al menos un punto temporal del esludio. Ninguna cerda del Grupo B presentó un título IFAT deteclable durante el mismo periodo de tiempo. Estos datos se presenlan a continuación en la Tabla 1.
Todas las cerdas fueron sacrificadas y evaluadas para determinar la presencia de lesiones macroscópicas típicas de la infección de Lawsonia. Sin embargo, ninguna cerda presentó lesiones macroscópicas o dio posiíivo en la defección de í-PCR. A pesar del hecho de que la vacuna se adminisíró duraníe el 2o y el 3er írimesíres del embarazo, no se regislraron observaciones de salud general anormales para ninguna cerda duraníe el ensayo clínico. Los resullados del parto entre las cerdas del Grupo A y del Grupo B también fueron muy similares, con una media de 9.6 y 7.6 cochinillos nacidos vivos en cada grupo, respectivamente. Las cerdas del Grupo A tenían una media de 1.8 cerdos nacidos muertos por camada, y ninguna momia o mortalidad en el parto. Las cerdas del Grupo B presentaron una media de 0.9 mortinatos, 0.1 momias y 0.1 cerdos muertos durante el parto, por camada. La evaluación diagnóslica de dichos cerdos mortinatos indicó que eran negaíivos en Lawsonia y que se enconíraban deníro de las pérdidas normales asociadas a la reproducción. Los resullados de serología fueron como se esperaba en tanto que las cerdas no vacunadas permanecieron seronegativas y en el Grupo A se deíectaron algunos animales seroposiíivos. Las cerdas del Grupo A tenían mayores valores de cerdos/carnada en comparación con los conlroles no vacunados. El resullado indica que no había ningún efecío negaíivo debido a los méíodos o al contenido de la vacunación. Esíos datos se resumen en la anterior Tabla 1. El desarrollo de lesiones macroscópicas en cochinillos se determinó evaluando y punteando el íleo y el colon de cada animal ensayado para determinar lesiones macroscópicas asociadas a PPE en el momento de la finalización del esludio. Los cochinillos de los Grupos 1 y 4 presenlaron las menores puntuaciones de íleo con un 0.16 y un 0.15, respectivamente. Estos valores no fueron significativamente diferentes y demostraron la eficacia de la vacuna en cerdos procedentes tanto de cerdas vacunadas como no vacunadas. Los Grupos 2 y 5 presentaron puntuación de lesiones de íleo de 0.85 y de 2.35, respeclivamenle. Estos valores fueron significativamente diferentes (P<0.05) e indicaron que la vacunación de las cerdas proporciona un cierto nivel de protección materna (Grupo 2) y que los animales recién nacidos eran sensibles a la exposición virulenta (Grupo 5). Los Grupos 4 y 5 lambién presenlaron puntuaciones de íleo significativamente diferentes (P<0.05) y confirmaron la eficacia de la vacuna en los cochinillos recién nacidos vacunados. Las puntuaciones de íleo de los Grupos 1 y 2 lambién fueron significalivamente diferentes (P<0.05) y confirman que la vacunación de cerdos procedentes de cerdas posilivas en Lawsonia proporciona un beneficio significalivo (P<0.05) más allá de la inmunidad malerna. Se obluvieron las mismas tendencias y significancias con las muestras de íleos en términos de porceníaje de animales positivos (positivos/total del grupo). Se descubrieron lesiones de íleo en el 80% de los cerdos del Grupo 5. Por el contrario, menos del 16% de los animales de los Grupos 1 y 4 presentaron lesiones de íleo. Con respecto a las puntuaciones de lesiones macroscópicas del colon y al porcentaje de animales positivos, se produjo una diferencia significativa (P<0.05) eníre el Grupo 4 y el Grupo 5. No se produjeron oirás diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Los controles estrictos (Grupos 3 y 6) fueron negativos en cuanto a lesiones macroscópicas del íleo y del colon, confirmando con ello la validez del estudio. Los resultados de este ensayo se proporcionan en la Tabla 2 que figura a continuación: Tabla 2: Resumen de las puntuaciones de lesiones macroscópicas en cerdos de los diferentes grupos de tratamiento
La comparación entre el Grupo 1 y el 2 es significativamente (P<0.05) diferente. c La comparación entre el Grupo 1 y el 4 es significativamente (P<0.05) diferente. d La comparación entre el Grupo 2 y el 5 es significativamente (P<0.05) diferente. e La comparación entre el Grupo 4 y el 5 es significativamente (P<0.05) diferente. f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el protocolo. Se usaron métodos IHC y H&E para evaluar el desarrollo de lesiones microscópicas en cochinillos. Se tomaron secciones de 2-4 cm. de longitud de amígdala, nodo linfático mesentérico, íleo terminal y colon a la finalización del esíudio (día 63), y fueron colocadas en formalina lamponada al 10% para el análisis IHC. No se detectó Lawsonia mediante tinción IHC de las secciones de amígdalas en ninguno de los grupos de tralamienío a la finalización del esludio. Se detectó Lawsonia en 2/20 de las muestras de nodo linfático mesentérico del Grupo 5. Todas las demás muestras de nodos linfáticos mesentéricos de todos los grupos fueron negativas y no se observó ninguna diferencia significativa entre los grupos de tratamiento en relación al ensayo de nodo linfático mesentérico. Los Grupos 1 y 4 presentaron puntuaciones de íleo microscópicas de 0.35 y de 0.15, respectivamente, y no fueron significativamente diferentes. El Grupo 5 presentó la mayor punluación de íleo microscópica con 2.42 y fue significalivamente diferente (P<0.05) a las de los grupos de tratamiento 2 y 4. Esto demuestra que exisíe un cierto grado de inmunidad maternal en el Grupo 2 y que la vacuna proporciona eficacia en los cerdos recién nacidos vacunados. La evaluación del porcenlaje de muesíras de íleo con lesiones microscópicas indicó que el 95% de los cerdos del Grupo 5 presenlaba lesiones y que dicho grupo es de nuevo significaíivameníe (P<0.05) diferente de los Grupos 2 y 4. El Grupo 5 presentó una punluación media de colon microscópica del 1.35%, y el 60% de los animales de este grupo de tratamiento fueron positivos en la detección de lesión debido a Lawsonia. Esíe valor fue significalivameníe (P<0.05) mayor que los de los grupos de íraíamienlo 2 y 4. Los dalos macroscópicos se resumen en la Tabla 3. Tabla 3: Resumen de las lesiones microscópicas en tejidos de cerdos a la finalización del esludio
d La comparación entre el Grupo 2 y el 5 es significativamente (PO.05) diferente, e La comparación entre el Grupo 4 y el 5 es significativamente (P<0.05) diferente.
f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el protocolo. " 1 muestra presentó necrosis y caída de tejido severo y no pudo leerse mediante IHC. Con el fin de evaluar la eliminación fecal de Lawsonia en los cochinillos mediante f-PCR, se tomaron mueslras fecales semanalmenle de lodos los animales de ensayo de cada grupo de íratamiento y se evaluó la presencia de L. intracellularis mediante PCR de ileítis en los días 21 , 28, 35, 42, 49, 56 y 63 del esíudio. En los días 21 , 28 y 35, los cochinillos de lodos los grupos de íratamiento dieron negativo para L. intracellularis en las pruebas de f-PCR. Los cochinillos del Grupo 1 fueron deteclados como posilivos mediante f-PCR en el día 42, y permanecieron positivos hasla el día 63, con un 11-16% de los cochinillos dando posilivo durante este periodo de tiempo. Los cochinillos del Grupo 2 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el día 49, y permanecieron posilivos hasla el día 63, con un 5-25% de los cochinillos dando positivo durante este periodo de tiempo. Los cochinillos del Grupo 4 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el día 42, y permanecieron positivos hasta el día 63, con un 5-25% de los cochinillos dando positivo durante este periodo de íiempo, respeclivamenle. Los cochinillos del Grupo 5 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el día 49, y permanecieron positivos hasta el día 63, con un 15-72% de los cochinillos dando positivo durante este periodo de tiempo. Los cochinillos del Grupo 3 y del 6 permanecieron negativos por f-PCR durante todo el experimento. El análisis de chi-cuadrado de los datos indica una diferencia significativa (P<0.05) eníre los grupos 4 y 5 en el día 42, enlre los grupos 2 y 5 en el día 63, y eníre los grupos 4 y 5 en el día 63. Los dalos de eliminación fecal se resumen en la Tabla 4. Tabla 4: Resumen de la eliminación fecal de L. intracellularis enlre los grupos de tratamiento de cerdos
a La comparación global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado. d La comparación de los Grupos 2 y 5 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparación de los Grupos 4 y 5 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el proíocolo. La colonización de tejidos por Lawsonia (í-PCR) en cerdos se evaluó a la finalización del esíudio (día 63) mediante ensayo PCR de las secciones de íejido del íleo terminal, del colon, de las amígdalas y del nodo linfático mesentérico. Los coníroles esíriclos (Grupos 3 y 6) fueron negalivos en í-PCR para la delección de Lawsonia, confirmando con ello la validez de la fuenle de cerdos y del estudio. Todas las muestras de amígdala fueron negativas por t- PCR. Únicamente las muestras de colon y de nodo linfático mesentérico del Grupo 5 dieron positivo, siendo posiíivos un 5-10% de los cochinillos. Las mueslras de íleo de cochinillos del Grupo 1 y del 2 presenlaron un 20% y un 25% de resullados de ensayo positivos mediante t-PCR, respectivamente. En comparación, los cochinillos del Grupo 4 y del 5 presentaron un 5% y un 45% de resultados de ensayo positivos mediante í-PCR, respecíivamenle. Todas las muestras de íleos de los Grupos 3 y 6 fueron negativas en el ensayo de t-PCR. El análisis de Chi-cuadrado no indicó diferencias significaíivas eníre los grupos de íralamienío en las muesfras de amígdala, nodo linfáíico meseníérico o colon. No hubo una diferencia significaliva (P<0.05) enlre los Grupos 4 y 5 en los resultados de t-PCR del íleo, presentando el Grupo 5 el mayor porceníaje de posilivos del experimento. Los datos de este ensayo se resumen en la Tabla 5. Tabla 5: Resumen de colonización de tejidos por L. intracellularis entre los grupos de tratamiento de cerdos (positivos/total grupo)
a La comparación global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado. d La comparación de los Grupos 4 y 5 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el protocolo. Se calculó la ADWG desde el tiempo de vacunación (día 21 ), hasta la adminislración de la exposición (día 42), hasta la finalización del estudio (día 63) y enlre la exposición (día 42) y la finalización del esíudio (día 63). El día de la vacunación (día 21 ), no había ninguna diferencia significaliva enlre los grupos de Iralamienlo. De forma similar, no hubo diferencias significativas después de la vacunación desde el día 21 hasta el día 42. Dichos resultados confirman que la vacuna es segura y no afecía al desarrollo medido a íravés de la ganancia de peso. Después de la exposición virulento, no se produjeron diferencias significaíivas (P<0.05) en la ADWG enlre los Grupos 1 y 4, entre los Grupos 2 y 5, y enlre los Grupos 4 y 5. El Grupo 5 presentó la menor ADWG del esíudio con un valor de 0.399 Kg/día. La evaluación de Chi-cuadrado del periodo de íiempo que va desde la vacunación hasía la exposición y hasfa el momento de finalización del estudio íambién indicó que había una diferencia significaíiva (P<0.05) eníre los Grupos 1 y 4 y eníre los Grupos 4 y 5. Estos daíos se resumen a conlinuación en la Tabla 6. Tabla 6: Resumen de las ganancias de peso medias diarias (ADWG) de los cerdos
a La comparación global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado. c La comparación de los Grupos 1 y 4 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparación de los Grupos 2 y 5 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparación de los Grupos 4 y 5 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el protocolo. Las observaciones clínicas de los cochinillos fueron registradas diariamente para cada animal desde el día de la exposición (día 42) hasta la finalización del estudio (día 63). Se calcularon las puntuaciones clínicas para obtener una puntuación clínica diaria media que reflejase la gravedad y la duración de la enfermedad entre los grupos de traíamienlo debido a la exposición a un elemento aislado virulento de Lawsonia. Una punluación de 3 era indicativa de un animal normal y saludable. Hubo pocas puntuaciones clínicas diferentes a "3" en cualquiera de los grupos después de la exposición virulenía, y no se produjeron diferencias significalivas enlre cualquiera de los grupos de íraíamienío. Las punluaciones clínicas medias de cada grupo de íratamiento se resumen a continuación en la Tabla 7.
Tabla 7: Puntuaciones clínicas medias de los cerdos
a La comparación global no es significativamente diferente. f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el protocolo. La evaluación serológica de los cochinillos mediante ensayo IFAT para determinar la presencia de anticuerpos IgG anti- awson/a se llevó a cabo con muestras de suero que fueron extraídas semanalmeníe de los animales evaluados. Las mueslras de suero fueron exíraídas los días 0, 7, 14, 21 , 28, 35, 42, 49, 56 y 63. Antes de la exposición, algunos cochinillos de los Grupos 1-3 fueron seroposiíivos para Lawsonia, confirmando con ello que se induce algo de inmunidad materna durante la vacunación de la cerda. Por el conlrario, iodos los cochinillos de los Grupos 4-6 fueron seronegalivos para Lawsonia. Los cochinillos del Grupo 1 preseníaron números significaíivamenfe mayores (P<0.05) de animales seroposilivos, en comparación con el Grupo 4, el día del parto y en los días 7 y 14. Los cochinillos del Grupo 1 lambién fueron significalivamente diferentes (P<0,05) de los del Grupo 2 en el día 63 del experimento. El Grupo 2 presentó números significativamente mayores (P<0.05) de animales seropositivos, en comparación con el Grupo 5, en los días 7, 14 y 28. La detección de anticuerpos maternos duró hasía el día 28 en los Grupos 1-3. Todos los animales de los Grupos 1-3 fueron seronegalivos para el día 35. Tras la exposición virulento, se detectó algo de seroconversión en los Grupos 1 , 2, 4 y 5. Se percibió una diferencia significaliva (P<0.05) eníre los Grupos 1 y 4 en el día 56 del experimento. Las lasas de seroconversión de cada grupo se resumen a coníinuación en la Tabla 8. Tabla 8: Resumen de las lasas de seroconversión entre los grupos de tratamiento de cerdos
a La comparación global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado. b La comparación de los Grupos 1 y 2 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. c La comparación de los Grupos 1 y 4 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparación de los Grupos 2 y 5 es significativamente (P<0.05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los análisis estadísticos tal como se indica en el protocolo. * Se produjo la muerte de animales en este grupo de tratamiento. Discusión Este estudio evaluó la seguridad de una vacuna de Lawsonia en cerdas después de dosis elevadas y repetidas de la vacuna durante la segunda y la tercera etapas de la gestación, cuyo objelivo era inducir un elevado nivel de respuesía de anlicuerpos maternos. No se delectó Lawsonia en los tejidos mediante IHC o t-PCR, ni indicaciones de infección de Lawsonia mediadas a través de patologías macroscópicas en cualquiera de las cerdas vacunadas. Además, no se produjo la detección de pérdidas fecales de Lawsonia en ninguna de las cerdas vacunadas. Finalmente, las cerdas vacunadas presentaron valores numéricamente superiores de cochinillos vivos y saludables. Por consiguiente, todo indica a que la vacuna es segura en animales preñados. Este complejo estudio incluyó íanío cerdas posilivas en Lawsonia (Grupo A) como cerdas negaíivas en Lawsonia (Grupo B), cuyos cochinillos fueron vacunados posteriormente (Grupos 1 y 4) o no fueron vacunados (Grupos 2 y 5). Los cochinillos de los Grupos 3 y 6 sirvieron como conlroles eslriclos y no recibieron íratamiento alguno o exposición a la bacteria. El análisis de los datos y las posteriores conclusiones se realizaron comparando los grupos de íralamienlo que variaban en una única variable (vacunación de cochinillo o vacunación de cerda). La eficacia de la vacuna en los cochinillos recién nacidos confirma que la fuenle del cerdo era suscepíible, y que la vacunación de dichos cochinillos proporcionó eficacia contra la exposición virulenta heteróloga. Esto requirió una comparación del Grupo 4 (vacunado) y del Grupo 5 (no vacunado), los cuales derivaban ambos de cerdas negalivas en Lawsonia. Los datos indicaron que el Grupo 4 era significativamente diferente (P<0.05) del Grupo 5 en punluaciones medias de íleo macroscópicas, en punluaciones medias de colon macroscópicas, en eliminación fecal (f-PCR), en colonización de tejido del íleo (t-PCR) y en ADWG. Como nota al margen, dicho estudio también confirmó que la Enterisol lleitis B3903 proporciona una protección eficaz después de una única administración. Además confirma y valida que la fuente de cerdos usada en el experimento era susceplible a la exposición virulento heíeróloga. La comparación del Grupo 2 (cochinillos procedentes de una cerda del Grupo A) y del Grupo 5 (cochinillos procedentes de una cerda del Grupo B) permilieron la evaluación del potencial de prolección malerna obtenido a través de la vacunación de la cerda. Los datos indicaron que no había diferencias significativas (P<0.05) entre los Grupos 2 y 5 en las puntuaciones medias de íleo macroscópicas, en las puntuaciones medias microscópicas de íleo y de colon, en la eliminación fecal (f-PCR), en la ADWG y en la serología. Estos dalos lambién indicaron que había un cierto grado de inmunidad materna que proporciona protección frente a la exposición virulenta durante al menos seis semanas después del nacimiento. El estudio midió además la serología (IFA) y que determinó que podían detectarse cochinillos seropositivos en los Grupos 1-3 desde el día del parto y hasía el día 28. Cabe destocar que, el día del parto, lodos los cerdos de lodos los grupos eran seronegativos usando el ensayo IFA, lo que posiblemente implica que el ensayo usado en este experimento no proporciona un indicador preciso de inmunidad frente a la exposición virulenta a Lawsonia. Dada la naturaleza del agente etiológico como patógeno mucosal y del uso de una vacuna viva no virulenta, es posible que alguna forma de inmunidad celular deba ser considerada como un factor. Olro objelivo de esíe esludio era determinar si la vacunación eficaz, cara a la inmunidad materna, podría llevarse a cabo vacunando a los cochinillos antes de lo que convencionalmente se hace o se recomienda. Para este ensayo, se confirmó la vacunación eficaz de los cochinillos de 16 a 26 días de edad. Esía determinación se realizó comparando el Grupo 1 (cochinillos vacunados procedentes de cerdas del Grupo A) y el Grupo 2 (cochinillos no vacunados procedentes de cerdas del Grupo A). Los parámelros primarios usados en esía comparación fueron las lesiones macroscópicas y microscópicas asociadas al íleo y al colon. Las punluaciones medias de íleo macroscópicas fueron de 0.16 y 0.85 para los Grupos 1 y 2, respeclivamente, siendo significativamente diferentes (P<0.05). El porcentaje de muestras de íleos con lesiones macroscópicas fue del 16% y del 45% para los Grupos 1 y 2, respeclivamenle, y esto también supuso una diferencia significativa (P<0.05). Los cochinillos del Grupo 1 también presentaron puntuaciones numéricamente menores, aunque no significativamente diferentes, de lesiones de colon macroscópicas y de lesiones microscópicas de íleo y de colon, y también una menor colonización de tejidos (t-PCR). En tolal, estos datos confirman que la vacunación proporciona una protección eficaz superior y a mayor plazo que la inmunidad materna por sí sola. Todas las comparaciones de los demás grupos, excepío uno, disculidas anteriormente se basaron en un estudio de variable única, bien la vacunación de cerda bien la vacunación de cochinillo, pero no de ambos. La comparación entre los Grupos 1 y 5 requirió la evaluación de los datos teniendo en cuenía dos variables de esludio (vacunación de cerda y vacunación de cochinillo). Se destoca que los Grupos 2 y 5 eran esíadísticamente diferentes (P<0.05) en algunos parámetros y numéricamente inferiores en otros. Se puede asumir razonablemente que los Grupos 1 y 5 serían estad íslicamenle diferentes en la mayoría de los parámeíros de esludio como en los Grupos 2 y 5. En resumen, se determinó que los Grupos 1 y 5 eran significativamente diferentes (P<0.05) en numerosos parámetros que incluyen los parámetros de estudio primarios de puníuaciones macroscópicas de íleo, puníuaciones microscópicas de íleo y punluaciones microscópicas de colon. Finalmente, los Grupos 3 y 6 (los grupos de control estricto) confirmaron el status de los cerdos en relación a la Lawsonia y validaron las fuentes de cerdos. Estos grupos no fueron incluidos en los análisis estad íslicos. Todos los parámelros medidos y evaluados confirman que esíos animales eran negalivos en Lawsonia, excepto por las punluaciones de lesiones microscópicas de un único cerdo del Grupo 6, que fue regislrado como positivo en Lawsonia. En base a los datos acumulados de iodos los demás parámelros, se cree que se írató de un error.