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BRPI0610830A2 - processo de produção de cepas de staphylococcus aureus, superprodutoras - Google Patents

processo de produção de cepas de staphylococcus aureus, superprodutoras Download PDF

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BRPI0610830A2
BRPI0610830A2 BRPI0610830-0A BRPI0610830A BRPI0610830A2 BR PI0610830 A2 BRPI0610830 A2 BR PI0610830A2 BR PI0610830 A BRPI0610830 A BR PI0610830A BR PI0610830 A2 BRPI0610830 A2 BR PI0610830A2
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BR
Brazil
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nacl
culture medium
medium
culture
advantageously
Prior art date
Application number
BRPI0610830-0A
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Inventor
Bachra Rokbi
Celine Lafont
Original Assignee
Sanofi Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

PROCESSO DE PRODUçãO DE CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, SUPERPRODUTORAS. A presente invenção refere-se a um processo de produção de uma cepa superprodutora de Staphylococcus Aureus, compreendendo: (a) a cultura de uma cepa de StaphylococcuS Aureus, sobre um meio de cultura Ml, M2 ou M3 (b) eventualmente a recuperação das cepas assim produzidas a partir do meio de cultura, assim como a utilização dessas cepas para a produção de polissacarídios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSODE PRODUÇÃO DE CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUPER-PRODUTORAS".
A presente invenção refere-se a um processo de produção decepas superprodutoras de Staphylococcus Aureus e à respectiva utilizaçãoem um processo de produção de polissacarídios capsulares.
Os polissacarídios capsulares de Staphylococcus Aureus, emparticular os polissacarídios de serótipos 5 e 8, são descritos na literaturacomo componentes de interesse para a produção de uma vacina, visando aproteger contra as infecções devido a Staphylococcus Aureus.
As cepas T5 e T8 são microcápsulas e produzem, portanto, pe-quenas quantidades de polissacarídios capsulares de interesse. As quanti-dades de polissacarídios capsulares que devem ser incluídos em uma vaci-na são importantes devido ao sistema imunitário deficiente das populaçõesalvos (vide, por exemplo, Fattom, A., et al (1995) Vaccine 13, 1288-1293).
No âmbito de um desenvolvimento industrial dessa vacina é,portanto, importante poder produzir grandes quantidades de polissacarídioscapsulares T5 e T8.
É nessa óptica que os inventores colocaram em evidência umnovo processo que permite aumentar substancialmente a capacidade desecreção de polissacarídio capsular das cepas de Staphylococcus Aureus.Os inventores fornecem, portanto, um processo de produção, permitindo ob-ter polissacarídio capsular de Staphylococcus Aureus em grandes quantidades.
De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção serefere, portanto, a um processo de produção de cepas de StaphylococcusAureus subprodutoras, compreendendo:
(a) a cultura de uma cepa de Staphylococcus Aureus sobre ummeio de cultura M1, compreendendo por litro de meio de cultura:
. 5 a 100 g de peptona vegetal;
. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;
. 1 a 30 g de açúcar;. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3) e FeS04,
. 1 a 700 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em MgCI2 e Mg S04, . 0,1 a 500 mg de Ca Cl2,
. 0 a 50 mg de Zn Cl2;
.10 a 250 g de NaCI, de preferência 58,5 g/l, ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5; e(b) eventualmente a recuperação das cepas a partir do meio de
cultura.
De acordo com o modo de realização particular do processo deprodução de cepas superprodutoras, o meio de cultura M1 da etapa (a)compreende a peptona de trigo.
De acordo com um modo de realização vantajoso do processode produção de cepas superprodutoras, o meio de cultura M1 compreendepor litro de meio de cultura:
. 30 g de peptona de trigo;
. 5 g de extrato de levedo;
. 1 g de D-glicose H20,
. 120 mg de Fe Cl3, 6 H20,
. 400 mg de MgCI2> 6 H20,
. 10 mg de CaCI2) 2 H20,
. 58,5 g de NaCI,
. 5 mg de Zn Cl2)
. 6,8 g de (NH4)2S04,
. 6g de NH4CI e pH = 6,5.
De acordo com um modo de realização vantajoso, o meio M1consiste por litro em: 30 g de peptona de trigo, 5 g de extrato de levedo, 1 gde D-glicose H20, 120 mg de FeCI3, 6H20, 400 mg de MgCI2, 6 H20, 10 mgde CaCI2, 2H20, 58,5 g de NaCI, 5 mg de ZnCI2, 6,8 g de (NH4)2S04 e 6 g deNH4CI, pH = 6,5.
De acordo com um modo de realização particular o processo deprodução de cepas superprodutoras compreende uma etapa de pré-culturasobre um meio de pré-cultura MO, compreendendo:
. 3 a 50 g de peptona vegetal;
. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;
. 1 a 30 g de açúcar;
. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3 e FeS04;
. 1 a 700 mg de sal de magnésio selecionado no grupo que con-siste em MgCI2 e MgS04 ,
. 0,1 a 50 mg de CaCI2,
. 0 a 50 mg de ZnCI2,
. 2 a 50 g de NaCI, de preferência 6 g/l; ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5.
De acordo com um modo particular de realização do processode produção de cepas superprodutoras, a etapa de pré-cultura utiliza ummeio de pré-cultura MO, compreendendo por litro 3,87 g de peptona de trigo.
De acordo com um outro modo de realização do processo deprodução de cepas superprodutoras, a etapa de pré-cultura utiliza um meiode pré-cultura MO, compreendendo por litro 3,87 g de peptona de trigo.
De acordo com um outro modo de realização do processo deprodução de cepas superprodutoras, a etapa de pré-cultura utiliza um meiode pré-cultura MO que compreende por litro 30 g de peptona de trigo.
De acordo com um modo de realização vantajoso do processode produção de cepas superprodutoras, a etapa de pré-cultura utiliza ummeio de pré-cultura MO gelosado, compreendendo: 3,87 g de peptona detrigo, 5 g de extrato de levedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de FeCl3,6H20, 400 mg de MgCI2, 6H20, 10 mg de CaCI2, 2H20, 6 g de NaCI, 5 mgde Zn Cl2, 6,8 g de (N H20)2S04 , 6 g de NH4CI, 15 g/l de ágar e pH = 6,5.
De acordo com um outro modo de realização vantajoso do pro-cesso de produção de cepas superprodutoras, a etapa de pré-cultura utilizaum meio de pré-cultura MO líquido, compreendendo: 30 g de peptona de tri-go, 5 g de extrato de levedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de FeCI3, 6H20,400 mg de MgCI2, 6H20, 10 mg de CaCI2, 2H20, 6 g de Na Cl, 5 mg de ZnCl2, 6,8 g de (NH4)2S04, 6 g de NH4CI, e pH = 6,5.
De acordo com um modo de realização, o processo tal comodefinido acima é um processo de produção de cepas superprodutoras deStaphylococcus Aureus T5.
De acordo com um outro modo de realização o processo tal co-mo definido acima é um processo de produção de cepas superprodutoras deStaphylococcus Aureus T8.
A presente invenção se refere também a uma cepa superprodu-tora obtida pelo processo, tal como definido acima e a utilização dessa cepapara a produção de polissacarídio capsular. A presente invenção se refere,portanto, em particular uma cepa Reynolds superprodutora, uma cepa Bec-ker superprodutora e uma cepa CYL770 superprodutora obtidas pelo pro-cesso tal como descrito acima.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção fornece,portanto, um processo de produção de polissacarídios capsulares, compre-endendo:
(a) a cultura de uma cepa Staphylococcus Aureus sobre ummeio de cultura M1, tal como definido acima;20 (b) a inativação da cultura assim produzida; e
(c) a recuperação dos polissacarídios capsulares.
De acordo com um modo de realização do processo de produ-ção de polissacarídios capsulares a etapa de cultura utiliza um meio de cul-tura M1, compreendendo a peptona de trigo.
De acordo com um modo de realização, o processo de produçãode polissacarídio capsular compreende uma etapa de pré-cultura, tal comodefinida acima em relação com o processo de produção de cepas superpro-dutoras.
A presente invenção tem também por objeto um meio MO adap-tado à cultura de Staphylococcus Aureus compreendendo:
. 3 a 50 g de peptona vegetal;
. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;. 1 a 30 g de açúcar;
. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3 e FeS04,
. 1 a 700 mg de sal de magnésio selecionado no grupo que con-siste em MgCI2 e MgS04,
.0,1 a 50 mg de CaCI2,
. 0 a 50 mg de ZnCI2,
. 2 a 50 g de NaCI, de preferência 6 g/l; ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5, ese refere, de preferência, a um meio MO gelosado ou líquido, compreenden-do por litro e vantajosamente consistindo em: 3,87 g ou 30 g de peptona detrigo e 5 g de extrato de levedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de FeCI3, 6H20, 400 mg de MgCI2, 6 H20, 10 mg de CaCI2, 2H20, 6 g de NaCI, 5 mg deZnCI2, 6,8 g de (NH4)2S04, 6 g de NH4CI e pH = 6,5.
A presente invenção tem também por objeto um meio de culturaM1 adaptado à superprodução de polissacarídio capsular de StaphylococcusAureus, compreendendo:
. 5 a 100 g de peptona vegetal;
. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;
. 1 a 30 g de açúcar;
. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3 e FeS04,
. 1 a 700 mg de um sal de magnésio selecionado no grupo queconsiste em MgCI2 e MgS04;
. 0,1 a 500 mg de CaCI2;
. 0 a 50 mg de ZnCI2;
.10 a 250 g de NaCI, de preferência 58,5 g/l que vai de 6,2 a 7,5, e
de preferência se refere a um meio de cultura M1, compreendendo por litro evantajosamente consistindo em: 30 g de peptona de trigo, 5 g de extrato delevedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de FeCI3, 6H20, 400 mg de MgCI2, 6H20, 10 mg de CaCI2, 2H20, 58,5 g de NaCI, 5 mg de ZnCI2, 6,8 g de(NH4)CI e pH = 6,5.
Os inventores colocaram em evidência que o meio M1, tal comodefinido acima, podia ser vantajosamente substituído por um meio simplifi-cado M2. A presente invenção se refere, portanto, também a um processode produção de cepas de Staphylococcus Aureus Superprodutores e a umprocesso de produção de polissacarídios capsulares, tais como definidosacima, nos quais o meio M1 é substituído por um meio M2, tal como definidoabaixo.
A presente invenção tem também por objeto um meio de culturaM2, compreendendo por litro de meio de cultura:52,5 a 100 g de peptona vegetal, vantajosamente peptona detrigo;
. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g em particu-lar 41 g/l de NaCI;
. 0 a 15 g/l de um sal de magnésio, vantajosamente de 0,01 a 15g/l, em particular 15 g/l de MgCI2, 6H20 e
. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l, em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose H20,
cujo pH está compreendido em uma faixa de valores de 6,3 a 6,7, vantajo-samente de 6,4 a 6,6.
De acordo com um modo de realização particular, o meio de cul-tura M2 compreende, e vantajosamente consiste em 93 g/l de peptona detrigo, 41 g/l de NaCI, 0,25 g/l de D-glicose H20 e 15 g/l de MgCI2, 6H20, cujopH está na faixa de valores de 6,3 a 6,7.
Os inventores colocaram também em evidência que um meio decultura M3, correspondendo a um meio M2, no qual a peptona vegetal ésubstituída por 65 a 85 g/l, vantajosamente 75 g/l de extrato de levedo podiaser utilizada. A presente invenção se refere, portanto, também a um proces-so de produção de cepas de Staphylococcus Aureus superprodutoras e a umprocesso de produção de polissacarídios capsulares, tais como definidosacima, nos quais o meio M1 é substituído por um meio M3, tal como definidoabaixo.A presente invenção tem, portanto, também por objeto um meiode cultura M3, compreendendo por litro de meio de cultura:
. 65 a 85 g de extrato de levedo, vantajosamente 75 g/l de extra-to de levedo;
. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5g a 82,5 g em particu-lar 41 g/l de NaCI;
. 0 a 15 g/l de um sal de magnésio, vantajosamente de 0,01 a 15g/l, em particular 15 g/l de MgCI2, 6H20; e
. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l, em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose, H20,
cujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,3 a 6,7.
A presente invenção vai ser descrita mais detalhadamente nadescrição que se segue por Referência: à figura 1, dando uma representa-ção do protocolo de recuperação dos polissacarídios.
Os inventores colocaram em evidência, de forma surpreendenteque os meios de cultura M1, M2 e M3 induzem um aumento substancial dacapacidade de secreção de polissacarídio capsular das cepas de Staphylo-coccus Aureus. Esse aumento pode ser colocado em evidência por medidada quantidade de polissacarídio capsular produzida pelo métodos ELISA, talcomo descrita no exemplo 2.4 abaixo. Essas cepas de Staphylococcus Au-reus que apresentam uma capacidade de secreção aumentada são denomi-nados no âmbito da presente invenção cepas superprotetoras.
Entende-se, portanto, no âmbito da presente invenção por "ce-pas superprodutoras" uma cepa de Staphylococcus Aureus que, após cultu-ra sobre um meio M1 ou M2 ou M3 produz uma quantidade de polissacarídiocapsular em mg/l, tal como determinada pelo métodos ELISA descrito noexemplo 2.4, pelo menos 3 vezes, de preferência 5 vezes e vantajosamente10 vezes superior, àquela produzida por cultura da mesma cepa de partidasobre por meio de Poutrel (vide Poutrel, B et al. (1995). Clin Diagn Lab Im-munol 2, 166-171 para um descritivo do meio ou o exemplo 1.1 abaixo) nasmesmas condições de cultura.
No caso de uma cepa recombinante, entende-se por "cepas su-perprodutoras" uma cepa de Staphylococcus Aureus recombinante que, a-pós cultura sobre um meio de cultura M1 ou M2 ou M3 produz uma quanti-dade de polissacarídio capsular em mg/l, tal como determinada pelo métodoELISA descrito no exemplo 2.4, pelo menos 2 vezes superior, àquele produ-zido pela cultura da mesma cepa de partida sobre o meio TSB (vide exemplo1.5 para um descritivo do meio) nas mesmas condições de cultura.
Os inventores colocaram em evidência, de forma surpreendente,que o processo de produção de cepas superprotetoras era aplicável às ce-pas de Staphylococcus Aureus T5 e às cepas T8. Os inventores tambémobservaram que o processo, de acordo com a invenção, era também aplicá-vel às cepas recombinantes que foram modificadas geneticamente para su-perproduzir seu polissacarídios capsular. Os inventores demonstraram esseaspecto, aplicando-se o processo, de acordo com a invenção, à cepa C-YL770 geneticamente modificada para produzir polissacarídio capsular T8em grandes quantidades. A cepa após cultura sobre meio M1 ou M2 ou M3vê sua capacidade de secreção em polissacarídio capsular T8 aumentar deum fator 2, conforme descrito nos exemplos abaixo.
Entende-se, portanto, no âmbito da presente invenção por "ce-pas de Staphylococcus Aureus" qualquer que expressa uma cápsula ou mi-crocápsula, compreendendo um polissacarídio de serotipo T5 e/ou T8. Po-dem-se citar, a título de exemplo não limitativo de cepas proriadas, as cepasNewman (T5), Reynolds (T5), Lowenstein (T5), Becker (T8), Wright (T8) eCYL 770 (T8) e CYL1892 (T5).
Essas cepas são disponíveis junto a diversos institutos ou emdiversas coleções, pode-se em particular citar a coleção do Instituí Pasteur(CIP): Reynolds CIP 103313 , Cecker CIP103314, ou ATCC: Wright ATC9525, Loweinstein ATCC 49521. No âmbito da presente invenção utilizam-se, de preferência, as cepas CYL770 (T8) e Reynolds (T5). A cepa CYL770é uma cepa Becker modificada geneticamente para produzir maiores quanti-dades de polissacarídio capsular T8. Essa cepa pode ser vantajosamenteutilizada como cepa de partida no processo de produção de cepas superpro-dutoras, de acordo com a invenção, assim como no processo de produçãodo polissacarídio, de acordo com a invenção. Um descritivo da cepa CYL770é dado no artigo de Luong, T.T e Lee, C.Y (2002), Infect. Immun. 70: 3389-3395. A cepa CY1892 designa a cepa de S. aureus recombinante, obtida apartir de uma cepa Reynolds (CIP 103313) na qual o promotor do operoncap 5 foi substituído pelo promotor constitutivo forte do operon capl da cepaM de S. aureus, segundo o processo descrito por Luong et Lee (2002 Infect.Immun. 70: 3389-3395) com as seguintes modificações: as seqüências ho-mólogas foram substituídas por seqüências equivalentes homólogas da cepaReynolds, o plasmídeo pCL52.2 foi substituído pelo plasmídeo pCL10, con-tendo uma origem de replicação tremossensível e compreendendo um mar-cador cat (cloranfenicol acetil transferase, conferindo uma resistência ao clo-ranfenicol). Em resumo, um fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb,contendo o ORF cap5 da cepa Reynolds fundido em um fragmento de apro-ximadamente 250-bp, contendo o Pcap 1 promotor é construído pela técnicade PCR por sobreposição. Um fragmento de ADN de aproximadamente 1kb,contendo a seqüência a montante do gene cap5A é amplificado por pCR apartir do genoma da cepa Reynolds. Os dois fragmentos são em seguidaclonados no plasmídeo pCL10 portando uma origem de réplica sensível àtemperatura e comportando um marcador cat, de modo que o promotorPcap5 seja substituído pelo promotor pCapl. O plasmídeo assim construídoé em seguida eletroportado em uma cepa RN4220, depois introduzido portransducção como auxílio do bacteriófago 52 na cepa Reynolds. A sensibili-dade da origem de replicação à temperatura do plasmídeo permite em se-guida favorecer a recombinação homóloga, bloqueando sua replicação, apli-cando uma seleção pelo cloranfenicol.
Entende-se por "polissacarídio capsular" no âmbito da presenteinvenção os polissacarídios capsulares T5 e/ou T8 das cepas de Staphylo-coccus Aureus, assim como os fragmentos que daí derivam.
Entende-se por "meio de cultura" no âmbito da presente inven-ção um meio isento de proteína de origem animal.
Por "proteína de origem animal", são entendidas as proteínasobtidas a partir de matéria de origem animal, assim, como qualquer produtoderivado, tais como os derivados oriundos do tratamento químico das proteí-nas animais. São entendidos também os produtos da hidrólise parcial outotal dessas proteínas animais, tais como peptonas, os polipeptídeos, ospeptídeos ou os ácidos aminados que deles derivam.
O processo de produção de uma cepa superprodutora, de acor-do com a invenção, compreende (a) uma etapa de cultura de uma cepa deStaphylococcus Aureus. Segundo um modo de realização, a etapa de culturautiliza um meio de cultura M1 que compreende:
. 5 a 100 g de peptona vegetal;
. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;
. 1 a 30 g de açúcar;
. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3, e FeS04,
. 1 a 700 mg de um sal de magnésio selecionado no grupo queconsiste em MgCl3 e MgS04,
. 0,1 a 50 mg de CaCI2,
. 0 a 50 mg de ZnCI2,
.10 a 250 g de NaCI, de preferência 58,5 g/l ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5.
A fonte de nitrogênio protéico no meio M1 utilizado é fornecidaprincipalmente por uma peptona vegetal.
Entende-se por peptona vegetal" no âmbito da presente inven-ção as peptonas selecionadas no grupo que consiste em: peptona de trigo epeptona de ervilha. As peptonas vegetais são geralmente sob a forma dehidrolisados obtidos por tratamento enzimático ou químico das proteínas ex-traídas geralmente das partes da planta que contêm os mais fortes teoresem proteínas, tais como o germe de trigo, por exemplo. São utilizadas, depreferência, plantas que não foram modificadas geneticamente. No caso dostratamentos químicos, o extrato protéico é submetido à ação do ácido clorí-drico a quente sob pressão. O hidrolisado é em seguida neutralizado pelasoda, depois livre dos subprodutos sólidos. No caso dos tratamentos enzi-máticos, o extrato protéico é digerido habitualmente pela papaína. As pepto-nas obtidas são constituídas principalmente de uma mistura de ácidos ami-nados, e pequenos peptídeos, cujo PM é < 1KD. Os peptídeos, cujo PM é >1 KD representam menos de 30% da mistura. Os preparados comerciaisreferenciados com os nomes (Hy-Pea 7404 de Quest ref 5710565, Petonade trigo E1 de Organotecnica ref. 19559) são exemplos de hidrolisados depeptonas vegetais utilizáveis no âmbito da presente invenção . A concentra-ção de peptona vegetal utilizada no meio M1 é selecionado, considerando-seo teor em nitrogênio protéico da peptona e considerando-se a concentraçãoem extrato de levedo. Esse teor é calculado pelo método de Kjeldahl. Paramaiores detalhes, pode-se fazer referência, por exemplo, ao artigo de LynchJ.M. et al, J. AOAC Int. (1999) 82 (6): 1389-98. Habitualmente, os teores emnitrogênio protéico das peptonas vegetais selecionadas estão compreendi-dos entre 8% e 15% ((peso/peso)). Nessa faixa de valores, a concentraçãoem peptona vegetal utilizável é de 5 a 100 g por litro de meio de cultura, depreferência de 20 a 50 g/l e, em particular, 30 g/l.
A fonte de nitrogênio protéico no meio M1 utilizado é fornecidatambém pelo extrato de levedo. Os teores em nitrogênio protéico nos extra-tos de levedo são geralmente de 9 a 13% (peso/peso). O extrato de levedo éutilizado a uma concentração de 0,5 a 20 g/l de meio de cultura, e, em parti-cular, a uma concentração de 5 g/l. O nitrogênio protéico do meio de culturapode também ser fornecido sob a forma de sais minerais, podem-se citar atítulo de exemplo os sais de amônio, tais como o cloreto ou sulfato. Essessais minerais podem ser utilizados a concentrações que deverão ser ajusta-das em função dos fornecimentos pelas outras fontes de nitrogênio.
As concentrações em fontes de nitrogênio protéico são ajusta-das de tal modo que o teor em nitrogênio protéico total não leva a um hiper-catabolismo nitrogenado, podendo ser responsável pelo acúmulo de dejetostóxicos no decorre da cultura. Por outro lado, para evitar o aparecimento deum efeito inibidor substancial de um excesso de vitaminas fornecidas peloextrato de levedo, este é utilizado apenas como fonte secundária de nitrogê-nio protéico e, de preferência, a uma concentração de 5 g/l.
De acordo com um modo de realização vantajoso, o meio decultura M1 compreende por litro de meio 30 g de peptona, de preferência depeptona de trigo e 5 g de extrato de levedo.
O meio de cultura compreende também uma fonte de açúcar.
Entende-se por "fonte de açúcar" no âmbito da presente inven-ção, qualquer fonte de açúcar de origem não animal, metabolizável pela bac-téria, tal como a frutose, ribose, xilose, fucose ou glicose. Concentrações daordem de 1 a 30 g/litro de meio de ccultura podem ser utilizadas. Para a gli-cose, por exemplo, uma concentração de 1 g/l é vantajosamente utilizada.
O meio de cultura M1 compreende também sais minerais e, emparticular, pelo menos sais, de preferência cloretos, de ferro, de magnésio,de cálcio, de zinco e de sódio nas seguintes quantidades:
- de 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo queconsiste em FeCl3, e FeSCU, e em particular 120 mg de FeCI3, por litro demeio de cultura;
- de 1 a 700 mg de um sal de magnésio selecionado no grupoque consiste em MgCl2 e MgSC^ e em particular 400 mg de MgCI2, por litrode meio de cultura;
- de 0,5 a 50 mg de CaCI2, e, em particular, 10 mg de CaCI2, porlitro de meio de cultura;
- de 0 a 50 mg de ZnCI2 e em particular 5 mg de ZnCI2 por litrode meio de cultura; e
- de 10 a 250 g de NaCI, de preferência 58,5 g por litro de meiode cultura.
Os sais minerais de Fe, Ca e Mg são classicamente utilizadossob a forma hidratada. No âmbito da presente invenção os seguintes saishidratados foram utilizados nos meios de cultura: FeCI3, 6 H20, MgCI2, 6H20, CaCI2, 2H20.
O meio M1 apresenta um pH inicial compreendido em uma faixade valores que vai de 6,2 a 7,5, de preferência um pH de 6,5, para isto qual-quer sal mineral classicamente utilizado por seu poder tampão e permitindoobter um pH na faixa de valor indicada acima pode ser utilizado, se necessá-rio. Para a determinação do pH, a medida do pH é feita com o auxílio de umpH - metro à temperatura ambiente.
O meio M1 pode também compreender agentes que regulam apressão osmótica, tal como glicerofosfato e/ou glicina-betaína a concentra-ções de 1 a 10 mM para a glicina betaína e 50 a 100 mM para o glicerofosfa-to, que pode ser vantajoso acrescentar, quando a concentração em NaCI ésuperior a 1 M (58 g/l).
O meio de cultura M1 utilizado corresponde, de preferência, aum meio líquido. Pode, todavia, se apresentar sob a forma sólido. A formasólida ou gelosada é obtida por adição ao meio líquido de uma substânciagelificante, habitualmente o ágar a uma concentração de 10 a 30 g por litrode meio de cultura.
De acordo com um modo de realização vantajoso o meio de cul-tura M1 compreende, e, de preferência, consiste em , por litro, 30 g de pep-tona de trigo, 5 g de extrato de levedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de Fe-Cl3, 6 H20, 400 mg de MgCI2, 6 H20, 10 mg de CaCI2, 2 H20, 58,5 g de Na-CI, 5 mg de ZnCI2, 6,8 g de (NH4)2S04 e 6 g de NH4CI e apresenta um pHde 6,5.
A etapa de cultura pode ser realizada por inseminação do meioM1 com um inoculum, por exemplo com um CO680 nm inicial de 0,2, e incu-bação a 37°C durante um período, por exemplo, de aproximadamente 48 a72 horas em uma atmosfera contendo ou não C02 a uma concentração de 5a 10% (para o tipo 5 sem C02 e no caso da utilização da cepa Becker comC02). O volume de cultura pode variar em função das necessidades. Volu-mes de 400 ml a 20 I ou volumes superiores, por exemplo, de 30 I a 100 Ipodem ser utilizados. De preferência, uma relação volume do meio de cultu-ra em relação ao volume do recipiente de cultura de 20% (V/V) é mantida.Para os grandes volumes, a oxigenação é controlada e regulada durante acultura por um ajuste da pressão em oxigênio e uma agitação apropriada.
Em função das necessidades, a etapa de cultura pode compre-ender culturas sucessivas em volumes crescentes, a fim de aumentar a bio-massa e a quantidade de polissacarídios produzidos.
De acordo com um modo de realização vantajoso, o processo deprodução de cepas superprodutoras compreende uma etapa de pré-culturasobre um meio de pré-cultura MO, compreendendo por litro:
. 1 a 30 g de peptona vegetal;
. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;
. 1 a 30 g de açúcar,
. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste me FeCfe e FeS04;
. 1 a 700 mg de um sal de magnésio selecionado no grupo queconsiste em MgCI2 e MgS04;
.0,1 a 50 mg de CaCI2)
. 0, 1 a 50 mg de ZnCI2;
. 0 a 50 g de NaCI, de preferência 6 g/l; ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vão de 6,2 a 7,5.
Para as definições dos diferentes componentes, pode-se repor-tar às definições dadas acima em relação com o meio de cultura M1.
Ao contrário, no âmbito da etapa de pré-cultura, utilizam-se, depreferência, 3,87 g ou 30 g de peptona, em particular de trigo por litro demeio de pré-cultura. A concentração em NaCI no meio MO é, de preferência,de 6 g por litro. O meio de pré-cultura MO na etapa de pré-cultura é, de pre-ferência, seja um meio gelosado, compreendendo 3,87 g de peptona de trigopor litro seja um meio líquido, compreendendo 30 g de peptona de trigo por litro.
De acordo com um modo de realização vantajoso, a etapa depré-cultura é utilizada por cultura da cepa sobre um meio de pré-cultura MOcompreendendo e, de preferência, consistindo em, por litro, 30 g de peptonade trigo, 5 g de extrato de levedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de FeCI3, 6H20, 400 mg de MgCI2, 6 H20, 10 mg de CaCI2, 2 H20, 6 g de NaCI, 5 mgde ZnCI2, 6,8 g de (NH4)2S04 e 6 g de NH4CI e pH de 6,5.
De acordo com um outro modo de realização vantajoso, a etapade pré-cultura é utilizada por cultura da cepa sobre um meio de pré-culturaMO líquido ou gelosado e que compreende e, de preferência, consiste em3,87 de peptona de trigo ou 30 g/L para o meio MO líquido, 5 g de extrato delevedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de FeCI3, 6 H20, 400 mg de MgCI2, 6H20, 10 mg de CaCI2, 2 H20, 6 g de NaCI, 5 mg de ZnCI2) 6,8 g de(NH4)2S04 e 6 g de NH4CI, pH = 6,5.
A etapa de pré-cultura permite uma amplificação do inoculum.Ela pode ser realizada por inseminação do meio de pré-cultura MO com umacepa de Staphylococcus Aureus por exemplo à razão de 1.107 CFU e incu-bação a 37°C durante um período que pode variar, por exemplo, de 5 a 20horas, em uma atmosfera que contém ou não de 5 a 10% em volume deC02 (sem C02 para o T5 e em presença de C02 no caso da utilização dacepa Becker). A etapa de pré-cultura pode a fim de aumentar a biomassacompreender pré-culturas sucessivs em volumes crescentes de meio MO. Apré-cultura serve em seguida para inseminar o meio líquido M1. Para isto,pode-se utilizar uma quantidade de inoculum tal que DO680 nm inicial sejade 0,2. O volume de cultura na etapa de pré-cultura pode variar classica-mente de 400 ml a 20 I. De preferência, mantém-se uma relação volume domeio de pré-cultura em relação ao volume do recipiente inferior ou igual a 20%.
Após a etapa de cultura, as cepas assim produzidas podem serrecuperadas por centrifugação e conservadas sob a forma de liofilizados oude congelados após adição de glicerol 20% ou ser utilizadas diretamentepara inseminar um maior volume de meio de cultura, ou ainda ser utilizadasdiretamente no processo de produção de polissacarídio capsular, segundo apresente invenção.
De acordo com um modo de realização vantajoso, o processo deprodução tal como definido acima corresponde a um processo de produçãode uma cepa Reynolds superprodutora.
De acordo com um outro modo de realização vantajoso, o pro-cesso de produção tal como definido acima corresponde a um processo deprodução de uma cepa CTYL770 superprodutora.
A presente invenção se refere também às cepas superproduto-ras de Staphylococccus aureus, em particular as cepas Reynolds, Becker etCYL770, produzidas pelo processo, tal como definido acima.Os inventores realizaram um plano de experiência que mostraque o meio de cultura M1 pode ser simplificado e substituído no âmbito doprocesso, segundo a presente invenção por um meio M2, tal como definidoabaixo.
De acordo com um outro modo de realização, a etapa (a) utiliza,portanto, um meio de cultura M2, compreendendo por litro de meio de cultura:
. 52,5 a 100 g de peptona vegetal, vantajosamente peptona detrigo;
. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g em particu-lar 41 g/l de NaCI;
. 0 a 15 g/l de um sal de magnésio, vantajosamente de 0,01 a 15g/l, em particular 15 g/l de MgCI2, 6H20 e
. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l, em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose H20,
cujo pH está compreendido em uma faixa de valores de 6,3 a 6,7.
Para a definição dos termos utilizados, serão feitas referênciasàs definições dadas acima em relação com o meio de cultura M1.
Os resultados do plano de experiência mostram que não é ne-cessário acrescentar açúcar ao meio de cultura M2, quando a peptona vege-tal continha um teor em açúcares total de pelo menos 5%. Esta pode com-preender uma mistura de açúcares, tais como: frutuose, glicose, manotriose,rafinose, sacarose, estaquiose). Se esse não for o caso, será então neces-sário acrescentar ao meio de cultura uma outra fonte de açúcar. O açúcarpode então ser acrescentado à razão de 0,25 g/l a 7 g/l.
De acordo com um modo de realização vantajoso, o meio decultura M2 compreende 0,25 g/l de açúcar, em particular de D-glicose, H20.
O meio de cultura M2 pode vantajosamente conter um sal demagnésio selecionado no grupo que consiste em MgCI2 e MG SO4 . Os in-ventores colocaram em evidência que a adição de um sal de magnésio per-mite aumentar a robustez do meio de cultura (as faixas de variação dosconstituintes são sensivelmente mais estreitos em presença de MgCI2). Ocloreto de magnésio, em particular MgCI2, 6 H20, pode, portanto, ser acres-centado vantajosamente ao meio M2 em uma faixa de 0,01 g/l a 15 g/l demeio de cultura. A melhor robustez é observada quando o meio M2 contém15 g/l de MgCI2, 6 H20 Concentrações superiores em sal de magnésio, nãoacarretando um aumento suplementar da robustez.
Os inventores colocaram, também em evidência que a produtivi-dade melhorada em polissacarídios é observada com o meio M2 em umaampla faixa de concentração que vai de 5 g/l a 100 g/l, vantajosamente de5 g/l a 82,5 g/l de meio de cultura.
O plano de experiência tem, por outro lado, permitido que hajauma forte interação entre a concentração em peptona e a concentração emNaCI. Faixas de concentrações que podem ser utilizadas no âmbito dos pro-cessos, segundo a presente invenção , puderam assim ser definidas.
De acordo com um modo de realização particularmente vantajo-so, o meio M2 tal como definido acima compreende 52,5 a 70 g de peptonavegetal, vantajosamente a peptona de trigo; e
5 a 37 g de NaCI.
De acordo com um outro modo de realização particularmentevantajoso, o meio M2 tal como definido acima compreende 66 a 82,5 g depeptona vegetal, vantajosamente a peptona de trigo, e 22 a 74 g de NaCI.
De acordo com um outro modo de realização particularmentevantajoso, o meio M2 tal como definido acima compreende 60 a 90,5 g depeptona vegetal, vantajosamente a peptona de trigo, e 35 a 63,5 g de NaCI.
De acordo com um outro modo de realização particularmentevantajoso, o meio M2 tal como definido acima compreende 79 a 95 g de pep-tona vegetal, vantajosamente a peptídeo de trigo e 46 a 82, 5 g de NaCI.
Os meios M2, segundos esses 4 modos de realização podemvantajosamente conter 0,25 g/l de glicose, em particular D-glicose e 15 g/l deMgCI2, 6 H20.
O meio de cultura M2 pode vantajosamente conter um sal demagnésio selecionado no grupo que consiste em MgCI2 e Mg SO4 . Os in-ventores colocaram em evidência que a adição de um sal de magnésio per-mite aumentar a robustez do meio de cultura (as faixas de variação dosconstituintes são sensivelmente mais estreitas em presença de MgCI2). Ocloreto de magnésio, em particular MgCI2, 6 H20, pode, portanto, ser acres-centado vantajosamente ao meio M2 em uma faixa de 0,01 g/l a 15 g/l demeio de cultura. A melhor robustez é observada quando o meio M2 contém15 g/l de MgCI2, 6 H20. Concentrações superiores em sal de magnésio nãoacarretam um aumento suplementar da robustez.
Os inventores colocaram também em evidência que a produtivi-dade melhorada em polissacarídios é observada com o meio M2 em umaampla faixa de concentrações de NaCI. Com efeito, o NaCI pode seja estarausente, seja ser utilizado em uma faixa de concentração que vai de 5 g/l a100 g/l, vantajosamente de 5g/l a 82,5 g/l de meio de cultura.
O plano de experiência permitiu, por outro lado, mostrar que hajauma forte interação entre a concentração em peptona e a concentração emNaCI. Faixas de concentrações que podem ser vantajosamente utilizadas noâmbito dos processos, segundo a presente invenção puderam assim ser de-finidas.
De acordo com um modo de realização particularmente vantajo-so, o meio M2, tal como definido acima compreende 52,5 a 70 g de peptonavegetal, vantajosamente a peptona de trigo; e 5 a 37 g de NaCI.
De acordo com um outro modo realização particularmente vanta-joso, o meio M2 tal como definido acima compreende 66 a 82,5 g de peptonavegetal, vantajosamente da peptona de trigo, e 22 a 74 g de NaCI.
De acordo com um outro modo de realização particularmentevantajoso, o meio M2 tal como definido acima compreende 60 a 90,5 g depeptona vegetal, vantajosamente a peptona de trigo, e 35 a 63,5 g de NaCI.
De acordo com um outro modo de realização particularmentevantajoso, o meio M2 tal como definido acima compreende 79 a 95 g de pep-tona vegetal, vantajosamente a peptona de trigo, e 46 a 82,5 g de NaCI.
Os meios M2, segundo esses 4 modos de realização podemvantajosamente conter 0,25 g/l de glicose, em particular D-glicose e 15 g/l deMgCI2, 6 H20.De acordo com um modo de realização particular, o meio de cul-tura M2 compreende e vantajosamente consiste em 93 g/l de peptona detrigo, 41 g/l de NaCI, 0,25 g/l de D-glicose, H20, e 15g/l de MgCI2) 6 H20,cujo pH está em uma faixa de valores de 6,3 a 6,7. Esse meio leva, por e-xemplo, a um rendimento de 40 mg/l de polissacarídio T5 a partir de umacepa Reynolds.
Os inventores mostraram também por um plano de experiênciaque um meio M2, tal como definido acima, no qual a peptona vegetal é subs-tituída por 65 a 85 g, vantajosamente 75 g/l de extrato de levedo podia serutilizado nos processos, segundo a presente invenção . Esse meio é deno-minado meio de cultura M3. O meio de cultura M3, segundo a presente in-venção compreende, portanto, por litros de meio de cultura:
. 65 g/l a 80 g/l de extrato de levedo, vantajosamente 75 g/l deextrato de levedo;
. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5g e a82,5 g, em parti-cular 41 g/l de NaCI;
. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g, em parti-cular 41 g/l de NaCI;
. 0 a 15 g/l de um sal de magnésio, vantajosamente de 0,01 a 15g/l, em particular 15 g/l de MgCI2, 6 H20; e
. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l, em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose H20,
. cujo pH está compreendido em uma faixa que vai de 6,3 a 6,7.
Experiências suplementares mostraram que a faixa de peptonavegetal (tal como definida acima) podia ser estendida até um valor de 200 g/lde meio de cultura. Os meios M2 e M3, tais como definidos acima, contendouma peptona vegetal à razão de 52,5 a 200 g/l são, portanto, incluídos noâmbito da presente invenção .
A presente invenção se refere, portanto, também às cepas su-perprodutoras de Staphylococcus Aureus, em particular as cepas Reynolds,Becker e CYL770, CYL1892 produzidas pelo processo que utiliza o meio decultura M2 ou M3, tal como definido acima.De acordo com um outro aspecto, a presente invenção se refere,portanto, a um processo de produção de polissacarídios capsular, compre-endendo:
(a) a cultura de uma cepa de Staphylococcus Aureus tal comodefinida acima sobre um meio de cultura M1 ou M2 ou M3, tal como definidoacima,
(b) a inativação da cultura assim produzida; e
(c) a recuperação do polissacarídio capsular.
A etapa (a) de cultura do processo de produção de polissacarí-dios capsular pode ser realizada nas mesmas condições que aquelas descri-tas acima em relação com a etapa (a) do processo de produção de cepassuperprodutoras e pode também ser precedida de uma etapa de pré-cultura,tal como descrita acima.
A cultura resultante da etapa (a) é em seguida submetida a umaetapa de inativação.
A etapa de inativação pode ser utilizada por tratamento da cultu-ra com uma mistura fenol/etanol (V/V) à razão de 2% em volume ao final,depois agitação por exemplo com o auxílio imantado à temperatura ambientedurante 6 horas a 48 horas em função da biomassa a tratar. A inativação écontrolada por um teste de mortalidade. Para isso, 100 microlitros da culturatratada são inseminados em mingau tripticase soja adicionado de 1/30 desoro de cavalo. As culturas são incubadas durante 48 H a 37°C em posiçãoestática, os bujões de frascos de mingau permanecendo desaparafusados. Ainativação das culturas pode ser controlada por um método que compreendeuma etapa de amplificação em meio TSB (sem acréscimo de soro) sob agi-tação a 37°C durante 16 a 18 horas, depois uma caixa de pétri de geloseColumbia 2% NaCI é inseminada com 150 uL de cultura assim amplificada.A caixa é ela própria colocada a 37°C durante 16 a 18 horas, depois obser-vada. Uma ausência de colônias prova da inativação conseguida da culturatratada. A ausência de bactérias confiáveis se traduz por uma ausência deimpulso após 24 de incubação a 37°C. Uma vez que a mortalidade da cultu-ra é estabelecida, recupera-se o polissacarídios capsular. A etapa de recu-peração compreende uma extração do polissacarídio a partir das células.Diferentes técnicas de extração foram descritas na literatura e podem seraplicadas no âmbito da presente invenção. Pode-se fazer referência, porexemplo, aos artigos de Lee J.C. Infect. Immunu. 1993; 67: 1853-1858;Dassy B. et al J. Gen. Microbiol. 1991; 137: 1155 - 1162. Um método de ex-tração por autocavagem a 121°C é ilustrada no exemplo 2.3. Uma técnica deextração utilizando a lisostafina é descrita no exemplo 2.5.
No caso da cepa CYL 770, a maior parte do polissacarídio é se-cretada no que flutua de cultura e pode, portanto, ser recuperada diretamen-te a partir deste. Para isto ao final da cultura, o meio é centrifugado e o resí-duo celular é eliminado.
O polissacarídio capsular resultante pode em seguida se neces-sário ser purificado. Diferentes técnicas de purificação foram descritas naliteratura e podem ser aplicadas no âmbito da presente invenção . Pode-sefazer referência, por exemplo, aos artigos de Lee J.C. et al 1987; 55: 2191-2197; Fattom A. et al Infect. Immun. 1990; 58: 2367-2374. Um técnica depurificação é ilustrada no exemplo 2.5.
A análise da composição molar em monossacarídeo e a análisepor RMN do próton a 500 MHz mostram que se obtém um polissacarídio,cuja estrutura está de acordo com aquela descrita na literatura com uma ta-xa de O-acetilação superior a 70% e uma taxa de pureza de pelo menos70%. Os residuais estão presentes no produto final à razão de aproximada-mente 0,5 a 3% (p/p) de residuais de natureza protéica e menos de 0,1%(p/p) de ácidos nucléicos residuais e menos de 5% (p/p) de ácido lipotecóicoe de ácido tecóico residuais.
A quantidade de polissacarídio capsular obtida pode ser avaliadapela técnica ELISA, tal como descrita no exemplo 2.4.
O processo de produção de PS, segundo a invenção, pode, por-tanto, ser utilizado vantajosamente para produzir polissacarídio T5, de prefe-rência a partir de uma cepa Reynold, tal como CIP 103313 e polissacarídioT8, de preferência a partir da cepa CYL770.
Segundo um outro aspecto, a presente invenção se refere, por-tanto, a um meio MO, tal como definido acima adaptado à cultura de Staph-ylococcus Aureus.
Entende-se no âmbito da presente invenção por "meio adaptadoà cultura de Staphylococcus Aureus" um meio que permite obter, por um la-do, um aumento da biomassa de um fator de pelo menos 10, tal como de-terminada pela medida da densidade óptica a 680 nm e, por outro lado, umaconfiabilidade tal como a relação DO/CFU, seja de pelo menos 1 Unidade deDO = 108 CFU/ml. Para determinar essa relação DO/CFU, a suspensão bac-teriana cuja densidade óptica foi medida com o auxílio de um espectrofotô-metro é diluída em um tampão PBS, utilizando diluições de razão 10. O nú-mero de CFU contidas nessas diluições é avaliado após inseminação destassobre uma caixa de Pétri, contendo um meio nutritivo (tal como a gelose Co-lômbia). Após incubação 24 horas a 37°C, as bactérias confiáveis são com-putadas e a correspondência entre o número de bactérias confiáveis expres-sa em Unidade que formam colônias (CFU) e a densidade óptica (DO) podeassim ser estabelecida.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção se referetambém aos meios de cultura M1, M2 e M3, tais como definidos acima adap-tados à superprodução de polissacarídio capsular de Staphylococcus Au-reus.
Entende-se no âmbito da presente invenção por "meio adaptadoà superprodução de polissacarídio capsular" um meio que leva a um aumen-to da capacidade de secreção em polissacarídio capsular de uma cepa Sta-phylococcus Aureus que se traduz por uma produção de polissacarídio cap-sular, tal como determinada por um teste ELISA, tal como definido no exem-plo 2.4 pelo menos 3 vezes, de preferência pelo menos 5 vezes e, em parti-cular, pelo menos 10 vezes superior àquela produzida pela cultura da mes-ma cepa de partida nas mesmas condições de cultura, mas sobre o meio dePoutrel.
No caso das cepas recombinantes, considera-se que o meio éadaptado à superprodução de polissacarídio capsular, se conduzir a um au-mento da capacidade de secreção em polissacarídio capsular de uma cepade Staphylococcus Aureus recombinante que se traduz por uma produçãode polissacarídio capsular, tal como determinada por um teste ELISA, talcomo definido no exemplo 2.4, pelo menos 2 vezes superior àquela produzi-da pela cultura da mesma cepa de partida nas mesmas condições de cultu-ra, mas sobre o meio TSB.
A presente invenção vai ser descrita de forma mais detalhadanos exemplos que seguem que são dados a título puramente ilustrativo dainvenção e não podem em nenhum caso ser considerados como limitando oalcance desta.
EXEMPLO 1: Preparo dos Meios de Cultura
Em uma primeira etapa, soluções mães de cada um dos compo-nentes são preparados. Para isso, os componentes são pesados sobre umabalança de precisão e dissolvidos em água ultrafiltrada (salvo indicação con-trária). As soluções assim obtidas são em seguida filtradas sobre Stericup0,22 mícron e armazenadas a + 4°C ao abrigo da luz. As soluções mães depeptonas de trigo, de extrato de levedo e de FeCl3, são preparadas extem-poraneamente.
1.1. Meio de Poutrel
O meio de Poutrel é preparado conforme indicado no artigo dePoutrel et al., (poutrel, B et al. (1995). Clin Diagn Lab Immunol 2, 166-171)por mistura das diferentes soluções mães. O pH é em seguida ajustada em 7por acréscimo de NaOH 30%, depois o meio é filtrado sobre 0,22 mícron.
A composição final em g/l de meio é: L-Cistina: 0,24 g/l; L-Aspártico ácido: 2,4 g/L; L-Glutâmico ácido: 2,4 g/L; L-proline: 2,4 g/L; L-Arginina: 0,36 g/L; L-Glicina: 2,4 g/L; L-Histidina: 0,48 g/L; L-lisina HCI: 0,6g/L; L-Serina: 2,4 g/L; L-Valina: 0,48 g/L; L-Tirosina: 0,18 g/L; L-Treonina: 2,4g/L; L-Alanina: 2,4 g/L; L-lsoleucina: 0,6 g/L; L-leucina: 0,6 g/L; L-Fenilalanina: 0,2 g/L; L-Triptofano: 0,06 g/L; L-Metionina: 0,18 g/L; D-Glicose: 10 g/L; Ácido nicotínico: 11,94 mg/L; Tiamina HCI: 0,6 mg/L; AmônioSlfato: 6,84 g/L; Potássio di-hidrogenofosfato: 1,34 g/L; Sódio difosfato:14,38 g/L; Cálcio cloreto: 5 mg/L; Cobalto cloreto hiexa-hidratado: 2,4 mg/L;Sulfato de cobre: 0,5 mg/L; Sulfato de manganês: 5,6 mg/L; sódio cloreto:5,8 mg/L; cloreto de zinco: 3,4 mg/L; cloreto de ferro: 27 mg/L; Magnésiosulfato: 247 mg/L.
1.2. Os Meios MO Gelosado. MO Líquido. M1 Para o meio MO gelosado:
Em uma primeira etapa, 150 ml de base gelosada são prepara-dos por dissolução de 3 g de ágar em 150 ml de H20 ultrafiltrada. A compo-sição resultante é colocada no banho-maria fervente até desaparecimentodos grãos de ágar (aproximadamente 30 minutos), depois esterilizada noauto clave durante 30 minutos a 116°C.
O meio MO gelosado é em seguida preparado por mistura dasdiferentes soluções mães na ordem indicada na composição abaixo), filtra-gem da mistura resultante sobre estericup 0,22 mícron e adição da misturaassim obtida sob 50 mL à base gelosada de forma a se conseguir um meiocontendo em g por litro:
Peptona de trigo: 3,87 g; extrato de levedo: 5 g; D-glicose H20:1 g; NaCI: 6 g; MgCI2, 6 H20, 0,4 g; (NH4)2 S04 : 6,8 g; NH4CI: 6 g; FeCI3,6 H20 : 120 10"3 g; ZnCI2: 5 10-3 g; CaCI2, 2H20: 10 10-3 g.
8 caixas de pétri são em seguida escoadas.
A peptona de trigo que foi utilizada corresponde à peptona detrigo de Organotecnia (ref. 19559). O extrato de levedo utilizado correspondeao extrato de Beckton Dickinson (ref 212750):
Para o meio MO líquido:
O meio MO líquido é preparado por mistura das diferentes solu-ções mães na ordem indicada na composição abaixo e filtragem da misturaresultante sobre estericup 0,22 mícron de forma a se conseguir um meiocontendo em g por litro:
peptona de trigo: 30 g; extrato de levedo: 5 g; D-glicose H20: 1g;NaCI: 6 g; MgCI2, 6 H20, 0,4 g; (NH4)2 S04 : 6,8 g; NH4CI: 6 g; FeCI3, 6 H20: 120 10"3 g; ZnCI2: 5 10-3 g; CaCI2, 2H20: 10 10-3 g; pH = 6,5.
Para o meio M1
O meio M1 é preparado por mistura das diferentes soluçõesmães na ordem indicada na composição abaixo e filtragem da mistura resul-tante sobre estericup 0,22 mícron, de forma a se conseguir um meio conten-do em g por litro:
Peptona de trigo: 30 g; extrato de levedo: 5 g; D-glicose H20:1 g; NaCI: 58,5 g; MgCI2) 6 H20, 0,4 g; (NH4)2 S04 : 6,8 g; NH4CI: 6 g; FeCI3,6 H20 : 120 10"3 g; ZnCI2: 5 10-3 g; CaCI2( 2H20: 10 10-3 g.
1.3. Gelose Columbia 2% NaCI
Para 1 litro de meio, 44g de Columbia "Blood Ágar Base" (Difcoref 279240) são pesados, depois são acrescentados 500 ml de H20 ultrafil-trada estéril. A mistura obtida é incubada no banho-maria a 100°C, duranteaproximadamente 30 minutos (até completa dissolução e obtenção de umasolução límpida). 500 ml de H20 ultrafiltrada estéril são em seguida acres-centados. A solução é repartida em frascos Schotts de 200 ml, depois esteri-lizada por autoclave a 116°C, durante 30 minutos. Os meios são em seguidamantidos a 55°C (banho-maria), antes de serem escoados em caixas de pé-tri (25ml/caixa). Antes de escoar as caixas, são acrescentados 13,3 ml deNaCI 30% (filtrado 0,22 |im) por frasco de 200 ml para se obter uma concen-tração final de 2% ( = 2g/100 ml).
1.4. "Trytic Sov Ágar" (GTS)
Para 1 litro de meio, 40 g de "Trytic Soy Ágar"(Difco ref. 236950)são pesados, depois são acrescentados 500 ml de H20 ultrafiltrada estéril. Amistura obtida é incubada no banho-maria a 100°C, durante aproximada-mente 30 minutos (até completa dissolução e obtenção de uma solução lím-pida). 500 ml de H20 ultrafiltrada estéril são em seguida acrescentadas. Asolução é repartida em frascos Schotts de 200 ml, depois esterilizada porautoclave a 116°C durante 30 minutos. Os meios são em seguida mantidosa 55°C (banho-maria) antes de serem derramados em caixas de pétri (25ml/caixa).
1.5 Minqau "bacto Tryptic Sov" Broth (TSB)
Para 1 litro de meio, 30 g de "Bacto Trytic Soy" (Difco Ref.211825) são pesados, depois são acrescentados 500 ml_ de H20 ultrafiltradaestéril. A mistura obtida é incubada no banho-maria a 100°C durante apro-ximadamente 30 minutos (até completa dissolução e obtenção de uma solu-ção límpida). 500 ml de H20 ultrafiltrada estéril são em seguida acrescenta-das. A solução é repartida em frascos Schotts de 200 ml, depois esterilizadapor autoclave a 116°C durante 30 minutos. Os meios são em seguida manti-dos a 55°C (banho-maria) antes de serem derramados em caixas de pétri(25 ml/caixa).
EXEMPLO 2: Avaliação da Produção de Polissacarídio Capsular de Tipo 5(CP5) em Diferentes Condições de Cultura
2.1. Cultura da cepa Reynolds
Congelados foram preparados de duas formas diferentes, se-gundo o fato de se desejar colocar em condições sem compostos de origemanimal ou em condições padrão. Para as condições padrão, um liofilizado deorigem é retomado sobre uma gelose Colombia+ 2% NaCI. Esta última écultivada durante 18 horas a 37°C com ou sem C02 em função da cepa. Acultura é de novo repicada sobre uma nova caixa de gelose durante 4 horasa 37°C para serem obtidos germes em fase exponencial de crescimento. Acultura é então recuperada em mingau trypticase soja ao qual são acrescen-tados 20% de glicerol. No caso em que as condições isentas de compostosde origem animal são requeridas, a pré-cultura é realizada sobre meio MO 18horas a 37°C, depois o inoculum serve para repicar um meio líquido MO. Ocongelamento é feito também após adição de glicerol 20%.
Um congelado Reynolds de 100 |iL obtido pelo primeiro métodocitado acima é retomado em 900 |iL de PBS.
Inseminam-se duas caixas de pétri de meio MO gelosado e duascaixas de pétri de gelose columbia 2% de NaCI em camada com 150 \iL desuspensão bacteriana por caixa e incuba-se 18-20 horas a 37°C.
As camadas são raspadas a esse e suspensas de novo em 5 mlde PBS. A DO680nm das suspensões é medida e permite determinar o volumede pré-cultura necessário para inseminar os erlens de 50 mL a DOesonm = 0,2.
A pré-cultura sobre Gelose Columbia 2% NaCI é utilizada parainseminar um erlen de meio de Poutrel, e a pré-cultura sobre MO gelosado(18-20 H a 37°C) é utilizada para inseminar um erlen de meio MO líquido eum erlen de meio M1. Os volumes são variáveis em função dos testes, maisfreqüentemente 50 ml. Para manter uma boa oxigenação, o volume de meioé inferior ou igual a 20% do volume do erlen.
Após verificação das DOesonm iniciais, os erlens são colocadossob agitação (x 100 tpm) a 37°C.
A seqüência das culturas é feita por medida da DO a 680 nm emto, tsh, t24h, t32h, Í48h, t56h, e t72h, o pH inicial é medido assim como em 72 horasde cultura. Os resultados obtidos sobre as culturas de 50 ml estão consigna-dos nas tabelas 1 e 2 abaixo.
Tabela 1
<table>table see original document page 28</column></row><table>
2.2. Inativacão da Cultura
Às 72 horas as culturas são repartidas em 4 frascos schott de 1contendo cada um 750 ml_ de cultura.
São acrescentados 15 mL de fenol/etanol (v/v) para 750 ml decultura seja 2% final e agita-se a mistura com o auxílio de uma barra imanta-da à temperatura ambiente durante 48 horas aproximadamente.O teste de mortalidade é realizado da seguinte forma:
100 ul de cultura tratada são aferidos sobre gelose Columbia 2%
NaCI e
100 uJ de cultura tratada são inseminadas em mingau trypcasesoja + 1/30 soro de cavalo, depois se incuba durante 48 horas a 37°C (osbujões dos frascos de mingau trypcase soja são desaparafusados). As cultu-ras assim inativadas são utilizadas para extrair o polissacarídio e avaliar aquantidade produzida por ELISA.
2.3. Extração do Polissacarídio Produzido
As culturas de 72 horas inativadas são em seguida centrifugadasdurante 30 minutos a 3500 rmp a + 4°C, o que flutua de cultura são separa-dos e armazenados a + 4°C. Os resíduos são retomados em 5 ml de PBS eautoclavados durante 60 minutos a 121°C, depois centrifugados durante 30minutos a 25000 g + 4°C. O que flutua (extrato 1) é recuperado. Os resíduossão retomados em 5 mL de PBS, autoclavados durante 60 minutos a 121°Ce centrifugados durante 30 minutos a 25000 g +4°C. O que flutua (extrato 2)é recuperado. Os extratos 1 e 2 são reunidos e tratados à proteinase K 50ug/ml 1H a 37°C, depois a proteína é inativada durante 20 minutos a 75°C.
2.4. Avaliação da Quantidade de Polissacarídio Produzida por ELISA
Os sera policlonais dirigidos contra a cápsula de tipo 5 ou de tipo8 foram produzidos segundo o método descrito por Karakawa et al. J ClinMicrobiol. 1985 set; 22(3): 445-7. Os monoclonais utilizados foram produzi-dos pelo protocolo, tal como descrito por Hochkeppel et al. J Clin Microbiol.1987 mar; 25 (3): 526-30 e nos foram transmitidos pelo Institut Pasteur.
A quantidade de polissacarídio capsular produzida é determina-da por ELISA. Para isto, um teste ELISA colocado entre 2 elementos é feitosobre placas de 96 cavidades (Nunc, Roskilde, Danemark). Em uma primeiraetapa, deposita-se nas cavidades um anticorpo monoclonal anti-CP5 (1 mi-crograma por ml em tampão carbonato de sódio 0,05 M pH = 9,6 (sigma) -100 ng/cavidade), as placas são incubadas durante toda a noite a 4°C. Asplacas são em seguida lavadas 4 vezes com 300 microlitros por cavidade detampão PBS (Eurobio) adicionado de 0,05% de tween 20 (Sigma) (PBS-Tween), depois saturadas durante uma hora a 37°C com 250 microlitros porcavidade de PBS-Tween adicionado de 1% (v/p) de BSA (Eurobio) (PBS-Tween-BSA). As placas são em seguida lavadas em três vezes com a solu-ção PBS-Tween.
Diluições em série de um fator 2 dos extratos da etapa 2.3 porutilização da solução PBS-Tween-BSA são realizadas e acrescentadas àrazão de 100 microlitros por cavidade. As placas são incubadas durante 90minutos a 37°C, depois lavadas 4 vezes com PBS-Tween. Anticorpos poli-clonais de coelho anti-CP5 produtos segundo o protocolo de Karakawa (Ka-rakawa et al., 1985, J. Clin. Microbiol. 1985, set; 22(3): 445-7) são diluídosem PBS-Tween-BSA (1/2000), depois acrescentados às cavidades à razãode 100 microlitros por cavidade, e incuba-se durante 90 minutos a 37°C. Asplacas são em seguida lavadas 4 vezes com PBS-Tween. O conjugado IgGde cabra anticoelho - peroxidase (Southern biotech), diluído em PBS-Tween-BSA (1/6000) é acrescentado à razão de 100 microlitros por cavidade e in-cuba-se durante 1 hora a 37°C. AS placas são lavadas 8 vezes com 300 mi-crolitros de PBS-Tween por cavidade e são acrescentados 100 microlitrospor cavidade de uma solução de substrato TMB (TEBU), depois se incubano negro durante 15 minutos à temperatura ambiente (aproximadamente22°C). A reação enzimática é parada por adição de 100 microlitros de H3P041M (sigma) por cavidade.
Uma leitora de placa automática (Versamax) mede em seguida adensidade óptica a 450 nm. O valor da prova é subtraído e a quantidadeavaliada por comparação com uma curva aferida.
Os resultados estão consignados na tabela 3 abaixo.Tabela 3
<table>table see original document page 31</column></row><table>
2.5 - Extração e Purificação do Polissacarídio CP5
A cepa Reynolds é cultivada como descrito no ponto 2.1 segun-do um protocolo, que compreende uma pré-cultura sobre meio MO gelosado,depois uma cultura em 400 ml de meio M1 em erlens. As culturas são agru-padas para serem obtidos 3 litros de cultura a partir dos quais se extrai e sepurifica o polissacarídio T5 produzido.
A integralidade da cultura é inativada por tratamento ao fenol-etanol (VA/ 2% final), depois centrifugada 30 minutos a 25000 g. Um resíduode aproximadamente 10,9 g de germes inativados úmidos por litro de culturaé obtido.
Os germes são colocados em suspensão à razão de 0,5 g/ml deTris 50mM, MgS04 2 mM, pH 7,5. Uma solução aquosa de lisistafina a 5mg/ml é acrescentada, de forma a se obter uma concentração final de 100u.g/ml. Após incubação de 4 horas a 37°C sob agitação magnética, acres-centa-se uma solução de benzonase a 5 U/ml final e a incubação é feita du-rante 2 horas a 37°C sob agitação magnética.
Após centrifugação (25000 g, 30 mn), o que flutua da extração écoletado, resfriado e ultrafiltrados . O que flutua é previamente diluído em Vaem H20, para se obter um volume suficiente para o sistema de ultrafiltragem.
A ultrafiltragem é feita sobre 2 caixas UF 50 kD nas seguintes condições:H20: 10 volumes; depois Tris 50 mM pH 8,0: 3 volumes. O volume de reten-tado permanece constante no decorrer da ultrafiltragem. O retentado consti-tui o que é denominado o extrato CP5.
O extrato CP5 é incubado a 37°C em presença de MgCI2 (1 mMno final) e de benzonase (5U/ml final seja ~ 40 U por grama de germes úmi-dos tratados) sob agitação. Após 3 horas de incubação, agita-se a benzona-se a uma concentração final de 50/ml, a incubação é contido cada durante 3horas. Uma solução aquosa de pronase a 10 mg/ml é adicionada de forma aobter uma concentração final de 4U/ml (seja - 30U por grama de germesúmidos tratados), adicionada de CaCI2, a uma concentração final de 1 mM. Amistura é então incubado durante 15 horas a 37°C. Uma ultrafiltragem 50 kDé realizada a fim de eliminar os fragmentos de ácidos nucléicos e de proteí-nas sobre 2 caixas UF 50KD nas seguintes condições: H20: 10 volumes,depois Tris 50 mM pH: 8,0: 3 volumes. O volume de retentado permanececonstante no decorrer da ultrafiltragem. Ao retentado anteriormente obtido éacrescentado: Mg Cl2 1mM em final, Benzonase 0,1 U/ml em final e incuba-se 3 horas sob agitação magnética.
Uma solução aquosa de pronase a 10 mg/ml é acrescentada auma concentração final de 0,1 U/ml, adicionada de CaCI2, a uma concentra-ção final de 1 mM, depois se incuba durante 2 horas a 37°C.
Uma ultrafiltragem sobre 2 caixas UF 30KD é então feita nasseguintes condições: H20: 10 volumes, depois Tris 50 mM pH 7,5: 3 volu-mes. O retentado obtido apresenta um precipitado/turvo esbranquiçado queé eliminado por centrifugação a 8000 g/30 min.
Uma etapa de purificação sobre cromatografia de troca de íons éem seguida realizada. Ela permite a eliminação dos residuais, notadamenteo ácido teicóico (TA) e o ácido lipoteicóico (LTA).
As seguintes condições são utilizadas: três colunas Hi Trap QHP de 5 ml são conectadas em série (Ref.: Amersham 17-1154-01); Tampãode equilíbrio: tris 20 mM pH 7,5: Vazão: 2 ml/min; Injeção da amostra emtampão de equilíbrio.
Purificação:
- Tris 20 mM PH 7,5: 5 volumes de coluna- gradiente Tris 20 mM PH 7,5 NaCI 0-0,5 M: 10 volumes de coluna
- Tris 20 mM, NaCI 0,5 M Ph: 7,5: 5 volumes de coluna
- gradiente Tris 20 mM pH 7,5 NaCI 0,5-1 M: 5 volumes de coluna
- Tris 20 mM, NaC11 M Ph 7,5: 5 volumes de coluna
- Tris 20 mM Ph 7,5: 5 volumes de coluna
A purificação é seguida por medida da absorbância 206 e 280nm. Uma análise por CZE permite identificar os diferentes componentes puri-ficados no decorrer da cromatografia. O polissacarídio CP5 é purificado auma concentração em NaCI compreendida entre 0,2 M e 0,3 M. Nas condi-ções cromatográficas utilizadas, este é bem separado dos residuais. Nota-damente, o ácido teicóico que é purificado entre 0,36 M e 0,48 M em NaCI eo ácido lipoteicoico que é purificado que é purificado entre 0,74 M e 0,86 Mem NaCI.
As frações contendo o CP5 são reunidas e dialisadas a +4°Ccontra 20 volumes de uma solução aquosa de NaCI 0,5 M (2-3 banhos), de-pois contra a água ultrafiltrada 20 volumes (3-4 banhos). O Tris é assim eli-minado.
O produto purificado é liofilizado e conservado a -20°C.
A partir de 3 litros de cultura, são obtidos 74 mg de polissacarí-dio capsular T5 em fim de purificação. As características do produto estãoconsignadas na tabela 4 abaixo.
Tabela 4
<table>table see original document page 33</column></row><table>EXEMPLO 3: Avaliação da Produtividade de Polissacarídios Capsulares deTipo 8 (CP8) em Diferentes Condições de Cultura.
A avaliação é realizada sobre as cepas Becker et CYL770.
3.1. Cultura da Cepa Becker
Os congelados são de duas formas diferentes segundo o fato secolocar em condições sem compostos de origem animal ou em condiçõespadrão. Para as condições padrão, um liofilizado de origem é retomado so-bre um gelose Colômbia + 2% NaCI. Esta é cultivada 18 horas a 37°C comou sem CO2 em função da cepa. A cultura é de novo repicada sobre umanova caixa de gelose durante 4 horas a 37°C para serem obtidos dos ger-mes em fase exponencial de crescimento. A cultura é, então, recuperada emmingau tripticase soja ao qual são acrescentados 20% de glicerol. No casoem que as condições isentos de compostos de origem animal são requeri-dos, a pré-cultura é realizada sobre meio MO 18 horas a 37°C, depois o ino-culum serve para repicar um meio MO líquido. O congelamento é feito tam-bém após adição de glicerol 20%.
Um congelado de 100 |a.l Becker preparado segundo o métodoem mingau tripticase soja é retomada em 900 uJ de PBS. Três caixas de pé-tri de MO gelosado, duas caixas de pétri de gelose columbia 2% NaCI, e umacaixa de pétri GTS são inseminadas em camada com 150 [l\ de suspensãobacteriana por caixa. As caixas são incubadas durante 18/20 h a 37°C +5%C02.
As camadas são raspadas nesse e suspensas novamente em 5ml de PBS.
A DOesonm das suspensões é medida, e permite determinar ovolume de pré-cultura necessário para inseminar os erlens de 50ml aDO680nm = 0,2.
A pré-cultura sobre gelose columbia 2% NaCI é utilizada parainseminar um erlen de meio de Poutrel, a pré-cultura sobre GTS é utilizadapara inseminar um erlen de TSB, e a pré-cultura sobre meio MO gelosado éutilizado para inseminar em erlen de meio de MO líquido e um erlen de meioM1.Para manter uma boa oxigenação, o volume de meio é inferiorou igual a 20% do volume do erlen.
Após verificação das DOesonm iniciais, os erlens são colocadossob agitação x100 tpm a 37°C.
Experiências similares são realizadas em erlens contendo 400ml de meio de cultura.
3.2. Cultura da cepa CYL770
Para a cepa recombinante CYL770, o método de preparo doscongelados utiliza uma repicagem do congelado inicial sobre meio TSB ousobre um meio MO líquido. A cultura é feita durante 5 horas a 37°C sob agi-tação. O congelamento é feito após adição de 20% de glicerol no meio.
Um congelado de 1 ml CYL770 assim obtido é retomado por 10ml de meio MO, depois colocado em erlen de 50 ml e incubado durante 18/20horas a 37°C sob agitação xlOOtpm. Um segundo congelado CYL770 é re-tomado em 10 ml de meio TSB, depois colocado sob agitação nas mesmascondições que anteriormente.
AS DOesonm das pré-culturas líquidas é medida, e permite deter-minar o volume de pré-cultura necessário para inseminar os erlens de 50 mla DOesonm = 0,2.
A pré-cultura em TSB permite inseminar um erlen de TSB, a pré-cultura em MO líquido permite inseminar um erlen em meio M1. Para manteruma boa oxigenação, o volume de meio é inferior ou igual a 20% do volumedo erlen.
Após verificação das DOesonm iniciais, os erlens são colocadossob agitação x100 tpm a 37°C.
Experiências similares são realizadas em erlens contendo 400ml de meio de cultura.
3.3- Acompanhamento das Culturas
O acompanhamento das culturas é feito por medida da DO a680 nm em to, tsh, t24h, Í32h. t48h> tõ6h e Í72h-
O ph inicial é medido assim como 72 horas de cultura. Os resul-tados das culturas de 50 ml são consignados na tabela 5 abaixo.Tabela 5
<table>table see original document page 36</column></row><table>
3.4. Inativação das Culturas
As culturas são inativadas segundo o mesmo protocolo que a-quele descrito no ponto 2.2. acima. A extração do polissacarídio produzido éutilizada segundo o mesmo protocolo que aquele descrito no item 2.3 acima.
3.5. Avaliação da quantidade de polissacarídio produzida é reali-zada por utilização do mesmo teste ELISA que aquele descrito no item 2.4acima, salvo os anticorpos utilizados são anticorpos anti-CP8 e o teste é rea-lizado sobre os extratos de resíduos e sobre o que flutua de cultura. A ad-sorção foi realizada com ascite contendo o monoclonal K8-24 diluído a1/200006 e o anticorpo policlonal de coelho é um soro absorvido diluído a1/10006.
Os resultados obtidos para culturas de 50 ml e de 400 ml sãoconsignados na tabela 6 abaixo. Para as culturas de 400 ml a análise é feitacada vez sobre uma única amostra de 50 ml de uma cultura e quantidadetotal é em seguida calculada e reportada na tabela 6.Tabela 6
<table>table see original document page 37</column></row><table>
3.6. Recuperação e Purificação do PS Produzido
A recuperação do polissacarídio T*8 foi feita a partir das culturasem erlens de 400 ml da cepa Becker em meio M-1 por utilização do proces-so, tal como descrito no exemplo 2 para a obtenção do polissacarídio T5.
A purificação do polissacarídio T8 foi também realizada a partirdas culturas em erlens de 400 ml da cepa CYL770 em meio M-1 e culturassobre meio TSB. Para isto 800 ml de cultura são inativados por tratamentoao fenol-etanol, segundo o processo descrito acima, depois centrifugada em30 min a 25000 g. 720 ml do que flutua foram obtidos.
A 500 ml do que flutua é acrescentada uma quantidade de ace-tato de sódio, de forma a se obter uma concentração final de 4% em acetatode sódio. A suspensão é colocada sob agitação durante 30 minutos à tempe-ratura ambiente. Depois, uma quantidade de etanol, de forma a se obter umaconcentração final em etanol de 50%, é acrescentada. A suspensão é entãoagitada à temperatura ambiente durante 30 minutos, depois armazenadasem agitação durante uma noite a +4°C.
Após centrifugação a 15000 g durante 30 minutos, o que flutua écoletado. Ao que flutua são acrescentados acetato de sódio e etanol, deforma a se obter uma concentração final de 4% em acetato de sódio e 85%em etanol. A suspensão é colocada sob agitação durante 30 minutos à tem-peratura ambiente, depois armazenada sem agitação durante uma noite a4°C. Após centrifugação a 15000 g durante 30 minutos, o resíduo é coletado.
O resíduo assim obtido é retomado por 100 ml de água ultrafil-trada (concentração de um fator 5 em relação ao volume do que flutua decultura centrifugado). Após agitação magnética até uma dissolução completado resíduo à temperatura ambiente, a suspensão obtida é dialisada contra 2litros de água ultrafiltrada com três mudanças de banho no dia à temperaturaambiente, seguida de uma etapa durante uma noite 4°C. São acrescentadosem seguida à suspensão assim obtida Tris e MgCfe, a fim de se obter umaconcentração final em Tris de 50 mM e de MgCI2 de 1 mM. Essa solução éincubada a 37°C em presença de benzonase (5U/ml final) sob agitação. A-pós 3 horas de incubação, acrescenta-se benzonase a uma concentraçãofinal de 5 U/ml e a incubação é prosseguida durante 3 horas.
Uma solução aquosa de pronase a 10 mg/ml é acrescentada deforma a se obter uma concentração final de 4 U/ml, adicionada de CaCfe auma concentração final de 1 mM. Essa etapa é então incubada durante 15horas a 37°C. Se aparecer uma turvação/opalescência visível, uma centrifu-gação a 8000 g durante 30 minutos é feita. Uma ultrafiltragem 30 kDa é rea-lizada, a fim de eliminar os fragmentos de ácidos nucléicos e de proteínasnas seguintes condições: H20: 10 volumes; depois Tris 20 mM pH 7,5: 3 vo-lumes.
O volume de retentado continua constante durante a ultrafiltra-gem e obtenção de uma solução límpida muito ligeiramente colorida.
Se o retentado obtido apresentar uma turvação/opalescência,esta é eliminada por centrifugação a 8000 g durante 30 minutos.
Uma etapa de cromatografia trocadora de íons é em seguidafeita para completar a eliminação dos resíduos, notadamente o ácido teicói-co (TA) e o ácido lipoteicóico (LTA) nas seguintes condições: Gel Q sefaroseHP; Coluna Hi Trap Q HP de 20 ml; Tampão de equilíbrio: tris 20 mM compH 7,5; Vazão: 2 ml/min; Injeção da amostra em tampão de equilíbrio. Inje-ção do equivalente de 125 ml do que flutua de cultura para 20 ml de gel; Pu-rificação:
- Tris 20 mM pH 7,5: 5 volumes de coluna
- gradiente Tris 20 mM pH 7,5 NaCI 0-0,5 M 20 volumes de coluna
- Tris 20mM, NaCI 0,5 M pH 7,5: 5 volumes de coluna
- Tris 20mM, NaCI 1 M pH 7,5: 5 volumes de coluna
- Tris 20mM, pH 7,5: 5 volumes de coluna
A purificação é seguida por medida da absorbância a 206 e 280nm. Uma análise por CZE permite identificar os diferentes componentes puri-ficados durante a cromatografia.
Pudemos assim determinar que o polissacarídio CP8 é purifica-do a uma concentração em NaCI compreendida entre 0,2 M e 0,3 M. Nascondições cromatográficas utilizadas, este é bem separado dos residuais,cuja quantidade é ínfima depois que essa etapa de cromatografia. Notada-mente, o ácido teicóico que é purificado entre 0,36 M e 0,48 M em NaCI e oácido lipoteicóico que é purificado entre 0,74 M e 0,86 M em NaCI.
As frações contendo o CP8 são reunidas e dialisadas a + 4°Ccontra 20 volumes de uma solução aquosa de NaCI 0,5 M (2-3 banhos), de-pois contra a água ultrafiltrada a 20 volumes (3-4 banhos). A etapa em forteconcentração de NaCI permite uma boa eliminação do Tris.
O produto assim purificado é liofilisado e conservado a -20°C.
Os resultados obtidos são consignados na tabela 7 abaixo.Tabela 7
<table>table see original document page 40</column></row><table>EXEMPLO 4: Cultura da Cepa de Staphylococcus Aureus Reynolds Tipo 5em Fermentador de 30 litros
4.1. Cultura sobre Meio BTS + NaCI
O congelado da cepa Reymolds preparado pelo primeiro métododo ponto 2.1 é inoculado à razão de 0,5% em volume em dois erlens comgargalos de 2L (E1 e E2) contendo, cada um, 200 ml de meio Mingau Tripto-na Soja adicionado de NaCI (55 g/l). Os erlens são incubados a 37°C duran-te 5+1 horas (E1) ou 48 horas (E2) sob uma agitação de 175 tpm.
O fermentador Braun de 30 litros contendo 20 litros do mesmomeio é inoculado com 70 ml de pré-cultura (E1) estimado a -1,38.1011 CFU(~5h de cultura de D06oonm final no erlen próximo de 4). A cultura é realizadanas condições seguintes: temperatura: 37°C; duração de cultura: 48 + 2 ho-ras; regulagem do pH a 6,50 com NH4OH 25% e H3P04 10%; PO230% (re-gulagem em cascata: agitação 20 a 80%, ar de 20 (1vvm) a 60% (3 vvm),enriquecimento em oxigênio de 0 a 100%); Pressão: 10 KPa (100 mbárias);regulagem antiespuma pelo estruktol 1/50.
O acompanhamento da cultura é realizado durante as primeirashoras com retiradas regulares, assim como 20 ± 2 horas de cultura, 24 ± 2horas de cultura, 42 ± 2 horas de cultura para controlar a DO a 600 nm; de-terminar o peso seco; determinar a viabilidade; observar a morfologia; dosara glicose; dosar o acetato e determinar a produtividade em polissacarídiopelo teste ELISA sobre 6 resíduos de DO = 50, após 4 ± 2 horas, 18 ± 2 ho-ras, 24 ± 3 horas, 44 ± 3 horas e 48 ± 2 horas de cultura.
As células são coletadas após 48 ± 2 horas de cultura em ca-çambas de centrifugação de 1L (12 caçambas/20 I de cultura) e centrifuga-das durante 20 minutos a 7000 g a 4°C. O peso úmido é determinado apóseliminação do que flutua. Os resíduos são conservados a < -20°C até a eta-pa de inativação dos germes ao fenol/etanol, depois recuperação e purifica-ção do polissacarídio T5, segundo o processo do exemplo 2.
O segundo erlen (E2) é acompanhado em 48 horas, a fim deacompanhar a produtividade da cápsula CP5 a 10 horas, 14 horas e 48 ho-ras de cultura.4.2. Cultura sobre Meio de Poutrel
O congelado da Staphylococcus Aureus Reynolds tipo 5 prepa-ro, segundo o primeiro método descrito no ponto 2.1 é inoculado à razão de1% em volume em dois erlens com gargalos de 2 litros (E1 e E2) contendocada um 200 ml de meio de Poutrel. Os erlens são incubados a 37°C a 175tpm durante 16 ± 2 horas. As pré-culturas são resfriadas e utilizadas parainocular o fermentador. A cultura em fermentador B. Braun de 30 I, contendo20 I de meio de Poutrel é realizada nas seguintes condições: temperatura:37°C; duração de cultura: 48 ± 2 horas; regulagem do pH a 6,50 com NH4OH25% e H3PO4 10%; P02 30% (regulagem em cascata: agitação 20 a 80%, arde 20 (1vvm) a 60% (3 vvm), enriquecimento em oxigênio de 0 a 100%);pressão: 10 KPa (100 mbárias); regulagem antiespuma pelo estruktol 1/50.
A cultura é acompanhada nas primeiras horas assim como a 24± 2 horas de cultura e 30 ± 2 horas de cultura, com retiradas para controlar aDO a 600 nm; determinar o peso seco; determinar a confiabilidade; observara morfologia; dosar a glicose; dosar o acetato, dosar os ácidos aminadoslivres e determinar a produtividade em polissacarídio pelo teste ELISA.
As células são coletadas após 48 ± 2 horas de cultura.
2 litros de coleta são coletados em um schott de 2 e tratadoscom fenol/etanol (v/v) a uma concentração final de 2% (V/V). Essa mistura écolocada sob agitação durante 6h ± 1 horas a 22°C ± 3CC. Após eliminaçãodo que flutua do resto da cultura, os resíduos bacterianos são retomadoscom um volume mínimo de tampão PBS, depois autoclavados para inativa-ção e recuperação do polissacarídio, segundo o processo descrito no exem-plo 2 acima.
O resto da cultura é coletado em caçambas de centrifugação de1 L (12 caçambas/18 litros decultura) e centrifugado durante 20 minutos a7000 g a 4°C. O peso úmido é determinado após eliminação do que flutua. 2litros do que flutua são conservados a < -20°C, após filtragem 0,45 ^im e au-toclavagem 55 minutos a 121°C.
Os 12 resíduos são recolocados em suspensão em um volumemínimo de tampão PBS (aproximadamente 650 ml) com o auxílio do ultratu-rax. As suspensões são resfriadas, homogeneizadas e repartidas equitati-vamente em 3 schott de 500 ml (aproximadamente 300 ml/schott) antes deautoclavagem durante 55 minutos a 121 °C. As suspensões autoclavadassão em seguida resfriadas e o polissacarídio é recuperado segundo o proto-colo descrito no exemplo 2 acima.
4.3 Cultura sobre Meio Columbia + NaCI
O congelado de Staphylococcus Aureus Reynolds tipo 5 prepa-rado, segundo o primeiro método do ponto 2.1 é inoculado à razão de 1%em volume em dois erlens com gargalos de 21, contendo cada um 200 ml demeio columbia + 20 g/l de NaCI (Difco ref 294420)1. Os erlens são incuba-dos a 37°C durante 24 ± 2 horas sob uma agitação d e 175 tpm. Após 24 ± 2horas, as pré-culturas são resfriadas e utilizadas para inocular o fermenta-dor. A cultura no fermentador de 30 I B.Braun contendo 20 I do mesmo meioé realizado nas seguintes condições: temperatura: 37°C; duração de cultura:24 ± 2 horas; regulagem do pH a 7,00 com NH4OH 25% e H3P04 10%; P0230% (regulagem em cascata: agitação 20 a 80% , ar de 20 (1vvm) a 60% (3vvm), enriquecimento em oxigênio de 0 a 100%); pressão: 10 KPa (100 mbá-rias); regulagem antiespuma pelo estruktol 1/50.
A cultura seguida regularmente com retiradas regulares paracontrolar a DO a 600 nm; determinar o peso seco; determinar a confiabilida-de; observar a morfologia; dosar a glicose; dosar o acetato e determinar aprodutividade em polissacarídio pelo teste ELISA.
As células são em seguida coletadas após 24+2 horas de cultu-ra. A cultura final é transferida em caçambas de centrifugação de 1 I (12 ca-çambas/20 I de cultura) e centrifugada 20 minutos a 7000 g a 4°C. O pesoúmido é determinado após a eliminação do que flutua. Após centrifugação,os 12 resíduos são recolocados em suspensão com o auxílio do ultraturaxem um volume mínimo de tampão PBS compreendido entre 1 e 1,2 I. Assuspensões são resfriadas, homogeneizadas e repartidas equitativamenteem schott de 500 ml, depois autoclavadas 55 minutos a 121°C. As suspen-sões autoclavadas são em seguida resfriadas e polissacarídio é recuperado,segundo o protocolo descrito no exemplo 2 acima.4.4 Cultura sobre Meio M1
Um congelado de Staphylococcus Aureus Reynolds tipo 5 prepa-rado, segundo o primeiro método descrito no ponto 2.1 acima é retomadoem tampão PBS 1C à razão de 1 ml de congelado para 9 ml de tampão parainseminar aproximadamente 10 caixas de meio MO gelosado à razão de 150|j.L/caixa.
As caixas são incubadas a 37°C durante 15 a 18 horas. Apósuma incubação de 15-18 horas a 37°C, as camadas formadas são raspadasantes de serem retomadas em suspensão em meio M1 para inocular doiserlens de composição idêntica (200 ml/2L -E1 e E2) de forma a ter umaDOeoonm inicial próximo de 0,2 em cada erlen. Os erlens são incubados a37°C sob uma agitação de 175 tpm, durante aproximadamente 5 horas (cul-tura em fase exponencial E1) ou 72 horas (E2).
Uma parte da cultura de E1 (D06oonm próxima de 3) é utilizadapara inocular o fermentador B. Braun de 30 I contendo 20 I de meio M1, deforma a ter uma D06oonm inicial próxima de 0,02.
A cultura é utilizada nas seguintes condições: temperatura:37°C; duração de cultura: 72+4 horas; regulagem do pH a 6,59 com NH4OH25% e H3PO4 10%; P02 30% (regulagem em cascata: agitação 20 a 80%, arde 20 (1 vvm) a 60% (3 vvm), enriquecimento em oxigênio de 0 a 100%);pressão: 10 KPa (100 mbárias); regulagem antiespuma pelo estruktol 1/50.
1L de cultura é em seguida coletado em caçambas de centrifu-gação e centrifugado durante 20 minutos a 7000 g a 4°C a fim de determinaro peso úmido após eliminação do que flutua. Os resíduos são conservados a< -20°C.
O resto da cultura é coletado em Nalgeno de 50 I e inativado aofenol/etanol (2% final V/V) e o polissacarídio é recuperado segundo o proto-colo descrito no exemplo 2-acima.
O conjunto dos resultados obtidos é consignado na tabela 8 a-baixo:TABELA 8
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Claims (29)

1. Processo de produção de uma cepa superprodutora de Sta-phylococcus Aureus, compreendendo:(a) a cultura de uma cepa de Staphylococcus Aureus sobre ummeio de cultura M1, compreendendo por litro de meio de cultura:. 5 a 100 g de peptona vegetal;. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;. 1 a 30 g de açúcar;. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3, e FeS04;. 1 a 700 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em MgCI2 e Mg S04,. 0,1 a 500 mg de Ca Cl2,. 0 a 50 mg de Zn Cl2;.10 a 250 g de NaCI, de preferência 58,5 g/l, ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5; e(b) eventualmente a recuperação das cepas a partir do meio decultura.
2. Processo de produção de uma cepa superprodutora, de acor-do com a reivindicação 1, no qual o meio de cultura M1 da etapa (a) com-preende a peptona de trigo.
3. Processo de produção de uma cepa superprodutora, de acor-do com a reivindicação 1 ou 2, no qual meio de cultura M1 compreende porlitro de meio de cultura:. 30 g de peptona de trigo;. 5 g de extrato de levedo;. 1 g de D-glicose H20,. 120mgdeFeCI3)6H2O,. 400 mg de MgCI2) 6 H20,. 10 mg de CaCI2) 2 H20,. 58,5 g de NaCI,. 5 mg de Zn Cl2,. 6,8 g de (NH4)2S04,. 6g de NH4CI e pH = 6,5.
4. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 4, noqual o meio M1 consiste por litro em: 30 g de peptona de trigo, 5 g de extratode levedo, 1 g de D-glicose H20, 120 mg de Fe Cl3, 6 H20, 400 mg de Mg-Cl2, 6 H20, 10 mg de CaCI2, 2 H20, 58,5 g de NaCI, 5 mg de Zn Cl2, 6,8 g de(NH4)2S04) 6g de NH4CI e pH = 6,5.
5. Processo de produção de uma cepa superprodutora, de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo uma etapade pré-cultura sobre um meio de cultura MO, compreendendo:. 3 a 50 g de peptona vegetal;. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;. 1 a 30 g de açúcar;. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que consiste em FeCI3, e FeS04,. 1 a 700 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que consiste em MgCI2 e Mg S04>. 0,1 a 50 mg de Ca Cl2,. 0 a 50 mg de Zn Cl2;. 2 a 50 g de NaCI, de preferência 6 g/l, ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5.
6. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 5, noqual o meio MO da etapa de pré-cultura compreende 3,87 g ou 30 g de pep-tona de trigo.
7. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 5 ou 6,no qual o meio MO da etapa de pré-cultura compreende:. 3,87 ou 30 g de peptona de trigo;. 5 g de extrato de levedo;. 1 g de D-glicose H20,. 120 mg de Fe Cl3, 6 H20,. 400 mg de MgCI2, 6 H20,. 10 mg de CaCI2) 2 H20,. 6 g de NaCI,. 5 mg de Zn Cl2). 6,8 g de (NH4)2S04,. 6g de NH4CI e pH = 6,5.
8. Processo de produção de uma cepa superprodutora de Sta-phylococcus Aureus, compreendendo:(a) a cultura de uma cepa de Staphylococcus Aureus sobre ummeio de cultura M2, compreendendo por litro de meio de cultura:. 52,5 a 100 g de peptona vegetal, vantajosamente a peptona detrigo;. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g, em parti-cular 41 g/l de NaCI;. 0 a 15 g/l de um sal de ferro selecionado no grupo que consisteem MgSC^e MgCl2 , vantajosamente de 0,01 a 15 g/l, em particular a 15 g/lde MgCI2, 6 H20; e. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose, H20, cujo pH está compreendido em uma faixa devalores que vai de 6,3 a 6,7; e(b) eventualmente a recuperação das cepas a partir do meio decultura.
9. Processo de produção de uma cepa superprodutora, de acor-do com a reivindicação 8, no qual o meio de cultura M2 compreende, e van-tajosamente consiste em 93 g/l de peptona de trigo, 41 g/l de NaCI, 0,25 g/lde D-glicose, H20 e 15 g/l de MagCI2, 6 H20, cujo pH está compreendidoem uma faixa de valores que vai de 6,3 a 6,7.
10. Processo de produção de uma cepa superprodutora de Sta-phylococcus Aureus, compreendendo:(a) a cultura de uma cepa de Staphylococcus Aureus sobre ummeio de cultura M3, compreendendo por litro de meio de cultura:. 65 a 85 g de extrato de levedo, vantajosamente 75 g;. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g, em parti-cular 41 g/l de NaCI;. O a 15 g/l de um sal de magnésio selecionado no grupo queconsiste em MgS04e MgCI2 , vantajosamente de 0,01 a 15 g/l, em particulara 15 g/l; e. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose, H20, cujo pH está compreendido em uma faixa devalores que vai de 6,3 a 6,7; e(b) eventualmente a recuperação das cepas a partir do meio decultura.
11. Processo de produção de uma cepa superprodutora Staph-ylococcus Aureus 15, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. Processo de produção de uma cepa superprodutora de Sta-phylococcus Aureus T8, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Processo de produção de polissacarídio capsular, compre-endendo:(a) cultura de uma cepa de Staphylococcus Aureus sobre ummeio de cultura M1, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 4 ou sobre um meio de cultura M2, tal como definido na reivindicação 8 ou 9, ou sobre um meio de cultura M3, tal como definido na reivindicação 10;(a) a inativação da cultura assim produzida; e(b) a recuperação do polissacarídio capsular.
14. Processo de produção de polissacarídio capsular, no qual omeio M1 da etapa de cultura compreende a peptona de trigo.
15. Processo de produção de polissacarídio capsular, de acordocom a reivindicação 13 ou 14, no qual o meio M1 da etapa de cultura com-preende por litro de meio de cultura: 30 g de peptona de trigo, 5 g de extratode levedo, 1g de D-glicose H20, 120 mg de Fe Cl3, 6 H20, 400 mg de MgCI2, 6 H20, 10 mg de CaCI2, 2 H20, 58,5 g de NaCI, 5 mg de Zn Cl2) 6,8 g de(NH4)2S04, 6g de NH4CI e pH = 6,5.
16. Processo de produção de polissacarídio capsular, de acordocom a reivindicação 15, no qual o M1 consiste, por litro de meio de cultura,em: 30 g de peptona de trigo, 5 g de extrato de levedo, 1g de D-glicose H20, 120 mg de Fe Cl3, 6 H20, 400 mg de MgCI2, 6 H20, 10 mg de CaCI2, 2 H20,-58,5 g de NaCI, 5 mg de Zn Cl2, 6,8 g de (NH4)2S04) 6g de NH4CI e pH =-6,5.
17. Processo de produção de polissacarídio capsular, de acordocom qualquer uma das reivindicações 13 a 16, compreendendo uma etapade pré-cultura, tal como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7.
18. Cepa subprodutora de Staphylococçus Aureus, obtida peloprocesso, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 17.
19. Cepa subprodutora Reynolds, de acordo com a reivindicação 18.
20. Cepa subprodutora Becker, de acordo com a reivindicação 18.
21. Cepa subprodutora CYL 770, de acordo com a reivindicação 18.
22. Cepa subprodutora CLY1892, de acordo com a reivindicação 18.
23. Meio MO adaptado à cultura de Staphylococçus Aureus,compreendendo:. 3 a 50 g de peptona vegetal;. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;. 1 a 30 g de açúcar;. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCl3, e FeS04,. 1 a 700 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em MgCI2 e Mg S04,.0,1 a 50 mg de Ca Cl2). 0 a 50 mg de Zn Cl2;. 2 a 50 g de NaCI, de preferência 6 g/l, ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5.
24. Meio MO, de acordo com a reivindicação 23, compreendendo:(a) . 3,87 ou 30 g de peptona de trigo;(b) . 5 g de extrato de levedo;(c) . 1 g de D-glicose H20,(d). 120 mg de Fe Cl3, 6 H20,(e) . 400 mg de MgCI2, 6 H20,(f) . 10 mg de CaCI2, 2 H20,(g) . 6 g de NaCI,(h) . 5 mg de Zn Cl2,(i) . 6,8 g de (NH4)2S04,(j). 6g de NH4CI e pH = 6,5.
25. Meio de cultura M1, adaptado a superprodução de polissaca-rídio capsular, compreendendo:. 5 a 100 g de peptona vegetal;. 0,5 a 20 g de extrato de levedo;. 1 a 30 g de açúcar;. 1 a 200 mg de um sal de ferro selecionado no grupo que con-siste em FeCI3, e FeS04;. 1 a 700 mg de um sal de magnésio selecionado no grupo queconsiste em MgCI2 e Mg S04,. 0,1 a 500 mg de Ca Cl2,. 0 a 50 mg de Zn Cl2;.10 a 250 g de NaCI, de preferência 58,5 g/l, ecujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,2 a 7,5.
26. Meio de cultura M1, de acordo com a reivindicação 22, com-preendendo:. 30 g de peptona de trigo;. 5 g de extrato de levedo;. 1 g de D-glicose H20,. 120 mg de Fe Cl3, 6 H20,. 400 mg de MgCI2, 6 H20,. 10 mg de CaCI2, 2 H20,. 58,5 g de NaCI,. 5 mg de Zn Cl2,. 6,8 g de (NH4)2S04,. 6g de NH4CI e pH = 6,5.
27. Meio M2, adaptado ã superprodução de polissacarídio cap-sular, compreendendo por litro de meio de cultura:. 52 a 100 g de peptona vegetal, vantajosamente a peptona detrigo;. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g, em parti-cular 41 g/l de NaCI;. 0 a 15 g/l de um sal de magnésio, vantajosamente de 0,01 a 15g/l, em particular 15 g/l de MgCI2, 6 H20; e. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose, H20,cujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,3 a 6,7.
28. Meio de cultura M2, de acordo com a reivindicação 27, com-preendendo por litro de meio de cultura: 93 g/l de peptona de trigo, 41 g/l deNaCI, 0,25 g/l de D-glicose H20 e 15 g/l de MgCI2, 6 H20, cujo pH está com-preendido em uma faixa de valor que vai de 6,3 a 6,7.
29. Meio M3, adaptado a superprodução de polissacarídio cap-sular, compreendendo por litro de meio de cultura:. 65 a 85 g de extrato de levedo, vantajosamente 75 g de extratode levedo;. 0 a 82,5 g de NaCI, vantajosamente de 5 g a 82,5 g, em parti-cular 41 g/l de NaCI;. 0 a 15 g/l de um sal de magnésio vantajosamente de 0,01 a 15g/l, em particular a 15 g/l de MgCI2, 6 H20; e. 0 a 7 g/l de açúcar, vantajosamente de 0,25 a 7 g/l em particu-lar 0,25 g/l de D-glicose, H20,cujo pH está compreendido em uma faixa de valores que vai de 6,3 a 6,7.
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